{"html": "

6.8.3. Pagrindinis nutrūkstamo ir pastovaus poveikių skirtumas yra tas, kad taikant nutrūkstamą poveikį, susidaro 17–18 valandų, o savaitgaliais ženkliai ilgiau, per kurias gyvūnai atsigauna nuo požymių, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo.

\n

6.8.4. Nutrūkstamas ar pastovus poveikis pasirenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir į poveikio žmogui mechanizmą, kuris imituojamas. Tačiau būtina atsižvelgti į konkrečius techninius sunkumus, pavyzdžiui: pastoviojo poveikio privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, atsvara yra tai, kad poveikio metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti, be to būtina ženkliai sudėtingesnė konstrukcija, užtikrinanti aerozolio ir garų generavimą bei stebėsenos įranga.

\n

6.9. Poveikio kamera 6.9.1. Gyvūnai bandomi taikant gebančius išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą inhaliacinius įrenginius, kuriuose užtikrintas būtinas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirsto poveikio oras. Jeigu naudojama kamera, jos konstrukcija turi užtikrinti, kad gyvūnai būtų nesusigrūdę, kad jie įkvėptų kaip galima daugiau bandomosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti oro pastovumą kameroje, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Kontrolinė kamera įrengta visiškai taip kaip bandomoji. Neženklus neigiamas slėgis kameros viduje palaikomas, kad išvengti bandomosios medžiagos patekimo į supančią aplinką.

\n

6.9.2. Bandymo metu būtina:

\n

6.9.2.1. stebėti ir matuoti oro srauto kitimą (nuolat);

\n

6.9.2.2. kvėpavimo zonoje matuoti bandomosios medžiagos tikrąją koncentraciją. Dienos poveikio laikotarpiu koncentracija negali skirtis daugiau kaip per 15 % nuo vidutinės vertės. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos pastovios (kiek įmanoma);

\n

6.9.2.3. stebėti temperatūrą ir drėgmę: graužikų atveju temperatūra turi būti apie 22 °C ± 2 °C ir drėgmė kameroje – nuo 30 % iki 70 %, išskyrus, kai naudojamas vanduo, kad bandomoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Geriau nuolat stebėti temperatūrą bei drėgmę;

\n

6.9.2.4. matuoti dalelių dydį: nustatyti kameros ore esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės tokio dydžio, kad naudojamas bandomasis gyvūnas jas įkvėptų. Kameros oro mėginiai paimami iš gyvūnų kvėpuojamosios zonos. Oro mėginys turi atstovauti dalelių sklaidą gyvūno kvėpavimo zonoje ir apskaičiuojamas gravimetrinės analizės metodu visoms aerozolio dalelėms, net toms, kurios nėra įkvėpiamos. Dalelių gamybos sistemos tobulinimu siekiama, kad dalelių dydis užtikrintų pastovią aerozolio koncentraciją. Poveikio metu nuolat tikrinama dalelių sklaida kameroje.

\n

6.10. Bandymo trukmė. Kancerogeniškumo bandymas trunka didžiąją bandomųjų gyvūnų gyvenimo dalį. Pelių ir žiurkėnų atveju, bandymas baigiamas po 18 mėnesių, o žiurkių atveju – po vienerių metų; tačiau, tam tikrų kamienų gyvūnams, kurių gyvenimo trukmė yra ilgesnė ir (arba) lėtas savaiminis auglio atsiradimas, bandymas turi trukti vienerius metus pelėms ir žiurkėnams ir 30 mėnesių žiurkėms. Kita pratęsto bandymo priežastis yra, kai kontrolinės bei mažiausios dozės grupių gyvūnų skaičius siekia 25 %. Jei bandymo metu nustatytas skirtingas dozės atsakas atsižvelgiant į gyvūnų lytį, tai kiekviena lytis vertinama atskirai. Jei dėl akivaizdžių toksiškumo požymių nugaišta didelę dozę gavusi grupė, tai nėra būtina baigti bandymą, kai pasireiškusios toksinės reakcijos nesukelia kritimo kitose bandymo grupėse. Neigiamas bandymo rezultatas priimtinas, kai ne daugiau kaip 10 % bet kurios grupės gyvūnų nugaišta bandymo metu dėl autolizės, kanibalizmo ar laikymo sąlygų ir po 18 mėnesių išlieka ne mažiau kaip 50 % visų grupių pelių ir žiurkėnų, bei po vienerių metų – ne mažiau kaip 50 % visų grupių žiurkių.

\n
7.Darbo eiga 7.1. Stebėjimas 7.1.1. Kasdienis stebėjimas narve apima: odos ir kailio, akių ir gleivinės kitimus, kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos kitimus.
\n

7.1.2. Reguliariai atliekami gyvūnų stebėjimai užtikrina, kad gyvūnai nekristų bandymo metu dėl kanibalizmo, audinių autolizės bei vietos pakeitimo. Kritę gyvūnai pašalinami bei skrodžiami.

\n

7.1.3. Registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai bei žuvimas. Ypatingas dėmesys skiriamas auglio augimui: registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo bei užčiuopiamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis ir išorė.

\n

7.1.4. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę matuojamas pašaro (ir vandens, jei bandomoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu) įsisavinimas; vėliau tai atliekama kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar kūno masės kitimai verčia elgtis kitaip.

\n

7.1.5. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę sveriamas kiekvienas gyvūnas ir individualiai užrašoma jo kūno masė, vėliau tai atliekama vieną kartą per mėnesį.

\n

7.2. Klinikiniai tyrimai 7.2.1. Hematologinis tyrimas 7.2.1.1. Jei, atsižvelgiant į laikomų narveliuose gyvūnų stebėjimus, spėjama, kad bandymo metu sutriko gyvūnų sveikata, tai atliekama paveiktų bandomąja medžiaga gyvūnų diferencinė kraujo analizė.

\n

7.2.1.2. Praėjus vieneriems metams ar 18 mėnesių, iš gyvūnų paimami kraujo tepinėliai. Kraujo diferencinė analizė atliekama gavusiems didžiausią medžiagos dozę gyvūnams bei kontrolinės grupės gyvūnams. Jei šie duomenys, ypač duomenys gauti prieš numarinimą, arba patologinių tyrimų duomenys rodo, kad reikia ištirti kraują, tai diferencinė kraujo analizė atliekama grupei, gavusiai žemesnę dozę.

\n

7.3. Skrodimas 7.3.1. Atliekamas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos kurie krito bandymų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie krenta. Visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, turi būti užkonservuoti.

\n

7.3.2. Histopatologiniams tyrimams išsaugomi, laikant atitinkamoje terpėje, tokie audiniai ir organai: smegenys - (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievė), hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liaukos audinys, plaučiai (trachėja), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, gaubiančioji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos, pagalbiniai lytiniai organai, pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant ir segmentinį paviršių) ir akys.

\n

7.3.3. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo bandymuose svarbus atitinkamiems histopatologiniams tyrimams atlikti. Įkvėpimo bandymo atveju išsaugomi visi kvėpavimo organai, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.

\n

7.4. Histopatologinis tyrimas 7.4.1 Visapusiškas histopatologinis įvertinimas atliekamas visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų odos, organų ir audinių.

\n

7.4.2. Visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, mikroskopiškai ištiriami visose grupėse.

\n

7.4.3. Jei gavusios didelę dozę ir kontrolinė grupės skiriasi pagal neoplastinių sutrikimų pasireiškimą, tai ištiriami konkretūs šių grupių organai ar audiniai.

\n

7.4.4. Jei nustatyti ženklūs neoplastinių pakitimų skirtumai grupėje, gavusioje didelę dozę, ir kontrolinėje grupėje, tai būtinas histopatologinis ištyrimas kitų dozes gavusių grupių tų audinių arba organų, kur buvo nustatyti kitimų skirtumai.

\n

7.4.5. Jei didelę dozę gavusioje grupėje gyvūnų išlikimas yra ženkliai mažesnis negu kontrolinėje, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė.

\n

7.4.6. Jei yra įrodymas, kad toksiniai ar kiti poveikiai turėjo įtakos neoplastiniam atsakui grupėje, gavusioje didelę dozę, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė.

\n

II. DUOMENYS 8. Duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti augliai bandymo metu, skaičius, auglių nustatymo laikas bei gyvūnų, kuriuose buvo nustatyti augliai numarinimo metu, skaičius. Skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą. Galima taikyti bet kokį pripažintą statistinio apdorojimo metodą.

\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 9. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikiama tokia informacija:

\n

9.1. rūšis, veislė, kamienas, gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

\n

9.2. bandymo sąlygos: poveikio sistemos aprašymas su smulkiomis techninėmis charakteristikomis; gyvūnų laikymo bandymo kameroje aprašymas; temperatūros, drėgmės, koncentracijos matuoklių aprašymas su techninėmis charakteristikomis;

\n

9.3. veikimo metu gauti duomenys: pateikiami lentelėse, nurodant vidutines vertes ir variacijos matą (pavyzdžiui, standartinį nukrypimą) ir pateikiant:

\n

9.3.1. oro srauto greičius per inhaliacijos prietaisą;

\n

9.3.2. oro temperatūrą ir drėgmę;

\n

9.3.3. vardines koncentracijas (bendras bandomosios medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos prietaisą, padalytas iš oro tūrio);

\n

9.3.4. tirpiklio (jei naudotas) rūšis;

\n

9.3.5. tikrąsias koncentracijas kvėpavimo zonoje bandymo metu;

\n

9.3.6. vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma tai nurodyti);

\n

9.3.7. dozes (įskaitant tirpiklį, jei taikytas) ir koncentracijas.

\n

9.4. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

\n

9.5. gyvūnų kritimo laikas bandymo metu arba gyvūnai, išgyvenę iki bandymo pabaigos;

\n

9.6. toksiškumo požymiai atsižvelgiant į lytį ir dozę;

\n

9.7. toksiškumo ir kitų poveikių aprašymas;

\n

9.8. kiekvieno anormalinio požymio stebėjimo laikas ir jo tolesnis plėtimasis;

\n

9.9. duomenys apie šėrimą ir kūno masės kitimą;

\n

9.10. atlikti hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

\n

9.11. skrodimo duomenys;

\n

9.12. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

\n

9.13. statistinis rezultatų apdorojimas (kai tinka);

\n

9.14. duomenų aptarimas;

\n

9.15. duomenų interpretavimas.

\n
10.Įvertinimas ir interpretacija pagal Bendrąjį įvadą.
\n

IV. NUORODOS 11. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ Patvirtinta Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B33 METODAS: LĖTINIO TOKSIŠKUMO IR KAncerogeniŠKUMO JUNGTINIS TYRIMAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

\n
2.Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.
\n
3.Pamatinės medžiagos. Nėra.
\n
4.Bandymo metodo principas 4.1. Jungtinio lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo badymo tikslas yra nustatyti medžiagos, kuria žinduoliai veikiami ilgiau nei įprasta, lėtinį ir kancerogeninį poveikius.
\n

4.2. Kancerogeniškumo bandymo metu naudojama mažiausiai viena papildoma bandomąja medžiaga veikiama grupė bei papildoma kontrolinė grupė. Dozė, suleidžiama papildomai didelės dozės grupei, gali būti didesnė, nei ta, kuri suleidžiama grupei kancerogeniškumo bandymo metu. Kancerogeniškumo bandymo metu įvertinamas bendras toksinis poveikis bei atsakas į kancerogeną. Papildomos bandomosios medžiagos veikiamos grupės gyvūnams įvertinamas bendras toksinis poveikis.

\n

4.3. Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės kiekvieną dieną septynis kartus per savaitę veikiamos bandomosios medžiagos: vienai grupei – vieną dozę, tai trunka didesnę gyvūnų gyvenimo laikotarpį. Poveikio metu ir jam pasibaigus gyvūnai turi būti stebimi kiekvieną dieną, norint laiku registruoti toksiškumo poveikio požymius, ypač auglio formavimąsi.

\n
5.Kokybės kriterijai. Nėra.
\n
6.Bandymo metodo aprašymas. Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki bandymo. Prieš bandymą sveiki gyvūnų jaunikliai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąją bei kontrolinę grupes.
\n

6.1. Eksperimentiniai gyvūnai 6.1.1. Dažniausiai naudojama rūšis yra žiurkės. Remiantis anksčiau atliktų bandymų rezultatais, gali būti naudojamos kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Naudojami įprastinių laboratorinių kamienų sveiki gyvūnų jaunikliai; medžiagos dozavimas prasideda iškart po atjunkymo.

\n

6.1.2. Bandymo pradžioje kiekvieno gyvūno kūno masės skirtumai neturi viršyti ± 20 % atitinkamos vidutinės vertės. Jei pusiau lėtinis bandymas per virškinimo traktą atliekamas kaip įvadinis prieš pagrindinį ilgalaikį bandymą, tai abiejuose bandymuose turi būti naudojami tos pačios veislės ir to paties tiekėjo gyvūnai.

\n

6.2. Skaičius ir lytis 6.2.1 Skaičius ir lytis. Graužikams kiekvienai medžiagos dozei naudojama ne mažiau kaip 100 gyvūnų (50 patinų ir 50 patelių), kartu naudojant kontrolinę grupę. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jeigu bandymo metu planuojama numarinti dalį gyvūnų, jų pradinis skaičius turi būti didesnis tiek, kiek planuojama gyvūnų numarinti prieš bandymo pradžią.

\n

6.2.2. Papildomoje veikiamojoje grupėje, skirtoje įvertinti ne navikinės kilmės patologinius kitimus, turi būti po 20 kiekvienos lyties gyvūnų, o papildomoje kontrolinėje grupėje turi būti po 10 kiekvienos lyties gyvūnų.

\n

6.3. Dozė 6.3.1. Kancerogeniškumui įvertinti naudojamos 3 bandomosios dozės bei kontrolinė grupė. Didžiausia dozė turi sukelti minimalų toksiškumą, pasireiškiantį nežymiu kūno masės prieaugio sumažėjimu (mažesniu nei 10 %), nepakeičiant įprastinės gyvenimo trukmės dėl poveikių, kurie skiriasi nuo auglių atsiradimo.

\n

6.3.2. Mažiausia dozė neturi paveikti gyvūno normalaus augimo, vystymosi bei gyvenimo trukmės ar sukelti toksiškumo požymius. Ši dozė neturi būti mažesnė nei didžiausios dozės dešimtoji dalis (10 %).

\n

6.3.3. Tarpinė dozė turi būti tarp didžiausios ir mažiausios dozių.

\n

6.3.4. Pasirenkant dozes būtina remtis anksčiau atliktų toksiškumo bandymų duomenimis.

\n

6.3.5. Atliekant lėtinio toksiškumo bandymą, naudojamos papildomos, veikiamos bandomąja medžiaga, bei kontrolinės grupės. Didžiausia veikiamoji dozė papildomai grupei turi sukelti apibrėžtus toksiškumo požymius.

\n

6.3.6. Kiekvieną dieną veikiama bandomąja medžiaga. Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turi būti nuolat prieinama.

\n

6.4. Kontrolė 6.4.1. Kartu naudojama kontrolinė grupė, ta pati veikiamoms grupėms pagal visas savybes, išskyrus veikimą bandomąja medžiaga.

\n

6.4.2. išskirtiniais atvejais, kaip aerozolio bandymai įkvėpus arba nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklio taikymo per virškinimo traktą bandymai, naudojama papildoma kontrolinė grupė, kuri neveikiama tirpiklio.

\n

6.5. Suleidimo būdas. Suleidžiama trimis pagrindiniais būdais: per virškinimo traktą, per odą ir įkvėpus. Suleidimo būdo pasirinkimas priklauso nuo bandomosios medžiagos fizikinių ir cheminių savybių ir poveikio žmogui panašumo.

\n

6.5.1. Bandymas per virškinimo traktą. Jei bandomoji medžiaga absorbuojama iš virškinimo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su bandomąja medžiaga, tai pasirenkamas suleidimas per virškinimo traktą, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gauna bandomąją medžiagą šeriant, ištirpintą vandenyje arba kapsulėje. Dozavimas atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozavimas penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir tai turi įtakos gaunamiems duomenims bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau, jei nagrinėtume iš praktinės pusės, tai dozavimas penkias dienas per savaitę yra priimtinas.

\n

6.5.2. Bandymas per odą. Poveikis per odą, sutepant ją, parenkamas tada, kai spėjama, kad tai yra galimas poveikio būdas žmogui ir yra modelis, kaip inicijuojami odos pakenkimai. 6.5.3. Bandymas įkvėpus 6.5.3.1. Bandymuose įkvėpus susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis, nei suleidžiant bandomąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip suleisti medžiagą šiuo būdu. Ypatingais atvejais lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas.

