LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 45-2003 PATVIRTINIMO 2004 m. balandžio 19 d. Nr. D1-193 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin.,2000, Nr. 36-987) 6 straipsniu, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų aplinkai, savybių tyrimo tvarka, patvirtinta aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 (Žin., 2001, Nr. 3-60), 1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“ papildymą, LAND 45-2003 (pridedama). 2. Nustatau, kad aplinkos apsaugos normatyvinis dokumentas LAND 45-2003: 2.1. įsigalioja nuo 2004 m. gegužės 1 d.; 2.2. yra privalomas juridiniams ir fiziniams asmenims, nustatyta tvarka atliekantiems cheminių medžiagų ir preparatų tyrimus. APLINKOS MINISTRAS                                                                          ARŪNAS KUNDROTAS PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2004 m. balandžio 19 d. įsakymu Nr. D1-193 CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI LAND45-2003 (LAND 45 – 2001 papildymas) BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS: BANDYMAS SU ŽUVIMIS, ESANT PRATEKĖJIMO SĄLYGOMS (C 13 ) 1 METODAS Šis biologinio koncentravimo metodas yra OECD TG 305 (1996) kopija. 1.1 ĮVADAS Šis metodas aprašo pratekėjimo sąlygomis vykstančio medžiagų biologinio koncentravimo gebos žuvyse apibūdinimo procedūrą. Nors tyrimams, atliekamiems pratekėjimo režimu, pabrėžtinai teikiama pirmenybė, leidžiama naudoti ir pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka patikimumo kriterijus. Metodas pateikia pakankamai išsamių bandymą atlikti reikalingų detalių, palikdamas atitinkamą laisvę eksperimento schemą pritaikyti konkrečių laboratorijų esamoms sąlygoms ir skirtingoms bandomųjų medžiagų savybėms. Jis tinkamiausias patvarioms organinėms medžiagoms, kurių log Pow vertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (1), tačiau gali būti taikomas ir ypač lipofilinėms medžiagoms (kurių log Pow > 6,0). Tokių ypač lipofilinių medžiagų biokoncentravimo faktoriaus (BKF), kartais žymimo KB, išankstinis įvertis greičiausiai būtų didesnis, nei nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktoriaus (BKFnb) vertė, kurios reikėtų laukti iš laboratorinių bandymų. Medžiagų, kurių log Pow vertės yra iki 9,0, išankstiniai biokoncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti, naudojant Bintein ir kt. lygtį (2). Parametrams, kurie apibūdina biokoncentravimo gebą, priklauso sugerties greičio konstanta (k1), apsivalymo greičio konstanta (k2) ir BKFmb. Radioaktyvias žymenas turinčios bandomosios medžiagos gali palengvinti vandens ir žuvų bandinių analizę ir gali būti naudojamos, siekiant nustatyti, ar reikia atlikti irimo produktų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., deginant arba soliubilizuojant audinius), BKF turi būti pagrįstas duomenimis apie pradinio junginio, visų sulaikytų metabolitų, taip pat įsisavintos anglies kiekiu. Taigi BKF vertės, pagrįstos bendruoju radioaktyviųjų likučių kiekiu, negali būti tiesiogiai lyginamos su BKF vertėmis, gautomis atliekant tik pradinio junginio selektyviąją analizę. Norint nustatyti BKF, pagrįstą tik pradinio junginio kiekiu, tyrimuose su radioaktyviomis žymenomis gali būti naudojami gryninimo būdai, ir gali būti apibūdinti pagrindiniai medžiagų apykaitos produktai, jei laikoma, kad tai yra būtina. Analizuojant ir identifikuojant likučius audiniuose, galima sujungti medžiagų apykaitos tyrimus žuvyse su biokoncentravimo tyrimais. 1.2 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Biokoncentravimas ir bioakumuliacija – bandomosios medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (tam tikruose audiniuose) arba organizmo paviršiuje, lyginant su bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje. Biokoncentravimo faktorius (BKF arba Kb) – bandomosios medžiagos koncentracijos žuvies viduje ir paviršiuje arba jos apibrėžtuose audiniuose (Cf, μg/g (ppm)) ir cheminės medžiagos koncentracijos supančioje terpėje (Cw, μg/ml (ppm)) santykis per bet kurį šio koncentravimo bandymo sugerties etapą. Nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktorius (BKFmb arba Kb) ilgesnį laiko tarpą daug nekinta, jei bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje nekinta. Horizontalioji dalis arba nuostovioji būsena pasiekiama tuomet, kai bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje (Cf) priklausomybės nuo laiko kreivė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys Cf vertės, gautos analizuojant mažiausiai kas dvi paras paeiliui paimtus bandinius, viena nuo kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir nėra didelių skirtumų tarp trijų bandinių ėmimo periodų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, reikia ne mažiau kaip keturių paeiliui atliktų analizių. Lėtai sugeriamoms bandomosioms medžiagoms tinkamesni būtų septynių parų tarpai. Kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKFk) – biologinio koncentravimo faktorius, apskaičiuotas tiesiog iš kinetinių greičio konstantų (k1 ir k2). Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Pow) – cheminės medžiagos tirpumo n-oktanolyje ir vandenyje santykis, esant pusiausvirai (A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais), taip pat išreiškiamas kaip K“w. Cheminės medžiagos biokoncentravimo vandens organizmuose gebos rodikliu taikomas Pow logaritmas. Poveikio arba sugerties etapas – laiko tarpas, per kurį žuvis yra veikiama bandoma chemine medžiaga. Sugerties greičio konstanta (k1) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis veikiama chemine medžiaga (k1 išreiškiama (para)-1). Etapas po veikimo, arba apsivalymo (išnykimo) etapas – laikas, kai bandymo žuvis perkelta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra, ir per kurį tiriamas bandomosios medžiagos išsivalymas (arba tiesiog išnykimas) iš bandymo žuvies arba tam tikrų jos audinių. Apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (k2) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandomosios medžiagos koncentracijos bandymo žuvyje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) mažėjimo greitį po to, kai bandymo žuvis buvo pernešta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra (k2 išreiškiama (para)-1). 1.3 BANDYMŲ METODO ESMĖ Bandymą sudaro du etapai: poveikio (sugerties) etapas ir etapas po poveikio (apsivalymo). Per sugerties etapą vienos rūšies žuvų grupės veikiamos mažiausiai bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Išsivalyti jos pernešamos į terpę be bandomosios medžiagos. Išsivalymo etapas yra būtinas, išskyrus tuos atvejus, kai medžiagos sugertis (pereiga) buvo nedidelė (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandomosios medžiagos koncentracija žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) nustatoma per abu bandymo etapus. Kontrolinė žuvų grupė laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir bandomųjų koncentracijų, bet be bandomosios medžiagos, kad biokoncentravimo bandyme galimas neigiamas pasekmes būtų galima palyginti su kontroline grupe ir gauti bandomosios medžiagos foninių koncentracijų. Sugerties etapas tęsiamas 28 paras, jei neįrodoma, kad pusiausvyra yra pasiekta anksčiau. Sugerties etapo trukmės ir laiko, kai bus pasiekta nuostovioji būsena, laiko prognozė gali būti padaryta pagal 3 priedo lygtį. Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandomosios medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei įmanoma, biologinio koncentravimo fektorių apskaičiuoti ir kaip santykį koncentracijos žuvyje (Cf) su koncentracija vandenyje (Cw) tariamosios nuostoviosios būsenos sąlygomis (BKFmb), ir kaip kinetinį biologinio koncentravimo fektorių (BKFk), išreiškiamą sugerties (k1) ir taikomi sudėtingesni modeliai (5 priedas). Jei nuostovioji būsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties etapas turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas anksčiau; tuomet pradedamas apsivalymo etapas. Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius, ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojamos pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandymo medžiagos koncentracijas. BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios drėgnos masės funkcija. Specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami atitinkami audiniai arba organai (pvz., raumuo, kepenys), arba žuvis gali būti padalinta į valgomą (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Yra aiški daugelio organinių medžiagų biologinio koncentravimo gebos ir lipofiliškumo priklausomybė, atitinkama priklausomybė yra ir tarp riebalų kiekio bandymų žuvyse ir stebimo tokių medžiagų biologinio koncentravimo. Tokiu būdu, norint sumažinti šį bandymo rezultatų kintamumo šaltinį, lipofilinių (t.y. kurių log Pow > 3) medžiagų biologinis koncentravimas turi būti apskaičiuojamas ne tik viso kūno masei, bet ir riebalų kiekiui. Kai tai įmanoma atlikti, riebalų kiekis turi būti nustatomas toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga. 1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandymą, apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma tokia informacija: a) tirpumas vandenyje; b) pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas Pow (taip pat išreikštas kaip Kow nustatomas HPLC metodu – A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais); c) hidrolizė; d) fotocheminiai virsmai vandenyje, nustatyti saulės arba dirbtinės spinduliuotės sąlygomis ir biologinio koncentravimo bandyme naudotos spinduliuotės sąlygomis (3); e) paviršiaus įtemptis (t. y. medžiagoms, kurioms log Pow negali būti nustatytas); f) garų slėgis; g) biologinio skaidomumo lengvumas (jei reikia). Kita reikalinga informacija yra toksiškumas bandyme naudojamoms žuvų rūšims, geriausiai – asimptotiška (t.y. nuo laiko nepriklausanti) LC50 vertė. Reikia turėti tinkamą žinomo tikslumo ir jautrumo analizinį metodą bandomajai medžiagai bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, kartu su bandinių ruošimo ir laikymo detalėmis. Tai pat turi būti žinoma bandymo medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audiniuose riba. Kai naudojama 14C žymėta bandymo medžiaga, turi būti žinoma radioaktyvumo dėl priemaišų buvimo procentinė dalis. 1.5 BANDYMŲ PAGRĮSTUMAS (patikimumas) Bandymai laikomi pagrįstais, jeigu laikomasi šių sąlygų: - temperatūros svyravimas ne didesnis kaip ± 2 °C; - ištirpusio deguonies koncentracija ne mažiau 60 % oro soties verties; - per sugerties etapą bandymo medžiagos koncentracija bandymo induose palaikoma vidutinių išmatuotų verčių ribose, su ne didesniu kaip ± 20 % nuokrypiu; - bandymo pabaigoje tiek kontrolinių, tiek ir veikiamų žuvų mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai arba liga yra mažesni kaip 10 %; jei bandymas vyksta kelias savaites arba mėnesius, mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuvų grupėse turi būti mažesnis kaip 5 %, o bendras mirtingumas ne didesnis kaip 30 %. 1.6 ETALONINĖS MEDŽIAGOS Tikrinant tyrimo metodiką, galima naudoti etalonines medžiagas su žinoma biokoncentravimo geba. Etaloninės medžiagos iki šiol nėra apibrėžtos. 1.7 BANDYMŲ METODO APRAŠAS 1.7.1 Aparatūra Reikia žiūrėti, kad visų įrangos dalių gamybai nebūtų naudojamos medžiagos, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Gali būti naudojami stačiakampio arba ritinio formos standartiniai indai, kurie būtų pagaminti iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį. Minkštų plastikinių vamzdžių turi būti naudojama kuo mažiau. Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono (R), nerūdijančio plieno arba stiklo. Patirtis parodė, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali būti reikalingas silanizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo turėtų būti išmesta. 1.7.2 Vanduo Bandymuose dažniausiai naudojamas gamtinis vanduo, jis turi būti imamas iš neužterštos ir vienodos kokybės gavimo vietos. Skiedimo vandens kokybė turi būti tokia, kad pasirinktų rūšių žuvys išgyventų per aklimatizavimo ir bandymo laiką ir jų išvaizdoje arba elgesyje neatsirastų ko nors neįprasto. Geriausiu atveju reikėtų parodyti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratoriniame veisimo bandyme arba gyvenimo ciklo toksikologiniame bandyme). Apibūdinant vandenį, turi būti nurodyta pH vertė, kietumas, bendrasis kietųjų dalelių kiekis, bendroji organinė anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitritų jonų kiekį bei šarmingumą, o jūrinėms žuvų rūšims – druskingumą. Parametrai, kurie atitiktų optimalias žuvų gyvavimo sąlygas, yra žinomi, tačiau 1 priede pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamų gėlo ir jūros vandens komponentų didžiausios koncentracijos. Vandens kokybė visą bandymo laiką turi būti pastovi. Vandens pH turi būti nuo 6,0 iki 8,5, tačiau konkrečiame bandyme pH reikšmė turi būti ± 0,5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudarydamas kompleksus su bandomąja medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, per tam tikrus laiko tarpus turi būti imami bandiniai analizei. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb. Zn, Hg. Cd. Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Ci SO4), pesticidų (pvz., bendrojo fosforoorganinių ir chlororganinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o tarpai tarp jų didesni (pvz., kas šešis mėnesius). Natūralus kietųjų dalelių kiekis, taip pat bendrosios organinės anglies (BOA) kiekis skiedimo vandenyje turi būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos absorbcijos organinėse medžiagose, nes gali sumažėti bandomosios medžiagos biologinis prieinamumas (4). Didžiausias leistinas kietųjų dalelių kiekis yra 5 mg/l (skaičiuojant pagal medžiagas, sulaikomas 0,45 μm filtru), o bendrosios organinės anglies – 2 mg/l (žr. 1 priedą). Prireikus prieš naudojimą vanduo turi būti filtruojamas. Bandymų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių indėlis į bendrosios organinės anglies kiekį turi būti kiek įmanoma mažesnis. Organinės anglies koncentracija bandymo inde visą bandymo laiką neturi viršyti su bandomąja medžiaga patekusios organinės anglies koncentracijos ir, jei naudojama, soliubilizuojančioje medžiagoje, esančios organinės anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %). 