(1996)kopija. 1.1 ĮVADAS Šis metodas aprašo pratekėjimo sąlygomis vykstančio medžiagų biologinio koncentravimo gebos žuvyse apibūdinimo procedūrą. Nors tyrimams, atliekamiems pratekėjimo režimu, pabrėžtinai teikiama pirmenybė, leidžiama naudoti ir pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka patikimumo kriterijus. Metodas pateikia pakankamai išsamių bandymą atlikti reikalingų detalių, palikdamas atitinkamą laisvę eksperimento schemą pritaikyti konkrečių laboratorijų esamoms sąlygoms ir skirtingoms bandomųjų medžiagų savybėms. Jis tinkamiausias patvarioms organinėms medžiagoms, kurių log Pow vertės yra nuo 1,5 iki 6,0

(1), tačiau gali būti taikomas ir ypač lipofilinėms medžiagoms (kurių log Pow > 6,0). Tokių ypač lipofilinių medžiagų biokoncentravimo faktoriaus (BKF), kartais žymimo KB, išankstinis įvertis greičiausiai būtų didesnis, nei nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktoriaus (BKFnb) vertė, kurios reikėtų laukti iš laboratorinių bandymų. Medžiagų, kurių log Pow vertės yra iki 9,0, išankstiniai biokoncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti, naudojant Bintein ir kt. lygtį

(2). Parametrams, kurie apibūdina biokoncentravimo gebą, priklauso sugerties greičio konstanta (k1), apsivalymo greičio konstanta (k2) ir BKFmb. Radioaktyvias žymenas turinčios bandomosios medžiagos gali palengvinti vandens ir žuvų bandinių analizę ir gali būti naudojamos, siekiant nustatyti, ar reikia atlikti irimo produktų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., deginant arba soliubilizuojant audinius), BKF turi būti pagrįstas duomenimis apie pradinio junginio, visų sulaikytų metabolitų, taip pat įsisavintos anglies kiekiu. Taigi BKF vertės, pagrįstos bendruoju radioaktyviųjų likučių kiekiu, negali būti tiesiogiai lyginamos su BKF vertėmis, gautomis atliekant tik pradinio junginio selektyviąją analizę. Norint nustatyti BKF, pagrįstą tik pradinio junginio kiekiu, tyrimuose su radioaktyviomis žymenomis gali būti naudojami gryninimo būdai, ir gali būti apibūdinti pagrindiniai medžiagų apykaitos produktai, jei laikoma, kad tai yra būtina. Analizuojant ir identifikuojant likučius audiniuose, galima sujungti medžiagų apykaitos tyrimus žuvyse su biokoncentravimo tyrimais. 1.2 APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Biokoncentravimas ir bioakumuliacija – bandomosios medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (tam tikruose audiniuose) arba organizmo paviršiuje, lyginant su bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje. Biokoncentravimo faktorius (BKF arba Kb) – bandomosios medžiagos koncentracijos žuvies viduje ir paviršiuje arba jos apibrėžtuose audiniuose (Cf, μg/g (ppm)) ir cheminės medžiagos koncentracijos supančioje terpėje (Cw, μg/ml (ppm)) santykis per bet kurį šio koncentravimo bandymo sugerties etapą. Nuostoviosios būsenos biokoncentravimo faktorius (BKFmb arba Kb) ilgesnį laiko tarpą daug nekinta, jei bandomosios medžiagos koncentracija supančioje terpėje nekinta. Horizontalioji dalis arba nuostovioji būsena pasiekiama tuomet, kai bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje (Cf) priklausomybės nuo laiko kreivė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys Cf vertės, gautos analizuojant mažiausiai kas dvi paras paeiliui paimtus bandinius, viena nuo kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir nėra didelių skirtumų tarp trijų bandinių ėmimo periodų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, reikia ne mažiau kaip keturių paeiliui atliktų analizių. Lėtai sugeriamoms bandomosioms medžiagoms tinkamesni būtų septynių parų tarpai. Kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKFk) – biologinio koncentravimo faktorius, apskaičiuotas tiesiog iš kinetinių greičio konstantų (k1 ir k2). Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Pow) – cheminės medžiagos tirpumo n-oktanolyje ir vandenyje santykis, esant pusiausvirai (A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais), taip pat išreiškiamas kaip K“w. Cheminės medžiagos biokoncentravimo vandens organizmuose gebos rodikliu taikomas Pow logaritmas. Poveikio arba sugerties etapas – laiko tarpas, per kurį žuvis yra veikiama bandoma chemine medžiaga. Sugerties greičio konstanta (k1) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis veikiama chemine medžiaga (k1 išreiškiama (para)-1). Etapas po veikimo, arba apsivalymo (išnykimo) etapas – laikas, kai bandymo žuvis perkelta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra, ir per kurį tiriamas bandomosios medžiagos išsivalymas (arba tiesiog išnykimas) iš bandymo žuvies arba tam tikrų jos audinių. Apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (k2) – skaitinė vertė, apibūdinanti bandomosios medžiagos koncentracijos bandymo žuvyje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) mažėjimo greitį po to, kai bandymo žuvis buvo pernešta iš terpės su bandomąja medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra (k2 išreiškiama (para)-1). 1.3 BANDYMŲ METODO ESMĖ Bandymą sudaro du etapai: poveikio (sugerties) etapas ir etapas po poveikio (apsivalymo). Per sugerties etapą vienos rūšies žuvų grupės veikiamos mažiausiai bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Išsivalyti jos pernešamos į terpę be bandomosios medžiagos. Išsivalymo etapas yra būtinas, išskyrus tuos atvejus, kai medžiagos sugertis (pereiga) buvo nedidelė (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandomosios medžiagos koncentracija žuvyje arba jos paviršiuje (arba apibrėžtuose jos audiniuose) nustatoma per abu bandymo etapus. Kontrolinė žuvų grupė laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir bandomųjų koncentracijų, bet be bandomosios medžiagos, kad biokoncentravimo bandyme galimas neigiamas pasekmes būtų galima palyginti su kontroline grupe ir gauti bandomosios medžiagos foninių koncentracijų. Sugerties etapas tęsiamas 28 paras, jei neįrodoma, kad pusiausvyra yra pasiekta anksčiau. Sugerties etapo trukmės ir laiko, kai bus pasiekta nuostovioji būsena, laiko prognozė gali būti padaryta pagal 3 priedo lygtį. Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandomosios medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei įmanoma, biologinio koncentravimo fektorių apskaičiuoti ir kaip santykį koncentracijos žuvyje (Cf) su koncentracija vandenyje (Cw) tariamosios nuostoviosios būsenos sąlygomis (BKFmb), ir kaip kinetinį biologinio koncentravimo fektorių (BKFk), išreiškiamą sugerties (k1) ir taikomi sudėtingesni modeliai (5 priedas). Jei nuostovioji būsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties etapas turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas anksčiau; tuomet pradedamas apsivalymo etapas. Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (išnykimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius, ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojamos pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandymo medžiagos koncentracijas. BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios drėgnos masės funkcija. Specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami atitinkami audiniai arba organai (pvz., raumuo, kepenys), arba žuvis gali būti padalinta į valgomą (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Yra aiški daugelio organinių medžiagų biologinio koncentravimo gebos ir lipofiliškumo priklausomybė, atitinkama priklausomybė yra ir tarp riebalų kiekio bandymų žuvyse ir stebimo tokių medžiagų biologinio koncentravimo. Tokiu būdu, norint sumažinti šį bandymo rezultatų kintamumo šaltinį, lipofilinių (t.y. kurių log Pow > 3) medžiagų biologinis koncentravimas turi būti apskaičiuojamas ne tik viso kūno masei, bet ir riebalų kiekiui. Kai tai įmanoma atlikti, riebalų kiekis turi būti nustatomas toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandomoji medžiaga. 1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandymą, apie bandomąją medžiagą turi būti žinoma tokia informacija: a) tirpumas vandenyje; b) pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas Pow (taip pat išreikštas kaip Kow nustatomas HPLC metodu – A. 8 metodas, Tarybos direktyva 67/548/EC su papildymais); c) hidrolizė; d) fotocheminiai virsmai vandenyje, nustatyti saulės arba dirbtinės spinduliuotės sąlygomis ir biologinio koncentravimo bandyme naudotos spinduliuotės sąlygomis

(3);

1. e)paviršiaus įtemptis (t. y. medžiagoms, kurioms log Pow negali būti nustatytas);
2. f)garų slėgis;
3. g)biologinio skaidomumo lengvumas (jei reikia). Kita reikalinga informacija yra toksiškumas bandyme naudojamoms žuvų rūšims, geriausiai – asimptotiška (t.y. nuo laiko nepriklausanti) LC50 vertė. Reikia turėti tinkamą žinomo tikslumo ir jautrumo analizinį metodą bandomajai medžiagai bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, kartu su bandinių ruošimo ir laikymo detalėmis. Tai pat turi būti žinoma bandymo medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audiniuose riba. Kai naudojama 14C žymėta bandymo medžiaga, turi būti žinoma radioaktyvumo dėl priemaišų buvimo procentinė dalis. 1.5 BANDYMŲ PAGRĮSTUMAS (patikimumas) Bandymai laikomi pagrįstais, jeigu laikomasi šių sąlygų: - temperatūros svyravimas ne didesnis kaip ± 2 °C; - ištirpusio deguonies koncentracija ne mažiau 60 % oro soties verties; - per sugerties etapą bandymo medžiagos koncentracija bandymo induose palaikoma vidutinių išmatuotų verčių ribose, su ne didesniu kaip ± 20 % nuokrypiu; - bandymo pabaigoje tiek kontrolinių, tiek ir veikiamų žuvų mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai arba liga yra mažesni kaip 10 %; jei bandymas vyksta kelias savaites arba mėnesius, mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuvų grupėse turi būti mažesnis kaip 5 %, o bendras mirtingumas ne didesnis kaip 30 %. 1.6 ETALONINĖS MEDŽIAGOS Tikrinant tyrimo metodiką, galima naudoti etalonines medžiagas su žinoma biokoncentravimo geba. Etaloninės medžiagos iki šiol nėra apibrėžtos. 1.7 BANDYMŲ METODO APRAŠAS 1.7.1 Aparatūra Reikia žiūrėti, kad visų įrangos dalių gamybai nebūtų naudojamos medžiagos, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Gali būti naudojami stačiakampio arba ritinio formos standartiniai indai, kurie būtų pagaminti iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį. Minkštų plastikinių vamzdžių turi būti naudojama kuo mažiau. Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono (R), nerūdijančio plieno arba stiklo. Patirtis parodė, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali būti reikalingas silanizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo turėtų būti išmesta. 1.7.2 Vanduo Bandymuose dažniausiai naudojamas gamtinis vanduo, jis turi būti imamas iš neužterštos ir vienodos kokybės gavimo vietos. Skiedimo vandens kokybė turi būti tokia, kad pasirinktų rūšių žuvys išgyventų per aklimatizavimo ir bandymo laiką ir jų išvaizdoje arba elgesyje neatsirastų ko nors neįprasto. Geriausiu atveju reikėtų parodyti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratoriniame veisimo bandyme arba gyvenimo ciklo toksikologiniame bandyme). Apibūdinant vandenį, turi būti nurodyta pH vertė, kietumas, bendrasis kietųjų dalelių kiekis, bendroji organinė anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitritų jonų kiekį bei šarmingumą, o jūrinėms žuvų rūšims – druskingumą. Parametrai, kurie atitiktų optimalias žuvų gyvavimo sąlygas, yra žinomi, tačiau 1 priede pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamų gėlo ir jūros vandens komponentų didžiausios koncentracijos. Vandens kokybė visą bandymo laiką turi būti pastovi. Vandens pH turi būti nuo 6,0 iki 8,5, tačiau konkrečiame bandyme pH reikšmė turi būti ± 0,5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudarydamas kompleksus su bandomąja medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, per tam tikrus laiko tarpus turi būti imami bandiniai analizei. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb. Zn, Hg. Cd. Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Ci SO4), pesticidų (pvz., bendrojo fosforoorganinių ir chlororganinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o tarpai tarp jų didesni (pvz., kas šešis mėnesius). Natūralus kietųjų dalelių kiekis, taip pat bendrosios organinės anglies (BOA) kiekis skiedimo vandenyje turi būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos absorbcijos organinėse medžiagose, nes gali sumažėti bandomosios medžiagos biologinis prieinamumas

(4). Didžiausias leistinas kietųjų dalelių kiekis yra 5 mg/l (skaičiuojant pagal medžiagas, sulaikomas 0,45 μm filtru), o bendrosios organinės anglies – 2 mg/l (žr. 1 priedą). Prireikus prieš naudojimą vanduo turi būti filtruojamas. Bandymų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių indėlis į bendrosios organinės anglies kiekį turi būti kiek įmanoma mažesnis. Organinės anglies koncentracija bandymo inde visą bandymo laiką neturi viršyti su bandomąja medžiaga patekusios organinės anglies koncentracijos ir, jei naudojama, soliubilizuojančioje medžiagoje, esančios organinės anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %). 1.7.3 Bandymų tirpalai Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandomosios medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojančias (solubilizuojančias) medžiagas nerekomenduojama; tačiau kai kuriais atvejais, norint pagaminti pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą, jų gali prireikti. Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etilenglikolio monometilo eteris (etandiolio monometilo eteris), etilenglikolio dimetilo eteris (etandiolio dimetilo eteris), dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Disperguojančios medžiagos, kurias galima naudoti, yra Cremophor RH40, Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-

