LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL PAŠARŲ TYRIMŲ TECHNINIŲ REGLAMENTŲ PATVIRTINIMO 2004 m. gruodžio 17 d. Nr. 3D-667 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952; 2004, Nr. 73-2541) ir siekdamas pašarų kokybės tikslaus įvertinimo: 1. Tvirtinu pridedamus: 1.1. Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techninį reglamentą; 1.2. Tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-chlordibenzo-p-dioksinų ir tetra-, penta-, heksa-, hepta-, okta-dibenzofuranų kiekių pašaruose nustatymo izotopų skiedimo metodu techninį reglamentą. 2. Šis įsakymas įsigalioja nuo 2005 m. sausio 1 d. ŽEMĖS ŪKIO MINISTRĖ KAZIMIERA DANUTĖ PRUNSKIENĖ ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2004 m. gruodžio 17 d. įsakymu Nr. 3D-667 PAŠARŲ TYRIMO CHEMINĖS ANALIZĖS METODŲ ĮTEISINIMO METODIKOS TECHNINIS REGLAMENTAS Parengtas pagal 2002 m. rugpjūčio 14 d. Europos Komisijos sprendimą 2002/657/EB dėl Tarybos direktyvos 96/23/EB nuostatų dėl analizės metodų tinkamumo ir rezultatų aiškinimo įgyvendinimo. I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techninis reglamentas (toliau – techninis reglamentas) numato analizės metodų, taikomų pašarų kokybės tyrimams, taikymo reikalavimus bei nustato bendruosius akredituotose (pripažintose) laboratorijose atliekamų tyrimų rezultatų aiškinimo kriterijus. Šis techninis reglamentas netaikomas medžiagoms, dėl kurių kituose teisės aktuose yra nustatytos ypatingos taisyklės. 2. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visos pašarų mėginių, paimtų valstybinę kontrolę atliekančios institucijos, tyrimus atliekančios laboratorijos ir pašarų kokybės valstybinę kontrolę vykdanti institucija. 3. Pašarų kokybės valstybinę kontrolę vykdanti institucija užtikrina, kad pašarų kokybės valstybinei kontrolei paimti mėginiai būtų analizuojami tyrimų metodais, kurie atitinka šio techninio reglamento priedo Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodika (toliau – priedas) 2 dalies nuostatas, yra įteisinti minėto priedo 3 dalyje aprašyta tvarka bei patenkina mažiausiųjų privalomų aptikti kiekių (MPAK) reikalavimus (pageidautina pagal ISO 78-2 [5.6]). Pastarasis reikalavimas taikomas analitiniams metodams, įgalinantiems analizuoti medžiagas, kurioms nėra nustatyti ribiniai leistini kiekiai. 4. Pašarų kokybės valstybinės kontrolės tyrimams paimtų mėginių analizės rezultatų kokybė turi būti garantuojama vadovaujantis ISO 17025 [5.1] 5.9 dalies nuostatomis. 5. Pašarų kokybės valstybinės kontrolės tyrimų rezultatai vertinami vadovaujantis šiomis nuostatomis: 5.1. analizės rezultatas laikomas teigiamu, jei viršijama patvirtinančio metodo analitės sprendimo riba; 5.2. jei nustatytas ribinis leistinas medžiagos kiekis, sprendimo riba yra tokia koncentracija, kurią viršijus 1 – a statistiniu patikimumu galima būtų spręsti, kad leistino kiekio riba yra iš tikrųjų viršyta; 5.3. Jei ribinis leistinas medžiagos kiekis nenustatytas, sprendimo riba yra žemiausias koncentracijos lygis, kuriam esant 1 – a statistiniu patikimumu būtų galima teigti, kad esama būtent tos analitės. II. SĄVOKOS, TERMINAI IR SUTRUMPINIMAI 6. Vartojamos sąvokos ir terminai pateikti techninio reglamento priedo 1 dalyje. 7. Vartojami sutrumpinimai pateikti techninio reglamento priedo 4 dalyje. III. CHEMINĖS ANALIZĖS METODŲ ĮTEISINIMAS 8. Pašarų tyrimų cheminės analizės metodai įteisinami taikant šio techninio reglamento priede nurodytą metodiką. ______________ Pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techninio reglamento priedas PAŠARŲ TYRIMO CHEMINĖS ANALIZĖS METODŲ ĮTEISINIMO METODIKA I. Sąvokos ir terminai 1. Šioje metodikoje vartojamos sąvokos ir terminai: Alfa (

