Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaa

14 DECEMBER 1998. - Koninklijk besluit tot wijziging van het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaarlijk kunnen zijn voor de mens of voor zijn leefmilieu ALBERT II, Koning der Belgen, Aan allen die nu zijn en hierna wezen zullen, Onze Groet. Gelet op de wet van 24 februari 1921Relevante gevonden documenten type wet prom. 24/02/1921 pub. 17/12/2004 numac 2004000617 bron federale overheidsdienst binnenlandse zaken Wet betreffende het verhandelen van giftstoffen, slaapmiddelen, verdovende middelen, ontsmettingsstoffen of antiseptica. - Duitse vertaling sluiten betreffende het verhandelen van giftstoffen, slaapmiddelen en verdovende middelen, ontsmettingsstoffen en antiseptica, inzonderheid op artikel 1, gewijzigd bij de wetten van 11 maart 1958, 1 juli 1976 en 14 juli 1994; Gelet op de wet van 4 augustus 1996Relevante gevonden documenten type wet prom. 04/08/1996 pub. 21/10/1999 numac 1999015088 bron ministerie van buitenlandse zaken, buitenlandse handel en internationale samenwerking Wet houdende instemming met het Protocol tussen de regering van het Koninkrijk België en de regering van de Franse Republiek betreffende het kraamgeld, ondertekend te Brussel op 26 april 1993 type wet prom. 04/08/1996 pub. 30/06/1998 numac 1998015016 bron ministerie van buitenlandse zaken, buitenlandse handel en ontwikkelingssamenwerking Wet houdende goedkeuring van de Overeenkomst over het Wegvervoer tussen het Koninkrijk België, de Republiek Estland, de Republiek Letland, de Republiek Litouwen, het Groothertogdom Luxemburg en het Koninkrijk der Nederlanden, ondertekend te Athene op 11 juni 1992 sluiten betreffende het welzijn van de werknemers bij de uitvoering van hun werk; Gelet op de wet van 28 mei 1956 betreffende ontplofbare en voor deflagratie vatbare stoffen en mengsels en de daarmee geladen tuigen; Gelet op de wet van 11 juli 1969 betreffende de bestrijdingsmiddelen en de grondstoffen voor de landbouw, tuinbouw, bosbouw en veeteelt; Gelet op de wet van 24 januari 1977Relevante gevonden documenten type wet prom. 24/01/1977 pub. 28/03/2023 numac 2023040887 bron federale overheidsdienst binnenlandse zaken Wet betreffende de bescherming van de gezondheid van de verbruikers op het stuk van de voedingsmiddelen en andere produkten. - Duitse vertaling van wijzigingsbepalingen sluiten betreffende de bescherming van de gezondheid van de verbruikers op het stuk van de voedingsmiddelen en andere produkten, gewijzigd bij de wet van 22 maart 1989; Gelet op de wet van 14 juli 1991Relevante gevonden documenten type wet prom. 14/07/1991 pub. 14/01/2008 numac 2007001065 bron federale overheidsdienst binnenlandse zaken Wet betreffende de handelspraktijken en de voorlichting en bescherming van de consument. - Duitse vertaling van wijzigingsbepalingen type wet prom. 14/07/1991 pub. 28/11/2007 numac 2007000956 bron federale overheidsdienst binnenlandse zaken Wet betreffende de handelspraktijken en de voorlichting en bescherming van de consument. - Duitse vertaling van wijzigingsbepalingen sluiten betreffende de handelspraktijken en de voorlichting en bescherming van de consument, gewijzigd bij de wet van 5 november 1993; Gelet op de richtlijn 67/548/EEG van de Raad van de Europese Gemeenschappen van 27 juni 1967 betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen van de Lid-Staten inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen, laatstelijk gewijzigd bij de richtlijn 96/56/EG van het Europees Parlement en de Raad van 3 september 1996; Gelet op de richtlijn 94/69/EG van de Commissie van 19 december 1994 tot eenentwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen; Gelet op de richtlijn 96/54/EG van de Commissie van 30 juli 1996 tot tweeëntwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtlelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijk stoffen; Gelet op het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaarlijk kunnen zijn voor de mens of voor zijn leefmilieu, gewijzigd bij de koninklijke besluiten van 14 februari 1985, 14 september 1989, van 19 juli 1994 en van 13 november 1997, alsook op het koninklijk besluit van 14 september 1993 tot aanstelling van de diensten en ambtenaren belast met het opsporen en vaststellen van de inbreuken op de bepalingen van voormeld koninklijk besluit van 24 mei 1982; Gelet op het koninklijk besluit van 27 oktober 1988 betreffende de toepassing van de beginselen van goede laboratoriumpraktijken en het toezicht op de uitvoering ervan bij proeven op scheikundige stoffen alsook op het koninklijk besluit van 14 november 1993 betreffende de bescherming van proefdieren; Gelet op het koninklijk besluit van 11 januari 1993 tot regeling van de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke preparaten met het oog op het op de markt brengen of het gebruik ervan gewijzigd door het koninklijk besluit van 23 juni 1995, en het koninklijk besluit van 14 juli 1998; Gelet op het advies van de Hoge Raad voor Preventie en Bescherming op het Werk van 16 oktober 1998; Gelet op de wetten op de Raad van State, gecoördineerd op 12 januari 1973, inzonderheid op artikel 3, § 1, gewijzigd door de wetten van 9 augustus 1980, 16 juni 1989 en 4 juli 1989; Gelet op de dringende noodzakelijkheid; Overwegende dat richtlijn 94/69/EG van 19 december 1994, waarvan de omzettingstermijn verstreken is sedert 1 september 1996 en richtlijn 96/54/EG van 30 juli 1996 waarvan de omzettingstermijn verstreken is, deels sedert 31 otober 1997 en voor het overige sedert 31 mei 1998, onverwijld moeten worden omgezet. Overwegende dat het Hof van Justitie van de Europese Gemeenschappen op 6 oktober 1998 Belgïe heeft veroordeeld wegens niet omzetting van de richtlijn 94/69/EG van 19 december 1994 in de Zaak C-79/98; Op de voordracht van Onze Minister van Volksgezondheid, van Onze Minister van Tewerkstelling en Arbeid en van Onze Staats- secretaris voor Leefmilieu, Hebben Wij besloten en besluiten Wij : Artikel 1.De bijlagen van het koninklijk besluit van 24 mei 1982 houdende reglementering van het in de handel brengen van stoffen die gevaarlijk kunnen zijn voor de mens of voor zijn leefmilieu, gewijzigd bij de koninklijke besluiten van 14 februari 1985, 14 september 1989, 19 juli 1994 en 13 november 1997 worden als volgt gewijzigd : - Bijlage I wordt vervangen door bijlage I bij dit besluit; - Bijlage V, deel B, wordt als volgt gewijzigd : a) De tekst in bijlage II, onder A, van dit besluit vervangt de titel en de algemene inleiding van deel B "Methoden voor de bepaling van de toxiciteit". b) De tekst in bijlage II, onder B, van dit besluit wordt ingevoegd na hoofdstuk B.1 bis. c) De tekst in bijlage II, onder C, van dit besluit vervangt hoofdstuk B.6. d) De tekst in bijlage II, onder D, van dit besluit vervangt hoofdstuk B.7. e) De tekst in bijlage II, onder E, van dit besluit wordt toegevoegd. - De tekst in bijlage III van dit besluit vervangt de aangegeven tekst van bijlage VI. Art. 2.Onze Minister van Volksgezondheid, Onze Minister van Tewerkstelling en Arbeid en Onze Staatssecretaris voor Leefmilieu zijn, ieder wat hem betreft, belast met de uitvoering van dit besluit. Gegeven te Brussel, 14 december 1998. ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS Bijlage 1 Lijst van de gevaarlijke stoffen Als lijst van de gevaarlijke stoffen voor deze bijlage geldt de bijlage III, deel I, van het koninklijk besluit van 11 januari 1993 tot regeling van de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke preparaten met het oog op het op de markt brengen of het gebruik ervan, gewijzigd door het koninklijk besluit van 23 juni 1995 en door het koninklijk besluit van 14 juli 1998; Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998. ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS Bijlage II A "DEEL B : METHODEN VOOR DE BEPALING VAN DE TOXICITEIT EN ANDERE INVLOEDEN OP DE GEZONDHEID ALGEMENE INLEIDING : DEEL B A. VERKLARENDE NOOT Voor de doeleinden van deze richtlijn wordt de volgende nummering toegepast : B.15. Genmutatie - Saccharomyces cerevisiae B.16. Mitotische recombinatie - Saccharomyces cerevisiae B.17. Genmutatietest - zoogdiercellen in vitro B.18. DNA-beschadiging en -herstel - DNA-herstelsynthese - zoogdiercellen in vitro B.19. Zusterchromatiden-uitwisselingstest in vitro B.20. Test op recessief-letale mutaties van geslachtsgebonden genen bij Drosophila melanogaster B.21. Transformatietest op zoogdiercellen in vitro B.22. Test op dominant-letale mutaties bij knaagdieren B.23. Cytogenetisch onderzoek van geslachtscellen van zoogdieren in vivo B.24. Vlekkentest op muizen B.25. Erfelijke translocaties bij de muis B.26. Subchronische orale toxiciteitstest : 90-daagse herhaalde orale toediening aan knaagdiersoorten B.27. Subchronische orale toxiciteitstest : 90-daagse herhaalde orale toediening aan niet-knaagdiersoorten B.28. Subchronische dermale toxiciteitstest : 90-daagse herhaalde dermale toediening aan knaagdiersoorten B.29. Subchronische inhalatietoxiciteitstest : 90-daagse herhaalde inhalatoire toediening aan knaagdiersoorten B.30. Chronische-toxiciteitstest B.31. Teratogeniteitstest bij knaagdieren en niet-knaagdieren B.32. Carcinogeniteitstest B.33. Gecombineerde test op chronische toxiciteit en carcinogeniteit B.34. Test op reproduktietoxiciteit over één generatie B.35. Test op reproduktietoxiciteit over twee generaties B.36. Toxicokinetica B. ALGEMENE DEFINITIES VAN DE BEGRIPPEN DIE GEBRUIKT WORDEN BIJ DE TESTMETHODEN IN DEZE BIJLAGE i) Acute toxiciteit omvat de schadelijke effecten die binnen een gegeven tijd (meestal 14 dagen) na de toediening van een enkelvoudige dosis van een stof optreden. ii) Manifeste toxiciteit is een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een risicobepaling mogelijk maken en van een zodanige aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden. iii) Dosis is de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht (gram of milligram) of als het gewicht van de teststof per gewichtseenheid van het proefdier (bij voorbeeld mg per kg lichaamsgewicht) of als constante concentratie in het dieet (ppm, delen per miljoen of mg per kg voedsel). iv) Discriminerende dosis is het hoogste van de vier vaste dosisniveaus dat kan worden toegediend zonder dat met de teststof verband houdende sterfte wordt veroorzaakt (met inbegrip van de proefdieren die moeten worden afgemaakt). v) Dosering is een algemeen begrip dat de dosis, de frequentie en de duur van de toediening omvat. vi) LD50 (letale-dosismediaan) is de statistisch vastgestelde enkelvoudige dosis van een stof waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de dieren die de dosis hebben ontvangen de dood intreedt. De LD50-waarde wordt uitgedrukt in het gewicht van de teststof per gewichtseenheid proefdier (mg/kg). vii) LC50 (letale-concentratiemediaan) is de statistisch vastgestelde concentratie van een stof waarvan kan worden verwacht dat bij 50 % van de gedurende een bepaalde tijd blootgestelde dieren, tijdens de blootstelling of binnen een bepaalde tijd na de blootstelling de dood intreedt. De LC50-waarde wordt uitgedrukt in het gewicht van de teststof per standaardvolume lucht (mg/l). viii) NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) is de afkorting voor de hoogste dosis of het hoogste niveau van blootstelling waarbij nog geen waarneembare toxiciteitsverschijnselen optreden die verband houden met de behandeling. ix) Subchronische toxiciteit bij herhaalde dosis omvat de schadelijke effecten die optreden bij proefdieren ten gevolge van herhaalde dagelijkse toediening van, of blootstelling aan een chemische stof gedurende een kort gedeelte van hun verwachte levensduur. x) De maximale verdraagbare dosis (Maximum Tolerated Dose - MTD) is het hoogste dosisniveau dat tekenen van toxiciteit bij proefdieren tot gevolg heeft zonder dat dit belangrijke gevolgen heeft voor de overleving in de test waarin ze wordt gebruikt. xi) Huidirritatie is het ontstaan van een ontstekingsreactie in de huid door het toedienen van een teststof op de huid. xii) Oogirritatie is het ontstaan van veranderingen in het oog door het toedienen van een teststof op het oppervlak aan de voorzijde van het oog. xiii) Sensibilisatie van de huid (allergische contactdermatitis) is een via het immuunsysteem veroorzaakte reactie van de huid op een stof. xiv) Huidaantasting is het optreden van irreversibele huidweefselbeschadiging na het toedienen van een teststof gedurende een periode van 3 minuten tot 4 uur. xv) Toxicokinetica is de bestudering van de absorptie, de distributie, het metabolisme en de excretie van teststoffen. xvi) Absorptie is het (geheel van) proces(sen) waardoor een toegediende stof het lichaam binnenkomt. xvii) Excretie is het (geheel van) proces(sen) waardoor de toegediende stof en/of de metabolieten daarvan door het lichaam worden uitgescheiden. xviii) Distributie is het (geheel van) proces(sen) waardoor de geabsorbeerde stof en/of de metabolieten daarvan over het lichaam worden verdeeld. xix) Metabolisme is het (geheel van) proces(sen) waardoor de toegediende stoffen in het lichaam chemisch worden veranderd door enzymatische of niet-enzymatische reacties. B.I Acute toxiciteit, subchronische toxiciteit bij herhaalde dosis en chronische toxiciteit. De acute toxicologische effecten en de orgaan- of systeemtoxiciteit van een stof kunnen worden vastgesteld via een aantal toxiciteitstesten (methoden B.1-B.5) waarmee, na toediening van een enkele dosis, een eerste indicatie van de toxiciteit kan worden verkregen. Afhankelijk van de toxiciteit van de stof kan worden overwogen een limietproef in plaats van een volledige LD50 uit te voeren. Er is echter geen limietproef gespecificeerd bij inhalatieonderzoek omdat het niet mogelijk is gebleken om een ondubbelzinnige blootstellingslimiet bij inhalatie te definiëren. Bij voorkeur moeten methoden worden toegepast waarbij zo weinig mogelijk proefdieren worden gebruikt en waarbij ongerief en pijn de proefdieren worden geminimaliseerd, bij voorbeeld door gebruik van de vaste-dosismethode (methode B.1 bis) en de bepaling van de acute-toxiciteitsklasse (methode B.1 ter). Bij proeven op het eerste niveau kunnen de resultaten van het eerste onderzoek worden aangevuld door onderzoek bij een tweede diersoort. In dit geval kan een standaard-testmethode worden gebruikt of kan de methode worden aangepast voor een kleiner aantal proefdieren. De toxiciteitstest door herhaalde toediening (methoden B.7, B.8 en B.9) omvat de evaluatie van toxische effecten die het gevolg zijn van herhaalde blootstelling. Van groot belang is nauwkeurige klinische observatie van de proefdieren om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen. Door deze proeven moet het mogelijk worden