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En resumen

Esta ley establece las medidas para combatir la necrosis bacteriana de la patata, causada por el organismo "Clavibacter michiganensis", con el fin de localizarlo, impedir su propagación y erradicarlo.

Qué regula

La realización de encuestas oficiales sistemáticas para detectar el organismo en patatas.
La obligación de notificar la aparición sospechosa o confirmada del organismo.
Las medidas a tomar en caso de sospecha o confirmación de la presencia del organismo.
Las medidas fitosanitarias para el material contaminado y para evitar la contaminación de patatas de siembra.

A quién concierne

Productores, almacenes colectivos y centros de expedición de patatas.
Organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas.

Puntos clave

Se realizarán encuestas oficiales sistemáticas en tubérculos y plantas de patata para confirmar la ausencia del organismo.
Los productores y almacenes deben notificar inmediatamente cualquier sospecha o presencia confirmada del organismo.
En caso de sospecha, se prohíbe la circulación de lotes afectados y se toman medidas cautelares.
Si se confirma la presencia del organismo, se declara el material contaminado, se delimita una zona y se destruyen o eliminan los tubérculos y plantas contaminados bajo control oficial.

Texto legal

200 ok Norma derogada, con efectos a partir del 1 de enero de 2022, por la disposición derogatoria única.2.

b)del Real Decreto 739/2021, de 24 de agosto. Ref. BOE-A-2021-15095#dd La Directiva 93/85/CEE del Consejo, de 4 de octubre de 1993, relativa a la lucha contra la necrosis bacteriana de la patata, establece las medidas generales a adoptar en el seno de la Comunidad para la lucha contra este agente nocivo, así como la posibilidad de que los Estados miembros puedan adoptar medidas adicionales más estrictas en caso necesario, siempre que no se obstaculice la circulación de las patatas dentro de la Comunidad, salvo en los casos previstos en el Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protección contra la introducción y difusión en el territorio nacional y de la Comunidad Económica Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales; así como para la exportación y tránsito hacia países terceros. Teniendo en cuenta que el conocimiento de esta enfermedad y sus métodos de detección han evolucionado significativamente en los últimos años y que la aplicación del régimen fitosanitario comunitario a la Comunidad como un espacio sin fronteras son circunstancias por las que ha sido necesario derogar la Directiva 80/665/CEE del Consejo, de 24 de junio de 1980, relativa a las medidas mínimas que los Estados miembros debían adoptar contra la necrosis bacteriana, se hace preciso adoptar las medidas necesarias contempladas en la Directiva 93/85/CEE del Consejo, de 4 de octubre de 1993. En consecuencia, mediante esta Orden se traspone al ordenamiento interno dicha Directiva, de acuerdo con la competencia atribuida al Estado por los artículos 149.1.10.ª y 149.1.13.ª de la Constitución Española en materia de comercio exterior y bases y coordinación de la planificación general de la actividad económica, así como en ejercicio de la facultad que la disposición final primera del Real Decreto 2071/1993 atribuye al Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación para su desarrollo. En su virtud, dispongo: Artículo 1. Objeto. La presente disposición establece las medidas que deben adoptarse contra «Clavibacter michiganensis» (Smith) Davis et al. ssp. «sepedonicus» (Spieckermann et kottohoff) Davis et al., causante de la necrosis bacteriana de la patata (en lo sucesivo denominado «el organismo»), para:
a)Localizarlo y determinar su distribución.
b)Impedir su aparición y propagación, y
c)En caso de que aparezca, impedir su propagación y combatirlo con el fin de erradicarlo. Artículo 2. Establecimiento de encuestas oficiales sistemáticas. 1. Se llevarán a cabo sistemáticamente encuestas oficiales relativas al organismo en tubérculos y, cuando corresponda, en plantas de patata («Solanum tuberosum» L.), para confirmar su ausencia. Para estas encuestas, en el caso de los tubérculos, se tomarán muestras de patatas de siembra y de otro tipo, preferiblemente procedentes de lotes almacenados, que se someterán a pruebas de laboratorio oficiales o realizadas bajo control oficial, según el método dispuesto en el anexo I, para la determinación y el diagnóstico del organismo. Además cuando proceda, podrá realizarse una inspección visual oficial o bajo control oficial de otras muestras que implique el corte de los tubérculos. En el caso de las plantas deberán realizarse según los métodos apropiados que se determinen y las muestras deberán someterse a pruebas oficiales o bajo control oficial. 2. Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Autónoma, a los que se hace referencia en el artículo 11.2, b), del Real Decreto 2071/1993, deberán elaborar anualmente un programa en el que se determine el número, origen, estrato y calendario de toma de muestras, basándose en principios científicos y estadísticos sólidos, y en la biología del organismo, teniendo en cuenta los sistemas particulares de producción de patatas de las diferentes Comunidades Autónomas. Los detalles se comunicarán anualmente a través del cauce establecido a los demás Estados miembros y a la Comisión de la Comunidad Europea, con objeto de garantizar niveles de protección comparables entre los Estados miembros para la confirmación de la ausencia del organismo. 3. Los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas notificarán los resultados de las encuestas oficiales a que se refiere el apartado 1, a la Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria, y ésta a su vez a los demás Estados miembros de la Comunidad y a la Comisión de la Comunidad Europea. Los detalles de esta notificación serán confidenciales y podrán comunicarse al Comité Fitosanitario Permanente con arreglo al procedimiento comunitario establecido. Artículo 3. Obligación de notificación. Los productores, los almacenes colectivos y los centros de expedición de patatas deberán notificar inmediatamente a los órganos competentes de las Comunidades Autónomas, en que estén situadas sus parcelas o establecimientos, la aparición sospechosa o la presencia confirmada del organismo en tubérculos o plantas que produzcan, almacenen o comercialicen. Artículo 4. Aparición sospechosa del organismo. 1. Cuando los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas, tengan conocimiento, a través de las encuestas a que se refiere el apartado 1 del artículo 2 o mediante la notificación a que se refiere el artículo 3, o por cualquier otro medio, de la aparición sospechosa del organismo, éstos adoptarán las medidas oportunas para que se realicen pruebas de laboratorio oficiales o realizadas bajo control oficial con el método a que se refiere el anexo I y en las condiciones establecidas en el punto 1 del anexo II, con el fin de confirmar o desmentir la aparición sospechosa; en el primer caso se aplicará lo dispuesto en el punto 2 del anexo II. 2. Hasta tanto no se haya confirmado ni desmentido la aparición sospechosa con arreglo al apartado 1, en aquellos casos de aparición sospechosa en que:
i)Se hayan observado síntomas visuales de diagnóstico sospechosos, o
ii)Se hayan obtenido resultados positivos con la prueba de inmunofluorescencia con arreglo al anexo I o con otra prueba idónea que se establezca al efecto. Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas adoptarán las siguientes medidas:
a)Prohibir la circulación de todos los lotes o partidas de los que se hayan tomado las muestras, excepto bajo control oficial y siempre que se compruebe que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo;
b)Tomar medidas para descubrir el origen de la aparición sospechosa;
c)Adoptar medidas cautelares suplementarias adecuadas, que se establecerán, basadas en el nivel de riesgo estimado, para evitar cualquier propagación del organismo. Dichas medidas podrán incluir el control oficial de la circulación de todos los demás tubérculos o plantas dentro o fuera de las instalaciones relacionadas con la aparición sospechosa. Artículo 5. Confirmación de la presencia del organismo. 1. En el caso de que las pruebas de laboratorio oficiales o realizadas bajo control oficial con el método establecido en el anexo I confirmen la presencia del organismo en una muestra de tubérculos, plantas o partes de plantas, los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas, basándose en principios científicos sólidos, las características biológicas del organismo y los sistemas particulares de producción, comercialización y transformación de cada región:
a)Declararán contaminados los tubérculos, plantas, partidas y/o lotes, así como la maquinaria, vehículos, buques, almacenes o unidades de almacenamiento y cualesquiera objetos, incluido el material de embalaje, de los que proceda la muestra y, en su caso, el lugar o lugares de producción y el campo o los campos donde hayan sido recolectados los tubérculos o las plantas;
b)Determinarán, teniendo en cuenta lo dispuesto en el punto 1 del anexo III, la extensión de la probable contaminación por contacto previo o posterior a la recolección o por relación de producción con la contaminación declarada;
c)Delimitarán una zona basándose en la declaración de la contaminación mencionada en la letra a), la determinación de la extensión de la probable contaminación a que se refiere la letra
b)y la posible propagación del organismo, teniendo en cuenta lo dispuesto en el punto 2 del anexo III. 2. Los organismos oficiales responsables de las Comunidades Autónomas notificarán inmediatamente a la Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria, y ésta a los demás Estados miembros de la Comunidad y a la Comisión de la Comunidad Europea, de acuerdo con lo dispuesto en el punto 3 del anexo III, cualquier contaminación declarada de conformidad con la letra
a)del apartado 1 y los detalles de la zona delimitada de conformidad con la letra
c)del apartado 1. Los detalles de esta notificación serán confidenciales. 3. Cuando el Estado español sea mencionado en la notificación de contaminación confirmada de otros Estados miembros, la autoridad competente deberá declarar la contaminación, determinar la extensión de la probable contaminación y delimitar una zona de conformidad con las letras a),
b)y
c)del apartado 1. Artículo 6. Encuestas de patatas relacionadas clonalmente con las contaminadas. Cuando los tubérculos o plantas hayan sido declarados contaminados, en virtud de la letra
a)del apartado 1 del artículo 5, se dispondrá la realización de pruebas conforme a lo dispuesto en el apartado 1 del artículo 4 en las existencias de patatas que tengan relación clonal con las implicadas en la contaminación. Las pruebas se realizarán en tantos tubérculos o plantas como sea necesario para determinar la causa primaria de infección probable y la extensión de la probable contaminación, preferiblemente por orden de riesgo. A la vista de los resultados de las pruebas, se procederá a una nueva declaración de contaminación, a la determinación de la extensión de la probable contaminación y a la delimitación de una zona, cuando proceda, de conformidad, respectivamente, con las letras a),
b)y
c)del apartado 1 del artículo 5. Artículo 7. Medidas fitosanitarias a adoptar sobre el material contaminado. Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas adoptarán las siguientes medidas:
a)Prohibir que los tubérculos o plantas declarados contaminados en virtud de la letra
a)del apartado 1 del artículo 5 puedan ser plantados y que, bajo control oficial, sean: Destruidos o Eliminados de otro modo, por medio de medidas bajo control oficial, de conformidad con el punto 1 del anexo IV, siempre que se compruebe que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo.
b)Disponer que los tubérculos o plantas que se consideren probablemente contaminados de conformidad con la letra
b)del apartado 1 del artículo 5 no puedan ser plantados y, sin perjuicio de los resultados de las pruebas a que se refiere el artículo 6 para las existencias de patata que tengan relación clonal, bajo control oficial sean utilizados o eliminados de manera apropiada como se indica en el punto 2 del anexo IV en condiciones que garanticen la exclusión de cualquier riesgo identificable de propagación del organismo.
c)Disponer que la maquinaria, vehículos, buques, almacenes o unidades de almacenamiento y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que se declaren contaminados de conformidad con la letra
a)del apartado 1 del artículo 5, o se consideren probablemente contaminadas de conformidad con la letra
b)del citado artículo, sean destruidos o limpiados y desinfectados aplicando métodos apropiados como los indicados en el punto 3 del anexo IV, que permitan garantizar la exclusión de cualquier riesgo identificable de propagación del organismo. Tras su desinfección, esos objetos ya no se considerarán contaminados.
d)Sin perjuicio de las medidas previstas en los apartados a),
b)y c), disponer la aplicación de una serie de medidas definidas en el punto 4 del anexo IV en la zona delimitada de conformidad con la letra
c)del apartado 1 del artículo 5. Artículo 8. Medidas aplicables para evitar la contaminación mediante la patata de siembra. Los organismos oficiales responsables dispondrán que las patatas de siembra se ajusten a los requisitos establecidos en el Real Decreto 2071/1993 y que procedan directamente de material obtenido de acuerdo con un programa oficialmente aprobado y que haya sido declarado exento del organismo merced a pruebas oficiales o realizadas bajo control oficial según el método establecido en el anexo I. Las mencionadas pruebas se llevarán a cabo:
a)En las plantas de la selección clonal inicial cuando la contaminación afecta a la producción de patata de siembra.
b)En los demás casos, en las plantas de la selección clonal inicial, en las muestras representativas de patatas de siembra de base o en los materiales de reproducción anteriores. Artículo 9. Prohibición expresa. Queda prohibida la tenencia y manipulación del organismo. Artículo 10. Excepciones a las medidas fitosanitarias. Sin perjuicio de lo dispuesto en el Real Decreto 2071/1993, los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán autorizar excepciones a las medidas contempladas en los artículos 6, 7 y 9 de la presente disposición para fines experimentales o científicos y para trabajos de selección varietal, siempre que tales excepciones no obstaculicen la lucha contra el organismo ni supongan un riesgo de propagación de éste. Artículo 11. Medidas adicionales. Los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán adoptar medidas adicionales o más estrictas necesarias para combatir al organismo o impedir su propagación, siempre y cuando se ajusten a lo dispuesto en el Real Decreto 2071/1993. Las medidas adicionales que se mencionan en el párrafo primero del presente artículo podrán disponer que sólo puedan plantarse patatas de siembra que, de acuerdo con una certificación o una inspección oficial, se ajusten a las normas fitosanitarias. La inspección oficial podrá aplicarse en caso de que los agricultores estén autorizados a utilizar en sus explotaciones patatas de siembra de recolección propia o en otros casos en que se planten patatas de siembra de producción propia. Los detalles de tales medidas serán notificados a la Dirección General de Sanidad de la Producción Agraria y ésta, a su vez, a los demás Estados miembros y a la Comisión de la Comunidad Europea a través del cauce correspondiente. Disposición derogatoria. Queda derogada la Orden de 28 de febrero de 1986 relativa a la prevención y lucha contra el marchitamiento bacteriano de la patata, en aplicación de la Directiva 80/665/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas. Disposición final única. La presente disposición entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el «Boletín Oficial del Estado». Madrid, 22 de marzo de 1994. ALBERO SILLA Ilmos. Sres. Secretario general de Producciones y Mercados Agrarios y Director general de Sanidad de la Producción Agraria. ANEXO I MÉTODO PARA LA DETECCIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE LA NECROSIS BACTERIANA [CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS (SPIECKERMANN ET KOTTHOFF) DAVIS ET AL.] EN LOTES DE TUBÉRCULOS DE PATATA 1. Extracción de cuñas de la parte basal. 1.1 Lávense 200 tubérculos en agua corriente y quítese la epidermis que cubre la parte basal de cada tubérculo mediante una lanceta o un mondapatatas desinfectado de la forma habitual; puede efectuarse la desinfección sumergiendo el mondapatatas en etanol al 70 % y flameándolo. 1.2 Extráiganse cuidadosamente cuñas de tejido cónicas de las partes básales con un cuchillo o un mondapatatas. Procúrese extraer el mínimo posible de tejido vascular excedente. Una vez efectuadas las tomas, deben procesarse las partes básales de los tubérculos en un plazo de 24 horas (véase el punto 3), o bien conservarse a ‒20 °C durante dos semanas como máximo. 2. Examen visual para detectar síntomas de necrosis bacteriana. Tras la extracción de las partes basales, efectúese un corte transversal de cada tubérculo y obsérvese la presencia de síntomas de necrosis bacteriana. Comprímanse los tubérculos y obsérvese si se produce salida de tejidos macerados del tejido vascular. Los primeros síntomas consisten en un ligero aspecto vítreo o traslúcido del tejido, sin ablandamiento, en torno al sistema vascular, en especial cerca de la parte basal. La corona vascular de la parte basal puede tener un color ligeramente más oscuro de lo normal. El primer síntoma claramente detectable consiste en que la corona vascular adquiere una coloración amarillenta y al comprimir suavemente el tubérculo emergen de los vasos unas columnillas de material caseoso. Dicho exudado contiene millones de bacterias. En esta fase, puede producirse un oscurecimiento pardo del tejido vascular. Al principio, estos síntomas pueden limitarse a una parte de la corona, no necesariamente cerca de la parte basal, y pueden extenderse posteriormente a la totalidad de la corona. A medida que la infección progresa, se produce destrucción de tejido vascular; la zona cortical externa puede separarse de la zona cortical interna. En las fases avanzadas de la infección, se producen grietas en la superficie del tubérculo, que suelen tener un color pardo rojizo en los bordes. Los síntomas pueden verse enmascarados por una invasión secundaria fúngica o bacteriana que puede hacer difícil o incluso imposible, diferenciar los síntomas de necrosis bacteriana avanzada de otras necrosis de los tubérculos. 3. Preparación de las muestras para la tinción de Gram, la tinción de inmunofluorescencia (IF) y la prueba de la berenjena. 3.1 Homogeneícense las partes basales hasta conseguir la maceración completa en un diluyente del que se sepa que no es tóxico para el Corynebacterium sepedonicum [por ejemplo, solución fisiológica con tampón de fosfato 0,05 M (PBS) de pH 7,0] a una temperatura inferior a 30 °C; es aconsejable la incorporación de un desfloculante que no sea tóxico y puede ser necesario un agente antiespumante no tóxico (Apéndices 1 y 2). Debe evitarse la maceración excesiva. 3.2 Extráiganse las bacterias del material homogeneizado empleando uno de los siguientes métodos