\n

6.5.3.2 Ilgalaikiai bandymai atliekami atsižvelgiant į medžiagos galimą poveikį žmogui. Gyvūnai gauna dienos šešių valandų dozę, kai susivienodina bandomosios medžiagos koncentracija bandymo kameros viduje, penkiskart per savaitę (nutrūkstamas poveikis) arba atsižvelgiant į galimą aplinkos poveikį veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus poveikis), vieną valandą per dieną šeriant laikomus gyvūnus tuo pačiu metu ir tvarkant kameras. Abiem atvejais gyvūnai veikiami pastoviomis bandomosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis nutrūkstamo ir pastovaus poveikių skirtumas yra tas, kad taikant nutrūkstamą poveikį, susidaro 17–18 valandų, o savaitgaliais ženkliai ilgiau, per kurias gyvūnai atsigauna nuo požymių, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo.

\n

6.5.3.3. Nutrūkstamas ar pastovus poveikis pasirenkamas atsižvelgiant į bandymo tikslą ir į poveikio žmogui mechanizmą, kuris imituojamas. Tačiau būtina atsižvelgti į konkrečius techninius sunkumus, pavyzdžiui: pastovaus poveikio privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, atsvara yra tai, kad poveikio metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti, be to, būtina ženkliai sudėtingesnė konstrukcija, užtikrinanti aerozolio ir garų generavimą bei stebėsenos įranga.

\n

6.6. Poveikio kamera.

\n

6.6.1. Gyvūnai bandomi taikant gebančius išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą inhaliacinius įrenginius, kuriuose užtikrintas būtinas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirsto poveikio oras. Jeigu naudojama kamera, jos konstrukcija turi užtikrinti, kad gyvūnai būtų nesusigrūdę, kad jie įkvėptų kaip galima daugiau bandomosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti oro pastovumą kameroje, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 %. bandymo kameros tūrio. Kontrolinė kamera įrengta visiškai taip kaip bandomoji. Neženklus neigiamas slėgis kameros viduje palaikomas, kad būtų išvengta bandomosios medžiagos patekimo į supančią aplinką.

\n

6.6.2. Bandymo metu būtina:

\n

6.6.2.1. stebėti ir matuoti oro srauto kitimą (nuolat);

\n

6.6.2.2. kvėpavimo zonoje matuoti bandomosios medžiagos tikrąją koncentraciją. Dienos poveikio laikotarpiu koncentracija negali skirtis daugiau kaip per 15 % nuo vidutinės vertės. Viso bandymo metu kiekvienos dienos koncentracijos pastovios (kiek įmanoma);

\n

6.6.2.3. stebėti temperatūrą ir drėgmę: graužikų atveju temperatūra apie 22 °C ± 2 °C ir drėgmė kameroje – nuo 30 % iki 70 %, išskyrus, kai naudojamas vanduo, kad bandomoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Geriau nuolat stebėti temperatūrą bei drėgmę;

\n

6.6.2.4. matuoti dalelių dydį: nustatyti kameros ore esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės tokio dydžio, kad naudojamas bandomasis gyvūnas jas įkvėptų. Kameros oro mėginiai paimami iš gyvūnų kvėpuojamosios zonos. Oro mėginys turi atstovauti dalelių sklaidą gyvūno kvėpavimo zonoje ir apskaičiuojamas gravimetrinės analizės metodu visoms aerozolio dalelėms, net toms, kurios nėra įkvėpiamos. Dalelių gamybos sistemos tobulinimu siekiama, kad dalelių dydis užtikrintų pastovią aerozolio koncentraciją. Poveikio metu nuolat tikrinama dalelių sklaida kameroje.

\n

6.7. Bandymo trukmė 6.7.1. Kancerogeniškumo bandymas trunka didžiąją bandomųjų gyvūnų gyvenimo dalį. Pelių ir žiurkėnų atveju bandymas baigiamas po 18 mėnesių, o žiurkių atveju – po vienerių metų; tačiau tam tikrų kamienų gyvūnams, kurių gyvenimo trukmė yra ilgesnė ir (arba) lėtas savaiminis auglio atsiradimas, bandymas turi trukti vienerius metus pelėms ir žiurkėnams ir 30 mėnesių žiurkėms. Kita pratęsto bandymo priežastis yra, kai kontrolinės bei mažiausios dozės grupių gyvūnų skaičius siekia 25 %. Jei bandymo metu nustatytas skirtingas dozės atsakas atsižvelgiant į gyvūnų lytį, tai kiekviena lytis vertinama atskirai. Jei dėl akivaizdžių toksiškumo požymių nugaišta didelę dozę gavusi grupė, tai nėra būtina baigti bandymą, kai pasireiškusios toksinės reakcijos nesukelia kritimo kitose bandymo grupėse. Neigiamas bandymo rezultatas priimtinas, kai ne daugiau kaip 10 % bet kurios grupės gyvūnų nugaišta bandymo metu dėl autolizės, kanibalizmo ar laikymo sąlygų ir po 18 mėnesių išlieka ne mažiau kaip 50 % visų grupių pelių ir žiurkėnų, bei po vienerių metų – ne mažiau kaip 50 % visų grupių žiurkių.

\n

6.7.2. Atliekant lėtinio toksiškumo bandymą, mažiausiai metus naudojamos papildomos grupės, veikiamos bandomąja medžiaga ir sudarytos iš 20 kiekvienos lyties gyvūnų, bei kontrolinės grupės, sudarytos iš 10 kiekvienos lyties gyvūnų. Numatomas gyvūnų numarinimas, kad būtų galima tirti bandomosios medžiagos sukeltus patologinius procesus, kuriems neturi įtakos gyvūnų senėjimas.

\n
7.Darbo eiga 7.1. Stebėjimas 7.1.1. Kasdienis stebėjimas narve apima: odos ir kailio, akių ir gleivinės kitimus, kvėpavimo, kraujo, periferinės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos bei elgsenos kitimus.
\n

7.1.2. Atitinkamais laiko tarpais atliekamas papildomų bandomųjų grupių gyvūnų klinikinis apžiūrėjimas.

\n

7.1.3. Reguliariai atliekami gyvūnų stebėjimai užtikrina, kad gyvūnai nekristų bandymo metu dėl kanibalizmo, audinių autolizės bei vietos pakeitimo. Kritę gyvūnai pašalinami bei skrodžiami.

\n

7.1.4. Registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai, įskaitant nervų sistemos bei akių pokyčius, bei žuvimas. Ypatingas dėmesys skiriamas auglio augimui: registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo bei užčiuopiamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis ir išorė. Fiksuojamas kiekvieno toksiškumo požymio atsiradimo bei plėtimosi laikas.

\n

7.1.5. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę matuojamas pašaro (ir vandens, jei bandomoji medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu) įsisavinimas; vėliau tai atliekama kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar kūno masės kitimai verčia elgtis kitaip.

\n

7.1.6. Pirmąsias 13 tyrimo savaičių kas savaitę sveriamas kiekvienas gyvūnas ir individualiai užrašoma jo kūno masė, vėliau tai atliekama vieną kartą per mėnesį.

\n
8.Klinikiniai tyrimai 8.1. Hematologinis tyrimas 8.1.1. Praėjus trims, šešiems mėnesiams, o po to kas pusę metų, surinkus kraujo mėginius iš kiekvienos grupės dešimties kiekvienos lyties žiurkių, atlikti hematologinį tyrimą (nustatant hemoglobino kiekį, eritrocitų užimamą tūrį kraujyje, bendrą eritrocitų, leukocitų ir trombocitų skaičių, kitus rodiklius kraujo krešėjimo aktyvumui įvertinti). Jei įmanoma, tai kraujo mėginiai imami iš tų pačių žiurkių tokiu pačiu laiko tarpu.
\n

8.1.2. Jei, atsižvelgiant į laikomų narveliuose gyvūnų stebėjimus, spėjama, kad bandymo metu sutriko gyvūnų sveikata, tai atliekama paveiktų bandomąja medžiaga gyvūnų diferencinė kraujo analizė.

\n

8.1.3. Kraujo diferencinė analizė atliekama gavusiems didžiausią medžiagos dozę gyvūnams bei kontrolinės grupės gyvūnams. Jei šie duomenys, ypač duomenys, gauti prieš numarinimą, arba patologinių tyrimų duomenys rodo, kad reikia ištirti kraują, tai diferencinė kraujo analizė atliekama grupei, gavusiai žemesnę dozę.

\n

8.2. Šlapimo analizė 8.2.1. Surinkti šlapimo mėginius iš kiekvienoje grupėje esančių dešimties kiekvienos lyties žiurkių, jei įmanoma, surenkama iš tų pačių žiurkių tais pačiais laiko tarpais, kai buvo atliekami hematologiniai tyrimai.

\n

8.2.2. Atlikti kiekvieno gyvūno arba bendro visų gyvūnų mėginio, arba vienos lyties gyvūnų, esančių vienoje graužikų grupėje, tokius tyrimus:

\n

8.2.1.1. bendras vaizdas: individualaus gyvūno šlapimo tūris bei tankumas;

\n

8.2.1.2. baltymų, gliukozės, ketonų, paslėpto kraujo kiekis (pusiau kiekybiškai);

\n

8.2.1.3. nuosėdų mikroskopinis vaizdas (pusiau kiekybiškai).

\n

8.3. Klinikinė chemija 8.3.1. Kas šeši mėnesiai ir tyrimo pabaigoje iš visų negraužikų bei 10 abiejų lyčių žiurkių, priklausančių visoms grupėms, jei įmanoma, iš tų pačių žiurkių tuo pačiu laiku surenkami kraujo mėginiai, kurie vėliau ištiriami.

\n

8.3.2. Paėmus mėginius, atskiriama plazma, kurioje nustatomi tokie rodikliai:

\n

8.3.2.1. bendra baltymo koncentracija;

\n

8.3.2.2. albumino koncentracija;

\n

8.3.2.3. kepenų funkciniai testai (tokie kaip šarminės fosfatazės aktyvumas, serumo alaninaminotransferazės aktyvumas, serumo aspartataminotransferazės aktyvumas, g – glutamiltranspeptidazės ir ornitino dekarboksilazės aktyvumas);

\n

8.3.2.4. angliavandenių metabolizmas, įvertinant gliukozės kraujyje trūkumą;

\n

8.3.2.5. inkstų funkciniai testai, tokie kaip kraujo karbamido nustatymas.

\n

8.4. Skrodimas 8.4.1. Atliekamas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos, kurie krito bandymų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie krenta. Prieš numarinimą paimami visų gyvūnų kraujo mėginiai, kad būtų atlikta diferencinė kraujo analizė. Visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, turi būti užkonservuoti. Reikia ieškoti sąsajų tarp pagrindinių stebėjimų duomenų ir mikroskopinio vertinimo rezultatų.

\n

8.4.2. Histopatologiniams tyrimams išsaugomi, laikant atitinkamoje terpėje, tokie audiniai ir organai: smegenys (sveria 10 kiekvienos lyties gyvūnų grupėje) - (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievė, hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liaukos audinys, plaučiai (trachėja), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), blužnis, inkstai (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), antinksčiai (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, gaubiančioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos (serumo alaninaminotransferazės aktyvumas), pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant ir segmentinį paviršių) ir akys.

\n

8.4.3. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo bandymuose svarbus atitinkamiems histopatologiniams tyrimams atlikti. Įkvėpimo bandymo atveju išsaugomi visi kvėpavimo organai, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę.

\n

8.4.4. Jei atliekami kiti klinikiniai tyrimai, gauta informacija turi būti prieinama prieš atliekant mikroskopinę analizę, nes tai gali sudaryti ženklias gaires patologo darbui.

\n

8.5. Histopatologinis tyrimas 8.5.1. Atliekant chroninio toksiškumo bandymą: detaliai ištirti visų, gavusių didelę dozę bei kontrolinių grupių gyvūnų užkonservuotus organus. Jei didelę dozę gavusioje papildomoje grupėje nustatomi su bandomąja medžiaga susiję patologiniai kitimai, tai bet kurios kitos bandomąja medžiaga veiktos grupės gyvūnų organai, veikti bandomąja medžiaga, turi būti visiškai histologiškai ištirti, tai turi būti padaryta ir bandomųjų grupių, atliekant kancerogeniškumo bandymą bei jo pabaigoje, atveju.

\n

8.5.2. Atliekant kancerogeniškumo bandymą:

\n

8.5.2.1. visų kontrolinės ir didžiausią dozę gavusių grupių gyvūnų odos, organų ir audinių visapusiškas histopatologinis įvertinimas;

\n

8.5.2.2. visi akivaizdžiai matomi augliai, pakitę audiniai arba organai, kurie įtariami kaip augliai, mikroskopiškai ištiriami visose grupėse;

\n

8.5.2.3. jei gavusios didelę dozę ir kontrolinė grupės skiriasi pagal neoplastinių sutrikimų pasireiškimą, tai ištiriami konkretūs šių grupių organai ar audiniai;

\n

8.5.2.4. jei didelę dozę gavusioje grupėje gyvūnų išlikimas yra ženkliai mažesnis negu kontrolinėje, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė;

\n

8.5.2.5. jei yra įrodymas, kad toksiniai ar kiti poveikiai turėjo įtaką neoplastiniam atsakui grupėje, gavusioje didelę dozę, tai detaliai ištiriama kita, mažesnę dozę gavusi, grupė.

\n

II. DUOMENYS 9. Duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti augliai, bandymo metu, skaičius, auglių nustatymo laikas bei gyvūnų, kuriuose buvo nustatyti augliai numarinimo metu, skaičius. Skaitmeniniai rezultatai apdorojami tinkamais statistiniais metodais, kurie parenkami planuojant bandymą. Galima taikyti bet kokį pripažintą statistinio apdorojimo metodą.

\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija:

\n

10.1. rūšis, veislė, kamienas, gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir pan.;

\n

10.2. tyrimo sąlygos:

\n

10.2.1. poveikio sistemos aprašymas su smulkiomis techninėmis charakteristikomis; gyvūnų laikymo bandymo kameroje aprašymas; temperatūros, drėgmės, koncentracijos matuoklių aprašymas su techninėmis charakteristikomis;

\n

10.2.2. veikimo metu gauti duomenys: pateikiami lentelėse, nurodant vidutines vertes ir variacijos matą (pavyzdžiui, standartinį nukrypimą) ir pateikiant:

\n

10.2.2.1. oro srauto greičius per inhaliacijos prietaisą;

\n

10.2.2.2. oro temperatūrą ir drėgmę;

\n

10.2.2.3 vardines koncentracijas (bendras bandomosios medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos prietaisą, padalytas iš oro tūrio);

\n

10.2.2.4. tirpiklio (jei naudotas) rūšis;

\n

10.2.2.5. tikrąsias koncentracijas kvėpavimo zonoje bandymo metu;

\n

10.2.2.6. vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma tai nurodyti);

\n

10.2.2.7. dozes (įskaitant tirpiklį, jei taikytas) ir koncentracijas.

\n

10.3. duomenys apie atsaką į toksinį poveikį, įskaitant toksiškumo požymius, pagal lytį ir dozę;

\n

10.4. gyvūnų kritimo laikas bandymo metu arba gyvūnai, išgyvenę iki bandymo pabaigos;

\n

10.5. toksiškumo požymiai atsižvelgiant į lytį ir dozę;

\n

10.6. toksiškumo ir kitų poveikių aprašymas;

\n

10.7. kiekvieno anormalinio požymio stebėjimo laikas ir jo tolesnė plėtra;

\n

10.8. oftalmologinių stebėjimų duomenys;

\n

10.9. duomenys apie šėrimą ir kūno masės kitimą;

\n

10.10. atlikti hematologiniai tyrimai, palyginti su norma;

\n

10.11. atlikti biocheminiai tyrimai (įskaitant šlapimo analizę), palyginti su norma;

\n

10.12. skrodimo duomenys;

\n

10.13. detalus histopatologinių pokyčių aprašymas;

\n

10.14. statistinis rezultatų apdorojimas, kai tinka;

\n

10.15. duomenų aptarimas;

\n

10.16. duomenų interpretavimas.

\n
11.Įvertinimas ir interpretacija. Šio metodo duomenų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.
\n

IV. NUORODOS 12. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ Patvirtinta Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B34 METODAS: TOKSIŠKUMO REPRODUKCIJAI VIENOS KARTOS BANDYMAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) patvirtintame Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas).

\n
2.Apibrėžimai. Šio metodo apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.
\n
3.Pamatinės medžiagos. Nėra.
\n
4.Bandymo metodo principas 4.1. Bandomoji medžiaga duodama laipsniškai keičiamomis dozėmis kelioms eksperimentinių grupių gyvūnams: patinams bei patelėms. Patinams dozės duodamos augimo metu ir pasibaigus vienai spermatogenezei (praėjus penkiasdešimt šešioms dienoms – pelių patinams ir septyniasdešimt dienų – žiurkių patinams), norint įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius spermatogenezei.
\n

4.2. Tėvinės (P) kartos patelėms duodama dozė praėjus dviems rujoms, kad būtų galima įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius kiaušinėlių subrendimui. Tada gyvūnai suporuojami. Bandomoji medžiaga duodama abiejų lyčių gyvūnams poravimosi metu, vėliau duodama tik patelėms, nėštumo, o vėliau žindymo metu.

