Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son env

14 DECEMBRE 1998. - Arrêté royal modifiant l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement ALBERT II, Roi des Belges, A tous, présents et à venir, Salut. Vu la loi du 24 février 1921Documents pertinents retrouvés type loi prom. 24/02/1921 pub. 17/12/2004 numac 2004000617 source service public federal interieur Loi concernant le trafic des substances vénéneuses, soporifiques, stupéfiantes, désinfectantes ou antiseptiques. - Traduction allemande fermer concernant le trafic des substances vénéneuses, soporifiques, stupéfiantes, désinfectantes et antiseptiques, notamment l'article 1er, modifié par les lois des 11 mars 1958, 1er juillet 1976 et 14 juillet 1994; Vu la loi du 4 août 1996Documents pertinents retrouvés type loi prom. 04/08/1996 pub. 24/07/1997 numac 1996015142 source ministere des affaires etrangeres, du commerce exterieur et de la cooperation au developpement Loi portant approbation de la Convention entre le Royaume de Belgique et la République Arabe d'Egypte tendant à éviter les doubles impositions et à prévenir l'évasion fiscale en matière d'impôts sur le revenu, signée au Caire le 3 janvier 1991 type loi prom. 04/08/1996 pub. 08/06/2005 numac 2005015073 source service public federal affaires etrangeres, commerce exterieur et cooperation au developpement Loi portant assentiment à la Convention entre le Royaume de Belgique et la République gabonaise tendant à éviter la double imposition et à prévenir l'évasion fiscale en matière d'impôts sur le revenu et sur la fortune, signée à Bruxelles le 14 janvier 1993 type loi prom. 04/08/1996 pub. 21/10/1999 numac 1999015088 source ministere des affaires etrangeres, du commerce exterieur et de la cooperation internationale Loi portant assentiment au Protocole entre le gouvernement du Royaume de Belgique et le gouvernement de la République française relatif aux allocations de naissance, signé à Bruxelles, le 26 avril 1993 fermer relative au bien-être des travailleurs lors de l'exécution de leur travail; Vu la loi du 28 mai 1956 relative aux substances et mélanges explosibles ou susceptibles de déflagrer et aux engins qui en sont chargés; Vu la loi du 11 juillet 1969 relative aux pesticides et aux matières premières pour l'agriculture, l'horticulture, la sylviculture et l'élevage; Vu la loi du 24 janvier 1977Documents pertinents retrouvés type loi prom. 24/01/1977 pub. 28/03/2023 numac 2023040887 source service public federal interieur Loi relative à la protection de la santé des consommateurs en ce qui concerne les denrées alimentaires et les autres produits. - Traduction allemande de dispositions modificatives fermer relative à la protection de la santé des consommateurs en ce qui concerne les denrées alimentaires et les autres produits, modifiée par la loi du 22 mars 1989; Vu la loi du 14 juillet 1991Documents pertinents retrouvés type loi prom. 14/07/1991 pub. 28/11/2007 numac 2007000956 source service public federal interieur Loi sur les pratiques du commerce et sur l'information et la protection du consommateur. - Traduction allemande de dispositions modificatives type loi prom. 14/07/1991 pub. 14/01/2008 numac 2007001065 source service public federal interieur Loi sur les pratiques du commerce et sur l'information et la protection du consommateur. - Traduction allemande de dispositions modificatives fermer sur les pratiques du commerce, et sur l'information et la protection du consommateur, modifiée par la loi du 5 novembre 1993; Vu la directive 67/548/CEE du Conseil des Communautés européennes du 27 juin 1967 concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses, modifiée en dernier lieu par la directive 96 /56/CE du Parlement européen et du Conseil du 3 septembre 1996; Vu la directive 94/69/CE de la Commission du 19 décembre 1994 portant vingt et unième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses; Vu la directive 96/54/CE de la Commission du 30 juillet 1996 portant vingt-deuxième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses; Vu l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement, modifié par les arrêtés royaux des 14 février 1985, 14 septembre 1989, du 19 juillet 1994 et du 13 novembre 1997, ainsi que l'arrêté royal du 14 septembre 1993 portant désignation des services et fonctionnaires chargés de rechercher et de constater les infractions aux dispositions de l'arrêté royal du 24 mai 1982 précité; Vu l'arrêté royal du 27 octobre 1988 relatif à l'application des principes de bonnes pratiques de laboratoire et au contrôle de leur application pour les essais sur les substances chimiques ainsi que l'arrêté royal du 14 novembre 1993 relatif à la protection des animaux d'expérience; Vu l'arrêté royal du 11 janvier 1993 réglementant la classification, l'emballage et l'étiquetage des préparations dangereuses en vue de leur mise sur le marché ou de leur emploi modifié par l'arrêté royal du 23 juin 1995, et l'arrêté royal du 14 juillet 1998; Vu l'avis du Conseil supérieur pour la Prévention et la Protection au Travail du 16 octobre 1998; Vu les lois sur le Conseil d'Etat, coordonnées le 12 janvier 1973, notamment l'article 3, § 1er, modifié par les lois des 9 août 1980, 16 juin 1989 et 4 juillet 1989; Vu l'urgence; Considérant qu'il convient de transposer, sans retard, la directive 94/69/CE du 19 décembre 1994 dont le délai de transposition est dépassé depuis le 1er septembre 1996 et la directive 96/54/CE du 30 juillet 1996 dont le délai de transposition est dépassé en partie depuis le 31 octobre 1997 et pour le reste depuis le 31 mai 1998. Considérant que la Cour de Justice des Communautés européennes a condamné la Belgique, le 6 octobre 1998, en raison de non transposition de la directive 94/69/CE du 19 décembre 1994 dans l'Affaire C-79/98; Sur la proposition de Notre Ministre de la Santé publique, de Notre Ministre de l'Emploi et du Travail et de Notre Secrétaire d'Etat à l'Environnement, Nous avons arrêté et arrêtons : Article 1er.Les annexes de l'arrêté royal du 24 mai 1982 réglementant la mise sur le marché de substances pouvant être dangereuses pour l'homme ou son environnement, modifié par les arrêtés royaux des 14 février 1985, 14 septembre 1989, 19 juillet 1994 et 13 novembre 1997 sont modifiées comme suit : - L'annexe I est remplacée par l'annexe I du présent arrêté; - L'annexe V, point B, est modifiée comme suit : a) Le texte de l'annexe II, point A, du présent arrêté remplace le titre et l'introduction générale de la partie B : "Méthodes pour la détermination de la toxicité". b) Le texte de l'annexe II, point B, du présent arrêté est inséré après le point B.1bis. c) Le texte de l'annexe II, point C, du présent arrêté remplace le point B.6. d) Le texte de l'annexe II, point D, du présent arrêté remplace le point B.7. e) Le texte de l'annexe II, point E, du présent arrêté est ajouté à la fin. - Le texte de l'annexe III du présent arrêté remplace le texte indiqué à l'annexe VI. Art. 2.Notre Ministre de la Santé publique, Notre Ministre de l'Emploi et du Travail et Notre Secrétaire d'Etat à l'Environnement sont chargés, chacun en ce qui le concerne, de l'exécution du présent arrêté. Donné à Bruxelles, le 14 décembre 1998. ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS Annexe I Liste des substances dangereuses La liste des substances dangereuses, mentionnée à cette annexe, est identique à celle qui figure à l'annexe III, partie I de l'arrêté royal du 11 janvier 1993 réglementant la classification, l'emballage et l'étiquetage des préparations dangereuses en vue de leur mise sur le marché ou de leur emploi modifié par l'arrêté royal du 23 juin 1995, et l'arrêté royal du 14 juillet 1998. Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998. ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS Annexe II A « PARTIE B: METHODES DE DETERMINATION DE LA TOXICITE ET DES AUTRES EFFETS SUR LA SANTE INTRODUCTION GENERALE: PARTIE B A. NOTE EXPLICATIVE Pour la présente introduction, la numérotation est la suivante: B.15 Mutation génique, Saccharomyces cerevisiae B.16 Recombinaison mitotique, Saccharomyces cerevisiae B.17 Cellules de mammifère in vitro, essai de mutation génique B.18 Lésion et réparation de l'ADN - synthèse non programmée de l'ADN (UDS) cellules de mammifère in vitro B.19 Essai in vitro d'échange de chromatides soeurs B.20 Test de létalité récessive liée au sexe chez Drosophila melanogaster B.21 Tests de transformation sur cellules de mammifère in vitro B.22 Tests de létalité dominante chez le rongeur B.23 Test cytogénétique sur cellules germinales de mammifère in vivo B.24 Spot test chez la souris B.25 Translocation héréditaire chez la souris B.26 Toxicité orale subchronique: étude de 90 jours sur des rongeurs B.27 Toxicité orale subchronique: étude de 90 jours sur des espèces n'appartenant pas à l'ordre des rongeurs B.28 Toxicité dermique subchronique: étude de 90 jours sur des rongeurs B.29 Toxicité subchronique par inhalation: étude de 90 jours sur des rongeurs B.30 Etude de la toxicité chronique B.31 Etude de tératogénicité B.32 Etude de cancérogénèse B.33 Etude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité B.34 Test de reproduction sur une génération B.35 Test de reproduction sur deux générations B.36 Toxicocinétique B. DEFINITIONS GENERALES DES TERMES EMPLOYES DANS LES METHODES D'ESSAI FIGURANT DANS LA PRESENTE ANNEXE i) La toxicité aiguë correspond aux effets indésirables qui se manifestent dans un intervalle de temps donné (généralement 14 jours) après administration d'une dose unique d'une substance. ii) La toxicité évidente est un terme général qui décrit les signes manifestes de toxicité résultant de l'administration d'une substance d'essai. Ces signes doivent être suffisamment marqués pour permettre une évaluation des dangers et sont tels qu'une augmentation de la dose administrée est susceptible d'entraîner des effets toxiques graves et éventuellement la mort. iii) La dose est la quantité de substance administrée. Elle est exprimée en poids (gramme et milligramme) ou en poids de substance d'essai par unité de poids corporel de l'animal d'expérience (par exemple, milligrammes par kilogramme de poids corporel), ou encore en concentration alimentaire constante (parties par million ou milligrammes par kilogramme d'aliment). iv) La dose discriminante est la plus forte des quatre doses fixées pouvant être administrée sans entraîner une mortalité liée à la substance (y compris animaux sacrifiés pour raisons humanitaires). v) Le dosage est un terme général qui comprend la dose administrée, ainsi que la fréquence et la durée d'administration. vi) La DL50 (dose létale médiane) est la dose unique d'une substance, calculée statistiquement, censée provoquer la mort de 50 % des animaux auxquels elle est administrée. La DL50 est exprimée en poids de la substance étudiée par unité de poids corporel de l'animal soumis à l'expérimentation (milligrammes par kilogramme). vii) La CL50 (concentration létale moyenne) est la concentration d'une substance, calculée statistiquement, susceptible de provoquer, lors d'une exposition ou dans un laps de temps donné après exposition, la mort de 50 % des animaux exposés pendant une durée déterminée. La CL50 est exprimée en poids de la substance étudiée rapporté à un volume standard d'air (milligrammes par litre). viii) La NOAEL est l'abréviation de l'anglais « no observed adverse effect level » : (dose sans effet indésirable observé) et correspond à la dose ou au niveau d'exposition maximum auquel aucun effet adverse lié au traitement n'est observé. ix) La toxicité subchronique par administration répétée correspond aux effets indésirables qui se manifestent chez les animaux d'expérience qui reçoivent une administration quotidienne d'une substance chimique ou qui sont exposés quotidiennement à cette substance pendant une période brève par rapport à leur espérance de vie. x) La dose maximale tolérée (DMT) est la plus forte dose provoquant des signes de toxicité chez les animaux sans entraîner d'effet majeur sur leur survie en ce qui concerne l'essai dans lequel elle est utilisée. xi) L'irritation cutanée correspond aux modifications cutanées de nature inflammatoire qui apparaissent après application d'une substance sur la peau. xii) L'irritation des yeux correspond aux modifications oculaires qui apparaissent après application d'une substance sur la surface antérieure de l'oeil. xiii) La sensibilisation cutanée (dermite allergique de contact) est une réaction immunologique cutanée d'origine immunologique à une substance. xiv) La corrosion dermique désigne les lésions cutanées irréversibles qui résultent de l'application d'une substance sur la peau pendant une période comprise entre 3 minutes et 4 heures. xv) La toxicocinétique est l'étude de l'absorption, de la distribution, du métabolisme et de l'excrétion des substances étudiées. xvi) L'absorption est le(s) processus par le(s)quel(s) une substance administrée pénètre dans l'organisme. xvii) L'excrétion est le(s) processus par le(s)quel(s) la substance administrée et/ou ses métabolites sont éliminés de l'organisme. xviii) La distribution est le(s) processus par le(s)quel(s) la substance absorbée et/ou ses métabolites se répartissent dans l'organisme. xix) Le métabolisme est le(s) processus par le(s)quel(s) la substance administrée subit dans l'organisme des réactions enzymatiques ou non qui aboutissent à des modifications de sa structure. B.I Toxicité aiguë - toxicité par administration répétée/toxicité subchronique et chronique Divers essais (méthodes B.1 - B.5) permettent d'évaluer les effets toxiques et la toxicité aiguë d'une substance pour l'ensemble de l'organisme ou pour certains organes; suite à l'administration d'une dose unique, ces essais fournissent une première indication de la toxicité de la substance. En fonction de la toxicité de la substance, on peut envisager un essai limite jusqu'à une étude complète menant à l'établissement d'une DL50, bien qu'aucun essai limite ne soit prescrit pour les études par inhalation puisqu'il n'a pas été possible de définir une valeur limite unique pour l'exposition par inhalation. La préférence doit être accordée aux méthodes qui utilisent le moins d'animaux possible et qui minimisent les souffrances de ces derniers, par exemple, la « méthode des doses fixes » : (méthode B.1 bis) et la « méthode de toxicité aiguë » : (méthode B.1 ter). Pour les essais de niveau 1, une étude sur une seconde espèce peut compléter les conclusions de la première étude. Dans ce cas, on utilisera une méthode d'essai standard ou on adaptera la méthode pour un plus petit nombre d'animaux. L'essai de toxicité par administration répétée (méthodes B.7, B.8 et B.9) comporte une