1. Naudojant biologiškai lengvai suardomas medžiagas, reikia žiūrėti, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo bandymų pratekančiame vandenyje. Bandomoji medžiaga gali turėti radioaktyvius žymenis ir turi būti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %). Bandymuose su pratekančiu vandeniu bandomosioms koncentracijoms bandymų induose užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojantis siurblys, proporcinis skiestuvas, prisotinimo sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens tūrio keitimus per dieną kiekvienoje bandymų talpoje. Geriau naudoti pratekėjimo režimą, tačiau, jei jis netinka (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), galima taikyti pusiau statinį metodą, jei jis atitinka pagrįstumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 valandas prieš bandymą ir vėliau visą bandymo laiką, bent kasdieną. Šį kartą tikrinant nustatomas pratekėjimo srautas ir užtikrinama, kad jis inde arba tarp indų nesikeistų daugiau kaip 20 %. 1.7.4 Žuvų rūšies parinkimas Pasirenkant žuvų rūšis, svarbu, ar lengva jas gauti, ar galima gauti tinkamų dydžių ir ar yra sąlygos jų priežiūrai laboratorijoje. Kiti žuvų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacinę, komercinę, ekologinę svarbą, taip pat palyginamąjį jautrumą, sėkmingą naudojimą praeityje ir t.t. Rekomenduotos bandomosios rūšys pateiktos 2 priede. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymo sąlygas. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pateikta rūšies pasirinkimo priežastis ir bandymų metodas. 1.7.5 Žuvų laikymas Žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje bandymo temperatūroje ir pakankamai šeriama tos pačios rūšies pašaru, kuris bus naudojamas atliekant bandymą. Po 48 valandų stabilizacijos periodo registruojamas mirtingumas ir taikomi tokie kriterijai: - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%, visa partija atmetama; - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras 5-10%, aklimatizuojama dar septynias papildomas paras; - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %, partija priimama, jei mirtingumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama. Reikia žiūrėti, kad bandymams naudojamos žuvys neturėtų pastebimų ligų ir apsigimimų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys dvi savaites prieš pradedant bandymą arba atliekant bandymą neturi būti gydomos. 1.8 Bandymo atlikimas 1.8.1 Išankstinis bandymas Gali praversti atlikti išankstinį bandymą, norint optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., bandymo medžiagos koncentraciją (-as), sugerties ir apsivalymo etapų trukmę. 1.8.2 Veikimo sąlygos 1.8.2.1 Sugerties etapo trukmė Sugerties etapo trukmės prognozavimas gali būti atliekamas remiantis praktiniu patyrimu (pvz., ankstesniu panašios cheminės medžiagos sugerties tyrimu) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandymo medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą (žr. 3 priedą). Sugerties etapas turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pusiausvyra pasiekta anksčiau. Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, sugerties etapas turi būti pratęstas, atliekant tolesnius matavimus, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba iki 60 parų, atsižvelgiant į tai, kas trumpiau. 1.8.2.
2. Apsivalymo etapo trukmė Pusės sugerties etapo laiko dažniausiai pakanka, kad į organizmą patekusios medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (dėl šio įverčio paaiškinimo žr. 3 priedą). Jei laikas, reikalingas 95 % išnykimo vertei pasiekti, yra neįvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus ilgesnis už normalią sugerties etapo trukmę (t.y. daugiau kaip 56 paros), galima naudoti trumpesnį periodą (pvz., kol bandomosios medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau medžiagų, kurių sugerties ir apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už tą, kurį vaizduoja žuvų vienoje talpoje modelis, atitinkantis pirmojo laipsnio kinetiką, išnykimo greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo etapai. Tačiau šio periodo trukmę gali nusakyti laikas, kai bandymo medžiagos koncentracija žuvyje vis dar yra didesnė už analizinio aptikimo ribą. 1.8.2.
3. Bandomųjų žuvų skaičius Bandomajai medžiagos koncentracijai nustatyti parenkamas toks žuvų skaičius, kad per kiekvieną bandinio ėmimą kiekvienam bandiniui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuvų reikės daugiau. Jei naudojamos suaugusios žuvys, reikia nurodyti, kurios vienos lyties ar abiejų lyčių žuvys buvo naudojamos bandyme. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, prieš veikimo pradžią turi būti dokumentuota, kad lyčių riebalų kiekio skirtumas yra nereikšmingas; gali būti būtina suleisti visas vyriškosios ir moteriškosios lyties žuvis į vieną grupę. Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turi būti to paties amžiaus ir iš to paties gavimo šaltinio. Kartais paaiškėja, kad žuvų masė ir amžius turi didelę įtaką BKF vertėms

(1), todėl šios detalės turi būti tiksliai registruojamos. Norint įvertinti vidutinę masę, rekomenduojama iš turimų žuvų atsargų prieš bandymą pasverti po bandinį. 1.8.2.

1. Įkrova Norint mažinti Cw sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo, naudojami dideli vandens ir žuvų kiekio santykiai. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandymų rūšį. Bet kuriuo atveju dažniausiai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1 – 1,0 g žuvies (šlapios masės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, jei įrodoma, kad reikiamą bandymo medžiagos koncentraciją įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos. Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastąsias gyvenimo aplinkos sąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims. 1.8.2.
2. Šėrimas Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu pašaru, kurio yra žinomas riebalų ir baltymų bendrasis kiekis ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė. Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kiekvieną dieną, pašaro kiekis sudaro maždaug 1 – 2 % kūno masės per parą; taip per bandymą riebalų koncentracija daugumoje žuvų rūšių palaikoma santykinai pastovi. Norint palaikyti kūno masės ir riebalų kiekio atitikimą, pašaro kiekis turi būti perskaičiuojamas, pvz., kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masė kiekviename inde gali būti įvertinta pagal neseniai iš šio indo bandiniui paimtų žuvų masę. Nesveriamos žuvys, liekančios bandymų inde. Nesuėstas pašaras ir išmatos išsiurbiami iš indo kasdien netrukus po šėrimo (nuo 30 minučių iki vienos valandos). Indai visą bandymo laiką turi būti palaikomi kuo švaresni, kad būtų kuo mažesnė organinių medžiagų koncentracija, nes organinė anglis gali riboti bandomosios medžiagos biologinį prieinamumą

(1). Kadangi daugelis pašarų gaminami iš žuvų miltų, pašaras turi būti analizuojamas, norint aptikti bandomosios medžiagos. Taip pat pageidautina pašaro pesticidų ir sunkiųjų metalų analizė. 1.8.2.

1. Šviesa ir temperatūra Apšvietimo periodo trukmė dažniausiai būna 12-16 valandų, o temperatūra (± 2 °C) turi būti tinkama žuvų rūšims (žr. 2 priedą). Turi būti žinomas apšvietimo tipas ir jo ypatybės. Būtina imtis atsargumo priemonių dėl galimų bandomosios medžiagos fotocheminių virsmų tiriant, naudojant apšvietimą. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti filtrą, kuris nepraleistų trumpesnių nei 290 nm bangos ilgio UV spindulių. 1.8.2.
2. Bandymuose naudojamos koncentracijos Žuvys pratekėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dviejų koncentracijų bandomąja medžiaga. Dažniausiai didesnė (arba didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos ūmios asimptotinės LC50 ir būtų bent dešimt kartų didesnė už jos aptikimo ribą vandenyje naudojamu analizės metodu. Didžiausią bandymo medžiagos koncentraciją taip pat galima nustatyti, padalinant ūmios 96 h LC5o vertę iš atitinkamo ūmaus ir chroniško koncentracijų santykio (kai kurių cheminių medžiagų atitinkamas santykis gali kisti maždaug nuo 3 iki 100). Jei įmanoma, parenkama kitokia arba kitokios koncentracijos, kuri (arba kurios) būtų didesnė už nurodytąją 10 kartų. Jei tai neįmanoma dėl 1 % LC50 sąlygos ir analizinio nustatymo ribos, galima taikyti mažesnį nei 10 daugiklį arba turi būti atsižvelgta į galimybę naudoti 14C žymėtą bandomąją medžiagą. Neturi būti naudojama koncentracija, kuri būtų didesnė už bandomosios medžiagos tirpumą. Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1ml/l ir ji turi būti vienoda visuose bandymo induose. Turi būti žinoma, kokią bendrosios organinės anglies kiekio dalį bandymo vandenyje sudaro ši medžiaga ir bandomoji medžiaga kartu. Tačiau reikia stengtis, kad tokių medžiagų naudoti nereikėtų. 1.8.2.
3. Kontroliniai bandymai Papildomai turi būti tikrinamas skiedimo vanduo arba, jei tinka, vanduo su soliubilizuojančia medžiaga, jei buvo nustatyta, kad soliubilizuojanti medžiaga neveikia žuvų. Jei taip nėra, turi būti atliekami abu tikrinimai. 1.8.3 Vandens kokybės matavimų dažnis Atliekant bandymą, visuose induose būtina matuoti ištirpusį deguonį, BOA, pH ir temperatūrą. Bendrasis kietumas ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatyti kontroliniuose bandymuose ir viename inde su didesne (arba didžiausia) koncentracija. Ištirpęs deguonis ir druskingumas, jei reikia, turi būti nustatomi mažiausiai tris kartus – sugerties etapo pradžioje, maždaug viduryje ir pabaigoje, o per apsivalymo etapą- kartą per savaitę. BOA turi būti nustatyta bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant sugerties etapą) prieš žuvis suleidžiant ir bent kartą per savaitę sugerties ir apsivalymo etapų metu. Temperatūra turi būti matuojama kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas – kartą, atliekant kiekvieną bandymą. Temperatūra bent viename inde turi būti stebima nuolat. 1.8.4 Bandinių ėmimas ir žuvų bei vandens analizė 1.8.4.1 Žuvų ir vandens bandinių ėmimo grafikas Vanduo iš bandymo indų nustatyti bandomosios medžiagos koncentraciją imamas prieš suleidžiant žuvis ir sugerties bei išsivalymo etapų metu. Minimalus vandens bandinių skaičius imamas tuomet, kai imami žuvų bandiniai ir prieš šeriant. Sugerties laiką bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma, norint kad būtų laikomasi pagrįstumo kriterijų. Žuvų bandiniai imami bent penkis kartus per sugerties etapą ir bent keturis kartus per išsivalymo etapą. Remiantis tokiu bandinių skaičiumi, kai kuriais atvejais būna sunku gauti pakankamai tikslų BKF vertės įvertį, ypač kai pasirodo, kad išsivalymo kinetika yra kitokia nei pirmojo laipsnio, galima būtų patarti bandinius imti dažniau (žr. 4 priedą). Papildomi bandiniai saugomi ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kad pirmosios eilės analizės duomenų nepakanka BKF apskaičiuoti norimu tikslumu. Tinkamo bandinių ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 priede. Naudojant kitas Pow numanomas vertes poveikio trukmei, per kurią būtų pasiekta 95% sugertis, apskaičiuoti, gali būti lengvai sudaryti kiti grafikai. Bandiniai imami per sugertį tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba 28 paras priklausomai nuo to, kas trumpiau. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandiniai imami tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų priklausomai nuo to, kas trumpiau. Prieš pradedant išsivalymo etapą, žuvys perkeliamos į švarius indus. 1.8.4.
4. Bandinių ėmimas ir bandinio ruošimas Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant (sifonuojant) juos iš inertiškos medžiagos pagamintais vamzdžiais, įstatytais į bandymo indo vidurį. Atrodo, jog nei filtravimu, nei centrifugavimu neįmanoma atskirti biologiškai neįsisavinamos bandomosios medžiagos dalies nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypač labai lipofilinių cheminių medžiagų, t.y. tokių medžiagų, kurių log Pow > 5)

(5), todėl bandinių tokiais būdais apdoroti nereikia. Todėl reikia imtis priemonių, kad rezervuarai būtų kuo švaresni, o bendrosios organinės anglies kiekis per sugerties ir apsivalymo etapus turi būti nuolat kontroliuojamas. Kiekvieną kartą imant bandinį iš bandymo indų paimamas atitinkamas žuvų skaičius (dažniausiai ne mažiau kaip keturios žuvys). Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, „sausai“ nušluostomos, tuojau pat užmušamos pačiu tinkamiausiu būdu ir sveriamos. Vanduo ir žuvys turi būti analizuojami iš karto po bandinio ėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuojami apytikriai sugerties bei apsivalymo greičiai per bandymą. Iš karto atlikta analizė leidžia negaištant nustatyti, kada pasiekiama horizontalioji sugerties kreivės dalis. Jei iš karto analizė neatliekama, bandiniai turi būti laikomi tinkamai. Prieš pradedant tyrimą, gaunama informacija apie tinkamą konkrečios bandymo medžiagos laikymo metodą, pvz., šaldymą, laikymą, esant 4 °C temperatūrai, laikymo trukmę, ekstrahavimą ir 1.