\n

4.3. Medžiagos davimo įkvepiant metodą reikia modifikuoti.

\n
5.Kokybės kriterijai. Nėra.
\n
6.Bandymo metodo aprašymas 6.1. Pasiruošimas 6.1.1. Sveiki gyvūnų jaunikliai „aklos atrankos“ metodu atrenkami ir suskirstomi į bandomąją bei kontrolinę grupes. Penkias dienas prieš bandymą gyvūnai aklimatizuojami laboratorijos sąlygomis.
\n

6.1.2. Bandomoji medžiaga duodama kartu su pašaru ar geriamuoju vandeniu. Galima naudoti ir kitus davimo būdus. Visiems gyvūnams bandomosios medžiagos dozė duodama taip pat atitinkamo eksperimentinio periodo metu. Jei dozavimui naudojamas tirpiklis ar kiti priedai, tai jie neturi sukelti toksinio poveikio.

\n

6.1.3. Dozė duodama septynis kartus per savaitę.

\n

6.2. Eksperimentiniai gyvūnai 6.2.1. Dažniausiai naudojamos pelės arba žiurkės. Naudojami sveiki gyvūnai, kurių atžvilgiu anksčiau nebuvo taikytos eksperimentinės procedūros. Bandomieji gyvūnai apibūdinami pagal rūšį, kamieną, lytį, masę ir/ar amžių.

\n

6.2.2. Vaisingumui įvertininti, tiriami patinai ir patelės. Prieš pradedant duoti dozę, visi bandomieji bei kontroliniai gyvūnai atjunkomi.

\n

6.3. Skaičius ir lytis. Gyvūnų skaičius bandomojoje ir kontrolinėje grupėse – dvidešimt apvaisintų patelių. Siekiama užtikrinti pakankamą vaisingumą ir prieauglio skaičių, norint įvertinti bandomosios medžiagos sugebėjimą daryti įtaką vislumui ir patelių elgesui tėvinės kartos (P) gyvūnuose nuo apvaisinimo iki subrendimo, pirmosios kartos (F1) palikuonių žindymui, augimui bei vystymosi svarbą.

\n

6.4. Bandymo sąlygos. Pašaras ir vanduo duodami pasirinktinai. Artėjant atsivedimui patelės atskiriamos, perkeliant jas į atsivedimui ar motinoms skirtus narvelius, kurie aprūpinti būtiniausiomis medžiagomis gūžtos susukimui.

\n

6.5. Dozės. Naudojamos trys bandomosios bei kontrolinė grupės. Jei bandomoji medžiaga duodama, naudojant tirpiklį, tai kontrolinė grupė kartu su tirpikliu turi gauti didžiausią bandomosios medžiagos kiekį. Jei bandomoji medžiaga pasisavinama ar sunaudojama su pašaru sunkiai, naudojama gretutinė maitinama kontrolinė grupė. Neatsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizikinę cheminę prigimtį ar biologinio veikimo ribotą efektą, didžiausia dozė turi sukelti toksiškumą bet ne mirtį tėvinės (P) kartos gyvūnų tarpe. Tarpinė bandomosios medžiagos dozė turi sukelti minimalų toksinį poveikį, o maža dozė neturi sukelti jokio pastebimo žalingo poveikio tėvams ar palikuonims. Kai kiekvienam gyvūnui medžiagos dozė duodama per zondą arba su kapsule, tai ji parenkama atsižvelgiant į kiekvieno gyvūno kūno masę ir kalibruojama kiekvieną savaitę priklausomai nuo kūno masės pokyčių. Nėštumo metu medžiagos davimas dozėmis patelėms pagrindžiamas kūno masės duomenimis nulinę arba šeštąją nėštumo dieną, jei to pageidaujama.

\n

6.6. Kontrolė. Jei naudojant mažo toksiškumo medžiagas, dozė - 1000 mg/kilogramui – netrukdo dauginimuisi, tai laikomasi nuostatos, kad bandymas, naudojant kitas dozes, nėra būtinas. Jei išankstinio bandymo metu naudojama didelė dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą patelėse, nepažeidžia vaisingumo, tai laikomasi nuostatos, jog bandymas naudojant kitas dozes nėra būtinas.

\n
7.Bandymo eiga 7.1. Dozavimas. Kasdienis dozės davimas tėvinės (P) kartos patinams prasideda, kai jie sulaukia 5–9 savaičių amžiaus, atjunkomi ir penkias dienas aklimatizuojami. Žiurkėms dozės davimas pratęsiamas dešimčiai savaičių, likusių iki suporavimo periodo (pelėms –pratęsiamas aštuonioms savaitėms). Poravimosi periodo pabaigoje patinai numarinami ir tiriami arba paliekami gyvi ir šeriami bandymo metu iki antrosios vados atsiradimo, po kurios jie numarinami bei tiriami prieš pasibaigiant bandymui. Tėvinės (P) kartos patelėms dozė pradedama duoti iškart po penkias dienas trukusios aklimatizacijos ir tęsiasi dvi savaites iki poravimosi periodo pradžios. Patelėms dozė duodama kiekvieną dieną tris savaites trunkančio poravimosi periodo bei nėštumo metu iki F1 kartos palikuonių atjunkymo. Dozės davimo tvarkaraštis keičiamas, remiantis prieinama informacija apie bandomosios medžiagos sukeliamą metabolizmą arba bioakumuliaciją.
\n

7.2. Poravimosi sąlygos 7.2.1. Bandant toksiškumo įtaką dauginimuisi, poruojama santykiu 1:1 (vienas patinas ir viena patelė) arba santykiu 1:2 (vienas patinas ir dvi patelės).

\n

7.2.2. Poruojant santykiu 1:1, viena patelė laikoma kartu su vienu patinu, kol prasideda nėštumas arba praeina trys savaitės. Kiekvieną rytą patelės tiriamos, ieškant spermos arba makšties išskyrų. Nulinė nėštumo diena yra ta, kai randama sperma arba makšties išskyros.

\n

7.2.3. Nesusiporavę poros laikomos nevaisingomis. Todėl papildomai poruojama su kitais veisliniais patinais ar patelėmis, mikroskopiškai analizuojant dauginimosi organus ir tiriant kiaušinėlio ir spermatozoidų susiformavimo ciklą.

\n

7.3. Vados dydis 7.3.1. Gyvūnams, kuriems vaisingumo tyrimo metu duodama dozė, leidžiama normaliai atsivesti palikuonių ir prižiūrėti juos iki atjunkymo, nestandartizuojant vados dydžio.

\n

7.3.2. Atliekant vados dydžio standartizavimą, praėjus 1–4 dienoms po gimimo, kiekvienos vados dydis reguliuojamas, pašalinant perteklinį prieauglį „aklos atrankos“ metodu, kad vienoje vadoje liktų keturi patinėliai ir keturios patelės. Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis kiekvienos lyties palikuonis, priimtinas dalinis palikuonių skaičiaus reguliavimas (pvz., penki patinėliai ir trys patelės). Vadų, kuriose yra mažiau nei aštuoni palikuonys, skaičius nereguliuojamas.

\n

7.4. Stebėjimas 7.4.1. Bandymo metu kiekvienas gyvūnas stebimas kiekvieną dieną registruojant elgesio pokyčius, komplikuoto arba užsitęsusio nėštumo požymius ir visus toksiškumo požymius, įskaitant kritimą. Prieš poravimosi periodą ir jo metu kasdien įvertinamas pašaro suvartojimas. Pasibaigus gimdymui ir prasidėjus laktacijai, pasveriama vada įvertintinus pašaro suvartojimą (tuo pat metu įvertinamas geriamo vandens suvartojimas, jei bandomoji medžiaga duodama su vandeniu). Pirmąją dozės davimo dieną ir vėliau po savaitės pasveriami tėvinės (P) kartos patinai ir patelės. Stebėjimai, registruojami ištyrus kiekvieną gyvūną atskirai.

\n

7.4.2. Nėštumo trukmė pradedama skaičiuoti nuo nulinės dienos. Kiekviena vada tiriama, norint nustatyti naujagimių lytį, gimimų skaičių ir pagrindines anomalijas.

\n

7.4.3. Kritę ir ketvirtą dieną po gimimo numarinti jaunikliai tiriami, ieškant sutrikimų. Gimę jaunikliai pasveriami. Sveriama po ketvirtos bei septintos dienos ir po savaitės bei kol baigsis tyrimas, kiekvienas gyvūnas sveriamas atskirai. Registruojami fiziniai ar elgesio sutrikimai veislinėse patelėse bei jų palikuonyse.

\n
8.Patologija 8.1. Skrodimas. Bandymo metu numarinus ar kritus tėvinės kartos (P) gyvūnams, jie makroskopiškai ištiriami, nustatomos bet kokios struktūrinės anomalijos ir patologiniai pakitimai, atkreipiant dėmesį į dauginimosi organus. Kritę ar gaištantys gyvūnai ištiriami, siekiant nustatyti sutrikimus.
\n

8.2. Histopatologinis tyrimas 8.2.1. Mikroskopiškai ištiriami tėvinės (P) kartos gyvūnų kiaušidės, gimda, gimdos kaklelis, makštis, sėklidės, sėklidės prielipas, prostata, koaguliacijos liauka, hipofizis bei bandomąja medžiaga paveikti organai. Jei atliekant bandymą ir naudojant daug skirtingų dozių šie organai nebuvo tirti, tai jie mikroskopiškai ištiriami didelę dozę gavusiuose gyvūnuose, kontrolinės grupės gyvūnuose bei bandymo metu kritusiuose gyvūnuose, jei tai įmanoma.

\n

8.2.2. Gyvūnų organai, kuriuose nustatytos anomalijos, ištiriami visuose likusiuose tėvinės (P) kartos gyvūnuose. Mikroskopiškai tiriami audiniai, kuriuose pastebėti pagrindiniai patologiniai pokyčiai. Gyvūnų, kurie, kaip įtariama, gali būti nevaisingi, dauginimosi organai tiriami mikroskopiškai.

\n

II. DUOMENYS 9. Duomenys pateikiami apibendrintai, lentelėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, vaisingų bei nėščių patelių skaičius, pokyčių tipai ir gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pokyčiai, skaičius, išreikštas procentais.

\n
10.Jei įmanoma, duomenys, išreikšti skaičiais, apdorojami pasitelkus bet kokį pripažintą statistinį metodą.
\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 11. Bandymo protokolas. Bandymo protokole pateikiama tokia informacija:

\n

11.1. panaudota gyvūnų rūšis bei kamienas;

\n

11.2. duomenys apie toksinį atsaką pagal bandytą lytį ir duotą dozę, įskaitant vaisingumą, nėštumą ir gyvybingumą;

\n

11.3. jei įmanoma, tai dozės lygis, kuriam esant jokių pokyčių nebuvo pastebėta;

\n

11.4. kritimo laikas bandymo metu arba jei gyvūnai išliko gyvi iki bandymo pabaigos;

\n

11.5. toksinių ir kitų požymių apibūdinimas;

\n

11.6. kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas;

\n

11.7. numarinimo laikas bandymo metu arba numatyto gyvūnų numarinimo, prieš užbaigiant bandymą, laikas, 11.8. lentelė, kurioje pateikiama kiekvienos vados kūno masė, jauniklių kūno masių vidurkiai ir kiekvieno jauniklio kūno masė bandymo pabaigoje;

\n

11.9. toksiniai ar kiti pokyčiai, turintys įtakos dauginimuisi, palikuonims bei jų vystymuisi;

\n

11.10. tėvinės (P) kartos gyvūnų kūno masė;

\n

11.11. skrodimo metu gauti duomenys;

\n

11.12. mikroskopinių tyrimų duomenų detalus apibūdinimas;

\n

11.13. duomenų statistinė analizė, jeigu įmanoma tai padaryti;

\n

11.14. duomenų aptarimas;

\n

11.15. duomenų aiškinimas.

\n
12.Įvertinimas ir interpretacija. Šio metodo duomenų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.
\n

IV. NUORODOS 13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B35: TOKSIŠKUMO REPRODUKCIJAI DVIEJŲ KARTŲ BANDYMAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) patvirtintame Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas).

\n
2.Apibrėžimai. Šio metodo apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.
\n
3.Pamatinės medžiagos. Nėra.
\n
4.Bandymo metodo principas 4.1. Bandomoji medžiaga duodama laipsniškai keičiamomis dozėmis kelioms eksperimentinių grupių gyvūnams patinams bei patelėms. Tėvinės kartos (P) patinams dozės duodamos augimo metu ir pasibaigus vienai spermatogenezei (praėjus penkiasdešimt šešioms dienoms – pelių patinams ir septyniasdešimt dienų – žiurkių patinams), norint įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius spermatogenezei.
\n

4.2. Tėvinės (P) kartos patelėms duodama dozė praėjus dviems rujoms, kad įvertinti bet kokius neigiamus bandomosios medžiagos poveikius kiaušinėlių subrendimui. Po to gyvūnai suporuojami. Bandomoji medžiaga duodama abejoms lytims poravimosi metu, vėliau duodama tik patelėms, iš pradžių nėštumo, o vėliau žindymo metu. Atjunkymo metu bandomoji medžiaga duodama (F1) palikuonims, jiems augant iki subrendimo, poravimosi metu ir (F2) kartai atsiradus iki (F2) kartos atjunkymo.

\n

4.3. Medžiagos davimo įkvepiant metodą reikia modifikuoti.

\n
5.Kokybės kriterijai. Nėra.
\n
6.Bandymo metodo aprašymas 6.1. Pasiruošimas. Prieš tyrimą sveiki gyvūnai „aklos atrankos“ metodu atrenkami ir suskirstomi į bandomąją bei kontrolinę grupes. Penkias dienas prieš bandymą tėvinės (P) kartos gyvūnai aklimatizuojami laboratorijos sąlygomis. Bandomoji medžiaga duodama kartu su pašaru ar geriamuoju vandeniu. Galima naudoti ir kitus davimo būdus. Visiems gyvūnams bandomosios medžiagos dozė duodama taip pat viso eksperimentinio periodo metu. Jei dozavimui naudojamas tirpiklis ar kiti priedai, tai jie neturi sukelti toksinio poveikio. Dozė duodama septynis kartus per savaitę.
\n

6.2. Eksperimentiniai gyvūnai 6.2.1. Dažniausiai naudojamos pelės arba žiurkės. Naudojami sveiki tėvinės (P) kartos gyvūnai, kurių atžvilgiu anksčiau nebuvo taikytos eksperimentinės procedūros. Nenaudojami mažai vaisingi kamienai. Bandomieji gyvūnai apibūdinami pagal rūšį, kamieną, lytį, masę ir/ar amžių.

\n

6.2.2. Vaisingumo įvertinimui tiriami patinai ir patelės. Prieš pradedant duoti dozę visi bandomieji bei kontroliniai gyvūnai atjunkomi.

\n

6.3. Skaičius ir lytis. Gyvūnų skaičius bandomojoje ir kontrolinėje grupėse – dvidešimt apvaisintų patelių. Siekiama užtikrinti pakankamą nėštumo ir prieauglio skaičių, įvertinti bandomosios medžiagos sugebėjimą daryti įtaką vislumui, nėštumui ir patelių tėvinės (P) kartos elgesui F1 palikuonių žindymui, augimui ir vystymuisi nuo apvaisinimo iki subrendimo ir jų palikuonims (F2) iki atjunkymo svarbą.

\n

6.4. Bandymo sąlygos. Pašaras ir vanduo duodami pasirinktinai. Artėjant atsivedimui patelės atskiriamos, perkeliant jas atsivedimui ar motinoms skirtus narvelius, kurie aprūpinti būtiniausiomis medžiagomis gūžtos susukimui.

\n

6.5. Dozės. Naudojamos trys bandomosios bei kontrolinė grupės. Jei bandomoji medžiaga duodama naudojant tirpiklį, tai kontrolinė grupė kartu su tirpikliu turi gauti didžiausią bandomosios medžiagos kiekį. Jei bandomoji medžiaga pasisavinamą ar sunaudojimą su pašaru sunkiai, naudojama gretutinė maitinama kontrolinė grupė. Neatsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizikinę cheminę prigimtį ar biologinio veikimo ribotą poveikį, didžiausia dozė turi sukelti toksiškumą bet ne mirtį tėvinės (P) kartos gyvūnų tarpe. Tarpinė bandomosios medžiagos dozė turi sukelti minimalius toksinius poveikius, o maža dozė neturi sukelti jokių pastebimų žalingų poveikių tėvams ar palikuonims. Kai kiekvienam gyvūnui medžiagos dozė duodama per zondą arba su kapsule, tai ji parenkama atsižvelgiant į kiekvieno gyvūno kūno masę ir kalibruojama kiekvieną savaitę priklausomai nuo kūno masės pokyčių. Nėštumo metu medžiagos davimas dozėmis patelėms pagrindžiamas kūno masės duomenimis nulinę arba šeštąją nėštumo dieną, jei to pageidaujama.

