Arrêté royal relatif à la lutte contre la pourriture brune de la pomme de terre Yabuuchi et al.)

26 JANVIER 2014. - Arrêté royal relatif à la lutte contre la pourriture brune de la pomme de terre (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) PHILIPPE, Roi des Belges, A tous, présents et à venir, Salut. Vu la Constitution, l'article 108; Vu la loi du 2 avril 1971Documents pertinents retrouvés type loi prom. 02/04/1971 pub. 07/12/2010 numac 2010000674 source service public federal interieur Loi relative à la lutte contre les organismes nuisibles aux végétaux et aux produits végétaux. - Coordination officieuse en langue allemande fermer relative à la lutte contre les organismes nuisibles aux végétaux et aux produits végétaux, l'article 2, § 1er, 1, 4, 5 et 8 modifié par la loi du 5 février 1999 et par l'arrêté royal du 22 février 2001 et § 2, modifié par la loi du 27 décembre 2004; Vu la loi du 4 février 2000Documents pertinents retrouvés type loi prom. 04/02/2000 pub. 18/02/2000 numac 2000022108 source ministere des affaires sociales, de la sante publique et de l'environnement Loi relative à la création de l'Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire fermer relative à la création de l'Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire, l'article 4, §§ 1er et 2, § 3, modifié par la loi du 22 décembre 2003, et l'article 5, alinéa 2, 7°, modifié par la loi du 22 décembre 2003; Vu l'arrêté ministériel du 30 août 1999 concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.; Vu l'arrêté ministériel du 14 février 2000 déterminant des mesures afin d'éviter la propagation de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.; Vu la concertation entre les gouvernements régionaux et l'autorité fédérale du 23 mai 2013; Vu l'examen préalable de la nécessité de réaliser une évaluation d'incidence des décisions sur le développement durable, comme prévu à l'article 19/1 de la loi du 5 mai 1997Documents pertinents retrouvés type loi prom. 05/05/1997 pub. 18/06/1997 numac 1997021155 source services du premier ministre 5 MAI 1997 Loi relative à la coordination de la politique fédérale de développement durable fermer relative à la coordination de la politique fédérale de développement durable, dont il ressort qu'une évaluation d'incidence n'est pas nécessaire dans le cas présent, étant donné que cet arrêté constitue la transposition d'une directive de l'Union européenne visée à l'article 2, 3° de l'arrêté royal du 20 septembre 2012 portant exécution de l'article 19/1, § 1er; Vu l'avis 54.368/1 du Conseil d'Etat, donné le 25 novembre 2013, en application de l'article 84, § 1er, alinéa 1er, 1°, des lois sur le Conseil d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973, Sur la proposition de la Ministre de l'Agriculture, Nous avons arrêté et arrêtons : CHAPITRE 1er. - Transposition Article 1er.Le présent arrêté transpose partiellement la Directive 98/57/CE du Conseil du 20 juillet 1998 concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. CHAPITRE 2. - Définitions Art. 2.Pour l'application du présent arrêté, on entend par : a) « l'Agence » : l'Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire; b) « l'organisme » : l'agent pathogène responsable de la pourriture brune de la pomme de terre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., auparavant connu sous la dénomination Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; c) « matériel végétal énuméré » : les plantes hôtes de l'organisme énumérées à l'annexe Ire, section Ire, du présent arrêté;d) « l'arrêté royal du 10 août 2005 » : l'arrêté royal du 10 août 2005 relatif à la lutte contre les organismes nuisibles aux végétaux et produits végétaux. CHAPITRE 3. - Surveillance Art. 3.§ 1er. L'Agence procède chaque année à des recherches officielles systématiques visant à détecter l'organisme sur le matériel végétal énuméré provenant du territoire belge. Afin de déterminer les autres sources éventuelles de contamination menaçant la production du matériel végétal énuméré, l'Agence procède à une évaluation des risques et, à moins qu'aucun risque de propagation de l'organisme n'ait été constaté à l'issue de l'évaluation, elle procède, dans les zones de production du matériel végétal énuméré, à des recherches officielles ciblées visant à détecter l'organisme sur des végétaux n'appartenant pas au matériel végétal énuméré, y compris sur les plantes sauvages hôtes de la famille des solanacées, de même que dans les eaux de surface utilisées pour l'irrigation ou le traitement par pulvérisation du matériel végétal énuméré et dans les eaux usées rejetées par les entreprises de transformation industrielle ou de conditionnement traitant du matériel végétal énuméré et utilisées pour l'irrigation ou le traitement par pulvérisation du matériel végétal énuméré. L'ampleur de ces recherches ciblées est déterminée en fonction du risque décelé. L'Agence peut également procéder à des recherches officielles visant à détecter l'organisme sur d'autres matériels, tels que le milieu de culture, le sol et les déchets solides provenant d'entreprises de transformation industrielle ou de conditionnement. § 2. Les recherches officielles visées au paragraphe 1er sont effectuées : a) pour le matériel végétal énuméré, selon les critères prévus à l'annexe Ire, section II;b) pour les plantes hôtes autres que le matériel végétal énuméré et pour les eaux, y compris les eaux usées, selon des méthodes appropriées;le cas échéant des échantillons sont prélevés et soumis à des tests en laboratoire officiels ou effectués sous contrôle officiel; c) si nécessaire, pour d'autres matériels, selon des méthodes appropriées. Sur la base de principes scientifiques et statistiques fondés et des caractéristiques biologiques de l'organisme, et compte tenu des systèmes particuliers de production du matériel végétal énuméré et, le cas échéant, d'autres plantes hôtes de l'organisme, l'Agence arrête les procédures d'inspection à suivre, ainsi que l'origine, le calendrier et le nombre d'échantillons à prélever et la stratification du prélèvement des échantillons. CHAPITRE 4. - Suspicion de contamination Art. 4.§ 1er. Pour toute apparition suspectée de l'organisme, l'Agence veille à ce que des tests en laboratoire officiels ou officiellement contrôlés soient effectués pour le matériel végétal énuméré, selon la méthode pertinente décrite à l'annexe II et conformément aux conditions énumérées à l'annexe III, point 1, ou, dans tous les autres cas, selon toute autre méthode officiellement agréée, afin de confirmer ou d'infirmer ladite apparition. Si la présence de l'organisme est confirmée, les dispositions de l'annexe III, point 2, s'appliquent. § 2. Dans l'attente de la confirmation ou de l'infirmation de l'apparition suspectée visée au paragraphe 1er : a) la circulation de végétaux et de tubercules issus de toutes les cultures, lots ou envois sur lesquels les échantillons ont été prélevés est interdite, sauf sous contrôle de l'Agence et à condition qu'il ait été établi qu'il n'y a aucun risque identifiable de propagation de l'organisme;b) l'Agence prend les mesures nécessaires pour remonter à l'origine de l'apparition suspectée;c) l'Agence introduit notamment pour la production du matériel végétal énuméré et la circulation de lots de plants de pommes de terre autres que ceux visés au a), produits sur le lieu de production sur lequel les échantillons visés au a) ont été prélevés, des mesures de précaution supplémentaires appropriées, fondées sur le degré de risque estimé, en vue de prévenir toute propagation de l'organisme. L'alinéa précédent ne s'applique que dans chaque cas où on a constaté a) des symptômes visuels diagnostiques suggérant la présence de la maladie causée par l'organisme et une réaction positive au(x) test(s) de dépistage rapide précisé(s) à l'annexe II, section Ire, point 1, et section II, ou b) une réaction positive au(x) test(s) de dépistage précisé(s) à l'annexe II, section Ire, point 2, et section III, § 3.Dans le cas d'apparition suspectée où il y a un risque de contamination du matériel végétal énuméré ou des eaux de surface à partir d'un autre Etat membre ou vers un autre Etat membre, l'Agence notifie immédiatement, en fonction du risque identifié, les informations relatives à ladite apparition suspectée à l'autre Etat membre ou aux autres Etats membres concernés. CHAPITRE 5. - Confirmation de la contamination Art. 5.