1.7.3 Bandymų tirpalai Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandomosios medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojančias (solubilizuojančias) medžiagas nerekomenduojama; tačiau kai kuriais atvejais, norint pagaminti pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą, jų gali prireikti. Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etilenglikolio monometilo eteris (etandiolio monometilo eteris), etilenglikolio dimetilo eteris (etandiolio dimetilo eteris), dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Disperguojančios medžiagos, kurias galima naudoti, yra Cremophor RH40, Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-40. Naudojant biologiškai lengvai suardomas medžiagas, reikia žiūrėti, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo bandymų pratekančiame vandenyje. Bandomoji medžiaga gali turėti radioaktyvius žymenis ir turi būti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %). Bandymuose su pratekančiu vandeniu bandomosioms koncentracijoms bandymų induose užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojantis siurblys, proporcinis skiestuvas, prisotinimo sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens tūrio keitimus per dieną kiekvienoje bandymų talpoje. Geriau naudoti pratekėjimo režimą, tačiau, jei jis netinka (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), galima taikyti pusiau statinį metodą, jei jis atitinka pagrįstumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 valandas prieš bandymą ir vėliau visą bandymo laiką, bent kasdieną. Šį kartą tikrinant nustatomas pratekėjimo srautas ir užtikrinama, kad jis inde arba tarp indų nesikeistų daugiau kaip 20 %. 1.7.4 Žuvų rūšies parinkimas Pasirenkant žuvų rūšis, svarbu, ar lengva jas gauti, ar galima gauti tinkamų dydžių ir ar yra sąlygos jų priežiūrai laboratorijoje. Kiti žuvų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacinę, komercinę, ekologinę svarbą, taip pat palyginamąjį jautrumą, sėkmingą naudojimą praeityje ir t.t. Rekomenduotos bandomosios rūšys pateiktos 2 priede. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymo sąlygas. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pateikta rūšies pasirinkimo priežastis ir bandymų metodas. 1.7.5 Žuvų laikymas Žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje bandymo temperatūroje ir pakankamai šeriama tos pačios rūšies pašaru, kuris bus naudojamas atliekant bandymą. Po 48 valandų stabilizacijos periodo registruojamas mirtingumas ir taikomi tokie kriterijai: - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%, visa partija atmetama; - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras 5-10%, aklimatizuojama dar septynias papildomas paras; - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %, partija priimama, jei mirtingumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama. Reikia žiūrėti, kad bandymams naudojamos žuvys neturėtų pastebimų ligų ir apsigimimų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys dvi savaites prieš pradedant bandymą arba atliekant bandymą neturi būti gydomos. 1.8 Bandymo atlikimas 1.8.1 Išankstinis bandymas Gali praversti atlikti išankstinį bandymą, norint optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., bandymo medžiagos koncentraciją (-as), sugerties ir apsivalymo etapų trukmę. 1.8.2 Veikimo sąlygos 1.8.2.1 Sugerties etapo trukmė Sugerties etapo trukmės prognozavimas gali būti atliekamas remiantis praktiniu patyrimu (pvz., ankstesniu panašios cheminės medžiagos sugerties tyrimu) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandymo medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą (žr. 3 priedą). Sugerties etapas turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pusiausvyra pasiekta anksčiau. Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, sugerties etapas turi būti pratęstas, atliekant tolesnius matavimus, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba iki 60 parų, atsižvelgiant į tai, kas trumpiau. 1.8.2.2. Apsivalymo etapo trukmė Pusės sugerties etapo laiko dažniausiai pakanka, kad į organizmą patekusios medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (dėl šio įverčio paaiškinimo žr. 3 priedą). Jei laikas, reikalingas 95 % išnykimo vertei pasiekti, yra neįvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus ilgesnis už normalią sugerties etapo trukmę (t.y. daugiau kaip 56 paros), galima naudoti trumpesnį periodą (pvz., kol bandomosios medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau medžiagų, kurių sugerties ir apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už tą, kurį vaizduoja žuvų vienoje talpoje modelis, atitinkantis pirmojo laipsnio kinetiką, išnykimo greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo etapai. Tačiau šio periodo trukmę gali nusakyti laikas, kai bandymo medžiagos koncentracija žuvyje vis dar yra didesnė už analizinio aptikimo ribą. 1.8.2.3. Bandomųjų žuvų skaičius Bandomajai medžiagos koncentracijai nustatyti parenkamas toks žuvų skaičius, kad per kiekvieną bandinio ėmimą kiekvienam bandiniui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuvų reikės daugiau. Jei naudojamos suaugusios žuvys, reikia nurodyti, kurios vienos lyties ar abiejų lyčių žuvys buvo naudojamos bandyme. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, prieš veikimo pradžią turi būti dokumentuota, kad lyčių riebalų kiekio skirtumas yra nereikšmingas; gali būti būtina suleisti visas vyriškosios ir moteriškosios lyties žuvis į vieną grupę. Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turi būti to paties amžiaus ir iš to paties gavimo šaltinio. Kartais paaiškėja, kad žuvų masė ir amžius turi didelę įtaką BKF vertėms (1), todėl šios detalės turi būti tiksliai registruojamos. Norint įvertinti vidutinę masę, rekomenduojama iš turimų žuvų atsargų prieš bandymą pasverti po bandinį. 1.8.2.4. Įkrova Norint mažinti Cw sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo, naudojami dideli vandens ir žuvų kiekio santykiai. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandymų rūšį. Bet kuriuo atveju dažniausiai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1 – 1,0 g žuvies (šlapios masės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, jei įrodoma, kad reikiamą bandymo medžiagos koncentraciją įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos. Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastąsias gyvenimo aplinkos sąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims. 1.8.2.5. Šėrimas Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu pašaru, kurio yra žinomas riebalų ir baltymų bendrasis kiekis ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė. Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kiekvieną dieną, pašaro kiekis sudaro maždaug 1 – 2 % kūno masės per parą; taip per bandymą riebalų koncentracija daugumoje žuvų rūšių palaikoma santykinai pastovi. Norint palaikyti kūno masės ir riebalų kiekio atitikimą, pašaro kiekis turi būti perskaičiuojamas, pvz., kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masė kiekviename inde gali būti įvertinta pagal neseniai iš šio indo bandiniui paimtų žuvų masę. Nesveriamos žuvys, liekančios bandymų inde. Nesuėstas pašaras ir išmatos išsiurbiami iš indo kasdien netrukus po šėrimo (nuo 30 minučių iki vienos valandos). Indai visą bandymo laiką turi būti palaikomi kuo švaresni, kad būtų kuo mažesnė organinių medžiagų koncentracija, nes organinė anglis gali riboti bandomosios medžiagos biologinį prieinamumą (1). Kadangi daugelis pašarų gaminami iš žuvų miltų, pašaras turi būti analizuojamas, norint aptikti bandomosios medžiagos. Taip pat pageidautina pašaro pesticidų ir sunkiųjų metalų analizė. 1.8.2.6. Šviesa ir temperatūra Apšvietimo periodo trukmė dažniausiai būna 12-16 valandų, o temperatūra (± 2 °C) turi būti tinkama žuvų rūšims (žr. 2 priedą). Turi būti žinomas apšvietimo tipas ir jo ypatybės. Būtina imtis atsargumo priemonių dėl galimų bandomosios medžiagos fotocheminių virsmų tiriant, naudojant apšvietimą. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti filtrą, kuris nepraleistų trumpesnių nei 290 nm bangos ilgio UV spindulių. 1.8.2.7. Bandymuose naudojamos koncentracijos Žuvys pratekėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Dažniausiai didesnė (arba didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos ūmios asimptotinės LC50 ir būtų bent dešimt kartų didesnė už jos aptikimo ribą vandenyje naudojamu analizės metodu. Didžiausią bandymo medžiagos koncentraciją taip pat galima nustatyti, padalinant ūmios 96 h LC5o vertę iš atitinkamo ūmaus ir chroniško koncentracijų santykio (kai kurių cheminių medžiagų atitinkamas santykis gali kisti maždaug nuo 3 iki 100). Jei įmanoma, parenkama kitokia arba kitokios koncentracijos, kuri (arba kurios) būtų didesnė už nurodytąją 10 kartų. Jei tai neįmanoma dėl 1 % LC50 sąlygos ir analizinio nustatymo ribos, galima taikyti mažesnį nei 10 daugiklį arba turi būti atsižvelgta į galimybę naudoti 14C žymėtą bandomąją medžiagą. Neturi būti naudojama koncentracija, kuri būtų didesnė už bandomosios medžiagos tirpumą. Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1ml/l ir ji turi būti vienoda visuose bandymo induose. Turi būti žinoma, kokią bendrosios organinės anglies kiekio dalį bandymo vandenyje sudaro ši medžiaga ir bandomoji medžiaga kartu. Tačiau reikia stengtis, kad tokių medžiagų naudoti nereikėtų. 1.8.2.8. Kontroliniai bandymai Papildomai turi būti tikrinamas skiedimo vanduo arba, jei tinka, vanduo su soliubilizuojančia medžiaga, jei buvo nustatyta, kad soliubilizuojanti medžiaga neveikia žuvų. Jei taip nėra, turi būti atliekami abu tikrinimai. 1.8.3 Vandens kokybės matavimų dažnis Atliekant bandymą, visuose induose būtina matuoti ištirpusį deguonį, BOA, pH ir temperatūrą. Bendrasis kietumas ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatyti kontroliniuose bandymuose ir viename inde su didesne (arba didžiausia) koncentracija. Ištirpęs deguonis ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatomi mažiausiai tris kartus – sugerties etapo pradžioje, maždaug viduryje ir pabaigoje, o per apsivalymo etapą- kartą per savaitę. BOA turi būti nustatyta bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant sugerties etapą) prieš žuvis suleidžiant ir bent kartą per savaitę sugerties ir apsivalymo etapų metu. Temperatūra turi būti matuojama kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas – kartą, atliekant kiekvieną bandymą. Temperatūra bent viename inde turi būti stebima nuolat. 1.8.4 Bandinių ėmimas ir žuvų bei vandens analizė 1.8.4.1 Žuvų ir vandens bandinių ėmimo grafikas Vanduo iš bandymo indų nustatyti bandomosios medžiagos koncentraciją imamas prieš suleidžiant žuvis ir sugerties bei išsivalymo etapų metu. Minimalus vandens bandinių skaičius imamas tuomet, kai imami žuvų bandiniai ir prieš šeriant. Sugerties laiką bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma, norint kad būtų laikomasi pagrįstumo kriterijų. Žuvų bandiniai imami bent penkis kartus per sugerties etapą ir bent keturis kartus per išsivalymo etapą. Remiantis tokiu bandinių skaičiumi, kai kuriais atvejais būna sunku gauti pakankamai tikslų BKF vertės įvertį, ypač kai pasirodo, kad išsivalymo kinetika yra kitokia nei pirmojo laipsnio, galima būtų patarti bandinius imti dažniau (žr. 4 priedą). Papildomi bandiniai saugomi ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kad pirmosios eilės analizės duomenų nepakanka BKF apskaičiuoti norimu tikslumu. Tinkamo bandinių ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 priede. Naudojant kitas Pow numanomas vertes poveikio trukmei, per kurią būtų pasiekta 95% sugertis, apskaičiuoti, gali būti lengvai sudaryti kiti grafikai. Bandiniai imami per sugertį tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba 28 paras priklausomai nuo to, kas trumpiau. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandiniai imami tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas trumpiau. Prieš pradedant išsivalymo etapą, žuvys perkeliamos į švarius indus. 1.8.4.2. Bandinių ėmimas ir bandinio ruošimas Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant (sifonuojant) juos iš inertiškos medžiagos pagamintais vamzdžiais, įstatytais į bandymo indo vidurį. Atrodo, jog nei filtravimu, nei centrifugavimu neįmanoma atskirti biologiškai neįsisavinamos bandomosios medžiagos dalies nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypač labai lipofilinių cheminių medžiagų, t.y. tokių medžiagų, kurių log Pow > 5) (1) (5), todėl bandinių tokiais būdais apdoroti nereikia. Todėl reikia imtis priemonių, kad rezervuarai būtų kuo švaresni, o bendrosios organinės anglies kiekis per sugerties ir apsivalymo etapus turi būti nuolat kontroliuojamas. Kiekvieną kartą imant bandinį iš bandymo indų paimamas atitinkamas žuvų skaičius (dažniausiai ne mažiau kaip keturios žuvys). Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, „sausai“ nušluostomos, tuojau pat užmušamos pačiu tinkamiausiu būdu ir sveriamos. Vanduo ir žuvys turi būti analizuojami iš karto po bandinio ėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuojami apytikriai sugerties bei apsivalymo greičiai per bandymą. Iš karto atlikta analizė leidžia negaištant nustatyti, kada pasiekiama horizontalioji sugerties kreivės dalis. Jei iš karto analizė neatliekama, bandiniai turi būti laikomi tinkamai. Prieš pradedant tyrimą, gaunama informacija apie tinkamą konkrečios bandymo medžiagos laikymo metodą, pvz., šaldymą, laikymą, esant 4 °C temperatūrai, laikymo trukmę, ekstrahavimą ir 1.1. 