\n

6.6. Kontrolė. Jei naudojant mažo toksiškumo medžiagas, dozė - 1000 mg/ kilogramui – netrukdo dauginimuisi, tai laikomasi nuostatos, kad bandymas, naudojant kitas dozes, nėra būtinas. Jei išankstinio bandymo metu naudojama didelė dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą patelėse, nepažeidžia vaisingumo, tai laikomasi nuostatos, jog bandymas, naudojant kitas dozes nėra būtinas.

\n
7.Bandymo eiga 7.1. Dozavimas 7.1.1. Kasdienis dozės davimas tėvinės (P) kartos patinams pradedamas, kai jie sulaukia 5–9 savaičių amžiaus, atjunkomi ir penkias dienas aklimatizuojami. Žiurkėms dozės davimas pratęsiamas dešimčiai savaičių, likusių iki suporavimo periodo (pelėms – pratęsiamas aštuonioms savaitėms). Poravimosi periodo pabaigoje patinai numarinami ir tiriami arba jie paliekami gyvi, kad patelės atsivestų antrąją vadą, po kurios jie numarinami bei tiriami prieš pasibaigiant tyrimui.
\n

7.1.2. Tėvinės (P) kartos patelėms dozė pradedama duoti iškart po penkias dienas trukusios aklimatizacijos ir tęsiasi dvi savaites iki poravimosi periodo pradžios. Patelėms dozė duodama kiekvieną dieną tris savaites trunkančio poravimosi periodo bei nėštumo metu iki F1 kartos palikuonių atjunkymo. Dozės davimo tvarkaraštis keičiamas, remiantis prieinama informacija apie bandomosios medžiagos sukeliamą metabolizmą arba bioakumuliaciją.

\n

7.1.3. (F1) kartos gyvūnams dozė pradedama duoti iškart po atjunkymo iki numarinimo.

\n

7.2. Poravimosi sąlygos 7.2.1. Bandant toksiškumo įtaką dauginimuisi, poruojama arba santykiu 1:1 (vienas patinas ir viena patelė) arba santykiu 1:2 (vienas patinas ir dvi patelės).

\n

7.2.2. Poruojant santykiu 1:1, viena patelė laikoma kartu su vienu patinu, kol prasideda nėštumas arba praeina trys savaitės. Kiekvieną rytą patelės tiriamos, ieškant spermos arba makšties išskyrų. Nulinė nėštumo diena yra ta, kai randama sperma arba makšties išskyros. Atsižvelgiant į spermatogenezę, nereikia poruoti (F1) kartos palikuonių, kol jie nesulaukia vienuolikos savaičių amžiaus (pelės) arba trylikos savaičių (žiurkės). Poruojant (F1) palikuonis, iš kiekvienos vados „aklos atrankos“ metodu parenkamas vienas patinas bei viena patelė, tam, kad jie būtų kryžmiškai suporuojami su kitos vados jaunikliais, gaunančiais tą pačią dozę ir kad atsirastų antroji (F2) palikuonių karta. Pirmos kartos (F1) patinai ir patelės, kurie nebuvo atrinkti suporavimui, numarinami atjunkymo metu.

\n

7.2.3. Poros, kurios nesusiporavo, laikomos nevaisingomis. Todėl papildomai poruojama su kitais veisliniais patinais ar patelėmis, mikroskopiškai analizuojant dauginimosi organus ir tiriant kiaušinėlio ir spermatozoidų susiformavimo ciklą.

\n

7.3. Vados dydis 7.3.1. Gyvūnams, kuriems vaisingumo tyrimo metu duodama dozė, leidžiama normaliai atsivesti palikuonių ir prižiūrėti juos iki atjunkymo, nestandartizuojant vados dydžio.

\n

7.3.2. Atliekant vados dydžio standartizavimą, praėjus vienai–keturioms dienoms po gimimo, kiekvienos vados dydis reguliuojamas pašalinant perteklinį prieauglį „aklos atrankos“ metodu, kad vienoje vadoje liktų keturi patinėliai ir keturios patelės. Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis kiekvienos lyties palikuonis, priimtinas dalinis palikuonių skaičiaus reguliavimas (pvz., penki patinėliai ir trys patelės). Vadų, kuriose yra mažiau nei aštuoni palikuonys, skaičius nereguliuojamas. Antros kartos (F2) vadų dydžio reguliavimas atliekamas tokiu pačiu būdu.

\n

7.4. Stebėjimas 7.4.1. Bandymo metu kiekvienas gyvūnas stebimas kiekvieną dieną registruojant elgesio pokyčius, komplikuoto arba užsitęsusio nėštumo požymius ir visus toksiškumo požymius, įskaitant kritimą. Prieš poravimosi periodą ir jo metu, nėštumo metu kiekvieną dieną įvertinamas pašaro suvartojimas. Pasibaigus gimdymui ir prasidėjus laktacijai, pasveriama vada įvertinant pašaro suvartojimą. Pirmąją dozės davimo dieną ir vėliau po savaitės pasveriami tėvai (P ir F1 kartos). Stebėjimai registruojami ištyrus kiekvieną gyvūną atskirai.

\n

7.4.2. Nėštumo trukmė pradedama skaičiuoti nuo nulinės dienos. Kiekviena vada tiriama, norint nustatyti naujagimių lytį, gimimų skaičių ir pagrindines anomalijas.

\n

7.4.3. Kritę ir ketvirtą dieną po gimimo numarinti jaunikliai tiriami, ieškant sutrikimų. Gyvi naujagimiai suskaičiuojami ir vados pasveriamos gimimo rytą, po ketvirtos bei septintos dienos ir po savaitės bei sveriami, kol baigsis bandymas, kiekvienas gyvūnas sveriamas atskirai. Registruojami fiziniai ar elgesio sutrikimai veislinėse patelėse bei jų palikuonyse.

\n
8.Patologija 8.1. Skrodimas 8.1.1. Visi tėvinės (P) ir pirmosios palikuonių kartos (F1) gyvūnai numarinami, kai jų nebereikia įvertinant bandomosios medžiagos poveikį dauginimuisi. Atjunkymo metu numarinami F1 palikuonys, kurie nebuvo atrinkti suporavimui, taip pat ir (F2) palikuonys.
\n

8.1.2. Bandymo metu numarinus ar kritus visiems tėvams (P ir F1 kartų gyvūnams), jie mikroskopiškai ištiriami, kad būtų nustatytos bet kokios struktūrinės anomalijoss ar patologiniai pakitimai, atkreipiant dėmesį į dauginimosi organus. Kritę ar gaištantys jaunikliai ištiriami, siekiant nustatyti sutrikimus.

\n

8.2. Histopatologinis tyrimas 8.2.1. Mikroskopiškai ištiriami visų tėvų (P ir F1 kartų gyvūnų) kiaušidės, gimda, gimdos kaklelis, makštis, sėklidės, sėklidės prielipas, prostata, koaguliacijos liauka, hipofizis bei bandomąja medžiaga paveikti organai. Jei atliekant tyrimus ir naudojant daug skirtingų dozių šie organai nebuvo tirti, jie mikroskopiškai ištiriami didelę dozę gavusiuose kontroliniuose (P ir F1) gyvūnuose, atrinktuose suporavimui bei bandymo metu nugaišusiuose gyvūnuose, jei tai įmanoma.

\n

8.2.2. Gyvūnų organai, kuriuose buvo nustatytos anomalijos, ištiriami kitas dozes gavusiuose gyvūnuose. Mikroskopiškai tiriami audiniai, kuriuose pastebėti pagrindiniai patologiniai pokyčiai. Gyvūnų, kurie, kaip įtariama, gali būti nevaisingi, dauginimosi organai tiriami mikroskopiškai.

\n

II. DUOMENYS 9. Duomenys pateikiami apibendrintai lentelėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grupės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, vaisingų bei nėščių patelių skaičius, pokyčių tipai ir gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pokyčiai, skaičius, išreikštas procentais.

\n
10.Jei įmanoma, tai duomenys, išreikšti skaičiais, turėtų būti apdorojami, pasitelkus atitinkamą statistinį metodą. Reikėtų panaudoti bet kokį visuotinai naudojamą statistinį metodą.
\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 11. Bandymo protokolas. Bandymo protokole pateikiama tokia informacija:

\n

11.1. panaudota gyvūnų rūšis bei kamienas;

\n

11.2. duomenys apie toksinį atsaką pagal bandytą lytį ir duotą dozę, įskaitant vaisingumo, nėštumo ir gyvybingumo rodiklius;

\n

11.3. jei įmanoma, tai dozės lygis, kuriam esant jokių pokyčių nebuvo pastebėta;

\n

11.4. kritimo laikas bandymo metu arba jei gyvūnai išliko gyvi iki tyrimo pabaigos;

\n

11.5. lentelė, kurioje pateikiamos kiekvienos vados, vidutinė jauniklio ir kiekvieno jauniklio kūno masės tyrimo pabaigoje;

\n

11.6. dauginimąsi, palikuonis bei augimą po gimimo, lemiantys toksiniai ir kiti poveikiai;

\n

11.7. kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas;

\n

11.8. tėvinės (P) kartos gyvūnų ir pirmos (F1) kartos palikuonių, atrinktų suporavimui, kūno masės;

\n

11.9. skrodimo metu gauti duomenys;

\n

11.10. mikroskopinių tyrimų duomenų detalus apibūdinimas;

\n

11.11. duomenų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti;

\n

11.12. duomenų aptarimas.

\n

11.13. duomenų aiškinimas.

\n
12.Įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų įvertinimas ir interpretacija pateikti Bendrajame įvade.
\n

IV. NUORODOS 13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ Patvirtinta Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B36 METODAS: TOKSIKOKINETIKA I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) patvirtintame Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas).

\n
2.Apibrėžimai. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.
\n
3.Pamatinės medžiagos. Nėra.
\n
4.Bandymo metodo principas 4.1. Tiriamoji medžiaga duodama atsižvelgiant į tyrimo tikslą tam tikrais periodais, paviene ar kartotinėmis dozėmis, eksperimentinių grupių gyvūnams. Vėliau priklausomai nuo tyrimo tipo kūno skysčiuose, audiniuose ir/ar ekskretuose nustatoma medžiaga ir/ar jos metabolitai.
\n

4.2. Galima tirti „nežymėtas“ ir „žymėtas“ tiriamosios medžiagos formas. Jei naudojama žymė, tai ji į tiriamąją medžiaga įvedama taip, kad būtų galima gauti kuo išsamesnės informacijos apie junginio likimą.

\n
5.Kokybės kriterijai. Nėra.
\n
6.Bandymo metodo aprašymas 6.1. Pasiruošimas. Penkias dienas prieš tyrimą sveiki jauni gyvuliukai aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis. Prieš pradedant tyrimą, gyvūnai „aklos atrankos“ metodu atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Ypatingais atvejais galima naudoti labai jaunus gyvūnus, nėščias pateles bei gyvūnus, iš anksto paveiktus tiriamąja medžiaga.
\n

6.1.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Toksikokinetiniai tyrimai atliekami, panaudojant vieną ar daugiau atitinkamų gyvūnų rūšių atsižvelgiant į rūšis, kurios yra naudojamos ir kurios pasirinktos naudoti kituose tos pačios tiriamosios medžiagos toksikologiniuose tyrimuose. Jei teste naudojami graužikai, tai jų kūno masės variacija neturėtų viršyti ± 20 % kūno masės vidurkio.

\n

6.1.2. Skaičius ir lytis.

\n

6.1.2.1. Atliekant absorbcijos ir ekskrecijos tyrimus, iš pradžių kiekvienoje grupėje, kuriai duodama skirtinga dozė, turi būti po keturis gyvūnus. Lyties pasirinkimas nėra būtinas, tačiau ypatingais atvejais tiriami abiejų lyčių gyvūnai. Jei egzistuoja lyčių skirtumai pagal atsaką, tai tiriami po keturis kiekvienos lyties gyvūnus. Tiriant negraužikus, galima naudoti tik keletą gyvūnų.

\n

6.1.2.2. Kai tiriamas medžiagos pasiskirstymas audiniuose, tyrimo pradžioje reikia atsižvelgti į grupės dydį pagal gyvūnų, kurie bus numarinti numatytu laiko momentu, ir laiko momentų, kurių metu bus tiriami gyvūnai, skaičių.

\n

6.1.2.3. Kai tiriamas metabolizmas, tai grupės dydis priklauso nuo tyrimo poreikių.

\n

6.1.2.4. Atliekant daugelio dozių ir daugelio laiko momentų tyrimus, atsižvelgiama į grupės dydį pagal laiko momentus ir numatomus numarinimus, tačiau grupėje turi būti ne mažiau kaip du gyvūnai. Grupė turi būti pakankamai didelė, kad būtų galima tinkamai apibūdinti tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų pasisavinimą, stabilizavimąsi bei pašalinimą.

\n

6.1.3. Dozė 6.1.3.1. Kai duodama pavienė dozė, tai mažiausiai dvi jos koncentracijos turėtų būti naudojamos. Turėtų būti duodama maža, nesukelianti toksinio poveikio, dozė ir didelė dozė, kuriai esant pasireiškia toksinis poveikis arba galėtų pakisti toksikokinetiniai parametrai.

\n

6.1.3.2. Kai duodama pakartotinė dozė, užtenka tik mažos koncentracijos dozės, tačiau ypatingais atvejais naudojama ir didelės koncentracijos dozė.

\n

6.1.4. Davimo būdas 6.1.4.1. Toksikokinetinių tyrimų metu naudojamas tas pats davimo būdas ir, jei reikia, tas pats prietaisas, kuris buvo naudojamas ar buvo pasirinktas naudoti kituose toksikologiniuose tyrimuose. Tiriamoji medžiaga eksperimentiniams gyvūnams duodama per os su zondu ar pašaru, užnešama ant odos arba duodama įkvėpti konkrečiais laiko momentais. Tiriamosios medžiagos intraveninė injekcija naudinga, siekiant nustatyti santykinę medžiagos, duodamos kitais būdais, absorbciją. Be to, atlikus tiriamosios medžiagos intraveninę injekciją, gaunama naudinga informacija apie jos pasiskirstymą.

\n

6.1.4.2. Reikia apsvarstyti galimybę, kai priemonė gali trukdyti tiriamosios medžiagos davimui. Atkreipti dėmesį į absorbcijos skirtumus, kai tiriamosios medžiagos duodamos per zondą ir su pašaru, ir būtent nustatyti tikslią tiriamosios medžiagos, duodamos su pašaru, dozę.

\n

6.1.5. Stebėjimai. Gyvūnai stebimi kiekvieną dieną bei registruojami toksiškumo požymiai ir kiti svarbūs klinikiniai parametrai, įskaitant efektų pasireiškimo laiką, laipsnį bei trukmę.

\n

6.2. Procedūra. Pasvėrus visus tiriamuosius gyvūnus, atitinkamu būdu jiems duodama tiriamoji medžiaga. Jeigu reikia, tai, prieš duodant medžiagą, tiriamieji gyvūnai įtvirtinami.

\n

6.2.1. Absorbcija. Duodamos medžiagos absorbcijos greitis bei apimtis įvertinami įvairiais metodais, panaudojant arba nenaudojant kontrolinių grupių:

\n

6.2.1.1. nustatant tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų kiekį ekskretuose, tokiuose kaip šlapimas, tulžis, išmatos, iškvėptas oras ir tai, kas gyvūno lavone be vidurių;

\n

6.2.1.2. lyginant tiriamąją ir kontrolinę arba tiriamąją ir etaloninę grupes pagal biologinį atsaką (pvz., atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus);

\n

6.2.1.3. lyginant tiriamąją ir etaloninę grupes pagal tiriamosios medžiagos ekskreciją per inkstus;

\n

6.2.1.4. nustatant tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų zoną, esančią žemiau plazmos ir laiko kreivės, ir gautus duomenis lyginant su etaloninės grupės tyrimų duomenimis.

\n

6.2.2. Pasiskirstymas. Galimi du medžiagos pasiskirstymo analizės atlikimo būdai:

\n

6.2.2.1. tiriant visą kūną autoradiografijos metodu, gaunama naudingos kokybinės informacijos;

\n

6.2.2.2. pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, skirtingu laiko momentu numarinant gyvūnus bei nustatant tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų kiekį bei koncentraciją audiniuose ir organuose, gaunama kiekybinė informacija.

\n

6.2.3. Ekskrecija.

\n

6.2.3.1. Tiriant ekskreciją, surenkamas šlapimas, išmatos, iškvėptas oras ir tam tikrais atvejais tulžis. Pasibaigus veikimui tiriamąja medžiaga, kelis kartus nustatomas tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų kiekis šiuose ekskretuose tol, kol ekskrecijos būdu pasišalins apie 95 % duotos medžiagos arba kai praeis savaitė.

\n

6.2.3.2. Ypatingais atvejais apsvarstoma tiriamosios medžiagos ekskrecija į laktacijos tyrime naudojamų gyvūnų pieną.

\n

6.2.4. Metabolizmas.

\n

6.2.4.1. Biologiniai mėginiai tiriami atitinkamais metodais, kad būtų nustatytas metabolizmo apimtis bei pobūdis. Nustatoma metabolitų struktūra bei pasiūlomi galimi metabolitinės apykaitos keliai, jei anksčiau atliktų toksikologinių tyrimų metu liko neišspręstų problemų. Tyrimai in vitro padeda gauti informacijos apie metabolitinės apykaitos kelius.