1. 1.8.4.
2. Analizės metodo kokybė Kadangi visas bandymas iš esmės priklauso nuo bandomajai medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, tikslumo ir jautrumo, reikia eksperimentiškai patikrinti, ar konkretaus metodo cheminės analizės tikslumas ir atkuriamumas, taip pat bandomosios medžiagos išgavimas iš vandens ir žuvies yra patenkinami. Taip pat reikia patikrinti, ar bandomoji medžiaga neaptinkama naudojamame skiedimo vandenyje. Jei būtina, daromos Cw ir Cf gautų verčių pataisos, atsižvelgiant į išgavimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais visą laiką elgiamasi taip, kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., dėl bandinio ėmimo įtaiso sugerties) būtų kuo mažesni. 1.8.4.
3. Žuvies bandinio analizė Jei bandyme naudojama radioaktyvius žymenis turinčių medžiagų, galima nustatyti bendrą jų kiekį (t.y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba bandiniai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat, pasiekus nuostoviąją būseną arba sugerties etapo pabaigą, priklausomai nuo to kas anksčiau, galima apibūdinti pagrindinius metabolitus. Jei BKF, apskaičiuotas pagal bendrąjį radioaktyvius žymenis turinčių likučių kiekį, yra didesnis ar lygus 100 %, būtų patartina, o radus kai kurių cheminių medžiagų rūšių, pvz., pesticidų, labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo likučių kiekio žuvies audiniuose nuostoviosios būsenos sąlygomis. Jei yra identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie sudaro daugiau kaip 10 % bendrojo žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekio, taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje. Bandomosios medžiagos koncentracija dažniausiai turi būti nustatoma kiekvienoje pasvertoje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvieno ėmimo bandinius galima sudėti, tačiau bandinių sudėtis riboja statistinio apdorojimo metodikas, kurios galėtų būti taikomos duomenims apdoroti, galimybes. Jei yra svarbi specifinė statistinė procedūra ir jos reikšmingumas, tuomet bandyme turi būti naudojamas pakankamas žuvų skaičius, kuris atitiktų norimą jungimo procedūrą ir statistinį reikšmingumą

(7). BKF turi būti išreikštas kaip visos šlapios masės funkcija, o labai lipofiliškoms medžiagoms – kaip riebalų kiekio funkcija. Riebalų kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo atveju, jei tai įmanoma. Riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomi atitinkami metodai (3 priedo 8 ir 2 nuorodos). Geriausias metodas, jei gali būti rekomenduota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika

(9). Įvairūs metodai neleidžia gauti vienodų verčių

(10), todėl svarbu pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, riebalų analizė turi būti atliekama tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandomajai medžiagai analizuoti, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekstrakto prieš tai, kai jį galima analizuoti chromatografiškai. Riebalų kiekis žuvyje (mg/kg šlapios masės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskaičiuotą audinio sausų medžiagų kiekį, kad būtų galima apskaičiuoti sausų medžiagų riebalų koncentraciją. 2 REZULTATAI 2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS Bandomosios medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje žymint per sugerties bandymą gautos koncentracijos kaitą žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose audiniuose) per tam tikrą laiką. Jei kreivė pasiekė horizontaliąją dalį, t.y. pasidaro beveik asimptotiška laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BKFmb apskaičiuojamas taip: Kai nuostovioji būsena nepasiekiama, BKFmb bali būti įmanoma apskaičiuoti pagal 80 % (l,6/k2) arba 95% (3,0/k2) „nuostoviosios būsenos“ pusiausvyros, tai bus pakankamas tikslumas, reikalingas įvertinant pavojingumą. Taip pat nustatomas biokoncentravimo faktorius (BKFk) kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetinių konstantų k1/k2 santykis. Apsivalymo greičio konstanta (k2) dažniausiai nustatoma pagal apsivalymo kreivę (t.y., bandymo medžiagos žuvyje koncentracijos mažėjimo per tam tikrą laiką grafiką). Tuomet, turint k2 vertę ir Cf, kuri gaunama pagal sugerties kreivę, apskaičiuojama sugerties greičio konstanta (k1) (žr. 5 priedą). Tinkamiausias metodas BKFk ir greičio konstantoms k1 ir k2 apskaičiuoti yra netiesinių parametrų kompiuterinio vertinimo metodų taikymas

(11). Kitaip k1 ir k2 apskaičiuoti gali būti naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, turi būti taikomi sudėtingesni modeliai (žr. 3 priedo nuorodas) ir prašoma biologo-statistiko patarimo. 2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos. Aiškiai apibrėžtos sugerties ir išsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Dviem koncentracijoms nustatytų sugerties ir apsivalymo konstantų kitimas turi būti mažesnis kaip 20 %. Dviem bandymų koncentracijoms stebėti dideli sugerties ir apsivalymo greičių skirtumai turi būti registruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai, atliekant gerai planuotus tyrimus, BKF verčių pasikliovimo riba artėja prie ± 20 %. 3 ATASKAITOS PATEIKIMAS Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta tokia informacija: 3.1 BANDOMOJI MEDŽIAGA - fizinė prigimtis ir, jei reikia, fizinės ir cheminės savybės, - cheminio identifikavimo duomenys (įskaitant organinės anglies kiekį jei reikia), - jei turi radioaktyvius žymenis, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis susijusio radioaktyvumo procentinė dalis. 3.2 BANDYMŲ RŪŠYS - mokslinis pavadinimas, rūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t.t. 3.3 BANDYMŲ SĄLYGOS - taikyta bandymų metodika (pvz., pratekėjimo arba pusiau stacionariomis sąlygomis), - naudoto apšvietimo tipas ir ypatybės bei apšvietimo periodas (-ai), - bandymų schema (pvz., bandymo indų (talpų) skaičius ir dydis, vandens tūrinės apykaitos greitis, lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius tuo pat metu atliktame bandyme, atliekant bandymus taikytų koncentracijų skaičius, sugerties ir išsivalymo etapų trukmė, žuvų ir vandens bandinių ėmimo dažnis), - pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų keitimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija ir indėlis į organinės anglies kiekį bandymo vandenyje), - vardinės bandymų koncentracijos, bandymų induose nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti, - skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, bandomųjų žuvų sugebėjimo gyventi vandenyje rodymo rezultatai ir vandens ypatybės: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei reikia) ir visi kiti daryti matavimai, - vandens kokybė bandymų talpose, pH, kietumas, BOA, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija, - išsami informacija apie šėrimą (pvz., pašaro tipas, šaltinis, sudėtis, jei įmanoma bent riebalų ir baltymų kiekis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnis), -informacija apie žuvų ir vandens bandinių apdorojimą, įskaitant ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandomosios medžiagos bei riebalų (jei nustatomi) analizės metodikas (ir tikslumą). 3.4 REZULTATAI - bet kokių atliktų išankstinių tyrimų rezultatai, - kontrolinių žuvų ir žuvų kiekviename bandymų inde mirtingumas bei bet koks jų neįprastas elgesys, - riebalų kiekis žuvyje (jei nustatoma), - kreivės (įskaitant visus gautų matavimų duomenis), rodančios bandomosios medžiagos žuvų sugertį ir jų apsivalymą, laikas iki nuostoviosios būsenos, - Cf ir Cw (ir jų standartinis nuokrypis bei intervalas, jei tinka) visiems bandinio ėmimo atvejams (Cf išreikšta μg/g viso kūno arba tam tikrų jo audinių, pvz., riebalų, šlapios masės (ppm), o Cw- μg/ml (ppm)). Cw vertės kontrolinėse serijose (taip pat turi būti nurodytas fonas), - nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFmb) ir (arba) kinetinis biokoncentravimo faktorius (BKFk) ir, jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms (viskas apskaičiuota viso gyvūno kūno ir bendro riebalų kiekio, jei nustatytas, arba apibrėžtų jo audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis (kai yra) bei apskaičiavimų (duomenų analizės) metodai kiekvienai naudotos bandomosios medžiagos koncentracijai, - jei naudojamos radioaktyvius žymenis turinčios medžiagos, ir jei to reikalaujama, gali būti pateikti bet kokių aptiktų metabolitų kaupimosi rezultatai, - visa, kas bandyme buvo neįprasto, bet koks numatytų veiksmų nukrypimas ir bet kuri kita tinkama informacija. Reikia mažinti rezultatų, kurie būtų „nenustatyti aptikimo riboje“, kiekį, paruošiant parengiamąjį bandymą ir planuojant bandymus, kadangi tokie rezultatai negali būti panaudoti apskaičiuojant greičio konstantas. 4 NUORODOS

(1)Connell D.W.

(1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, 117 -156 p.

(2)Birsein S, Devillers J. and Karcher W.

(1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR ir QSAR in Environmental Research, 1, 29 – 390 p.

(3)OECD, Paris

(1996). Direct phototransformatkm of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing ir Assessment of Chemicals. No 3.

(4)Kristensen P.

(1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailabilily of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5)US EPA 822-R-94-002

(1994)Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document (or the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6)US PDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1,5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7)US EPA

(1974). Section 5, A

(1). Analysis of Human arba animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8)Compaan H.

(1980)in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aąuatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Ch. 2.3. Part H. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9)Gardner et al. (199.5). Limn. & Oceanogr. 30, 1099 – 1105 p.

(10)Randall R. C, Lee H., Ozretich R.J., Lake J. L. and Pruell R.J.

(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, 1431 – 1436 p.

(11)CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method, Ring Test Programme. 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholni.

(12)ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 1 priedas Skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės Medžiaga Didžiausia leistina koncentracija 1 Kietosios dalelės 5 mg/l 2 Bendroji organinė anglis 2 mg/l 3 Nejonizuotas amoniakas 1 μg/l 4 Liekamasis chloras 1 μg/l 5 Bendras fosforoorganinių pesticidų kiekis 50 ng/1 6 Bendras chlororganinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis 50 ng/l 7 Bendras organinis chloras 25 ng/l 8 Aliuminis 1 μg/l 9 Arsenas 1 μg/l 10 Chromas 1 μg/l 11 Kobaltas 1 μg/l 12 Varis 1 μg/l 13 Geležis 1 μg/l 14 Švinas 1 μg/l 15 Nikelis 1 μg/l 16 Cinkas 1 μg/l 17 Kadmis 100 ng/l 18 Gyvsidabris 100 ng/l 19 Sidabras 100 ng/l 2 priedas Bandyti rekomenduotos žuvų rūšys Rekomenduojamos rūšys Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendrasis kūno ilgis, cm 1 Zebrinė danija (Danio rerio (')) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) 20-25 3,0 ± 0,5 2 Rainė (Pimephales promelas) (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesąue) (Phoxinus phoxinus) 20-25 5,0 ±2,0 3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus) Paprastasis karpis 20-25 5,0 ± 3,0 4 Japoninė medaka (Oryzias latipes) (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck ir Schlegel) 20-25 4,0 ±1,0 5 Vaivorykštinis gupis (Poecilia reticulata) (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupi 20-25 3,0 ±1,0 6 Melsvažiaunis saulešeris (Lepomis macrochirus) (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesąue) 20-25 5,0 ±2,0 7 Margasis upėtakis (Onchorhynchus mykiss) (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) 13-17 8.0 ± 4,0 8 Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus) (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) 18-20 3,0 ±1,0 (')Me yer A, Orti G.

(1993)Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231. Skirtingose šalyse buvo naudojamos įvairios upių žiočių ir jūros žuvų rūšys, pvz., Spotas (Leiostomus xanthuru); Margoji lėlžuvė (Cyprinodon variegatus); Priekrančių menidija (Menidia beryllind); Gyvavedis šaineris (Cymatogaster aggregata); Plekšnė (Parophrys vertulus); Siauragalvė plernė (Leptocottus armatus); Trispyglė dyglė (Gasterosteus aculeatus); Jūros ešerys (Dicentracus labrax); Aukšlė (Albumus albumus). Parinkimas Lentelėje nurodytas gėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus, tuo tarpu galimybė gauti jūros ir upių žiočių žuvų iš dalies ribota atitinkamoms šalimis. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijose, ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandomieji gyvūnai būtų sveiki, ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų. 3 priedas Sugerties ir apsivalymo etapų trukmės prognozavimas 1 Sugerties etapo trukmės prognozavimas Prieš atliekant bandymą, k2 įvertis, taigi nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, gali būti gauta iš empirinių k2 ir n-oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficiento (Pow) arba k2 priklausomybių ir tirpumo vandenyje (s). Įvertis k2 (para-1) gali būti gautas, pvz., pagal tokią empirinę priklausomybę

(1): logk2 = -0,414 log10(P“w) + 1,47 (r2 = 0,95) (1 lygtis) Kitos priklausomybės pateiktos 2 nuorodoje. Jei pasiskirstymo koeficientas (Pow) nežinomas, įvertis gali būti atliktas

(3), jei žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (s), taikant lygtį: log10(Pow) = 0,862 logl0(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (2 lygtis) kurioje s = tirpumas (mol/l): (n – 36). Šios priklausomybės tinka tik toms cheminėms medžiagoms, kurių log (Pow) vertės yra nuo 2 iki 6,5

(4). Nuostoviajai būsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentinė dalis, taikant k2 įvertį, gali būti nustatyta iš bendrosios kinetinės lygties, aprašančios sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika): arba jei Cw yra pastovus dydis: Artėjant prie nuostoviosios būsenos (t →∞), 3 lygtis gali būti supaprastinta

(6)iki: Tokiu atveju, k1/k2 x Cw yra arti koncentracijos žuvyje „nuostoviosios būsenos“ sąlygomis (Cf,s). 3 lygtis gali būti pertvarkyta į: arba (4 lygtis) Taikant 4 lygtį, galima prognozuoti laiką, reikalingą pasiekti tam tikrą nuostoviosios būsenos procentinę dalį, kai pagal 1 arba 2 lygtį iš anksto yra įvertinta k2. Statistiškai priimtiniems duomenims (BKFk) gauti, statistiškai optimalios sugerties etapo trukmės atskaitos tašku laikomas laikas, per kurį kreivė, vaizduojanti priklausomybę tarp bandymų medžiagos žuvyje koncentracijos logaritmo ir tiesinėje skalėje atidėto laiko, pasiektų jos vidurio tašką arba l,6/k2, arba 80 % nuostoviosios būsenos, tačiau ne didesnis kaip 3,0/k2, arba 95 % nuostoviosios būsenos

(7). Laikas 80% nuostoviosios būsenos pasiekti (4 lygtis)yra lygus: arba (5 lygtis) k2 Panašiu būdu laikas, reikalingas pasiekti 95 % nuostoviosios būsenos, yra lygus: (6 lygtis) Pvz., sugerties etapo trukmė (sug) bandymų medžiagai, kurios log10(Pow) = 4, būtų (taikant lygtis 1, 5 ir 6): log10k2 = -0,414 x

(4)+ 1,47 k2 = 0,652 paros-1 sug (80%) = 1,6/0,652, t.y. 2,45 paros (59 valandos) arba sug (95%) = 3,0/0,652, t.y. 4,60 paros (110 valandų) Panašiai, jei bandymų medžiagos s= 10-5 mol/l (log(s) =-5,0), sug trukmė būtų (taikant lygtis 1,2, 5 ir 6): log10 (Pow) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 =-0,414 (5,02)+ 1,47 k2 = 0,246 paros-1 sug (80%) = 1.6/0,246, t.y. 6,5 paros (156 valandos) arba sug (95 %) = 3.0/0,246, t.y. 12,2 paros (293 valandos) Kaip alternatyva, lygtis: Teq = 6,54 x 10-3 Pow + 55,31 (valandos) gali būti taikoma apskaičiuoti laiką, reikalingą pasiekti tikrąją nuostoviąją būseną

(4). 2 APSIVALYMO ETAPO TRUKMĖS PROGNOZAVIMAS Laikas, per kurį organizme sulaikytos medžiagos kiekis sumažėja iki tam tikros pradinės koncentracijos procentinės dalies, taip pat gali būti prognozuojamas, taikant bendrąja lygtį kuri aprašo sugertį ir apsivalymą (pirmojo laipsnio kinetika)

(8). Apsivalymo etapo atveju daroma prielaida, kad Cw lygi nuliui. Lygtis gali būti redukuota į lygtį: arba, kurioje Cf,o yra koncentracija apsivalymo etapo pradžioje. Tuomet 50 % apsivalymas bus pasiektas per laiką (t50): Panašiai 95 % apsivalymas bus pasiektas per laiką: Jei pirmajam periodui taikoma sugerties trukmė sudaro 80 % (l,6/k2), o per apsivalymo etapą sumažėjimas sudaro 95 % (3,0/k2), tuomet apsivalymo etapas trunka maždaug du kartus ilgiau už sugerties etapą. Svarbu pažymėti, kad įverčiai remiasi prielaida, jog sugerties ir apsivalymo modeliai atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (pvz.,

(1)nuoroda). Nuorodos (3 priedo)

(1)Spacie A. and Hamelink J. L.

