Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen Yabuuchi et al.)

26 JANUARI 2014. - Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet. Gelet op de Grondwet, artikel 108; Gelet op de wet van 2 april 1971Relevante gevonden documenten type wet prom. 02/04/1971 pub. 07/12/2010 numac 2010000674 bron federale overheidsdienst binnenlandse zaken Wet betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. - Officieuze coördinatie in het Duits sluiten betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen, artikel 2, § 1, 1, 4, 5 en 8, gewijzigd bij de wet van 5 februari 1999 en bij het koninklijk besluit van 22 februari 2001 en § 2, gewijzigd bij de wet van 27 december 2004; Gelet op de wet van 4 februari 2000Relevante gevonden documenten type wet prom. 04/02/2000 pub. 18/02/2000 numac 2000022108 bron ministerie van sociale zaken, volksgezondheid en leefmilieu Wet houdende oprichting van het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen sluiten houdende oprichting van het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen, artikel 4, §§ 1 en 2, § 3, gewijzigd bij de wet van 22 december 2003, en artikel 5, tweede lid, 7°, gewijzigd bij de wet van 22 december 2003; Gelet op het ministerieel besluit van 30 augustus 1999Relevante gevonden documenten type ministerieel besluit prom. 30/08/1999 pub. 19/10/1999 numac 1999016303 bron ministerie van middenstand en landbouw Ministerieel besluit betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al sluiten betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.; Gelet op het ministerieel besluit van 14 februari 2000Relevante gevonden documenten type ministerieel besluit prom. 14/02/2000 pub. 02/03/2000 numac 2000016049 bron ministerie van middenstand en landbouw Ministerieel besluit tot vaststelling van maatregelen om te beletten dat Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al. zich verspreidt sluiten tot vaststelling van maatregelen om te beletten dat Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. zich verspreidt; Gelet op het overleg tussen de gewestregeringen en de federale overheid van 23 mei 2013; Gelet op het voorafgaand onderzoek met betrekking tot de noodzaak om een duurzame ontwikkelingseffectbeoordeling uit te voeren zoals bepaald in artikel 19/1 van de wet van 5 mei 1997Relevante gevonden documenten type wet prom. 05/05/1997 pub. 18/06/1997 numac 1997021155 bron diensten van de eerste minister 5 MEI 1997 Wet betreffende de coördinatie van het federale beleid inzake duurzame ontwikkeling sluiten betreffende de coördinatie van het federale beleid inzake duurzame ontwikkeling, waaruit blijkt dat een effectbeoordeling in dit geval niet vereist is aangezien dit besluit de omzetting is van een richtlijn van de Europese Unie bedoeld in artikel 2, 3° van het koninklijk besluit van 20 september 2012 tot uitvoering van artikel 19/1, § 1; Gelet op het advies 54.368/1 van de Raad van State, gegeven op 25 november 2013, bij toepassing van art. 84, § 1, eerste lid, 1°, van de wetten op de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973, Op voordracht van de Minister van Landbouw, Hebben Wij besloten en besluiten Wij : HOOFDSTUK 1. - Omzetting Artikel 1.Dit besluit is de gedeeltelijke omzetting van richtlijn 98/57/EG van de Raad van 20 juli 1998 betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. HOOFDSTUK 2. - Definities Art. 2.Voor de toepassing van dit besluit wordt verstaan onder : a) "het Agentschap" : het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen; b) "het organisme" : de voor bruinrot verantwoordelijke ziekteverwekker Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., vroeger bekend als Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; c) "het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal" : de in bijlage I, deel I, bij dit besluit vermelde waardplanten van het organisme;d) "het koninklijk besluit van 10 augustus 2005Relevante gevonden documenten type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/08/2005 numac 2005022636 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu en federaal agentschap voor de veiligheid van de voedselketen Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/05/2016 numac 2016000333 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. - Officieuze coördinatie in het Duits sluiten" : het koninklijk besluit van 10 augustus 2005Relevante gevonden documenten type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/08/2005 numac 2005022636 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu en federaal agentschap voor de veiligheid van de voedselketen Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/05/2016 numac 2016000333 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. - Officieuze coördinatie in het Duits sluiten betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. HOOFDSTUK 3. - Toezicht Art. 3.§ 1. Het Agentschap verricht ieder jaar systematisch officiële onderzoeken voor het opsporen van het organisme op het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat afkomstig is van het Belgische grondgebied. Met het oog op de identificatie van mogelijke andere besmettingsbronnen die een bedreiging vormen voor de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, voert het Agentschap in de productiegebieden van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal een risicobeoordeling uit en, als daaruit een risico op verspreiding van het organisme naar voren komt, voert het gerichte officiële onderzoeken uit naar het organisme op andere planten dan het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, inclusief in het wild voorkomende waardplanten van de nachtschadefamilie, alsmede zowel in het oppervlaktewater dat wordt gebruikt voor beregening of bespuiting van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, als in het afvalwater dat wordt geloosd door industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven die in de lijst opgenomen plantaardig materiaal behandelen en dat wordt gebruikt voor beregening of bespuiting van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal. De omvang van die gerichte onderzoeken wordt aan de hand van het vastgestelde risico bepaald. Het Agentschap kan eveneens officiële onderzoeken doen ter opsporing van het organisme op ander materiaal, zoals groeimedium, grond en vast afval van industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven. § 2. De in paragraaf 1 bedoelde officiële onderzoeken worden als volgt uitgevoerd : a) voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, volgens de in bijlage I, deel II vermelde criteria;b) voor andere waardplanten dan het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en voor water, inclusief afvalwater, overeenkomstig daartoe geëigende methoden, waarbij, in voorkomend geval, monsters worden genomen waarop tests worden gedaan in officiële laboratoria of onder officieel toezicht;c) waar nodig, voor ander materiaal : overeenkomstig de daartoe geëigende methoden. Op basis van gefundeerde wetenschappelijke en statistische beginselen en van de biologische kenmerken van het organisme en rekening houdend met de bijzondere productiesystemen voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en, desgevallend, voor andere waardplanten van het organisme, legt het Agentschap de te volgen inspectieprocedures vast alsook waar, op welk tijdstip en hoeveel monsters moeten worden genomen en de samenstelling van de steekproef. HOOFDSTUK 4. - Vermoeden van besmetting Art. 4.