\n

6.2.4.2. Detalesnę informaciją apie metabolizmo ir toksiškumo sąsają galima gauti atlikus tokius biocheminius tyrimus, kaip metabolitinių fermentinių sistemų efektų tyrimai, endogeninių nebaltyminės kilmės sulfhidrilinių junginių pasišalinimo analizė bei tiriamosios medžiagos susirišimo su makromolekulėmis tyrimas.

\n

II. DUOMENYS 7. Atsižvelgiant į atlikto tyrimo pobūdį, duomenys pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles ir, jei reikia, tai pateikiant papildomai ir paveikslus. Kiekvienos tirtos grupės atveju reikėtų nurodyti, jei to reikalaujama, laiko, dozės bei medžiagos pasiskirstymo audiniuose bei organuose matavimų vidurkius ir statistines variacijas. Absorbcijos laipsnis bei ekskrecijos apimtis ir greičiai nustatomi atitinkamais metodais. Kai atliekami metabolizmo tyrimai, pateikiama identifikuotų metabolitų struktūra bei galimus metabolitinės apykaitos kelius.

\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 8. Tyrimo ataskaita. Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje pateikiama tokia informacija:

\n

8.1. panaudota rūšis, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos;

\n

8.2. žymėtų medžiagų, jei šios buvo naudojamos, apibūdinimas;

\n

8.3. dozės ir kaip dažnai jos buvo duodamos;

\n

8.4. davimo būdas ir bet kokie prietaisai, jei buvo naudoti;

\n

8.5. užregistruoti toksiniai ir kiti efektai;

\n

8.6. tiriamosios medžiagos ir/ar metabolitų biologiniuose mėginiuose, įskaitant iškvėptą orą, nustatymo metodai;

\n

8.7. lyties, dozės, režimo, laiko, audinių bei organų atžvilgiu atliktų matavimų išdėstymas paeiliui;

\n

8.8. ekskrecijos ir absorbcijos apimties laiko ribose pateikimas;

\n

8.9. metabolitų identifikacijos biologiniuose mėginiuose bei apibūdinimo metodai;

\n

8.10. biocheminiai metabolizmo įvertinimo metodai;

\n

8.11. galimi metabolitinės apykaitos keliai;

\n

8.12. rezultatų aptarimas;

\n

8.13. rezultatų interpretavimas.

\n
9.Įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo duomenų įvertinimas ir aiškinimas pateikti Bendrajame įvade.
\n

IV. NUORODOS 10. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B37 METODAS: ORGANINIŲ FOSFORO JUNGINIŲ UŽDELSTAS NEUROTOKSIŠKUMAS PO ŪMAUS POVEIKIO I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas 1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 418 metodu.

\n

1.2. Vertinant toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų klasės sukelia specifinius neurotoksiškumo požymius, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurie organiniai fosforo junginiai sukelia uždelstą neurotoksiškumą, todėl vertinant šios grupės medžiagas reikia į tai atsižvelgti.

\n

1.3. Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai in vitro, tačiau neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad medžiaga yra ne neurotoksiška. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

\n
2.Apibrėžimai 2.1. Organiniai fosforo junginiai apima organinius fosforo esterius, tioesterius ar anhidridus, pagamintus iš organinių fosfono, fosforamido ar giminingų tiofosforo, tiofosforono ar tiofosforamido rūgščių ar kitas medžiagas, galinčias sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei.
\n

2.2. Uždelstas neurotoksiškumas – sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose.

\n
3.Kontrolinės medžiagos 3.1. Norint parodyti, kad laboratorinėmis sąlygomis tiriamųjų rūšių atsakas reikšmingai nesikeičia, pozityvinė kontrolės grupė gali gauti kontrolinę medžiagą.
\n

3.2. Plačiai naudojamas neurotoksinas yra tri-o-tolilfosfatas (CAS Nr. 78-30-8, EINECS Nr. 201-103-5, CAS nomenklatūra: fosforo rūgštis, tris(2-metilfenil)esteris), sinonimas: tris-o-krezilfosfatas.

\n
4.Bandymo metodo principas 4.1. Naminėms vištoms, kurios, jeigu reikia, yra apsaugotos nuo ūmaus cholinerginio poveikio, per virškinamąjį traktą duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė. 21 dieną stebimi jų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu paimtoms iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus 21 dienai po medžiagos poveikio, likusios vištos humaniškai numarinamos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai.
\n
5.Bandymo metodo aprašymas 5.1. Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąją ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas iki tyrimo aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Reikia jas laikyti gana dideliuose narvuose arba aptvaruose, kuriuose vištos galėtų laisvai judėti ir būtų galima stebėti jų eiseną.
\n

5.2. Tiriamoji medžiaga turi būti dozuojama per virškinamąjį traktą naudojant zondą, želatinines kapsules arba panašiu metodu. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje tokiame, kaip kukurūzų aliejus. Didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos.

\n

5.3. Bandymo sąlygos 5.3.1. Eksperimentiniai gyvūnai Rekomenduojamos 8–12 mėnesių amžiaus standartinio dydžio, linijos ir naminės veislės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Vištos turi būti užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis joms laisvai judėti.

\n

5.3.2. Skaičius ir lytis 5.3.2.1. Be tiriamosios grupės, turi būti dar tirpiklio kontrolinė bei pozityvinės kontrolės grupės. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat, kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos. Kiekvienoje grupėje reikia panaudoti tiek vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų humaniškai numarinti (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) biocheminiams tyrimams ir kad po 21 stebėjimo dienos patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos.

\n

5.3.2.2. Pozityvinės kontrolės grupė gali būti tiriama paraleliai su kitomis grupėmis arba gali būti panaudojama nesena kontrolės grupė. Šioje grupėje turi būti mažiausiai šešios vištos, paveiktos žinomais uždelsto veikimo neurotoksinais, trys vištos skirtos biocheminiams ir trys – patologiniams tyrimams. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti kontrolės duomenis. Kai tyrimo laboratorija pakeičia keletą esminių tyrimo elementų (pvz., vištų veislę, pašarus, laikymo sąlygas), turi būti gauti nauji pozityvinės kontrolės duomenys.

\n

5.3.3. Dozių lygiai 5.3.3.1. Pagrindiniame bandyme naudotinų dozių lygių nustatymui reikalingas įvadinis tyrimas su atitinkamu vištų ir dozių grupių skaičiumi. Nustatant pagrindinio bandymo dozės ribas, įvadiniame bandyme yra būtinos kelių paukščių žūtys. Norint užkirsti kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms žūtims, galima naudoti atropiną ar kitą apsauginę medžiagą, kuri netrukdytų uždelsto neurotoksiškumo atsakams.

\n

5.3.3.2. Apskaičiuojant didžiausią toleruojamą tiriamosios medžiagos dozę, galima panaudoti daugybę tiriamųjų metodų (žiūrėti B12 metodą). Parenkant dozę, gali būti naudingi jau turimi vištų duomenys arba bet kokia kita toksikologinė informacija.

\n

5.3.3.3. Atsižvelgiant į įvadinio bandymo rezultatus ir aukščiausią ribinę 2 000 mg/kg kūno masės dozę, tiriamosios medžiagos dozės lygis pagrindiniame bandyme turi būti kuo aukštesnis. Bet kokia žūtis per 21 dieną turi nepakeisti reikalingo išgyvenusių paukščių skaičiaus: šešių biocheminiams ir šešių histologiniams tyrimams. Užkertant kelią dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylančioms žūtims, galima naudoti atropiną arba bet kurią kitą apsauginę medžiagą, netrukdančią uždelsto neurotoksiškumo atsakams.

\n

5.3.4. Ribinis bandymas 5.3.4.1. Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis kaip 2 000 mg/kg kūno masės, nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu pagal turimus duomenis apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini.

\n

5.3.4.2. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.

\n

5.3.5. Stebėjimo periodas. Stebėjimo periodas turi trukti 21 dieną.

\n

5.3.6. Darbo eiga 5.3.6.1. Kai paukštis gauna apsauginę medžiagą, kuri užkerta kelią galimai žūčiai dėl ūmaus cholinerginio poveikio, duodama tiriamosios medžiagos vienkartinė dozė.

\n

5.3.6.2. Bendrasis stebėjimas. Stebėti reikia tuoj pat po medžiagos davimo. Pirmas dvi dienas visos vištos atidžiai stebimos kelis kartus, o vėliau mažiausiai vieną kartą per dieną, kol jos humaniškai numarinamos arba praeina 21 diena. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, ryškumą ir elgesio nukrypimų trukmę. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos, atrinktos patologijai, mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų aktyvumas, priverčiant jas judėti, pvz., kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai numarinami ir skrodžiami.

\n

5.3.6.3. Kūno masė. Prieš tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau sveriama mažiausiai vieną kartą per savaitę.

\n

5.3.6.4. Biochemija 5.3.6.4.1. Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių bei trys vištos iš pozityvinės kontrolinės grupės (jei ši grupė paraleliai tiriama) kelios dienos po dozavimo humaniškai numarinamos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms, humaniškai numarinami trys kontrolinės ir trys tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris, tuo tarpu trys pozityvinės kontrolės vištos humaniškai numarinamos po 24 valandų.

\n

5.3.6.4.2. Jeigu klinikiniai intoksikacijos požymiai (tai visada gali būti nustatyta stebint cholinerginių požymių pradžios laiką) rodo, kad toksinė medžiaga veikia labai lėtai, tada geriau paukščių audinių pavyzdžius imti du kartus tarp 24 ir 72 valandų po dozavimo. Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali nulemti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, įvertinimą.

\n

5.3.6.5. Bendrasis skrodimas. Visų gyvūnų bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti galvos bei nugaros smegenų išvaizdą.

\n

5.3.6.6. Histopatologinis ištyrimas. Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai ištirti. Audiniai turi būti fiksuojami in situ, naudojant perfuzijos techniką. Įtraukiama smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Iš viršutinio kaklo segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių paimamos nugaros smegenų atkarpos. Paimamos blauzdikaulio nervo distalinės ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpos. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais.

\n

II. DUOMENYS 6. Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik gauti dviprasmiški arba negalutiniai rezultatai gali pareikalauti tolesnio įvertinimo.

\n
7.Turi būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir jų sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu.
\n
8.Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biocheminių ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamojoje ir kontrolinėje grupėse.
\n
9.Skaitmeniniai rezultatai turi būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.
\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija.

\n

10.1. Tiriamieji gyvūnai.

\n

10.1.1. Panaudotos linijos.

\n

10.1.2. Skaičius ir amžius.

\n

10.1.3. Gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt.

\n

10.1.4. Kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.

\n

10.2. Tyrimo sąlygos.

\n

10.2.1. Informacija apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, jei to reikalaujama.

\n

10.2.2. Tirpiklio pasirinkimo pagrindimas.

\n

10.2.3. Informacija apie poveikį tiriamąja medžiaga.

\n

10.2.4. Informacija apie pašarų ir vandens kokybę.

\n

10.2.5. Dozės pasirinkimo pagrindimas.

\n

10.2.6. Duotų dozių detalizavimas, taip pat naudotas tirpiklis, jo tūris ir medžiagos fizikinė būklė.

\n

10.2.7. Informacija apie naudotas apsaugines medžiagas ir poveikį jomis.

\n

10.3. Duomenys.

\n

10.3.1. Kūno masės duomenys.

\n

10.3.2. Grupės toksinio atsako duomenys ir žuvimai.

\n

10.3.3. Klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (grįžtamieji ir negrįžtamieji).

\n

10.3.4. Smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas.

\n

10.3.5. Skrodimo duomenys.

\n

10.3.6. Smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas.

\n

10.3.7. Statistinis duomenų apdorojimas ten, kur tinka.

\n
11.Duomenų aptarimas.
\n
12.Išvados.
\n

IV. NUORODOS 13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ Patvirtinta Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B38 METODAS: ORGANINIŲ FOSFORO JUNGINIŲ UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO 28 DIENŲ BANDYMAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas 1.1. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 419 metodu.

\n

1.2. Vertinant toksinius medžiagų poveikius reikia žinoti, kad kai kurios medžiagų grupės sukelia specifinius neurotoksiškumo tipus, nenustatomus įprastais toksiškumo tyrimais. Pavyzdžiui, kai kurie organiniai fosforo junginiai sukelia uždelstą neurotoksiškumą, todėl vertinant šios grupės medžiagas į tai reikėtų atsižvelgti.

\n

1.3. Nustatant medžiagas, sukeliančias uždelstą polineuropatiją, gali būti taikomi atrankos tyrimai in vitro, tačiau neigiami tyrimo in vitro duomenys dar neįrodo, kad medžiaga nėra neurotoksiška.

\n

1.4. Šis 28 dienų uždelsto neurotoksiškumo tyrimas rodo kylančią riziką sveikatai, gaunant medžiagą pakartotinai per tam tikrą laiko tarpą. Šis tyrimas rodys reakciją į dozę bei įvertins nepastebimą neigiamą poveikio lygį, reikalingą nustatant medžiagos saugumo kriterijus. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

\n
2.Apibrėžimai 2.1. Organiniai fosforo junginiai apima organinius fosforo esterius, tioesterius ar anhidridus, pagamintus iš organinių fosfono, fosforamido ar giminingų tiofosforo, tiofosforono ar tiofosforamido rūgščių ar kitas medžiagas, galinčias sukelti uždelstą neurotoksiškumą, būdingą šiai medžiagų klasei.
\n

2.2. Uždelstas neurotoksiškumas – sindromas, susijęs su ataksijos, nugaros smegenų ir periferinio nervo distalinės aksonopatijos ilgai trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esterazės slopinimu nervų audiniuose.

\n
3.Bandymo metodo principas. Naminėms vištoms per virškinimo traktą 28 dienas kasdien duodama tiriamoji medžiaga. Medžiagos davimo periodu ir praėjus 14 dienų po to, rečiausiai vieną kartą per dieną stebimi jų elgesio nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai praėjus 24 ir 48 valandoms po paskutinio dozavimo, atsitiktiniu atrankos būdu iš kiekvienos grupės vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimas. Praėjus dviems savaitėms po paskutinės dozės, likusios vištos humaniškai numarinamos ir tam tikri nervų audiniai ištiriami histopatologiškai.
\n
4.Bandymo metodo aprašymas 4.1. Pasiruošimas. Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesirgusios virusinėmis ligomis ir negydytos, neturinčios eisenos pakitimų, atsitiktinės atrankos principu paskirstomos į tiriamąsias ir kontrolinę grupes ir mažiausiai 5 dienas iki tyrimo aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis. Reikia jas laikyti gana dideliuose narvuose arba aptvaruose, kuriuose vištos galėtų laisvai judėti ir būtų galima stebėti jų eiseną.
\n

4.2. Tiriamoji medžiaga kasdien septynias dienas savaitėje dozuojama per virškinamąjį traktą, naudojant zondą arba želatinines kapsules. Skysčiai gali būti leidžiami neskiesti arba ištirpinti tirpiklyje tokiame, kaip kukurūzų aliejus. Didelės dozės kietųjų medžiagų želatininėse kapsulėse gali būti neefektyviai absorbuojamos, jas reikėtų ištirpinti. Naudojamo tirpiklio (ne vandens) toksinės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, tai prieš tyrimą jos turi būti nustatytos.

\n
5.Bandymo sąlygos 5.1. Tiriamieji gyvūnai. Rekomenduojamos 8–12 mėnesių amžiaus standartinio dydžio, linijos ir naminės veislės vištos (Gallus gallus domesticus), dedančios kiaušinius. Vištos turi būti užaugintos sąlygomis, leidžiančiomis joms laisvai judėti.
\n

5.2. Skaičius ir lytis 5.2.1. Reikia sudaryti mažiausiai tris tiriamąsias grupes bei vieną tirpiklio kontrolinę grupę. Su tirpiklio kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su tiriamaisiais gyvūnais, išskyrus tai, kad jie negautų tiriamosios medžiagos.

\n

5.2.2. Kiekvienoje paukščių grupėje reikia panaudoti tiek vištų, kad mažiausiai šešias galima būtų humaniškai numarinti (po tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) biocheminiams tyrimams ir kad praėjus 14 dienų po paskutinio dozavimo patologiniams tyrimams išgyventų dar šešios vištos.

\n

5.3. Dozių lygiai. Dozės lygius reikia parinkti atsižvelgiant į uždelsto neurotoksiškumo ūmaus tyrimo tris rezultatus arba į jau turimus tiriamosios medžiagos toksiškumo ar kinetinius duomenis. Pasirinktas aukščiausias dozės lygis turi sukelti toksinius poveikius, geriausiai uždelstą neurotoksiškumą, tačiau turi nesukelti gyvūno žūties ar nepakeliamų kančių. Sekantys mažėjančia tvarka einantys dozių lygiai turi sukelti atitinkamai mažesnius pokyčius (atsakus), o mažiausias dozės lygis turėtų nesukelti pastebimų neigiamų poveikių.

