Удебеляване на кожата от 1,5 до 2 mm се смята за положителна реакция на BST.
\n
3.2. Конкурентен имуноензимен метод (кЕЛАЙЗА) 3.2.1. Условия за използването на кЕЛАЙЗА кЕЛАЙЗА не се използва за целите на сертифицирането за търговия в рамките на Общността.
\n
Говеда, тествани с положителен резултат при един от другите серологични тестове, определени в това приложение, могат да бъдат подложени на кЕЛАЙЗА, за да се потвърди интерпретирането на резултатите от другите серологични тестове, особено в случаите, когато не може да се изключи кръстосана реакция между антитела и други бактерии в официално свободно или в свободно от бруцелоза стадо говеда или за да се елиминират реакции, дължащи се на остатъчни антитела, свързани с ваксинация с ваксина S19.
\n
3.2.2. Процедура на теста Тестът се изпълнява в съответствие с глава 2.4.3, раздел В, точка 2 от Наръчника по диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, шесто издание, 2008 г.
\n
4.НАЦИОНАЛНА РЕФЕФЕРЕНТНА ЛАБОРАТОРИЯ 4.1. Задачи и отговорности Националната референтна лаборатория, определена в съответствие с член 10, отговаря за: а) одобрението на резултатите от валидираните проучвания, които показват достоверността на използваните методи в Р България; б) определянето на максимален брой проби, които се вземат при използването на изследвания чрез ЕЛАЙЗА метод; в) калибриране на вторичните референтни национални серумни стандарти („работни стандарти“) спрямо първоначалните международни стандарти, посочени в т. 2.1; д) качествени проверки на всички антигени и групи ЕЛАЙЗА методи, които се използват в държавите членки;
\n
e)съвместно сътрудничество с националните референтни лаборатории за бруцелоза на държавите членки.
\n
Приложение № 4 към чл. 40 ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА Тестове за ензоотична левкоза по говедата се извършват чрез агар гел имунно-дифузионен тест (AGID) при условията, описани в раздели A и Б, или чрез ензимосвързан имуносорбентен анализ (ELISA) при условията, описани в раздел В.
\n
Агар гел имунно-дифузионният метод може да бъде използван само за изследване на отделни проби. Ако резултатите от теста бъдат оспорени, като бъдат надлежно представени доказателства, се прави допълнителна проверка посредством агар гел имунно-дифузионен тест.
\n
AGID и ELISA се стандартизират спрямо E05 серум, който е официалният стандартен серум на ЕС и се доставя от:
\n
Friedrich-Loeffler-Institut Federal Research Institute for Animal Health Референтна лаборатория на OIE за ензоотична левкоза по говедата (ЕЛГ) S ü dufer 10, 17493 Greifswald – Insel Riems, Германия А. АГАР ГЕЛ ИМУННО-ДИФУЗИОНЕН ТЕСТ ЗА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА 1. Антигенът, който следва да бъде използван в теста, трябва да съдържа гликопротеин на левкозен вирус по говедата. Антигенът е стандартизиран спрямо E05 серум.
\n
2.Националната референтна лаборатория, определена в съответствие с член 10 за координиране на стандартите и методите за диагностициране на тестовете за ензоотична левкоза по говедата, следва да отговаря за калибрирането на стандартните работни антигени на лабораторията спрямо официалния ЕО стандартен серум (EI серум), осигурен от Националния ветеринарен институт към Техническия университет на Дания.
\n
3.Стандартните антигени, използвани в лабораторията, следва да бъдат предавани най-малко веднъж годишно на други лаборатории, в които се извършват изследвания за ЕЛГ, за тестване спрямо официалния ЕО стандартен серум. Освен чрез това стандартизиране използваният антиген може да се калибрира в съответствие с метода, описан в буква Б.
\n
4.Реагентите за теста се състоят от: а) антиген: антиген, който трябва да съдържа специфичен гликопротеин от вируса на ензоотична левкоза по говедата, стандартизиран спрямо E05 серум; б) тест серума; в) известен положителен контролен серум; г) агар гел:
\n
–0,8 % агар;
\n
–8,5 % NaCl;
\n
–трис буферен разтвор, моларност 0,05 М, рН 7,2;
\n
–15 ml от този агар трябва да се сложат в петриева паничка с диаметър 85 mm, като в резултат се получава 2,6 mm дълбок агарен слой.
\n
5.В агарния слой до дъното на паничката трябва да се изреже тест форма, състояща се от седем свободни от влага ямки; формата трябва да се състои от една централна ямка и шест ямки в кръг около нея.