1. a)paklaida – tikimybė, kad ištirtas mėginys yra neigiamas, nors buvo gautas teigiamas matavimo rezultatas (neteisingas sprendimas dėl teigiamo rezultato); Analitė – medžiaga (bei analizės metu iš jos susidarę dariniai), kurią reikia aptikti, identifikuoti ir (arba) nustatyti jos kiekį; Aptikimo geba (CCb) – mažiausias medžiagos kiekis, kurį su b paklaidos tikimybe galima aptikti, identifikuoti ir (arba) nustatyti mėginyje. Jei ribinis leistinas medžiagų kiekis nenustatytas, aptikimo geba yra tokia mažiausia koncentracija, kuriai esant tuo metodu 1 – b statistiniu patikimumu galima nustatyti tikrai užterštus mėginius. Jei ribinis leistinas medžiagų kiekis nustatytas, tai yra tokia koncentracija, kuriai esant tuo metodu 1 – b statistiniu patikimumu galima nustatyti ribinio leistino kiekio koncentraciją; Atkuriamumas – glaudumas atkuriamumo sąlygomis [5.2]; Atkuriamumas laboratorijoje – glaudumas toje pačioje laboratorijoje nurodytomis (iš anksto nustatytomis) sąlygomis (pvz., dėl metodo, tiriamųjų medžiagų, laborantų, aplinkos), tyrimus atliekant pagrįstai ilgais laiko tarpais; Atkuriamumo sąlygos – sąlygos, kuriomis tyrimų rezultatai gaunami skirtingose laboratorijose, dirbant skirtingiems laborantams, naudojant skirtingą įrangą, taikant tą patį metodą ir tiriant tapačius mėginius [5.2, 5.4]; Atrankos metodas – tyrimo metodas, taikomas aptikti medžiagas ar medžiagų klasę dominančiu lygiu. Toks metodas pasižymi dideliu mėginių tyrimo našumu ir taikomas dideliems kiekiams tokių mėginių, kurių rezultatai yra potencialiai teigiami, išanalizuoti. Jie specialiai skirti tam, kad būtų išvengta neteisingų neigiamų rezultatų; Atsparumas – analizės metodo jautrumas tiems eksperimentinių sąlygų pokyčiams, kuriuos galima išreikšti kaip mėginio medžiagų, analičių, sandėliavimo sąlygų, aplinkos ir (arba) mėginio paruošimo sąlygų derinį, kuriam esant metodą galima taikyti pagal nurodymus arba su nurodytais nedideliais pakeitimais. Reikia nurodyti visų eksperimentinių sąlygų, kurios iš tikrųjų gali kisti (pvz., reagentų stabilumas, mėginio sudėtis, pH, temperatūra), pokyčius, kurie gali turėti įtakos analizės rezultatams; Beta (
2. b)paklaida – tikimybė, kad ištirtas mėginys yra teigiamas, nors buvo gautas neigiamas matavimo rezultatas (neteisingas sprendimas dėl neigiamo rezultato); Dominantis lygis – medžiagos ar analitės koncentracija mėginyje, kuri yra svarbi nustatant medžiagos atitikimą teisės aktų reikalavimus; Etaloninė analitė – žinomos ir patvirtintos sudėties bei grynumo analitė, skirta naudoti kaip analizės etalonas; Etaloninė priemaiša – procedūra, pagal kurią tiriamasis mėginys padalijamas į dvi (ar daugiau) tiriamųjų dalių. Viena dalis analizuojama tokia, kokia yra, o į kitas tiriamąsias dalis prieš analizę pridedamas tam tikras žinomas kiekis etaloninės analitės. Etaloninės analitės pridedama 2-5 kartus daugiau, nei numatomas analitės kiekis mėginyje. Ši procedūra skirta nustatyti analitės kiekį mėginyje, atsižvelgiant į analizės procedūros aptinkamosios dalies rodiklį; Glaudumas – nepriklausomų tyrimų rezultatų, gautų pagal nurodytas (iš anksto nustatytas) sąlygas, panašumas. Glaudumas dažniausiai išreiškiamas netikslumu ir apskaičiuojamas kaip tyrimo rezultato standartinis nuokrypis. Didesnis standartinis nuokrypis reiškia mažesnį glaudumą [5.2]; Išgava – tikrosios medžiagos koncentracijos procentinė dalis, aptikta atliekant analizės procedūrą; Jungtinis tyrimas – to paties mėginio analizavimas tuo pačiu metodu, norint nustatyti to metodo tinkamumo požymius. Tokiu tyrimu analizuojamos atsitiktinės matavimo paklaidos ir laboratorijos nuokrypiai; Kalibracinis etalonas – matavimų priemonė, kuria išreiškiamas dominančios medžiagos kiekis, jo vertę susiejus su pamatine baze; Kiekybinis metodas – analizės metodas, kuriuo medžiagos