§ 1er. Si les tests officiels ou officiellement contrôlés, effectués en laboratoire selon la méthode pertinente décrite à l'annexe II, pour le matériel végétal énuméré, ou, dans tous les autres cas, selon toute autre méthode officiellement agréée, confirment la présence de l'organisme dans un échantillon prélevé conformément au présent arrêté : a) s'agissant du matériel végétal énuméré, l'Agence : i) procède à une enquête afin de déterminer l'étendue et la ou les sources primaires de la contamination, conformément aux dispositions de l'annexe IV et en effectuant des tests complémentaires conformément à l'article 4, § 1er, sur, au moins, tous les stocks de plants de pommes de terre liés par clonage, et ii) déclare contaminés 1° le matériel végétal énuméré, l'envoi et/ou le lot d'où l'échantillon a été prélevé, ainsi que le matériel, le véhicule, le récipient, l'entrepôt ou des parties de ceux-ci et tout autre objet, y compris les emballages qui ont été en contact avec le matériel végétal énuméré d'où l'échantillon a été prélevé;2° le cas échéant, le(s) champ(s), unité(s) de production de cultures protégées et lieu(x) de production où le matériel végétal a été récolté et d'où l'échantillon a été prélevé;3° et, pour les échantillons prélevés en cours de végétation, le(s) champ(s), lieu(x) de production et, le cas échéant, unité(s) de production de cultures protégées d'où l'échantillon a été prélevé, et iii) détermine, conformément aux dispositions de l'annexe V, point 1, l'étendue de la contamination probable, soit par contact avant ou après la récolte avec des éléments déclarés contaminés, soit par des liens avec ceux-ci au travers du système de production, d'irrigation ou de pulvérisation, soit par une relation clonale, et iv) délimite une zone sur la base de la déclaration de contamination visée au ii), de la détermination de l'étendue de la contamination probable visée au iii) et de la propagation possible de l'organisme, conformément aux dispositions de l'annexe V, point 2, sous i);b) s'agissant des cultures de plantes hôtes autres que celles mentionnées au a) et lorsque la production du matériel végétal énuméré est identifiée comme soumise à un risque, l'Agence : i) effectue une enquête conformément au a), i), et ii) déclare contaminées les plantes hôtes de l'organisme d'où l'échantillon a été prélevé, et iii) détermine l'étendue de la contamination probable et délimite une zone conformément aux a), iii) et a), iv), respectivement, en ce qui concerne la production du matériel végétal énuméré;c) s'agissant des eaux de surface (y compris les effluents liquides d'entreprises de transformation industrielle ou de conditionnement traitant du matériel végétal énuméré) et des plantes hôtes sauvages associées appartenant à la famille des solanacées, lorsque la production du matériel végétal énuméré est identifiée comme soumise à un risque, que ce soit par irrigation, par pulvérisation ou par submersion par les eaux de surface, l'Agence : i) effectue une enquête, y compris des recherches officielles à des moments opportuns sur des échantillons d'eaux de surface et de plantes hôtes sauvages de la famille des solanacées éventuellement présentes, afin d'établir l'étendue de la contamination, et ii) déclare contaminées les eaux de surface d'où le ou les échantillons ont été prélevés, dans la mesure appropriée et sur la base de l'enquête visée au i), et iii) détermine l'étendue de la contamination probable sur la base de la déclaration de contamination visée au ii) et de la propagation possible de l'organisme, en tenant compte des dispositions de l'annexe V, point 1 et point 2, ii). Pour l'application des a), b) et c), l'Agence tient compte de principes scientifiques fondés, des caractéristiques biologiques de l'organisme et des systèmes particuliers de production, de commercialisation et de transformation des plantes hôtes de l'organisme en usage. § 2. Le Ministre délimite les zones sur la base de la détermination de l'étendue de la contamination prévue au paragraphe 1er, c) § 3. A la suite de la notification par un autre Etat membre, conformément aux dispositions de l'article 5, paragraphe 2, de la Directive précitée 98/57/CE du Conseil du 20 juillet 1998, d'une contamination visant la Belgique, l'Agence procède à une enquête conformément au paragraphe 1er, a), i) et, s'il y a lieu, au paragraphe 1er, c), i) et mène toute action complémentaire appropriée conformément au paragraphe 1er. CHAPITRE 6. - Mesures de lutte spécifiques Art. 6.§ 1er. Le matériel végétal énuméré déclaré contaminé conformément à l'article 5, § 1er, a), ii), ne peut pas être planté et est soumis, sous le contrôle de l'Agence, à l'une des dispositions de l'annexe VI, point 1, de telle sorte qu'il soit établi qu'il n'existe aucun risque identifiable de propagation de l'organisme. § 2. Le matériel végétal énuméré déclaré probablement contaminé conformément à l'article 5 § 1er, a), iii) et c), iii), comprenant le matériel végétal énuméré pour lequel un risque a été identifié, produit sur les lieux de production déclarés probablement contaminés conformément à l'article 5, § 1er, a), iii), ne peut pas être planté et est, sous le contrôle de l'Agence, utilisé ou éliminé de la manière appropriée précisée à l'annexe VI, point 2, de telle sorte qu'il soit établi qu'il n'existe aucun risque identifiable de propagation de l'organisme. § 3. Le matériel, les véhicules, les récipients, les entrepôts ou des parties de ceux-ci, et tout autre objet, y compris les emballages, déclarés contaminés conformément à l'article 5, § 1er, a), ii), ou déclarés probablement contaminés conformément à l'article 5, § 1er, a), iii) et c), iii), doivent être détruits ou décontaminés selon des méthodes appropriées précisées à l'annexe VI, point 3. Après décontamination, ces objets ne sont plus considérés comme contaminés. § 4. Sans préjudice des mesures mises en oeuvre en application des paragraphes 1er, 2 et 3, diverses mesures, définies à l'annexe VI, points 4.1 et 4.2, et à l'annexe VII sont mises en oeuvre dans la zone délimitée conformément à l'article 5, § 1er, a), iv). § 5. Sans préjudice des mesures mises en oeuvre en application des paragraphes 1er, 2 et 3, les mesures, détaillées à l'annexe VI, point 4.2. et à l'annexe VII, sont mises en oeuvre dans la zone délimitée conformément à l'article 5, § 2 . § 6. Afin de prévenir tout risque identifiable de propagation de l'organisme, l'élimination des déchets respecte les conditions fixées dans l'annexe VII de la Directive précitée 98/57/CE du Conseil du 20 juillet 1998. CHAPITRE 7. - Matériel de reproduction Art. 7.