évaluation des effets toxiques résultant d'une exposition répétée. L'observation clinique des animaux doit être minutieuse, afin de recueillir le maximum d'informations possible. Ces essais doivent permettre de déterminer la toxicité sur les organes cibles, ainsi que les doses non toxiques. Ces aspects pourront nécessiter une analyse plus approfondie dans les études à long terme (méthodes B.26 - B.30 et B.33). B.II Mutagénicité - Génotoxicité La mutagénicité concerne l'induction de modifications permanentes et transmissibles, la quantité ou la structure du matériel génétique des cellules ou des organismes. Ces modifications ou « mutations » : peuvent concerner un gène unique ou des segments d'un gène, un bloc de gènes ou des chromosomes entiers. Les effets sur les chromosomes (entiers) peuvent être structurels et/ou numériques. L'activité mutagène d'une substance est évaluée à l'aide d'essais in vitro, sur des bactéries (méthode B.13/14) pour les mutations géniques (ponctuelles), et/ou sur des cellules de mammifères pour les aberrations chromosomiques structurelles (méthode B.10). Les méthodes in vivo sont également acceptables, par exemple l'essai du micronoyau (méthode B.12) ou l'analyse de métaphase de cellules de moelle osseuse (méthode B.11). Néanmoins, et en l'absence de contre-indication, les méthodes in vitro sont nettement préférables. Les gros volumes de production peuvent nécessiter des études complémentaires pour préciser le potentiel mutagène d'une substance ou effectuer des essais préliminaires de dépistage d'un éventuel effet cancérogène, et/ou réaliser ou assurer le suivi de l'évaluation des risques et ces études peuvent avoir plusieurs utilités : confirmer les résultats des essais de base, analyser des critères non étudiés (end-points) dans les essais de base, servir de point de départ ou de complément à des études in vivo. A cet effet, les méthodes B.15 à B.25 utilisent des systèmes eucaryotes in vivo et in vitro et portent sur une plus large série de systèmes biologiques. Ces essais fournissent des informations sur les mutations ponctuelles et sur d'autres critères chez des organismes plus complexes que les bactéries utilisées dans les essais de base. En règle générale, lorsqu'un programme complémentaire d'études de mutagénicité est envisagé, celui-ci doit être conçu pour permettre l'obtention d'informations complémentaires pertinentes sur le potentiel mutagène ou cancérogène de la substance en question. Les études qui s'avèrent nécessaires dans un cas précis dépendent de nombreux facteurs, notamment des caractéristiques physiques et chimiques de la substance, des résultats des premiers essais bactériens et cytogénétiques, du profil métabolique de la substance, des résultats d'autres études de toxicité et des utilisations connues de la substance. Etant donné la diversité des facteurs à prendre en considération, un schéma rigide de sélection des essais ne semble pas opportun. L'A.R. du 13 novembre 1997 définit certains principes généraux en matière de stratégie, mais un document, le guide technique pour l'Evaluation des Risques présente des stratégies précises qui sont néanmoins souples et peuvent être adaptées en fonction des circonstances. Les méthodes d'études complémentaires ont néanmoins été regroupées ci-après, en fonction du principal paramètre (end-point) génétique analysé. Etudes portant sur les mutations géniques (ponctuelles) a) Etudes des mutations directes ou inverses sur micro-organismes eucaryotes (Saccharomyces cerevisiae) (méthode B.15) b) Etudes in vitro des mutations directes sur cellules de mammifère (méthode B.17) c) Test de létalité récessive liée au sexe sur Drosophila melanogaster (méthode B.20) d) Test de mutation génétique sur cellules somatique in vivo, test des taches chez la souris (spot test - méthode B.24) Etudes portant sur les aberrations chromosomiques a) Etudes cytogénétiques in vivo chez les mammifères;une analyse en métaphase des cellules de moelle osseuse in vivo doit être envisagée lorsqu'elle n'a pas été réalisée lors de l'évaluation initiale (méthode B.11). Il est en outre possible d'étudier la cytogénétique des cellules germinales in vivo (méthode B.23) b) Etudes cytogénétiques in vitro sur cellules de mammifère, lorsqu'elles n'ont pas été réalisées lors de l'évaluation initiale (méthode B.10) c) Etudes de létalité dominante chez les rongeurs (méthode B.22) d) Test de translocation héréditaire chez la souris (méthode B.25) Effets génotoxiques - effets sur l'ADN La génotoxicité, caractérisée par des altérations potentielles du matériel génétique non nécessairement liées à la mutagénicité, peut se manifester par des lésions de l'ADN sans preuve directe de mutation. Les méthodes ci-après qui utilisent des micro-organismes eucaryotes ou des cellules de mammifère peuvent s'avérer utiles pour étudier ces phénomènes : a) Recombinaison mitotique sur Saccharomyces cerevisiae (méthode B.16) b) Lésion et réparation de l'ADN - synthèse non programmée de l'ADN sur cellules de mammifère - in vitro (méthode B.18) c) Echange de chromatides soeurs sur cellules de mammifère - in vitro (méthode B.19) Méthodes alternatives pour la recherche du potentiel cancérogène Des tests de transformation sur cellules de mammifère permettent de mesurer la capacité d'une substance à induire, dans une culture cellulaire, des modifications morphologiques et comportementales qui sont supposées être associées à une transformation maligne in vivo (méthode B.21). Un certain nombre de types cellulaires et de critères de transformation différents peuvent être utilisés. Evaluation du risque d'effets héréditaires chez les mammifères Il existe plusieurs méthodes qui permettent de mesurer, chez les mammifères, les effets héréditaires induits par des mutations géniques (ponctuelles), par exemple, le test du locus spécifique chez la souris qui permet de mesurer les mutations intervenues sur les cellules germinales dans la première génération (non décrit dans la présente annexe), ou par des aberrations chromosomiques, par exemple, le test de translocation héréditaire chez la souris (méthode B.25). Ces méthodes peuvent être utilisées pour apprécier le risque génétique que peut présenter une substance pour l'homme. Toutefois, étant donné la complexité de ces essais et le nombre élevé d'animaux requis, en particulier pour le test du locus spécifique, ces études ne doivent être entreprises que lorsqu'elles sont pleinement justifiées. B.III Cancérogénicité Les substances chimiques peuvent être considérées comme des agents cancérogènes génotoxiques ou non génotoxiques, selon le mécanisme d'action présumé. Les études de mutagénicité/génotoxicité peuvent fournir des informations préalables permettant de dépister le potentiel cancérogène génotoxique d'une substance. Des informations complémentaires seront fournies par les essais de toxicité par administration répétée, de toxicité subchronique ou de toxicité chronique. L'essai de toxicité par administration répétée, méthode B.7 et les études de toxicité à plus long terme comprennent une évaluation des modifications histopathologiques observées, par exemple de l'hyperplasie de certains tissus, qui peuvent être inquiétantes. Ces études ainsi que les informations toxicocinétiques peuvent aider à mettre en évidence les substances chimiques ayant un potentiel cancérogène qui pourrait alors être