§ 1. Bij elke vermoede aanwezigheid van het organisme voor het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal ziet het Agentschap toe op de volledige afwikkeling van officiële of onder officieel toezicht verrichte laboratoriumtests volgens de in bijlage II beschreven relevante methode en conform de voorwaarden beschreven in bijlage III, punt 1 of, in alle andere gevallen volgens om het even welke andere officieel erkende methode met als doel die aanwezigheid te bevestigen of te ontkennen. Als de aanwezigheid van het organisme wordt bevestigd, zijn de bepalingen van bijlage III, punt 2, van toepassing. § 2. In afwachting van de bevestiging of de ontkenning van de in paragraaf 1 bedoelde vermoede aanwezigheid : a) is het verkeer van planten en knollen van alle gewassen, partijen of zendingen waarvan de monsters zijn genomen, verboden, tenzij onder toezicht van het Agentschap en op voorwaarde dat vaststaat dat er geen aanwijsbaar risico is dat het organisme zich kan verspreiden;b) treft het Agentschap de maatregelen die nodig zijn om de oorsprong van de vermoede aanwezigheid van het organisme te achterhalen;c) stelt het Agentschap, met name voor de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal en het verkeer van andere pootaardappelpartijen dan die bedoeld in a), die geteeld zijn op de productieplaats waar de in a) bedoelde monsters werden genomen, passende aanvullende, op de geraamde risicograad gesteunde voorzorgsmaatregelen in om elke verspreiding van het organisme te voorkomen. Het vorige lid is alleen van toepassing telkens wanneer a) diagnostische visuele symptomen zijn vastgesteld die de aanwezigheid doen veronderstellen van de door het organisme veroorzaakte ziekte alsook een positieve reactie op de in bijlage II, deel I, punt 1, en deel II nader omschreven snelle opsporingstest(s), of b) een positieve reactie werd vastgesteld op de in bijlage II, deel I, punt 2, en deel III nader omschreven opsporingstest(s). § 3. Indien bij vermoede aanwezigheid van het organisme een risico bestaat voor besmetting van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal of het oppervlaktewater vanuit of naar een andere lidstaat, stelt het Agentschap de andere betrokken lidstaat of lidstaten onverwijld en al naargelang van het vastgestelde risico in kennis van de gegevens met betrekking tot die vermoede aanwezigheid. HOOFDSTUK 5. - Bevestiging van de besmetting Art. 5.§ 1. Wanneer de officiële of onder officieel toezicht verrichte laboratoriumtests waarbij de in bijlage II beschreven relevante methode of, in alle overige gevallen, enige andere officieel erkende methode werd toegepast, de aanwezigheid van het organisme in het overeenkomstig dit besluit genomen monster bevestigen : a) als het gaat om in de lijst opgenomen plantaardig materiaal : i) stelt het Agentschap een onderzoek in om de omvang en de primaire bron(nen) van de besmetting te bepalen, overeenkomstig het bepaalde in bijlage IV en aan de hand van bijkomende tests overeenkomstig artikel 4, § 1, op ten minste alle voorraden van klonaal verwante pootaardappelen, en ii) verklaart het Agentschap besmet : 1° het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, de zending en/of de partij waarvan het monster is genomen, alsmede de machines, het voertuig, de container, de opslagplaats of delen daarvan, en enig ander voorwerp, inclusief de verpakkingen die in contact zijn geweest met het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal waarvan het monster werd genomen;2° indien van toepassing, het veld (de velden), de productie-eenheid (-eenheden) voor beschutte teelt en de productieplaats(en) waar het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal werd geoogst en waarvan het monster werd genomen;3° en voor de tijdens de groei genomen monsters, het(de) veld(en), de productieplaats(en) en, in voorkomend geval, de productie-eenheid (-eenheden) voor beschutte teelt waar het monster werd genomen, en iii) bepaalt het Agentschap, overeenkomstig het bepaalde in bijlage V, punt 1, de omvang van de waarschijnlijke besmetting hetzij door contact voor of na de oogst met besmet verklaarde elementen hetzij door verbanden met deze doorheen het productie-, beregenings- of bespuitingssysteem, hetzij door klonale verwantschap, en iv) bakent het Agentschap een zone af op basis van de in ii) bedoelde besmetverklaring, de in iii) bedoelde bepaling van de omvang van de waarschijnlijke besmetting en de mogelijke verspreiding van het organisme, overeenkomstig het bepaalde in bijlage V, punt 2, onder i);b) voor teelten van andere dan de in a) vermelde waardplanten en als de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal is geïdentificeerd als vatbaar voor een risico : i) stelt het Agentschap een onderzoek in overeenkomstig punt a), i), en ii) verklaart het Agentschap de waardplanten van het organisme, waarvan het monster werd genomen, besmet, en iii) bepaalt het Agentschap de omvang van de waarschijnlijke besmetting en bakent het een zone af overeenkomstig respectievelijk punt a), iii) en a) iv) ten aanzien van de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal;c) voor oppervlaktewater (inclusief de vloeibare effluenten van industriële verwerkings- of verpakkingsbedrijven die in de lijst opgenomen plantaardig materiaal behandelen) en daarbij horende in het wild groeiende waardplanten van de nachtschadefamilie en wanneer de productie van het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal is geïdentificeerd als vatbaar voor een risico door hetzij beregening, hetzij bespuiting of overstroming met oppervlaktewater : i) stelt het Agentschap een onderzoek in met inbegrip van een officieel onderzoek, op de daartoe geschikte tijdstippen, van monsters van oppervlaktewater en van eventueel aanwezige in het wild groeiende waardplanten van de nachtschadefamilie om de omvang van de besmetting te bepalen, en ii) verklaart het Agentschap, voor zover nodig en op grond van het in punt i) bedoelde onderzoek, het oppervlaktewater waarvan het monster is of de monsters zijn genomen, besmet, en iii) bepaalt het Agentschap de omvang van de waarschijnlijke besmetting op basis van de in ii) bedoelde besmetverklaring en de mogelijke verspreiding van het organisme, rekening houdend met het bepaalde in bijlage V, punt 1 en punt 2, ii). Voor de toepassing van a), b) en c) houdt het Agentschap rekening met gefundeerde wetenschappelijke beginselen, de biologische kenmerken van het organisme en de gebruikelijke bijzondere systemen voor de productie, het in de handel brengen en de verwerking van de waardplanten van het organisme. § 2. De Minister bakent de gebieden af op basis van de in paragraaf 1, c), bedoelde bepaling van de omvang van de besmetting. § 3. In aansluiting op de kennisgeving door een andere lidstaat, overeenkomstig de bepalingen van artikel 5, lid 2, van de voornoemde richtlijn 98/57/EG van de Raad van 20 juli 1998, van een besmetting waarbij België is betrokken gaat het Agentschap over tot een onderzoek, conform paragraaf 1, a) i) en, waar nodig, paragraaf 1, c) i) en onderneemt het Agentschap elke gepaste bijkomende actie overeenkomstig paragraaf 1. HOOFDSTUK 6. - Bijzondere bestrijdingsmaatregelen Art. 6.