1.8.4.3. Analizės metodo kokybė Kadangi visas bandymas iš esmės priklauso nuo bandomajai medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, tikslumo ir jautrumo, reikia eksperimentiškai patikrinti, ar konkretaus metodo cheminės analizės tikslumas ir atkuriamumas, taip pat bandomosios medžiagos išgavimas iš vandens ir žuvies yra patenkinami. Taip pat reikia patikrinti, ar bandomoji medžiaga neaptinkama naudojamame skiedimo vandenyje. Jei būtina, daromos Cw ir Cf gautų verčių pataisos, atsižvelgiant į išgavimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais visą laiką elgiamasi taip, kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., dėl bandinio ėmimo įtaiso sugerties) būtų kuo mažesni. 1.8.4.4. Žuvies bandinio analizė Jei bandyme naudojama radioaktyvius žymenis turinčių medžiagų, galima nustatyti bendrą jų kiekį (t.y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba bandiniai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat, pasiekus nuostoviąją būseną arba sugerties etapo pabaigą, priklausomai nuo to kas anksčiau, galima apibūdinti pagrindinius metabolitus. Jei BKF, apskaičiuotas pagal bendrąjį radioaktyvius žymenis turinčių likučių kiekį, yra didesnis ar lygus 100 %, būtų patartina, o radus kai kurių cheminių medžiagų rūšių, pvz., pesticidų, labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo likučių kiekio žuvies audiniuose nuostoviosios būsenos sąlygomis. Jei yra identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekio, taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje. Bandomosios medžiagos koncentracija dažniausiai turi būti nustatoma kiekvienoje pasvertoje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvieno ėmimo bandinius galima sudėti, tačiau bandinių sudėtis riboja statistinio apdorojimo metodikas, kurios galėtų būti taikomos duomenims apdoroti, galimybes. Jei yra svarbi specifinė statistinė procedūra ir jos reikšmingumas, tuomet bandyme turi būti naudojamas pakankamas žuvų skaičius, kuris atitiktų norimą jungimo procedūrą ir statistinį reikšmingumą (6) (7). BKF turi būti išreikštas kaip visos šlapios masės funkcija, o labai lipofiliškoms medžiagoms – kaip riebalų kiekio funkcija. Riebalų kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo atveju, jei tai įmanoma. Riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomi atitinkami metodai (3 priedo 8 ir 2 nuorodos). Geriausias metodas, jei gali būti rekomenduota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika (9). Įvairūs metodai neleidžia gauti vienodų verčių (10), todėl svarbu pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, riebalų analizė turi būti atliekama tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandomajai medžiagai analizuoti, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekstrakto prieš tai, kai jį galima analizuoti chromatografiškai. Riebalų kiekis žuvyje (mg/kg šlapios masės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskaičiuotą audinio sausų medžiagų kiekį, kad būtų galima apskaičiuoti sausų medžiagų riebalų koncentraciją. 2 REZULTATAI 2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS Bandomosios medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje žymint per sugerties bandymą gautos koncentracijos kaitą žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose audiniuose) per tam tikrą laiką. Jei kreivė pasiekė horizontaliąją dalį, t.y. pasidaro beveik asimptotiška laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BKFmb apskaičiuojamas taip: Kai nuostovioji būsena nepasiekiama, BKFmb bali būti įmanoma apskaičiuoti pagal 80 % (l,6/k2) arba 95% (3,0/k2) „nuostoviosios būsenos“ pusiausvyros, tai bus pakankamas tikslumas, reikalingas įvertinant pavojingumą. Taip pat nustatomas biokoncentravimo faktorius (BKFk) kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetinių konstantų k1/k2 santykis. Apsivalymo greičio konstanta (k2) dažniausiai nustatoma pagal apsivalymo kreivę (t.y., bandymo medžiagos žuvyje koncentracijos mažėjimo per tam tikrą laiką grafiką). Tuomet, turint k2 vertę ir Cf, kuri gaunama pagal sugerties kreivę, apskaičiuojama sugerties greičio konstanta (k1) (žr. 5 priedą). Tinkamiausias metodas BKFk ir greičio konstantoms k1 ir k2 apskaičiuoti yra netiesinių parametrų kompiuterinio vertinimo metodų taikymas (11). Kitaip k1 ir k2 apskaičiuoti gali būti naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, turi būti taikomi sudėtingesni modeliai (žr. 3 priedo nuorodas) ir prašoma biologo-statistiko patarimo. 2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos. Aiškiai apibrėžtos sugerties ir išsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Dviem koncentracijoms nustatytų sugerties ir apsivalymo konstantų kitimas turi būti mažesnis kaip 20 %. Dviem bandymų koncentracijoms stebėti dideli sugerties ir apsivalymo greičių skirtumai turi būti registruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai, atliekant gerai planuotus tyrimus, BKF verčių pasikliovimo riba artėja prie ± 20 %. 3 ATASKAITOS PATEIKIMAS Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija: 3.1 BANDOMOJI MEDŽIAGA - fizinė prigimtis ir, jei reikia, fizinės ir cheminės savybės, - cheminio identifikavimo duomenys (įskaitant organinės anglies kiekį jei reikia), - jei turi radioaktyvius žymenis, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis susijusio radioaktyvumo procentinė dalis. 3.2 BANDYMŲ RŪŠYS - mokslinis pavadinimas, rūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t.t. 3.3 BANDYMŲ SĄLYGOS - taikyta bandymų metodika (pvz., pratekėjimo arba pusiau stacionariomis sąlygomis), - naudoto apšvietimo tipas ir ypatybės bei apšvietimo periodas (-ai), - bandymų schema (pvz., bandymo indų (talpų) skaičius ir dydis, vandens tūrinės apykaitos greitis, lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius tuo pat metu atliktame bandyme, atliekant bandymus taikytų koncentracijų skaičius, sugerties ir išsivalymo etapų trukmė, žuvų ir vandens bandinių ėmimo dažnis), - pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų keitimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija ir indėlis į organinės anglies kiekį bandymo vandenyje), - vardinės bandymų koncentracijos, bandymų induose nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti, - skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, bandomųjų žuvų sugebėjimo gyventi vandenyje rodymo rezultatai ir vandens ypatybės: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei reikia) ir visi kiti daryti matavimai, - vandens kokybė bandymų talpose, pH, kietumas, BOA, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija, - išsami informacija apie šėrimą (pvz., pašaro tipas, šaltinis, sudėtis, jei įmanoma bent riebalų ir baltymų kiekis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnis), -informacija apie žuvų ir vandens bandinių apdorojimą, įskaitant ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandomosios medžiagos bei riebalų (jei nustatomi) analizės metodikas (ir tikslumą). 