approfondi dans le cadre d'un essai de cancérogénicité (méthode B.32) ou souvent d'une étude combinée de toxicité chronique et de cancérogénicité (méthode B.33). B.IV Toxicité pour la reproduction La toxicité pour la reproduction peut se manifester de différentes façons, notamment par des troubles de la fonction ou de la capacité reproductrice mâle ou femelle, qualifiés d'« effet sur la fertilité » :, ou par l'apparition d'effets néfastes non transmissibles chez les descendants, qualifiés de -*toxicité pour le développement »- : qui englobe également la tératogénicité et les effets durant l'allaitement. Pour les études de tératogénicité qui font partie de l'étude de la toxicité pour le développement, la méthode d'essai (méthode B.31) porte principalement sur l'administration par voie orale. D'autres voies d'administration sont également possibles en fonction des propriétés physiques de la substance d'essai ou de la voie probable d'exposition humaine. Dans de tels cas, la méthode d'essai doit être convenablement adaptée en tenant compte des éléments pertinents des méthodes d'essai sur 28 jours. Lorsqu'une étude de la reproduction sur trois générations (fertilité) s'avère nécessaire, il est possible d'utiliser la méthode décrite pour le test de reproduction sur deux générations (méthode B.35) en l'appliquant à une troisième génération. B.V Neurotoxicité La neurotoxicité peut se manifester de différentes façons, à savoir par des modifications fonctionnelles et/ou structurelles et par des modifications biochimiques au niveau du système nerveux central ou périphérique. Les essais de toxicité aiguë peuvent donner une première indication de la neurotoxicité. L'essai de toxicité par administration répétée, méthode B.7, comporte une évaluation des effets neurotoxiques; l'observation clinique des animaux doit donc être particulièrement minutieuse, afin de fournir le maximum de renseignements possible. La méthode doit permettre de mettre en évidence les substances chimiques ayant un potentiel neurotoxique qui pourrait nécessiter d'autres études plus appronfondies. Il importe en outre d'étudier la capacité des substances à produire des effets neurotoxiques spécifiques qui ne seraient pas détectés par d'autres études de toxicité. Certaines substances organophosphorées, par exemple, ont une neurotoxicité différée que les méthodes B.37 et B.38 permettent d'évaluer, après administration unique ou administration répétée. B.VI Immunotoxicité L'immunotoxicité peut se manifester de différentes façons, notamment par une immunosuppression et/ou un renforcement de la réponse immunitaire entraînant soit une hypersensibilité soit une auto-immunité induite. L'essai de toxicité par administration répétée, méthode B.7, comporte une évaluation des effets immunotoxiques. Cette méthode doit permettre de mettre en évidence les substances chimiques ayant un potentiel immunotoxique qui pourrait nécessiter d'autres études plus approfondies. B.VII Toxicocinétique Les études toxicocinétiques facilitent l'interprétation et l'évaluation des données de toxicité. Elles ont pour objet d'élucider certains aspects particuliers de la toxicité de la substance chimique étudiée, et leurs résultats peuvent aider à concevoir d'autres études de toxicité. Il n'est pas envisagé de déterminer l'ensemble des paramètres dans tous les cas; la séquence complète des études toxicocinétiques (absorption, excrétion, distribution et métabolisme) n'est nécessaire que dans de rares cas. Pour certains composés, des modifications de cette séquence peuvent être souhaitables, ou une étude par administration unique peut s'avérer être suffisante (méthode B.36). Les informations concernant la structure chimique (RSA) et les propriétés physico-chimiques peuvent également fournir des renseignements sur les caractéristiques d'absorption par la voie d'administration prévue, ainsi que sur les possibilités de transformation et de distribution dans les tissus. Des études de toxicité et des études toxicocinétiques antérieures peuvent aussi fournir des informations sur les paramètres toxicocinétiques. C. CARACTERISATION DE LA SUBSTANCE A TESTER Avant d'entreprendre toute étude de toxicité, il faut connaître la composition de la substance à tester, y compris les principales impuretés, ainsi que ses propriétés physico-chimiques dont sa stabilité. Les propriétés physico-chimiques de la substance fournissent des informations importantes pour le choix de la voie d'administration, pour la conception des différentes études, ainsi que pour la manipulation et le stockage de la substance. La mise au point d'une méthode d'analyse permettant une évaluation qualitative et quantitative de la substance à tester (y compris, si possible, de ses principales impuretés) dans le véhicule d'administration et dans le matériel biologique doit précéder la mise en oeuvre de l'étude. Toutes les informations concernant l'identification, les propriétés physico-chimiques, la pureté et le comportement de la substance à tester doivent être consignées dans le procès-verbal d'essai. D. SOIN DES ANIMAUX Lors des essais de toxicité, il est essentiel de procéder à des contrôles stricts des conditions ambiantes et d'utiliser des techniques appropriées de soin des animaux. i) Conditions d'hébergement Les conditions ambiantes dans les locaux ou enceintes réservés aux animaux d'expérience doivent être adaptées à l'espèce utilisée pour l'essai.Pour les rats, les souris et les cobayes, la température ambiante doit être de 22° C + 3° C et l'humidité relative de 30 à 70 %; pour les lapins, la température doit être de 20° C + 3° C et l'humidité relative de 30 à 70 %. Certaines techniques expérimentales sont particulièrement sensibles aux effets thermiques et dans de tels cas, des indications précises concernant les conditions adéquates figurent dans la description de la méthode d'essai. Dans tous les essais de toxicité, la température et l'humidité doivent être contrôlées et consignées, et doivent figurer dans le rapport final d'étude. Un éclairage artificiel doit garantir l'alternance de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Les détails concernant les conditions d'éclairage doivent être consignés dans le rapport final d'étude. Sauf si la méthode prévoit d'autres conditions, les animaux doivent être hébergés individuellement ou mis en cage par petits groupes de même sexe. Les cages collectives ne doivent pas contenir plus de cinq animaux. Il est important que les comptes rendus d'expérimentation animale précisent le type de cage utilisé et le nombre d'animaux par cage lors de l'exposition à la substance chimique et pendant toute période d'observation qui suit. ii) Conditions d'alimentation Le régime alimentaire doit répondre à tous les besoins nutritionnels de l'espèce soumise à l'expérience. Lorsque les substances à tester sont administrées dans la nourriture, il se peut que la valeur nutritionnelle de cette dernière soit amoindrie par une interaction entre la substance et un ingrédient de l'alimentation. Cette éventualité doit être prise en compte lors de l'interprétation des résultats de l'essai. Les régimes alimentaires classiquement utilisés en laboratoire sont acceptables, l'eau de boisson étant fournie à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être guidé par la nécessité de garantir une proportion appropriée de substance en cas