kiekis ar masės dalis nustatomi taip, kad juos galima būtų išreikšti atitinkamų vienetų skaitmenine verte; Kochromatografija – procedūra, kurią taikant ekstraktas prieš chromatografavimo etapus padalijamas į dvi dalis. Viena dalis ekstrakto chromatografuojama. Antra dalis sumaišoma su etalonine analite, kurios kiekį ir reikia išmatuoti. Tuomet šis mišinys taip pat chromatografuojamas. Etaloninės analitės pridedama maždaug tiek, kiek jo turėtų būti ekstrakte. Šis metodas skirtas geriau identifikuoti analitę taikant chromatografijos metodiką, ypač tuomet, kai negalima naudotis jokiu tinkamu vidiniu etalonu; Kokybinis metodas – analizės metodas, kuriuo medžiaga identifikuojama pagal jos chemines, biologines ar fizines savybes; Kvalifikacijos tyrimas – to paties mėginio analizavimas leidžiant laboratorijoms pasirinkti savą metodiką, jei tokia metodika taikoma pagal nustatytus reikalavimus. Tyrimas turi būti atliekamas pagal ISO vadovus 43-1 [5.3] bei 43-2 [5.4] ir gali būti naudojamas įvertinti metodų atkartojamumą. Laboratorinis mėginys – mėginys, paruoštas siųsti į laboratoriją ir skirtas tikrinti ar tirti; Ribinis leistinas kiekis – didžiausia likučių koncentracija, didžiausias lygis arba kitas didžiausias leistinas kiekis, nustatytas teisės aktais; Mažiausiasis privalomas aptikti kiekis (MPAK) – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį būtina aptikti ir patvirtinti. Šis rodiklis skirtas suderinti metodų, taikomų toms medžiagoms, kurių ribinis leistinas kiekis nenustatytas, analitinį tinkamumą; Medžiaga – tam tikros ar apibrėžtos cheminės sudėties substancija ir jos metabolitai; Nuokrypis – skirtumas tarp laukiamo tyrimų rezultato ir priimtinos pamatinės vertės [5.2]; Pakartojamumas – glaudumas pakartojamumo sąlygomis [5.2]; Pakartojamumo sąlygos – sąlygos, kuriomis toje pačioje laboratorijoje, dirbant tam pačiam laborantui, naudojant tą pačią įrangą, taikant tą patį metodą ir tiriant tapačius mėginius gaunami nepriklausomi tyrimų rezultatai [5.2]; Pamatinė medžiaga – medžiaga, kurios viena ar keletas savybių yra patvirtintos taikant pripažintą metodą, todėl ją galima naudoti prietaisams kalibruoti arba matavimo metodams tikrinti; Papildyta mėginio medžiaga – mėginys, į kurį pridėtas tam tikras žinomas kiekis analitės, kurią reikia aptikti; Patvirtinamasis metodas – metodas, suteikiantis visą ar papildomą informaciją, pagal kurią galima neabejotinai identifikuoti medžiagą, o prireikus nustatyti jos kiekį dominančiu lygiu; Paliudytoji pamatinė medžiaga (PPM) – medžiaga, kurioje yra tam tikras nustatytas jai priskirtos analitės kiekis; Specifiškumas – metodo geba išskirti matuojamą analitę ir kitas medžiagas. Šis rodiklis daugiausia priklauso nuo nurodytos matavimo technologijos, tačiau gali priklausyti nuo junginio klasės ar matricos; Sprendimo riba (CCa) – riba, kurią pasiekus arba viršijus galima a paklaidos patikimumu spręsti, kad mėginys yra teigiamas; Tarplaboratorinis tyrimas (palyginimas) – to paties mėginio tyrimų organizavimas, atlikimas ir įvertinimas dviejose ar daugiau laboratorijų iš anksto nustatytomis sąlygomis tyrimo tinkamumui nustatyti. Pagal tyrimų tikslus juos galima skirstyti į jungtinius ir kvalifikacijos tyrimus; Teisingumas – didelės tyrimų rezultatų serijos vertės vidurkio panašumas į priimtiną pamatinę vertę. Teisingumas paprastai išreiškiamas nuokrypiu [5.2]; Tikslumas – tyrimo rezultato ir priimtinos pamatinės vertės atitikimo artumas [5.2]. Jis nustatomas nustačius teisingumą ir glaudumą; Tinkamumo kriterijai – tinkamumo požymio reikalavimai, pagal kuriuos galima spręsti, ar analizės metodas yra tinkamas ir ar jį taikant gaunami patikimi rezultatai; Tinkamumo požymis – funkcinė kokybė, kurią galima priskirti analizės metodui. Ja