§ 1er Sans préjudice des dispositions de l'arrêté royal du 10 août 2005, les plants de pommes de terre doivent provenir en ligne directe de matériel qui a été obtenu dans le cadre d'un programme officiellement approuvé et qui a été déclaré indemne de l'organisme à la suite de tests effectués officiellement ou sous contrôle officiel, selon la méthode décrite à l'annexe II. § 2. Les tests visés au paragraphe 1er sont effectués : a) lorsque la découverte de l'organisme a été confirmée dans la production belge de plants de pommes de terre : i) par des tests portant sur les générations antérieures, y compris la sélection clonale initiale, et par des tests systématiques sur les clones de pommes de plants de terre de base, ou ii) lorsque l'absence de relation clonale a été établie, par des tests sur tous les clones de plants de pommes de terre de base ou sur les générations antérieures, y compris la sélection clonale initiale, b) dans les autres cas, soit sur chaque plante de la sélection clonale initiale, soit sur des échantillons représentatifs des plants de pommes de terre de base ou des générations antérieures. CHAPITRE 8. - Mesures complémentaires Art. 8.Le Ministre peut adopter des mesures complémentaires ou plus rigoureuses requises pour la lutte contre l'organisme ou la prévention de sa propagation, pour autant qu'elles respectent les dispositions de l'arrêté royal du 10 août 2005. CHAPITRE 9. - Dispositions abrogatoires Art. 9.§ 1er . Sont abrogés : a) l'arrêté ministériel du 30 août 1999 concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.b) les articles 2 et 3 de l'arrêté ministériel du 14 février 2000 déterminant des mesures afin d'éviter la propagation de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. CHAPITRE 1 0. - Disposition d'exécution Art. 10.Le ministre qui a la Sécurité de la Chaîne alimentaire dans ses attributions est chargé de l'exécution du présent arrêté. Donné à Bruxelles le 26 janvier 2014. PHILIPPE Par le Roi : La Ministre de l'Agriculture, Mme S. LARUELLE Annexe Ire SECTION Ire. - Liste des plantes hôtes de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. visées à l'article 2 Végétaux (y compris les tubercules), à l'exception des semences Pomme de terreproprement dites de l'espèce Solanum tuberosum L. Végétaux, à l'exception des semences et des fruits de l'espèce Tomate Lycopersicon lycopersicum L. Karsten ex Farw. SECTION II. - Recherches Les recherches officielles visées à l'article 3, § 2, a), sont fondées sur les caractéristiques biologiques de l'organisme et des systèmes particuliers de production et comprennent: i) dans le cas de la pomme de terre: a) à des moments opportuns, une inspection visuelle de la culture en phase de croissance et/ou un prélèvement d'échantillons de plants de pommes de terre et d'autres pommes de terre, en cours de végétation ou stockées;ces échantillons sont soumis à une inspection visuelle, officielle ou officiellement contrôlée, sur tubercules coupés, et b) dans le cas des plants de pommes de terre et, le cas échéant, des autres pommes de terre, des tests en laboratoire officiels ou officiellement contrôlés, suivant la méthode décrite à l'annexe II; ii) dans le cas de la tomate: a) une inspection visuelle, à des moments opportuns, au moins de la culture en phase de croissance de plants destinés à être replantés pour un usage professionnel. Vu pour être annexé à notre arrêté du 26 janvier 2014 relatif à la lutte contre la pourriture brune de la pomme de terre (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) PHILIPPE Par le Roi : La Ministre de l'Agriculture Mme S. LARUELLE Annexe II Procédure de test pour diagnostiquer, détecter et identifier Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. DOMAINE D'APPLICATION DE LA PROCEDURE La procédure présentée ci-dessous décrit les différentes étapes à suivre pour: i) diagnostiquer le flétrissement bactérien sur les tubercules de pomme de terre et sur les plantes de pomme de terre et de tomate et quelques autres plantes hôtes; ii) détecter Ralstonia solanacearum dans des échantillons de tubercules de pomme de terre, de plants de pommes de terre, de tomates et d'autres hôtes, dans l'eau ou dans le sol; iii) identifier Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). PRINCIPES GENERAUX Les protocoles optimisés pour les différentes méthodes, les réactifs validés et les détails de la préparation du matériel nécessaire aux tests et aux contrôles figurent dans les appendices. Une liste des laboratoires retenus pour l'optimisation et la validation des protocoles est fournie à l'appendice 1. Etant donné que les protocoles impliquent la détection d'un organisme nuisible à mettre en quarantaine et incluent l'utilisation de cultures viables de R. solanacearum en tant que matériels de contrôle, il sera nécessaire de mettre en oeuvre les procédures dans des conditions de quarantaine appropriées prévoyant des installations adéquates d'élimination des déchets et dans les conditions des licences appropriées délivrées par les autorités officielles de quarantaine. Les paramètres des tests doivent garantir une détection cohérente et reproductible des niveaux de R. solanacearum aux seuils fixés par les méthodes sélectionnées. La préparation précise de témoins positifs est impérative. La réalisation des tests selon les seuils requis implique également l'établissement de paramètres corrects, la maintenance et l'étalonnage des équipements, la manipulation et la conservation soigneuses des réactifs et toutes les mesures visant à empêcher la contamination entre échantillons, par exemple la séparation des témoins positifs et des échantillons des tests. Des normes de contrôle de la qualité doivent être appliquées pour éviter des erreurs administratives et autres, notamment en ce qui concerne l'étiquetage et la documentation. L'apparition suspectée au sens de l'article 4, paragraphe 2, de la Directive 98/57/CE implique un résultat positif des tests de diagnostic ou de dépistage réalisés sur un échantillon comme précisé dans les diagrammes fonctionnels ci-après. Un premier test de dépistage positif (test IF, PCR/FISH, isolement sélectif) doit être confirmé par un deuxième test de dépistage fondé sur un autre principe biologique. Si le premier test de dépistage est positif, la contamination par R. solanacearum est suspectée et un deuxième test de dépistage doit être réalisé. Si le deuxième test de dépistage est positif, la suspicion est confirmée (apparition suspectée) et les tests suivant la procédure doivent être poursuivis. Si le deuxième test de dépistage est négatif, l'échantillon est considéré comme non contaminé par R. solanacearum. La présence confirmée visée à l'article 5, paragraphe 1er, de la Directive 98/57/CE implique l'isolement et l'identification d'une culture pure de R. solanacearum avec confirmation de la pathogénicité. SECTION Ire. - Application de la procédure de test 1. Procédure de détection pour diagnostiquer le flétrissement bactérien (Ralstonia solanacearum) sur les tubercules de pomme de terre et sur les plantes de pomme de terre et de tomate ou d'autres plantes hôtes présentant des symptômes de flétrissement bactérien La procédure de test concerne les tubercules de pomme de terre et les plantes présentant des symptômes typiques du flétrissement bactérien ou permettant de soupçonner sa présence.Elle comporte un test rapide de dépistage, l'isolement de l'agent pathogène à