d'administration par cette méthode. Les contaminants alimentaires qui agissent sur la toxicité ne doivent pas être présents à des concentrations susceptibles d'influencer les résultats. E. BIEN-ETRE DES ANIMAUX Le bien-être des animaux est dûment pris en compte lors de l'élaboration des méthodes d'essai. Quelques exemples sont brièvement cités ci-après, mais cette liste n'est pas exhaustive. Pour connaître les règles et/ou conditions exactes, il faut se référer à l'énoncé des méthodes. - Pour la détermination de la toxicité orale aiguë, deux méthodes sont envisageables : la « méthode des doses fixes » : et la « méthode de classe de toxicité aiguë » :. La méthode des doses fixes n'utilise pas la mort comme critère spécifique d'évaluation de la toxicité, et nécessite moins d'animaux. La méthode de la classe de toxicité aiguë utilise en moyenne 70 % d'animaux en moins que la méthode B.1 pour la toxicité orale aiguë. Ces deux méthodes entraînent moins de souffrances et de détresse que la méthode classique. - Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum scientifiquement acceptable : cinq animaux de même sexe seulement sont testés par dose pour les méthodes B.1 et B.3; 10 animaux seulement (et 5 seulement pour le groupe témoin négatif) sont utilisés pour déterminer la sensibilisation cutanée par la méthode de maximalisation chez le cobaye (méthode B.6); le nombre d'animaux nécessaires comme témoins positifs pour étudier la mutagénicité in vivo est également réduit (méthodes B.11 et B.12). - La souffrance et la détresse des animaux pendant les essais sont minimisées : les animaux présentant des signes de souffrance et de détresse intenses et persistantes pourront être euthanasiés; il n'est pas nécessaire d'administrer les substances connues pour provoquer une détresse et une souffrance intenses du fait des propriétés corrosives ou irritantes de la substances (méthodes B.1, B.2 et B.3). - Les essais limite évitent d'avoir à tester des doses inutilement élevées, tant pour les essais de toxicité aiguë (méthode B.1, B.2 et B.3) que pour les essais de mutagénicité in vivo (méthodes B.11 et B.12). - Une stratégie relative à la détermination des propriétés irritantes permet désormais de ne pas réaliser l'essai ou de le limiter à un seul animal lorsque des éléments scientifiques probants peuvent être fournis. Ces éléments scientifiques peuvent être basés sur les propriétés physico-chimiques de la substance, sur les résultats d'autres essais antérieurs, ou sur les résultats d'essais in vitro dûment validés. Par exemple, si une substance a fait l'objet d'une étude de toxicité aiguë par exposition cutanée à la dose limite (méthode B.3) et qu'aucune irritation cutanée n'a été observée, il n'est peut être pas utile d'effectuer d'autres essais d'irritation cutanée (méthode B.4); les produits qui se sont révélés nettement corrosifs ou responsables d'une irritation cutanée grave à la suite d'une étude d'irritation cutanée (méthode B.4) ne doivent pas faire l'objet d'essais complémentaires d'irritation oculaire (méthode B.5). F. METHODES ALTERNATIVES Un des objectifs scientifiques de l'Union européenne est de mettre au point et de valider des méthodes alternatives qui fournissent autant d'informations que les expérimentations animales actuelles, mais qui nécessitent moins d'animaux, minimisent leurs souffrances et permettent d'éviter leur sacrifice. Dès que de telles méthodes sont disponibles, elles doivent être envisagées, chaque fois que cela est possible, pour la caractérisation des dangers et pour la classification et l'étiquetage des substances en fonction des dangers intrinsèques. G. EVALUATION ET INTERPRETATION L'extrapolation directe à l'homme des résultats des expériences sur les animaux et des essais in vitro n'est possible que dans certaines limites; il faut en tenir compte lors de l'évaluation et de l'interprétation des essais; aussi, lorsque des effets indésirables ont été mis en évidence chez l'homme, ces données peuvent être utilisées pour confirmer les résultats expérimentaux. Ces résultats sont utilisables pour la classification et l'étiquetage des produits chimiques nouveaux ou existants pour leurs effets sur la santé humaine sur la base de leurs propriétés intrinsèques mis en évidence et quantifiés par les méthodes préconisées. Les critères correspondants de classification et d'étiquetage figurant à l'annexe VI font également référence aux critères d'évaluation des protocoles d'essais de ces méthodes. Ces résultats peuvent aussi être utilisés pour les études d'évaluation des risques des produits chimiques nouveaux ou existants, et des stratégies d'essai appropriées sont proposées dans les documents guides correspondants. H. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES La plupart des méthodes présentées ici sont élaborées dans le cadre du programme de lignes directrices de l'OCDE en matière d'essais. Ces méthodes doivent être mises en oeuvre conformément aux Bonnes Pratiques de Laboratoire, afin de garantir l'acceptation mutuelle des données. De plus amples informations peuvent être obtenues dans les références citées dans les lignes directrices de l'OCDE et dans d'autres publications pertinentes. » Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998. ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS Annexe II B « B.1ter TOXICITE (ORALE) AIGU" - METHODE DE LA CLASSE DE TOXICITE AIGU" 1. METHODE 1.1. Introduction La méthode de la classe de toxicité aiguë fournit des informations à la fois pour l'évaluation des risques et pour la classification des substances. La méthode utilise trois doses fixes suffisamment distinctes pour permettre la classification de la substance en fonction des résultats de l'étude. En outre, le protocole décrit permet de choisir trois doses supplémentaires qui peuvent être utilisées à certains stades de décision ou pour la poursuite de l'essai. L'utilisation d'une de ces doses supplémentaires peut être envisagée lorsqu'une analyse plus fine s'avère souhaitable ou nécessaire. La méthode utilise des doses de départ définies; l'objectif n'est pas de calculer une DL50 précise, mais de déterminer une plage d'exposition susceptible d'entraîner la mort, puisque la mort d'une certaine proportion d'animaux reste le principal critère d'évaluation de cet essai. Les résultats de l'essai doivent permettre une classification selon les critères de l'annexe VI. Du fait de l'approche séquentielle, la durée de l'essai peut être supérieure à celle indiquée dans la méthode B.1. Le principal avantage de cette méthode est qu'elle nécessite moins d'animaux que la méthode de toxicité (orale) aiguë (B.1) et que la méthode alternative de la dose fixe (B.1bis). Voir également l'introduction générale, partie B. 1.2. Définitions Voir introduction générale, partie B. 1.3. Principe de la méthode d'essai Une des doses prédéterminées de la substance est administrée oralement à un groupe d'animaux d'expérience. La substance est testée par étapes, chacune des étapes nécessitant trois animaux du même sexe. Il n'est pas nécessaire de procéder à une étude d'observation préliminaire. Selon qu'une mortalité liée à la substance est ou non constatée chez les animaux traités, l'essai se poursuivra comme suit : - l'essai ne sera pas poursuivi, - l'étape suivante sera réalisée à la même dose, mais sur des animaux de l'autre sexe, - l'étape suivante sera réalisée à la dose immédiatement supérieure ou immédiatement inférieure. 