om de toxicologische doelwitorganen alsmede de toxische en niet-toxische doses te bepalen. Verder gedetailleerd onderzoek van deze aspecten kan nodig zijn in onderzoek op langere termijn (methoden B.26-B.30 en B.33). B.II Mutageniteit - Genotoxiciteit Mutageniteit heeft betrekking op het veroorzaken van permanente erfelijke veranderingen in de hoeveelheid of de structuur van het erfelijk materiaal van cellen of organismen. Deze veranderingen (mutaties) kunnen een enkel gen of gensegment, een genenblok of één of meer volledige chromosomen betreffen. De chromosomale effecten kunnen van structurele en/of numerieke aard zijn. De mutagene activiteit van een stof wordt in vitro vastgesteld voor puntmutaties bij bacteriën (methoden B.13/14) en/of voor structurele chromosoomafwijkingen bij zoogdiercellen (methode B.10). Ook in vivo procedures, zoals de micronucleustest (methode B.12) of de metafaseanalyse bij beenmergcellen (methode B.11) zijn aanvaardbaar. Bij afwezigheid van contra-indicaties hebben de in vitro methoden echter verre de voorkeur. Voor hogere produktievolumes en/of met het oog op de uitvoering of nadere uitwerking van een risicobeoordeling, kunnen aanvullende onderzoeken van de mutageniteit en pre-screening op carcinogeniteit nodig zijn. Deze kunnen voor een aantal doelen worden gebruikt : om resultaten van de basistests te bevestigen, om parameters te evalueren die niet in de basistests zijn onderzocht en om in vivo onderzoek op te zetten of uit te breiden. Hiertoe omvatten de methoden B.15 tot B.25 zowel in vivo als in vitro eukaryotische systemen en een uitgebreide reeks biologische parameters ("end-points"). Deze proeven geven informatie over puntmutaties en andere parameters in organismen die complexer zijn dan de bacteriën die in de basistests worden gebruikt. Als een programma van verder mutageniteitsonderzoek wordt overwogen, moet de opzet in principe zodanig zijn dat relevante aanvullende informatie over de mogelijke mutagene en/of carcinogene eigenschappen van de stof wordt verkregen. Welk onderzoek in een bepaald geval geschikt is hangt af van een groot aantal factoren zoals : de chemische en fysische eigenschappen van de stof, de resultaten van voorafgaand bacteriologisch en cytogenetisch onderzoek, het metabolisch profiel van de stof, de resultaten van andere toxiciteitsonderzoeken en de toepassingen van de stof voor zover deze bekend zijn. In het licht van de verscheidenheid van factoren die eventueel nader onderzoek verdienen, is het niet gewenst om ten aanzien van de aard van de uitgevoerde proeven strikte regels vast te stellen. In KB van 13 november 1997 is een aantal algemene beginselen vastgelegd. Duidelijke teststrategieën kunnen worden gevonden in de technische leidraad met betrekking tot risicobepaling; die is echter flexibel en kan naar behoefte worden aangepast aan specifieke omstandigheden. Hieronder zijn methoden voor verder onderzoek opgesomd op basis van het voornaamste genetische criterium. Onderzoek op gen(punt)mutaties a) Vooruit- of terugmutatieonderzoek waarbij eukaryotische micro-organismen (Saccharomyces cerevisiae) worden gebruikt (methode B.15) b) In vitro onderzoek op vooruitmutaties bij zoogdiercellen (methode B.17) c) Bepaling van recessief-letale mutaties van geslachtsgebonden genen bij Drosophila melanogaster (methode B.20) d) In vivo bepaling van somatische mutaties, vlekkentest op muizen (methode B.24) Onderzoek op chromosoomafwijkingen a) In vivo cytogenetische tests op zoogdieren;in vivo metafaseanalyse van beenmergcellen kan worden overwogen als dit niet bij het eerste onderzoek is gedaan (methode B.11). Verder kan in vivo cytogenetisch onderzoek worden verricht op geslachtscellen (methode B.23) b) In vitro cytogenetische tests op zoogdiercellen als dit niet bij het eerste onderzoek is gedaan (methode B.10) c) Onderzoek op dominant-letale mutaties bij knaagdieren (methode B.22) d) Onderzoek op erfelijke translocaties bij muizen (methode B.25) Genotoxische effecten - effecten op DNA Genotoxiciteit, waaronder wordt verstaan de mogelijk schadelijke effecten op genetisch materiaal die niet direct geassocieerd zijn met mutageniteit, kan worden aangetoond als schade aan het DNA zonder directe tekenen van mutatie. De volgende methoden, die gebruik maken van eukaryotische micro-organismen of zoogdiercellen, kunnen voor dergelijk onderzoek worden gebruikt : a) Mitotische recombinatie bij Saccharomyces cerevisiae (methode B.16) b) DNA-beschadiging en -herstel - DNA-herstelsynthese - zoogdiercellen in vitro (methode B.18) c) Zusterchromatidenuitwisseling bij zoogdiercellen in vitro (methode B.19) Alternatieve methoden voor onderzoek naar mogelijke carcinogeniteit Er zijn transformatietests voor zoogdiercellen beschikbaar die het vermogen meten van een stof om in celculturen morfologische en gedragsveranderingen te veroorzaken die waarschijnlijk samenhangen met kwaardaardige veranderingen in vivo (methode B.21). Er kunnen verschillende celtypes en verschillende transformatiecriteria worden gebruikt. Risicobeoordeling van erfelijke effecten bij zoogdieren Er bestaan methoden voor het meten van erfelijke effecten bij zoogdieren die worden veroorzaakt door gen(punt)mutaties, bij voorbeeld de specifieke-locustest bij muizen, voor het meten van geslachtscelmutaties bij de eerste generatie (niet in deze bijlage opgenomen), en voor chromosoomafwijkingen, bij voorbeeld de test op erfelijke translocatie bij muizen (methode B.25). Dergelijke methoden kunnen worden gebruikt bij het evalueren van het genetisch risico van een stof voor de mens. Gezien de complexiteit van deze onderzoeken en het zeer grote aantal benodigde proefdieren, zeker bij de specifieke-locustest, zijn echter goede redenen nodig om deze uit te voeren. B.III Carcinogeniteit Chemische stoffen kunnen, afhankelijk van het veronderstelde werkingsmechanisme, worden getypeerd als wel- of niet-genotoxische carcinogenen. Het onderzoek op mutageniteit/genotoxiciteit kan reeds informatie over het genotoxisch-carcinogene vermogen van een stof opleveren nog vóór een screening wordt uitgevoerd. Aanvullende informatie kan worden verkregen uit subchronische of chronische toxiciteitstest waarbij herhaalde doses worden toegediend. De toxiciteitstest met herhaalde toediening, methode B.7 en onderzoeken met langer herhaalde doses omvatten de bepaling van histopathologische veranderingen, bij voorbeeld hyperplasie in bepaalde weefsels, die een aanwijzing kunnen vormen. Deze onderzoeken en toxicologische gegevens kunnen bijdragen tot het identificeren van stoffen met mogelijke carcinogeniteit, waarna dit aspect eventueel grondiger moet worden onderzocht via een carcinogeniteitstest (methode B.32) of vaak ook een gecombineerd onderzoek op chronische toxiciteit en carcinogeniteit (methode B.33). B.IV Reproduktietoxiciteit Reproduktietoxiciteit kan op verschillende manieren worden vastgesteld, bij voorbeeld door verslechtering van de mannelijke en vrouwelijke voortplantingsfuncties of -capaciteit, "effecten op de vruchtbaarheid" genoemd. Dit laatste aspect omvat ook teratogeniteit en effecten die optreden tijdens de lactatie. Bij onderzoek op teratogeniteit, als onderdeel van onderzoek op ontwikkelingstoxiciteit, is de onderzoekmethode (methode B.31) voornamelijk gericht op toediening via orale weg. Als alternatief kunnen ook andere wegen gekozen worden, afhankelijk