\n
Диаметър на централна ямка: 4 mm.
\n
Диаметър на периферните ямки: 6 mm.
\n
Разстояние между централната и периферните ямки: 3 mm.
\n
6.Централната ямка трябва да бъде напълнена със стандартния антиген. Периферните ямки с номера 1 и 4, посочени в раздел Б.3, се запълват с известния положителен серум; ямки 2, 3, 5 и 6 се запълват с тест серумите. Ямките се запълват до изчезване на мениска.
\n
7.Това води до получаване на следните количества:
\n
–антиген: 32 µl;
\n
–контролен серум: 73 µl;
\n
–тест серум: 73 µl.
\n
8.Инкубирането трябва да е с продължителност 72 часа при стайна температура (между 20 и 27 °С) в затворена влажна камера.
\n
9.Тестът може да се отчете на 24 и 48 часа, но окончателният резултат не може да бъде получен по-рано от 72 часа: а) даден тест серум е положителен, ако той образува специфична утаечна линия с антигена на вируса на левкозата по говедата (ЕЛГ) и образува непрекъсната идентична линия с контролния серум; б) даден тест серум е отрицателен, ако той не образува специфична утаечна линия с антигена на ЕЛГ и не изкривява линията на контролния серум; в) реакцията не би могла да се разглежда като определяща, ако тя:
\n
i)отчетливо изкривява линията на контролния серум в посока на антигена на вируса на ЕЛГ, без при това да формира видима утаечна линия с антигена; или
\n
ii)не може да бъде отчетена нито като положителна, нито като отрицателна.
\n
При неопределените реакции тестовете могат да бъдат повторени и да се използва концентриран серум.
\n
10.Може да се използва каквато и да е друга конфигурация или схема на разпределение, при условие че позволява като положителен да се отчете серум E05, разреден в съотношение 1:10 в отрицателен серум.
\n
Б. МЕТОД ЗА СТАНДАРТИЗИРАНЕ НА АНТИГЕН 1. Необходими разтвори и материали: а) 40 ml от 1,6 % агароза в буферен разтвор трис/HCl, моларност 0,05 M, pH 7,2 с 8,5 % NaCl; б) 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ антитяло само към гликопротеини на вируса на левкозата по говедата, разреден в съотношение 1:10 в буферен разтвор трис/HCl, моларност 0,05 M, pH 7,2 с 8,5 % NaCl; в) 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ антитяло само към гликопротеини на вируса на левкозата по говедата, разреден в съотношение 1:5 в буферен разтвор трис/HCl, моларност 0,05 M, pH 7,2 с 8,5 % NaCl; г) четири пластмасови петриеви панички с диаметър 85 mm; д) пробивно острие с диаметър между 4 и 6 mm; е) референтен антиген; ж) антиген, който подлежи на стандартизиране; з) водна баня (56 °C).
\n
2.Процедура:
\n
Разтваря се агарозата (1,6 %) в буферния разтвор трис/HCl, като внимателно се загрява до 100 °С. Поставя се във водна баня при 56 °C за около един час. Разтворите на серума на левкозата по говедата също трябва да се поставят във водна баня при 56 °C.
\n
Разбъркват се 15 ml от загретия на 56 °С агарозен разтвор с 15 ml серум от левкоза по говедата (1:10), бързо се разклащат и се изливат в обем от по 15 ml във всяка една от двете петриеви панички. Процедурата се повтаря и със серума от левкоза по говедата, разреден в съотношение 1:5.
\n
Когато агарозата се е втвърдила, в нея се правят дупки, както следва:
\n
Петриева панич- Петриева панич- ка № 1 Серум 1:10 ка № 2 Серум 1:10 Забележка на редакцията: виж фигурата в PDF -а на броя Петриева панич- Петриева панич- ка № 3 Серум 1:5 ка № 4 Серум 1:5 Забележка на редакцията: виж фигурата в PDF -а на броя 3. Добавяне на антиген: а) петриеви панички 1 и 3:
\n
i)ямка A – неразреден референтен антиген;
\n
ii)ямка B – разреден в съотношение 1:2 референтен антиген; iii) ямки С и Е – референтен антиген;
\n
iv)ямка D – неразреден тест антиген; б) петриеви панички 2 и 4:
\n
i)ямка A – неразреден тест антиген;
\n
ii)ямка B – разреден в съотношение 1:2 тест антиген; iii) ямка C – разреден в съотношение 1:4 тест антиген;
\n
iv)ямка D – разреден в съотношение 1:8 тест антиген.