1.4. Description de la méthode d'essai 1.4.1. Préparation Des animaux adultes jeunes et sains sont sélectionnés au hasard, marqués pour permettre leur identification et maintenus dans leur cage pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai, afin de leur permettre de s'acclimater aux conditions régnant dans le laboratoire. Les animaux peuvent être regroupés dans les cages par sexe et par dose, mais le nombre d'animaux par cage doit toujours permettre une observation aisée de chaque animal. La substance à tester est administrée aux animaux en une seule fois, par gavage à l'aide d'une sonde oesophagienne ou d'une canule pour intubation appropriée. Si nécessaire, la substance à tester est dissoute ou mise en suspension dans un véhicule approprié. Chaque fois que possible, on utilisera de préférence une solution/suspension aqueuse, ou sinon une solution/émulsion dans l'huile (par exemple, huile de maïs) ou éventuellement une solution dans d'autres véhicules. Si le véhicule utilisé n'est pas aqueux, ses caractéristiques toxiques doivent être connues ou être déterminées avant l'essai. Les animaux sont mis à la diète avant l'administration de la substance (la veille au soir pour le rat et pendant 3-4 heures pour la souris), mais sans les priver d'eau. 1.4.2. Conditions de l'essai 1.4.2.1. Animaux d'expérience Sauf indication contraire, le rat est l'espèce de prédilection en ce qui concerne les rongeurs. Les femelles doivent être nullipares et non gravides. Au début de l'étude, l'écart de poids entre les animaux doit être minime et ne pas dépasser + 20 pour cent du poids moyen pour chaque sexe. 1.4.2.2. Nombre et sexe Trois animaux de même sexe sont utilisés pour chaque étape. Le choix du sexe est indifférent pour la première étape. 1.4.2.3. Doses La dose de départ à utiliser est choisie parmi l'une des trois doses fixes, à savoir 25, 200 et 2 000 mg/kg de poids corporel. La dose de départ doit être celle qui est la plus susceptible d'entraîner la mort d'au moins certains des animaux traités. En fonction de la dose de départ, on pourra utiliser un des modes opératoires représentés sous forme de diagrammes à l'annexe I. Pour sélectionner le sexe et la dose de départ, toutes les informations disponibles doivent être utilisées, y compris les données concernant la relation structure-activité. Lorsque les informations suggèrent qu'une mortalité est improbable à la dose la plus élevée (2 000 mg/kg p.c.), il y a lieu d'effectuer un essai de limite. En l'absence d'informations sur une substance à tester, il est recommandé, pour des motifs ayant trait au bien-être des animaux, d'utiliser la dose de départ de 200 mg/kg p.c. Il peut être souhaitable d'obtenir des informations plus précises que celles fournies par l'essai aux trois doses fixes de 25, 200 et 2 000 mg/kg p.c. Dans ce cas, il est possible de poursuivre l'essai en utilisant des doses fixes supplémentaires de 5, 50 ou 500 mg/kg p.c. Il n'est pas nécessaire d'administrer des doses dont on sait qu'elles entraîneront une souffrance et une détresse importantes, du fait des propriétés corrosives ou très irritantes de la substance. Le laps de temps qui s'écoule entre le traitement des différents groupes est fonction de la date d'apparition, de la durée et de la gravité des signes de toxicité observés. Le traitement des animaux de l'autre sexe ou le traitement par la dose supérieure seront différés jusqu'à ce que l'on se soit assuré de la survie des animaux précédemment traités. 1.4.2.4. Essai limite Il est possible d'effectuer un essai limite à la dose de 2 000 mg/kg p.c. sur trois animaux de chaque sexe. Si l'on observe une mortalité due à la substance, il peut s'avérer nécessaire de poursuivre l'essai à la dose de 200 mg/kg p.c. (ou 500 mg/kg p.c.). 1.4.2.5. Période d'observation Les animaux sont normalement observés pendant 14 jours, à moins qu'ils ne meurent avant ou qu'il ne soit nécessaire de les exclure de l'étude et de les sacrifier par euthanasie pour abréger leurs souffrances. La durée de la période d'observation ne doit toutefois pas être fixée de façon rigide; elle doit être déterminée en fonction des effets toxiques, de leur date d'apparition et de la durée de la période de récupération, et peut donc être prolongée si nécessaire. Le moment où les signes de toxicité apparaissent et celui où ils disparaissent sont importants, en particulier si ces signes ont tendance à apparaître tardivement. Toutes les observations sont systématiquement consignées et une fiche individuelle est établie pour chaque animal. 1.4.3. Mode opératoire Après la période de jeûne, les animaux sont pesés préalablement à l'administration de la substance. Une fois la substance administrée, les animaux peuvent être privés de nourriture pendant une nouvelle période de 3-4 heures. Lorsqu'une dose est administrée en plusieurs fois sur une période donnée, il peut être nécessaire, suivant la durée de cette période, de nourrir et d'abreuver les animaux. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une seule fois dépend de la taille de l'animal d'expérience. Chez les rongeurs, ce volume ne doit normalement pas excéder 1 ml/100 g de poids corporel; toutefois, cette limite peut être portée à 2 ml/100 g de poids corporel dans le cas des solutions aqueuses. Pour minimiser la variabilité du volume d'essai, les concentrations doivent être adaptées de manière que toutes les doses soient administrées à volume constant. Si l'administration en une dose unique n'est pas possible, la dose peut être fractionnée en plusieurs prises sur une période ne dépassant pas 24 heures. Le mode opératoire détaillé figure à l'annexe I. 1.4.3.1. Observation générale Une observation clinique détaillée doit être effectuée à deux reprises au moins le jour de l'administration ou davantage si la réaction des animaux le nécessite, et au moins une fois par jour par la suite. Les animaux retrouvés à l'état moribond et ceux qui présentent des signes de souffrance et de détresse intenses et persistants doivent être euthanasiés. Les animaux sacrifiés pour ces motifs sont pris en compte de la même façon que les animaux qui succombent au cours de l'essai. Lorsque des animaux sont sacrifiés pour des raisons humanitaires ou sont retrouvés morts, le moment de leur mort doit être noté aussi précisément que possible. Des observations complémentaires sont nécessaires si les animaux continuent de présenter des signes de toxicité. Ces observations doivent porter sur les modifications de la peau et des poils, des yeux et des muqueuses, de l'appareil respiratoire, du système circulatoire, des systèmes nerveux autonome et central, de l'activité somato-motrice et du comportement. Il convient d'être particulièrement attentifs aux manifestations telles que tremblements, convulsions, salivation, diarrhées, léthargie, sommeil et coma. Toutes les observations sont systématiquement consignées, et une fiche individuelle est établie pour chaque animal. 1.4.3.2. Poids corporel Tous les animaux doivent être pesés peu de temps avant l'administration de la substance à tester, et au moins une fois par semaine par la suite. Les variations du poids doivent être calculées et consignées. A la fin de l'essai, les animaux survivants sont pesés avant d'être euthanasiés. 