van de fysische eigenschappen van de te onderzoeken teststof of de waarschijnlijke wijze van blootstelling bij de mens. In zulke gevallen moet de methode op een passende manier gewijzigd worden met inachtneming van de relevante elementen van de 28-daagse testmethode. Als een voortplantings(vruchtbaarheids)onderzoek over drie generaties nodig is kan de beschreven methode voor voortplantingsonderzoek over twee generaties (methode B.35) tot drie generaties worden verlengd. B.V Neurotoxiciteit Neurotoxiciteit kan op verschillende manieren worden vastgesteld, bij voorbeeld door functionele veranderingen en/of structurele en biochemische veranderingen in het centrale of het perifere zenuwstelsel. Een eerste indicatie van neurotoxiciteit kan worden verkregen uit onderzoek naar acute toxiciteit. De toxiciteitstest met herhaalde toediening (methode B.7) houdt ook het vaststellen van neurotoxicologische effecten in, en de nadruk moet worden gelegd op nauwkeurige klinische waarnemingen om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen. De methode moet het mogelijk maken om stoffen te identificeren die een neurotoxische werking kunnen hebben, waarna verder, diepgaand onderzoek naar dit aspect nodig kan zijn. Verder is het van belang om rekening te houden met de mogelijkheid dat stoffen een specifieke neurotoxische werking kunnen hebben die met ander toxiciteitsonderzoek niet ontdekt kan worden. Bij bepaalde organische fosforverbindingen is bij voorbeeld een vertraagde neurotoxische werking ontdekt die vastgesteld kan worden met de methoden B.37 en B.38 na enkelvoudige of herhaalde blootstelling. B.VI Immunotoxiciteit Immunotoxiciteit kan op verschillende manieren worden vastgesteld, bij voorbeeld door immunosuppressie en/of verhoging van de gevoeligheid van het immuunsysteem welke hypersensitiviteit of geïnduceerde auto-immuniteit tot gevolg heeft. De toxiciteitstest met herhaalde toediening (methode B.7) houdt onder meer het vaststellen van immunotoxische effecten in. De methode moet het mogelijk maken stoffen te identificeren die een immunotoxische werking kunnen hebben, waarna verder, diepgaand onderzoek naar dit aspect nodig kan zijn. B.VII Toxicokinetica Toxicokinetisch onderzoek is een ondersteuning bij de interpretatie en evaluatie van toxiciteitsgegevens. Dit onderzoek dient om licht te werpen op bepaalde aspecten van de toxiciteit van de onderzochte stoffen en de resultaten kunnen worden gebruikt bij het opzetten van voortgezet toxiciteitsonderzoek. Het is niet de bedoeling dat in alle gevallen alle parameters worden bepaald. Zelden zal de gehele reeks toxicokinetische onderzoeken (absorptie, excretie, distributie en metabolisme) nodig zijn. Bij bepaalde verbindingen kan een andere volgorde de voorkeur verdienen, of kan worden volstaan met een onderzoek waarbij één enkele dosis wordt toegediend (methode B.36). Informatie over de chemische structuur (SAR) en fysisch-chemische eigenschappen kan ook een indicatie geven over de absorptiekarakteristieken langs de voorgestelde toedieningsweg en over de te verwachten metabolische reacties en de verdeling over de weefsels. Over de toxicokinetische parameters kan ook informatie beschikbaar zijn door voorafgaand toxiciteitsonderzoek en toxicokinetisch onderzoek. C. KARAKTERISERING VAN DE TESTSTOF De samenstelling van de teststof, met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen, en de relevante fysisch-chemische eigenschappen, waaronder de stabiliteit, moeten vóór de aanvang van ieder toxiciteitsonderzoek bekend zijn. De fysisch-chemische eigenschappen van de teststof leveren belangrijke informatie over de keuze van de manier van toedienen, de opzet van ieder afzonderlijk onderzoek en het hanteren en bewaren van de teststof. Alvorens het onderzoek wordt aangevat, moet een analytische methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van de teststof (zo mogelijk met inbegrip van de voornaamste verontreinigingen) in het toedieningsmedium en in het biologisch materiaal ontwikkeld worden. Alle gegevens met betrekking tot de identificatie, de fysisch-chemische eigenschappen, de zuiverheid en het gedrag van de teststof moeten in het onderzoeksrapport worden opgenomen. D. VERZORGING VAN DE DIEREN Bij toxiciteitstests zijn een stringente bewaking van de levensomstandigheden en een goede verzorging van de dieren een eerste vereiste. i) Huisvesting De leefomstandigheden in de kamers of ruimten waar de proefdieren zijn ondergebracht, moeten geschikt zijn voor het soort proefdier.Voor ratten, muizen en cavia's is een kamertemperatuur van 22° C + 3° C en een relatieve luchtvochtigheid van 30-70 % geschikt; voor konijnen moet de temperatuur 20° C + 3° C en de relatieve luchtvochtigheid 30-70 % bedragen. Sommige experimentele technieken zijn bijzonder gevoelig voor temperatuureffecten; in dergelijke gevallen wordt in de beschrijving van de onderzoekmethode nader ingegaan op de correcte proefomstandigheden. Bij ieder onderzoek naar toxische effecten moeten de temperatuur en de vochtigheidsgraad worden gecontroleerd, opgetekend en in het eindverslag van de studie worden opgenomen. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met afwisselend twaalf uur licht - twaalf uur duisternis. Nadere gegevens over de verlichting moeten worden opgetekend en in het eindverslag worden opgenomen. Tenzij anders bij de methode vermeld, worden de dieren hetzij afzonderlijk, hetzij in kleine groepen van hetzelfde geslacht gehuisvest. In het laatste geval mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest. Het is belangrijk om in verslagen over dierproeven steeds te vermelden welk soort kooien is gebruikt en hoeveel dieren tijdens de blootstelling aan de chemische stof en tijdens latere waarnemingsperioden in iedere kooi waren gehuisvest. ii) Voeding Bij de samenstelling van het voedsel moet worden voldaan aan alle eisen die de proefdiersoorten aan hun voeding stellen. Indien chemische stoffen via de voeding aan de dieren worden toegediend, kan de voedingswaarde door interactie tussen de stof en een bestanddeel van de voeding verminderd worden. Bij het interpreteren van de resultaten dient rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van dergelijke reacties. Er kan gebruik worden gemaakt van gebruikelijk laboratoriumvoeder met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voedsel kan mede worden bepaald door de noodzaak de teststof, wanneer die via het voedsel wordt toegediend, op een passende wijze daarmee te vermengen. Onzuiverheden in de voeding waarvan bekend is dat ze de toxiciteit beïnvloeden, mogen niet in werkzame concentraties voorkomen. E. WELZIJN VAN DE DIEREN Bij het uitwerken van de testmethoden werd extra aandacht besteed aan dierenwelzijn. Enkele voorbeelden worden hieronder samengevat, maar deze lijst is niet volledig. De exacte formulering en/of voorwaarden dienen te worden nagelezen in de tekst van de methoden : - Voor de bepaling van de acute orale toxiciteit moeten twee alternatieve methoden, de "vaste-dosismethode" en de "bepaling van de acute-toxiciteitsklasse" worden overwogen. Bij de eerste methode wordt niet uitgegaan van de dood als specifiek criterium en bij deze methode worden minder proefdieren gebruikt. Bij de tweede methode wordt gemiddeld 70 % minder proefdieren gebruikt dan bij methode B.1 ter bepaling van de acute orale toxiciteit. Beide alternatieve