3.4 REZULTATAI - bet kokių atliktų išankstinių tyrimų rezultatai, - kontrolinių žuvų ir žuvų kiekviename bandymų inde mirtingumas bei bet koks jų neįprastas elgesys, - riebalų kiekis žuvyje (jei nustatoma), - kreivės (įskaitant visus gautų matavimų duomenis), rodančios bandomosios medžiagos žuvų sugertį ir jų apsivalymą, laikas iki nuostoviosios būsenos, - Cf ir Cw (ir jų standartinis nuokrypis bei intervalas, jei tinka) visiems bandinio ėmimo atvejams (Cf išreikšta μg/g viso kūno arba tam tikrų jo audinių, pvz., riebalų, šlapios masės (ppm), o Cw- μg/ml (ppm)). Cw vertės kontrolinėse serijose (taip pat turi būti nurodytas fonas), - nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFmb) ir (arba) kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKFk) ir, jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms (viskas apskaičiuota viso gyvūno kūno ir bendro riebalų kiekio, jei nustatytas, arba apibrėžtų jo audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis (kai yra) bei apskaičiavimų (duomenų analizės) metodai kiekvienai naudotos bandomosios medžiagos koncentracijai, - jei naudojamos radioaktyvius žymenis turinčios medžiagos, ir jei to reikalaujama, gali būti pateikti bet kokių aptiktų metabolitų kaupimosi rezultatai, - visa, kas bandyme buvo neįprasto, bet koks numatytų veiksmų nukrypimas ir bet kuri kita tinkama informacija. Reikia mažinti rezultatų, kurie būtų „nenustatyti aptikimo riboje“, kiekį, paruošiant parengiamąjį bandymą ir planuojant bandymus, kadangi tokie rezultatai negali būti panaudoti apskaičiuojant greičio konstantas. 4 NUORODOS (1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, 117 -156 p. (2) Birsein S, Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR ir QSAR in Environmental Research, 1, 29 – 390 p. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformatkm of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing ir Assessment of Chemicals. No 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailabilily of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document (or the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US PDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1,5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human arba animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aąuatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3. Part H. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. (9) Gardner et al. (199.5). Limn. & Oceanogr. 30, 1099 – 1105 p. (10) Randall R. C, Lee H., Ozretich R.J., Lake J. L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, 1431 – 1436 p. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method, Ring Test Programme. 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholni. (12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 1 priedas Skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės Medžiaga Didžiausia leistina koncentracija 1 Kietosios dalelės 5 mg/l 2 Bendroji organinė anglis 2 mg/l 3 Nejonizuotas amoniakas 1 μg/l 4 Liekamasis chloras 1 μg/l 5 Bendras fosforoorganinių pesticidų kiekis 50 ng/1 6 Bendras chlororganinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis 50 ng/l 7 Bendras organinis chloras 25 ng/l 8 Aliuminis 1 μg/l 9 Arsenas 1 μg/l 10 Chromas 1 μg/l 11 Kobaltas 1 μg/l 12 Varis 1 μg/l 13 Geležis 1 μg/l 14 Švinas 1 μg/l 15 Nikelis 1 μg/l 16 Cinkas 1 μg/l 17 Kadmis 100 ng/l 18 Gyvsidabris 100 ng/l 19 Sidabras 100 ng/l 2 priedas Bandyti rekomenduotos žuvų rūšys Rekomenduojamos rūšys Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendrasis kūno ilgis, cm 1 Zebrinė danija (Danio rerio (')) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) 20-25 3,0 ± 0,5 2 Rainė (Pimephales promelas) (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesąue) (Phoxinus phoxinus) 20-25 5,0 ±2,0 3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus) Paprastasis karpis 20-25 5,0 ± 3,0 4 Japoninė medaka (Oryzias latipes) (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck ir Schlegel) 20-25 4,0 ±1,0 5 Vaivorykštinis gupis (Poecilia reticulata) (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupi 20-25 3,0 ±1,0 6 Melsvažiaunis saulešeris (Lepomis macrochirus) (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesąue) 20-25 5,0 ±2,0 7 Margasis upėtakis (Onchorhynchus mykiss) (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) 13-17 8.0 ± 4,0 8 Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus) (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) 18-20 3,0 ±1,0 (')Me yer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231. Skirtingose šalyse buvo naudojamos įvairios upių žiočių ir jūros žuvų rūšys, pvz., Spotas (Leiostomus xanthuru); Margoji lėlžuvė (Cyprinodon variegatus); Priekrančių menidija (Menidia beryllind); Gyvavedis šaineris (Cymatogaster aggregata); Plekšnė (Parophrys vertulus); Siauragalvė plernė (Leptocottus armatus); Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus); Jūros ešerys (Dicentracus labrax); Aukšlė (Albumus albumus). Parinkimas Lentelėje nurodytas gėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus, tuo tarpu galimybė gauti jūros ir upių žiočių žuvų iš dalies ribota atitinkamoms šalimis. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijose, ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandomieji gyvūnai būtų sveiki, ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų. 3 priedas Sugerties ir apsivalymo etapų trukmės prognozavimas 1 Sugerties etapo trukmės prognozavimas Prieš atliekant bandymą, k2 įvertis, taigi nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, gali būti gauta iš empirinių k2 ir n-oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficiento (Pow) arba k2 priklausomybių ir tirpumo vandenyje (s). Įvertis k2 (para-1) gali būti gautas, pvz., pagal tokią empirinę priklausomybę (1): logk2 = -0,414 log10(P“w) + 1,47 (r2 = 0,95) (1 lygtis) Kitos priklausomybės pateiktos 2 nuorodoje. Jei pasiskirstymo koeficientas (Pow) nežinomas, įvertis gali būti atliktas (3), jei žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (s), taikant lygtį: log10(Pow) = 0,862 logl0(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (2 lygtis) kurioje s = tirpumas (mol/l): (n – 36). Šios priklausomybės tinka tik toms cheminėms medžiagoms, kurių log (Pow) vertės yra nuo 2 iki 6,5 (4). Nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, taikant k2 įvertį, gali būti nustatyta iš bendrosios kinetinės lygties, aprašančios sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika): arba jei Cw yra pastovus dydis: Artėjant prie nuostoviosios būsenos (t →∞), 3 lygtis gali būti supaprastinta (5) (6) iki: Tokiu atveju, k1/k2 x Cw yra arti koncentracijos žuvyje „nuostoviosios būsenos“ sąlygomis (Cf,s). 