(1):

(1)Un método alternativo de extracción es el descrito por Dinesen, 1984. A.

a)Centrifúguese durante 10 minutos, a 180 g como máximo.
b)Centrifúguese el sobrenadante durante 10 minutos, a 4.000 g como mínimo. Decántese y deséchese el sobrenadante. B.
a)Déjese reposar el macerado durante 30 minutos, a fin de que los restos de tejido se posen. Decántese el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
b)Fíltrese el sobrenadante a través de un papel de filtro (Whatman n.º 1) colocado en un filtro de vidrio sinterizado (n.º 2 = 40 ‒ 100 µm) mediante una bomba de agua de vacío. Recójase el material filtrado en un tubo de centrífuga. Lávese el filtro con solución PBS estéril para obtener un volumen máximo de material filtrado de 35 ml.
c)Centrifúguese el material filtrado durante 20 minutos, a 4.000 g como mínimo. 3.3 Suspéndase el sedimento en tampón de fosfato 0,01 M de pH 7,2 estéril (Apéndice 2), con el fin de obtener un volumen total aproximado de 1 ml. Divídase en dos partes iguales y consérvese una de ellas como referencia, bien por congelación a ‒20 °C

(2)o bien por liofilización. Divídase la otra parte en dos mitades, una para la prueba de IF y tinción de Gram y la otra para la prueba de la berenjena.

(2)Existen purebas (Janse y Van de Vaerenberg, 1987) que la congelación podría disminuir la viabilidad del Corynebacterium sepedonicum. Puede superarse este problema mediante suspensión del sedimento en glicerol al 10 %. 3.4 Es imprescindible que todos los controles y muestras positivos en lo que respecta al C. sepedonicum se procesen por separado, a fin de evitar contaminaciones. Esto se aplica a las preparaciones para IF y a las pruebas de la berenjena. 4. Tinción de Gram. 4.1 Prepárense tinciones de Gram para todas las diluciones del material centrifugado (5.2.1) y para cualquier tubérculo cortado

(2)que presente aspecto vítreo, reblandecimiento u otros síntomas sospechosos. Las muestras deben tomarse del borde de los tejidos enfermos. 4.2 Prepárense tinciones de Gram de cultivos conocidos de C. sepedonicum y, si fuese posible, de tejidos infectados naturalmente (5.1). 4.3 Determínense las muestras que contienen células grampositivas corineformes típicas. Por lo general, las células de C. sepedonicum miden 0,8-1,2 µm de largo y 0,4-0,6 µm de ancho. En el Apéndice 3 se describe un procedimiento de tinción adecuado. Los preparados de infecciones naturales o de cultivos aislados recientemente suelen mostrar un predominio de bacilos cocoides que habitualmente son de menor tamaño que las células de cultivos en agar más antiguos. En la mayor parte de los medios de cultivo, las células de C. sepedonicum son bacilos corineformes pleomorfos y pueden dar una reacción de Gram variable. Las células se presentan aisladas, de a pares con unos «codos» característicos típicos de la división por plegado y, en ocasiones, en grupos irregulares descritos generalmente como empalizadas o caracteres chinos.

Método para la prueba de IF. 5.1 Utilícese suero inmune contra una cepa conocida de C. sepedonicum ATCC 33113 (NCPPB 2137), o NCPPB
Dicho suero debe tener un título IF no inferior a 1:
Inclúyase en el portaobjetos de la prueba un control de PBS, a fin de determinar si el conjugado de inmunoglobulina anticonejo con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se combina de forma inespecífica con las células bacterianas. Deben utilizarse Corynebacterium sepedonicum [ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140] como controles de antígenos homólogos en un portaobjetos separado. De ser posible, deberán utilizarse tejidos infectados de forma natural (conservados mediante liofilización o congelación a - 20 °C) como control similar, en el mismo portaobjetos (véase la figura 2). 5.2 Procedimiento. 5.2.1 Prepárense tres diluciones decimales seriadas (101, 102, 103) del sedimento final en agua destilada (véase la figura 1). 5.2.2 Extráigase con pipeta un volumen estándar medido que sea suficiente para cubrir la ventanita (aprox. 25 µl) de cada una de las diluciones del sedimento o de suspensión de C. sepedonicum (aproximadamente 106 células/ml) y viértase en las ventanitas de un portaobjetos múltiple del tipo representado en la figura
5.2.3 Déjese secar al aire a una temperatura de unos 37 ºC y fíjese con etanol 95 % o mediante flameado. 5.2.4 Cúbranse las ventanitas correspondientes con suero inmune anti-C. sepedonicum a las diluciones recomendadas en PBS 0,01 M de pH 7,2 (Apéndice 2), según se ilustra en la figura
(Empléese PBS para el control de FITC). La dilución de trabajo del suero inmune debe ser aproximadamente la mitad del título de IF. En caso de que vayan a incluirse otras diluciones de suero inmune deberán prepararse portaobjetos separados para cada dilución que vaya a emplearse. 5.2.5 Incúbese en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5.2.6 Enjuáguese cuidadosamente con PBS 0,01 M de pH 7,
Lávese durante 5 minutos en PBS 0,01 M de pH 7,2, cambiando la solución tres veces. 5.2.7 Retírese con cuidado el exceso de humedad. 5.2.8 Cúbrase cada ventanita con conjugado FITC en la misma dilución empleada para determinar el título e incúbese en cámara húmeda oscura a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5.2.9 Enjuáguese y lávese como se hizo anteriormente. 5.2.10 Aplíquense aproximadamente 5-10 µl de glicerina con tampón de fosfato 0,1 M de pH 7,6 (o un producto similar con un pH que no sea inferior a 7,6) a cada una de las ventanitas y cúbrase con un cubreobjetos (Apéndice 2). 5.2.11 Examínese con un microscopio dotado de una fuente luminosa epifluorescente y de filtros adecuados para trabajar con FITC. Un aumento de 400-1.000 resulta adecuado. Recórranse las ventanitas cultivadas a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro de las ventanitas. Búsquense células fluorescentes en los controles positivos y determínese el título. Búsquense células fluorescentes en la ventanita de control FITC/PBS y, de no hallarse, pásese a las ventanas del material de la prueba. Determínese como mínimo en 10 campos microscópicos el número medio de células fluorescentes morfológicamente típicas por campo, y calcúlese en número por ml de sedimento sin diluir (véase el Apéndice 4). Existen varios problemas inherentes a la prueba de inmunofluorescencia. ‒ Pueden aparecer en el material centrifugado de patata poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los del Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Ténganse en cuenta únicamente las células fluorescentes de tamaño y morfología típicos. Dada la posibilidad de reacciones cruzadas, se volverá a efectuar la prueba con un suero inmune diferente en las muestras con resultado positivo de la prueba de inmunofluorescencia. ‒ El límite técnico de detección de este método se sitúa entre 103 y 104 células por ml de material de sedimento, centrifugado sin diluir. Las muestras con recuentos de células IF típicas en el límite de detección suelen dar resultado negativo en lo que respecta al C.m. ssp sepedonicus, pero pueden utilizarse para la prueba de la berenjena. Se identificará como prueba de inmunofluorescencia negativa toda muestra en la que no se observen células fluorescentes de morfología típica. Se considerará que las muestras «no están contaminadas» por Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. No será necesario efectuar la prueba de la berenjena. Se identificará como prueba de inmunofluorescencia positiva toda muestra en la que se observen células fluorescentes de morfología típica. Las muestras identificadas como positivas en la prueba de inmunofluorescencia con ambos sueros inmunes se considerarán «potencialmente contaminadas» por Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Deberá efectuarse la prueba de la berenjena para todas las muestras que se consideren potencialmente contaminadas.
Prueba de la berenjena. Consúltense los pormenores de cultivo en el Apéndice
6.1 Repártase el material centrifugado obtenido según el punto 3.3 entre un mínimo de 25 plantas de berenjena en la fase foliar 3 (Apéndice 5) con arreglo a uno de los métodos que se indican a continuación (6.2, 6.3 o 6.4). 6.2 Inoculación en estrías I. 6.2.1 Sujétese el tiesto en posición horizontal [un bloque de poliestireno expandido al que se extrae de una de sus caras un trozo de 5 cm de profundidad × 10 cm de ancho × 15 cm de largo (figura 3) resulta adecuado para un tiesto de 10 cm]. Debe colocarse entre el tallo y el bloque una tira de hoja de aluminio estéril por cada muestra sometida a la prueba. Puede inmovilizarse la planta con una banda de goma alrededor del bloque. 6.2.2 Con una lanceta efectúese un corte longitudinal o ligeramente en diagonal, de 0,5-1,0 cm de largo y de una profundidad aproximada de las tres cuartas partes del diámetro del tallo, entre los cotiledones y la primera hoja. 6.2.3 Manténgase abierta la estría con la punta de la hoja de la lanceta y sitúese en ella el material inoculado mediante un pincel del tipo de delineador de párpados o un pincel fino de pintura artística cargado con el material obtenido por centrifugado. Distribúyase el resto de este material entre las plantas de berenjena. 6.2.4 Séllese el corte con vaselina estéril con una jeringa de 2 ml. 6.3 Inoculación en estrías II. 6.3.1 Sosteniendo la planta entre dos dedos aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 µl) del sedimento en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja. 6.3.2 Con una lanceta estéril practíquese una incisión diagonal (a un ángulo de unos 5º), de 1,0 cm de largo y de una profundidad de unos 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del sedimento. 6.3.3 Séllese el corte con vaselina estéril con una jeringa. 6.
Inoculación con jeringa. 6.4.1 Las berenjenas no deben regarse el día anterior a la inoculación para reducir la presión de turgencia. 6.4.2 Inocúlense los tallos de la berenjena justo por encima de los cotiledones utilizando una jeringa provista de aguja hipodérmica (no menos de 23G). Distribúyase el sedimento entre las berenjenas. 6.5 Inocúlense 25 plantas con un cultivo conocido de C. sepedonicum y, cuando sea posible, tejido tuberoso infectado naturalmente (5.1) con el mismo método de inoculación (6.2, 6.3 o 6.4). 6.6 Inocúlense 25 plantas con PBS 0,05 M estéril con el mismo método de inoculación (6.2, 6.3 o 6.4). 6.7 Incúbense las plantas en las condiciones adecuadas (Apéndice 5) durante 40 días. Examínese regularmente si hay síntomas a los 8 días. Cuéntese el número de plantas en que se manifiesten síntomas. La C. sepedonicum produce un marchitamiento de las hojas de las berenjenas, que puede comenzar en forma de flaccidez intervenosa o marginal. El tejido marchito puede aparecer al principio de color verde oscuro o moteado, pero se vuelve más pálido antes de necrosarse. Los marchitamientos intervenosos suelen tener un aspecto graso, como de estar empapados de agua. El tejido necrosado presenta a veces un margen amarillo brillante. Las plantas no están necesariamente muertas; cuanto más tardan en aparecer los síntomas, tanto mayor es la posibilidad de supervivencia. Las plantas pueden superar la infección. Las berenjenas jóvenes delicadas son mucho más sensibles a las poblaciones bajas de C. sepedonicum que las plantas de más edad, por lo que es necesario utilizar plantas en el estadio foliar 3, o inmediatamente antes del mismo. Pueden inducir asimismo el marchitamiento las poblaciones de otras bacterias u hongos presentes en el sedimento de tejido tuberoso, entre las que se incluyen la Erwinia carotovora, subespecie carotovora, y la E. carotovora, subespecie atroséptica, la Phoma exigua, variedad foveata, así como grandes poblaciones de bacterias saprofitas. Dichos marchitamientos se pueden distinguir de los causados por la C. sepedonicum, porque se marchitan rápidamente hojas o plantas enteras. 6.8 Prepárese una tinción de Gram