\n

5.4. Ribinis bandymas 5.4.1. Jeigu tirtas dozės lygis, ne žemesnis kaip 1 000 mg/kg kūno masės/d nesukelia pastebimų toksinių poveikių ir jeigu iš turimų duomenų apie struktūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiškumo, didesnių dozių tyrimai nebūtini.

\n

5.4.2. Ribinis bandymas neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveikį žmogui, reikia naudoti didesnes dozes.

\n

5.5. Stebėjimo periodas. Visi paukščiai stebimi mažiausiai vieną kartą per dieną visą medžiagos dozavimo periodą ir 14 dienų po to, iki atliekamas skrodimas.

\n

5.6. Darbo eiga 5.6.1. Paukščiams tiriamoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septynias dienas per savaitę.

\n

5.6.2. Bendrasis stebėjimas. Stebėti reikia tuoj pat po medžiagos davimo. 28 dozavimo dienas ir 14 dienų po to visos vištos atidžiai stebimos mažiausiai vieną kartą per dieną, po to jos humaniškai numarinamos. Visi toksiškumo požymiai turi būti registruojami, žymint jų pradžią, tipą, sunkumo laipsnį ir elgesio nukrypimų trukmę. Nereikėtų apsiriboti elgesio nukrypimų stebėjimais. Ataksiją reikėtų vertinti mažiausiai pagal keturių lygių skalę, reikėtų žymėti paralyžių. Norint pastebėti minimalų toksinį poveikį, vištos mažiausiai du kartus per savaitę išimamos iš narvų ir stebimas jų aktyvumas, priverčiant judėti, pvz., kopėčiomis. Dvesiantys ir patiriantys dideles kančias bei skausmą paukščiai išimami iš narvų, pažymimi, humaniškai numarinami ir skrodžiami.

\n

5.6.3. Kūno masė. Prieš tiriamosios medžiagos davimą visas vištas reikia pasverti, vėliau mažiausiai vieną kartą per savaitę.

\n

5.6.4. Biochemija 5.6.4.1. Atsitiktinės atrankos būdu šešios vištos iš kiekvienos tiriamosios ir tirpiklio kontrolinių grupių, praėjus kelioms dienoms po paskutinės dozės, humaniškai numarinamos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esterazės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti sėdimojo nervo audinio neuropatijos sukeltą esterazės slopinimo aktyvumą. Paprastai, praėjus 24 valandoms po paskutinės dozės, humaniškai numarinami trys kontrolinės ir trys kiekvienos tiriamosios grupės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris. Jeigu ūmaus arba kitų tyrimų (pvz. toksikokinetinių) duomenys rodo, kad po paskutinės dozės geriau pasirinkti kitą numarinimo laiką, negu siūloma, tai reikia raštiškai pagrįsti.

\n

5.6.4.2. Taip pat galima tirti acetilcholinesterazę (AChE). Tačiau gali įvykti spontaninė AChE reaktyvacija in vivo, o tai gali nulemti nepakankamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, įvertinimą.

\n

5.6.5. Bendrasis skrodimas. Bendrojo skrodimo metu reikia apžiūrėti visų gyvūnų galvos bei nugaros smegenų išvaizdą.

\n

5.6.5.1. Histopatologinis ištyrimas. Išgyvenusių visą stebėjimo periodą ir nepanaudotų biocheminiams tyrimams paukščių nervų audiniai turi būti mikroskopiškai ištirti. Audiniai turi būti fiksuojami in situ, naudojant perfuzijos techniką. Įtraukiama smegenėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, nugaros smegenų ir periferinių nervų dalis. Iš viršutinio kaklo segmento, vidurinės-krūtininės ir juosmens-kryžmens dalių paimamos nugaros smegenų atkarpos. Paimamos blauzdikaulio nervo distalinės ir jo atšakų į skrandžio raumenį bei sėdimojo nervo atkarpos. Šias atkarpas reikia dažyti būdingais mielinui ir specifiniais aksonui dažais. Pradžioje reikia mikroskopiškai ištirti visų kontrolinės ir didžiausios dozės grupių paukščių fiksuotus audinius. Jeigu didžiausios dozės grupėje nustatomi pakitimai, galima mikroskopiškai tirti viduriniosios ir mažiausios dozės grupių paukščių audinius.

\n

II. DUOMENYS 6. Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio stebėjimo) požiūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja uždelsto neurotoksiškumo tyrimo tęsimo. Tik šiuo požiūriu dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įvertinimo.

\n
7.Turi būti pateikiami kiekvieno paukščio duomenys. Visi duomenys turi būti pateikiami lentelių forma, nurodant kiekvienoje tirtoje grupėje tyrimo pradžioje buvusių paukščių skaičių, paukščių skaičių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais, šių pažeidimų ar pakitimų tipus ir jų sunkumo laipsnį bei paukščių procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo laipsniu.
\n
8.Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitimų pasireiškimą ir sunkumo laipsnį bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, biochemijos ir histopatologinių pakitimų bei visų kitų pastebėtų pakitimų tiriamosiose ir kontrolinėje grupėse.
\n
9.Skaitmeniniai rezultatai turi būti apdoroti tinkamais ir priimtinais statistiniais metodais. Statistiniai metodai turėtų būti pasirinkti planuojant tyrimą.
\n

III. ATASKAITOS PATEIKIMAS 10. Bandymo protokolas. Bandymo protokole, jeigu įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija:

\n

10.1. Tiriamieji gyvūnai 10.1.1. Panaudotos linijos.

\n

10.1.2. Skaičius ir amžius.

\n

10.1.3. Gavimo šaltinis, laikymo sąlygos ir kt.

\n

10.1.4. Kiekvieno gyvūno kūno masė tyrimo pradžioje.

\n

10.2. Tyrimo sąlygos.

\n

10.2.1. Informacija apie tiriamosios medžiagos paruošimą, pastovumą ir homogeniškumą, jei to reikalaujama.

\n

10.2.2. Tirpiklio pasirinkimo pagrindimas.

\n

10.2.3. Informacija apie poveikį tiriamąja medžiaga.

\n

10.2.4. Informacija apie pašarų ir vandens kokybę.

\n

10.2.5. Dozės pasirinkimo pagrindimas.

\n

10.2.6. Duotų dozių detalizavimas, taip pat naudotas tirpiklis, jo tūris ir medžiagos fizikinė būklė.

\n

10.2.7. Pagrindimas, pasirinkus biocheminiams tyrimams kitą laiką (ne po 24 ir 48 valandų).

\n

10.3. Duomenys.

\n

10.3.1. Kūno masės duomenys.

\n

10.3.2. Duomenys apie toksinį atsaką pagal dozės lygį ir žuvimai.

\n

10.3.3. Nepastebimas neigiamas poveikio lygis.

\n

10.3.4. Klinikiniai pokyčiai, sunkumo laipsnis ir trukmė (grįžtamieji ir negrįžtamieji).

\n

10.3.5. Smulkus biocheminių metodų ir gautų duomenų aprašymas.

\n

10.3.6. Skrodimo duomenys.

\n

10.3.7. Smulkus visų gautų histopatologinių duomenų aprašymas.

\n

10.3.8. Statistinis duomenų apdorojimas ten, kur tinka.

\n
11.Duomenų aptarimas.
\n
12.Išvados.
\n

IV. NUORODOS 13. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B40 METODAS: ODOS SUARDYMAS I. Bendrosios nuostatos 1. Įvadas. Europos Komisijos Generalinio direktorato Jungtinio tyrimų centro Europos alternatyvių tyrimo metodų patvirtinimo centras (ECVAM) patvirtino, kad du in vitro bandymo metodai odos suardymui įvertinti - žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos (TEV) nustatymas ir bandymas naudojant žmogaus odos modelį yra moksliškai patikimi. ECVAM atliktas patikrinamasis bandymas patvirtino, kad šiais metodais galima patikimai atskirti odą suardančias chemines medžiagas ir odos nesuardančias chemines medžiagas. Be to, bandymas naudojant žmogaus odos modelį įgalino teisingai nustatyti odos suardymo laipsnį (R35 – medžiagos, visiškai suardančios odą, ir R34 – kitos medžiagos, suardančios odą). Pateikiami abiejų metodų aprašymai bei procedūros. Šių metodų pasirinkimas priklauso nuo užsakovo poreikių. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).

\n
2.Apibrėžimai 2.1. Odos suardymas – negrįžtamas odos audinių suardymas tiriamąja chemine medžiaga.
\n

2.2. Kiti šiame metode vartojamų sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade.

\n
3.Pamatinės medžiagos. Pamatinės medžiagos nurodytos šio metodo 4.2.3.4 ir 4.4.2.3 punktuose.
\n
4.Bandymo metodo principas 4.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymas. Tiriamosios medžiagos inkubuojamos 24 valandas ant odos diskų, paimtų iš humaniškai numarintų jaunų žiurkių odos epidermio paviršiaus. Odą suardančiosios medžiagos nustatomos pagal jų savybę suardyti odos raginio sluoksnio (stratum corneum) vientisumą bei pažeisti barjerinę jo funkciją, kuri nustatoma odos transepitelinės elektrinės varžos sumažėjimu žemiau slenkstinio lygio (5 kW). Odą dirginančios ir nedirginančios medžiagos nesumažina transepitelinės elektrinės varžos žemiau slenkstinio lygio. Tiriant paviršiaus įtemptį didinančius cheminius junginius bei organines chemines medžiagas, kurių pH yra neutralus, tyrimo metu papildomai analizuojamas šių medžiagų susirišimas su dažikliais. Tai daroma siekiant gauti mažiau klaidingų teigiamų duomenų, kurie paprastai gaunami tiriant tokias medžiagas.
\n

4.2. Bandymo metodo aprašymas 4.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai. Odos diskai paimami iš jaunų (20–23 dienų amžiaus) Wistar ar panašaus inbrydinio kamieno žiurkių. Nugaros ir šonų vilna nukerpama žirklėmis, skirtomis gyvūnams kirpti. Po to gyvūnai gerai apiplaunami panardinus į antibiotikų (pvz., streptomicino, penicilino, chloramfenikolio ar amfotericino) bakteriostatinės koncentracijos tirpalą. 3 ar 4 dieną po pirmojo apiplovimo gyvūnai dar kartą apiplaunami antibiotikų tirpalu ir panaudojami ne vėliau kaip per 3 dienas (ruošiant odos preparatus, gyvūnai ne vyresni kaip 28 dienų).

\n

4.2.2. Odos diskų paruošimas. Gyvūnai humaniškai numarinami. Po to atskiriama kiekvieno gyvūno oda, nuo jos atsargiai nuskutami pertekliniai riebalai. Oda uždedama ant mėgintuvėlio su politetrafluoretilenu (PTFE) galo, kad odos epidermis liestųsi su mėgintuvėlio paviršiumi. Ant mėgintuvėlio galo tvirtai užmaunamas guminis žiedas, prilaikantis odą, o nereikalingas odos likutis nukerpamas. Mėgintuvėlio ir žiedo matmenys pateikti šio metodo 1 piešinyje. Po to guminis žiedas, suteptas vazelinu, rūpestingai pritvirtinamas prie mėgintuvėlio su PTFE galo. Spyruokliniu gnybtu mėgintuvėlis įtvirtinamas recepcinėje kameroje, pripildytoje 154 mM magnio sulfato tirpalo (2 piešinys).

\n

4.2.3. Bandymo procedūra 4.2.3.1. Tiriamosios cheminės medžiagos panaudojimas. Skystos tiriamosios cheminės medžiagos 150 ml užpilama ant odos epidermio paviršiaus, esančio mėgintuvėlyje (žiūrėti šio metodo 2 piešinį). Tiriant kietas chemines medžiagas, reikiamas kiekis užpilamas ant odos disko ir padengiamas visas epidermio paviršius. Po to ant medžiagos užpilama 150 ml dejonizuoto vandens ir mėgintuvėlis švelniai pakratomas. Tiriamosios medžiagos ir odos sąlytis turi būti kaip galima didesnis. Naudojant kai kurias kietas medžiagas tai pasiekiama pašildant mėgintuvėlį iki 30 °C, kad cheminė medžiaga ištirptų, arba ji susmulkinama į granules ar smulkius miltelius. Kiekvienai tiriamajai medžiagai naudojami 3 odos diskai. Tiriamosios medžiagos inkubuojamos 24 valandas (žiūrėti šio metodo 4.1 punktą). Tiriamoji medžiaga pašalinama, plaunant 30°C temperatūros vandens srove tol, kol jos nebelieka. Sukietėjusios tiriamosios cheminės medžiagos iš mėgintuvėlio pašalinamos 30 °C temperatūros vandens srove.

\n

4.2.3.2. Transepitelinės elektrinės varžos matavimas 4.2.3.2.1. TEV matuojama mažos įtampos kintamosios srovės analizatoriumi (pvz., AIM 401, 6401 arba ekvivalentiškais). Prieš matuojant TEV, odos paviršiaus įtemptis sumažinama, reikiamu 70 % etilo alkoholio kiekiu padengiant visą epitelio paviršių. Po kelių sekundžių 70 % etilo alkoholis pašalinamas, apverčiant mėgintuvėlį, o odos paviršius sudrėkinamas magnio sulfato 154 mM tirpalu. Matuojant odos disko transepitelinę elektrinę varžą, kΩ, iš abiejų odos disko pusių uždedami analizatoriaus elektrodai (žiūrėti šio metodo 2 piešinį). Elektrodų matmenys ir jų ilgis žemiau spyruoklinių gnybtų parodyti šio metodo 1 piešinyje. Matuojant TEV, vidinis (storasis) elektrodo gnybtas uždedamas ant PTFE pripildyto mėgintuvėlio viršaus, kad į magnio sulfato tirpalą būtų galima panardinti reikiamą elektrodo dalį. Išorinis (plonasis) elektrodas įdedamas į recepcinės kameros dugną. Išlaikomas pastovus atstumas tarp spyruoklinio gnybto apačios ir pripildyto PTFE mėgintuvėlio (1 piešinys), kadangi nuo šio atstumo priklauso TEV.

\n

4.2.3.2.2. Jei matuojama TEV yra didesnė nei 20 kΩ, tiriamoji cheminė medžiaga yra padengusi odos disko epidermį. Ji pašalinama, pvz., pirštine apmautos rankos nykščiu užspaudus PTFE mėgintuvėlį ir jį pakračius apie 10 sekundžių, po to magnio sulfato tirpalą išpylus ir TEV matavimus pakartojus su nauju magnio sulfato tirpalu. Transepitelinės elektrinės varžos matavimų metu gautų duomenų vidurkiai laikomi priimtinais, jei gautos vienalaikės teigiamos ir neigiamos kontrolinės vertės neviršija metode nurodytų leistinų dydžių. Žemiau pateikiamos Siūlomos kontrolinės medžiagos ir priimtini jų elektrinės varžos svyravimo intervalai, taikant aprašytą metodą ir prietaisus, pateikti 1 lentelėje.

\n

1 lentelė. Kontrolinės medžiagos ir priimtini jų elektrinės varžos svyravimo intervalai Kontrolė Medžiaga Leistinas elektrinės varžos intervalas (kΩ) Teigiama Neigiama 10 M HCl (36 %) Distiliuotas vanduo 0,5-1,0 10-25 4.2.3.3. Modifikuota paviršiaus įtemptį didinančių medžiagų ir neutralaus pH organinių junginių tyrimo metodika. Jei tiriamųjų cheminių medžiagų paviršiaus įtemptį didinančių medžiagų ar neutralaus pH organinių junginių transepitelinė elektrinė varža yra lygi 5 kΩ arba mažesnė, tokiu atveju galima tirti dažų skvarbą į audinius.

\n

4.2.3.3.1. Sulforodamino B dažiklio panaudojimas ir pašalinimas. Po pirminio apdorojimo tiriamąja chemine medžiaga ant kiekvieno odos disko epidermio paviršiaus užpilama 150 ml 10 % sulforodamino B dažiklio ir distiliuoto vandens tirpalo ir palaikoma 2 valandas. Po to odos diskai 10 sekundžių plaunami kambario temperatūros vandentiekio vandeniu ir pašalinamas dažiklio perteklius ar neįsiskverbęs dažiklis. Kiekvienas odos diskas atsargiai išimamas iš PTFE mėgintuvėlio su PTFE ir įdedamas į indą (pavyzdžiui, į 20 ml scintiliacinį indą) su 8 ml dejonizuoto vandens. Dažiklio pertekliui ar neįsiskverbusiam dažikliui pašalinti indai 5 minutes švelniai kratomi. Pakartojus plovimo procedūrą, odos diskai perkeliami į indus su 5 ml 30 % natrio dodecilsulfato ir distiliuoto vandens tirpalu ir inkubuojami nakčiai 60°C temperatūroje. Po inkubacijos kiekvienas odos diskas išimamas, o likęs tirpalas centrifuguojamas 8 min. 21 °C temperatūroje (santykinė centrifuginė jėga @175). 1 ml supernatanto atskiedžiama santykiu 1:5 (t. y. 1 ml + 4 ml) 30 % natrio dodecilsulfato ir distiliuoto vandens tirpalu. Tirpalo optinis tankis (OT) išmatuojamas, esant apie 565 nm bangos ilgiui.