partir du tissu vasculaire infecté sur un milieu (sélectif) et, en cas de résultat positif, l'identification de la culture comme étant Ralstonia solanacearum. Pour la consultation du tableau, voir image 2. Procédure pour détecter et identifier Ralstonia solanacearum sur des échantillons de tubercules de pomme de terre asymptomatiques Principe La procédure de test vise à détecter des infections latentes de tubercules de pomme de terre.Un résultat positif d'au moins deux tests de dépistage (3) fondés sur des principes biologiques différents doit être complété par l'isolement de l'agent pathogène, suivi, en cas d'isolement de colonies caractéristiques, de la confirmation d'une culture pure comme étant R. solanacearum. Un résultat positif d'un seul test de dépistage n'est pas suffisant pour considérer l'échantillon comme suspect. Les tests de dépistage et les tests d'isolement doivent permettre de détecter 103 à 104 cellules/ml d'extrait concentré remis en suspension, inclus comme témoins positifs dans chaque série de tests. Pour la consultation du tableau, voir image SECTION II. - Méthodes détaillées pour détecter ralstonia solanacearum sur des tubercules de pomme de terre et des plantes de pomme de terre et de tomate ou d'autres plantes hôtes présentant des symptômes de fletrissement bacterien 1. Symptômes 1.1. Symptômes sur les pommes de terre Plante de pomme de terre. Le premier stade de l'infection dans le champ se traduit par un flétrissement des feuilles du haut de la plante à température élevée pendant la journée et un retour à l'aspect normal pendant la nuit. Au cours des premiers stades du flétrissement, les feuilles restent vertes, mais plus tard, un jaunissement et une nécrose brune se développent. L'épinastie apparaît également. Le flétrissement d'une pousse ou de plants entiers devient rapidement irréversible et se termine par l'effondrement et la mort de la plante. On peut observer un brunissement du tissu vasculaire des tiges de plantes flétries coupées transversalement, et un exsudat bactérien laiteux apparaît à la surface de la coupe ou peut en être extrait en pinçant la tige. Lorsqu'une tige coupée est placée dans l'eau verticalement, des filets de productions bactériennes s'écoulent des faisceaux vasculaires. Tubercule de pomme de terre. Les tubercules de pomme de terre doivent être coupés transversalement, près du talon (stolon) ou longitudinalement jusqu'au stolon. Le premier stade de l'infection se traduit par une coloration jaune vitreux à brun clair de l'anneau vasculaire, d'où émerge un suintement bactérien crémeux pâle spontanément après quelques minutes. Par la suite, la décoloration vasculaire devient plus nettement brune, et la nécrose s'étend parfois au tissu parenchymateux. Aux stades avancés, l'infection se propage à partir du talon et des yeux, et un liquide bactérien peut suinter, provoquant l'adhérence des particules de sol. L'épiderme des tubercules peut alors présenter des lésions brun rougeâtre légèrement concaves en raison de l'effondrement interne du tissu vasculaire. Le développement secondaire de pourritures fongiques et bactériennes est commun aux stades avancés de la maladie. 1.2. Symptômes sur les tomates Plante de tomate. Le premier symptôme visible est la flaccidité des plus jeunes feuilles. Dans des conditions favorables à l'agent pathogène (température du sol d'environ 25 ° C, humidité saturée), l'épinastie et le flétrissement d'un côté de la plante ou de l'ensemble de la plante surviennent en quelques jours et provoquent l'effondrement complet de la plante. Dans des conditions moins favorables (température du sol inférieure à 21 ° C), le flétrissement est moindre, mais un grand nombre de racines adventices peuvent se développer sur la tige. On peut observer le long de la tige des stries imbibées d'eau partant de la base de la tige, qui témoignent de la nécrose du système vasculaire. Lorsque la tige est coupée transversalement, un exsudat bactérien blanc ou jaunâtre s'écoule du tissu vasculaire brun décoloré de celle-ci. 1.3. Symptômes sur d'autres hôtes Solanum dulcamara et S. nigrum. Dans des conditions naturelles, des symptômes de flétrissement sont rarement observés sur ces hôtes adventices, sauf si les températures du sol sont supérieures à 25 ° C ou si les niveaux d'inoculum sont extrêmement élevés (par exemple : pour S. nigrum se développant dans le voisinage de plantes de pomme de terre ou de tomate malades). Lorsque le flétrissement apparaît, les symptômes sont pareils à ceux décrits pour la tomate. Les plants de S. dulcamara qui ne se flétrissent pas et se développent avec des tiges et des racines dans l'eau peuvent révéler une légère décoloration brune du tissu vasculaire sur la partie transversale de la base de la tige ou les parties sous eau de la tige. Des bactéries peuvent suinter du tissu vasculaire coupé ou constituer des filets de productions bactériennes si la tige coupée est placée verticalement dans l'eau, même en l'absence de symptômes de flétrissement. 2. Tests rapides de dépistage Des tests rapides de dépistage peuvent faciliter le diagnostic supposé, mais ne sont pas essentiels.Utiliser un ou plusieurs des tests validés suivants : 2.1. Test d'exsudation destiges (voir section VI.A.1). 2.2. Mise en évidence des granules de poly-ßâ-hydroxybutyrate (PHB) La coloration au bleu du Nil A ou au noir du Soudan B (voir section VI.A.2) de frottis fixés à la chaleur d'exsudat bactérien de tissu infecté sur une lame de microscope permet de visualiser les granules caractéristiques de PHB présents dans les cellules de R. solanacearum. 2.3. Tests de séro-agglutination (voir section VI.A.3). 2.4. Autres tests Parmi les autres tests rapides de dépistage, on peut citer le test IF (voir section VI.A.5), le test FISH (voir section VI.A.7), les tests ELISA (voir section VI.A.8) et les tests PCR (voir section VI.A.6). 3. Procédure d'isolement a) Prélever de l'exsudat ou des morceaux de tissu décoloré, soit à partir de l'anneau vasculaire du tubercule de pomme de terre, soit à partir des vaisseaux de la tige de pomme de terre, de tomate ou d'autres plantes hôtes flétries.Mettre en suspension dans un petit volume d'eau distillée stérile ou dans un tampon au phosphate 50 mM (appendice 4). Laisser reposer cinq à dix minutes. b) Préparer une série de dilutions au dixième de la suspension.c) Transférer 50-100 µl de la suspension et des dilutions sur un milieu de culture général (NA, YPGA ou SPA;voir appendice 2) et/ou sur le milieu tétrazolium de Kelman (appendice 2), et/ou sur un milieu sélectif validé (par exemple : SMSA; voir appendice 2). Etaler à l'aide d'une technique appropriée par dilution et étalement. Si cela est jugé utile, préparer des boîtes de Petri séparées avec une suspension de cellules diluées appartenant au biovar 2 de R. solanacearum comme témoin positif. d) Incuber les boîtes pendant deux à six jours à 28 ° C. - Sur le milieu nutritif général, les isolats virulents de R. solanacearum forment des colonies fluides, à bord irrégulier, plates, blanchâtres et présentant fréquemment des verticilles caractéristiques au centre. Les formes non virulentes de R. solanacearum forment de petites colonies arrondies non fluides, butyreuses, de couleur uniforme blanchâtre. - Sur le milieu tétrazolium de Kelman et sur le milieu SMSA, les verticilles sont de couleur rouge sang. Les formes non virulentes de R. solanacearum forment de petites colonies arrondies non fluides, butyreuses, de couleur uniforme rouge sombre. 