(4)para todos los lotes de berenjenas con síntomas, utilizando secciones del tejido foliar y del tallo marchito de las plantas, y aísleselas en medios nutritivos adecuados

(7). Desinféctese la superficie de las hojas y tallos de berenjena frotándolos con etanol al 70 %. 6.9 En determinadas circunstancias, en particular cuando las condiciones de crecimiento sean óptimas, puede ocurrir que la C. sepedonicum esté presente como infección latente de las berenjenas, incluso después de un período de incubación de cuarenta días. Dichas infecciones pueden dar lugar a atrofia y falta de vigor de las plantas inoculadas. Si la prueba de IF se considera positiva, puede considerarse necesario hacer nuevas pruebas. Es esencial, por tanto, comparar los índices de crecimiento de todas las plantas de berenjena del grupo experimental con las plantas de control inoculadas con PBS 0,05 M estéril y controlar las condiciones ambientales del invernadero. A continuación se exponen las recomendaciones para las nuevas pruebas: 6.9.1 Córtense los tallos por encima del sitio de inoculación y quítense las hojas. 6.9.2 Macérense los tallos en una solución de PBS 0,05 M de pH 7,0, como se indica en 3.1 y 3.2. 6.9.3 Utilícese la mitad del sedimento para realizar una tinción de Gram

(4)y una prueba de IF

(5). 6.9.4 Utilícese la otra mitad para realizar una nueva prueba de la berenjena

(6)si la tinción de Gram o la prueba de IF o ambas son positivas. Utilícese un cultivo conocido de C. sepedonicum y controles de PBS 0,05 M estériles. Si no se observan síntomas en la prueba siguiente hay que considerar que la muestra es negativa. 7. Aislamiento de la C. sepedonicum. Sólo se puede confirmar el diagnóstico si la C. sepedonicum es aislada e identificada como tal

(8). Aunque la C. sepedonicum es un organismo delicado, puede aislarse a partir de tejido sintomático. No obstante, puede ser eliminado por las bacterias saprofitas que proliferan rápidamente y, por tanto, no se recomiendan los aislamientos directos a partir del sedimento de tejido tuberoso (3.3). Las berenjenas ofrecen un medio de enriquecimiento selectivo excelente para la proliferación de la C. sepedonicum y facilitan también una prueba confirmatoria excelente de huésped. Se deben realizar los aislamientos a partir de todos los tubérculos de patata y berenjenas sintomáticos (4 y 6). La maceración de los tallos de berenjena debería realizarse cuando sea necesario, como se expone en 3 y 6.

7.1 Siémbrense suspensiones en la superficie de uno de los siguientes medios (las fórmulas están indicadas en el Apéndice 6): ‒ agar de dextrosa nutritivo (solamente para subcultivo), ‒ agar de levadura, peptona, glucosa, ‒ agar nutritivo de levadura, dextrosa, ‒ agar de extracto de levadura, sales minerales. Incúbese a 21 °C durante 20 días como máximo. La C. sepedonicum crece lentamente y suele provocar unas colonias punteadas, de color crema, de forma abovedada, en el plazo de diez días. Siémbrese de nuevo para purificar. Se mejora el ritmo de crecimiento con subcultivos. Las colonias típicas son de color blanco crema o marfil, redondeadas, lisas, abultadas, abovedadas en forma convexa, mucoso-fluidas, con bordes intactos y normalmente de un diámetro de 1 a 3 mm. Identificación. Muchas bacterias grampositivas corineformes, con características de colonia similares a las de C. sepedonicum, pueden aislarse a partir de patatas y berenjenas sanas o enfermas. En dicho contexto, la C. sepedonicum debe identificarse con las siguientes pruebas: ‒ prueba IF (5.1); ‒ prueba de la berenjena; ‒ pruebas fisiológicas y nutricionales (Apéndice 7): • prueba de la oxidación/fermentación (O/F), • prueba de la oxidasa, • crecimiento a 37 °C, • producción de ureasa, • hidrólisis de la esculina, • hidrólisis del almidón, • tolerancia a una solución de cloruro sódico al 7 %, • prueba del indol, • prueba de la catalasa, • producción de H2S, • utilización de citrato, • hidrólisis de la gelatina, • ácido de: glicerol, lactosa, ramnosa y salicina, • tinción de Gram. En todas las pruebas deberá incluirse un control conocido de C. sepedonicum. Las pruebas fisiológicas y nutricionales deberán realizarse utilizando inoculaciones de subcultivos de agar nutritivo. Las comparaciones morfológicas deberán realizarse a partir de cultivos de agar de dextrosa nutritivos. Para la prueba de la IF, las poblaciones celulares deberán ajustarse a 106 células/ml. El título de IF deberá ser similar al del cultivo conocido de C. sepedonicum. Para la prueba con berenjenas, las poblaciones celulares deberán ajustarse aproximadamente a 107 células/ml. Las pruebas con berenjenas deberán realizarse utilizando 10 plantas para cada organismo de prueba, utilizando de nuevo un cultivo conocido de C. sepedonicum y controles de agua esterilizada; con cultivos puros deberá obtenerse un marchitamiento típico a partir de los 20 días, pero las plantas que no presenten los síntomas tras este período deberán incubarse durante un período total de 30 días a temperaturas propicias para el desarrollo de las berenjenas, pero sin sobrepasar los 30 °C (véase el Apéndice 5). Si después de 30 días no se presentan los síntomas, no podrá confirmarse que el cultivo es una forma patógena de Corynebacterium sepedonicum. Prueba C. sepedonicum O/F Inerte o ligeramente oxidante Oxidasa ‒ Catalasa + Reducción de nitratos ‒ Actividad de ureasa ‒ Producción de H2S ‒ Producción de indol ‒ Utilización de citratos ‒ Hidrólisis del almidón ‒ o débil Crecimiento a 37 °C ‒ Crecimiento en NaCl al 7 % ‒ Hidrólisis de la gelatina ‒ Hidrólisis de la esculina + Ácido de: ‒ glicerol ‒ ‒ lactosa ‒ o débil ‒ ramnosa ‒ ‒ salicina ‒ Apéndice 1 FORMULACIÓN DEL FLUIDO MACERANTE RECOMENDADA POR LELLIOTT Y SELLAR 1976 Compuesto D C silicona antiespumante MS A (Hopkins & Williams Ltd, Cat n° 9964-25, Chadwell Heath, Essex, England) 10 ml Copos de LubroI W (ICI. Ltd) 0,5 g Pirofosfato tetrasódico 1 g Solución fisiológica con tampón de fosfato 0,05 M pH 7,0 (Apéndice 2) 1 litro Apéndice 2 SOLUCIONES TAMPÓN Solución fisiológica con tampón de fosfato 0,05 M (PBS) de pH 7,
Esta solución puede utilizarse para la maceración de tejidos de tubérculo (2.1). Na2HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g NaCl 8,0 g Agua destilada hasta 1 litro Solución fisiológica con tampón de fosfato, 0,01 M (PBS) de pH 7,
Esta solución tampón se utiliza para diluir sueros inmunes y lavar los portaobjetos. Na2HPO4: 12H20 2,7 g NaH2PO4: 2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Agua destilada hasta 1 litro Solución de glicerina con tampón de fosfato 0,1 M (PBS) de pH 7,
Esta solución tampón se utiliza para aumentar la fluorescencia en la prueba de IF. Na2HPO4: 12H2O 3,2 g NaH2PO4: 2H2O 0,15 g Glicerol 50 ml Agua destilada 100 ml Apéndice 3 TINCIÓN DE GRAM (MODIFICACIÓN DE HUCKER’S) (DOETSCH, 1981) Solución de cristal violeta. Disuélvanse 2 g de cristal violeta en 20 ml de etanol de 95 %. Disuélvanse 0,8 g de oxalato amónico en 80 ml de agua destilada. Mézclense las dos soluciones. Solución de Lugol. Yodo 1 g Yoduro potásico 2 g Agua destilada 300 ml Tritúrense conjuntamente los sólidos en un mortero. Añádanse al agua y remuévanse hasta su disolución en un recipiente cerrado. Solución de contraste de safranina. Solución base: Safranina O 2,5 g Etanol de 95 % 100 ml Mézclese y consérvese. Dilúyase al 1:10 para conseguir una solución de trabajo. Procedimiento de tinción.
Prepárense los frotis, séquense con aire y fíjese por calor.
Sumérjase el portaobjetos en la solución de cristal violeta durante un minuto.
Lávese brevemente con agua corriente.
Sumérjase en solución de Lugol durante un minuto.
Lávese con agua corriente y séquese.
Decolórese con etanol de 95 %, añadido gota a gota hasta que ya no se produzca ningún cambio de color, o sumérjase agitando suavemente durante 30 segundos.
Lávese con agua corriente y séquese.
Sumérjase en la solución de safranina durante 10 segundos.
Lávese con agua corriente y séquese. Las bacterias grampositivas se colorean de violeta-azul y las gramnegativas de rosa-rojo. Apéndice 4 DETERMINACIÓN DE LA POBLACIÓN DE CÉLULAS POSITIVAS IF Superficie (S) de la ventanita del portaobjetos múltiple

(1)en que D = diámetro de la ventanita. Superficie (s) del campo del objetivo

(2)Calcúlese d bien por medición directa bien con las siguientes fórmulas:

(3)en que i = coeficiente de campo (dependiente del tipo del ocular y varía de 8 a 24). K = coeficiente del tubo (1 o 1,25). G = aumento de (100 ×, 40 ×, etc.) objetivo. ‬‬