methoden veroorzaken minder ongerief en pijn dan de klassieke methode. - Het aantal proefdieren is teruggebracht tot het wetenschappelijk aanvaardbare minimum : slechts vijf proefdieren van hetzelfde geslacht worden per dosisniveau getest voor de methoden B.1 en B.3; slechts tien dieren (en maar vijf voor de negatieve controlegroep) worden gebruikt voor de bepaling van de sensibilisering van de huid door de maximalisatietest voor cavia's (methode B.6); het aantal dieren dat benodigd is voor de positieve controle bij het testen van de mutageniteit in vivo wordt ook verminderd (methoden B.11 en B.12). - Ongerief en pijn van de dieren tijdens de proef worden tot een minimum teruggebracht; het kan nodig zijn dieren die ernstige, blijvende verschijnselen van lijden en pijn vertonen op humane wijze af te maken; het doseren van teststoffen volgens een methode waarvan bekend is dat zij veel lijden en pijn veroorzaken wegens de corrosieve of irriterende eigenschappen van de stof, is niet vereist (methoden B.1, B.2 en B.3). - Het testen met irrelevant hoge doses wordt vermeden door het invoeren van limietproeven, niet alleen bij de tests op acute toxiciteit (methoden B.1, B.2 en B.3) maar ook bij de in vivo tests op mutageniteit (methoden B.11 en B.12). - Een strategie voor irritatietests maakt het thans mogelijk een test achterwege te laten of de studie te beperken tot een enkel dier wanneer voldoende wetenschappelijke gegevens voorhanden zijn. Deze wetenschappelijke gegevens kunnen worden gebaseerd op de fysisch-chemische eigenschappen van de stof, de resultaten van andere reeds uitgevoerde proeven of de resultaten van goed gevalideerde in vitro proeven. Indien bij voorbeeld bij het uitvoeren van een onderzoek naar acute toxiciteit bij toediening via de huid geen huidirritatie werd waargenomen bij de limietdosis van de te onderzoeken stof (methode B.3), kan verder testen op huidirritatie (methode B.4) overbodig zijn; stoffen die duidelijk bijtende of ernstige huidirriterende eigenschappen vertonen bij het onderzoek naar huidirritatie (methode B.4), dienen niet verder te worden getest op oogirritatie (methode B.5). F. ALTERNATIEVE TESTEN Een wetenschappelijke doelstelling van de Europese Unie is het ontwikkelen en valideren van alternatieve technieken die dezelfde hoeveelheid informatie opleveren als de huidige dierproeven, maar waarbij minder proefdieren worden gebruikt, die minder lijden veroorzaken of die het gebruik van dieren volledig overbodig maken. Naarmate dergelijke methoden ter beschikking komen, moet het gebruik ervan waar mogelijk worden overwogen voor de risicobeoordeling en de daaruit voortvloeiende classificatie en etikettering ten aanzien van de intrinsieke risico's. G. EVALUATIE EN INTERPRETATIE Bij de evaluatie en interpretatie van de testresultaten moet rekening worden gehouden met de beperkingen ten aanzien van de mate waarin de resultaten van dierproeven en in vitro tests kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens. Daarom kunnen aanwijzingen voor schadelijke effecten bij de mens, indien beschikbaar, gebruikt worden als bevestiging van de testresultaten. Deze resultaten kunnen worden gebruikt voor de classificatie en etikettering van nieuwe en bestaande chemische stoffen met betrekking tot hun effecten op de menselijke gezondheid op basis van de intrinsieke eigenschappen die met deze methoden geïdentificeerd en gekwantificeerd worden. De criteria voor classificatie en etikettering in de desbetreffende bijlage IV hebben mede betrekking op de "end-points" van de testprotocollen die bij deze testmethoden horen. Deze resultaten kunnen ook worden gebruikt voor onderzoek gericht op de risicobeoordeling van nieuwe en bestaande chemische stoffen. De voor deze doeleinden gepaste teststrategieën zijn aangegeven in de desbetreffende documenten met richtsnoeren. H. LITERATUUR De meeste van deze methoden zijn ontwikkeld binnen het kader van het OESO-programma inzake richtsnoeren voor het testen; zij moeten worden toegepast overeenkomstig de beginselen van "goede laboratoriumpraktijken", om zoveel mogelijk te komen tot "onderlinge acceptatie van gegevens". Verdere informatie kan worden gevonden in de referenties die te vinden zijn in de OESO-richtsnoeren en in relevante literatuur die elders is gepubliceerd. » Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998. ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS Bijlage II B "B.1ter ACUTE ORALE TOXICITEIT - METHODE TER BEPALING VAN DE ACUTE-TOXICITEITSKLASSE 1. METHODE 1.1. Inleiding De methode ter bepaling van de acute-toxiciteitsklasse geeft informatie ten behoeve van zowel risicobeoordeling als risicoclassificatie. Bij de methode worden drie vaste doses gebruikt die voldoende ver uit elkaar liggen om een stof in te kunnen delen met behulp van de resultaten van het onderzoek. Verder kunnen in de door deze testmethode beschreven procedure nog drie aanvullende vaste doses gekozen worden die gebruikt kunnen worden als alternatieve opties op gegeven beslispunten of als opties voor verdere proeven. Het gebruik van (een of meer) aanvullende doses kan overwogen worden als een verdere verfijning wenselijk of noodzakelijk is. Bij de methode wordt gebruik gemaakt van drie vastgestelde begindoses. Het is niet de bedoeling om een exacte LD50 te berekenen maar om een blootstellingsbereik te bepalen waarbij mortaliteit kan worden verwacht, daar de dood van een aantal proefdieren nog steeds het hoofdcriterium van deze test is. De resultaten van deze test moeten volgens de criteria van bijlage IV geclassificeerd kunnen worden. Ten gevolge van de sequentiële aanpak kan de duur van de test langer zijn dan die van de in B.1 beschreven procedure. Het grote voordeel van deze methode is dat een kleiner aantal proefdieren nodig is dan in de acute-toxiciteitstest (oraal) (B.1) en de alternatieve vaste-dosismethode (B.1bis). Zie ook de algemene inleiding deel B. 1.2. Definities Zie algemene inleiding deel B. 1.3. Principe van de testmethode De stof wordt in een van de vastgestelde doses oraal toegediend aan een groep proefdieren. De stof wordt getest met behulp van een getrapte procedure waarbij bij iedere stap drie dieren van hetzelfde geslacht worden gebruikt. Het is niet nodig om een voorstudie te doen. Het al dan niet voorkomen van door de stof veroorzaakte mortaliteit bepaalt de volgende stap, d.w.z. : - verder testen is niet nodig - de volgende stap wordt uitgevoerd met dezelfde dosis, maar met dieren van het andere geslacht - de volgende stap wordt uitgevoerd met de eerstvolgende hogere of de eerstvolgende lagere dosis 1.4. Beschrijving van de testmethode 1.4.1. Voorbereiding Er wordt een aselecte steekproef samengesteld van gezonde jonge volwassen dieren. Deze worden gemerkt voor individuele herkenning en vóór het begin van de test ten minste vijf dagen in hun kooien gehouden ter acclimatisatie aan de laboratoriumomstandigheden. Dieren van hetzelfde geslacht die dezelfde dosis krijgen, mogen in één kooi worden ondergebracht maar het aantal dieren per kooi mag niet zo groot zijn dat duidelijke waarneming van ieder dier afzonderlijk belemmerd wordt. De teststof wordt in een enkele dosis toegediend met behulp van een maagsonde of een geschikte intubatiecanule. Zo nodig wordt de teststof in een geschikt vehiculum opgelost of gesuspendeerd. Het verdient aanbeveling om zo mogelijk gebruik te maken van een oplossing/suspensie in water. Als dat niet mogelijk is, kan naar olie (bij voorbeeld maïsolie) of in laatste instantie naar een ander vehiculum worden gegrepen. Van niet-waterige media moeten de toxicologische eigenschappen bekend zijn; als dat niet het geval is moeten deze eigenschappen vóór de test worden vastgesteld. Voor het toedienen van de dosis dienen de proefdieren te vasten. Aan ratten wordt gedurende de voorafgaande nacht geen voedsel verstrekt, voor muizen geldt een periode van 3-4 uur. Water mag onbeperkt worden gegeven. 