(1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, 309-320 p.

(2)Kristensen P.

(1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3)ChiouC.T. and Schmedding D.W.

(1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16

(1), 4- 10 p.

(4)Hawker D.W. and Connell D.W.

(1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentralion kinetics withfish. Wat. Res. 22

(6), 701-707 p.

(5)Branson D. R, Blau G. E, Alexander H.C. and Neely W. B.

(1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104

(4), 785 – 792 p.

(6)Ernst W.

(1985). Accumulation in Aąuatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte P., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4,243 – 255 p. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons LtdN.Y.

(7)Reilly P.M, Bajraniovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhotf M.W.

(1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55. 614 – 622 p.

(8)Konemann H. and .Van Leeuwen K.

(1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemnsinherp 9 3 – 19 p. 4 priedas Bandinių ėmimo teorinis grafiko pavyzdys, tiriant medžiagų, kurių log (Pow) = 4, biologini koncentravimą Bandinių ėmimo tvarkaraštis Žuvų bandinių ėmimas Mažiausias reikalingas dažnis (paros) Papildomas bandinių ėmimas Vandens bandinių skaičius Žuvų skaičius bandinyje Sugerties etapas -1 0 2(*) 2 45-80 žuvų 1-asis 0,3 0,4 2

(2)4

(4)2-asis 0,6 0,9 2

(2)4

(4)3-iasis 1,2 1,7 2

(2)4

(4)4-asis 2,4 3,3 2

(2)4

(4)5-asis Apsivalymo etapas 4,7 2 6 Žuvų pernešimas į vandenį be bandymo medžiagos 6-asis 5,0 5,3 4

(4)7-asis 5,9 7,0 4

(4)8-asis 9,3 11,2 4

(4)9-asis 14,0 17,5 6

(4)(*) Vandens bandinys imamas po to, kai buvo pateikti mažiausiai trys „indo tūriai“. Vertės skliausteliuose rodo bandinių (vandens, žuvų) skaičių, kurį reikia paimti, jei bandiniai papildomai imami. NB: Prieš bandymą darytas k2 įvertis, kai log (Pow) = 4,0, yra 0,652 paros-

1. Bendra bandymo trukmė nustatyta 3 x sug = 3 x 4,6 paros, t.y. 14 parų. Kaip vertinti „sug“, žr. 3 priedą. 5 priedas Modelio pasirinkimas Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenys „pakankamai“ gerai aprašomi paprasto dviejų indų ir dviejų parametrų modelio (tai matyti ištiesintoje kreivėje, kuri priartina žuvies apsivalymo etapo koncentracijos taškus, kai jie vaizduojami pusiau logaritminiame popieriuje. (Jei šie taškai negali būti aprašyti ištiesinta kreive, tuomet reikia naudoti sudėtingesnius modelius, žr., pvz., Spacie and Hanwhnk, 3 priedo 1 nuoroda). Grafinis metodas apsivalymo (išnykimo) greičio konstantai k2 nustatyti Pusiau logaritminiame popieriuje nubraižomas kiekviename žuvies bandinyje rastos bandymo medžiagos koncentracijos kitimo ir laiko grafikas. Šios tiesės krypties koeficientas yra k
2. Atkreipkite dėmesį, kad nukrypimai nuo tiesės gali reikšti, kad apsivalymo modelis yra sudėtingesnis už pirmojo laipsnio kinetiką. Norint spręsti apie tai, ar apsivalymo tipas nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos, galima taikyti grafinį metodą. Grafinis metodas, nustatant sugerties greičio konstantą k. Duotai k2 vertei k1 apskaičiuojamas taip: (1 lygtis) Cf vertė yra gautosios sugerties glaudžiusios kreivės duomenų vidurio taškas. Kreivė vaizduoja koncentracijos logaritmo kitimą per tam tikrą laiką (aritmetinėje skalėje). Kompiuteriniai metodai sugerties ir apsivalymo (išnykimo) greičio konstantoms apskaičiuoti Geriausias būdas yra taikyti kompiuterinius netiesinių parametrų vertinimo metodus biologinio koncentravimo faktorių ir kj bei k2 greičio konstantoms apskaičiuoti. Jei duota koncentracijos kitimo laike duomenų aibė ir modelis, šios programos apskaičiuoja k] ir k2 vertes: (2lygtis) (3 lygtis) čia: tc = sugerties etapo pabaigos laikas. Šis metodas duoda k1 ir k2 standartinio nuokrypio įverčius. Didesnė dalis k2 atvejų pagal išsivalymo kreivę gali būti įvertinta pakankamai tiksliai. Tarp dviejų parametrų, k1 ir k2, jei juos vertintume kartu, yra stipri koreliacija. Galima būtų patarti iš pradžių tik pagal išsivalymo duomenis apskaičiuoti k2, o vėliau pagal sugerties duomenis ir taikant netiesinę regresiją apskaičiuoti k
3. ŽUVŲ MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS (C.14.)
4. METODAS Šis toksiškumo augimui bandymo metodas yra OECD TG 215

(2000)kopija. 1.1 ĮVADAS Sis bandymas skirtas įvertinti cheminių medžiagų ilgo veikimo įtaką žuvų mailiaus augimui. Jis pagrįstas Europos Sąjungoje sukurtu ir tarplaboratoriniais bandymais patikrintu

(3)dinaminiu metodu, taikytu įvertinti cheminių medžiagų poveikius vaivorykštinio upėtakio (Oncorynchus mykiss) mailiaus augimui. Galima naudoti kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis. Pvz., įgyta patyrimo, atliekant zebrinės danijos (Danio rerio)

(5)ir japoninės medakos (Oryzias latipes)

(8)augimo bandymus. 1.2 APIBRĖŽIMAI Mažiausioji pastebimo poveikio koncentracija, LOEC: mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis už LOEC poveikį. Nepastebimo poveikio koncentracija, NOEC: bent kiek už LOEC mažesnė bandomoji koncentracija. EC,: šiam bandymo metodui tai yra bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant žuvų augimo greičio pokytis lyginant su kontroliniais bandiniais yra x %. Įkrova: gyvų žuvų masė, tenkanti vandens tūrio vienetui. Žuvų tankis: žuvų skaičius, tenkantis vandens tūrio vienetui. Atskiros žuvies savitasis augimo greitis: išreiškia atskiros žuvies augimo greitį pagal jos pradinę masę. Vidutinis savitasis augimo greitis bandymo indui: išreiškia bandymo indo populiacijos vidutinį augimo greitį vienai koncentracijai. Tariamai („Pseudo“) savitasis augimo greitis: išreiškia atskirų žuvų augimo greitį lyginant su bandymo indo populiacijos vidutine pradine mase. 1.3 BANDYMO METODO ESMĖ Eksponentinio augimo etapo žuvų mailius pasveriamas, įleidžiamas į bandymo indus, kur jis geriau dinaminio bandymo sąlygomis ar, jei neįmanoma, atitinkamomis pusiau statinio bandymo (periodinio atnaujinimo) sąlygomis yra veikiamas bandomosios medžiagos subletalios koncentracijos diapazono vandeniniais tirpalais. Bandymo trukmė 28 paros. Žuvys šeriamos kasdien. Pašaro davinys nustatomas pagal pradinę žuvų masę ir po 14 parų gali būti perskaičiuojamas iš naujo. Bandymo pabaigoje žuvys vėl sveriamos. Taikant regresijos modelį, analizuojamas poveikis augimo greičiui, norint nustatyti koncentraciją, sukeliančią x % augimo greičio pokytį, t. y. ECx (pvz., EC10, EC20 ar EC30). Be to, norint nustatyti mažiausią pastebimo poveikio koncentraciją (LOEC), taigi ir nepastebimo poveikio koncentraciją (NOEC), duomenis galima lyginti su kontrolinių bandinių vertėmis. 1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ Reikėtų turėti atlikto ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), daryto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Tai reikštų, kad bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis yra žinomi ir kad ataskaitoje yra pateiktas patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu bei aptikimo riba. Naudingą informaciją apie bandomąją medžiagą apima struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493). 1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS) Bandymas yra pagrįstas, jei išlaikytos šios sąlygos: - baigiant bandymą kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) žuvų gaištamumas turi būti ne didesnis kaip 10%, - kontrolinio (-ių) bandymo (-ų) vidutinė žuvų masė turi būti pakankamai padidėjusi, kad būtų galima aptikti mažiausią augimo greičio kitimą, kuris dar laikomas reikšmingu. Tarplaboratorinių bandymų palyginimas

(3)parodė, kad kontroliniuose bandymuose vaivorykštinio upėtakio vidutinė masė per 28 paras turi padidėti bent per pusę jo pradinės vidutinės masės (t. y. 50 %); pvz., pradinė masė: 1g/žuviai (= 100 %), galutinė masė po 28 parų: daugiau arba lygu 1,5 g/žuviai (> 150 %), - ištirpusio deguonies koncentracija per visą bandymą turi sudaryti bent 60 % oro soties vertės (OSV), - kiekvieną bandymo momentą bandymo indų vandens temperatūra neturi tarpusavyje skirtis daugiau kaip ±1°C ir būti palaikoma 2°C intervale bandymo rūšims nurodytame diapazone (1 priedas). 1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS 1.6.1 Aparatūra Be įprastos laboratorinės įrangos, reikalinga ši speciali įranga:

1. a)deguonies ir pH matuokliai;
2. b)įranga, nustatanti vandens kietumą ir šarmingumą;
3. c)darbo reikalavimus atitinkantys aparatai, kontroliuojantys temperatūrą, pirmenybę teikiant nuolatinės kontrolės aparatūrai;
4. d)indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos ir atitinkantys rekomenduotą įkrovą bei žuvų tankį (žr. 1.8.5 skirsnį ir 1 priedą);
5. e)reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ± 0,5 % tikslumo). 1.6.2 Vanduo Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame žuvys gali ilgai gyventi ir augti. Vandens kokybė turi nekisti visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,5 -8,5, tačiau atliekant konkretų bandymą jo reikšmė neturi kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Rekomenduojamas didesnis kaip 140 mg/l (skaičiuojant CaCOs) kietumas. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga), bandiniai tam tikrais laiko tarpais turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendro kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė santykinai nekinta. Jei buvo įrodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens savybės yra pateiktos 2 priede. 1.6.3 Bandomieji tirpalai Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Kartais norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, gali tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01% metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai suardomas medžiagas (pvz., acetoną) ir (
6. ar)labai lakius junginius, nes, atliekant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizuojanti medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio žuvų augimui ir neigiamo poveikio mailiui, kaip tai nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo indus tiekti dinaminių bandymų metu reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir per visą bandymą neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Tarplaboratorinio palyginimo bandymas

(3)parodė, kad, atliekant bandymą su vaivorykštiniu upėtakiu, yra priimtinas 6 litrų/g žuvies ir parai vandens keitimo dažnis (žr. 1.8.2.2 skirsnį). Pusiau statiniams (atnaujinimo) bandymams terpės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4 poskyrį) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminį bandymą. 1.6.4 Rūšių parinkimas Šiam bandymui rekomenduojama rūšis yra vaivorykštinis upėtakis (Oncorhynchus mykiss), nes naudojant šią rūšį buvo sukauptas didžiausias tarplaboratorinio palyginimo bandymų patyrimas

(3). Galima naudoti ir kitas dokumentais tinkamai patvirtintas rūšis, bet tinkamoms bandymo sąlygoms gauti gali tekti pritaikyti bandymo metodiką. Pvz., įgyta patyrimo su zebrine danija (Danio rerio)

(5)ir japonine medaka (Oryzias latipes)

(8). Taigi ataskaitoje reikia pateikti rūšies pasirinkimo priežastį ir bandymų metodą. 1.6.5 Žuvų laikymas Bandymui pasirenkamos vieno kamieno populiacijos ir geriau to paties neršto bandymo žuvys, kurios prieš bandymą bent dvi savaites buvo laikomos tokios kokybės vandenyje ir tokiomis apšvietimo sąlygomis, kurios panašios į bandymo sąlygas. Jų dienos pašaro davinys laikymo ir bandymo laikotarpiu turi sudaryti ne mažiau kaip 2 % kūno masės, bet geriau 4 % kūno masės. Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi šie kriterijai: - jei populiacijos mirtingumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 %, visa partija atmetama; - jei populiacijos mirtingumas 5-10%: žuvys papildomai aklimatizuojamos dar septynias paras; jei per kitas septynias paras mirtingumas yra didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama; - jei populiacijos mirtingumas per septyniais paras yra mažesnis kaip 5 %, partija priimama. Dvi savaites prieš bandymą ir visą bandymo laiką žuvys neturėtų būti gydomos vaistais. 1.7 BANDYMO PLANAS Bandymo planą sudaro – bandomosios koncentracijos verčių ir tarpo tarp jų parinkimas, indų kiekvienai koncentracijai ir žuvų skaičiaus viename inde parinkimas. Geriausia būtų, kad bandymo planas būtų pasirinktas atsižvelgiant į: a) tyrimo tikslą; b) taikomą statistinės analizės metodą; c) bandymų priemonių buvimą ir kainą. Jei įmanoma, aptariant tikslą reikėtų nurodyti statistinę galimybę duoto dydžio (pvz., augimo greičio) skirtumui aptikti, arba kitaip, koks turi būti EC“ (pvz., kai x = 10,20 ar 30 ir geriau ne mažesnis kaip 10) įvertinimo tikslumas. Be šito negalima tiksliai apibrėžti tyrimo apimties. Svarbu pripažinti, kad vienam statistinės analizės metodui taikytas optimalus (geriausiai panaudoja išteklius) planas nebūtinai yra optimalus kitam metodui. Taigi rekomenduotas planas LOEC ir NOEC įvertinti nebus toks pat kaip regresinei analizei rekomenduotas planas. Dėl Stephan ir Rogers