(4)Cuéntese el número de células fluorescentes típicas por campo (c). Calcúlese el número de células fluorescentes típicas por ventanita (C). Calcúlese el número de células fluorescentes típicas por ml de sedimento (N) en que y = volumen de sedimento en ventanita en que F = factor de dilución sedimento. Apéndice 5 CULTIVO DE BERENJENAS Siémbrense semillas de berenjena (Solanum melongena cv. Black Beauty) en «compost» pasteurizado de semillas. Trasplántense los plantones con los cotiledones completamente abiertos (10 a 14 días) en «compost» pasteurizado de tiesto. Utilícense las berenjenas en su fase foliar 3, cuando tengan de dos a tres hojas como máximo totalmente abiertas. Las berenjenas deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones ambientales: duración diurna: 14 horas o día natural si es de mayor duración temperatura: ‒ día de 21 a 24 °C, ‒ noche 15 °C. NB: C. sepedonicum no crece con temperaturas >30 °C. Si la temperatura nocturna no baja hasta 15 °C, puede resultar lesionado el cromóforo (necrosis plateada). La lesión radicular causada por larvas de Scraridae puede superarse aplicando un insecticida apropiado. Se puede obtener la berenjena cv. Black Beauty en: 1) AB Hammenhögs Frö 270 50 Hammenhög Suecia 2) HURST Seeds Ltd Avenue Road Witham Essex CM8 2DX Inglaterra 3) ASGRO Italia Sp.A. Corso Lodi, 23 Milán 4) KÜPPER Mitteldeutsche Samen GmbH Hessenring, 22 D-37269 Eschwege Apéndice 6 MEDIO DE CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE LA C. SEPEDONICUM Agar nutritivo (NA). Viértase agar nutritivo Difco Bacto en agua destilada en la proporción indicada por el fabricante. Esterilícese en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Agar de dextrosa nutritivo (NDA). Agar nutritivo de Difco Bacto con un 1 % de D( + )-gIucosa (monohidrato). Esterilícese en autoclave a 115 °C durante 20 minutos. Agar de levadura, glucosa, peptona, (YPGA). Extracto de levadura Difco Bacto (n.º 0127) 5 g Difco Bacto Peptona (n.º 0118) 5 g D( + )-glucosa (monohidrato) 10 g Agar purificado Difco Bacto (n.º 0560) 15 g Agua destilada 1 litro Esterilícense volúmenes de medio litro de este medio en autoclave a 115 ºC durante 20 minutos. Medio de sales minerales, extracto de levadura (YGM). Extracto de levadura Difco Bacto 2,0 g D( + )-glucosa (monohidrato) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4 ∙ 7H2O 0,1 g MnSO4 ∙ H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4 ∙ 7H2O 0,005 g Agar purificado Difco Bacto 18 g Agua destilada 1 litro Esterilícense volúmenes de medio litro de este medio en autoclave a 115 °C durante 20 minutos. Apéndice 7 PRUEBAS FISIOLÓGICAS Y NUTRICIONALES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA C. SEPEDONICUM Incúbense todos los medios a 21 °C y examínense transcurridos 6 días. Si no se ha producido crecimiento, incúbense hasta llegar a los 20 días. — Prueba oxidativa y fermentativa (Hugh & Leifson, 1953) - prueba O/F Medio básico: KCl 0,2 g MgSO4 ∙ 7H2O 0,2 g NH4H2PO4 1,0 g Peptona Difco Bacto 1,0 g Agar purificado Difco Bacto 3,0 g D( + )-glucosa (monohidrato) 10,0 g Azul de bromotimol 0,03 g Agua destilada 1 litro Mézclese y ajústese a pH 7,0-7,2 con KOH 1N. Distribúyase en tubos de cultivo Pyrex de 16 mm x 100 mm (12 ml de capacidad), en volúmenes de 5 ml y 10 ml. Esterilícese en autoclave a 115 °C durante 10 minutos. Inyéctense por punción los tubos de 5 ml y 10 ml para cada cultivo. Añádanse asépticamente de 1 a 2 ml de parafina líquida estéril al tubo de 10 ml. Incúbese. Tubo Color Interpretación Abierto Cerrado Amarillo Amarillo Fermentativa Abierto Cerrado Amarillo Azul-verde Oxidativa o inerte Abierto Cerrado Verdoso Azul-verde Oxidativa ‒ Prueba de la oxidasa (Kovacs, 1956). Reactivo de la oxidasa de Kovacs: Solución acuosa al 1 % de clorhidrato de tetrametilparafenilnediamina (BDH n.º 30386) en agua destilada. Este reactivo debe estar recién preparado en volúmenes de 1 ml o puede conservarse en un frasco de vidrio pardo a 5 °C durante 1-4 semanas. Colóquese una gota del reactivo en un papel de filtro en una placa de Petri limpia. Inmediatamente frótese algo del cultivo para la prueba a partir de agar nutritivo usando una asa de platino. Reacción positiva: aparece coloración púrpura en el término de 10 segundos. Los cultivos con tiempos de 10-30 segundos son débilmente positivos. Nota: Tiene importancia fundamental usar una asa de platino y cultivos NA, ya que las trazas de hierro o un elevado contenido de azúcar en el medio de cultivo pueden dar resultados positivos falsos. ‒ Producción de ácido de lactosa, ramnosa, salicina, glicerol. Prepárese el medio de Hugh & Leifson O/F sin la glucosa. Distribúyase en volúmenes de 5 ml en tubos. Esterilícese en autoclave a 115 °C durante 10 minutos. A la base fundida a 45 °C, añádanse en condiciones de asepsia 0,5 ml de soluciones acuosas al 10 % esterilizadas y filtradas de glicerol, lactosa, ramnosa o salicina. Mézclese cuidadosamente. Reacción positiva: el cambio de color de verde-azul a amarillo indica la producción de ácido. ‒ Prueba de la catalasa. Colóquese una gota de peróxido de hidrógeno (30 en volumen) en un portaobjetos limpio y emulsifíquese con una asa de platino llena de cultivo. Reacción positiva: La producción de burbujas de oxígeno en la gota indica la presencia de catalasa. ‒ Actividad nitrato reductasa y desnitrificación (Bradbury, 1970). Medio de cultivo: KNO3 (libre de nitritos) 1 g Extracto de levadura Difco Bacto 1 g K2HPO4 5 g Agua destilada 1 litro Distribúyase en volúmenes de 10 ml en frascos de 20 ml. Esterilícese en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Reactivo A: H2SO4 8 g Ácido acético 5N 1 litro Reactivo B: Naftilamina 5 g Ácido acético 5N 1 litro Inocúlese el medio de nitrato por duplicado. Efectúese la prueba al cabo de 10 y 20 días, añadiendo una gota de solución de Lugol, 0,5 ml de reactivo A y 0,5 ml de reactivo B. Si el medio no pasa a color rojizo, añádanse unos 50 mg de polvo de zinc. Obsérvese la reacción de color. Reacción positiva Reacción de color Fase 1 Fase 2 Sin reducción de nitratos incolora rojo Reducción de nitratos hasta nitritos (nitrato reductasa solamente) rojo ‒ Reducción de nitratos más allá de nitritos (desnitrificación ‒ nitrato y nitrito reductasa) incolora incolora ‒ Producción de ureasa (Lelliott, 1966). Medio básico: Agar urea oxoide base (CM53) 2,4 g Agua destilada 95 ml Esterilícese en autoclave a 115 °C durante 20 minutos. Enfríese la base fundida a 50 °C y en condiciones de asepsia añádanse 5 ml de solución de urea acuosa al 40 % esterilizada y filtrada (Oxoid SR20). Mézclese bien. Distribúyase en volúmenes de 6 ml en tubos estériles (16 × 100 mm) y déjese sedimentar en forma de pendientes con un buen extremo. Reacción positiva: el medio amarilio-naranja desarrolla una coloración rosa magenta a rojo cereza si ha habido actividad ureasa. Utilización de citratos (Christensen) (Skerman, 1967). Citrato agar base (Merck 2503) 23 g Agua destilada 1 litro Mézclese y disuélvase calentando. Distribúyase en volúmenes de 6 ml como para el medio de urea. Esterilícese en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y déjese sedimentar en forma de pendientes. Reacción positiva: la utilización de citratos la indica un cambio de color del medio de naranja a rojo. – Producción de sulfuro de hidrógeno (Ramamurthi, 1959). Medio: Triptona Difco Bacto (n.º 0123) 10 g K2HPO4 1 g NaCl 5 g Agua destilada 1 litro Disuélvase y distribúyase en volúmenes de 6 ml en tubos de 16 x 100 mm. Esterilícese en autoclave a 115 °C durante 10 minutos. Inocúlese y suspéndase, en condiciones de asepsia, un papel de acetato de plomo (Merck 9511) del borde del tubo. Manténgase en dicho lugar con el tapón. Incúbese hasta 20 días. Reacción positiva: la producción de H2S a partir de la triptona la indica la aparición de una coloración negra-parda del papel de prueba. ‒ Producción de indol (Ramamurthi, 1959). Medio: Como para la prueba del H2S. Retírese el papel de acetato de plomo y añádanse 1-2 ml de dietiléter y agítese suavemente. Déjese que las capas se separen (5 minutos). Añádanse 0,5 ml de reactivo de Kovacs (Merck 9293) haciendo que bajen por el interior del tubo en pendiente. Reacción positiva: la presencia de indol la indica la aparición de un color rojo en la capa amarilla entre las fracciones de éter y acuosa. ‒ Crecimiento a 37 ºC (Ramamurthi, 1959). Medio: Caldo nutritivo Difco Bacto (n.º 0003) 8 g Agua destilada 1 litro Mézclese, disuélvase y distribúyase en volúmenes de 6 ml en tubos. Esterilícese en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Inocúlese e incúbese a 37 °C. Reacción positiva: compruébese el crecimiento. ‒ Crecimiento en cloruro sódico al 7 % (Ramamurthi, 1959). Medio: Caldo nutritivo Difco Bacto 8 g NaCl 70 g Agua destilada 1 litro Mézclese, disuélvase y distribúyase en volúmenes de 6 ml en tubos. Esterilícese en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Reacción positiva: compruébese el crecimiento. ‒ Hidrólisis de la gelatina (Lelliott, Billing & Hayward, 1966). Medio: Gelatina Difco Bacto (n.º 0143) 120 g Agua destilada 1 litro Mézclese, disuélvase calentando y distribúyase en volúmenes de 6 ml en tubos. Esterilícese en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Reacción positiva: licuefacción de la gelatina incluso si se mantiene a 5 ºC durante 30 minutos. ‒ Hidrólisis del almidón Medio: Agar nutritivo (fundido) Difco Bacto 1 litro Almidón soluble Difco Bacto º(n.º 0178) 2 g Mézclese, esterilícese en autoclave a 115 °C durante 10 minutos. Viértase en placas. Háganse siembras puntuales en las placas. Cuando se haya producido un buen crecimiento (de 10 a 20 días), retírese parte del crecimiento y cúbrase con solución de Lugol. Reacción positiva: la hidrólisis del almidón la indican zonas claras debajo o alrededor del crecimiento bacteriano; el resto del medio se tiñe de púrpura. ‒ Actividad de esculina hidrolasa (Sneath & Collins, 1974). Medio: Peptona Difco Bacto 10 g Esculina 1 g Citrato férrico (Merck 3862) 0,05 g Citrato sódico 1 g Agua destilada 1 litro Mézclese hasta disolución y distribúyase en volúmenes de 6 ml en tubos. Esterilícese en autoclave a 115 ºC durante 10 minutos. El medio es claro, pero presenta una fluorescencia azulada. Reacción positiva: la hidrólisis de la esculina se manifiesta por la aparición de un color pardo junto con la desaparición de la fluorescencia, lo cual puede comprobarse utilizando una lámpara ultravioleta. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bradbury, J. F., 1970. Isolation and preliminary study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218. Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14

(2), 147-

Doetsch, R. N.,
«Determinative methods of light microscopy», In: Manual of methods for general bacteriology, American Society for Microbiology, Washington. 21-
Hugh, R. F. Leifson,
The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram-negative bacteria. J. Bact., 66, 24-
Janse, J. D. J. Van Vaerenbergh, The interpretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., n.º 17, 1987, p. 1-
Kovacs, N.,
Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178,
Lelliott, R. A.,
The plant pathogenic coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-
Lelliott, R. A., E. Billing A. C. Hayward,
A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads. J. appl. Bact., 29, 470-
Lelliott, R. A., P. W. Sellar,
The detection of latent ring rot [Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.] in potato stocks. EPPO Bull., 6

(2), 101-106. Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive phytopathogenic bacteria and their relationship to the Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta. 366, 52 p. Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera of bacteria. Segunda edición, Williams and Wilkins Company, Baltimore. Sneath, P. H. A. V. G. Collins, 1974. A study in test reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527. ANEXO I Método de diagnóstico, detección e identificación de la necrosis bacteriana, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis etal. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) ÁMBITO DE APLICACIÓN DEL MÉTODO El método expuesto describe diversos procedimientos relacionados con:

i)el diagnóstico de la necrosis bacteriana en tubérculos y plantas de patata,
ii)la detección de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en muestras de tubérculos y plantas de patata, iii) la identificación de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus). PRINCIPIOS GENERALES Los apéndices recogen protocolos optimizados para los distintos métodos, reactivos validados y datos relativos a la preparación de los materiales utilizados en las pruebas y de los materiales de control. El apéndice 1 incluye una lista de los laboratorios que participaron en la optimización y la validación de los protocolos. Dado que los protocolos entrañan la detección de un organismo sujeto a cuarentena e incluirán la utilización de cultivos viables de C. m. subsp. sepedonicus como materiales de control, será necesario ejecutar los procedimientos en las condiciones de cuarentena apropiadas con las instalaciones necesarias para el desecho de los residuos y contando con los permisos pertinentes emitidos por las autoridades oficiales responsables de la cuarentena fitosanitaria. Los parámetros de prueba deben garantizar la detección coherente y reproducible de los niveles de C. m. subsp. sepedonicus en los límites fijados por los métodos seleccionados. Es esencial una preparación precisa de los controles positivos. El hecho de ejecutar las pruebas de acuerdo con los límites exigidos implica también la utilización de los ajustes correctos, el mantenimiento y la calibración del equipo, una cuidadosa manipulación y conservación de los reactivos, y la aplicación de todas las medidas destinadas a evitar la contaminación entre las muestras, como, por ejemplo, la separación de los controles positivos de las muestras de prueba. Se deben aplicar normas relativas al control de la calidad con el fin de evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente por lo que se refiere al etiquetado y la documentación. Toda aparición sospechosa, como la referida en el artículo 4, apartado 2, de esta orden, entraña un resultado positivo en las pruebas de diagnóstico o de selección realizadas con una muestra tal como se especifica en los diagramas de flujo. Si en la primera prueba de selección (IF o PCR/FISH) se obtiene un resultado positivo, puede sospecharse la contaminación con C. m. subsp. sepedonicus y se debe efectuar una segunda prueba de selección. Si el resultado de la segunda prueba de selección es positivo, la sospecha se confirma (aparición sospechosa) y las pruebas deben proseguir de acuerdo con el método. En el caso de que el resultado de la segunda prueba de selección sea negativo, la muestra no se considerará contaminada con C. m. subsp. sepedonicus. Por tanto, los resultados positivos de una prueba IF a los que hace referencia el artículo 4, apartado 2, se definen mediante una lectura positiva en una prueba IF confirmada por una segunda prueba de selección (PCR/FISH). La presencia confirmada a la que se hace referencia en el artículo 5, apartado 1 de esta orden, requiere el aislamiento y la identificación de un cultivo puro de C. m. subsp. sepedonicus con confirmación de su patogenicidad. 1. PRESENTACIÓN EN DIAGRAMAS DE FLUJO. 1.1 Método de detección para el diagnóstico de la necrosis bacteriana en tubérculos y plantas de patata que presentan síntomas de necrosis bacteriana. Este protocolo de análisis está destinado a los tubérculos y plantas de patata que muestran síntomas típicos o sospechosos de necrosis bacteriana. Incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio de diagnóstico y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como C. m. subsp. Sepedonicus.