gali būti, pvz.: specifiškumas, tikslumas, teisingumas, glaudumas, pakartojamumas, atkuriamumas, aptinkamoji dalis, aptikimo geba ir atsparumas; Tiriamasis mėginys – iš laboratorinio mėginio paruoštas mėginys, iš kurio imamos tiriamosios dalys; Tiriamoji dalis – iš tiriamojo mėginio paimtas medžiagos kiekis atlikti tyrimą ar stebėjimą; Tuščiojo mėginio tyrimas – visa analizės procedūra, atliekama su mėginio, kuriame nėra analitės, tiriamąja dalimi; Tuščiojo reagento tyrimas – visa analizės procedūra, atliekama be mėginio arba vietoj mėginio dalies naudojant tokį patį kiekį tinkamo tirpiklio; Įteisinimas – patvirtinimas objektyviais įrodymais, kad specifinio ketinamo naudojimo ir taikymo reikalavimai yra įvykdyti (LST EN ISO 9000:2001); Vidinis etalonas (VE) – mėginyje nesanti medžiaga, kurios fizinės ir cheminės savybės yra kaip galima panašesnės į tos analitės, kurią reikia identifikuoti ir kurios pridedama į kiekvieną mėginį ir į kalibracinį etaloną; Vidinis laboratorinis atkuriamumas (vietinis pripažinimas) – analizinis tyrimas, kurį atlieka viena laboratorija, taikydama vieną metodą tai pačiai arba skirtingoms tiriamosioms medžiagoms tirti skirtingomis sąlygomis ir pagrįstai ilgais laiko tarpais. II. Analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai 2. Atrankos ar patvirtinimo tikslais gali būti naudojami ir kiti nei toliau aprašyti analizės metodai ar jų deriniai įrodžius, kad jie atitinka pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikos techniniu reglamentu (toliau – metodika) nustatytus reikalavimus. 2.1. Bendrieji reikalavimai 2.1.1. Mėginių paruošimas Mėginiai gaunami, tvarkomi ir apdorojami taip, kad būtų kuo daugiau galimybių aptikti medžiagą. Mėginio paruošimo procedūrų metu turi būti išvengta galimybių atsitiktinai užteršti analites ar sumažinti jų kiekį. 2.1.2. Tyrimų tinkamumas 2.1.2.1. Išgava Jei naudojamas fiksuotas išgavos pataisos daugiklis, analizuojant mėginius nustatoma kiekvienos mėginių partijos išgava. Jei išgava yra leistino dydžio, galima taikyti fiksuotą pataisos daugiklį. Priešingu atveju naudojamas konkrečiai vienos rūšies mėginių serijai nustatytas išgavos daugiklis, nebent reikia taikyti savitąjį mėginio analitės išgavos daugiklį – tuomet analitei mėginyje kiekybiškai nustatyti naudojama etaloninės priemaišos procedūra (žr. 3.5 punktą) arba vidinis etalonas. 2.1.2.2. Specifiškumas Metodas turi būti toks, kad eksperimento sąlygomis galima būtų išskirti analitę ir kitas medžiagas. Reikia pateikti apytikrį tokių galimybių įvertinimą. Reikia imtis priemonių, kad taikant aprašytą matavimo metodą būtų išvengta bet kokios numatomos sąveikos su kitomis medžiagomis, pvz., reikia naudoti dominančių likučių homologus, analogus ar metabolitus. Svarbiausia išnagrinėti galimą matricos komponentų sąveiką. 2.2. Atrankos metodai. Atrankai galima naudoti tik tokius analizės metodus, kurie yra įteisinti ir kurių neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato koeficientas dominančiu lygiu yra mažesnis už 5 % (b paklaida). Visa tai turi būti įrodyta dokumentais, kuriuos galima patikrinti. Jei gaunamas abejotinas teigiamas rezultatas, jis patikrinamas patvirtinamuoju metodu. 2.3. Patvirtinamieji metodai taikomi organiniams likučiams ir teršalams, suteikia informacijos apie cheminę analitės sandarą. Todėl vien chromatografine analize paremti metodai, nenaudojant spektrometrinės detekcijos, patvirtinimui netinka. Tačiau jei vieno metodo specifiškumas yra nepakankamas, norimas specifiškumas pasiekiamas kelių analizės procedūrų tinkamu deriniu – gryninimo, chromatografinio atskyrimo ir spektrometrinės detekcijos. 