(9)svarstytų priežasčių regresinė analizė dažniausiai tinka geriau nei dispersinė analizė. Tačiau nerandant tinkamo regresijos modelio (r2 < 0,9), reikia taikyti NOEC ir LOEC įvertinimą. 1.7.1. Regresinės analizės planas Svarbūs regresijos metodu analizuojamo bandymo plano nagrinėtini klausimai yra šie:

1. a)bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC10, 20, 30 ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Poveikio koncentracijos įverčiai bus tiksliausi, kai poveikio koncentracijos bus ties bandomųjų koncentracijos verčių diapazono viduriu. Tinkamai parinkti bandomąsiams koncentracijas gali padėti iš anksto atliktas diapazono nustatymo bandymas;
2. b)norint turėti patenkinamą statistinį modelį bandymui turi būti naudojamas vienas kontrolinis rezervuaras ir penki papildomi rezervuarai, skirti skirtingoms koncentracijų vertėms. Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, be bandomosios serijos, turi būti dar vienas kontrolinis bandinys su didžiausios bandomosios koncentracijos soliubilizavimo medžiaga (žr. 1.8.3 ir 1.8.4 skirsnius);
3. c)galima naudoti tinkamą geometrinės progresijos ar logaritminę eilutę

(10)(žr. 3 priedą). Geriau naudoti logaritminę bandomųjų koncentracijų eilutę; d) jei yra daugiau kaip šeši indai, papildomi indai turi būti panaudoti lygiagretiems bandymams arba paskirstyti visam koncentracijų verčių diapazonui, tarpams tarp jų sumažinti. Abi šios priemonės vienodai tinka. 1.7.2. NOEC ir LOEC įvertinimo planas taikant dispersinę analizę Kiekvienai koncentracijos vertei gerai būtų turėti dar po vieną indą, ir statistinė analizė turėtų būti daroma atsižvelgiant į kiekvieno indo duomenis

(11). Jei nėra indų lygiagrečiam bandymui, neįmanoma atsižvelgti į kintamumą tarp indų be to kintamumo, kuris atsiranda dėl atskirų žuvų. Tačiau patyrimas parodė

(12), kad tiriamu atveju kintamumas tarp bandymo indų buvo labai mažas, lyginant su kintamumu viename inde (t. y. tarp žuvų). Taigi santykinai priimtina alternatyva yra statistinę analizę atlikti atsižvelgiant į kiekvienos žuvies tyrimus. Dažniausiai naudojamos bent penkios koncentracijų vertės, sudarančios eilutę pagal geometrinę progresiją, kurios koeficientas turėtų būti ne didesnis kaip 3,2. Kai bandymai daromi turint bandymų indus lygiagretiems bandymams, lygiagrečių kontrolinių indų skaičius, taigi ir žuvų skaičius, turi būti dvigubai didesnis negu kiekvienai bandomajai koncentracijai pasirinktas skaičius, kuris turi būti vienodas

(15). Priešingu atveju, jei indų lygiagretiems bandymams nėra, kontrolinės grupės žuvų skaičius turi būti lygus kiekvienai bandomajai koncentracijai naudojamam žuvų skaičiui. Jei dispersinė analizė (ANOVA) turi būti atliekama atsižvelgiant į bandymų indų duomenis, o ne į kiekvienos žuvies tyrimus (tam reikėtų kiekvieną žuvį paženklinti ar naudoti tariamai („pseudo“) savituosius augimo greičius (žr.2.1.2 skirsnį)), reikia turėti pakankamą indų skaičių lygiagretiems bandymams, kad būtų galima nustatyti standartinį,vienos koncentracijos bandymų indų“ nuokrypį. Vadinasi, dispersinės analizės paklaidai reikėtų turėti bent 5 laisvės laipsnius

(11). Jei daromi tik lygiagretūs kontroliniai bandymai, esama pavojaus, kad paklaidos kintamumas bus pasislinkęs, nes paklaida gali didėti didėjant tiriamo augimo greičio vidutinei vertei. Reikia tikėtis, jog augimo greitis mažėja, koncentracijai didėjant, todėl atsiranda tendencija per daug sureikšminti kintamumą. 1.8 DARBO EIGA 1.8.1 Bandymų žuvų atranka ir svėrimas Svarbu, kad žuvų masės skirtumas bandymo pradžioje būtų kuo mažesnis. Bandymams rekomenduotų skirtingų rūšių žuvų masės tinkami diapazonai yra pateikti 1 priedėlyje. Būtų geriausia, kad bandymo pradžioje visos partijos žuvų masės kitimo diapazonas būtų lygus žuvų masės aritmetiniam vidurkiui ± 10 % ir jokiu atveju nebūtų didesnis kaip 25 %. Vidutinei masei nustatyti rekomenduojama prieš bandymą pasverti žuvų ėminio dalį. Žuvys turi būti nustojamos maitinti 24 h iki bandymo pradžios. Toliau jos turi būti atsitiktinai atrenkamos. Vartojant bendrąjį anestetiką, pvz., [neutralizuotą vandeninį 100 mg/l (3 – aminobenzenkarboninės rūgšties etilesterio metansulfonato (MS 222) tirpalą, sumaišant dvi dalis natrio hidrokarbonato ir vieną dalį MS 222], žuvys turi būti atskirai pasveriamos (sausai nušluostytos) gyvų žuvų masei nustatyti 1 priede nurodytu tikslumu. Tos žuvys, kurių masė atitinka numatytą diapazoną, paliekamos ir vėliau paskirstomos į bandymų indus. Turi būti registruojama bendra kiekvieno bandymų indo gyvų žuvų masė. Anestetiko vartojimas, taip pat apdorojimas (įskaitant šluostymą ir svėrimą) žuvų mailiui gali sukelti įtampą ir jį galima sužeisti, ypač jei tai mažų žuvų rūšys. Taigi apdoroti mailių reikia ypač atsargiai ir vengti bandymų gyvūnų įtampos ir sužeidimų. Žuvys vėl sveriamos 28 bandymo parą (žr. 1.8.6 skirsnį). Tačiau, jei manoma, kad būtina perskaičiuoti pašaro davinį žuvys gali būti sveriamos 14 bandymo parą (žr. 1.8.2.3 skirsnį). Galima taikyti kitus metodus, pvz., fotografavimą, norint nustatyti žuvų dydžio pokytį pagal kurį būtų galima reguliuoti pašaro davinį. 1.8.2. Poveikio sąlygos 1.8.2.1. Trukmė Bandymo trukmė ≥ 28 paros. 1.8.2.2. Įkrova ir žuvų tankis Svarbu, kad įkrova ir žuvų tankis būtų tinkamas tiriamai žuvų rūšiai (žr. 1 priedą). Jei žuvų tankis per didelis, dėl perpildymo sukeltos įtampos mažėja augimo greitis ir žuvys gali susirgti. Jei žuvų tankis per mažas, gali atsirasti teritorinis elgesys, kuris irgi gali veikti augimą. Bet kuriuo atveju įkrova turi būti pakankamai maža, kad be aeravimo būtų palaikoma bent 60 % OSV ištirpusio deguonies koncentracija. Tarplaboratorinis bandymas

(3)parodė, kad vaivorykštiniam upėtakiui priimtina įkrova, jei 40 l vandens tūrio būtų 16 upėtakių po 3 – 5 g masės. Rekomenduojamas vandens keitimo dažnis bandymo metu yra 6 litrai/g žuvies per parą. 1.8.2.3. Šėrimas Žuvys turi būti šeriamos atitinkamu pašaru (1 priedas) ir pakankamai dažnai, kad būtų garantuotas priimtinas augimo greitis. Reikėtų stengtis išvengti mikroorganizmų dauginimosi ir vandens drumstumo. Vaivorykštiniam upėtakiui 4 % kūno masės davinys per parą turėtų atitikti šias sąlygas

(18). Paros davinys turi būti padalytas į dvi lygias dalis ir sušeriamas žuvims per du kartus darant bent penkių valandų pertrauką. Davinys nustatomas pagal kiekvieno bandymų indo bendrą pradinę žuvų masę. Jei žuvys 14 parą sveriamos papildomai, davinys perskaičiuojamas. Prieš sveriant, žuvys turi būti nemaitintos 24 h. Nesuėstas pašaras ir išmatos iš bandymų indų turi būti pašalinami kasdien, rūpestingai išsiurbiant kiekvieno indo dugną. 1.8.2.4. Šviesa ir temperatūra Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (1 priedas). 1.8.3. Bandomosios medžiagos koncentracijos Dažniausiai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, neatsižvelgiant į bandymo planą (žr. 1.7.2 skirsnį). Ankstesnės žinios apie bandomosios medžiagos toksiškumą (pvz., ūmaus toksiškumo bandymo ir (

1. ar)koncentracijų diapazono nustatymo tyrimo duomenys) turėtų padėti renkantis tinkamas bandomąsias koncentracijas. Sprendimą naudoti mažiau kaip penkias koncentracijas reikia pagrįsti. Didžiausia bandoma koncentracija turi būti ne didesnė už medžiagos tirpumo vandenyje ribinę koncentraciją. Kad pradinį tirpalą būtų lengviau paruošti, gali būti naudojama soliubilizuojanti medžiaga, o jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l. Geriau būtų, jei ji visuose bandymų induose būtų vienoda (žr. 1.6.3 skirsnį). Reikėtų kiek įmanoma stengtis vengti naudoti šias medžiagas. 1.8.4. Kontroliniai bandymai Skiedimo vandens kontrolinių bandinių skaičius priklauso nuo bandymo plano (žr. 1.7 – 1.7.2). Jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, į bandymo planą turi būti įtrauktas toks soliubilizavimo medžiagos kontrolinių bandinių skaičius, kiek yra skiedimo vandens kontrolinių bandinių. 1.8.5. Kiekybės analizių ir matavimų dažnis Atliekant bandymą bandomosios medžiagos koncentracijų vertės nustatomos reguliariais tarpais (žr. toliau). Atliekant dinaminius bandymus, skiediklio ir toksiškos medžiagos pradinio tirpalo srautai turi būti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, geriau kasdien, ir visą bandymą neturi kisti daugiau kaip 10 %. Jei tikimasi, kad bandomosios medžiagos koncentracijos vertės bus lygios vardinei koncentracijai ± 20 % (t. y. 80 -120 %; žr. 1.6.2 ir 1.6.3 skirsnius), rekomenduojama atlikti bent didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos analizę bandymo pradžioje, o vėliau kas savaitę. Jei atliekant bandymus nesitikima, kad bandomosios medžiagos koncentracija gali likti vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (pagal bandomosios medžiagos stabilumo duomenis), būtina atlikti visų bandomųjų koncentracijų analizę, bet pagal tą patį grafiką. Jei tikimasi, kad, atliekant pusiau statinius (atnaujinimo) bandymus, bandomosios medžiagos koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, rekomenduojama atlikti bent didžiausios ir mažiausios bandomosios koncentracijos analizę iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą tyrimo pradžioje ir kas savaitę vėliau. Jei tai bandymai, kuriuos atliekant nemanoma, kad koncentracija liks vardinės koncentracijos ± 20 % vertės, turi būti išmatuotos visos koncentracijos vertės laikantis to paties kaip ir stabilioms medžiagoms analizės režimo. Rekomenduojama rezultatus pateikti remiantis išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma vardinės koncentracijos ± 20 % vertės ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės, rezultatai gali būti pateikiami remiantis vardine ar išmatuota vertėmis. Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., pro 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Rekomenduojamas metodas – centrifugavimas. Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neabsorbuoja, tinkamas būtų ir filtravimas. Atliekant bandymą visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandymų ir indo su didžiausios koncentracijos bandymu bendras kietumas, šarmingumas ir druskingumas (jei reikia). Ištirpusio deguonies koncentracija ir druskingumas (jei reikia) turi būti matuojami mažiausiai tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Darant pusiau statinius bandymus, ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, ar bent kartą per savaitę. Atliekant statinius bandymus su atnaujinimu, pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, o atliekant dinaminius bandymus – bent kartą per savaitę. Vandens kietumas ir šarmingumas atliekant kiekvieną bandymą matuojami vieną kartą. Temperatūrą bent viename bandymų inde reikėtų kontroliuoti nuolat. 1.8.6. Stebėjimai Masė. Baigiant bandymą visos gyvos žuvys turi būti pasvertos, norint nustatyti gyvų žuvų grupių (sausai nušluostytų filtro popieriumi) masę, imant duomenis pagal bandymų indus ar atskirai kiekvienos žuvies. Geriau yra sverti bendrai bandymų indus, nes, sveriant kiekvieną žuvį, jas reikėtų atskirai ženklinti. Nustatant atskirų žuvų masę kiekvienos žuvies savitajam augimo greičiui nustatyti, pasirinktoji ženklinimo metodika gyvūnams neturi kelti įtampos (gali tikti žuvų ženklinimo užsaldant alternatyvos, pvz., plonas spalvotas valas). Žuvys visą bandymo laiką turi būti kasdien apžiūrimos ir turi būti pažymimos bet kokios išorės anomalijos (pvz., kraujavimas, spalvos pakeitimas) bei neįprastas elgesys. Visi gaištamumo atvejai turi būti registruojami, o negyvos žuvys kuo greičiau pašalinamos. Jei įkrova ir žuvų tankis yra pakankami, negyvos žuvys kitomis nekeičiamos, kad būtų išvengta poveikio augimui dėl vienam bandymų indui tenkančio žuvų skaičiaus kitimo. Tačiau šėrimo davinį reikia koreguoti. 2 DUOMENYS IR ATASKAITA 2.1 REZULTATŲ APDOROJIMAS Rekomenduojama, kad, planuojant ir analizuojant bandymo planą, dalyvautų statistikas, nes šis bandymo metodas leidžia keisti eksperimento planą, pvz., bandymo indų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, žuvų skaičių ir t. t. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių nurodymų dėl statistinės tyrimo eigos čia nepateikiama. Augimo greitis neturėtų būti apskaičiuojamas bandymų indams, jei gaištamumas juose didesnis kaip 10 %. Tačiau gaištamumas turi būti nurodytas visoms bandomosioms koncentracijoms. Koks metodas bebūtų taikomas duomenims analizuoti, pagrindinė sąvoka yra savitasis augimo greitis r tarp laiko ti ir t2. Jis gali būti nustatytas keliais būdais pagal tai, ar žuvys yra ženklinamos atskirai ar ne, arba pagal tai, ar reikia nustatyti bandymo indui vidutinį greitį. čia: r1 = atskiros žuvies savitasis augimo greitis, r2 = vidutinis savitasis augimo greitis rezervuare, r3 = tariamai „pseudo“ savitasis augimo greitis, w1, w2 = konkrečios žuvies masė, atitinkamai, laiku t1 ir t2, loge w1 = atskiros žuvies masės tyrimo pradžioje logaritmas, loge w2 = atskiros žuvies masės tyrimo pabaigoje logaritmas, logew, = tyrimo pradžioje nustatytos rezervuaro žuvų masės w1 logaritmų verčių vidurkis, loge w2 = tyrimo pabaigoje nustatytos rezervuaro žuvų masės w2 logaritmų verčių vidurkis, t1, t2 = tyrimo laikotarpio pradžios ir pabaigos laikas (paros), r1, r2, r3 gali būti apskaičiuoti 0-28 parų laikotarpiui ir, jei tinka (t. y. kai buvo matuojama 14 parą), 0-14 ir 14-28 parų laikotarpiams. 2.1.1 Rezultatų analizė, taikant regresiją (koncentracijos ir atsako santykio modeliavimas) Šis analizės metodas nustato atitinkamą savitojo augimo greičio ir koncentracijos matematiškai išreiškiamą santykį taigi leidžia įvertinti EC“, t. y. kiekvieną reikiamą EC vertę. Taikant šį metodą, r vertės (
2. n)atskirai žuviai apskaičiuoti nebūtina, ir analizė gali būti pagrįsta vidutine bandymo indo (r2) r verte. Šiam metodui taikoma pirmenybė. Jis taip pat tinkamesnis naudojant mažiausių žuvų rūšis. Norint ištirti koncentracijos ir atsako santykį, vidutiniai savitieji augimo greičiai bandymo indui (r2) turi būti išreiškiami grafiškai, kaip koncentracijos funkcija. Santykiui tarp r2 ir koncentracijos išreikšti turi būti pasirinktas atitinkamas modelis ir jo pasirinkimas turi būti atitinkamai pagrįstas. Jei kiekviename bandymo inde likusių gyvų žuvų skaičius yra nevienodas, modelio pritaikymo procese, paprastame ar netiesiniame, reikėtų naudoti svorinius koeficientus, taip atsižvelgiant į nevienodą grupių dydį. Modelio pritaikymo metodas turi leisti įvertinti, pvz., EC20 ir nustatyti jos sklaidą (standartinę paklaidą ar pasikliovimo intervalą). Pritaikyto modelio grafikas turėtų būti parodytas lyginant su duomenimis, kad būtų galima įvertinti pritaikyto modelio atitikimą