(1)El punto 2 recoge una descripción de los síntomas.

(2)Se consideran adecuadas las pruebas siguientes: – la prueba IF (punto 4), – la prueba PCR (punto 5), – la prueba FISH (punto 6).

(3)Aunque el aislamiento de patógeno a partir de material vegetal con síntomas típicos mediante dilución de placas es sencillo, el aislamiento puede fallar en estados avanzados de infección, las bacterias saprofitas que crecen en el tejido enfermo pueden enmascarar o inhibir el patógeno en el medio de aislamiento. Se recomienda, por tanto, utilizar medios selectivos y no selectivos, preferiblemente MTNA (punto 8) o la prueba de bioensayo (punto 7).

(4)El punto 8 recoge una descripción de la morfología típica de las colonias.

(5)Si los resultados de la prueba de aislamiento son negativos, pero los síntomas de la enfermedad son los típicos, deberá repetirse el aislamiento.

(6)La identificación fiable de un cultivo puro de C.m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se enumeran en el punto 9.

(7)En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad. 1.2 Método de detección e identificación de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de tubérculos de patata asintomáticos. Principio. Este protocolo de análisis se destina a la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata asintomáticos mediante al menos dos pruebas de selección basadas en distintos principios biológicos que, de ser positivas, deberán complementarse con el aislamiento del patógeno; en caso de aislamiento de colonias típicas, se procede a continuación a la identificación de un cultivo puro como C. m. subsp. sepedonicus. El hecho de obtener resultados positivos sólo en una de las pruebas no es suficiente para considerar la muestra sospechosa. Las pruebas de selección y aislamiento deben permitir límites de detección de 103 a 104 células por ml de precipitado resuspendido, incluidos como controles positivos en cada serie de pruebas.

(1)El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos, aunque el procedimiento puede adaptarse para muestras con menos tubérculos en el caso de que no se disponga de 200.

(2)Los métodos de extracción y concentración del patógeno se describen en el punto 3.1.

(3)En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biológicos diferentes proporcionen resultados positivos, habrá de procederse al aislamiento y la confirmación. Debe realizarse como mínimo una prueba de selección. Cuando el resultado de esta prueba sea negativo, la muestra se considerará negativa. En el caso de que el resultado de esta prueba sea positivo, será necesario realizar dos o más pruebas de selección basadas en principios biológicos diferentes con el fin de verificar el primer resultado positivo. Sí la segunda prueba o el resto de las pruebas proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa y no será necesario llevar a cabo más pruebas.

(4)Prueba de inmunofluorescencia (IF}. Para la prueba de selección IF debe utilizarse siempre un anticuerpo policional, los anticuerpos monoclonales adicionales pueden proporcionar una mayor especificidad (véase el punto 4).

(5)Prueba PCR. Deben utilizarse reactivos y protocolos PCR convenientemente validados (véase el punto 6).

(6)Prueba FISH. Deben utilizarse reactivos y protocolos convenientemente validados (véase el punto 5).

(7)Aislamiento selectivo. Con el medio MTNA o el medio NCP-88 y una dilución al 1/100 del precipitado resuspendido, es en muchos casos un método adecuado para el aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus. Entre 3 y 10dias después de la siembra selectiva pueden obtenerse colonias típicas. Posteriormente se puede purificar e identificar el patógeno. Para poder aprovechar plenamente el potencial de la prueba, es necesario preparar con cuidado las cuñas de la parte basal a fin de evitar que otras bacterias secundarias asociadas al tubérculo de la patata, que compitan con C. m. subsp. sepedonicus en el medio, puedan afectar al desarrollo del patógeno. Si la prueba de la siembra selectiva no resulta efectiva, se deberá proceder al aislamiento a partir de las plantas utilizadas para el bioensayo (véase el punto 8).

(8)La prueba de bioensayo se utiliza para el aislamiento de C. m. subsp. sepedonicus a partir de precipitado de extracto de patatas mediante el enriquecimiento selectivo de la bacteria en berenjenas (Solanum melongena). Exige que las condiciones de incubación sean óptimas, según se especifican en este método. Es muy probable que las bacterias inhibidoras de C. m. subsp. sepedonicus en los medios MTNA o NCP-88 no interfieran en esta prueba (véase el punto 7).

(9)En el punto 8 se describe la morfología típica de las colonias.

(10)Los cultivos o bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprofitas o a la inhibición provocada por las mismas. En el caso de que se obtengan resultados positivos en las pruebas de selección pero negativos en las de aislamiento, se deberán repetir las pruebas de aislamiento a partir del mismo precipitado o utilizando además tejido vascular de la parte basal de tubérculos cortados de la misma muestra y, si fuese necesario, con otras muestras.

(11)La identificación fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9.

(12)En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad. 1.3 Método de detección e identificación de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus en muestras de plantas de patata asintomáticas.

(1)Véase el punto 3.2 para obtener información sobre los tamaños recomendados de la muestra.

(2)Los métodos de extracción y concentración del patógeno se describen en el punto 3.2.

(3)En el caso de que al menos dos de las pruebas basadas en principios biológicos diferentes proporcionen resultados positivos, habrá de procederse al aislamiento y la confirmación. Debe realizarse como mínimo una prueba de selección. Cuando el resultado de la prueba sea negativo, la muestra se considerará negativa. En el caso de que el resultado de esta prueba sea positivo, será necesario realizar dos o más pruebas de selección basadas en principios biológicos diferentes con el fin de verificar el primer resultado positivo. Si la segunda prueba o el resto de las pruebas proporcionan resultados negativos, la muestra se considerará negativa y no será necesario llevar a cabo más pruebas.

(4)En el punto 8 se describe la prueba de aislamiento selectivo y la morfología típica de las colonias.

(5)En el punto 4 se describe la prueba IF.

(6)En el punto 6 se describe la prueba PCR.

(7)En el punto 5 se describe la prueba FISH.

(8)En el punto 7 se describe la prueba de bioensayo.

(9)Los cultivos o bioensayos pueden fallar debido a la competencia de las bacterias saprofitas o a la inhibición provocada por las mismas. En el caso de que se obtengan resultados positivos en las pruebas de selección pero negativos en las de aislamiento, se deberán repetir las pruebas de aislamiento y, si fuese necesario, efectuar pruebas con otras muestras.

(10)La identificación fiable de cultivos puros supuestamente de C. m. subsp. sepedonicus se consigue utilizando las pruebas que se describen en el punto 9.

(11)En el punto 10 se describe la prueba de patogenicidad. 2. EXAMEN VISUAL PARA DETECTAR SÍNTOMAS DE NECROSIS BACTERIANA. 2.1 Plantas de patata. En las condiciones climáticas europeas, los síntomas se presentan rara vez en el campo y con frecuencia sólo al final de la temporada. Por otra parte, en numerosos casos, otras enfermedades, la senescencia o los daños mecánicos enmascaran los síntomas o se confunden con ellos. Por tanto, puede ser fácil pasar por alto los síntomas en las inspecciones de campo. Los síntomas de marchitamiento son muy distintos de los de la podredumbre parda; el marchitamiento es normalmente un proceso lento y se limita en principio a los bordes de las hojas. El crecimiento de las hojas jóvenes infectadas no suele detenerse, aunque sea más lento en las zonas infectadas. Esto hace que las hojas tengan formas extrañas. Las hojas afectadas por el bloqueo de los tejidos vasculares de la parte baja del tallo desarrollan con frecuencia zonas intenerviales cloróticas amarillas o anaranjadas. Los foliolos, hojas e incluso tallos infectados pueden llegar a morir. Con frecuencia las hojas y tubérculos muestran simplemente un tamaño reducido. En algunos casos las plantas se atrofian. Se pueden consultar fotografías en color de algunos de estos síntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main 2.2 Tubérculos de patata. Los primeros síntomas consisten en un ligero aspecto vítreo o traslúcido del tejido, sin ablandamiento, en torno al sistema vascular, en especial cerca de la parte basal. La corona vascular de la parte basal puede tener un color ligeramente más oscuro de lo normal. El primer síntoma claramente detectable consiste en que la corona vascular adquiere una coloración amarillenta y al comprimir suavemente el tubérculo emergen de los vasos unos exudados de aspecto lechoso. Dicho exudado contiene millones de bacterias. Se puede producir el oscurecimiento del tejido vascular y los síntomas que presentan los tubérculos en esta fase son similares a los de la podredumbre parda provocada por Ralstonia solanacearum. Al principio, estos síntomas pueden limitarse a una parte de la corona, no necesariamente cerca de la parte basal, y pueden extenderse posteriormente a la totalidad de la corona. A medida que la infección progresa, se produce destrucción de tejido vascular; la zona cortical externa puede separarse de la zona cortical interna. En las fases avanzadas de la infección, se producen grietas en la superficie del tubérculo, que suelen tener un color pardo rojizo en los bordes. Recientemente se han producido varios casos en Europa en los que la zona cortical central se ha podrido al mismo tiempo que la corona vascular provocando una invasión secundaria con oquedades y necrosis interna. Los síntomas pueden verse enmascarados por una invasión secundaria fúngica o bacteriana que puede hacer difícil, o incluso imposible, diferenciar los síntomas de necrosis bacteriana avanzada de otras necrosis de los tubérculos. Pueden presentarse síntomas atípicos. Se pueden consultar fotografías en color de algunos de estos síntomas en el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main 3 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA. 3.1 Tubérculos de patata. Nota: ‒ El tamaño normal de la muestra es de 200 tubérculos por ensayo. Para realizar un muestreo más intensivo es preciso llevar a cabo más pruebas con muestras de este tamaño. El hecho de disponer de un número mayor de tubérculos en la muestra puede provocar la inhibición o dificultar la interpretación de los resultados. No obstante, el procedimiento puede adaptarse convenientemente a muestras formadas por un número menor de tubérculos en el caso de que no se disponga de 200. ‒ La validación de todos los métodos de detección descritos más adelante se basa en los ensayos realizados con muestras de 200 tubérculos. ‒ El extracto de patata descrito a continuación puede emplearse también para la detección de la bacteria de la podredumbre parda de la patata, Ralstonia solanacearum. Pretratamiento opcional previo a la preparación de la muestra: Lavar los tubérculos. Utilizar desinfectantes (cuando se vaya a efectuar la prueba PCR, la desinfección con compuestos de cloro puede interferir en la extracción de ADN del patógeno) y detergentes adecuados para cada muestra. Secar los tubérculos al aire. Este procedimiento de lavado resulta particularmente útil (aunque no necesario) en el caso de muestras con exceso de tierra y cuando se vaya a efectuar una prueba PCR o un procedimiento de aislamiento directo. 3.1.1 Quitar la epidermis de la parte basal de cada tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que el tejido vascular quede a la vista. Extraer cuidadosamente una pequeña cuña de tejido vascular de la parte basal y el mínimo volumen posible de tejido no vascular (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) Nota: Retirar los tubérculos que presenten síntomas sospechosos de necrosis bacteriana y analizarlos separadamente. En el caso de que se observen síntomas sospechosos de necrosis bacteriana durante la extracción de la cuña de la parte basal, deberá realizarse una inspección visual del tubérculo una vez cortado a la altura de la parte basal. Todo tubérculo cortado que presente síntomas sospechosos deberá suberizarse a temperatura ambiente durante dos días y almacenarse en cuarentena (a una temperatura de entre 4 y 10 °C) hasta que concluyan todos los ensayos. Todas las muestras de tubérculos, incluidas las que presenten síntomas sospechosos, deberán conservarse de acuerdo con lo dispuesto en el anexo II. 3.1.2 Introducir las cuñas de la parte basal en recipientes desechables que no hayan sido utilizados previamente y que puedan cerrarse y/o sellarse (en el caso de que estos recipientes vayan a volver a utilizarse deberán limpiarse y desinfectarse concienzudamente con compuestos de cloro). Preferiblemente, las cuñas deben procesarse inmediatamente. Si esto no fuese posible, deberán almacenarse en el recipiente, sin tampón, y conservarse por un período máximo de 72 horas refrigeradas o de 24 horas a temperatura ambiente. El secado y la suberización de las cuñas, así como el crecimiento de saprofitos durante el almacenamiento, pueden dificultar la detección de la bacteria causante de la necrosis bacteriana. 3.1.3 Procesar las cuñas básales por uno de los métodos siguientes:

a)bien añadir la solución de tampón de extracción (apéndice 3) en cantidad suficiente para que cubra las cuñas (aproximadamente 40
ml)y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante 4 horas a una temperatura inferior a 24 °C o durante 16 a 24 horas si están refrigeradas;
b)o bien homogeneizar las cuñas con solución de tampón de extracción (apéndice 3) en cantidad suficiente (aproximadamente 40 ml), ya sea mediante una trituradora (por ejemplo, Waring o Ultra Thurax) o machacándolas en una bolsa de maceración desechable sellada (por ejemplo, bolsas resistentes Stomacher o Bioreba de polietileno de 150 mm × 250 mm, esterilizadas por radiación) utilizando un mazo de caucho o un aparato triturador adecuado (por ejemplo, Homex). Nota: El riesgo de contaminación cruzada de las muestras es alto cuando éstas se homogeneizan mediante una trituradora. Se debe actuar con precaución para evitar la generación de aerosoles o el vertido durante el proceso de extracción. Es preciso asegurarse de que se esterilizan las cuchillas de la trituradora y los recipientes que vayan a utilizarse para cada muestra. Si se va a realizar la prueba PCR, es preciso evitar que existan restos de ADN en los recipientes o el aparato triturador. Cuando se vaya a efectuar la prueba PCR se recomienda la trituración en bolsas desechables y la utilización de tubos desechables. 3.1.4 Decantar el sobrenadante. Si presenta un aspecto excesivamente turbio, clarificarlo centrifugándolo a baja velocidad (a 180 g como máximo, durante 10 minutos, a una temperatura entre 4 y 10 °C) o mediante filtración al vacío (40-100 μm), lavando el filtro con solución adicional (10
ml)de tampón de extracción (apéndice 3). 3.1.5 Concentrar la fracción bacteriana mediante centrifugación a 7.000 g durante 15 minutos (o a 10.000 g durante 10 minutos) a una temperatura entre 4 y 10 °C y descartar el sobrenadante sin perturbar el precipitado. 3.1.6 Resuspender el precipitado en un 1,5 ml de tampón de precipitado (apéndice 3). Utilizar 500 μl para la prueba de C. m. subsp. sepedonicus, 500 μl para Ralstonia solanacearum y 500 μl a efectos de referencia. Añadir glicerol estéril en una concentración final de 10-25 % (v/
v)a los 500 μl de la alícuota de referencia y a la alícuota restante de cada prueba, homogeneizar por agitación y guardar a una temperatura entre ‒16 y ‒24 °C (semanas) o entre ‒68 y ‒86 °C (meses). Mantener las alícuotas de la prueba a una temperatura comprendida entre 4 y 10 °C durante los ensayos. No es recomendable congelar y descongelar el extracto en repetidas ocasiones. Si fuese preciso transportar el extracto, es conveniente asegurarse de que la entrega se efectúa en una caja refrigerada en el plazo de 24 a 48 horas. 3.1.7 Es imprescindible que todos los controles y muestras positivas de C. m. subsp. sepedonicus se procesen por separado, a fin de evitar la contaminación. Esto se aplica a las preparaciones para IF y a todas las pruebas. 3.2 Plantas de patata. Nota: Para la detección de poblaciones latentes de C. m. subsp. sepedonicus se recomienda efectuar las pruebas con muestras mixtas. El procedimiento se puede adaptar convenientemente para muestras mixtas de hasta 200 partes de tallos (los estudios deberán basarse en una muestra representativa desde el punto de vista estadístico de la población vegetal que se someta a investigación). 3.2.1 Extraer una sección de 1 a 2 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo, utilizando un cuchillo o tijeras de podar limpios y desinfectados. Desinfectar ligeramente las secciones de tallo con etanol al 70 % y secar inmediatamente con un pañuelo de papel. Introducir las secciones de tallo en un recipiente estéril cerrado de acuerdo con los siguientes procedimientos de muestreo: 3.2.2 Procesar las secciones de tallo mediante uno de los métodos siguientes:
a)bien añadir la solución de tampón de extracción (apéndice 3) en cantidad suficiente para que cubra las secciones (aproximadamente 40
ml)y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante 4 horas a una temperatura inferior a 24 °C o durante 16 a 24 horas si están refrigeradas;
b)o bien procesar inmediatamente triturando las secciones en una bolsa de maceración resistente (p. ej. Stomacher o Bioreba) con una cantidad adecuada de tampón de extracción (apéndice 3) utilizando para ello un mazo de caucho o un aparato triturador adecuado (p. ej. Homex). Si esto no es posible, almacenar las secciones de tallo refrigeradas durante 72 horas como máximo o a temperatura ambiente durante 24 horas como máximo. 3.2.3 Decantar el sobrenadante tras haberlo dejado reposar durante 15 minutos. 3.2.4 Normalmente no es necesario clarificar más el extracto ni la concentración de la fracción bacteriana, pero esto se puede lograr mediante la filtración y/o la centrifugación, tal como se describe en los puntos 3.1.4 a 3.1.6. 3.2.5 Dividir el extracto puro o concentrado de la muestra en dos partes iguales. Mantener una de las partes a 4-10 °C durante los ensayos y almacenar la parte restante, tras haber añadido glicerol estéril al 10-25 % (v/v), a una temperatura comprendida entre ‒16 y ‒24 °C (semanas) o entre ‒68 y ‒86 °C (meses) en el caso de que sea necesario realizar nuevas pruebas. 4. PRUEBA IF. Principio: La utilización de la prueba IF como principal prueba de selección está recomendada por su solidez demostrada para alcanzar los límites exigidos. Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, deberán realizarse las pruebas PCR o FISH como segunda prueba de selección. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, será preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el análisis. Nota: Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección, deberá utilizarse siempre un anticuerpo policlonal. En el caso de resultados IF positivos con un anticuerpo policlonal, la selección posterior de la muestra con un anticuerpo monoclonal puede proporcionar una mayor especificidad pero ser menos sensible. Conviene utilizar anticuerpos frente a la cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus. Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución superior en la que se produce la reacción óptima cuando se realiza la prueba con una suspensión que contiene entre 105 y 106 células por ml de la cepa homologa de C. m. subsp. sepedonicus y se utiliza una dilución apropiada del conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), según las recomendaciones del fabricante. Los anticuerpos policlonales o monoclonales crudos deberían tener un título IF de al menos 1:2000. Durante las pruebas, los anticuerpos deberían utilizarse en diluciones de trabajo (DT) próximas o iguales al título. Utilizar anticuerpos validados. (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) La prueba debería realizarse con extractos de muestras que se acaben de preparar. Si fuese necesario, puede efectuarse también con extractos almacenados a una temperatura comprendida entre ‒68 y ‒86 °C en glicerol. El glicerol puede separarse de la muestra mediante la adición de 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 4), la recentrifugación durante 15 minutos a 7.000 g y la resuspensión en el mismo volumen de tampón de precipitado. Normalmente esto no es necesario, especialmente si las muestras se fijan al portaobjetos flameándolas (véase el punto 2.2). Preparar otros portaobjetos con controles positivos de la cepa homologa o de cualquier otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 2 y, opcionalmente, en tampón. De ser posible, deberán utilizarse tejidos infectados de forma natural (conservados mediante liofilización o congelación a temperaturas comprendidas entre ‒16 y ‒24 °C) como control similar, en el mismo portaobjetos. Como controles negativos, utilizar alícuotas de extractos de muestra que previamente hayan proporcionado resultados negativos en la prueba. Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con 10 pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras. 4.1 Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes:
i)Para precipitados con una cantidad relativamente pequeña de sedimento de almidón: Verter con una pipeta un volumen determinado (15 μl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) de una dilución al 1/100 del precipitado de patata resuspendido en el primer pocillo. Posteriormente, verter un volumen similar de precipitado sin diluir (1/1) en los demás pocillos de la fila. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.
ii)Para otros precipitados: Preparar diluciones decimales (1/10 y 1/100) del precipitado resuspendido en el tampón de precipitado. Verter con una pipeta un volumen determinado (15 μl es suficiente para pocillos de 6 mm de diámetro; aumentar el volumen si el diámetro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada dilución en una de las filas de pocillos. La otra fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2. 4.2 Dejar secar las gotitas a temperatura ambiente o calentándolas a una temperatura comprendida entre 40 y 45 °C. Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo (15 minutos a 60 °C), flameándolo, mediante etanol al 95 %, o de acuerdo con las instrucciones específicas de los proveedores de los anticuerpos. De ser necesario, los portaobjetos fijados pueden almacenarse congelados en una caja seca durante el mínimo tiempo posible (hasta un máximo de tres meses) antes de realizar nuevas pruebas. 4.3 Procedimiento IF:
i)si el portaobjetos se ha preparado según el inciso
i)del punto 4.1: Preparar un conjunto de diluciones a 1/2 del anticuerpo en el tampón IF. El primer pocillo deberá tener 1/2 del título (T/2) y el resto 1/4 del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y dos veces el título (2T),
ii)si el portaobjetos se ha preparado según el inciso
ii)del punto 4.1: Preparar la dilución de trabajo (DT) del anticuerpo en tampón IF. La dilución de trabajo afecta a la especificidad. Figura 1. Preparación del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1, inciso i), y el punto 4.3, inciso
i)Figura 2. Preparación del portaobjetos de acuerdo con el punto 4.1, inciso ii), y el punto 4.3, inciso
ii)4.3.1 Colocar los portaobjetos en papel humedecido. Cubrir completamente cada pocillo con la dilución o diluciones del anticuerpo. El volumen del anticuerpo aplicado en cada pocillo debe ser equivalente al menos al del extracto aplicado. A falta de instrucciones específicas de los proveedores de anticuerpos, deberá seguirse el procedimiento siguiente: 4.3.2 Tapar los portaobjetos y dejar incubar sobre papel humedecido durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). 4.3.3 Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tampón IF. Lavar por inmersión durante 5 minutos en tampón IF-Tween (apéndice 3) y repetir la operación durante 5 minutos en tampón IF. Deben evitarse los aerosoles o la transferencia de gotitas que puedan provocar la contaminación cruzada. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secándolos ligeramente. 4.3.4 Colocar los portaobjetos en papel humedecido. Cubrir los pocillos con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de anticuerpo aplicado. 4.3.5 Tapar los portaobjetos y dejar incubar sobre papel humedecido durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). 4.3.6 Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (punto 4.3.3). Retirar con cuidado el exceso de humedad. 4.3.7 Verter con una pipeta de 5 a 10 μl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (véase el apéndice 3) o una solución comercial similar que proteja la fluorescencia (anti-fading) en cada pocillo y tapar. 4.4 Lectura de la prueba IF: 4.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite o agua de inmersión y a 500-1.000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que no presenten células o sólo un pequeño número de ellas es preciso observar como mínimo 40 campos microscópicos. En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas al título de anticuerpos determinado o la dilución de trabajo. La prueba IF (punto 4) debe repetirse si la tinción no es correcta. 4.4.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo a la misma dilución del anticuerpo o mejor que ésta. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa. En el caso que se sospeche cualquier posible contaminación, deberá repetirse la prueba. Esto puede ocurrir cuando todos los portaobjetos de un lote presenten células positivas debido a la contaminación del tampón o cuando se encuentren células positivas (fuera de los pocillos) en la superficie del portaobjetos. 4.4.3 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cuñas básales y secciones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de C. m. subsp sepedonicus. 4.4.4 Sólo deben considerarse las células fluorescentes con tamaño y morfología típicos, al título o la dilución de trabajo de los anticuerpos, al igual que en el punto 4.3. 4.4.5 Interpretación de los resultados de la prueba IF:
i)si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, calcular el número medio de células típicas por campo microscópico y el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4). La prueba IF es positiva para las muestras que presenten al menos 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido. La muestra se considera potencialmente contaminada y es necesario realizar nuevas pruebas,
ii)la prueba IF es negativa para las muestras que presenten menos de 5 × 103 células por ml de precipitado resuspendido y la muestra se considera negativa. No es necesario realizar nuevas pruebas. 5. PRUEBA FISH. Principio: Cuando se utilice la prueba FISH como primera prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, deberá realizarse la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba FISH como segunda prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, será preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico. Nota: Utilizar oligosondas específicas para C. m. subsp. sepedonicus validadas (apéndice 7). Las pruebas preliminares realizadas con este método deberán permitir la detección reproducible de al menos 103-104 células de C. m. subsp. sepedonicus por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. El procedimiento siguiente debería llevarse a cabo, a ser posible, con extracto de muestra que se acabe de preparar, pero también puede realizarse con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre ‒16 y ‒24 °C o entre ‒68 y ‒86 °C. Como controles negativos, deben utilizarse alícuotas de extracto de muestra que previamente haya arrojado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus. Como controles positivos, deben prepararse suspensiones que contengan de 105 a 106 células por ml de C. m. subsp. sepedonicus (por ejemplo, la cepa NCPPB 4053, o PD 406) en tampón fosfato de concentración 0,01 M de un cultivo de 3 a 5 días (para la preparación véase el apéndice 2). Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homologa o de cualquier otra cepa de referencia de C. m. subsp. sepedonicus, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 2. El uso de una oligosonda eubacteriana marcada con FITC ofrece un control para el proceso de hibridación, ya que teñirá todas las eubacterias que estén presentes en la muestra. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras. 5.1 Fijación del extracto de patata. El protocolo siguiente se basa en Wullings et al.,