\n

4.2.3.3.2. Dažiklio kiekio apskaičiavimas. Sulforodamino B dažiklio kiekis, esantis viename odos diske, apskaičiuojamas pagal optinio tankio (OT) vertes (sulforodamino B dažiklio molinės ekstinkcijos koeficientas, esant bangos ilgiui 565 nm - 8,7´104, molekulinė masė - 580). Kiekviename odos diske nustatomas sulforodamino B dažiklio kiekis, po to kartojant apskaičiuojamas dažiklio kiekio vidurkis. Dažiklio skvarbos duomenų vidurkiai laikomi priimtinais, jei vienalaikės kontrolinės vertės neperžengia metodo nustatytų ribų. Siūlomi priimtini dažiklio kiekio kontrolinėse medžiagose svyravimo intervalai, taikant aprašytą metodiką ir prietaisus, pateikti 2 lentelėje.

\n

2 lentelė. Dažiklio kiekio kontrolinėse medžiagose svyravimo intervalai Kontrolė Medžiaga Dažiklio kiekio intervalas mg Teigiama Neigiama 10 M HCl (36 %) Distiliuotas vanduo 40-100 15-35 4.2.3.4. Papildoma informacija 4.2.3.4.1. Kai norima nustatyti visiškai odą suardančias chemines medžiagas, tiriamosios cheminės medžiagos panaudojamos odos diskams trumpą periodą (pavyzdžiui, 2 valandas). Tačiau atliekant patvirtinantį tyrimą gauti duomenys rodo, kad transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodu tiriant keletą cheminių medžiagų, po jų panaudojimo odos diskams 2 valandas, šių medžiagų sugebėjimas suardyti odą buvo pernelyg pervertintas, nors šis metodas leido teisingai nustatyti odą suardančias ir nesuardančias chemines medžiagas po 24 valandas trukusio bandymo.

\n

4.2.3.4.2. Panaudoto prietaiso savybės ir matmenys bei taikyta eksperimentinė procedūra turi įtakos transepitelinės elektrinės varžos matavimo metu gaunamiems duomenims. Medžiagų, suardančių odos audinį, elektrinės varžos aukščiausia riba, lygi 5 kW, gauta panaudojus specialų prietaisą bei šiame metode aprašytą procedūrą. Tyrimo sąlygoms kardinaliai pakitus, tinka skirtingos ribinė ir kontrolinė vertės. Tiriant etalonines pasirinktas chemines medžiagas, naudojamas atliekant patikrinamąjį bandymą, rekomenduojama ribinę vertę pasirinkti pagal metodiką.

\n

4.3. Bandymo metodo naudojant žmogaus odos modelį principas. Tiriama medžiaga iki 4 valandų laikoma ant trimačio žmogaus odos modelio, kurį sudaro rekonstruotas epidermis, turintis funkcinį raginį sluoksnį (stratum corneum). Medžiagos, suardančios odą, identifikuojamos pagal jų sugebėjimą sumažinti ląstelių gyvybingumą (pavyzdžiui, panaudojant MTT metodą) žemiau nurodytų ribinių lygių per nustatytą inkubavimo trukmę. Šis metodas patvirtina hipotezę, kad odą suardančios cheminės medžiagos yra tos, kurios sugeba prasiskverbti pro raginį sluoksnį (difuzijos ar erozijos būdu) ir yra pakankamai citotoksiškos bei sunaikina apatinių sluoksnių ląsteles.

\n

4.4. Bandymo metodo naudojant žmogaus odos modelį aprašymas 4.4.1. Žmogaus odos modelis 4.4.1.1. Žmogaus odos modelis turi atitikti tam tikrus kriterijus. Modelis turi turėti funkcinį raginį sluoksnį, po kuriuo yra gyvų ląstelių sluoksnis. Turi būti reikiama barjerinė raginio sluoksnio funkcija. Tai parodoma demonstruojant modelio atsparumą citotoksiškumui, panaudojant ląsteles sunaikinančias chemines medžiagas, kurios normaliomis sąlygomis neprasiskverbia pro odos raginį sluoksnį. Esant nustatytoms eksperimentinėms sąlygoms, naudojant pasirinktą modelį įmanoma pakartoti rezultatus.

\n

4.4.1.2. Modelyje esančių ląstelių gyvybingumas turi būti gana didelis, kad būtų galima atskirti teigiamas ir neigiamas kontrolines medžiagas. Ląstelių gyvybingumas (pavyzdžiui, įvertinamas pagal MTT kiekio sumažėjimą, matuojant optinį tankį) po inkubacijos su neigiama kontroline chemine medžiaga turi atitikti priimtinas konkrečiam modeliui ribas. Po inkubacijos su teigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, lyginant jas su neigiamomis kontrolinėmis medžiagomis, ląstelių gyvybingumo laipsnis turi neviršyti nustatyto lygio. Svarbiausia įrodyti, kad panaudotas spėjimų modelis atitinka tarptautinį patvirtinimo standartą.

\n

4.4.2. Bandymo procedūra 4.4.2.1. Tiriamosios cheminės medžiagos panaudojimas. Jei tiriamosios cheminės medžiagos yra skystos, jos naudojamos taip, kad padengtų odos paviršių (mažiausiai - 25 ml/cm2). Jei tiriamoji cheminė medžiaga yra kieta, ji naudojama taip, kad padengtų odą, po to ji sudrėkinama, kad kuo glaudžiau liestųsi su oda; jei reikia, prieš panaudojant kietos medžiagos susmulkinamos į miltelius. Pasibaigus cheminės medžiagos veikimo laikui, tiriamoji cheminė medžiaga kruopščiai nuplaunama nuo odos druskos tirpalu.

\n

4.4.2.2. Ląstelių gyvybingumo matavimas 4.4.2.2.1. Ląstelių gyvybingumui įvertinti taikomas bet kuris kokybinis patvirtintas metodas. Dažniausiai yra taikomas MTT redukcijos metodas, pagal kurį įvairios laboratorijos gauna tikslius ir atkartojamus rezultatus.

\n

4.4.2.2.2. Odos diskas pamerkiamas į MTT tirpalą (0,3 mg/ml) 3 valandoms, esant 20-28 °C temperatūrai). Ekstrahuojamas (tirpikliais) nusėdęs netirpus mėlynos spalvos formazanas ir nustatoma jo koncentracija, matuojant jo optinį tankį, bangos ilgiui esant tarp 545 nm ir 595 nm.

\n

4.4.2.3. Papildoma informacija. Panaudotas odos modelis, tiksli medžiagos veikimo trukmė ir plovimo procedūros turi didžiausią įtaką ląstelių gyvybingumo matavimo rezultatams. Labai svarbu, kad šį metodą galima pakartoti daugelyje laboratorijų, panaudojant daug įvairių cheminių medžiagų. Šis metodas turi atitikti mokslinio patvirtinimo kriterijus, o patvirtinimo tyrimo duomenys privalo būti specialistų recenzuoti ir paskelbti moksliniame žurnale.

\n

II. Duomenys 5. Rezultatų apdorojimas 5.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas. Tiriamosios cheminės medžiagos transepitelinės varžos dydžiai (kW), teigiamos bei neigiamos kontrolės ir bet kokios standartinės etaloninės cheminės medžiagos pateikiamos lentelėse, jose pateikiami ir kartojamų mėginių (pakartotinių eksperimentų) duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija.

\n

5.1.2. Žmogaus odos modelio tyrimas. Optinio tankio tiriamąja chemine medžiaga bei teigiamomis ir neigiamomis kontrolėmis paveiktų ląstelių gyvybingumo duomenys (%) ir bet kokios etaloninės cheminės medžiagos pateikiamos lentelėse, jose pateikiami ir kartojamų mėginių (pakartotinių eksperimentų) duomenys, vidurkiai bei nustatyta klasifikacija.

\n

5.2. Įvertinimas ir rezultatų interpretavimas 5.2.1. Žiurkės odos transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas 5.2.1.1. Jei tiriamosios cheminės medžiagos transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra didesnis nei 5 kW, ji laikoma odos audinį nesuardančia chemine medžiaga. Jei transepitelinės elektrinės varžos vidurkis yra mažesnis arba lygus 5 kW, o tiriamoji cheminė medžiaga priklauso paviršiaus įtemptį didinančioms arba neutraliu pH pasižyminčioms organinėms cheminėms medžiagoms, ji laikoma odos audinį suardančiąja chemine medžiaga.

\n

5.2.1.2. Su paviršiaus įtemptį didinančiomis ir neutraliu pH pasižyminčiomis organinėmis cheminėmis medžiagomis, kurių transepitelinė elektrinė varža yra mažesnė arba lygi 5 kW, galima atlikti dažiklio įsiskverbimo tyrimą. Jeigu dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra didesnis arba lygus tuo pat metu gautam vidutiniam dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, paveiktą 36 % HCl teigiama kontrole, kiekiui, tai tiriamoji cheminė medžiaga priklauso odą suardančioms medžiagoms. Jei dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, vidutinis kiekis yra mažesnis nei tuo pat metu gauto dažiklio, įsiskverbusio į odos diską, paveikto 36 % HCl teigiama kontrole, kiekiui, tai tiriamoji medžiaga laikoma netikra teigiamąja ir priskiriama odos nesuardančioms cheminėms medžiagoms.

\n

5.2.2. Žmogaus odos modelio tyrimas. Neigiamos kontrolės optinio tankio vertė atspindi šimtaprocentinį ląstelių gyvybingumą, taigi kiekvieno tiriamojo mėginio optinio tankio vertės panaudojamos apskaičiuojant gyvybingumo, palyginti su neigiama kontrole, procentais išreikštą vertę. Galutinė ląstelių gyvybingumo vertė, išreikšta procentais, skirianti odą suardančias chemines medžiagas nuo nesuardančių medžiagų (arba atskirianti vieną nuo kitos skirtingoms klasėms priklausančias odą suardančias chemines medžiagas), turi būti aiškiai apibūdinta spėjimo modelyje prieš patvirtinant metodą, o tolesnis patvirtinantis tyrimas turi įrodyti, kad ši galutinė riba yra tinkama.

\n

III. Ataskaitos pateikimas 6. Bandymo protokolas. Jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

\n

6.1. Tiriamoji medžiaga:

\n

6.1.1. identifikacijos duomenys, fizinė prigimtis ir, jei būtina, jos fizikinės ir cheminės savybės;

\n

6.1.2. panaši informacija pateikiama, jei naudojamos etaloninės cheminės medžiagos.

\n

6.2. Bandymo sąlygos:

\n

6.2.1. taikytos procedūros aprašymas;

\n

6.2.2. bet kokios modifikacijos aprašymas ir pagrindimas.

\n

6.3. Rezultatai:

\n

6.3.1. lentelėse pateikiami tiriamosios cheminės medžiagos, teigiamų bei neigiamų kontrolinių medžiagų ir bet kokių nurodytų standartinių etaloninių medžiagų varžų dydžiai (transepitelinės elektrinės varžos nustatymo metodas) arba ląstelių gyvybingumo, išreikšto procentais, dydžiai (žmogaus odos modelio tyrimas), kartu pateikiant pakartotinių mėginių (kartotinių eksperimentų) duomenis bei vidurkius;

\n

6.3.2. bet koks kito pastebėto poveikio aprašymas.

\n

6.4. Rezultatų aptarimas.

\n

6.5. Išvados.

\n

IV. Nuorodos 7. ECVAM (1998). ECVAM naujienos ir apžvalga. ATLA 26, p.275–280.

\n
8.Fentem, J. H.., Archer, G. E. B., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H-G. ir Liebsch, M. (1998). Odos suardymo bandymo studijų ECVAM tarptautinis įteisinimas. 2. Vadybos komandos rezultatų įvertinimas. Toksikologija in vitro 12, p.483-524.
\n
9.Barrat, M. D., Brantom, P. G., Fentem, J. H., Gerner, L., Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998). Odos suardymo in vitro bandymų ECVAM tarptautinis įteisinimas. 1. Bandymo chemikalų atrinkimas ir paskirstymas. Toksikologija in vitro 121, p. 471–482.
\n
10.Oliver, G. J. A., Pembeerton, M. A. & Rhodes, C. (1986). Odos suardymo bandymas in vitro – modifikacijos ir patvirtinimas. Maisto ir chemikalų toksikologija 24, pp. 507–512.
\n
11.Botham, P. A., Hall, T. J., Dennett, R., McCall, J. C., Basketter, D. A., Whittle, E., Cheesman, M., Esdaile, D. J. ir Gardner, J. (1992). Odos suardymo in vitro bandymas: tarp laboratorinių tyrimų rezultatai. Toksikologija in vitro 6, p.191–194.
\n
12.Worth, A. P., Fentem, J. H., Balls, M., Botham, P. A., Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J. ir Liebsch, M. (1998). EBPO pasiūlyto odos suardymo bandymo strategijos įvertinimas. ATLA 26, p. 709–720.
\n
13.Botham, P. A., Chamberlain, M.“ Barratt, M. D., Curren, R. D., Esdaile, D. J., Gardner, J. R., Gordon, V. C., Hildebrand, B., Lewis, R. W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J. F., Steiling, W., Walker, A. P. ir Balls, M. (1995). Galutinės studijos prieš įteisinant odos suardymo bandymą in vitro. ECVAM darbinio posėdžio 6 įteisinimas ir rekomendacijos. ATLA 23, p.219–255.
\n

PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-508 B41 METODAS: FOTOTOKSIŠKUMAS. 3T3 NRU FOTOKSIŠKUMO IN VITRO BANDYMAS I. Bendrosios nuostatos 1. Įvadas 1.1. Fototoksiškumas apibūdinamas kaip toksinė reakcija, atsirandanti, kai oda pirmą kartą paveikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o po to – šviesa arba kuri sukeliama panašiai – kai, sistemingai veikiama oda chemine medžiaga, ji apšvitinama.

\n

1.2. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro rezultatai leidžia nustatyti tiriamos medžiagos fototoksinį aktyvumą, t. y. ar kokios nors tiriamosios medžiagos ultravioletiniais ir matomos šviesos spinduliais gali kelti pavojų.

\n

1.3. Kadangi toksikologinio tyrimo in vitro tikslas - ištirti fototoksiškumą, odą paveikus cheminėmis medžiagomis ir šviesa, todėl šio tyrimo metu identifikuojami fototoksiški junginiai in vivo po to, kai jais sistemingai veikiama odą bei, kai jie joje pasiskirsto, o taip pat foto-dirginančias medžiagas, kurių veikimas pasireiškia joms paveikus konkrečią odos vietą.

\n

1.4. Europos Bendrijos ir COLIPA (Europos kosmetikos gamintojų asociacija) bendro projekto, vykdyto 1992-1997 metų laikotarpiu, sukurtas bei patvirtintas 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas norint rasti įvairiems in vivo naudojamiems metodams patikimą alternatyvą in vitro sąlygomis. 1996 metais vykusiame EBPO (Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacija) seminare pasiūlytas pakopinis in vitro tyrimas fototoksiškumui įvertinti.

\n

1.5. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimu in vitro gautus duomenis palyginus su ūmiojo fototoksiškumo/fotodirglumo poveikiu žmonėms bei gyvūnams pastebėta, kad šis tyrimas leidžia prognozuoti tokį poveikį. Šiuo tyrimu nesiekiama prognozuoti kitokio pobūdžio žalingo poveikio, kuris atsiranda, kai oda vienu metu veikiama cheminėmis medžiagomis bei šviesa, pavyzdžiui, fotogenotoksiškumas, fotoalergija, fotosensibilizacija ar fotokarcinogenotoksiškumas, nors 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo metu daugelis šiomis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų reagavo teigiamai. Šis tyrimas nėra skirtas įvertinti šviesos fototoksiniam aktyvumui.

\n

1.6. Nuoseklus cheminių medžiagų fototoksiškumo tyrimas pateikiamas šio metodo 1 piešinyje.

\n
2.Apibrėžimai 2.1. Spindėjimas – ultravioletinės (UV) ar matomos šviesos, krentančios ant paviršiaus, intensyvumas, išreiškiamas W/m2 arba mW/m2.
\n

2.2. Šviesos dozė – ultravioletinės (UV) ar matomosios šviesos, krentančios ant paviršiaus, kiekis išreiškiamas džauliais (= W x s) paviršiaus plotui, pvz., J/m2, J/cm2.

\n

2.3. Ultravioletinės šviesos bangų juostos – CIE (Tarptautinės radiacijos komisijos) rekomenduojami žymėjimai:UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm), UVC (100-280 nm).