1.4.3.3. Autopsie Tous les animaux d'expérience, y compris ceux qui sont morts pendant l'essai ou qui ont été retirés de l'étude, sont soumis à une autopsie. Pour chaque animal, toutes les modifications pathologiques macroscopiques doivent être consignées. Un examen microscopique des organes présentant des signes de pathologie à l'examen macroscopique peut être envisagé pour les animaux ayant survécu au minimum 24 heures, car il peut fournir des informations utiles. 2. RESULTATS Les résultats doivent être indiqués pour chaque animal, individuellement.En outre, tous les résultats doivent être récapitulés sous forme de tableaux indiquant, pour chaque lot d'expérience, le nombre d'animaux utilisé, le nombre d'animaux présentant des signes de toxicité, le nombre d'animaux retrouvés morts au cours de l'essai ou sacrifiés pour des raisons humanitaires, le moment de la mort de chaque animal, la description des effets toxiques, leur période d'apparition et leur évolution, ainsi que les résultats de l'autopsie. Des indications générales concernant l'interprétation des résultats en vue de la classification figurent à l'annexe 2. 3. COMPTE RENDU Procès-verbal d'essai Le procès-verbal d'essai contiendra, si possible, les renseignements suivants : Animaux d'expérience : - espèce/souche, - état des animaux, sur le plan microbiologique, si informations à ce sujet, - nombre d'animaux, âge et sexe, - origine, conditions d'hébergement, régime alimentaire, etc., - poids de chaque animal au début de l'essai, à intervalles d'une semaine par la suite et à la fin de l'essai. Conditions expérimentales : - justification du choix du véhicule si autre que de l'eau, - détails concernant l'administration de la substance, y compris les volumes administrés et le moment de l'administration, - détails sur la qualité de la nourriture et de l'eau (type/origine, origine de l'eau), - justification du choix de la dose de départ. Résultats : - tableaux des résultats par sexe et par dose pour chaque animal (à savoir les animaux présentant des signes d'intoxication, mortalité comprise; nature, gravité et durée des effets), - date d'apparition des signes de toxicité, évolution dans le temps et réversibilité éventuelle, - résultats de l'autopsie et le cas échéant de l'examen histopathologique, pour chaque animal. Discussion des résultats Conclusions 4. REFERENCES Cette méthode reprend la ligne directrice 423 de l'OCDE. Annexe 1 MODE OPERATOIRE 1. Comme indiqué au paragraphe 1.4.2.3, la dose de départ doit être la dose susceptible d'entraîner une mortalité chez au moins certains des animaux traités. Les informations pouvant servir à sélectionner cette dose de départ sont les suivantes : - données relatives aux propriétés physico-chimiques, - relation structure-activité, - toutes les données résultant des autres essais de toxicité, - usage prévu de la substance à tester. 2. Pour chaque dose de départ, la procédure à suivre est indiquée par le programme d'essai correspondant figurant dans la présente annexe. En fonction du nombre d'animaux morts ou sacrifiés selon une méthode humaine, la procédure à suivre est indiquée par des flèches. 3. Lorsque l'administration d'une dose de départ de 25 ou de 200 mg/kg de poids corporel entraîne la mort d'un seul animal de l'autre sexe, l'essai n'a normalement pas à être poursuivi.Toutefois, si aucun signe de toxicité n'est observé sur les cinq autres animaux, il convient, au moment de l'autopsie, d'envisager la possibilité que le décès n'ait pas été causé par la substance. Dans ce cas, l'essai doit être poursuivi en utilisant la dose immédiatement supérieure. 4. Si l'administration d'une dose de 2 000 mg/kg de poids corporel entraîne la mort d'un animal de chaque sexe, il est probable que la DL50 soit supérieure à 2 000 mg/kg p.c. Toutefois, dans la mesure où il s'agit d'un résultat limite, il convient d'observer attentivement la réaction des deux autres animaux de chaque sexe car l'apparition de signes nets et marqués d'intoxication chez ces animaux pourrait aboutir à une classification correspondant à une DL50 inférieure ou égale à 2 000 mg/kg p.c. ou justifier la poursuite de l'essai à cette même dose. 5. La procédure permet d'effectuer l'essai en utilisant trois doses fixes supplémentaires (option 2).Cette option peut être utilisée pour sélectionner une autre dose à un moment donné, ou pour poursuivre les essais une fois l'essai en question terminé (option 1). L'option 1 est indiquée par des flèches épaisses, l'option 2 par des flèches fines. Pour la consultation du tableau, voir image Vu pour être annexé à Notre arrêté du 14 décembre 1998. ALBERT Par le Roi : Le Ministre de la Santé publique, M. COLLA La Ministre de l'Emploi et du Travail, Mme M. SMET Le Secrétaire d'Etat à l'Environnement, J. PEETERS Annexe II C « B.6 SENSIBILISATION CUTANEE 1. METHODE 1.1. Introduction Remarques : La sensibilité des essais et leur capacité à détecter les substances susceptibles d'entraîner une sensibilisation cutanée chez l'homme sont des critères importants dans un système de classification de la toxicité établi à des fins de santé publique. Il n'existe pas de méthode d'essai unique qui permette d'identifier de manière adéquate toutes les substances ayant un potentiel de sensibilisation cutanée pour l'homme et qui puisse être appliquée à toutes les substances. Divers facteurs tels que les caractéristiques physiques d'une substance, y compris son pouvoir de pénétration cutanée, doivent être pris en considération lors du choix de l'essai. Deux types d'essai utilisant des cobayes ont été développés : d'une part, les essais avec adjuvant dans lesquels l'état est potentialisé par la dissolution ou la mise en suspension dans de l'adjuvant complet de Freund (ACF) de la substance à tester, et d'autre part les essais sans adjuvant. Les essais avec adjuvant ont généralement un meilleur pouvoir prédictif du potentiel sensibilisant cutané de la substance testée avec plus de précision que les méthodes qui n'utilisent pas l'adjuvant complet de Freund. C'est la raison pour laquelle leur utilisation est préférable. L'essai de maximalisation chez le cobaye (GPMT : Guinea Pig Maximisation Test) est un essai avec adjuvant très répandu. Bien qu'il existe plusieurs autres méthodes pour détecter le potentiel de sensibilisation cutanée, le GPMT est l'essai avec adjuvant de prédilection. Les essais sans adjuvant (l'essai de Buehler étant préférable) sont considérés comme moins sensibles vis-à-vis de nombreuses classes de produits chimiques. Dans certains cas, l'essai de Buehler qui consiste en une application topique, peut s'avérer préférable à l'essai de maximalisation qui nécessite une injection intradermique. L'utilisation de l'essai de Buehler doit être scientifiquement justifiée. L'essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT) et l'essai de Buehler sont décrits dans cette méthode. D'autres méthodes peuvent être utilisées, à condition qu'elles soient correctement validées et que leur utilisation soit scientifiquement justifiée. Si un résultat positif est obtenu dans un test de dépistage reconnu, une substance peut être considéré comme un sensibilisant potentiel et il peut ne pas être nécessaire de réaliser un essai complémentaire sur le cobaye. Cependant si un résultat négatif est obtenu dans un tel test de dépistage, un essai sur le cobaye doit être effectué en utilisant la procédure décrite dans la présente méthode d'essai. Voir également introduction générale, partie B. 1.2. Définitions La sensibilisation cutanée (dermite allergique de contact) est une réaction immunologique cutanée à une substance. Chez l'homme, la réaction peut se caractériser par un prurit, un érythème, un oedème, des vésicules, des bulles ou une association de ces manifestations. Dans les autres espèces, la réaction peut différer et prendre uniquement la forme d'un érythème ou d'un oedème. Exposition d'induction : exposition expérimentale d'un sujet à une substance dans le but d'induire une hypersensibilité. Période d'induction : période d'au moins une semaine consécutive à l'exposition d'induction, au cours de laquelle une hypersensibilité peut s'installer. Exposition de déclenchement : exposition expérimentale, après période d'induction, d'un sujet préalablement exposé à la substance, dans le but de vérifier si le sujet présente une réaction d'hypersensibilité. 