(1998): 5.1.1 Preparar la solución de fijación (véase el apéndice 7). 5.1.2 Verter 100 μl de cada extracto de muestra en un tubo eppendorf y centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g. 5.1.3 Quitar el sobrenadante y disolver el precipitado en 500 μl de solución fijadora preparada con menos de 24 horas de antelación. Agitar e incubar de un día para otro a 4 °C. El etanol al 96 % constituye una solución fijadora alternativa. Para utilizarlo, disolver el precipitado a partir del paso 5.1.2 en 50 μl de tampón fosfato de concentración 0,01 M y 50 μl de etanol al 96 %. Agitar la mezcla e incubar a 4 °C durante 30 a 60 minutos. 5.1.4 Centrifugar durante 8 minutos a 7 000 g, quitar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 μl de tampón fosfato de concentración 0,01 M (véase el apéndice 3). 5.1.5 Colocar 16 μl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos múltiple limpio, tal como muestra la figura 3. Aplicar 2 muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 μl para realizar una dilución al 1:100 (en tampón fosfato de concentración 0,01 M). La solución de la muestra restante (49 μl) puede almacenarse a ‒20 °C tras la adición de 1 volumen de etanol al 96 %. En el caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugación y añadir un volumen equivalente de tampón fosfato de concentración 0,01 M (mezclar mediante agitación). Figura 3 5.1.6 Secar los portaobjetos al aire (o con secador de portaobjetos a 37 °C) y fijarlos flameándolos. El procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pudiéndose proseguir con la hibridación al día siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente. 5.2 Prehibridación e hibridación. 5.2.1 Preparar una solución de lisozima que contenga 10 mg de lisozima (Sigma L-6876) en 10 ml de tampón (100 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8,0). Esta solución puede almacenarse pero sólo debe congelarse y descongelarse una vez. Cubrir todas las muestras bien con aproximadamente 50 μl de solución de lisozima e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sumergir los portaobjetos en agua desmineralizada una única vez y secar con papel de filtro. Alternativamente, en lugar de lisozima, añadir 50 μl de 40-400 μg ml-1 de proteinasa K en tampón (20 mM Tris-HCI, 2 mM CaCl2, pH 7,4) en cada pocillo e incubar a 37 °C durante 30 minutos. 5.2.2 Deshidratar las células en series de etanol escalonadas al 50 %, 80 % y 96 % durante 1 minuto cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos. 5.2.3 Preparar una cámara de incubación húmeda recubriendo el fondo de una caja hermética con un pañuelo de papel o papel de filtro empapado en 1x hybmix (apéndice 7). Preincubar la caja en el horno de hibridación a 55 °C durante 10 minutos como mínimo. 5.2.4 Preparar la solución de hibridación (apéndice 7) con 45 μl por portaobjeto, y preincubar durante 5 minutos a 55 °C. 5.2.5 Colocar los portaobjetos en una placa caliente a 45 °C y aplicar 10 μl de solución de hibridación en cada uno de los 4 pocillos del (o de los) portaobjetos. 5.2.6 Aplicar 2 cubreobjetos (24 × 24

mm)a cada portaobjeto evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda precalentada y dejar que se produzca la hibridación de un día para otro a 55 °C en la oscuridad. 5.2.7 Preparar 3 vasos de precipitado que contengan 1 I de agua ultrapura, 1 I de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml de agua ultrapura) y 1 I de 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix y 833 ml de agua ultrapura). Preincubarlos al baño maría a 55 °C. 5.2.8 Quitar los cubreobjetos de los portaobjetos y colocar los portaobjetos en un soporte. 5.2.9 Lavar el exceso de sonda mediante incubación durante 15 minutos en el vaso de precipitado con 1x hybmix a 55 °C. 5.2.10 Transferir el portaobjetos a una solución de lavado de hybmix al 1/2 e incubar durante otros 15 minutos. 5.2.11 Sumergir las preparaciones brevemente en agua ultrapura y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 μl de solución de montaje protectora de la fluorescencia (p. ej. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 × 60
mm)sobre la totalidad de los portaobjetos. 5.3 Lectura de la prueba FISH: 5.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1.000 aumentos con aceite de inmersión. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresceína (FITC) las células eubacterianas (incluidas la mayoría de las células gramnegativas) de la muestra aparecen teñidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las células de C. m. subsp. sepedonicus marcadas con Cy3 aparecen teñidas de rojo fluorescente. Comparar la morfología de las células con la de los controles positivos. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas. Debe repetirse la prueba FISH (punto 9.4) si la tinción es aberrante. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que no presenten células o sólo un pequeño número de ellas es preciso observar como mínimo 40 campos microscópicos. 5.3.2 Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de C. m. subsp. sepedonicus en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser mejor que la de la cepa de control positivo o equivalente a la misma. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa. 5.3.3 En el caso que se sospeche cualquier posible contaminación, deberá repetirse la prueba. Esto puede ocurrir cuando todos los portaobjetos de un lote presenten células positivas debido a la contaminación del tampón o cuando se encuentren células positivas (fuera de los pocillos) en la superficie del portaobjetos. 5.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cuñas básales y secciones de tallo de patata pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de C. m. subsp. sepedonicus, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF. 5.3.5 Deben tenerse en cuenta únicamente las células fluorescentes de tamaño y morfología típicos (véase el punto 5.3.2). 5.3.6 Interpretación de los resultados de la prueba FISH:
i)se obtendrán resultados válidos en la prueba FISH siempre que en todos los controles positivos y en ninguno de los controles negativos se observen células teñidas de verde fluorescente brillante, cuyo tamaño y morfología sean los típicos de las de C. m. subsp. sepedonicus, cuando se utilice el filtro FITC, y células teñidas de rojo fluorescente brillante cuando se utilice el filtro de rodamina. Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, calcular el número medio de células típicas por campo microscópico y el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4). Las muestras que presenten al menos 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se considerarán potencialmente contaminadas y será preciso realizar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se considerarán negativas,
ii)los resultados de la prueba FISH serán negativos cuando, utilizando el filtro de rodamina, no se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante con un tamaño y morfología típicos de C. m. subsp. sepedonicus, siempre que se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante típicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina. 6. PRUEBA PCR. Principio: Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, deberá realizarse la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba PCR como segunda prueba de selección y ésta proporcione resultados positivos, será preciso realizar las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico. La plena explotación de este método como principal método de selección sólo se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo. Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberán permitir la detección reproducible de 103 a 104 células de C. m. subsp. sepedonicus por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesario llevar a cabo experimentos de optimización para lograr niveles máximos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios. Deben utilizarse reactivos y protocolos PCR validados. Seleccionar preferiblemente un método con control interno. Tomar las precauciones necesarias para evitar la contaminación de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR deben llevarla a cabo técnicos experimentados en laboratorios especializados en biología molecular, con el fin de reducir al máximo la posibilidad de contaminación con el ADN buscado. Como prueba final del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (extracción de ADN y PCR) que dejen constancia de que no se ha producido arrastre de ADN. En la prueba PCR deben incluirse los siguientes controles negativos: ‒ extracto de la muestra que previamente haya proporcionado resultados negativos para C. m. subsp. sepedonicus, ‒ controles de tampón utilizados para extraer la bacteria y el ADN de la muestra, ‒ mezcla para la reacción PCR. Deben incluirse los siguientes controles positivos: ‒ alícuotas de los precipitados resuspendidos a los que se haya añadido C. m. subsp. sepedonicus (para la preparación, véase el apéndice 2), ‒ una suspensión de 106 células por ml de C. m. subsp. sepedonicus en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 2140 o NCPPB 4053), ‒ siempre que sea posible, utilizar también ADN extraído de las muestras de control positivas en la prueba PCR. Para evitar toda posible contaminación, preparar los controles positivos en un entorno distinto al de las muestras que se vayan a someter a prueba. Los extractos de muestras deben estar, en la medida de lo posible, libres de tierra. En determinados casos puede ser recomendable preparar las extracciones a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR. 6.1 Métodos de purificación del ADN. Utilizar muestras de control positivas y negativas, como se indica más arriba. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras. Para la purificación del ADN buscado a partir de sustratos de muestras complejas, existen diversos métodos que eliminan los inhibidores de PCR y otras reacciones enzimáticas y concentran el ADN buscado en el extracto de la muestra. El siguiente método ha sido optimizado para su utilización con el método PCR validado que figura en el apéndice 6. 6.1.
a)Método de Pastrik

(2000): 1. Verter con una pipeta 220 μl de tampón de lisis (100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) en un tubo eppendorf de 1,5 ml. 2. Añadir 100 μl de extracto de muestra y colocar en un calentador o al baño maría a 95 °C durante 10 minutos. 3. Colocar el tubo en hielo durante 5 minutos. 4. Añadir 80 μl de solución madre de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCI, pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos. 5. Añadir 220 μl de solución A Easy DNA® (Invitrogen), mezclar adecuadamente por agitación e incubar a 65 °C durante 30 minutos. 6. Añadir 100 μl de solución B Easy DNA® (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente viscosa. 7. Añadir 500 μl de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homogénea. 8. Centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 °C para separar las fases y formar la interfase. 9. Transferir la fase superior a un tubo eppendorf sin utilizar. 10. Añadir 1 ml de etanol al 100 % (‒20 °C), agitar brevemente e incubar en hielo durante 10 minutos. 11. Centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 °C y retirar el etanol del precipitado. 12. Añadir 500 μl de etanol al 80 % (‒20 °C) y mezclar invirtiendo el tubo. 13. Centrifugar a 15.000 g durante 10 minutos a 4 °C, guardar el precipitado y retirar el etanol. 14. Dejar que el precipitado se seque al aire o en un Speed Vac de ADN. 15. Resuspender el precipitado en 100 μl de agua ultrapura estéril y dejar a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos. 16. Almacenar a ‒20 °C hasta que se necesite para PCR. 17. Decantar todo precipitado blanco mediante centrifugación, y utilizar 5 μl del sobrenadante que contenga ADN para la prueba PCR. 6.1.