1.4.2. Proefomstandigheden 1.4.2.1. Proefdieren Tenzij er contra-indicaties zijn, wordt de voorkeur gegeven aan ratten. De wijfjes moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Bij het begin van de studie moet de gewichtsvariatie van de dieren minimaal zijn; het gewicht van ieder dier mag ten hoogste 20 % van het gemiddelde voor zijn geslacht afwijken. 1.4.2.2. Aantal en geslacht Voor iedere stap worden drie dieren van hetzelfde geslacht gebruikt. Voor de eerste stap mag het geslacht vrij worden gekozen. 1.4.2.3. Dosisniveaus Het initiële dosisniveau wordt gekozen uit één van drie vaste dosisniveaus, bij voorbeeld 25, 200 en 2 000 mg/kg lichaamsgewicht. De begindosis moet zo zijn, dat waarschijnlijk bij ten minste een aantal van de blootgestelde proefdieren mortaliteit optreedt. Afhankelijk van de begindosis wordt één van de in bijlage 1 opgenomen stroomschema's gevolgd. Bij het kiezen van het geslacht en de begindosis moet alle beschikbare informatie gebruikt worden, met inbegrip van die over relaties tussen structuur en activiteit. Als op grond van die informatie vermoed wordt dat waarschijnlijk bij het hoogste dosisniveau (2 000 mg/kg lichaamsgewicht) geen mortaliteit zal optreden, moet een limiettest uitgevoerd worden. Als over een teststof geen informatie beschikbaar is, wordt met het oog op het welzijn van de proefdieren een startdosis van 200 mg/kg lichaamsgewicht aanbevolen. Soms kan het wenselijk zijn de informatie meer te verfijnen dan met het uitvoeren van de proef met drie vaste dosisniveaus van 25, 200 en 2 000 mg/kg lichaamsgewicht mogelijk zou zijn. In die gevallen kan overwogen worden om verder te testen met bijkomende vaste dosisniveaus van 5, 50 of 500 mg/kg lichaamsgewicht. Doses waarvan bekend is dat zij hevige pijn en ongemak veroorzaken door bijtende of sterk irriterende werking, behoeven niet te worden toegediend. Het tijdsinterval tussen de blootstelling van de opeenvolgende groepen wordt bepaald door de aanvang, de duur en de hevigheid van de toxische verschijnselen. Blootstelling van proefdieren van het andere geslacht, of blootstelling aan een volgende dosis moet worden uitgesteld totdat men zeker is van het overleven van de proefdieren die de vorige dosis toegediend hebben gekregen. 1.4.2.4. Limiettest Een limiettest met een dosisniveau van 2 000 mg/kg lichaamsgewicht kan worden uitgevoerd met drie proefdieren van elk geslacht. Als mortaliteit optreedt ten gevolge van de toediening van de teststof kan het nodig zijn om verder te testen met een dosis van 200 of 500 mg/kg lichaamsgewicht. 1.4.2.5. Observatieperiode De proefdieren moeten doorgaans 14 dagen worden geobserveerd, behalve wanneer dieren uit het onderzoek moeten worden verwijderd en op humane wijze worden afgemaakt uit welzijnsoverwegingen of omdat zij dood worden aangetroffen. De duur van deze observatieperiode moet echter niet streng vastgelegd worden. Deze moet worden bepaald door de toxische reacties, het tijdstip waarop deze voor het eerst worden waargenomen en de duur van het herstel, en kan dus worden verlengd als dat nodig is. De tijdstippen waarop toxische verschijnselen merkbaar worden en weer verdwijnen zijn van belang, zeker als er een bepaalde tendens tot vertraagde toxiciteit wordt vastgesteld. Alle waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd, waarbij voor ieder dier een apart verslag wordt bijgehouden. 1.4.3. Procedure Na de periode van voedselonthouding moeten de dieren vóór de toediening van de teststof worden gewogen. Na toediening van de teststof kan nog gedurende 3-4 uur voedsel onthouden worden. Als een dosis in gedeelten over een langere tijd wordt toegediend kan het nodig zijn de dieren van voedsel en water te voorzien, afhankelijk van de duur van die periode. Het maximale vloeistofvolume dat per keer kan worden toegediend hangt af van de grootte van de proefdieren. Bij knaagdieren mag het volume doorgaans niet meer dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht bedragen; in het geval van waterige oplossingen kan echter 2 ml/100 g lichaamsgewicht aanvaardbaar zijn. Variaties in het testvolume moeten geminimaliseerd worden door het aanpassen van de concentratie zodat op alle dosisniveaus hetzelfde constante volume kan worden gebruikt. Als een enkelvoudige dosis niet mogelijk is, kan de dosis gedurende een periode van minder dan 24 uur in kleinere gedeelten worden toegediend. Bijzonderheden van de testprocedure worden beschreven in bijlage 1. 1.4.3.1. Algemene observaties Op de dag van de toediening moeten minimaal tweemaal - en eventueel vaker, als de reactie van de dieren op de behandeling dat nodig maakt - nauwkeurige klinische observaties worden verricht, en vervolgens minstens één keer daags. Dieren die stervende zijn of dieren die hevige pijn lijden of persistente tekenen van ernstige nood vertonen moeten op humane wijze worden afgemaakt. Dieren die om ethische redenen zijn afgemaakt worden beschouwd als dieren die door de teststof zijn gestorven. Als dieren om ethische redenen worden gedood of dood worden aangetroffen, moet het tijdstip hiervan zo nauwkeurig mogelijk worden genoteerd. Wanneer de dieren aanhoudende verschijnselen van toxiciteit vertonen moeten aanvullende waarnemingen worden verricht. Onder meer moet gelet worden op veranderingen in huid en vacht, ogen en slijmvliezen en ook bij de ademhaling, de bloedsomloop en het autonome en centrale zenuwstelsel alsmede de somatomotorische activiteit en het gedrag. Er moet gelet worden op bevingen, stuiptrekkingen, kwijlen, diarree, lethargie, slaap en coma. Alle waarnemingen moeten systematisch worden geregistreerd, waarbij voor ieder dier een apart rapport wordt bijgehouden. 1.4.3.2. Lichaamsgewicht Elk dier moet kort voor de teststof wordt toegediend worden gewogen en daarna ten minste eenmaal per week. Veranderingen in gewicht moeten worden berekend en bijgehouden. Bij de beëindiging van de test moeten de overlevende dieren worden gewogen alvorens ze op humane wijze worden afgemaakt. 1.4.3.3. Macroscopische necropsie Op alle proefdieren, met inbegrip van de dieren die tijdens de test sterven of die uit de test worden verwijderd, moet een macroscopische necropsie worden uitgevoerd. Alle macroscopische pathologische veranderingen moeten voor elk proefdier worden vastgelegd. Als organen van proefdieren die 24 uur of meer in leven zijn gebleven, macroscopische pathologische veranderingen vertonen kan ook microscopische necropsie worden overwogen omdat dat bruikbare informatie kan opleveren. 