1.3. Substances de référence La sensibilité et la fiabilité de la technique expérimentale utilisée doivent être vérifiées tous les six mois à l'aide de substances ayant des propriétés connues de sensibilisation cutanée faible à modérée. Pour un essai conduit selon les règles, les substances faiblement ou moyennement sensibilisantes provoquent normalement une réaction d'au moins 30 % dans les méthodes avec adjuvant et 15 % dans les méthodes sans adjuvant. Les substances suivantes seront de préférence utilisées : Pour la consultation du tableau, voir image Dans certaines circonstances dûment justifiées, il est possible d'utiliser d'autres substances répondant aux critères ci-dessus. 1.4. Principe de la méthode d'essai Les animaux d'expérience sont dans un premier temps exposés à la substance à tester par une injection intradermique et/ou une application épidermique (exposition d'induction). Après une période de repos de 10 à 14 jours (période d'induction) au cours de laquelle une réaction immunitaire peut se produire, les animaux sont exposés à une dose de déclenchement. L'étendue et le degré de la réaction cutanée des animaux sont alors comparées à celles de la réaction observée chez les animaux témoins qui ont reçu un placebo lors de l'induction et qui ont été soumis à l'exposition de déclenchement. 1.5. Description des méthodes d'essai Si l'élimination de la substance à tester s'avère nécessaire, ceci doit être fait en utilisant de l'eau ou un solvant approprié afin de ne pas modifier la réaction existante ou l'intégrité de l'épiderme. 1.5.1. Essai de maximalisation chez le cobaye (GMPT) 1.5.1.1. Préparation De jeunes cobayes albinos, sains, sont acclimatés aux conditions du laboratoire pendant au moins cinq jours avant le début de l'essai. Avant l'essai, les animaux sont répartis au hasard en lots à traiter et lots témoins. Les poils sont tondus, rasés ou épilés chimiquement selon la méthode utilisée. Il faut veiller à ne pas érafler la peau. Les animaux sont pesés avant le début et à la fin de l'essai. 1.5.1.2. Conditions de l'essai 1.5.1.2.1. Animaux d'expérience Souches de cobayes albinos couramment utilisées en laboratoire. 1.5.1.2.2. Nombre et sexe On peut utiliser des animaux de l'un ou l'autre sexe. Si l'on utilise des femelles, elles doivent être nullipares et non gravides. Le lot traité comprend au minimum 10 animaux et le lot témoin, au moins 5. Si le lot traité comprend moins de 20 animaux et le lot témoin moins de 10, et qu'il n'est pas possible de conclure que la substance à tester est un agent sensibilisant. Dans ce cas, il est fortement recommandé d'utiliser d'autres animaux afin d'arriver à un total d'au moins 20 animaux d'essai et 10 animaux témoins. 1.5.1.2.3. Doses La concentration de substance utilisée pour chaque exposition d'induction doit être bien tolérée par l'organisme des animaux et doit correspondre à la concentration maximale entraînant une irritation cutanée légère à modérée. La concentration utilisée pour l'exposition de déclenchement doit correspondre à la concentration maximale n'entraînant pas d'irritation. Si nécessaire, les concentrations appropriées peuvent être déterminées à partir d'un essai pilote impliquant deux ou trois animaux. A cet effet, il convient d'utiliser des animaux traités par l'adjuvant complet de Freund. 1.5.1.3. Mode opératoire 1.5.1.3.1. Induction Jour 0 - lot traité Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml chacune sont pratiquées dans la région scapulaire préalablement débarrassée de ses poils, de part et d'autre de la ligne médiane. Injection 1 : mélange 1 :1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique Injection 2 : la substance à tester dans un véhicule adéquat, à la concentration sélectionnée Injection 3 : la substance à tester à la concentration voulue, mélangée dans un rapport 1 :1 (v/v) à de l'adjuvant complet de Freund ou du sérum physiologique. Pour l'injection 3, les substances hydrosolubles sont dissoutes dans la phase aqueuse avant d'être mélangées avec l'adjuvant complet de Freund. Les substances liposolubles ou insolubles sont d'abord mises en suspension dans l'adjuvant complet de Freund, puis mises en phase aqueuse. La concentration finale de la substante à tester doit être égale à celle utilisée pour l'injection 2. Les injections 1 et 2 sont pratiquées à proximité l'une de l'autre et le plus près possible de la tête, tandis que l'injection 3 est effectuée vers la partie caudale de la zone d'essai. Jour 0 - lot témoin Trois séries de deux injections intradermiques d'un volume de 0,1 ml chacune sont réalisées aux mêmes endroits que chez les animaux traités. Injection 1 : mélange 1 :1 (v/v) adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique Injection 2 : le véhicule non dilué Injection 3 : formulation à 50 % du véhicule dans un mélange 1 :1 d'adjuvant complet de Freund/eau ou sérum physiologique. 5ème - 7ème jour - lot traité et lot témoin Environ 24 heures avant l'application topique d'induction et si la substance ne provoque pas d'irritation cutanée, la zone d'essai rasée et/ou tondue est badigeonnée avec 0,5 ml de lauryl sulfate de sodium à 10 % dans de la vaseline, afin de créer une irritation locale. 6ème - 8ème jour - lot traité La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Un papier filtre (2 x 4 cm) imprégné de la substance dans le véhicule approprié est appliqué sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau à l'aide d'un pansement occlusif pendant 48 heures. Le choix du véhicule doit être justifié. Les substances solides sont réduites en poudre fine et incorporées dans un véhicule approprié; les substances liquides peuvent éventuellement être appliquées directement. 6ème - 8ème jour - lot témoin La zone d'essai est à nouveau débarrassée de ses poils. Le véhicule seul est appliqué comme indiqué précédemment sur la zone d'essai et maintenu en contact avec la peau pendant 48 heures à l'aide d'un pansement occlusif. 1.5.1.3.2. Déclenchement 20ème - 22ème jour - lot traité et lot témoin Les flancs des animaux traités et des animaux témoins sont débarrassés de leurs poils. Un patch ou une cupule chargés de la substance à tester est appliqué sur un des flancs des animaux et, s'il y a lieu, un patch ou une cupule imprégnés uniquement du véhicule est appliqué sur l'autre flanc. Les pastilles sont maintenues en contact avec la peau pendant 24 heures à l' …