b)Otros métodos: Se pueden aplicar otros métodos de extracción de ADN (como p. ej. Qiagen DNeasy Plant Kit) siempre que hayan demostrado ser igual de eficaces para purificar el ADN de muestras de control que contengan de 103 a 104 células patógenas por ml. 6.2 PCR. 6.2.1 Preparar los ensayos controles de PCR de acuerdo con el protocolo validado (apéndice 6). Preparar una dilución decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura). 6.2.2 Preparar la mezcla de reacción PCR adecuada en un entorno libre de contaminación de acuerdo con el protocolo publicado (apéndice 6). El protocolo PCR validado es una reacción “multiplex” que también incorpora un protocolo PCR interno. 6.2.3 Añadir 5 μl de extracto de ADN por 25 μl de reacción PCR en tubos PCR estériles. 6.2.4 Incorporar una muestra de control negativa que contenga sólo mezcla de reacción PCR y añadir la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra. 6.2.5 Colocar los tubos en el mismo termociclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado (apéndice 6). 6.3 Análisis del producto de la PCR. 6.3.1 Confirmar los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Correr al menos 12 μl de mezcla de reacción de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 μl de tampón de carga (apéndice 6) en un gel de agarosa al 2,0 % (p/
v)en tampón tris-acetato-EDTA (TAE) (apéndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 bp ladder. 6.3.2 Revelar las bandas de ADN mediante la tinción con bromuro de etidio (0,5 mg por I) durante 30 a 45 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el manejo de este mutágeno. 6.3.3 En el caso de los productos PCR amplificados del tamaño esperado (apéndice 6), visualizar el gel teñido mediante transiluminación UV de onda corta (por ejemplo, = 302
nm)y anotar los resultados. 6.3.4 Para todos los resultados o casos nuevos, verificar la autenticidad del amplicón de PCR realizando un análisis con enzima de restricción en una muestra del ADN amplificado restante mediante la incubación a la temperatura óptima y durante el tiempo necesario con una enzima y tampón adecuados (véase el apéndice 6). Confirmar los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, siguiendo el método indicado anteriormente, y observar el patrón característico del fragmento de restricción con transiluminación UV una vez teñido con bromuro de etidio y comparar con el control positivo no digerido y digerido. Interpretación de los resultados de la prueba PCR. La prueba PCR es negativa si el amplicón PCR específico de la C. m. subsp. sepedonicus del tamaño esperado no se detecta en la muestra en cuestión pero sí en todas las muestras de los controles positivos (en el caso de PCR “multiplex” con cebadores de control interno específicos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuestión un segundo producto PCR del tamaño esperado). La prueba PCR es positiva si se detecta el amplicón PCR específico de la C. m. subsp. sepedonicus del tamaño y patrón de restricción (cuando sea necesario) esperados, siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de los controles negativos. La confirmación fiable de un resultado positivo puede obtenerse también repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores PCR (punto 9.3). Nota: Se puede sospechar la inhibición de la PCR si el amplicón esperado se obtiene de la muestra de control positiva que contiene C. m. subsp. sepedonicus en agua pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con C. m. subsp. sepedonicus en extracto de patata. En protocolos PCR “multiplex” con controles PCR internos, la inhibición de la reacción aparece indicada cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones. Se puede sospechar la existencia de contaminación si el amplicón esperado se obtiene a partir de uno o varios de los controles negativos. 7. PRUEBA DE BIOENSAYO. Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberán permitir la detección reproducible de 103 a 104 unidades de formación de colonias de C. m. subsp. sepedonicus por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos (para la preparación véase el apéndice 2). La máxima sensibilidad de detección se alcanzará cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las óptimas. No obstante, este método puede aplicarse también con éxito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre ‒68 y ‒86 °C. Algunas variedades de berenjena constituyen un medio de enriquecimiento selectivo excelente para la proliferación de C. m. subsp. sepedonicus, incluso en ausencia de síntomas, y facilitan también una prueba confirmatoria de huésped excelente. Las condiciones de cultivo deben ser óptimas para reducir el riesgo de obtener falsos resultados negativos en las pruebas. Para más detalles sobre el cultivo, véase el apéndice 8. 7.1 Distribuir la totalidad de la alícuota de prueba sobrante del precipitado resuspendido de los puntos 3.1.6 o 3.2.5 entre las berenjenas, siguiendo uno de los métodos que se exponen a continuación (7.3 o 7.4). Utilizar exclusivamente plantas que se encuentren en la fase foliar 2 - 3 y hasta la plena expansión de la tercera hoja verdadera. A fin de garantizar la utilización completa del precipitado resuspendido, así como la inoculación efectiva, se requerirán entre 15 y 25 berenjenas por muestra para los procedimientos que se esbozan a continuación. 7.2 Las berenjenas no deben regarse de uno a dos días antes de la inoculación para reducir la presión de turgencia. 7.3 Inoculación en estrías. 7.3.1 Sosteniendo la planta entre dos dedos aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 μl) del precipitado en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja. 7.3.2 Con un bisturí estéril practicar una incisión diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado. 7.3.3 Sellar el corte con vaselina estéril con una jeringa. 7.4 Inoculación con jeringa. Inocúlense los tallos de la berenjena justo por encima de los cotiledones utilizando una jeringa provista de aguja hipodérmica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las berenjenas. 7.5 Como controles positivos, inocular 5 plantas con una suspensión acuosa de 105 a 106 células por ml de un cultivo conocido de C. m. subsp. sepedonicus y, siempre que sea posible, con tejido de tubérculo infectado de forma natural (véase el punto 4) mediante el mismo método de inoculación (7.3 o 7.4). 7.6 Como control negativo, inocular 5 plantas con tampón de precipitado estéril mediante el mismo método de inoculación (7.3 o 7.4). 7.7 Incubar las plantas en instalaciones adecuadas para la cuarentena durante un máximo de 4 semanas a una temperatura de 18 a 24 °C. Incubar las plantas con suficiente luz y un elevado nivel de humedad (70 a 80 %) y agua, evitando que el agua se estanque y que las plantas se marchiten por falta de agua. Las células de C. m. subsp sepedonicus mueren a temperaturas superiores a 30 °C y la temperatura óptima es 21 °C. Para evitar la contaminación se deben incubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente separados en un invernadero o cámara de cultivo; en el caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separación entre tratamientos. En el caso de que plantas para distintas muestras deban incubarse juntas, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertilización, el riego, la inspección y cualquier otra manipulación deben extremarse las precauciones para evitar la contaminación cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las cámaras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra. 7.8 Transcurrida una semana, examinar con regularidad a fin de detectar los síntomas. Contar el número de plantas que muestren síntomas. C. m. subsp. sepedonicus provoca el marchitamiento de las hojas en las berenjenas, que puede iniciarse con flacidez internervial o de los bordes. El tejido marchito puede aparecer al principio de color verde oscuro o moteado, pero se vuelve más pálido antes de necrosarse. Las zonas de marchitamiento internerviales suelen tener un aspecto graso o húmedo como empapados en agua. El tejido necrosado presenta a veces un borde amarillo brillante. Las plantas no están necesariamente muertas; cuanto más tardan en aparecer los síntomas, tanto mayor es la posibilidad de supervivencia. Las plantas pueden superar la infección. Las berenjenas jóvenes son mucho más sensibles a las poblaciones bajas de C. m. subsp. sepedonicus que las plantas de más edad, por lo que es necesario utilizar plantas en el estadio foliar 3, o inmediatamente antes del mismo. El marchitamiento puede estar inducido también por poblaciones de otras bacterias u hongos presentes en el precipitado de tejido tuberoso. Entre estos se incluyen Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora y E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, así como grandes poblaciones de bacterias saprofitas. En particular, Erwinia chrysanthemi puede provocar síntomas y marchitamiento en las hojas muy parecidos a los de C. m. subsp sepedonicus. La única diferencia en el caso de las infecciones causadas por Erwinia chrysanthemi es el ennegrecimiento de los tallos. Dichos marchitamientos se pueden distinguir de los causados por C. m. subsp. sepedonicus, porque se marchitan rápidamente hojas o plantas enteras. También puede prepararse una tinción de Gram, esta prueba diferenciará a C. m. subsp. sepedonicus de Erwinia ssp. 7.9 Tan pronto como se observen síntomas en las berenjenas deberá procederse al reaislamiento, utilizando secciones de tejido foliar o del tallo de las plantas marchitas (véase el punto 3.1.3 para la maceración del tejido). Desinfectar la superficie de las hojas y tallos de berenjena frotándolos con etanol al 70 %. Realizar una prueba IF o PCR con la savia de la planta de berenjena y aislar en medios (selectivos) adecuados (véase el punto 8). También puede prepararse una tinción de Gram (apéndice 9). Identificar los cultivos purificados de presunta C. m. subsp. sepedonicus y confirmar la patogenicidad (véanse las secciones 9 y 10). 7.10 En determinadas circunstancias, en particular cuando las condiciones de cultivo no sean óptimas, puede ocurrir que C. m. subsp. sepedonicus esté presente de forma latente en las berenjenas, incluso después de períodos de incubación de hasta 4 semanas. En el caso de que, transcurridas 4 semanas, no se observen síntomas, realizar una prueba IF/PCR con una muestra mixta de secciones de tallo de 1 cm de cada planta tomadas por encima de la sección de inoculación. Si los resultados de la prueba son positivos, deberá procederse al reaislamiento en medios (selectivos) adecuados de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto 8. Identificar los cultivos purificados de posible C. m. subsp. sepedonicus y confirmar la patogenicidad (secciones 9 y 10). Interpretación de los resultados de la prueba del bioensayo. Se obtendrán resultados válidos en la prueba del bioensayo cuando las plantas de control positivo muestren síntomas típicos, se puedan reaislar las bacterias de dichas plantas y no se detecten síntomas en los controles negativos. Los resultados de la prueba del bioensayo serán negativos si las plantas sometidas a la prueba no están infectadas por C. m. subsp. sepedonicus y siempre que se detecte la C. m. subsp. sepedonicus en los controles positivos. Los resultados de la prueba del bioensayo serán positivos cuando las plantas sometidas a la prueba estén infectadas por C. m. subsp. sepedonicus. 8. AISLAMIENTO DE C. m. subsp. sepedonicus. Nota: El diagnóstico sólo estará completo cuando se haya aislado e identificado (véase el punto 9) C. m. subsp. sepedonicus, y posteriormente confirmado mediante una prueba de patogenicidad (punto 10). Aunque C. m. subsp sepedonicus es un organismo delicado, puede aislarse a partir de tejido sintomático. No obstante, puede verse inhibida por las bacterias saprofitas que proliferan rápidamente y, por tanto, los aislamientos directos a partir del precipitado de tejido tuberoso o del tallo (punto 3.1.6 o 3.2.5) son difíciles. El aislamiento directo de C. m. subsp. sepedonicus se puede realizar con un medio selectivo y la dilución adecuada del precipitado resuspendido de las cuñas básales o tallos de patatas. Los aislamientos se realizarán con todos los tubérculos o secciones de tallo de patata sintomáticos y con las berenjenas en las no se observen síntomas pero con las que la prueba IF/PCR realizada a partir de la muestra mixta haya arrojado resultados positivos (véase el punto 7.10). Cuando sea necesario, la maceración de los tallos de berenjena deberá realizarse siguiendo el procedimiento descrito en el punto 3.1.3. Como controles positivos preparar diluciones decimales a partir de una suspensión de 106 cfu por ml de C. m. subsp. sepedonicus (p. ej. NCPPB 4053 o PD 406). Para evitar cualquier posibilidad de contaminación, preparar los controles positivos separadamente de las muestras que se vayan a someter a prueba. Cada lote de medio selectivo que se prepare deberá someterse a prueba a fin de determinar su idoneidad para el cultivo del patógeno con anterioridad a su utilización en pruebas con muestras rutinarias. Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras. 8.1 Siembra en medio selectivo. 8.1.1 A partir de una alícuota de 100 μl de una muestra de precipitado de patata resuspendido o de savia de berenjena, realizar diluciones decimales en tampón de precipitado (apéndice 3). 8.1.2 El aislamiento a partir de precipitado de patata sin diluir no suele funcionar debido a la lentitud de crecimiento de C. m. subsp sepedonicus y a la competencia de saprofitas. Dado que en los tejidos infectados suele haber poblaciones elevadas de la bacteria, las saprofitas se diluyen normalmente, mientras que el patógeno persiste. Se recomienda, por tanto, recurrir a la técnica de la extensión en placa y extender, con ayuda de un asa de extensión (“palos de hockey”), 100 μl de cada una de las muestras, en diluciones de 1/100 hasta 1/10 000, en medio MTNA o NCP-88 (apéndice 5) (si se utilizan placas de Petri de 90 mm de diámetro, se deberá ajustar el volumen para tamaños alternativos de placa). Nota: Otra estrategia alternativa consiste en extender la alícuota inicial de 100 μl de precipitado de patata en una primera placa de agar con ayuda de un aplicador y posteriormente extender, en estrías, todos los residuos que queden en el aplicador en una segunda placa de agar. Repetir por último con una tercera placa, logrando así, mediante el aplicador, el efecto de dilución en las placas. 8.1.3 Incubar las placas en la oscuridad a una temperatura de 21 a 23 °C. 8.1.4 Las observaciones iniciales de las placas, incluidos los recuentos de colonias típicas de la C. m. subsp. sepedonicus en relación con las placas de control, se realizan 3 días después, con recuentos posteriores transcurridos 5, 7 y, finalmente, 10 días. 8.2 Purificación de las colonias sospechosas. Nota: El subcultivo de colonias de aspecto similar a C. m. subsp. sepedonicus debe realizarse en medios YMG para la inoculación de berenjenas y/o la posterior identificación. Esto debe realizarse antes de que las placas crezcan demasiado, es decir, preferiblemente transcurridos de 3 a 5 días. 8.2.1 Practicar una siembra en estrías de colonias de aspecto similar a la C. m. subsp. sepedonicus en la superficie de uno de los siguientes medios (apéndice 5): agar de dextrosa nutritivo (NAD) (para su utilización exclusiva en el subcultivo), agar de levadura, peptona, glucosa (YPGA), agar de extracto de levadura, sales minerales (YGM). Incubar a 21-24 °C durante 10 días como máximo. C. m. subsp. sepedonicus crece lentamente y suele provocar unas colonias punteadas, de color crema, de forma abovedada, en el plazo de diez días. [Fotos de colonias típicas de C. m. subsp. sepedonicus (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)]. 8.2.2 Volver a sembrar en estrías para obtener cultivos puros. El ritmo de crecimiento mejora con subcultivos. Las colonias típicas son de color blanco crema o marfil, amarillas en ocasiones, redondeadas, lisas, abultadas, abovedadas en forma convexa, mucoso-fluidas, con bordes intactos y normalmente de un diámetro de 1 a 3 mm. Una simple tinción de Gram (apéndice 9) puede resultar útil para seleccionar colonias para pruebas posteriores. 8.2.3 Identificar los supuestos cultivos (véase el punto 9) y realizar una prueba de patogenicidad (véase el punto 10). 9. IDENTIFICACIÓN. Identificar cultivos puros de posibles aislados de C. m. subsp. Sepedonicus, utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biológicos diferentes. Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada, como controles positivos. 9.1 Pruebas de identificación nutricional y enzimática. Determinar las propiedades fenotípicas siguientes que estén universalmente presentes o ausentes en la C. m. subsp. sepedonicus, de acuerdo con los métodos de Lelliott y Stead

(1987), Klement et al.

(1990), Schaad

(2001), Anónimo

(1987). Incubar todos los medios a 21 °C y examinar transcurridos 6 días. Si no se ha producido crecimiento, incubar 20 días. En todas las pruebas deberá incluirse un control conocido de C. m. subsp. sepedonicus. Las pruebas fisiológicas y nutricionales deberán realizarse utilizando inoculaciones de subcultivos en agar nutritivo. Las comparaciones morfológicas deberán realizarse a partir de cultivos de agar de dextrosa nutritivos. Pruebas Resultado esperado Prueba de la oxidación/fermentac. (O/F) Inerte o ligeramente oxidante Actividad oxidasa ‒ Crecimiento a 37 °C ‒ Actividad ureasa ‒ Hidrólisis de la esculina + Hidrólisis del almidón ‒ o débil Tolerancia de NaCI al 7 % ‒ Producción de indol ‒ Actividad catalasa + Producción de H2S ‒ Utilización de citrato ‒ Licuefacción de la gelatina ‒ Producción de ácido de glicerol ‒ Producción de ácido de lactosa ‒ o débil Producción de ácido de ramnosa ‒ Producción de ácido de salicina ‒ Tinción de Gram (apéndice 9) + 9.2 Prueba IF.

a)Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en tampón IF (apéndice 3).
b)Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado.
c)Aplicar el procedimiento IF (punto 4).
d)La prueba IF será positiva si el título IF del cultivo es equivalente al del control positivo. 9.3 Prueba PCR.
a)Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua ultrapura.
b)Calentar 100 μl de la suspensión celular en tubos cerrados en un calentador o al baño maría a 100 °C durante 4 minutos. Si fuese necesario, la adición de NaOH recién preparado a una concentración final de 0,05 M puede ayudar a la lisis celular. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de ‒16 a ‒24 °C hasta que sea necesario.
c)Aplicar los procedimientos PCR adecuados para amplificar los amplicones específicos de C. m. subsp. sepedonicus (por ejemplo, Pastrik, 2000; véase el apéndice 4; Li y de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik y Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).
d)Se logrará la identificación positiva de C. m. subsp. sepedonicus si los amplicones de PCR son del mismo tamaño y presentan polimorfismos del fragmento de restricción con la misma longitud que los de la cepa de control positivo. 9.4 Prueba FISH.
a)Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua ultrapura.
b)Aplicar el procedimiento FISH (punto 5).
c)La prueba FISH será positiva si se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo. 9.5 Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profiling o FAP).
a)Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoid) durante 72 horas a 21 °C (+/‒1o).
b)Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991; Stead, 1992).
c)La prueba FAP será positiva si el perfil del supuesto cultivo es idéntico al del control positivo. Los ácidos grasos cuya presencia es característica son 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 y 17:0. El Anteiso es altamente indicativo de C. m. subsp sepedonicus. Otros géneros tales como Curtobacterium, Arthrobacter y Micrococcus cuentan también con algunos de estos ácidos. No obstante, el 15:1 Anteiso A es un ácido raro en estas bacterias que, sin embargo, está presente en todas las spp. Clavibacter en una prop

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