3 lygtis gali būti pertvarkyta į: arba                                                               (4 lygtis) Taikant 4 lygtį, galima prognozuoti laiką, reikalingą pasiekti tam tikrą nuostoviosios būsenos procentinę dalį, kai pagal 1 arba 2 lygtį iš anksto yra įvertinta k2. Statistiškai priimtiniems duomenims (BKFk) gauti, statistiškai optimalios sugerties etapo trukmės atskaitos tašku laikomas laikas, per kurį kreivė, vaizduojanti priklausomybę tarp bandymų medžiagos žuvyje koncentracijos logaritmo ir tiesinėje skalėje atidėto laiko, pasiektų jos vidurio tašką arba l,6/k2, arba 80 % nuostoviosios būsenos, tačiau ne didesnis kaip 3,0/k2, arba 95 % nuostoviosios būsenos (7). Laikas 80% nuostoviosios būsenos pasiekti (4 lygtis)yra lygus: arba                                                                             (5 lygtis) k2 Panašiu būdu laikas, reikalingas pasiekti 95 % nuostoviosios būsenos, yra lygus:                          (6 lygtis) Pvz., sugerties etapo trukmė (sug) bandymų medžiagai, kurios log10(Pow) = 4, būtų (taikant lygtis 1, 5 ir 6): log10k2 = -0,414 x (4) + 1,47                                                   k2 = 0,652 paros-1 sug (80%) = 1,6/0,652, t.y. 2,45 paros (59 valandos) arba sug (95%) = 3,0/0,652, t.y. 4,60 paros (110 valandų) Panašiai, jei bandymų medžiagos s= 10-5 mol/l (log(s) =-5,0), sug trukmė būtų (taikant lygtis 1,2, 5 ir 6): log10 (Pow) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 =-0,414 (5,02)+ 1,47 k2 = 0,246 paros-1 sug (80%) = 1.6/0,246, t.y. 6,5 paros (156 valandos) arba sug (95 %) = 3.0/0,246, t.y. 12,2 paros (293 valandos) Kaip alternatyva, lygtis: Teq = 6,54 x 10-3 Pow + 55,31 (valandos) gali būti taikoma apskaičiuoti laiką, reikalingą pasiekti tikrąją nuostoviąją būseną (4). 2 APSIVALYMO ETAPO TRUKMĖS PROGNOZAVIMAS Laikas, per kurį organizme sulaikytos medžiagos kiekis sumažėja iki tam tikros pradinės koncentracijos procentinės dalies, taip pat gali būti prognozuojamas, taikant bendrąja lygtį kuri aprašo sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika) (1) (8). Apsivalymo etapo atveju daroma prielaida, kad Cw lygi nuliui. Lygtis gali būti redukuota į lygtį:  arba, kurioje Cf,o yra koncentracija apsivalymo etapo pradžioje. Tuomet 50 % apsivalymas bus pasiektas per laiką (t50): Panašiai 95 % apsivalymas bus pasiektas per laiką: Jei pirmajam periodui taikoma sugerties trukmė sudaro 80 % (l,6/k2), o per apsivalymo etapą sumažėjimas sudaro 95 % (3,0/k2), tuomet apsivalymo etapas trunka maždaug du kartus ilgiau už sugerties etapą. Svarbu pažymėti, kad įverčiai remiasi prielaida, jog sugerties ir apsivalymo modeliai atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (pvz., (1) nuoroda). Nuorodos (3 priedo) (1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, 309-320 p. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) ChiouC.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16(1), 4- 10 p. (4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentralion kinetics withfish. Wat. Res. 22(6), 701-707 p. (5) Branson D. R, Blau G. E, Alexander H.C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), 785 – 792 p. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aąuatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte P., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4,243 – 255 p. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons LtdN.Y. (7) Reilly P.M, Bajraniovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhotf M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55. 614 – 622 p. (8) Konemann H. and .Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemnsinherp 9 3 – 19 p. 4 priedas Bandinių ėmimo teorinis grafiko pavyzdys, tiriant medžiagų, kurių log (Pow) = 4, biologini koncentravimą Bandinių ėmimo tvarkaraštis Žuvų bandinių ėmimas Mažiausias reikalingas dažnis (paros) Papildomas bandinių ėmimas Vandens bandinių skaičius Žuvų skaičius bandinyje Sugerties etapas -1 0 2(*) 2 45-80 žuvų 1-asis 0,3 0,4 2 (2) 4 (4) 2-asis 0,6 0,9 2 (2) 4 (4) 3-iasis 1,2 1,7 2 (2) 4 (4) 4-asis 2,4 3,3 2 (2) 4 (4) 5-asis Apsivalymo etapas 4,7 2 6 Žuvų pernešimas į vandenį be bandymo medžiagos 6-asis 5,0 5,3 4 (4) 7-asis 5,9 7,0 4 (4) 8-asis 9,3 11,2 4 (4) 9-asis 14,0 17,5 6 (4) (*) Vandens bandinys imamas po to, kai buvo pateikti mažiausiai trys „indo tūriai“. Vertės skliausteliuose rodo bandinių (vandens, žuvų) skaičių, kurį reikia paimti, jei bandiniai papildomai imami. NB: Prieš bandymą darytas k2 įvertis, kai log (Pow) = 4,0, yra 0,652 paros-1. Bendra bandymo trukmė nustatyta 3 x sug = 3 x 4,6 paros, t.y. 14 parų. Kaip vertinti „sug“, žr. 3 priedą. 5 priedas Modelio pasirinkimas Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenys „pakankamai“ gerai aprašomi paprasto dviejų indų ir dviejų parametrų modelio (tai matyti ištiesintoje kreivėje, kuri priartina žuvies apsivalymo etapo koncentracijos taškus, kai jie vaizduojami pusiau logaritminiame popieriuje. (Jei šie taškai negali būti aprašyti ištiesinta kreive, tuomet reikia naudoti sudėtingesnius modelius, žr., pvz., Spacie and Hanwhnk, 3 priedo 1 nuoroda). Grafinis metodas apsivalymo (išnykimo) greičio konstantai k2 nustatyti Pusiau logaritminiame popieriuje nubraižomas kiekviename žuvies bandinyje rastos bandymo medžiagos koncentracijos kitimo ir laiko grafikas. Šios tiesės krypties koeficientas yra k2. Atkreipkite dėmesį, kad nukrypimai nuo tiesės gali reikšti, kad apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už pirmojo laipsnio kinetiką. Norint spręsti apie tai, ar apsivalymo tipas nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos, galima taikyti grafinį metodą. Grafinis metodas, nustatant sugerties greičio konstantą k. Duotai k2 vertei k1 apskaičiuojamas taip:  (1 lygtis) Cf vertė yra gautosios sugerties glaudžiusios kreivės duomenų vidurio taškas. Kreivė vaizduoja koncentracijos logaritmo kitimą per tam tikrą laiką (aritmetinėje skalėje). Kompiuteriniai metodai sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms apskaičiuoti Geriausias būdas yra taikyti kompiuterinius netiesinių parametrų vertinimo metodus biologinio koncentravimo faktorių ir kj bei k2 greičio konstantoms apskaičiuoti. Jei duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir modelis, šios programos apskaičiuoja k] ir k2 vertes:   (2lygtis)  (3 lygtis) čia: tc = sugerties etapo pabaigos laikas. Šis metodas duoda k1 ir k2 standartinio nuokrypio įverčius. Didesnė dalis k2 atvejų pagal išsivalymo kreivę gali būti įvertinta pakankamai tiksliai. Tarp dviejų parametrų, k1 ir k2, jei juos vertintume kartu, yra stipri koreliacija. Galima būtų patarti iš pradžių tik pagal išsivalymo duomenis apskaičiuoti k2, o vėliau pagal sugerties duomenis ir taikant netiesinę regresiją apskaičiuoti k1. ŽUVŲ MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS (C.14.) 