§ 1. Het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal, dat conform artikel 5, § 1, a), ii), besmet is verklaard, mag niet worden geplant en wordt onder toezicht van het Agentschap onderworpen aan één van de in bijlage VI, punt 1, vermelde bepalingen, zodat vast komt te staan dat er geen aanwijsbaar risico bestaat voor verspreiding van het organisme. § 2. Het in de lijst opgenomen plantaardig materiaal dat conform artikel 5, § 1, a), iii), en c), iii) waarschijnlijk besmet is verklaard, met inbegrip van het in de lijst opgenomen materiaal waarvoor een risico is vastgesteld, dat is geproduceerd op productieplaatsen die waarschijnlijk besmet zijn verklaard conform artikel 5, § 1, a), iii), mag niet worden geplant en wordt onder toezicht van het Agentschap gebruikt of verwijderd op de in bijlage VI, punt 2, aangegeven adequate wijze zodat vast komt te staan dat er geen aanwijsbaar risico bestaat voor verspreiding van het organisme. § 3. Machines, voertuigen, recipiënten, opslagplaatsen of delen daarvan, en elk ander voorwerp, met inbegrip van verpakkingen, die conform artikel 5, § 1, a), ii), besmet zijn verklaard of die conform artikel 5, § 1, punt a), iii), en c), iii), waarschijnlijk besmet zijn verklaard, moeten volgens de in bijlage VI, punt 3, nader omschreven adequate methoden worden vernietigd of ontsmet. Die voorwerpen worden na ontsmetting niet langer als besmet beschouwd. § 4. Onverminderd de krachtens paragrafen 1, 2 en 3 genomen maatregelen, worden in de overeenkomstig artikel 5, § 1, a), iv), afgebakende zone diverse maatregelen toegepast, omschreven in bijlage VI, punten 4.1 en 4.2. en in bijlage VII. § 5. Onverminderd de krachtens paragrafen 1, 2 en 3 genomen maatregelen worden de in bijlage VI, punt 4.2 en in bijlage VII nader omschreven maatregelen toegepast in de conform artikel 5, § 2, afgebakende zone. § 6. Om elk aanwijsbaar risico van verspreiding van het organisme te voorkomen, gebeurt de verwijdering van afval met inachtneming van de voorwaarden die zijn vastgelegd in bijlage VII bij de voornoemde richtlijn 98/57/EG van de Raad van 20 juli 1998. HOOFDSTUK 7. - Teeltmateriaal Art. 7.§ 1 Onverminderd hetgeen is bepaald in het koninklijk besluit van 10 augustus 2005Relevante gevonden documenten type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/08/2005 numac 2005022636 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu en federaal agentschap voor de veiligheid van de voedselketen Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/05/2016 numac 2016000333 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. - Officieuze coördinatie in het Duits sluiten moeten pootaardappelen in rechte lijn afstammen van materiaal dat werd verkregen in het kader van een officieel goedgekeurd programma en dat vrij van het organisme werd verklaard in aansluiting op volgens de in bijlage II beschreven methode officieel of onder officieel toezicht uitgevoerde tests. § 2. De in paragraaf 1 bedoelde tests worden uitgevoerd : a) wanneer de vaststelling van het organisme werd bevestigd in de Belgische pootaardappelproductie : i) door middel van tests op de voorgaande generaties, met inbegrip van de oorspronkelijke kloonselectie, en van systematische tests op de klonen van basisaardappelpootgoed, of ii) wanneer de afwezigheid van klonale verwantschap werd aangetoond door tests op al de klonen van basisaardappelpootgoed of de voorgaande generaties, met inbegrip van de oorspronkelijke kloonselectie, b) in de overige gevallen hetzij op elke plant van de oorspronkelijke kloonselectie, hetzij op representatieve monsters van het basisaardappelpootgoed of van de voorgaande generaties. HOOFDSTUK 8. - Aanvullende maatregelen Art. 8.De Minister kan aanvullende of strengere maatregelen vastleggen die vereist zijn om het organisme te bestrijden of om verspreiding ervan te voorkomen, voor zover die maatregelen in overeenstemming zijn met de bepalingen van het koninklijk besluit van 10 augustus 2005Relevante gevonden documenten type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/08/2005 numac 2005022636 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu en federaal agentschap voor de veiligheid van de voedselketen Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen type koninklijk besluit prom. 10/08/2005 pub. 31/05/2016 numac 2016000333 bron federale overheidsdienst volksgezondheid, veiligheid van de voedselketen en leefmilieu Koninklijk besluit betreffende de bestrijding van voor planten en plantaardige producten schadelijke organismen. - Officieuze coördinatie in het Duits sluiten. HOOFDSTUK 9. - Opheffingsbepalingen Art. 9.§ 1. Worden opgeheven : a) het ministerieel besluit van 30 augustus 1999Relevante gevonden documenten type ministerieel besluit prom. 30/08/1999 pub. 19/10/1999 numac 1999016303 bron ministerie van middenstand en landbouw Ministerieel besluit betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al sluiten betreffende de bestrijding van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.b) artikelen 2 en 3 van het ministerieel besluit van 14 februari 2000Relevante gevonden documenten type ministerieel besluit prom. 14/02/2000 pub. 02/03/2000 numac 2000016049 bron ministerie van middenstand en landbouw Ministerieel besluit tot vaststelling van maatregelen om te beletten dat Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al. zich verspreidt sluiten tot vaststelling van maatregelen om te beletten dat Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.zich verspreidt. HOOFDSTUK 1 0. - Uitvoeringsbepaling Art. 10.De minister die bevoegd is voor de Veiligheid van de Voedselketen is belast met de uitvoering van dit besluit. Gegeven te Brussel 26 januari 2014. FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw, Mevr. S. LARUELLE Bijlage I DEEL I. - Lijst van waardplanten van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. als bedoeld in artikel 2 Planten (met inbegrip van knollen) van Solanum tuberosum L., Aardappel met uitzondering van de eigenlijke zaden Planten van Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw., Tomaat met uitzondering van de zaden en de vruchten DEEL II. - Onderzoeken De officiële onderzoeken als bedoeld in artikel 3, § 2, onder a), steunen op de biologische eigenschappen van het organisme en op bijzondere specifieke productiesystemen en omvatten : i) voor aardappelen : a) op daartoe geschikte tijdstippen, een visuele inspectie van het gewas in de groeifase en/of een bemonstering van pootaardappelen en andere aardappelen tijdens de groei of de opslag;die monsters ondergaan een officiële of onder officieel toezicht uitgevoerde visuele inspectie op doorgesneden knollen, en b) voor pootaardappelen en, desgevallend, voor andere aardappelen, officiële of