(21). 2.1.2 Rezultatų analizė LOEC įvertinti Jei atliekant bandymą kiekvienai iš visų koncentracijų verčių yra po keletą indų lygiagretiems pakartojimams, LOEC įvertinimas gali būti grindžiamas vidutinio savitojo augimo greičio bandymo indui dispersine analize (ANOVA) (žr. 2.1 poskyrį). Vėliau taikomas tinkamas metodas (pvz., Dunnett ar Williams kriterijus

(22), kuriuo kiekvienos koncentracijos vidutinė r vertė lyginama su kontrolinių bandinių vidutine r verte. Tai daroma, norint nustatyti mažiausią koncentraciją, kuriai šis skirtumas yra reikšmingas, esant 0,05 kriterijaus reikšmingumo lygmeniui. Jei parametriniams metodams reikiamos hipotezės (nenormalus pasiskirstymas (pvz., Shapiro-Wilk kriterijus) ar heterogeninė sklaida (Bartlett kriterijus)) nepasitvirtina, reikėtų numatyti duomenų pertvarkymą sklaidoms homogenizuoti prieš atliekant dispersine analizę ar atlikti svorinę dispersine analizę. Jei, atliekant bandymą, lygiagretiems pakartojimams atlikti reikalingų indų yra ne visoms koncentracijos vertėms, bandymo indais pagrįsta dispersine analizė bus netiksli ar neįmanoma. Šiuo atveju yra priimtinas kompromisas dispersinei analizei panaudoti kiekvienos žuvies „pseudo“ savitąjį augimo greitį r3. Toliau vidutinė r3 vertė kiekvienai koncentracijai gali būti lyginama su vidutine r3 verte kontroliniams bandymams. Tuomet LOEC gali būti nustatytas taip, kaip buvo daryta pirmiau. Būtina pripažinti, kad šis metodas neatsižvelgia į kintamumą tarp bandymo indų, išskyrus kintamumą tarp atskirų žuvų, ir šiuo požiūriu nesuteikia jokios apsaugos. Tačiau patyrimas parodė

(9), kad kintamumas tarp bandymo indų buvo labai mažas lyginant su kintamumu konkrečiame inde (t.y. tarp žuvų). Jei į analizę neįtraukiami kiekvienos žuvies duomenys, būtina numatyti išskirčių identifikavimo metodą ir pagrįsti jo taikymą. 2.2 REZULTATŲ AIŠKINIMAS Rezultatai turi būti aiškinami atsargiai, jei išmatuotos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos arba, jei atliekant pusiau statinius bandymus, bandomosios medžiagos tirpalo prieš atnaujinimą koncentracija yra mažesnė kaip šviežiai paruošto tirpalo koncentracija. 2.3 BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija: 2.3.1 Bandomoji medžiaga: - fizinė būsena ir atitinkamos fizinės ir cheminės savybės, - cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą, ir, jei reikia, analizės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti. 2.3.2 Bandomieji gyvūnai - mokslinis pavadinimas, gali būti, - veislė, dydis, tiekėjas, bet kokie prieš tai buvę poveikiai, priežiūra ir 1.1. 2.3.3 Bandymo sąlygos: - taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar su atnaujinimu, dinaminis, įkrova, žuvų tankis ir 1.1, - bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius, bandomosios koncentracijos ir lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius viename inde), - pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizuojanti medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija), - vardinės bandymo koncentracijos, bandymų induose nustatytų analizės būdu koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei nustatymo metodas ir įrodymai, kad buvo atliekami tikrųjų bandomosios medžiagos tirpalų koncentracijų matavimai, - skiedimo vandens savybės: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei matuota) ir visi kiti atlikti matavimai, - vandens kokybė bandymų induose: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija, - išsami informacija apie šėrimą (pvz., davinio rūšis (-ys), šaltinis, duodamas kiekis ir šėrimo dažnumas). 2.3.4 Rezultatai: - kontrolinių bandymų atitikimo pagrįstumo kriterijams duomenys ir duomenys apie gaištamumą visose bandomosiose koncentracijose, - taikytos statistinės analizės metodikos, statistika, pagrįsta lygiagrečiais bandymų indais ar žuvimis, duomenų apdorojimas ir naudotų metodikų pagrindimas, - lentelėse pateikti 0,14 (jei matuota) ir 28 parų atskirų žuvų ir vidutinės žuvų masės duomenys bandymo indui ar tariamai „pseudo“ savitojo augimo greičio (jei reikia) vertės 0-28 parų laikotarpiu ar galbūt 0 – 14 ir 14 – 28 parų laikotarpiu, - statistinės analizės (t. y. regresinės analizės ar dispersinės analizės) rezultatai, geriau , kad tai būtų lentelės ir grafikai, LOEC (p = 0,05) bei NOEC ar ECX vertės, nurodant, kai įmanoma, atitinkamas standartines paklaidas, - visi pasitaikantys žuvų neįprasto elgesio atvejai ir visos matomos bandomosios medžiagos poveikio pasekmės. 3 NUORODOS 1) Solbe J. F. de LG

(1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UKRing Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2. 2) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G.

(1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231 – 236 p. 3) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J.

(1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. 4) Crossland N. O.

(1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, 1855 – 1870 p. 5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Hofte B. B.

(1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, 157 – 164 p. 6) Yamamoto, Tokio.

(1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan. 7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D.

(1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28,287 – 297 p. 8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L.

(1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota. 9) Stephan C. E. and Rogers J. W.

(1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia,328-338p. 10) Environment Canada

(1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 p. 11) Cox D. R.

(1958). Planning of experiments. Wiley Edt. 12) Pack S.

(1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10—12 December 1991. 13) Dunnett C. W.

(1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control J. Amer. Statist. Assoc, 50, 1096 – 1121 p. 14) Dunnett C. W.

(1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20,482 — 491 p. 15) Williams D. A.

(1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103 – 117 p. 16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T.

(1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, 123 – 133 p. 17) Quinton, J. C. and Blake, R. W.

(1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, 33 – 41 p. 18) Post, G.

(1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 p. 19) Bruce, R. D. and Versteeg D. J.

(1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1485 – 1494 P- 20) De Graeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O.

(1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA. 21) Norbert-King T. J.

(1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assessment Center. Sept. 1988.12 p. 22) Williams D. A.

(1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28,510 —531 p. 1 priedas BANDYMAMS REKOMENDUOJAMOS ŽUVŲ RŪŠYS IR TINKAMOS BANDYMO SĄLYGOS Rūšys Rekomenduojamas bandymo temperatūros diapazonas (°C) Apšvietimo trukmė (valandos) Rekomenduojamas žuvų pradinės masės diapazonas (

1. g)Būtinas matavimo tikslumas Įkrova (g/
2. l)Gyvūnų tankis (litrui) Maistas Bandymo trukmė (paros) Rekomenduojamos rūšys: Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis 12,5-16,0 12-16 1-5 100 mg tikslumu 1,2-2,0 4 Sausas firminis lašišinių mailių maistas ≥28 Kitos dokumentais tinkamai patvirtintos rūšys: Danio rerio Zebrinė danija 21-25 12-16 0,050-0,100 1 mg tikslumu 0,2-1,0 5-10 Gyvas maistas {Brachionus Artemid) ≥28 Oryzias latipes Japoninė medaka 21-25 12-16 0,050-0,100 1 mg tikslumu 0,2-1,0 5-20 Gyvas maistas (Brachionus Artemid) ≥28 2 Priedas KAI KURIOS SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS SAVYBĖS Medžiaga Koncentracija Kietosios dalelės < 20 mg/l Bendra organinė anglis < 2 mg/l Nejonizuotas amoniakas <1 μg/l Liekamasis chloras < 10 μg/l Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis < 50 ng/l Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintų difenilų kiekis < 50 ng/l Bendras organinis chloras < 25 ng/l 3 Priedas TOKSIŠKUMO BANDYMUI TINKAMŲ KONCENTRACIJŲ LOGARITMINĖ EILUTĖ

(9)Stulpelis (koncentracijų tarp 100 ir 10 ar tarp 10 ir 1 skaičius)1 1 2 3 4 5 6 7 100 100 100 100 100 100 100 32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 1,4 2,4 1,0 1,8 1,3 1,0 1 Stulpelyje galima pasirinkti penkių (ar daugiau) viena po kitos einančių koncentracijų eilutę. Stulpelio (x) koncentracijų vidurio taškai randami stulpelyje (2x +1). Sąraše nurodytos vertės gali būti išreikštos procentine tūrio dalimi ar masės koncentracija (mg/l ar μg/1). Vertės gali būti padaugintos ar padalytos iš 10, pakelto bet kuriuo tinkamu laipsniu. 1 stulpelį galima būtų naudoti, jei toksiškumo lygio neapibrėžtis yra didelė. ŽUVYS, TRUMPALAIKIS TOKSIŠKUMO EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMAS (C.15.) 1 METODAS Šis trumpalaikio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 212

(1998)kopija. 1.1 ĮVADAS Šis trumpalaikio toksiškumo žuvų embrionams ir mailiui su trynio maišeliu bandymas yra trumpalaikis. Ką tik apvaisinti žuvų ikrai yra veikiami nuo jų apvaisinimo iki mailiaus su trynio maišeliu stadijos pabaigos. Toksiškumo bandymas embrionui ir mailiui su trynio maišeliu atliekamas be šėrimo, bandymas turi būti baigtas, kol mailius dar maitinamas iš trynio maišelio. Bandymo tikslas – nustatyti cheminių medžiagų letalaus ir mažesnio subletalaus poveikio specifinėms vystymosi stadijoms ir bandytai rūšiai pasekmes. Šis bandymas turėtų suteikti vertingos informacijos, nes jis

1. a)galėtų būti letalumo ir subletalumo bandymų jungtimi,
2. b)galėtų būti taikomas kaip atrankos bandymas, numatant visą pradinės gyvenimo stadijos bandymą ar chroniško toksiškumo bandymus ir
3. c)galėtų būti taikomas bandyti rūšis, kurių auginimo metodai dar nėra taip gerai parengti, kad aprėptų perėjimo etapą iš endogeninio į egzogeninį maitinimą. Žinotina, kad tik visas žuvies gyvenimo ciklo stadijas apimantys bandymai gali duoti tikslų chroniško toksiškumo žuvims įvertį ir kad bent kiek sutrumpinus veikimą, neįtraukiant kurios nors gyvenimo stadijos, gali sumažėti jautrumas, taigi gali būti nepakankamai įvertintas chroniškas toksiškumas. Todėl manoma, kad embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymas turėtų būti ne toks jautrus kaip visas pradinio gyvenimo stadijų bandymas, ypač labai lipofiliškų cheminių medžiagų (log Pow > 4) ir specifinio toksiško veikimo cheminių medžiagų atvejais. Tačiau mažesnių jautrumo skirtumų tarp šių dviejų bandymų reikėtų tikėtis bandant nespecifinio, narkotinio veikimo tipo chemines medžiagas