2. GEGEVENS Van ieder dier moeten individuele gegevens beschikbaar gemaakt worden. Verder moeten alle gegevens worden samengevat in tabellen waarbij voor iedere testgroep wordt geregistreerd : het gebruikte aantal proefdieren, het aantal dat tekenen van toxiciteit heeft vertoond, het aantal dieren dat tijdens de test is gestorven of om ethische redenen is afgemaakt, het tijdstip van sterven van ieder dier, een beschrijving en het verloop in de tijd van de toxische effecten (inclusief de eventuele reversibiliteit daarvan), en de resultaten van de necropsie. Algemene richtsnoeren voor de interpretatie van de resultaten met het oog op de classificatie worden gegeven in bijlage 2. 3. RAPPORTAGE Verslag van de proefnemingen In dit verslag dienen, voor zover mogelijk, de volgende gegevens te worden opgenomen : Proefdieren : - diersoort, stam; - microbiologische status van de dieren, indien bekend; - aantal, leeftijd en geslacht van de dieren; - herkomst, behuizing, voeding enz.; - het gewicht van elk dier afzonderlijk bij de aanvang van de test, wekelijks daarna en bij het einde van de test. Proefomstandigheden : - motivering van de keuze van het vehiculum als dit geen water is; - bijzonderheden over de toediening van de teststof met inbegrip van de toegediende volumes en het tijdstip van toediening; - bijzonderheden omtrent voedsel en water (met inbegrip van type en herkomst van het voedsel, waterbron); - motivering van de keuze van de begindosis. Resultaten : - overzicht in tabelvorm van de gegevens met betrekking tot ieder dier, opgesplitst naar dosis en geslacht (het betreft de respons van de dieren die toxische verschijnselen, waaronder sterfte, vertoonden alsmede de aard, duur en hevigheid van de effecten); - tijdsverloop van de eerste verschijnselen van intoxicatie en eventuele reversibiliteit van deze verschijnselen voor ieder dier afzonderlijk; - resultaten van de necropsie en eventuele histopathologische bevindingen voor ieder dier afzonderlijk, indien beschikbaar. Bespreking van de resultaten. Conclusies. 4. LITERATUUR Deze methode komt overeen met TG 423 van de OESO. BIJLAGE 1 TESTPROCEDURE 1. Zoals vermeld in punt 1.4.2.3 moet de begindosis zó worden gekozen dat ten minste een gedeelte van de proefdieren sterft. De ter zake relevante informatie omvat onder meer : - gegevens over fysisch-chemische eigenschappen; - relaties tussen structuur en activiteit; - alle gegevens van andere toxiciteitstesten, en - het verwachte gebruik van de teststof. 2. Voor iedere begindosis geeft het bijbehorende testschema dat in deze bijlage is opgenomen, de te volgen procedure.Afhankelijk van het aantal gestorven of op humane wijze afgemaakte dieren volgt de testprocedure de aangegeven pijlen. 3. Indien bij een begindosis van 25 of 200 mg/kg lichaamsgewicht slechts één dier van het tweede geslacht sterft, leidt dit gewoonlijk tot niet verder testen.Als er echter geen toxische verschijnselen worden waargenomen bij de andere vijf dieren moet bij de autopsie aan de mogelijkheid gedacht worden dat de mortaliteit geen gevolg is van de teststof. In dat geval moet de test worden vervolgd met de eerstvolgende hogere dosis. 4. Indien bij een begindosis van 2000 mg/kg lichaamsgewicht slechts één dier per geslacht sterft is de verwachtingswaarde van de LD50 meer dan 2000 mg/kg lichaamsgewicht.Omdat dit echter een grensgeval is moet de respons van de andere twee dieren per geslacht nauwkeurig worden onderzocht. Het optreden van duidelijke toxische verschijnselen bij deze dieren kan aanleiding zijn tot een classificatie die overeenkomt met een LD50-waarde van 2000 mg/kg lichaamsgewicht of minder, of tot verder testen op hetzelfde niveau. 5. De procedure kan het verder testen op drie vaste dosisniveaus inhouden (optie 2).Deze optie kan worden gebruikt voor het kiezen van een alternatieve dosis op een gegeven beslispunt, of voor verder testen nadat de lopende test is afgesloten (optie 1). Bij optie 1 is de testprocedure aangegeven met vette pijlen, bij optie 2 met dunne pijlen. Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Gezien om te worden gevoegd bij Ons besluit van 14 december 1998. ALBERT Van Koningswege : De Minister van Volksgezondheid, M. COLLA De Minister van Tewerkstelling en Arbeid, Mevr. M. SMET De Staatssecretaris voor Leefmilieu, J. PEETERS Bijlage II C "B.6 SENSIBILISATIE VAN DE HUID 1. METHODE 1.1. Inleiding Opmerkingen : De gevoeligheid en het vermogen van een test om stoffen op te sporen met potentieel huidsensibiliserende eigenschappen bij de mens zijn belangrijk in een systeem voor de classificatie van toxische stoffen ten behoeve van de volksgezondheid. Er bestaat géén universele testmethode waarmee alle stoffen die de menselijke huid kunnen sensibiliseren, adequaat kunnen worden geïdentificeerd en die voor alle stoffen toepasbaar is. Bij de keuze van een test moet rekening worden gehouden met factoren zoals de fysische kenmerken van een stof, met inbegrip van het vermogen om de huid binnen te dringen. Er zijn twee soorten tests ontwikkeld die gebruik maken van cavia's : het type waarbij een adjuvans wordt gebruikt en waarbij een verhoogde allergische reactie wordt opgewekt door het oplossen of suspenderen van de teststof in Freunds compleet adjuvans (FCA), en tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt. Proeven met adjuvans voorspellen een eventueel huidsensibiliserend effect van een stof bij mensen wellicht nauwkeuriger dan methoden die geen gebruik maken van Freunds compleet adjuvans; zij verdienen dan ook de voorkeur. De maximalisatietest met cavia's is een algemeen toegepaste test waarbij een adjuvans gebruikt wordt. Alhoewel verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om het huidsensibiliserend vermogen van een stof aan te tonen, wordt de maximalisatietest beschouwd als de adjuvanstechniek die de voorkeur heeft. Voor veel soorten chemicaliën worden tests waarbij geen adjuvans wordt gebruikt (de Buehlertest heeft de voorkeur) als minder gevoelig beschouwd. In bepaalde gevallen kunnen er goede redenen zijn om de Buehlertest te verkiezen, met lokale applicatie in plaats van intradermale injectie zoals in de maximalisatietest met cavia's. Voor het gebruik van de Buehlertest dient een wetenschappelijke motivering te worden gegeven. De maximalisatietest met cavia's en de Buehlertest worden hier beschreven. Andere methoden mogen worden gebruikt op voorwaarde dat zij goed zijn gevalideerd en wetenschappelijk verantwoord zijn. Indien een erkende screeningtest werd uitgevoerd en daarbij een positief resultaat werd geconstateerd, mag de teststof als een potentieel sensibiliserende stof worden aangemerkt en is het niet nodig ook nog een test met cavia's uit te voeren. Indien een dergelijke test evenwel tot een negatief resultaat heeft geleid, moet een caviatest worden uitgevoerd overeenkomstig de onder deze testmethode beschreven procedure. Zie ook algemene inleiding deel B. 1.2. Definities Huidsensibilisatie (allergische contactdermatitis) : is een door een immuunrespons veroorzaakte huidreactie op een stof. Bij mensen kan de reactie de vorm aannemen van jeuk, erytheem, oedeem (waterzucht), pukkels, blaasjes, blaren of een combinatie hiervan. Bij andere soorten kunnen de reacties anders zijn en kan alleen erytheem of oedeem optreden. Inductieblootstelling : een experimentele blootstelling van een proefdier aan een teststof met de bedoeling een hypersensitieve toestand te induceren. Inductieperiode : een periode van ten minste een week na de inductieblootstelling, gedurende welke een hypersensitieve toestand ontwikkeld kan worden. Provocatieblootstelling : een experimentele blootstelling - na de inductieperiode - van een voorheen reeds blootgesteld proefdier aan een teststof, om vast te stellen of het dier een hypersensitieve reactie vertoont. 