4. Tests d'identification de R.solanacearum Les tests permettant de confirmer l'identification d'isolats supposés de R. solanacearum sont indiqués dans la section VI.B. SECTION III 1. Méthodes détaillées pour détecter et identifier Ralstonia solanacearum sur des échantillons de tubercules de pomme de terre asymptomatiques 1.1. Préparation de l'échantillon Remarques : - La taille de l'échantillon standard est de deux cents tubercules par test. Un échantillonnage plus intensif implique davantage de tests sur des échantillons de cette taille. Un nombre plus important de tubercules dans l'échantillon entraînera une inhibition ou une interprétation difficile des résultats. Cependant, la procédure peut être appliquée facilement à des échantillons de moins de deux cents tubercules lorsqu'un nombre moins élevé de tubercules est disponible. - La validation de toutes les méthodes de détection décrites ci-après est fondée sur la réalisation de tests sur des échantillons de deux cents tubercules. - L'extrait de pomme de terre décrit ci-dessous peut également être utilisé pour détecter la présence de la bactérie responsable du flétrissement bactérien de la pomme de terre, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Prétraitement facultatif préalable à la préparation de l'échantillon : a) Incuber les échantillons à 25-30 ° C pendant une période pouvant aller jusqu'à deux semaines avant de réaliser les tests afin d'encourager la multiplication de populations éventuelles de R. solanacearum. b) Laver les tubercules en utilisant des désinfectants (composés chlorés lorsque le test PCR doit être utilisé pour éliminer l'ADN pathogène) et des détergents appropriés entre chaque échantillon. Sécher les tubercules à l'air. Cette procédure de lavage est particulièrement utile (mais pas obligatoire) pour les échantillons comportant des particules de sol en excédent et si un test PCR ou une procédure d'isolement direct doivent être mis en oeuvre. 1.1.1. Enlever la peau de chaque tubercule au niveau du talon (stolon) au moyen d'un scalpel ou d'un couteau à légumes propre et désinfecté, de façon à faire apparaître le tissu vasculaire. Découper soigneusement un petit noyau de tissu vasculaire au niveau du talon et prélever aussi peu que possible de tissu non vasculaire. NB : Mettre de côté les tubercules (en voie de pourrissement) présentant des symptômes de "pourriture brune" suspects et les tester séparément. Si, au cours du prélèvement du noyau de talon, des symptômes suspects de flétrissement bactérien sont observés, il convient de procéder à une inspection visuelle de ce tubercule et de le couper à proximité du talon. Tout tubercule coupé présentant des symptômes suspects doit être conservé pendant au minimum deux jours à température ambiante afin de permettre une subérisation, et être entreposé réfrigéré (entre 4 et 10 ° C) dans des conditions de quarantaine appropriées. Tous les tubercules, y compris ceux qui présentent des symptômes suspects, doivent être conservés conformément à l'annexe III. 1.1.2. Rassembler les noyaux de talons dans des récipients jetables inutilisés qui peuvent être fermés et/ou scellés (s'il s'agit de récipients réutilisés, ils doivent être nettoyés et désinfectés complètement à l'aide de composés chlorés). Il est préférable de traiter immédiatement les noyaux de talons. Sinon, il convient de les entreposer dans le récipient, sans addition de tampon, pour une période de moins de 72 heures réfrigérés ou de moins de 24 heures à température ambiante. Traiter les noyaux de talons en suivant l'une des procédures ci-dessous : a) soit recouvrir les talons avec un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d'extraction (appendice 4) et les placer sur un agitateur rotatif (50-100 tours/minute) pendant 4 heures à une température inférieure à 24 ° C ou réfrigérés pendant 16 à 24 heures; ou b) homogénéiser les talons avec un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d'extraction (appendice 4) dans un mixeur (par exemple : Waring ou Ultra Thurax) ou en les broyant dans un sac de macération jetable scellé (par exemple, sac Stomacher ou de type « Bioreba strong gauge polythene » de 150 mm x 250 mm stérilisé par radiations) en utilisant un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (par exemple : Homex). NB : Le risque de contaminations croisées d'échantillons est élevé lorsque les échantillons sont homogénéisés en utilisant un mixeur. Prendre des précautions pour éviter la production d'aérosol ou des débordements pendant le processus d'extraction. Veiller à utiliser des lames de mixeur et des récipients fraîchement stérilisés pour chaque échantillon. En cas d'utilisation du test PCR, éviter le transfert d'ADN sur les récipients ou le dispositif de broyage. Le broyage dans des sacs jetables et l'utilisation de tubes jetables sont recommandés en cas de recours au test PCR 1.1.3. Décanter le liquide surnageant. S'il est excessivement trouble, le clarifier par une centrifugation à basse vitesse (à 180 g au maximum pendant dix minutes, à une température de 4 à 10 ° C) ou par une filtration sous vide (40-100 µm), en lavant le filtre avec un tampon d'extraction supplémentaire (10 ml). 1.1.4. Concentrer la fraction bactérienne par centrifugation à 7 000 g pendant quinze minutes (ou à 10 000 g pendant dix minutes) à une température de 4 à 10 ° C et jeter le surnageant sans déranger l'extrait concentré. 1.1.5. Remettre en suspension l'extrait concentré dans un tampon concentré de 1,5 ml (appendice 4). Utiliser 500 µl pour tester R. solanacearum, 500 µl pour Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus et 500 µl à des fins de référence. Ajouter du glycérol stérile à la concentration finale de 10 à 25 % (en volume) aux 500 µl de l'aliquote de référence et à l'aliquote de test restant, homogénéiser au vortex et stocker à une température de - 16 à - 24 ° C (semaines) ou de - 68 à - 86 ° C (mois). Maintenir les aliquotes de test à une température de 4 à 10 ° C pendant les tests. Une congélation et un dégel répétés ne sont pas recommandés. Si le transport de l'extrait est requis, veiller à effectuer la livraison dans une glacière dans un délai de vingt-quatre heures. 1.1.6. Il est impératif que tous les témoins positifs et les échantillons de R. solanacearum soient traités séparément afin d'éviter toute contamination, aussi bien pour les lames d'immunofluorescence que pour tous les tests. 1.2. Tests Voir le diagramme et la description des tests et des protocoles optimisés dans les appendices concernés : Isolement sélectif (voir section VI.A.4) Test IF (voir section VI.A.5) Tests PCR (voir section VI.A.6) Test FISH (voir section VI.A.7) Tests ELISA (voir section VI.A.8) Test biologique (voir section VI.A.9) 2. Méthodes détaillées pour détecter et identifier R.solanacearum dans des échantillons de plantes de pomme de terre et de tomate ou d'autres plantes hôtes asymptomatiques 2.1. Préparation de l'échantillon NB : Pour détecter des populations latentes de R. solanacearum, il est conseillé de tester des échantillons composites. La procédure peut facilement être appliquée à des échantillons composites comportant jusqu'à deux cents morceaux de tiges. Lorsque des recherches sont réalisées, elles doivent être fondées sur un échantillon statistiquement représentatif de la population végétale considérée. 