1. METODAS Šis toksiškumo augimui bandymo metodas yra OECD TG 215 (2000) kopija. 1.1 ĮVADAS Sis bandymas skirtas įvertinti cheminių medžiagų ilgo veikimo įtaką žuvų mailiaus augimui. Jis pagrįstas Europos Sąjungoje sukurtu ir tarplaboratoriniais bandymais patikrintu (1) (3) dinaminiu metodu, taikytu įvertinti cheminių medžiagų poveikius vaivorykštinio upėtakio (Oncorynchus mykiss) mailiaus augimui. Galima naudoti kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis. Pvz., įgyta patyrimo, atliekant zebrinės danijos (Danio rerio) (2) (4) (5) ir japoninės medakos (Oryzias latipes) (6) (7) (8) augimo bandymus. 1.2 APIBRĖŽIMAI Mažiausioji pastebimo poveikio koncentracija, LOEC: mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis už LOEC poveikį. Nepastebimo poveikio koncentracija, NOEC: bent kiek už LOEC mažesnė bandomoji koncentracija. EC,: šiam bandymo metodui tai yra bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant žuvų augimo greičio pokytis lyginant su kontroliniais bandiniais yra x %. Įkrova: gyvų žuvų masė, tenkanti vandens tūrio vienetui. Žuvų tankis: žuvų skaičius, tenkantis vandens tūrio vienetui. Atskiros žuvies savitasis augimo greitis: išreiškia atskiros žuvies augimo greitį pagal jos pradinę masę. Vidutinis savitasis augimo greitis bandymo indui: išreiškia bandymo indo populiacijos vidutinį augimo greitį vienai koncentracijai. Tariamai („Pseudo“) savitasis augimo greitis: išreiškia atskirų žuvų augimo greitį lyginant su bandymo indo populiacijos vidutine pradine mase. 1.3 BANDYMO METODO ESMĖ Eksponentinio augimo etapo žuvų mailius pasveriamas, įleidžiamas į bandymo indus, kur jis geriau dinaminio bandymo sąlygomis ar, jei neįmanoma, atitinkamomis pusiau statinio bandymo (periodinio atnaujinimo) sąlygomis yra veikiamas bandomosios medžiagos subletalios koncentracijos diapazono vandeniniais tirpalais. Bandymo trukmė 28 paros. Žuvys šeriamos kasdien. Pašaro davinys nustatomas pagal pradinę žuvų masę ir po 14 parų gali būti perskaičiuojamas iš naujo. Bandymo pabaigoje žuvys vėl sveriamos. Taikant regresijos modelį, analizuojamas poveikis augimo greičiui, norint nustatyti koncentraciją, sukeliančią x % augimo greičio pokytį, t. y. ECx (pvz., EC10, EC20 ar EC30). Be to, norint nustatyti mažiausią pastebimo poveikio koncentraciją (LOEC), taigi ir nepastebimo poveikio koncentraciją (NOEC), duomenis galima lyginti su kontrolinių bandinių vertėmis. 1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ Reikėtų turėti atlikto ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), daryto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Tai reikštų, kad bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis yra žinomi ir kad ataskaitoje yra pateiktas patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu bei aptikimo riba. Naudingą informaciją apie bandomąją medžiagą apima struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493). 1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS) Bandymas yra pagrįstas, jei išlaikytos šios sąlygos: - baigiant bandymą kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) žuvų gaištamumas turi būti ne didesnis kaip 10%, - kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) vidutinė žuvų masė turi būti pakankamai padidėjusi, kad būtų galima aptikti mažiausią augimo greičio kitimą, kuris dar laikomas reikšmingu. Tarplaboratorinių bandymų palyginimas (3) parodė, kad kontroliniuose bandymuose vaivorykštinio upėtakio vidutinė masė per 28 paras turi padidėti bent per pusę jo pradinės vidutinės masės (t. y. 50 %); pvz., pradinė masė: 1g/žuviai (= 100 %), galutinė masė po 28 parų: daugiau arba lygu 1,5 g/žuviai (> 150 %), - ištirpusio deguonies koncentracija per visą bandymą turi sudaryti bent 60 % oro soties vertės (OSV), - kiekvieną bandymo momentą bandymo indų vandens temperatūra neturi tarpusavyje skirtis daugiau kaip ±1°C ir būti palaikoma 2°C intervale bandymo rūšims nurodytame diapazone (1 priedas). 1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS 1.6.1 Aparatūra Be įprastos laboratorinės įrangos, reikalinga ši speciali įranga: a) deguonies ir pH matuokliai; b) įranga, nustatanti vandens kietumą ir šarmingumą; c) darbo reikalavimus atitinkantys aparatai, kontroliuojantys temperatūrą, pirmenybę teikiant nuolatinės kontrolės aparatūrai; d) indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos ir atitinkantys rekomenduotą įkrovą bei žuvų tankį (žr. 1.8.5 skirsnį ir 1 priedą); e) reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ± 0,5 % tikslumo). 1.6.2 Vanduo Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame žuvys gali ilgai gyventi ir augti. Vandens kokybė turi nekisti visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,5 -8,5, tačiau atliekant konkretų bandymą jo reikšmė neturi kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Rekomenduojamas didesnis kaip 140 mg/l (skaičiuojant CaCOs) kietumas. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga), bandiniai tam tikrais laiko tarpais turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendro kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė santykinai nekinta. Jei buvo įrodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens savybės yra pateiktos 2 priede. 1.6.3 Bandomieji tirpalai Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Kartais norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai suardomas medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, atliekant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizuojanti medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio žuvų augimui ir neigiamo poveikio mailiui, kaip tai nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo indus tiekti dinaminių bandymų metu reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir per visą bandymą neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Tarplaboratorinio palyginimo bandymas (3) parodė, kad, atliekant bandymą su vaivorykštiniu upėtakiu, yra priimtinas 6 litrų/g žuvies ir parai vandens keitimo dažnis (žr. 1.8.2.2 skirsnį). Pusiau statiniams (atnaujinimo) bandymams terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4 poskyrį) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminį bandymą. 1.6.4 Rūšių parinkimas Šiam bandymui rekomenduojama rūšis yra vaivorykštinis upėtakis (Oncorhynchus mykiss), nes naudojant šią rūšį buvo sukauptas didžiausias tarplaboratorinio palyginimo bandymų patyrimas (1) (3). Galima naudoti ir kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis, bet tinkamoms bandymo sąlygoms gauti gali tekti pritaikyti bandymo metodiką. Pvz., įgyta patyrimo su zebrine danija (Danio rerio) (4) (5) ir japonine me …