1.3. Referentiestoffen De gevoeligheid en de betrouwbaarheid van de gebruikte technieken moet iedere zes maanden worden vastgesteld door het gebruik van stoffen waarvan bekend is dat ze lichte tot matige huidsensibiliserende eigenschappen hebben. Bij een goed uitgevoerde test kan een reactie van ten minste 30 % worden verwacht bij een adjuvanstest en van ten minste 15 % bij een niet-adjuvanstest, bij gebruikmaking van zwakke/middelsterke sensibilisatoren. De volgende stoffen genieten de voorkeur : Voor de raadpleging van de tabel, zie beeld Er kunnen omstandigheden zijn waarbij andere referentiestoffen, die aan bovenstaande eisen voldoen, kunnen worden gebruikt; dit moet wetenschappelijk verantwoord worden. 1.4. Principe van de testmethode De proefdieren worden eerst aan de teststof blootgesteld door een intradermale injectie en/of epidermale toepassing (inductieblootstelling). Na een rustperiode van 10 tot 14 dagen (inductieperiode), tijdens welke een immuunreactie op gang kan komen, worden de dieren blootgesteld aan een provocatiedosis. De omvang en intensiteit van de cutane reactie op de provocatieblootstelling bij de proefdieren wordt vergeleken met die van de controlegroep die een blanco behandeling ondergaat bij de industrie maar wél de provocatiedosis toegediend krijgt. 1.5. Beschrijving van de testmethoden Als het nodig wordt geacht om de teststof te verwijderen, moet dit gebeuren met behulp van water of een ander geschikt oplosmiddel zonder dat de optredende reactie daardoor wordt beïnvloed of de opperhuid daardoor wordt geschonden. 1.5.1. Maximalisatietest met cavia's (GPMT) 1.5.1.1. Voorbereiding Gezonde jonge volwassen albino cavia's worden ten minste 5 dagen voor het begin van de test geacclimatiseerd aan de laboratoriumomstandigheden. Voor de test worden de dieren op aselecte wijze verdeeld over de behandelingsgroepen. Verwijdering van het haar gebeurt door middel van knippen, scheren of eventueel door chemische ontharing, afhankelijk van de gebruikte testmethode. Er dient op te worden gelet dat de huid niet beschadigd wordt. De dieren worden gewogen vóór het begin en aan het einde van de test. 1.5.1.2. Proefomstandigheden 1.5.1.2.1. Proefdieren Er wordt gebruik gemaakt van stammen albino cavia's die gewoonlijk in laboratoria worden gebruikt. 1.5.1.2.2. Aantal en geslacht Er kan gebruik worden gemaakt van mannelijke en/of vrouwelijke dieren. Vrouwelijke dieren moeten nullipaar zijn en mogen niet zwanger zijn. Minimaal 10 dieren worden gebruikt voor de behandelde groep en ten minste vijf voor de controlegroep. Als er minder dan 20 testcavia's en 10 controlecavia's worden gebruikt en het niet mogelijk is om vast te stellen of de teststof sensibiliserende eigenschappen heeft, wordt ten sterkste aangeraden om meer dieren te testen zodat een totaal van ten minste 20 testdieren en 10 controledieren wordt bereikt. 1.5.1.2.3. Dosisniveaus De concentratie van de teststof die voor iedere inductie wordt gebruikt moet systemisch goed te verdragen zijn en gelijk zijn aan de hoogste concentratie die lichte tot matige huidirritatie veroorzaakt. De concentratie die voor de provocatieblootstelling wordt gebruikt moet de hoogste niet-irriterende dosis zijn. Indien noodzakelijk, kunnen de juiste concentraties worden vastgesteld aan de hand van een verkennende studie bij twee of drie proefdieren. Hierbij kan worden overwogen gebruik te maken van met FCA behandelde proefdieren. 1.5.1.3. Procedure 1.5.1.3.1. Inductie Dag 0 - Testgroep In de onthaarde schouderstreek worden drie paar injecties van 0,1 ml gegeven, zó dat van ieder paar er één aan elke zijde ligt : Injectie 1 : een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing; Injectie 2 : de teststof in een geschikt vehiculum en in de geschikte concentratie; Injectie 3 : de teststof in de gekozen concentratie, opgelost in een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing. Voor injectie 3 worden de in water oplosbare teststoffen in water opgelost vóór het mengen met FCA. In vet oplosbare of onoplosbare stoffen worden in FCA gesuspendeerd vóór het mengen met water. De uiteindelijke concentratie van de teststof moet gelijk zijn aan die welke voor injectie 2 wordt gebruikt. De injecties 1 en 2 worden dicht bij elkaar en het dichtst bij het hoofd toegediend en injectie 3 aan de staartzijde van het testgebied. Dag 0 - Controlegroep Op dezelfde plaatsen als bij de proefdieren worden drie paar intradermale injecties van 0,1 ml toegediend : Injectie 1 : een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing; Injectie 2 : het onverdunde vehiculum; Injectie 3 : een 50 %-formulering (gewicht/volume) van het vehiculum in een 1 :1-mengsel (volumeverhouding) van FCA en water of fysiologische zoutoplossing. Dag 5-7 - Testgroep en controlegroep Als de te onderzoeken stof geen huidiritatie geeft wordt het testgebied ongeveer 24 uur vóór de plaatselijke inductiebehandeling na knippen en/of scheren behandeld met 0,5 ml van een 10 %-formulering van natriumlaurylsulfaat in vaseline om een plaatselijke irritatie op te wekken. Dag 6-8 - Testgroep Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Een filtreerpapier (2 cm x 4 cm) wordt gedrenkt met de teststof in een geschikt vehiculum en door middel van een occlusief verband gedurende 48 uur op het testgebied aangebracht. De keuze van het vehiculum moet worden verantwoord. Vaste stoffen worden verpulverd en in een geschikt vehiculum opgenomen. Vloeistoffen kunnen, zo nodig, onverdund worden aangebracht. Dag 6-8 - Controlegroep Het testgebied wordt opnieuw onthaard. Op dezelfde wijze als bij de testgroep wordt alleen het vehiculum aangebracht en gedurende 48 uur met het testgebied in contact gehouden door een occlusief verband. 1.5.1.3.2. Provocatie Dag 20-22 - Testgroep en controlegroep Beide flanken van de dieren uit de testgroep en de controlegroep worden onthaard. Op één flank van de behandelde dieren wordt een gaasje of cupje met de teststof aangebracht en, waar nodig, een gaasje of cupje met alleen het vehiculum op de andere flank. Door middel van een occlusief verband wordt het gaasje gedurende 24 uur met de huid in contact gehouden. 1.5.1.3.3. Observatie en scoring : testgroep en controlegroep - Ongeveer 21 uur nadat het gaasje is verwijderd, wordt het provocatiegebied gereinigd en zo nodig zorgvuldig geknipt en/of geschoren en onthaard. - Ongeveer 3 uur hierna (ongeveer 48 uur na het begin van de provocatie) wordt de reactie van de huid geobserveerd en geregistreerd volgens de in het aanhangsel vermelde scores. - Ongeveer 24 uur na deze waarneming wordt een tweede waarneming gedaan (72 uur na aanvang provocatie) en eveneens geregistreerd. Aangeraden wordt om de proefdieren en controledieren "blind" (d.w.z. zonder te weten of het test- of controledieren betreft) te scoren. Als het nodig blijkt om opheldering te verkrijgen over de resultaten van de eerste provocatie kan na ongeveer een week een tweede provocatie (d.w.z. een herprovocatie) worden overwogen met, zo nodig, een nieuwe controlegroep. Herprovocatie kan ook plaatsvinden bij de oorspronkelijke controlegroep. Alle reacties van de huid en alle ongewone bevindingen, waaronder ook systemische reacties, die het gevolg zijn van de inductie- en provocatieprocedures moe …