2.1.1. Collecter des segments de tiges de 1 à 2 cm dans un récipient stérile fermé suivant les procédures de prélèvement suivantes Plantules de tomate de pépinière : enlever au moyen d'un couteau propre et désinfecté un segment de 1 cm à la base de chaque tige, juste au-dessus du niveau du sol. Plantes de tomate cultivées en serre ou en plein champ : enlever au moyen d'un couteau propre et désinfecté la pousse latérale la plus basse de chaque plante en coupant juste au-dessus de la jonction avec la tige principale. Enlever le segment de 1 cm le plus bas de chaque pousse latérale. Autres hôtes : enlever au moyen d'un couteau ou d'un sécateur propre et désinfecté un segment de 1 cm à la base de chaque tige, juste au-dessus du niveau du sol. Dans le cas de S. dulcamara ou d'autres plantes hôtes poussant dans l'eau, enlever des morceaux de 1 à 2 cm des tiges se trouvant sous l'eau ou des stolons ayant des racines aquatiques. En cas de prélèvement dans un lieu particulier, il est recommandé de tester un échantillon statistiquement représentatif d'au moins dix plants par point de prélèvement de chaque adventice hôte potentiel. La détection de l'agent pathogène sera le plus fiable à la fin du printemps, en été et en automne, bien que des infections naturelles puissent être détectées tout au long de l'année dans les Solanum dulcamara pérennantes poussant dans les cours d'eau. Parmi les hôtes connus figurent les plants de pommes de terre spontanés (repousses), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium et d'autres membres de la famille des solanacées. Pelargonium spp. et Portulaca oleracea sont également des hôtes. Parmi certaines adventices spp. européennes qui peuvent abriter des populations du biovar 2, race 3 de R. solanacearum dans les racines et/ou les rhizosphères dans des conditions environnementales spécifiques, on peut citer Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra et Urtica dioica. NB : Un examen visuel des symptômes internes (coloration vasculaire ou exsudat bactérien) peut être effectué à ce stade. Mettre de côté tout segment de tige présentant des symptômes et le tester séparément (voir section II). 2.1.2. Désinfecter brièvement les segments avec de l'éthanol à 70 % et les sécher immédiatement avec du papier absorbant. Ensuite, traiter les segments de tiges en suivant l'une des procédures ci-dessous : a) soit recouvrir les segments avec un volume suffisant (environ 40 ml) de tampon d'extraction (appendice 4) et les placer sur un agitateur rotatif (50-100 tours/minute) pendant 4 heures à une température inférieure à 24 ° C ou pendant 16 à 24 heures réfrigérés; ou b) traiter immédiatement les segments en les broyant dans un sac de macération résistant (par exemple : Stomacher ou Bioreba) avec un volume approprié de tampon d'extraction (appendice 4) en utilisant un maillet en caoutchouc ou un dispositif de broyage approprié (par exemple : Homex).Si ce n'est pas possible, stocker les segments, pas plus de 72 heures réfrigérés ou de 24 heures à température ambiante. 2.1.3. Décanter le surnageant après sédimentation pendant quinze minutes. 2.1.4. Une nouvelle clarification de l'extrait ou du concentré de la fraction bactérienne n'est habituellement pas requise, mais peut être réalisée par filtration et/ou centrifugation selon la méthode décrite dans la section III.1.1.3 à 1.1.5. 2.1.5. Diviser l'extrait d'échantillon initial ou concentré en deux parties égales. Maintenir une moitié à une température de 4 à 10 ° C au cours du test et entreposer l'autre moitié avec 10 à 25 % (en volume) de glycérol stérile à une température de - 16 à - 24 ° C (semaines) ou de - 68 à - 86 ° C (mois) si un test supplémentaire est requis. 2.2. Tests Voir le diagramme et la description des tests et les protocoles optimisés dans les appendices concernés : Isolement sélectif (voir section VI.A.4) Test IF (voir section VI.A.5) Tests PCR (voir section VI.A.6) Test FISH (voir section VI.A.7) Tests ELISA (voir section VI.A.8) Test biologique (voir section VI.A.9) SECTION IV 1. Procédure pour détecter et identifier R.solanacearum dans l'eau Pour la consultation du tableau, voir image 2. Méthodes pour détecter et identifier R.solanacearum dans l'eau Principe La procédure de détection validée décrite dans la présente section est applicable pour la détection de l'agent pathogène dans les échantillons d'eaux de surface et peut également être utilisée pour tester les échantillons d'effluents issus de la transformation de pommes de terre ou d'effluents d'eaux usées. Cependant, il importe de noter que la sensibilité prévue de la détection variera avec le substrat. La sensibilité du test d'isolement est perturbée par des populations de bactéries saprophytes concurrentes qui sont généralement beaucoup plus importantes dans les effluents issus de la transformation de pommes de terre et les effluents d'eaux usées que dans les eaux de surface. Alors que la procédure ci-après ne doit détecter que 103 cellules/l dans les eaux de surface, la sensibilité de la détection dans les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d'eaux usées est susceptible d'être considérablement plus faible. Pour cette raison, il est recommandé de tester les effluents après les traitements de purification éventuels (par exemple : sédimentation ou filtration) au cours desquels les populations de bactéries saprophytes sont réduites. Les limitations de la sensibilité de la procédure de test doivent être envisagées lors de l'évaluation de la fiabilité des résultats négatifs obtenus, le cas échéant. Tandis que cette procédure a été couronnée de succès lors de son utilisation dans des études visant à déterminer la présence ou l'absence de l'agent pathogène dans les eaux de surface, ses limitations doivent être prises en considération lorsqu'elle est utilisée dans des travaux semblables concernant les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d'eaux usées. 2.1. Préparation de l'échantillon Remarques : - La détection de R. solanacearum dans les eaux de surface est plus fiable à la fin du printemps, en été et en automne, lorsque la température de l'eau est supérieure à 15 ° C. - Le fait de recommencer le prélèvement à des moments différents au cours de la période susmentionnée dans des points de prélèvement désignés augmentera la fiabilité de la détection en réduisant les conséquences des variations climatiques. - Tenir compte des conséquences de pluies abondantes et de la géographie du cours d'eau afin d'éviter des effets de dilution importants qui peuvent occulter la présence de l'agent pathogène. - Prélever des échantillons d'eaux de surface à proximité de plantes hôtes si ces plantes hôtes sont présentes. 2.1.1. Dans des points de prélèvement sélectionnés, collecter des échantillons d'eau en remplissant des tubes ou des bouteilles stériles jetables à une profondeur si possible supérieure à 30 cm et à une distance maximale de 2 m de la berge. Pour les effluents issus de la transformation de pommes de terre ou les effluents d'eaux usées, collecter des échantillons au point de rejet des effluents. La taille des échantillons recommandée va jusqu'à 500 ml par point de prélèvement. Si la préférence est donnée à des échantillons plus modestes, il est conseillé de prélever des échantillons au moins à trois reprises par point de prélèvement, chaque échantillon consistant en deux sous-échantillons répliqués d'au moins 30 ml. Pour une étude intensive, sélectionner au minimum trois points de prélèvement pour 3 km de cours d'eau et veiller à ce que les affluents du cours d'eau fassent également l'objet d'un prélèvement. 