(1). Dar prieš šio bandymo paskelbimą daugiausia patyrimo, atliekant embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymą, buvo sukaupta su gėlavandenėmis žuvimis – zebrinėmis danijomis (Danio rerio) Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – įprastas pavadinimas danija). Todėl smulkesnių nurodymų, kaip atlikti bandymą, naudojant šią žuvų rūšį, pateikta 1 priede. Tačiau tai netrukdo naudoti kitas rūšis, su kuriomis taip pat yra sukaupta patyrimo (IA ir IB lentelės). 1.2 APIBRĖŽIMAI Mažiausia pastebimo poveikio koncentracija LOEC. Mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontroliniais bandiniais (kai p<0,05). Tačiau visų didesnių kaip LOEC bandomųjų koncentracijų kenksmingas poveikis turi būti lygus ar didesnis kaip LOEC poveikis. Nepastebimo poveikio koncentracija NOEC. Bent kiek už LOEC mažesnė bandomosios medžiagos koncentracija. 1.3 BANDYMO ESMĖ Embrionų ir mailiaus su trynio maišeliu augimo stadijų žuvys veikiamos vandeniniais įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpalais. Bandymo protokolas leidžia pasirinkti pusiau statinį ar dinaminį bandymą. Pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos prigimties. Bandymas pradedamas sudėjus apvaisintus ikrus į bandymo indus ir baigiamas prieš pat tą momentą, kai kuriame nors inde lervos trynio maišelis yra visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradeda gaišti kontrolinių bandymų lervos. Įvertinamos letalios ir subletalios poveikio pasekmės. Jos lyginamos su kontrolinėmis vertėmis mažiausiai pastebimo poveikio koncentracijai, taigi ir nestebimo poveikio koncentracijai nustatyti. Kitaip poveikiai gali būti analizuojami, taikant regresijos modelį ir siekiant nustatyti koncentraciją, kuri sukeltų x % pokytį (t. y., LC/ECX, čia x yra tam tikras % išreikštas poveikis). 1.4 INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ MEDŽIAGĄ Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. „Ūminis toksinis poveikis žuvims“, Žin., 2002, Nr. 81-3493), geriau atlikto su šiam bandymui pasirinkta rūšimi, rezultatus. Rezultatai gali būti naudingi, tiriant ankstyvuosius gyvenimo etapus, pasirenkant atitinkamą bandomųjų koncentracijų diapazoną. Turi būti žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (įskaitant tirpumą bandymo vandenyje) ir bandomosios medžiagos garų slėgis. Turi būti patikimas metodas nustatyti ištirpintos bandomosios medžiagos kiekį žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje. Informacija apie bandomąją medžiagą, vertinga bandymo sąlygoms nustatyti, yra struktūrinė formulė, medžiagos grynumas, stabilumas veikiant šviesai, stabilumas bandymo sąlygomis, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidomumo bandymo rezultatai (žr. „„Lengvo“ biologinio skaidomumo nustatymas“, Žin., 2002, Nr. 81-3493). 1.5 BANDYMO PAGRĮSTUMAS (PATIKIMUMAS) Bandymo pagrįstumui (patikimumui), turi būti įvykdytos šios sąlygos: - bendras apvaisintų ikrų išgyvenamumas kontroliniuose bandiniuose ir, jei reikia, induose vien tik su tirpikliu turi būti didesnis arba lygus ribinėms vertėms, apibrėžtoms 2 ir 3 prieduose, - ištirpusio deguonies koncentracija visą bandymą turi sudaryti 60 % – 100 % oro soties vertės (OSV), - kiekvieną bandymo momentą temperatūros verčių (ir bandymo induose, ir skirtingomis bandymo dienomis) skirtumas neturi būti didesnis kaip ±1,5 °C, o temperatūra turėtų būti palaikoma bandymo rūšims nurodyto diapazono (2 ir 3 priedai) ribose. 1.6 BANDYMO METODO APRAŠYMAS 1.6.1. Bandymų indai Galima naudoti bet kokius stiklinius ar chemiškai inertiškos medžiagos indus. Indų matmenys turi būti pakankamai dideli, kad atitiktų įkrovos sąlygas (žr. 1.7.1.2). Bandymų indus bandymų atlikimo plote rekomenduojama išdėstyti atsitiktinai. Jei laboratorijoje yra sistemingi poveikiai, kuriuos būtų galima kontroliuoti suskirstant į blokus, indus geriau išdėstyti nevisiškai atsitiktinai, bet pagal atsitiktinę blokų schemą, kiekvieną bloką kontroliuojant. Jei taikoma blokų schema, į tai būtina atsižvelgti vėliau analizuojant duomenis. Bandymų indai turi būti apsaugoti nuo nepageidautinų trikdžių. 1.6.2 Žuvų rūšių parinkimas Rekomenduotos žuvų rūšys nurodytos 1A lentelėje. Tai netrukdo naudoti kitas rūšis (pavyzdžiai pateikti 1B lentelėje), bet, norint sudaryti tinkamas bandymų sąlygas, gali tekti pritaikyti bandymų metodiką. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pagrįsti rūšies pasirinkimas ir tyrimo metodas. 1.6.3 Veislinių žuvų laikymas Duomenų apie veislinių žuvų laikymą patenkinamomis sąlygomis galima rasti OECD TG 210[1] ir nuorodose

(6). 1.6.4 Embrionų ir lervų priežiūra (apdorojimas) Embrionai ir lervos gali būti veisiami mažesniuose į pagrindinį indą įstatomuose induose, jų šonines ar galines sieneles pakeičiant tinklu, kad tirpalas galėtų tekėti per indą. Galima padaryti taip, kad per mažus indus tekėtų neturbulentinis srautas, tik reikia pakabinti juos ant svirties, kuri indus keltų ir nuleistų, bet visą laiką organizmai turi būti panardinti; taip pat galima naudoti sifoninę tekėjimo sistemą. Apvaisinti lašišinių žuvų ikrai gali būti laikomi dėžėse ar tinkluose su pakankamai didelėmis akutėmis, kad išsiritusios lervos galėtų pro jas iškristi. Lervoms pernešti, atliekant pusiau statinius bandymus su visišku kasdieniu atnaujinimu, tinka Pastero pipetės (žr. 1.6.6). Jei ikrų talpyklos, grotelės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrindiniame inde laikyti, šitos apribojimo priemonės turėtų būti pašalintos išsiritus lervoms1, tačiau reikia palikti tinklelius, kurie neleistų ištrūkti žuvims. Jei lervas reikia pernešti, jų neturi veikti oras, o žuvims iš ikrų talpyklų pernešti neturi būti naudojami tinklai (tokia atsargumo priemonė gal ir nebūtina kai kurioms ne tokioms gležnoms rūšims, pvz., karpiui). Šio pernešimo laikas įvairioms rūšims skirtingas ir pernešti nėra visuomet būtina. Taikant pusiau statinį metodą galima naudoti chemines stiklines ar negilias talpyklas ir, jei būtina, turinčias tinklo ekraną, truputį pakeltą virš stiklinės dugno. Jei šių talpyklų tūris yra pakankamas, kad atitiktų įkrovos reikalavimus (žr. 1.7.1.2), embrionų ar lervų pernešti nebūtina. 1.6.5 Vanduo Bandymams galima naudoti bet kokį vandenį, kuris atitinka priimtino skiedimo vandens chemines ypatybes, nurodytas 4 priede, ir kuriame bandymo rūšis rodo kontrolinį išgyvenamumą, bent tokį, koks aprašytas 2 ir 3 prieduose. Vandens kokybė turėtų būti vienoda visą bandymo laiką. pH reikšmė neturėtų kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Norint garantuoti, kad skiedimo vanduo neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudarytų kompleksinių junginių su bandomąja medžiaga) ar nedarytų neigiamo poveikio neršiančių žuvų elgesiui, vandens bandiniai kartkartėmis turi būti analizuojami. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ir Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cf ir SO), pesticidų (pvz., bendro fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė pakankamai ilgai nekinta. Jei būtų parodyta, kad vandens kokybė nekinta bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). 1.6.6 Bandomieji tirpalai Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant ar plakant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą ruošiant galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Kiek įmanoma, reikia vengti naudoti tirpiklius ar dispergatorius (soliubilizuojančias medžiagas); tačiau kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą, tokias medžiagas gali tekti panaudoti. Tinkami tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40. Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai irstančias medžiagas (pvz., acetoną) ir (ar) labai lakius junginius, nes, darant dinaminius bandymus, jie gali kelti problemų dėl bakterijų kaupimosi. Naudojama soliubilizavimo medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio išgyvenamumui ir neigiamo poveikio ankstyvosioms stadijoms, kaip kad nustatoma atliekant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau reikia kiek įmanoma stengtis tokių medžiagų nenaudoti. Pusiau statiniam metodui galima taikyti dvi atnaujinimo metodikas: 1) nauji bandomosios medžiagos tirpalai paruošiami švariuose induose ir gyvi likę ikrai bei lervos su mažu seno tirpalo kiekiu pernešami į naujus indus, vengiant sąlyčio su oru, ar 2) bandymų organizmai paliekami senuose induose, tačiau pakeičiama dalis (bent trys ketvirčiai) jų vandens. Terpės atnaujinimo dažnis dažniausiai priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo, tačiau vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo bandymai (žr. 1.4) rodo, kad bandomosios medžiagos koncentracija tarp atnaujinimų yra nestabili (t. y. yra už 80 – 120 % vardinės koncentracijos ribų ar yra mažesnė kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dinaminio bandymo taikymą. Bet kuriuo atveju reikėtų pasirūpinti, kad atnaujinant vandenį lervos nepatirtų įtampos. Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras tiekti atliekant dinaminius bandymus reikalinga sistema, kuri nepertraukiamai dozuotų ir skiestų bandomosios medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi būti kartais, geriau kasdien, tikrinami ir visą bandymą turi nekisti daugiau kaip 10 %. Tinkamas pasirodė esąs srautas, atitinkantis bent penkis bandymo indo tūrius per 24 h

(2). 1.7 BANDYMO EIGA Vertingos informacijos, kaip atlikti žuvų embrionų ir mailiaus su trynio maišeliu toksiškumo bandymus, yra literatūroje, kurios keli pavyzdžiai įtraukti į šio teksto nuorodų dalį

(9). 1.7.1 Veikimo sąlygos 1.7.1.

1. Trukmė Bandymą geriau pradėti per 30 min. nuo ikrų apvaisinimo. Embrionai į bandomąjį tirpalą dedami prieš prasidedant blastodisko segmentacijos stadijai ar tik jai prasidėjus, bet būtinai prieš gastrolės stadijos pradžią. Jei ikrus tiekia prekybininkas, pradėti bandymą iš karto po apvaisinimo gali būti neįmanoma. Kadangi bandymo pradžios vėlavimas gali labai paveikti bandymo jautrumą, bandymas turėtų būti pradėtas per aštuonias valandas po apvaisinimo. Dėl tos priežasties, kad lervos veikimo laikotarpiu nemaitinamos, bandymas turėtų būti baigtas prieš pat tą momentą, kai kurioje nors bandymo kameroje kurios nors lervos trynio maišelis bus visiškai absorbuotas ar kai iš bado pradės žūti kontrolinių bandymų gyvūnai. Trukmė priklauso nuo naudotos rūšies. Kai kurios rekomenduojamos trukmės yra nurodytos 2 ir 3 priedėliuose. 1.7.1.
2. Įkrova Bandymo pradžioje turimų apvaisintų ikrų skaičiaus turi pakakti vykdant statistikos reikalavimus. Ikrai turi būti paskirstyti atsitiktinai ir kiekvienai koncentracijai turi būti naudojama bent po 30 apvaisintų ikrų, vienodai (ar kuo panašiau, nes naudojant kai kurias rūšis gali būti sunku gauti vienodas įkrovas) paskirstytų bent į tris tos pačios koncentracijos bandymų indus. Įkrova (biomasė bandomojo tirpalo tūrio vienetui) turi būti pakankamai maža, kad be aeracijos ištirpusio deguonies koncentraciją būtų galima palaikyti ne mažiau kaip 60 % oro soties vertės. Dinaminiams bandymams yra rekomenduota

(2)ne didesnė kaip 0,5 g/l per 24 h ir bet kuriuo momentu ne didesnė kaip 5 g/l tirpalo įkrova. 1.7.1.