onder officieel toezicht volgens de in bijlage II beschreven methode uitgevoerde laboratoriumtests; ii) voor tomaten : a) een visuele inspectie, op daartoe geschikte tijdstippen, van ten minste het gewas in de groeifase van voor herplanten voor professioneel gebruik bestemd plantgoed. Gezien om te worden gevoegd bij ons besluit van 26 januari 2014 betreffende de bestrijding van bruinrot in aardappelen (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.) FILIP Van Koningswege : De Minister van Landbouw Mevr. S. LARUELLE Bijlage II Testsmethode voor de diagnose, detectie en identificatie van Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. OVERZICHT VAN DE TESTSMETHODE Deze testsmethode beschrijft de verschillende procedures voor : i) de diagnose van bruinrot in aardappelknollen en aardappel- en, tomatenplanten en enkele andere waardplanten; ii) de detectie van Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) in monsters van aardappelknollen, aardappel- en tomatenplanten en andere waardplanten, water en grond; iii) de identificatie van R. solanacearum. ALGEMENE BEGINSELEN In de aanhangsels worden geoptimaliseerde protocollen voor de verschillende methoden, gevalideerde reagentia, en nadere bijzonderheden betreffende de bereiding van analyse- en controlemateriaal beschreven. Aanhangsel 1 bevat een lijst van laboratoria die bij de optimalisering en validering van de protocollen zijn betrokken. Aangezien de protocollen betrekking hebben op de detectie van een quarantaineorganisme en daarbij levensvatbare culturen van R. solanacearum als controlemateriaal gebruikt worden, moeten de procedures onder adequate quarantaineomstandigheden met de nodige faciliteiten voor afvalverwijdering worden uitgevoerd en moeten de officiële autoriteiten voor plantenquarantaine de vereiste vergunningen hebben verstrekt. De testparameters moeten zodanig zijn dat R. solanacearum bij de drempelwaarden die voor de gekozen methoden zijn vastgesteld op consistente en reproduceerbare wijze gedetecteerd wordt. Het is essentieel dat de positieve controlemonsters zorgvuldig bereid worden. Om de tests met de vereiste drempelwaarden te kunnen verrichten moet verder de apparatuur juist ingesteld, in goede staat van onderhoud en geijkt zijn, moeten de reagentia zorgvuldig gehanteerd en bewaard worden en moeten alle maatregelen worden genomen om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen; zo moeten de positieve controlemonsters gescheiden van de analysemonsters bewaard worden. Er moeten kwaliteitsbewakingsnormen worden toegepast om administratieve en andere fouten te vermijden, met name bij de etikettering en documentatie. Een vermoede aanwezigheid als bedoeld in artikel 4, lid 2, van richtlijn 98/57/EG betekent dat een positieve uitslag is verkregen bij een diagnostische of screeningstest op een monster zoals aangegeven in de stroomdiagrammen. Een positieve eerste screeningstest (IF, PCR/FISH, selectieve isolatie) moet met een tweede, op andere biologische principes gebaseerde screeningstest worden bevestigd. Als de eerste screeningstest positief is, wordt besmetting met R. solanacearum vermoed en moet een tweede screeningstest worden uitgevoerd. Is de tweede screeningstest ook positief, dan wordt het vermoeden bevestigd (vermoede aanwezigheid) en moeten de tests volgens de testsmethode worden voortgezet. Als de tweede screeningstest negatief is, wordt aangenomen dat het monster niet met R. solanacearum besmet is. Onder bevestigde aanwezigheid als bedoeld in artikel 5, lid 1, van richtlijn 98/57/EG wordt verstaan dat een reincultuur van R. solanacearum is geïsoleerd en geïdentificeerd en de pathogeniteit ervan bevestigd is. DEEL I. - Toepassing van de testsmethode 1. Stroomdiagram voor de diagnose van bruinrot (R.solanacearum) in aardappelknollen en aardappel-, tomaten en andere waardplanten met symptomen van bruinrot De testprocedure is bedoeld voor aardappelknollen en -planten met symptomen die karakteristiek zijn voor bruinrot of een vermoeden daarvan doen rijzen. Ze omvat een snelle screeningstest, isolatie van het pathogeen uit geïnfecteerd vaatweefsel op een (selectief) medium en, in geval van een positieve uitslag, identificatie van de cultuur als R. solanacearum. Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen Principe Deze testprocedure is bedoeld voor het opsporen van latente infecties in aardappelknollen. Een positieve uitslag bij ten minste twee, op verschillende biologische principes gebaseerde screeningstests (3) moet worden bevestigd door isolatie van het pathogeen. In geval van isolatie van karakteristieke kolonies wordt de procedure vervolgd door identificatie van een reincultuur als R. solanacearum. Een positieve uitslag bij slechts één van de screeningstests is niet voldoende om het monster als verdacht aan te merken. Met de screenings- en isolatietests moet een detectiegrens worden gehaald van 103-104 cellen/ml van de geresuspendeerde pellet die als positieve controle aan elke testreeks wordt toegevoegd. Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 3. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- of andere waardplanten Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld DEEL II. - Gedetailleerde beschrijving van de methoden voor de detectie van R. solanacearum in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot 1. Symptomen 1.1. Symptomen bij aardappel Aardappelplant. Het eerste infectiestadium uit zich in bladverwelking nabij de top van de plant bij hoge temperaturen overdag met herstel's nachts. Aanvankelijk blijven de bladeren groen, later vergelen ze en treedt bruine necrose op. Ook komt epinastie voor. De verwelking van scheuten of hele planten is al snel onomkeerbaar; de plant zakt ineen en sterft. Het vaatweefsel in dwars doorgesneden stengels van verwelkte planten ziet er doorgaans bruin uit en uit het snijvlak komt een melkachtig bacterieslijm (spontaan of als de stengel wordt dichtgeknepen). Wanneer een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, komen er slijmdraden uit de vaatbundels. Aardappelknol. De aardappelknollen moeten dicht bij het naveleinde (stoloon) dwars of over de stoloon overlangs doorgesneden worden. Het eerste infectiestadium uit zich in een glazige gele tot lichtbruine verkleuring van de vaatbundelring, waaruit na enkele minuten spontaan roomkleurig bacterieslijm komt. Later wordt de vaatverkleuring duidelijker bruin en kan de necrose zich tot in het parenchym uitstrekken. In gevorderde stadia komt uit de navel en de ogen bacterieslijm waaraan bodemdeeltjes blijven hangen. Op de schil kunnen door instorting van onderliggend vaatweefsel roodbruine, iets verzonken laesies verschijnen. In gevorderde stadia van de ziekte komt secundair vaak zacht bacterieel of schimmelrot voor. 1.2. Symptomen bij tomaat Tomatenplant. Het eerste zichtbare symptoom is dat de jongste bladeren er slap bijhangen. In voor het pathogeen gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur ongeveer 25 ° C, 100 % luchtvochtigheid) volgen na enkele dagen epinastie en eenzijdige of totale verwelking van de plant, waarna deze volledig inzakt. In minder gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur lager dan 21 ° C) treedt minder verwelking op, maar kunnen zich aan de stengel grote aantallen bijwortels ontwikkelen. Vanaf de voet van de stengel verschijnen met water verzadigde ribbels, wat wijst op necrose in het vaatstelsel. Als de stengel dwars wordt doorgesneden, komt er wit of gelig bacterieslijm uit het bruin verkleurde vaatweefsel 1.3. Symptomen bij andere waardplanten Solanum dulcamara (bitterzoet) en S. nigrum (zwarte nachtschade) - In het wild wordt verwelking bij deze onkruidplanten zelden waargenomen, tenzij bij bodemtemperaturen van meer dan 25 ° C of extreem hoge inoculumniveaus (bijvoorbeeld wanneer S. nigrum vlak naast zieke aardappel- of tomatenplanten groeit). Als verwelking wel optreedt, zijn de symptomen dezelfde als bij tomaat. Niet-verwelkende S. dulcamara die met wortel en stengel in water staat kan op een dwarse doorsnede van de onderste of onder water gelegen stengeldelen een lichtbruine verkleuring van het vaatweefsel vertonen. Bacterieslijm of -slijmdraden kunnen uit het vaatweefsel komen als een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, ook als er geen verwelkingssymptomen zijn. 2. Snelle screeningstests Snelle screeningstests zijn nuttig voor een voorlopige diagnose, maar niet essentieel.Voer een of meer van de onderstaande gevalideerde tests uit. 2.1. Slijmdradentest (Zie VI.A.1) 2.2. Detectie van poly-?-hydroxybutyraatkorrels (PHB-korrels) Kleur thermisch gefixeerde uitstrijkjes bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel op een objectglaasje met nijlblauw A of soedanzwart om de karakteristieke PHB-korrels in de cellen van R. solanacearum te zien (VI.A.2). 2.3. Serumagglutinatietests (Zie VI.A.3) 2.4. Andere tests Andere geschikte snelle screeningstests zijn onder meer de IF-test (VI.A.5), FISH-test (VI.A.7), ELISA-tests (VI.A.8) en PCR-tests (VI.A.6). 3. Isolatieprocedure a) Neem wat slijm of verkleurd vaatweefsel uit de aardappelknol of uit de stengel van de verwelkte aardappel-, tomaten- of andere waardplant. Suspendeer dit in een klein volume steriel gedestilleerd water of steriele fosfaatbuffer 50 mM (aanhangsel 4) en laat 5-10 minuten staan. b) Maak een reeks decimale verdunningen van de suspensie.c) Breng 50-100 µl van de suspensie en verdunningen over op een algemeen medium (NA, YPGA of SPA;aanhangsel 2) en/of op Kelman's tetrazoliummedium (aanhangsel 2) of een ander gevalideerd selectief medium (zoals SMSA; aanhangsel 2). Gebruik daarvoor een geschikte techniek. Plaat als positieve controle eventueel ook een verdunde celsuspensie van R. solanacearum biovar 2 uit. d) Incubeer de platen 2-6 dagen bij 28 ° C. - Op een algemeen medium vormen virulente isolaten van R. solanacearum parelwitte, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies, vaak met kenmerkende slierten in het midden. Avirulente isolaten vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig roomkleurige, botervette kolonies. - Op Kelman's tetrazolium en SMSA zijn de slierten bloedrood. Avirulente isolaten van R. solanacearum vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig dieprode, botervette kolonies. 4. Identificatietests voor R.solanacearum Onder VI. B worden tests beschreven om de identificatie van vermoedelijke isolaten van R. solanacearum te bevestigen. DEEL III 1. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen 1.1. Bereiding van de monsters Opmerkingen - De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. Intensievere bemonstering houdt in dat er meer tests op monsters van deze grootte worden genomen. Wanneer een groter aantal knollen per monster wordt genomen, treedt remming op of zijn de resultaten moeilijk te interpreteren. De procedure is echter ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen, wanneer er niet zoveel beschikbaar zijn. - De hierna beschreven detectiemethoden zijn gevalideerd met monsters van 200 knollen. - Het hierna beschreven aardappelextract kan ook worden gebruikt voor de detectie van de aardappelringrotbacterie, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Facultatieve behandeling vóór de bereiding van het monster : a) Incubeer de monsters vooraf maximaal twee weken voor de test bij 25-30 ° C, zodat eventueel aanwezige R.solanacearum zich vermenigvuldigt. b) Was de knollen.Gebruik geschikte ontsmettingsmiddelen (als een PCR-test uitgevoerd wordt, chloorverbindingen om eventueel aanwezig pathogeen-DNA te verwijderen) en reinigingsmiddelen na elk monster. Laat de knollen aan de lucht drogen. Deze wasprocedure is vooral nuttig, maar niet verplicht, voor monsters met veel aanhangende grond en als een PCR-test of directe isolatie moet worden uitgevoerd. 1.1.1. Verwijder met een schoon, ontsmet scalpel of aardappelschilmes de schil aan het naveleinde (stoloon) van elke knol, zodat het vaatweefsel zichtbaar wordt. Snij voorzichtig een kleine kegelvormige kern vaatweefsel uit het naveleinde van elke knol en zorg er daarbij voor dat deze zo weinig mogelijk niet-vaatweefsel bevat. NB : Houd (rottende) knollen met verdachte symptomen van bruinrot apart en test die afzonderlijk Als bij het uitsnijden van het naveleindstukje voor bruinrot verdachte symptomen worden waargenomen, moet de knol visueel worden onderzocht en bij de navel worden doorgesneden. Doorgesneden knollen met vermoedelijke symptomen moeten ten minste twee dagen bij kamertemperatuur worden bewaard om verkurking te laten optreden en vervolgens gekoeld (bij 4-10 ° C) onder de juiste quarantaineomstandigheden worden opgeslagen. Alle knollen, ook die met verdachte symptomen, moeten overeenkomstig bijlage III worden bewaard. 1.1.2. Verzamel de naveleindstukjes in ongebruikte afsluitbare of verzegelbare wegwerpcontainers (als de containers wel opnieuw gebruikt worden, moeten ze grondig worden gereinigd en met chloorverbindingen worden ontsmet). De naveleindstukjes worden bij voorkeur direct verwerkt. Is dat niet mogelijk, dan moeten ze zonder toevoeging van buffer in de container worden bewaard; gekoeld mogen ze hooguit 72 uur worden bewaard, bij kamertemperatuur hooguit 24 uur. Verwerk de naveleindstukjes volgens een van onderstaande procedures : a) overgiet de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud 4 uur (bij minder dan 24° C) of 16-24 uur (gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of b) homogeniseer de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) in een blender (bv.Waring of Ultra Thurax) of door ze fijn te maken in een afgesloten wegwerpbaar maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba sterk polytheen, 150 x 250 mm, met straling gesteriliseerd) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). NB : Bij gebruik van een blender is er een groot risico op kruisbesmetting tussen de monsters. Neem maatregelen om aërosolvorming en morsen tijdens de extractie te vermijden. Voor elk monster moeten pas gesteriliseerde blendermessen en vaten gebruikt worden. Als de PCR-test wordt gedaan, moet worden vermeden dat er DNA in de containers of maalapparatuur achterblijft. Aanbevolen wordt om voor de PCR-test het materiaal in wegwerpzakjes fijn te maken en wegwerpbuisjes te gebruiken 1.1.3. Schenk de bovenstaande vloeistof af. Als de vloeistof erg troebel is, kan dit worden verholpen door centrifugeren bij laag toerental (maximaal 180 g, 10 minuten, 4-10 ° C) of vacuümfiltratie (40-100 µm) waarbij het filter met ongeveer 10 ml extractiebuffer wordt nagespoeld. 