2.1.2. Transporter les échantillons dans des conditions d'obscurité et à basse température (4-10° C) et tester dans un délai de vingt-quatre heures 2.1.3. Au besoin, la fraction bactérienne peut être concentrée par l'une des méthodes suivantes : a) Centrifuger 30-50 ml de sous-échantillons à 10 000 g pendant dix minutes (ou à 7 000 g pendant quinze minutes), de préférence à une température de 4 à 10 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension l'extrait concentré dans un tampon concentré de 1 ml (appendice 4).b) Filtration sur membrane (dimension minimale des pores de 0,45 ~m) suivie du lavage du filtre dans 5-10 ml de tampon concentré et rétention des solutions de lavage.Cette méthode convient à de grands volumes d'eau contenant un petit nombre de saprophytes. La concentration n'est généralement pas recommandée pour les échantillons d'effluents issus de la transformation de pommes de terre ou d'effluents d'eaux usées, étant donné que des populations plus importantes de bactéries saprophytes concurrentes auront un effet inhibiteur sur la détection de R. solanacearum. 2.2. Tests Voir le diagramme et la description des tests dans les appendices concernés. SECTION V 1. Procédure pour détecter et identifier R.solanacearum dans le sol Pour la consultation du tableau, voir image 2. Méthodes pour détecter et identifier R.solanacearum dans le sol Principes La procédure de détection validée décrite dans la présente section est applicable pour la détection de l'agent pathogène dans des échantillons de sol, mais peut également être utilisée pour tester les échantillons de déchets solides issus de la transformation de pommes de terre ou de boues d'épuration. Cependant, il convient de noter que ces méthodes ne sont pas assez sensibles pour garantir la détection de populations faibles et/ou inégalement dispersées de R. solanacearum pouvant apparaître dans des échantillons naturellement contaminés de ces substrats. Les limitations de la sensibilité de cette procédure de test doivent être envisagées lors de l'évaluation de la fiabilité de résultats négatifs obtenus et également lors de son utilisation dans des études visant à déterminer la présence ou l'absence de l'agent pathogène dans les sols ou les boues. Le test le plus fiable de détection de la présence de l'agent pathogène dans le sol d'un champ est de planter un hôte sensible et de surveiller son infection éventuelle, mais même avec cette méthode, de faibles degrés de contamination échapperont à la détection. 2.1. Préparation de l'échantillon 2.1.1. Le prélèvement de sol du champ doit suivre les normes fondamentales utilisées pour le prélèvement de nématodes. Collecter de 0,5 à 1 kg de sol par échantillon dans soixante sites pour 0,3 ha à une profondeur de 10 à 20 cm (ou dans un tamis de 7 X 7 mètres). Si l'on soupçonne la présence de l'agent pathogène, accroître le nombre de points de collecte à 120 pour 0,3 ha. Maintenir les échantillons à une température de 12 à 15 ° C avant le test. Prélever les boues issues de la transformation de pommes de terre et les boues d'épuration en collectant au total 1 kg dans des sites représentant le volume total de boues à tester. Bien mélanger chaque échantillon avant le test. 2.1.2. Disperser les sous-échantillons de 10 à 25 g de sol ou de boue avec un agitateur rotatif (250 tours/minute) dans un tampon d'extraction de 60 à 150 ml (appendice 4) pendant deux heures au maximum. Au besoin, l'ajout de 0,02 % de Tween-20 stérile et de 10 à 20 g de gravier stérile peut favoriser la dispersion. 2.1.3. Maintenir la suspension à 4 ° C pendant le test. 2.2. Tests Voir le diagramme et la description des tests dans les appendices concernés. SECTION VI. - Protocoles optimisés pour détecter et identifier R. solanacearum A. DIAGNOSTIC ET TESTS DE DETECTION 1. Test d'exsudation des tiges La présence de R.solanacearum dans des tiges de pommes de terre, de tomates ou d'autres plantes hôtes flétries peut être mise en évidence en procédant au simple test de présomption suivant : sectionner la tige juste au-dessus du sol. Suspendre l'extrémité sectionnée dans un tube d'eau propre. Observer l'écoulement spontané et caractéristique de filets de productions bactériennes des faisceaux vasculaires coupés après quelques minutes. 2. Mise en évidence des granules de poly-B-hydroxybutyrate 1.Préparer, sur une lame de microscope, un frottis à partir de l'exsudat bactérien du tissu infecté ou préparer un frottis à partir d'une culture de 48 heures sur gélose au levure-peptone-glucose (YPGA) ou à la peptone (SPA) (appendice 2). 2. Préparer des frottis témoins positifs obtenus avec une souche du biovar 2 de R.solanacearum et, si cela est jugé utile, un frottis témoin négatif d'un PHB négatif connu. 3. Laisser sécher et passer rapidement le côté inférieur de chaque lame dans une flamme jusqu'à ce que le frottis soit fixé.4. Colorer la préparation au bleu du Nil ou au noir du Soudan et observer au microscope de la manière décrite ci-après. Test au bleu du Nil a) Recouvrir chaque lame d'une solution aqueuse à 1 % de bleu du Nil A.Incuber dix minutes à 55 ° C. b) Egoutter la solution colorante.Laver rapidement sous un filet d'eau courante. Enlever l'eau excédentaire avec du papier absorbant. c) Recouvrir le frottis dans une solution aqueuse d'acide acétique à 8 % et incuber une minute à température ambiante.d) Laver rapidement sous un filet d'eau courante.Enlever l'eau excédentaire avec du papier absorbant. e) Réhumecter en déposant une goutte d'eau et recouvrir d'une lamelle.f) Examiner le frottis coloré au microscope à épifluorescence sous un film d'huile de 450 nm, à un grossissement de 600 à 1 000, en utilisant un objectif à immersion dans l'huile ou dans l'eau.g) Observer la fluorescence orange vif des granules de PHB.Faire également des observations en lumière normale afin de vérifier le caractère intracellulaire des granules; vérifier que la morphologie des cellules est caractéristique de R. solanacearum. Test au noir du Soudan a) Recouvrir chaque lame avec une solution de noir du Soudan B à 0,3 % dans de l'éthanol à 70 % et incuber dix minutes à température ambiante.b) Egoutter la solution colorante et laver rapidement à l'eau courante, enlever l'eau excédentaire avec du papier absorbant.c) Plonger rapidement les lames dans du xylol et sécher avec du papier absorbant.Attention, le xylol est un produit dangereux; prendre les précautions nécessaires et travailler sous une hotte de chimiste. d) Recouvrir les lames dans une solution aqueuse de safranine à 0,5 % et laisser dix secondes à température ambiante.Attention, la safranine est un produit dangereux; prendre les précautions nécessaires et travailler sous une hotte de chimiste. e) Laver sous un filet d'eau courante, sécher avec du papier absorbant et recouvrir d'une lamelle.f) Examiner le frottis coloré au microscope à immersion sous un film d'huile, à un grossissement de 1 000, sous lumière transmise normale en utilisant un objectif à immersion dans l'huile.g) Observer la coloration bleu noir des granules de PHB dans les cellules de R.solanacearum; les parois des cellules sont colorées en rose. 3. Tests de séro-agglutination L'agglutination des cellules de R.solanacearum sur l'exsudat bactérien ou les extraits de tissus symptomatiques s'observe le mieux en utilisant des anticorps validés (voir appendice 3) étiquetés par des marqueurs colorés appropriés tels que les cellules de Staphylococcus aureus rouge ou des particules de latex colorées. En cas d'utilisation d'un matériel disponible dans le commerce (voir appendice 3), suivre les instructions des producteurs. Sinon, suivre la procédure suivante : a) Mélanger les gouttes d'une suspension d'anticorps et d'exsudat bactérien marqués (environ 5 E l dans chaque cas) sur les fenêtres de lames de test multipuits.b) Préparer des témoins positifs et négatifs en utilisant des suspensions de biovar 2 de R.solanacearum et une souche hétérologue. c) Observer l'agglutination dans les échantillons positifs après avoir mélangé doucement pendant quinze secondes. 