\n

2.4. Vartojami ir kiti apibrėžimai: skiriamoji riba tarp UVA ir UVB ties 320 nm padala, todėl UVA galima padalyti į UV-A1 ir UV-A2, skiriamąją ribą nustatant ties 340 nm padala.

\n

2.5. Ląstelių gyvybingumas – absoliutus ląstelių populiacijos aktyvumas (pavyzdžiui, vitalinio neutralaus raudonojo dažo sugėrimą į ląstelių lizosomas), kuris priklausomai nuo galutinio išmatuoto dydžio bei tyrimo programos susijęs/priklauso nuo bendro ląstelių skaičiaus ir/ar jų gyvybingumo.

\n

2.6. Santykinis ląstelių gyvybingumas – ląstelių gyvybingumas, išreikštas palyginus su neigiamais pamatiniais mėginiais (tirpikliais), su kuriais atliekama visa tyrimo procedūra (arba + UV arba - UV), tačiau kurie nebuvo paveikti tiriamąja chemine medžiaga.

\n

2.7. Spėjimų modelis – algoritmas, naudojamas toksiškumo tyrimo rezultatus paversti toksiškumo galios prognoze. Pasirinkus šį kelią, bandant spėti apie fototoksinį aktyvumą, norint 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimo in vitro metu gautus rezultatus paversti fotoksiškumo galios prognoze, galima panaudoti FSF (fotosudirginimo faktorių) bei VFE (vidutinį foto efektą).

\n

2.8. Fotosudirginimo faktorius (FSF) – faktorius, gaunamas, lyginant tarpusavyje dvi vienodai veiksmingas tiriamas cheminės medžiagos citotoksines koncentracijas (EC50) gautas, apšvitinus necitotoksine ultravioletine/matoma šviesa, nesant (- UV) ir esant (+UV).

\n

2.9. Vidutinis fotoefektas (VFE) – naujas parametras, gautas matematiškai išanalizavus visą 2 skirtingų koncentracijų kreivių duomenis, gautus apšvitinus necitotoksine ultravioletine/matoma šviesa, nesant (- UV) ir esant (+ UV).

\n

2.10. Fototoksiškumas – ūmiai pasireiškiantis toksinis atsakas, kai oda iš pradžių veikiama tam tikromis cheminėmis medžiagomis, o vėliau - šviesa, arba kurį sukelia į odą sistemiškai injekuojama cheminė medžiaga.

\n

2.11. Fotosudirginimas – „fototoksiškumo“ atmaina, naudojama apibūdinti fototoksines reakcijas, kurios vyksta odoje, kai ji veikiama cheminėmis medžiagomis vietiniu ar oraliniu būdu. Vykstant šioms fototoksinėms reakcijoms, ląstelės suardomos nespecifiniu būdu (ši reakcija panaši į tą, kurią sukelia nudegimas nuo saulės).

\n

2.12. Fotoalergija – įgytas imunologinis reaktyvumas, kurio nebūna odą veikiant chemine medžiaga pirmą kartą; jį sukelia tik 1–2 savaites trunkanti indukcija.

\n

2.13. Fotogenotoksiškumas – genotoksinis atsakas, pažeidžiantis ląstelės genomą ir atsirandantis, kai ląstelės apšvitinamos ultravioletinės/matomos šviesos bangų negenotoksine doze ir paveikiamos negenotoksine chemine medžiaga.

\n

2.14. Fotokancerogeniškumas – kancerogeniškas, sukeliamas pakartotinai paveikus chemine medžiaga ir šviesa. Terminas „fotokarcinogenezė“ naudojamas, kai cheminė medžiaga sustiprina ultravioletinio spinduliavimo sukelto vėžio vystymąsi.

\n
3.Kontrolinės medžiagos. Atliekant tyrimą, norint nustatyti 3T3 NRU fototoksiškumą, šalia teigiamos kontrolinės medžiagos - chlorpromazino, kuri tiriama kiekvieno naujo bandymo metu, vienu metu naudojama grupė kontrolinių cheminių medžiagų, kurios naudojamos, atliekant šį tyrimą keliose skirtingose laboratorijose.
\n
4.Parengtinis aptarimas. Nustatyta, kad daugelio tipų cheminės medžiagos sukelia fototoksinį poveikį. Vienintelė bendra šių medžiagų ypatybė - sugebėjimas absorbuoti saulės šviesos bangų spektre esančią šviesos energiją. Pagal I fotochemijos dėsnį (Grotthaus-Draper dėsnis) tam, kad vyktų fotocheminė reakcija, yra reikalingas pakankamas absorbuotų šviesos kvantų kiekis. Prieš atliekant biologinį tyrimą, vadovaujantis šia tyrimo metodika (pagal EBPO fototoksiškumo tyrimo rekomendaciją Nr. 101), nustatomas tiriamos medžiagos absorbuojamos ultravioletinės/matomosios šviesos bangų spektras. Jeigu moliarinės ekstinkcijos/absorbcijos koeficientas yra mažesnis nei 10 litrų ´ mol-1´ cm-1, tai tiriamoji medžiaga nepasižymi fototoksiniu aktyvumu ir ji nenaudojama atliekant in vitro 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą nei kurį nors kitą biologinį tyrimą, norint nustatyti žalingą fotocheminį poveikį.
\n
5.Bandymo metodo principas 5.1. Nustatyti 4 mechanizmai, kaip chromoforas (cheminė medžiaga), absorbuodamas šviesą, sukelia fototoksinį atsaką. Jie visi sukelia ląstelių pažeidimus. 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimas in vitro remiasi cheminės medžiagos citotoksiškumo, medžiagą apšvitinant arba neapšvitinant necitotoksine UVA/matomos šviesos doze, palyginimu. Šio tyrimo metu citotoksiškumas išreiškiamas nuo koncentracijos priklausomu vitalinio neutralaus raudonojo dažo (NR) susigėrimo į ląstelę susilpnėjimu praėjus 24 valandoms, kai ląstelės buvo paveiktos tiriamąja chemine medžiaga bei apšvitintos.
\n

5.2. Balb/c inbredinio pelių kamieno transformuoto fibroblastų ląstelių linija 3T3 kultivuojama 24 valandas in vitro, kad susiformuotų monosluoksniai. Po to į dvi 96 duobučių mikroplokšteles, tiriant vieną tiriamąją medžiagą, įvedamos 8 skirtingos tiriamosios medžiagos koncentracijos, ir plokštelės inkubuojamos 1 valandą. Po to viena mikroplokštelė apšvitinama necitotoksine 5J/cm2 UVA/matomos šviesos doze (+ UV eksperimentas), o kita plokštelė tuo metu laikoma tamsoje (- UV eksperimentas). Vėliau abiejose plokštelėse esanti terpė pakeičiama kultivavimui skirta terpe, ir po pakartotinio 24 valandų inkubavimo nustatomas ląstelių gyvybingumas pagal 3 valandas trunkantį neutralaus raudonojo dažo susigėrimą (NRU) į ląsteles. Santykinis ląstelių gyvybingumas, išreiškiamas neigiamų kontrolinių mėginių (nepaveiktų nei chemine medžiaga, nei šviesa) procentais ir apskaičiuojamas kiekvienai iš 8 tiriamosios medžiagos koncentracijų. Norint prognozuoti medžiagos fototoksinį aktyvumą, lyginami atsakai į skirtingas (+ UV) ir (- UV) medžiagos koncentracijas, kai lygis būna EC50, t. y. tokios koncentracijos, kuri slopina ląstelių gyvybingumą 50% tiriamąja medžiaga nepaveiktuose kontroliniuose mėginiuose.

\n
6.Kokybės kriterijai 6.1. Ląstelių jautrumas UVA; ankstesnių tyrimų duomenys: ląstelių jautrumas UVA reguliariai tikrinamas. Ląstelės pasėjamos tokiu tankiu, kuris naudojamas, atliekant 3T3 NRU fototoksiškumą in vitro, kitą dieną ląstelės apšvitinamos UVA (1–9 J/cm2) dozėmis, o sekančią dieną ląstelių gyvybingumas nustatomas atliekant neutralaus raudonojo dažo susigėrimo į ląsteles (NRU) tyrimą. Ląstelės laikomos atitinkančios kokybės kriterijus, jei jų gyvybingumas po apšvitinimo su 5 J/cm2 UVA spindulių doze sudaro ne mažiau kaip 80% tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Esant didžiausiai apšvitinimo UVA spinduliais dozei (9 J/cm2), ląstelių gyvybingumas sudaro ne mažiau kaip 50% tamsoje laikytų kontrolinių ląstelių gyvybingumo. Tikrinimas atliekamas, darant kas dešimtą ląstelių persėjimą.
\n

6.2. Neigiamų pamatinių mėginių ląstelių jautrumas UVA tyrimas: tyrimas laikomas atitinkančiu kokybės kriterijus, jei neigiamų pamatinių ląstelių (laikomų Earl’o subalansuotame druskų tirpale (EBSS), kuriame yra ar nėra 1% dimetilsulfoksido (DMSO) ar 1% etiletanolio (EtOH), atliekant + UVA tyrimą, gyvybingumas sudaro ne mažiau kaip 80% neapšvitintų ląstelių, laikytų tame pačiame tirpale tamsoje (- UVA).

\n

6.3. Neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių gyvybingumas: absoliutus optinis tankis (OT540 NRU) išmatuotas NR neigiamų kontrolinių mėginių ląstelių ekstrakte parodo, ar 1 x 104 ląstelių, pasėtų į 1 mikroplokštelės duobutę, skaičius padidėjo, padvigubinus laiką per dvi tyrimo dienas. Tyrimas laikomas priimtinu, jei kontrolinių mėginių, nepaveiktų chemine medžiaga, optinio tankio (OT540 NRU) vidurkis yra ³ 0,2.

\n

6.4. Teigiami kontroliniai mėginiai: atliekant kiekvieną 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, tiriamas ir žinomos cheminės medžiagos fototoksinis aktyvumas. Europos Sąjungos/COLIPA patvirtinančiame tyrime teigiama kontroline medžiaga buvo chlorpromazinas, todėl rekomenduojama jį naudoti. Atliekant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrimą in vitro, naudojant chlorpromaziną pagal standartinį protokolą, nustatyti tokie tyrimo priimtinumo kriterijai: ląstelių, apšvitintas UVA chlorpromazinas: EC50 = 0,1-2mg/ml, neapšvitintas UVA chlorpromazinas = nuo 7,0 iki 90,0 mg/ml. Foto dirglumo faktorius, t. y. EC50 pokytis ne mažesnius negu 6.

\n

6.5. Vietoj chlorpromazino kaip gretutinės teigiamos kontrolinės medžiagos naudojamos kitos žinomos cheminės medžiagos, pasižyminčias fototoksiniu aktyvumu bei atitinkančias tiriamos medžiagos klasę bei pasižyminčias tokiomis pat tirpumo savybėmis. Tuo atveju, kaip rodo ankstesnių tyrimų duomenys, tinkamai nustatoma EC50 dydžių intervalus/skalė, fotodirglumo faktorius bei vidutinis fotoefektas kaip tyrimo priimtinumo kriterijus.

\n
7.Bandymo metodo aprašymas 7.1. Pasiruošimas 7.1.1. Ląstelės 7.1.1.1. Atliekant patvirtinimo tyrimą, panaudota pelių fibroblastų ląstelių permanentinė linija Balb/c/3T3 (klonas 31), gauta arba iš ATCC arba iš ECACC ir todėl siūloma ją naudoti. Atliekant tyrimą pagal tą patį protokolą, galima sėkmingai panaudoti kitas ląsteles ar ląstelių linijas, jei jų kultivavimo sąlygos yra pritaikytos specifiniams ląstelių poreikius, tačiau reikia, kad jos būtų ekvivalentiškos.
\n

7.1.1.2. Nuolat tikrinama, ar ląstelės neužkrėstos mikoplazmomis, ir tik tada, kai tokio patikrinimo rezultatai yra patenkinami, ląstelės tiriamos.

\n

7.1.1.3. Didinant ląstelių persėjimų skaičių, ląstelių jautrumas UVA spinduliams padidėja, todėl tiriamos pačio mažiausio persėjimo (mažesnio nei 100) Balb/c/3T3 linijos ląstelės. Svarbu patikrinti Balb/c/3T3 linijos ląstelių jautrumą UVA spinduliams pagal šioje metodikoje pateiktą kokybės kontrolės procedūrą.

\n

7.1.2. Terpė ir kultivavimo sąlygos. Atliekant įprastinį ląstelių persėjimą bei tyrimo procedūras, naudojama atitinkama terpė bei kultivavimo sąlygos. Balb/c/3T3 linijos ląstelės kultivuojamos DMEM terpėje, papildytoje 10% naujagimių veršelių serumu, 4mM glutaminu, penicilinu bei streptomicinu drėgnoje atmosferoje, kai aplinkos temperatūra siekia 37°C, o CO2 kiekis - 7,5%. Svarbu, kad ląstelių kultivavimo sąlygos užtikrintų ląstelinį ciklą tyrime naudojamų ląstelių ar jų linijų gyvavimo laikotarpiu.

\n

7.1.3. Kultūrų paruošimas 7.1.3.1. Ląstelės, paimtos iš užšaldytų kamieninių kultūrų, pasėjamos į kultivavimo terpę reikiamu tankumu ir bent kartą yra persėjamos prieš jas panaudojant 3T3 NRU fototoksiškumo tyrime in vitro.

\n

7.1.3.2. Ląstelės, kurios naudojamos fototoksiškumo tyrime, pasėjamos į kultivavimo terpę tokiu tankiu, kad atskiros ląstelių kolonijos nesusilietų kultivavimo pabaigoje, t. y. tada, kai praėjus 48 valandoms nuo ląstelių pasėjimo, yra įvertinamas jų gyvybingumas. Balb/c/3T3 linijos ląstelėms, auginamoms 96 duobučių mikrotitravimo plokštelėje, rekomenduojamas ląstelių tankis 1 duobutėje yra 1 x 104.

\n

7.1.3.3. Tiriant kiekvieną cheminę medžiagą, ląstelės vienodai pasėjamos į 2 atskiras 96 duobučių mikrotitravimo plokšteles, kurios viso tyrimo metu yra kultivuojamos vienodomis sąlygomis, išskyrus tą laikotarpį, kai ląstelės, kultivuojamos vienoje plokštelėje, apšvitinamos (+ UVA spinduliais/matoma šviesa), o kitoje plokštelėje - laikomos tamsoje (- UVA/matoma šviesa).

\n

7.1.4. Metabolinė aktyvacija. Atliekant tyrimus, siekiant įvertinti tiriamų medžiagų genotoksinį bei karcinogeninį aktyvumą, naudojamos metabolinės sistemos, tačiau fototoksikologinių tyrimų atveju nėra žinoma jokia cheminė medžiaga, kurią reikia transformuoti metaboliniu būdu, norint, kad ta medžiaga veiktų kaip fototoksinas tiek in vivo, tiek in vitro. Dėl šios priežasties šiam tyrimui metabolinės aktyvacijos sistema nėra nei būtina, nei moksliškai pateisinama.

\n

7.1.5. Tiriamoji cheminė medžiaga/preparatas 7.1.5.1. Iškart, prieš pradedant tyrimą, tiriamos cheminės medžiagos naujai paruošiamos, nebent jų stabilumo tyrimai rodo, kad laikymo metu medžiagos nepakito. Medžiagos paruošiamos apšvietus raudona šviesa, jei gali prasidėti greita jų fotodegradacija.

\n

7.1.5.2. Tiriamos medžiagos ištirpinamos buferiniuose druskų tirpaluose - Earl’o balansuotame druskų tirpale (EBSS) arba buferiniame fosfatinių druskų tirpale (PBS), kuriuose nėra nei baltymų, nei absorbuojančių šviesą pH indikatorinių spalvų, nes švitinimo metu nebus išvengta tyrimo klaidų.

\n

7.1.5.3. Ribotai tirpstančios vandenyje tiriamosios medžiagos maksimaliai (iki 100%) ištirpinamos atitinkamuose tirpikliuose, kad būtų pasiekta pageidaujama jų koncentracija ir tada jas galima praskiesti buferiniais druskų tirpalais santykiu 1:100. Jei naudojamas tirpiklis, visose kultūrose jo tūris turi būti pastovus -1%(v/v), t. y. neigiamuose kontroliniuose mėginiuose ir visose tiriamosios medžiagos koncentracijose.

\n

7.1.5.4. Rekomenduojami tirpikliai yra dimetilsulfoksidas (DMSO) ir etanolis (EtOH). Galima naudoti ir kitus nedidelio citotoksiškumo tirpiklius (pvz., acetoną), tačiau prieš naudojimą detaliai ištiriamos jų specifinės savybės, pvz., jų sąveika su chemine medžiaga, fototoksinio efekto slopinimas bei laisvųjų radikalų surišimas.

\n

7.1.5.5. Tirpumas padidinamas tiriamąją medžiagą suplakant, ir/ar suardant ultragarsu, ir/ar kaitinant iki 37°C temperatūros.

\n

7.1.6. Švitinimas ultravioletiniais spinduliais/pasirengimas

", "next": 239513}