1.1.4. Concentreer de bacteriefractie door 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g (of 10 minuten bij 10 000 g) bij 4-10 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. 1.1.5. Resuspendeer de pellet in 1,5 ml pelletbuffer (aanhangsel 4). Gebruik 500 µl voor de test op R. solanacearum, 500 µl voor die op Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en 500 µl voor referentiedoeleinden. Voeg aan het referentiealiquot van 500 µl en aan het niet-gebruikte analysealiquot steriele glycerol toe tot een eindconcentratie van 10-25 % (V/V), vortex en bewaar tussen - 16 en - 24 ° C (enkele weken) of - 68 en - 86 ° C (enkele maanden). Bewaar de analysealiquots tijdens de test bij 4-10 ° C. Herhaald invriezen en ontdooien wordt niet aangeraden. Als het extract moet worden vervoerd, moet het binnen 24 à 48 uur in een koelbox worden afgeleverd. 1.1.6. Alle positieve R. solanacearum-controles en -monsters moeten gescheiden behandeld worden om contaminatie te voorkomen. Dit geldt voor de IF-glaasjes en voor alle tests. 1.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels : selectieve isolatie (VI.A.4); IF-test (VI.A.5); PCR-tests (VI.A.6); FISH-test (VI.A.7); ELISA-tests (VI.A.8); bioassay (VI.A.9). 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere waardplanten 2.1. Bereiding van de monsters NB : Voor de detectie van latente R. solanacearum-populaties wordt aangeraden samengestelde monsters te testen. De methode is goed bruikbaar voor samengestelde monsters van maximaal 200 stengeldelen. Surveyonderzoeken moeten gebaseerd zijn op een statistisch representatieve steekproef van de onderzochte plantenpopulatie. 2.1.1. Doe stengeldelen van 1-2 cm in een gesloten steriele container overeenkomstig de onderstaande bemonsteringsprocedures. Zaailingen van tomatenplanten : Snij met een schoon, ontsmet mes een stuk van 1 cm van het onderste deel van elke stengel, vlak boven het bodemniveau. Kas- of vollegrondtomatenplanten : Snij met een schoon, ontsmet mes de onderste zijscheut van elke plant zo dicht mogelijk bij de hoofdstengel af. Neem de onderste 1 cm van elke zijscheut. Andere planten : Snij met een schoon, ontsmet mes of dito snoeischaar een stuk van 1 cm van het onderste deel van de stengel af, vlak boven het bodemniveau. Snij van S. dulcamara of andere in water groeiende planten een stuk van 1-2 cm van het deel van de stengel onder water of de stoloon met waterwortels. Test bij het bemonsteren van een bepaalde plaats bij voorkeur een statistisch representatieve steekproef van ten minste tien planten per bemonsteringspunt van elke mogelijke onkruidwaard. Het pathogeen is het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, al kan natuurlijke infectie in overblijvend bitterzoet (S. dulcamara) in waterlopen het hele jaar worden gedetecteerd. Het organisme komt onder meer voor in aardappelopslag, S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium en andere planten van de nachtschadefamilie, en daarnaast in Pelargonium spp. en Portulaca oleracea. R. solanacearum biovar 2/ras 3 kan in specifieke omstandigheden voorkomen in de wortel of rizosfeer van Europese onkruidsoorten als Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfara en Urtica dioica. NB : In dit stadium kan het visuele onderzoek naar inwendige symptomen (vaatverkleuring of bacterieslijm) plaatsvinden. Bewaar en test stengeldelen met symptomen afzonderlijk (zie deel II). 2.1.2. Ontsmet de stengeldelen kort met ethanol 70 % en dep ze direct droog met tissuepapier. Verwerk de stengeldelen daarna volgens een van de volgende procedures : a) overgiet de stengeldelen met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud gedurende 4 uur (bij minder dan 24 ° C) dan wel 16-24 uur (indien gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of b) verwerk de stengeldelen onmiddellijk door ze fijn te maken in een sterk maceratiezakje (bv.Stomacher of Bioreba) met voldoende extractiebuffer (aanhangsel 4) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). Is dit niet mogelijk, dan kunnen ze gekoeld hooguit 72 uur worden bewaard en bij kamertemperatuur hooguit 24 uur. 2.1.3. Laat 15 minuten bezinken en schenk de bovenstaande vloeistof af. 2.1.4. Het is doorgaans niet nodig het extract verder te zuiveren of de bacteriefractie te concentreren; desgewenst kan dit worden gedaan door filtratie en/of centrifugering zoals beschreven onder III.1.1.3 tot 1.1.5. 2.1.5. Verdeel het oorspronkelijke of geconcentreerde monsterextract in twee gelijke delen. Houd de ene helft gedurende de test op 4-10 ° C en bewaar de andere helft na toevoeging van 10-25 % (V/V) steriele glycerol tussen - 16 en - 24 ° C (enkele weken) of - 68 en - 86 ° C (enkele maanden) voor het geval verder test nodig is. 2.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels : selectieve isolatie (VI.A.4); IF-test (VI.A.5); PCR-tests (VI.A.6); FISH-test (VI.A.7); ELISA-tests (VI.A.8); bioassay (VI.A.9). DEEL IV 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in water Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in water Principe Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in oppervlaktewatermonsters en monsters van afvalwater van aardappelverwerkingsinstallaties of riooleffluent. De verwachte detectiegevoeligheid hangt echter af van het substraat. De gevoeligheid van de isolatietest hangt af van de populatie concurrerende saprofytische bacteriën, die doorgaans veel groter is in aardappelverwerkingsafvalwater of effluent dan in oppervlaktewater. Met de onderstaande methode kan in oppervlaktewater een concentratie van 103 cellen per liter nog worden gedetecteerd, maar voor afvalwater ligt de gevoeligheid waarschijnlijk aanzienlijk lager. Daarom wordt afvalwater het beste getest na een eventuele zuivering (bv. sedimentatie, filtratie), waardoor de populatie saprofytische bacteriën wordt gereduceerd. Bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen moet rekening worden gehouden met de gevoeligheid van de testmethode. Deze methode is met succes toegepast bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in oppervlaktewater, maar heeft haar beperkingen bij vergelijkbaar onderzoek op aardappelverwerkingsafvalwater of riooleffluent. 2.1. Bereiding van de monsters Opmerkingen - In oppervlaktewater is R. solanacearum het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, bij een watertemperatuur van meer dan 15 ° C. - Herhaalde bemonstering van dezelfde plaatsen op verschillende tijdstippen in die periode reduceert de weersinvloed en verhoogt daardoor de betrouwbaarheid van de detectie. - Zware regenval en de geografie van de waterloop kunnen leiden tot een grote verdunning die de aanwezigheid van het pathogeen kan maskeren. - Bemonster oppervlaktewater in de buurt van waardplanten (indien aanwezig). 