4. Isolement sélectif 4.1. Etalement sur milieu sélectif NB : Avant d'utiliser cette méthode pour la première fois, réaliser des tests préliminaires pour garantir une détection reproductible des 103 à 104 unités formant des colonies de R. solanacearum par ml ajouté aux extraits des échantillons dont les tests antérieurs étaient négatifs. Utiliser un milieu sélectif validé approprié, par exemple : SMSA (modifié par Elphinstone et al., 1996; voir appendice 2). Il faut veiller également à différencier R. solanacearum des autres bactéries susceptibles de développer des colonies sur le milieu. En outre, les colonies de R. solanacearum peuvent présenter une morphologie atypique si les boîtes sont surpeuplées ou si des bactéries antagonistes sont également présentes. Lorsque l'on suspecte des effets de concurrence ou d'antagonisme, l'échantillon doit faire l'objet d'un nouveau test en utilisant un test différent. La plus grande sensibilité de détection par cette méthode peut être attendue lorsqu'on utilise des extraits d'échantillons fraîchement préparés. Cependant, la méthode est également applicable pour une utilisation avec des extraits qui ont été stockés sous du glycérol entre - 68 et - 86 ° C. Comme témoins positifs, préparer des dilutions au dixième d'une suspension de 106 ufc/ml d'une souche virulente de biovar 2 de R. solanacearum (par exemple : NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pour éviter toute possibilité de contamination, préparer des témoins positifs de manière totalement séparée des échantillons à tester. Pour chaque lot nouvellement préparé de milieu sélectif, il y a lieu de tester s'il convient pour la croissance de l'agent pathogène avant de l'utiliser pour tester des échantillons de routine. Tester le matériel de contrôle de la même façon que les échantillons. 4.1.1. Effectuer le test avec une technique appropriée par dilution et étalement visant à garantir la dilution de toute population formant des colonies de saprophytes. Etaler 50-100 NE l par boîte d'extrait d'échantillon et chaque dilution. 4.1.2. Incuber les boîtes à 28 ° C. Relever les observations après 48 heures et ensuite quotidiennement pendant une durée allant jusqu'à six jours. Les colonies caractéristiques de R. solanacearum sur le milieu nutritif SMSA sont de couleur blanc laiteux, plates, irrégulières et fluides, et après trois jours d'incubation prennent une coloration rose à rouge sang au centre, présentant des stries internes ou des verticilles . NB : Des colonies atypiques de R. solanacearum se constituent parfois sur ce milieu. Elles peuvent être petites, entièrement rouges et non fluides ou seulement partiellement fluides et donc difficiles à distinguer des bactéries saprophytes formant des colonies. 4.1.3. Purifier les colonies supposées de R. solanacearum après étalement ou dilution et étalement sur un milieu nutritif général pour obtenir des colonies isolées (voir appendice 2). 4.1.4. Les cultures peuvent être stockées à court terme dans de l'eau stérile (pH 6-8, sans chlore) à température ambiante et dans l'obscurité ou à long terme dans un milieu cryoprotecteur approprié entre - 68 et - 86 ° C ou lyophilisées. 4.1.5. Identifier les cultures supposées (voir section VI.B) et réaliser un test de pathogénicité (voir section VI.C). Interprétation des résultats du test de dilution-étalement Le test de dilution-étalement est négatif si aucune colonie bactérienne n'est apparue au bout de six jours ou si aucune colonie caractéristique de R. solanacearum n'est isolée, sous réserve qu'aucune inhibition ne soit soupçonnée en raison de la concurrence ou de l'antagonisme d'autres bactéries et que des colonies caractéristiques de R. solanacearum soient isolées à partir des témoins positifs. Le test de dilution-étalement est positif si l'on peut isoler des colonies supposées de R. solanacearum. 4.2. Procédure d`enrichissement Utiliser un milieu d'enrichissement validé tel que le bouillon nutritif modifié de Wilbrink (voir appendice 2). Cette procédure peut être utilisée pour accroître sélectivement les populations de R. solanacearum dans des extraits d'échantillons et améliorer la sensibilité de détection. La procédure permet également la dilution des inhibiteurs de la réaction PCR (1:100). Il convient cependant de noter que l'enrichissement de R. solanacearum peut échouer en raison de la concurrence ou de l'antagonisme d'organismes saprophytes qui sont souvent enrichis simultanément. Par conséquent, l'isolement de R. solanacearum dans des bouillons de culture enrichis peut se révéler difficile. En outre, comme les populations de saprophytes sérologiquement proches peuvent être augmentées, l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques en lieu et place d'anticorps polyclonaux est recommandée en cas d'utilisation du test ELISA. 4.2.1. Pour l'enrichissement PCR, verser 100 NE l d'extrait d'échantillon dans 10 ml de milieu nutritif liquide d'enrichissement (appendice 2) précédemment aliquoté dans des tubes ou des flacons exempts d'ADN. Pour l'enrichissement ELISA, des proportions plus importantes de milieu nutritif liquide peuvent être utilisées (par exemple : 100 NE l dans 1,0 ml de milieu nutritif liquide d'enrichissement). 4.2.2. Incuber pendant soixante-douze heures entre 27 et 30 ° C dans une culture agitée ou statique sans refermer hermétiquement les bouchons pour permettre l'aération. 4.2.3. Bien mélanger avant d'utiliser pour des tests ELISA ou PCR. 4.2.4. Traiter le milieu nutritif liquide d'enrichissement de la même manière que les échantillons dans les tests ci-dessus. NB : Si une inhibition ou un enrichissement de R. solanacearum est prévu en raison de populations importantes de certaines bactéries saprophytes concurrentes, l'enrichissement d'extraits d'échantillons avant toute centrifugation ou autres actions de concentration peut donner de meilleurs résultats. 5. Test d'immunofluorescence Principe Compte tenu de sa capacité reconnue à atteindre les seuils requis, il est recommandé d'utiliser le test d'immunofluorescence comme principal test de dépistage. Si le test d'immunofluorescence est utilisé comme principal test de dépistage et qu'il produit un résultat positif, il y a lieu de pratiquer un test d'isolement, un test PCR ou un test FISH à titre de test secondaire. Si le test d'immunofluorescence est utilisé comme test secondaire et qu'il produit un résultat positif, l'analyse doit être complétée par des tests supplémentaires comme indiqué dans le diagramme fonctionnel. NB : Utiliser une source validée d'anticorps de R. solanacearum. Il est recommandé de déterminer le titre pour chaque nouveau lot d'anticorps. Le titre est défini comme la plus haute dilution à laquelle on obtient une réaction optimale lorsqu'on teste une suspension contenant entre 105 et 106 cellules/ml d'une souche homologue de R. solanacearum en utilisant un conjugué approprié d'isothiocyanate de fluorescéine (F …