\n
4.Допълнителни инструкции: а) за да може да се получи оптимално утаяване, експериментът трябва да се осъществи с два серумни разтвора (разредени в съотношение 1:5 и 1:10); б) ако диаметърът на утайката е прекалено малък и при двата разтвора, серумът трябва да бъде разреден допълнително; в) ако диаметърът на утайката при двата разтвора е прекалено голям и слаб, трябва да се избере серум с по-ниска степен на разреждане; г) крайната концентрация на агарозата трябва да бъде 0,8 %; тази на серумите – съответно 5 % и 10 %; д) отбелязват се измерените диаметри в следната координатна система: работният титър на тествания антиген представлява неговия разтвор, при който се получава диаметър, равен на получения с референтния антиген.
\n
Диаметър (в mm) Забележка на редакцията: виж фигурата в PDF -а на броя Разтвори на антигени В. ЕНЗИМОСВЪРЗАН ИМУНОСОРБЕНТЕН АНАЛИТИЧЕН ТЕСТ (ELISA) ЗА ОТКРИВАНЕ НА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА 1. Материалите и реагентите, които се използват, са следните: а) твърдофазови микроплаки, епруветки или други в твърда фаза; б) антигенът е фиксиран към твърдата фаза със или без помощта на поликлонални или моноклонални улавящи антитела; ако антигенът е директно приложен към твърдата фаза, всички тест проби, даващи положителни реакции, трябва да бъдат тествани отново към контролния антиген; контролният антиген следва да бъде идентичен с антигена с тази разлика, че отсъстват BLV антигени; ако улавящите антитела са приложени към твърдата фаза, антителата не трябва да реагират на антигени, различни от BLV антигени; в) биологична течност, която трябва да се тества; г) съответстващ положителен и отрицателен контрол; д) конюнгат; е) субстрат, адаптиран към използвания ензим; ж) спиращ разтвор, ако е необходим; з) разтвори за разреждането на тест проби за препарати на реагенти и за измиване; и) подходяща за използвания субстрат система за отчитане.
\n
2.СТАНДАРТИЗИРАНЕ И ЧУВСТВИТЕЛНОСТ НА ТЕСТА Чувствителността на теста ELISA трябва да е от такъв порядък, че да може да отчете положителен резултат от E05 серум, когато той е разреден 10 пъти повече (серумни проби) или 250 пъти повече (млечни проби) от разтвора, получен от отделните проби, ако те са включени в групи. При анализи, при които се изследват отделни проби (серумни и млечни), E05 серумът, разреден в съотношение 1:10 (при отрицателен серум) или в съотношение 1:250 (при отрицателно мляко), трябва да отчете положителен резултат, когато е изследван при същата степен на разреждане като отделните тест проби. Лабораторията по чл. 10 отговаря за проверката на качеството на ELISA метода, и по-специално за определянето на броя на пробите за всяка производствена партида, които следва да се обединят в обща група въз основа на изброената стойност, получена за E05 серума.
\n
3.УСЛОВИЯ ЗА ИЗПОЛЗВАНЕ НА ELISA ТЕСТА ЗА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА а) тестовете ELISA могат да бъдат използвани върху серумни и млечни проби; б) в случаите, в които тестовете ELISA се използват за целите на сертифицирането в съответствие с член 6, параграф 2, буква в) или за установяване и поддържане на статус на стадо в съответствие с приложение Г, раздел I, групирането на серумни или млечни проби трябва да се извърши по такъв начин, че взетите за изследване проби да могат да се отнесат по недвусмислен начин до отделните животни в групата; всеки тест за потвърждение трябва да бъде извършен с проби, взети от отделни животни; в) когато тестовете ELISA се прилагат върху проба от мляко от различни животни, тази проба се взима от мляко, събрано от стадо, в което най-малко 30 % от млечните крави са в период на лактация; всеки тест за потвърждение се извършва със серумни или млечни проби, взети от отделни животни.
\n
Приложение № 5 към чл. 12, ал. 1 Болести, които подлежат на задължително обявяване 1. Болести при говедата:
\n
Шап Бяс Туберкулоза Бруцелоза Заразна плевропневмония по говедата Ензоотична левкоза по говедата Антракс 2. Болести при свинете:
\n
Бяс Бруцелоза Класическа чума по свинете Африканска чума по свинете Шап Везикулозна болест по свинете Антракс Приложение № 6 към чл. 12, ал. 2 Болести, за които се изискват допълнителни гаранции:
\n
Ауески Заразен ринотрахеит по говедата Бруцелоза по свинете Трансмисивен гастроентерит.
\n
2258 Забележка на редакцията: виж този материал в PDF-а на броя