2.1.1. Neem op de bemonsteringsplaatsen in steriele wegwerpbuizen of -flessen watermonsters op een diepte van meer dan 30 cm (indien mogelijk) en binnen 2 m van de oever. Neem afvalwater- of effluentmonsters bij het lozingspunt. Neem bij voorkeur monsters van maximaal 500 ml per bemonsteringspunt. Als kleinere monsters worden genomen, worden op elke bemonsteringsplaats bij voorkeur op ten minste drie verschillende tijdstippen telkens twee submonsters in duplo van ten minste 30 ml genomen. Kies voor intensief onderzoek ten minste drie bemonsteringsplaatsen per 3 km waterloop en bemonster ook de zijwaterlopen. 2.1.2. Vervoer de monsters koel (4-10 ° C) en in het donker en test ze binnen 24 uur. 2.1.3. Concentreer de bacteriefractie indien nodig op een van de volgende manieren : a) centrifugeer submonsters van 30-50 ml 10 minuten bij 10 000 g (of 15 minuten bij 7 000 g), bij voorkeur bij 4-10 ° C.Giet de bovenstaande vloeistof af. Resuspendeer de pellet in 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4); b) filtreer de suspensie door een membraan (minimale maasgrootte 0,45 µm).Was het filter met 5-10 ml pelletbuffer en bewaar de wasvloeistof. Deze werkwijze is geschikt voor grotere volumes water met weinig saprofyten. Monsters van aardappelverwerkingsafvalwater of effluent worden doorgaans beter niet geconcentreerd, omdat te grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën de detectie van R. solanacearum hinderen. 2.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels. DEEL V 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in grond Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R.solanacearum in grond Principe Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in bodemmonsters en monsters van vast aardappelverwerkingsafval of rioolslib. Ze is echter niet gevoelig genoeg om detectie van lage concentraties of onregelmatig verspreide populaties van R. solanacearum in natuurlijk besmette monsters van deze substraten te waarborgen. Houd bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen en bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in bodems of slib rekening met de gevoeligheid van de testmethode. De betrouwbaarste manier om na te gaan of het pathogeen in een bodem aanwezig is, is een vatbare waardplant te planten en op infectie te controleren, maar ook met die methode kunnen lage besmettingsniveaus niet altijd worden gedetecteerd. 2.1. Bereiding van de monsters 2.1.1. Neem bodemmonsters volgens de standaardprincipes voor bemonstering bij nematodenonderzoek. Verzamel 0,5- 1 kg grond per monster op 60 plaatsen per 0,3 ha (in een raster van 7 x 7 m) op een diepte van 10-20 cm. Gebruik 120 bemonsteringspunten per 0,3 ha als aanwezigheid van het pathogeen wordt vermoed. Bewaar de monsters bij 12-15 ° C. Bemonster aardappelverwerkings- en rioolslib door in totaal 1 kg slib te verzamelen dat representatief is voor het hele te testen volume. Meng elk monster grondig voor het testen. 2.1.2. Dispergeer submonsters van 10-25 g grond of slib in 60-150 ml extractiebuffer (aanhangsel 4) op een rondschudapparaat (250 rpm, maximaal 2 uur). Voeg zo nodig steriele 0,02 % Tween 20 en 10-20 g steriele kiezel toe voor een betere dispersie. 2.1.3. Bewaar de suspensie tijdens het testen bij 4 ° C. 2.2. Testmethode Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels. DEEL VI. - Geoptimaliseerde protocollen voor de detectie en identificatie van R. solanacearum A. Diagnose en detectie 1. Slijmdradentest De volgende eenvoudige oriënterende test geeft aan of R.solanacearum aanwezig is in stengels van verwelkende aardappel-, tomaten- of andere planten. Snij de stengel vlak boven het bodemniveau af. Dompel het snijvlak in een buis schoon water. Kijk of er na enkele minuten spontaan bacterieslijmdraden uit de doorgesneden vaatbundels komen. 2. Detectie van poly-?-hydroxybutyraatkorrels 1.Maak op een objectglaasje een uitstrijkje van bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel of uit een 48 uur oude kweek op YPGA- of SPA-medium (aanhangsel 2). 2. Maak uitstrijkjes van een biovar 2-stam van R.solanacearum als positieve controle en eventueel van een bekende PHB-negatieve soort als negatieve controle. 3. Laat aan de lucht drogen en haal elk glaasje door de vlam om de uitstrijkjes te fixeren.4. Kleur de preparaten met nijlblauw of soedanzwart en bekijk ze onder de microscoop volgens de onderstaande procedure. Nijlblauwkleuring a) Overgiet elk glaasje met een 1 % oplossing van nijlblauw A in water.Incubeer 10 minuten bij 55 ° C. b) Laat de kleuroplossing weglopen.Spoel even in rustig stromend kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier. c) Overgiet met azijnzuur 8 % en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur.d) Spoel even in rustig stromend kraanwater.Verwijder overtollig water met tissuepapier. e) Herbevochtig met een druppel water en breng een dekglaasje aan.f) Bekijk het preparaat met een epifluorescentiemicroscoop (450 nm, olie-immersie, 600-1 000 x).g) Kijk of er een helderoranje fluorescentie van PHB-korrels te zien is.Controleer onder doorvallend natuurlijk licht of de korrels zich wel degelijk in de cellen bevinden en de celmorfologie karakteristiek is voor R.solanacearum. Soedanzwartkleuring a) Overgiet elk glaasje met een 0,3 % oplossing van sudanzwart B in ethanol 70 %.Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. b) Laat de kleuroplossing weglopen.Spoel even met kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier. c) Dompel even in xyleen en dep droog op tissuepapier.Let op! Xyleen is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast. d) Overgiet met waterige safranineoplossing 0,5 % (m/V) en laat 10 seconden bij kamertemperatuur inwerken.Let op! Safranine is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast. e) Spoel in rustig stromend kraanwater.Dep droog op tissuepapier. Breng een dekglaasje aan. f) Bekijk het preparaat met een lichtmicroscoop onder doorvallend licht (olie-immersie, 1 000 x).g) Kijk of er blauwzwarte PHB-korrels te zien zijn in R. solanacearum-cellen met roze celwanden. 3. Serumagglutinatietests Agglutinatie van R.solanacearum-cellen in bacterieslijm of weefselextract van planten met symptomen is het beste waar te nemen met gevalideerde antilichamen (aanhangsel 3) die met kleur zijn gelabeld, bv. met rode Staphylococcus aureus of gekleurde latexdeeltjes. Volg bij gebruik van in de handel verkrijgbare kits (aanhangsel 3) de instructies van de fabrikant en anders de volgende procedure : a) Meng ongeveer 5 µl van een suspensie van gelabeld antilichaam met ongeveer 5 µl bacterieslijm op venstertjes van een objectglaasje met meerdere venstertjes.b) Maak positieve en negatieve controles met suspensies van R. solanacearum biovar 2 en een heterologe stam. c) Meng zachtjes gedurende 15 seconden.In positieve monsters treedt agglutinatie op. 4. Selectieve isolatie 4.1. Selectieve uitplating NB : Controleer vóór de eerste toepassing van deze methode of de toevoeging van 103-104 kve/ml R. solanacearum aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar wordt gedetecteerd. Gebruik een geschikt gevalideerd selectief medium, bv. SMSA zoals gemodificeerd door Elphinstone e.a. (1996) (aanhangsel 2). Om R. solanacearum te onderscheiden van andere bacteriën die op het medium kolonies kunnen vormen, is zorg vereist. Kolonies van R. solanacearum kunnen bovendien een atypische morfologie vertonen op overvolle platen en in aanwezigheid van antagonistische bacteriën. Test het monster bij een vermoeden van concurrentie of antagonisme met een andere test opnieuw. Deze methode is het gevoeligst met vers bereide monsterextracten. Zij kan echter ook worden gebruikt met extracten die tussen - 68 en - 86 ° C in glycerol zijn bewaard. Maak als positieve controle decimale verdunningen van een suspensie van 106 kve/ml van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Om contaminatie uit te sluiten moeten de positieve controles volledig gescheiden van de analysemonsters worden bereid Ga voor elke nieuw bereide charge van een selectief medium na of die geschikt is voor het kweken van de bacterie en gebruik haar pas daarna om routinemonsters te testen. Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters. 4.1.1. Neutraliseer eventueel aanwezige saprofytische kolonievormende populaties door verdunning en uitplating. Strijk per plaat monsterextract en per verdunning 50-100 µl uit. 4.1.2. Incubeer de platen bij 28 ° C. Bekijk ze na 48 uur en daarna zes dagen lang dagelijks. Karakteristieke kolonies van R. solanacearum op SMSA zijn melkwit, plat, onregelmatig en uitvloeiend; na drie dagen incubatie worden ze in het midden roze tot bloedrood, met interne strepen en slierten. NB : R. solanacearum vormt op dit medium soms ook atypische kolonies. Deze kunnen klein, rond, helemaal rood en niet of slechts gedeeltelijk uitvloeiend zijn, waardoor ze moeilijk van saprofytische kolonievormende bacteriën te onderscheiden zijn. 4.1.3. Kweek vermoedelijke R. solanacearum-kolonies rein na uitstrijken of uitplaten van verdunningen op een algemeen medium om geïsoleerde kolonies te krijgen (aanhangsel 2). 4.1.4. De kweek kan worden bewaard in steriel water (pH 6-8, chloorvrij) in het donker en bij kamertemperatuur (kort) of in een geschikt cryoprotectans bij - 68 à - 86 ° C of gevriesdroogd (lang). 4.1.5. Identificeer vermoedelijke culturen (VI. B) en voer een pathogeniteitstest uit (VI. C). Interpretatie van het resultaat van de selectieve uitplating De test is negatief als de platen na zes dagen geen kolonies of geen vermoedelijke R. solanacearum-kolonies vertonen, mits er geen aanwijzingen zijn voor remming door concurrentie of antagonisme van andere bacteriën en de positieve controles wel karakteristieke R. solanacearum-kolonies vertonen. De test is positief als er vermoedelijke R. solanacearum-kolonies worden geïsoleerd. 4.2. Ophopingsprocedure Gebruik een gevalideerd ophopingsmedium, bv. gemodificeerde Wilbrink-bouillon (aanhangsel 2). Deze procedure dient om populaties van R. solanacearum in monsterextracten selectief te stimuleren en de detectiegevoeligheid te verbeteren. Ook worden remmers van de PCR-reactie doeltreffend verdund (1 :100). De ophoping van R. solanacearum kan echter mislukken door concurrentie of antagonisme van saprofytische organismen die vaak ook worden gestimuleerd. Daarom is isolatie van R. solanacearum uit kweken in ophopingsbouillon soms moeilijk. Voor de ELISA-test verdienen specifieke monoklonale (in plaats van polyklonale) antilichamen de voorkeur, daar populaties van serologisch verwante saprofyten ook kunnen toenemen. 4.2.1. Breng voor ophoping+PCR 100 µl monsterextract over in 10 ml ophopingsbouillon (aanhangsel 2) in DNA-vrije buisjes of flesjes. Voor ophoping+ELISA kan de concentratie van het monsterextract worden verhoogd (bv. 100 µl in 1,0 ml ophopingsbouillon). 4.2.2. Incubeer 72 uur bij 27-30 ° C (al dan niet op een schudapparaat) met de dop los op de buisjes voor de beluchting. 4.2.3. Meng de suspensies voor de ELISA- of PCR-test grondig. 4.2.4. Behandel de bouillon vervolgens op dezelfde manier als de monsters in de boven beschreven tests. NB : Bij een hoge kans op remming van de ophoping van R. solanacearum door grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën levert ophoping van de monsterextracten vóór centrifugering of andere concentratiestappen vaak betere resultaten op. 5. Immunofluorescentiestest (IF-test) Principe De IF-test wordt als eerste screeningstest aanbevolen vanwege de aangetoonde robuustheid ten opzichte van de vereiste drempelwaarden. Wanneer de IF-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede screeningstest een isolatie-, PCR- of FISH-test worden gedaan. Wanneer de IF-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd voor de verdere analyses. NB : Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum. Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugaat, overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. De gevalideerde polyklonale antiserums hebben allemaal een IF-titer van ten minste 1:2 000. Bij de test moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer. De test moet worden uitgevoerd op vers bereide monsterextracten. Zo nodig kan de test ook goed worden uitgevoerd op extracten die tussen - 68 en - 86 ° C in glycerol zijn bewaard. De glycerol kan uit het monster worden verwijderd door toevoegen van 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4), 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g en resuspensie in een gelijk volume pelletbuffer. Dit is vaak niet nodig, met name als de monsters op de objectglaasjes worden gefixeerd door ze door de vlam te halen. Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B), en eventueel in buffervloeistof. Natuurlijk geïnfecteerd weefsel (geconserveerd door vriesdrogen of invriezen bij -16 tot - 24 ° C) moet zo mogelijk als soortgelijke controle op hetzelfde glaasje worden gebruikt. Als negatieve controle kunnen aliquots monsterextract worden gebruikt waarbij een eerdere test voor R. solanacearum negatief was. Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test. Gebruik microscoopglaasjes met meerdere venstertjes, bij voorkeur tien venstertjes met een diameter van minstens 6 mm. Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters. 5.1. Prepareer de objectglaasjes volgens een van onderstaande procedures : i) voor pellets met betrekkelijk weinig zetmeelsediment : Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm - vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van een 1:100-verdunning van de geresuspendeerde aardappelpellet op het eerste venstertje.Pipetteer vervolgens eenzelfde volume onverdunde pellet (1/1) op de resterende venstertjes van de rij. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 1. ii) voor andere pellets : Maak decimale oplossingen (1:10 en 1:100) van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm - vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van de geresuspendeerde pellet en van elke verdunning op een rij venstertjes. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 2. 5.2. Laat de druppels bij kamertemperatuur of door verwarming tot 40-45 ° C drogen. Fixeer de bacteriecellen op het glaasje door het te verwarmen (15 minuten op 60 ° C), door het door de vlam te halen, met ethanol 95 % of volgens de specifieke aa …