1. Šviesa ir temperatūra Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperatūra turi atitikti žuvų rūšį (2 ir 3 priedai). Nuolatinei temperatūros kontrolei pravartu būtų turėti papildomą bandymų indą. 1.7.2 Bandomosios medžiagos koncentracijos Dažniausiai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentracijas, kurios skiriasi vienodu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,
2. Renkantis koncentracijų verčių diapazoną, turi būti išnagrinėta ūmaus toksiškumo tyrimų kreivė, siejanti LC50 ir veikimo trukmę. Tam tikromis aplinkybėmis gali pasiteisinti mažiau kaip penkių koncentracijų verčių naudojimas, pvz., atliekant ribinės koncentracijos vertės nustatymo bandymus, ar siauresnio koncentracijos verčių diapazono. Naudojant mažiau kaip penkias koncentracijų vertes, reikia tai pagrįsti. Medžiagos koncentracijos verčių, didesnių kaip 96 h LC5o ar 100 mg/l, priklauso nuo to, kuri mažesnė, bandyti nebūtina. Neturėtų būti atliekami bandymai su koncentracijos vertėmis, didesnėmis kaip medžiagos tirpumo ribinė koncentracija. Jei pradinio tirpalo ruošimui naudojama soliubilizuojanti medžiaga, jos galutinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l ir geriau, kad ji visuose bandymo induose būtų vienoda (žr. 1.6.6). 1.7.3 Kontroliniai bandymai Be bandomosios serijos turi būti atliktas vienas skiedimo vandens kontrolinis bandymas (su lygiagrečiais bandymais, kai reikia) ir, jei tinka, vienas kontrolinis bandymas su soliubilizavimo medžiaga (su lygiagrečiais bandymais, kai reikia). 1.7.4 Kiekybinių analizių ir matavimų dažnis Atliekant bandymą reguliariais tarpais, nustatomos bandomosios medžiagos koncentracijų vertės. Jei manoma, kad atliekant pusiau statinius bandymus bandomosios medžiagos koncentracija lieka vardinės koncentracijos ± 20 % vertės (t. y. 80 -120 % diapazono; žr. 1.4 ir 1.6.6), rekomenduojama mažiausiai tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandomąją koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą (t. y. reikia analizuoti tą patį tirpalą, imant bandinius iš šviežio tirpalo ir prieš pat jo atnaujinimą). Jei bandymai tokie, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija lieka lygi vardinei vertei ± 20 % (pagal medžiagos stabilumo duomenis), turi būti nustatomos visos naujai paruoštų tirpalų ir atnaujintinų tirpalų koncentracijos vertės, laikantis to paties analizės režimo (t. y. bent tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais). Bandomosios medžiagos koncentraciją prieš atnaujinimą reikia nustatyti tik viename tos pačios koncentracijos inde. Tarp nustatymų turi būti ne ilgesnis kaip septynių parų tarpas. Rekomenduojama pateikiant rezultatus remtis išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau jei yra įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką buvo patenkinamai palaikoma kaip vardinė koncentracijos ± 20 % vertė ar išmatuotoji pradinė koncentracijos vertė, rezultatai gali būti pateikiami remiantis vardine ar išmatuotąja vertėmis. Atliekant dinaminius bandymus, tinka bandinių ėmimo režimas, panašus į aprašytąjį ir taikomas atliekant pusiau statinius bandymus (bet „senų“ tirpalų koncentracijų matavimas šiuo atveju netaikomas). Tačiau jei šis bandymas trunka ilgiau kaip septynias paras, būtų pageidautina pirmą savaitę padidinti bandinių ėmimo dažnį (pvz., trys matavimų serijos), norint įsitikinti, kad bandomosios koncentracijų vertės nesikeičia. Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akytumo filtrą) ar centrifuguoti. Nei centrifugavimu, nei filtravimu dažniausiai negalima atskirti biologiškai neprieinamos bandomosios medžiagos dalies nuo biologiškai prieinamos dalies, todėl bandinių apdorojimas šiais būdais gali būti netaikomas. Atliekant bandymą, visuose bandymų induose turi būti matuojama ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperatūra. Turi būti matuojamas kontrolinių bandinių ir vieno indo su didžiausios koncentracijos bandiniu bendras kietumas ir druskingumas (jei reikia). Ištirpusio deguonies koncentracija ir druskingumas (jei reikia) turi būti matuojami mažiausiai tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Atliekant pusiau statinius bandymus ištirpusio deguonies koncentraciją rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, ar bent kartą per savaitę. Atliekant pusiau statinius bandymus pH vertė turi būti matuojama prieš kiekvieną vandens atnaujinimą ir po jo, atliekant dinaminius bandymus -bent kartą per savaitę. Vandens kietumas kiekvieną bandymą matuojamas vieną kartą. Temperatūrą būtina matuoti kasdien, o bent viename inde būtų gerai ją stebėti visą laiką, nepertraukiamai. 1.7.5 Stebėjimai 1.7.5.
3. Embrioninio vystymosi stadija Embrioninė stadija (t. y. gastrolės stadija) veikimo bandomąja medžiaga pradžioje turi būti kiek įmanoma tiksliau patikrinta (verifikuota). Tai galima padaryti naudojant tinkamai išlaikytų ir nuvalytų ikrų pavyzdinį bandinį. Embrioninių stadijų aprašymo ir iliustravimo pavyzdžių galima rasti literatūroje

(11). 1.7.5.2. Išsiritimas ir išlikimas Išsiritimo ir išlikimo stebėjimai turi būti daromi bent kasdien, o gauti skaičiai registruojami. Pageidautina bandymo pradžioje stebėti dažniau (pvz., pirmąsias tris valandas kas 30 minučių), nes kartais išlikimo laikas gali būti svarbesnis už vien tik žūčių skaičių (pvz., dėl ūmaus toksiškumo poveikio). Negyvi embrionai ir lervos turi būti pašalinti iš karto, kai tik bus pastebėti, nes jie greitai suyra. Šalinti reikėtų labai atsargiai, kad nebūtų užgauti ar fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai arba lervos, kadangi jie yra labai gležni ir jautrūs. Žūties kriterijai kinta, atsižvelgiant į gyvenimo etapą: - ikrams, ypač ankstyvosiomis stadijomis, pastebimas skaidrumo sumažėjimas ir spalvos pokytis dėl baltymo koaguliacijos ir (

1. ar)nusėdimo, dėl to atsiranda baltas matinis atspalvis, - embrionams pastebimas kūno judėjimo ir (
2. ar)širdies plakimo nebuvimas, matinio atspalvio atsiradimas rūšims, kurių embrionai yra permatomi, esant normalioms sąlygoms, - lervoms pastebimas nejudamumas ir (
3. ar)kvėpavimo judėjimo, ir (
4. ar)širdies plakimo nebuvimas, ir (
5. ar)balta matinė centrinės nervų sistemos spalva, ir (
6. ar)reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas. 1.7.5.3. Išvaizdos anomalijos Kūno ir (
7. ar)pigmentacijos anomalijų turinčių lervų skaičius ir trynio maišelio absorbcijos stadija turi būti registruojami atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę ir į aprašytos anomalijos prigimtį. Pastebėtina, kad nenormalūs embrionai ir lervos pasitaiko natūraliai ir kai kurių rūšių gali sudaryti net kelis kontrolinio (-ių) bandinio (-ių) procentus. Iš bandymo indų turi būti pašalinami išvaizdos anomalijų turintys ką tik žuvę gyvūnai. 1.7.5.4. Elgesio anomalijos Anomalijos, pvz., hipervėdinimas, nekoordinuotas plaukimas ir netipiškas nejudrumas, turi būti registruojamos atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę. Šie pastebėti pokyčiai, nors juos sunku įvertinti kiekybiškai, gali padėti interpretuojant gaištamumo duomenis, t. y. suteikti informacijos apie medžiagos toksiško veikimo būdą. 1.7.5.5. Ilgis Baigiant bandymą, rekomenduojama išmatuoti atskirų gyvūnų ilgį galima matuoti standartinį ilgį iki uodegos peleko išsišakojimo arba bendrą ilgį. Jei supuvo uodegos pelekas ar jis yra išėstas, turi būti imamas standartinis ilgis. Dažniausiai, jei bandymas vykdomas tiksliai, ilgio variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti < 20 %. 1.7.5.6. Masė Baigiant bandymą, galima išmatuoti atskirų gyvūnų masę; geriau nustatyti sausų gyvūnų masę (po 24 h esant 60 °C temperatūrai), o ne gyvų (sausai nušluostytų filtro popieriumi). Dažniausiai, jei bandymas atliekamas tiksliai, masės variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi būti < 20 %. Atliekant stebėjimus, dažniausiai gaunama dalis nurodytų duomenų ar visi duomenys, kuriems taikytina statistinė analizė: - bendras gaištamumas, - sveikų lervų skaičius baigiant bandymą, - išsiritimo pradžia ir jo pabaiga (t. y. 90 % išsiritusių ikrų kiekviename vienodos koncentracijos inde), - kiekvieną parą išsiritančių lervų skaičius, - iki bandymo pabaigos išgyvenusių gyvūnų ilgis (ir masė), - deformuotų ar anomalios išvaizdos lervų skaičius, - anomalaus elgesio lervų skaičius. 2. DUOMENYS IR ATASKAITA 2.1. REZULTATŲ APDOROJIMAS Rekomenduojama, kad tiek rengiant bandymo planą, tiek ir analizuojant bandymą dalyvautų statistikas, nes šis bandymų metodas leidžia labai keisti eksperimento planą, pvz., bandymo indų skaičių, bandomųjų koncentracijų skaičių, pradinį apvaisintų ikrų skaičių, matuojamų parametrų skaičių. Atsižvelgiant į bandymo plano variantų įvairovę, jokių specialių statistinės metodikos nurodymų čia nepateikiama. Jei reikia įvertinti LOEC ir NOEC vertes, būtina analizuoti kiekvieno vienodos koncentracijos pakartojimų duomenų sklaidą, taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar atsitiktinių veiksnių analizę. Norint atlikti atskiros koncentracijos ir kontrolinių bandinių gautų rezultatų bendrą palyginimą, gali būti naudingas Dunnetto metodas

(13). Yra ir kitų naudingų metodų pavyzdžių

(15). Taikant dispersinę analizę (ANOVA) ar kitas procedūras, nustatomo poveikio dydis (t. y. metodo galimybės) turi būti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje. Žinotina, kad ne visus 1.7.5.6 skirsnyje išvardytus stebėjimus galima statistiškai apdoroti, taikant dispersinę analizę. Pvz., bendras gaištamumas ir gyvų lervų skaičius baigiant bandymą galėtų būti analizuojami, taikant probito modelio metodus. Jei reikia įvertinti LC ar EC“ vertes, tyrimo rezultatams taikant statistinį metodą, pvz., mažiausių kvadratų ar netiesinių mažiausių kvadratų metodą, turi būti pritaikyta tinkama (-

1. os)kreivė (-ės), pvz., logistinė kreivė. Kreivė (-ės) turi būti sudalyta (-
2. os)taip, kad nustatomos LC ar EC“ vertės ir jų standartinė paklaida galėtų būti įvertintos tiesiogiai. Tai tikrai lengviau apskaičiuoti pasikliovimo rėžius LC ar ECX. Jei nėra svarbių priežasčių pirmenybę teikti kitiems pasikliovimo lygmenims, turi būti nurodomas dvipusis 95 % pasikliovimo intervalas. Pageidautina, kad pritaikymo metodika turėtų priemonių įvertinti atitikimo stokos reikšmę. Galima taikyti grafinius kreivių pritaikymo metodus. Regresinė analizė tinka visiems 1.7.5.6 skirsnyje išvardytiems stebėjimams. 2.2 REZULTATŲ INTERPRETAVIMAS Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei matuojamos bandomųjų tirpalų toksiškų medžiagų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos. Taip pat labai atsargiai reikėtų interpretuoti gautus koncentracijos verčių rezultatus, didesnius už medžiagos tirpumo vandenyje vertes. 2.3 BANDYMO ATASKAITA Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija: 2.3.1. Bandomoji medžiaga: - fizinė būsena ir atitinkamos fizinės bei cheminės savybės, - cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą ir, jei reikia, analizės metodas, norint nustatyti bandomosios medžiagos kiekį. 2.3.2 Bandymų gyvūnai: - mokslinis pavadinimas, veislė, motininių žuvų skaičius (t. y. kiek moteriškosios lyties žuvų buvo naudojama bandymui reikalingų ikrų skaičiui gauti), apvaisintų ikrų surinkimo šaltinis bei metodas ir vėlesnė priežiūra. 2.3.3 Bandymo sąlygos: - taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar dinaminis, laikas nuo apvaisinimo iki bandymo pradžios, įkrova ir 1.1); - apšvietimo laikotarpio (-ių) trukmė, - bandymo planas (pvz., bandymų indų skaičius ir lygiagrečių bandymų skaičius, embrionų skaičius vienam lygiagrečiam bandiniui), - pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų atnaujinimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija), - vardinės bandomosios koncentracijos, išmatuotos tirpalų koncentracijos vertės bandymų induose, jų vidutinės vertės, standartiniai nuokrypiai ir nustatymo metodas; jei bandomosios medžiagos tirpumas yra mažesnis už bandomosios koncentracijos, įrodymai, kad buvo matuojama bandomosios medžiagos koncentracija tirpale, - skiedimo vandens savybės: pH, kietumas, šarmingumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės druskingumas (jei matuotas) ir visi kiti atlikti matavimai, - vandens kokybė bandymų induose: pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija. 2.3.4 Rezultatai: - visų parengiamųjų bandomosios medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai; - įrodymai, kad kontroliniai bandiniai atitinka priimtą bendro bandymų rūšies išgyvenamumo standartą (2 ir 3 priedai); - embriono ir lervos stadijos žuvų gaištamumo ir išgyvenamumo bei bendro gaištamumo ir išgyvenamumo duomenys; - ikrų inkubacijos parų skaičius ir išsiritusių lervų skaičius; - ilgio (ir masės) duomenys; - morfologinių anomalijų, jei yra, dažnis ir aprašymas; - poveikių elgesiui, jei yra, dažnis ir aprašymas; - duomenų statistinė analizė ir apdorojimas; - jei bandymų duomenims buvo taikoma dispersinė analizė, kiekvieno įvertinto atsako mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC), kai p = 0,05, ir nestebimo poveikio koncentracija (NOEC), įskaitant taikytų statistinių procedūrų aprašymą ir nuorodą, kokio dydžio poveikis gali būti aptiktas, - jei bandymo duomenims buvo taikomas regresinės analizės metodas, LC ir ECx jų pasikliovimo intervalai ir šioms vertėms apskaičiuoti naudoto pritaikyto modelio grafikas, - visų nukrypimų nuo bandymo metodo paaiškinimai. 3. NUORODOS 1) Kristensen P.

(1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 p. June 1990. 2) ASTM

(1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241 – 88. 26 P- 3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A.

(1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 4) Brungs W. A. and Jones B. R.

(1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. 5) Laale H. W.

(1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, 121 – 173 p. 6) Legault R.

(1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spavming and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, 328 – 330 p. 7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T.

(1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chenristry, 6,61 — 71 p. 8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G.

(1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chenristry 4, 807 – 821 p. 9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F.

(1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. m. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, 129 – 145 p. 10) Kirchen R. V. and W. R. West

(1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32

(4): 1 – 4. Carolina Biological Supply Company. 11) Kirchen R. V. and W. R. West

(1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 p. 12) Dunnett C. W.

(1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50,1096 – 1121 p. 13) Dunnett C. W.

(1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20,482 – 491 p. 14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G.

(1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity TestData. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. 15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J.

(1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, 321 – 334 p. 16) Environment Canada.

(1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological TestMethod Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 p. 17) Dave G. and Xiu R.

(1991). Toxicity of Mercury, Niekei, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, 126 – 134 p. 18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G.

(1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231 – 236 p. 19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P.

(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, 19 – 28 p. 20) US EPA,

(1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth. 21) US EPA,

(1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth. 22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D.

(1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth tęst: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189-1203 p. 23) Calow P.

(1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spavming, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish. 24) Balon E. K.

(1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ, Dordrecht, 280 p. 25) Blaxter J. H. S.

(1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, 1 – 58 p. 1A LENTELĖ. Bandymui rekomenduojamos žuvų rūšys Gėlavandenės Oncorhynchus mykiss — Vaivorykštinis upėtakis

(16)Danio