1 lentelėje pateikti metodai arba metodų deriniai laikomi tinkamais nurodytų medžiagų grupių organiniams likučiams ar teršalams identifikuoti: 1 lentelė. Tinkami organinių likučių ir teršalų nustatymo patvirtinamieji metodai Matavimo metodas Medžiagos[1] Apribojimai SCh arba DCh su masių spektrometrine detekcija A ir B grupės Tik atliekant po tiesioginio arba netiesioginio chromatografinio atskyrimo Tik taikant viso spektro skenavimo metodiką, o jei visas masių spektras nėra fiksuojamas – naudojant ne mažiau kaip 3 (B grupė) arba 4 (A grupė) identifikavimo taškus SCh arba DCh su IR spektrometrine detekcija A ir B grupės Reikia laikytis ypatingųjų IR absorbcinės spektrometrijos reikalavimų SCh su viso spektro skenavimo diodinės matricos detekcija (DMD) B grupė Reikia laikytis ypatingųjų UV absorbcinės spektrometrijos reikalavimų SCh su fluorescencine detekcija B grupė Tik molekulėms, kurios natūraliai fluorescuoja arba kurios fluorescuoja po transformavimosi arba derivatizacijos Dvimatė PSCh su viso spektro skenavimo UV/VIS B grupė Privaloma dvimatė EPSCh ir kochromatografija DCh su elektronų pagava B grupė Tik naudojant dvi skirtingo poliškumo kapiliarines kolonėles SCh su imunograma B grupė Tik naudojant bent dvi skirtingas chromatografines sistemas arba taikant antrą nepriklausomą detekcijos metodą SCh su UV/VIS (vieno bangos ilgio) B grupė Tik naudojant bent dvi skirtingas chromatografines sistemas arba taikant antrą nepriklausomą detekcijos metodą 2.3.1. Bendrieji tinkamumo kriterijai ir reikalavimai Taikant patvirtinamuosius metodus gaunama informacija apie cheminę analitės sandarą. Jei tą patį atsaką sukelia daugiau kaip vienas junginys, tuomet tuo metodu šių junginių atskirti neįmanoma. Vien chromatografine analize paremtų metodų, nenaudojant spektrometrinės detekcijos, negalima taikyti kaip patvirtinamųjų. Jei taikant metodą naudojamas tinkamas vidinis etalonas, tuomet jo pridedama į tiriamąją dalį pradedant ekstrahavimo procedūra. Gali būti naudojamos stabilios žymėtųjų izotopų analitės formos, kurios ypač tinka masių spektrometrinei detekcijai arba panašios į analitę sandaros junginiai (atsižvelgiant į tai, kuriuos lengviau gauti). Kai tinkamu vidiniu etalonu naudotis negalima, analitės identifikacija patvirtinama kochromatografija. Tokiu atveju gaunama tik viena smailė, o padidėjęs smailės aukštis (arba plotas) atitinka pridėtos analitės kiekį. Naudojant dujų chromatografiją (DCh) arba skysčių chromatografiją (SCh), smailės plotis pusės smailės aukštyje sudaro 90-110 % tikrojo pločio, o sulaikymo trukmė skiriasi ne daugiau kaip 5 %. Taikant plonasluoksnės chromatografijos (PSCh) metodus, suintensyvėti gali tik numanomai analitei priklausantis taškas; naujo taško neatsiranda, chromatograma nepasikeičia. Geriausia, jei per visą procedūrą pamatinė arba papildyta medžiaga, kurioje yra žinomas analitės kiekis, lygus arba artimas ribiniam leistinam kiekiui arba sprendimo ribai (teigiamas kontrolinis mėginys), kaip ir tinkamos kontrolinės medžiagos ir tuštieji reagentai, yra tiriama kartu su kiekviena iš analizuojamų vienos rūšies mėginių serija. Ekstraktai analizuojami tokia tvarka: tuščiasis reagentas, neigiamas kontrolinis mėginys, patvirtintinas mėginys (ar mėginiai), vėl neigiamas kontrolinis mėginys ir galiausiai teigiamas kontrolinis mėginys. Bet koks nukrypimas nuo šios sekos turi būti pagrįstas. 2.3.2. Papildomi kiekybinių analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai 2.3.2.1. Kiekybinių metodų teisingumas. Daugkartinės paliudytos pamatinės medžiagos analizės atveju eksperimentiškai nustatytos išgavos pakoreguotosios vidutinės masės dalies nuokrypio nuo patvirtintos vertės rekomenduojamo nuokrypio sritys pateikiamos 2 lentelėje. 2 lentelė. Mažiausiasis kiekybinių metodų teisingumas Masės dalis Nuokrypio sritis ≤ 1 µg/kg nuo 1 µg/kg iki 10 µg/kg ≥ 10 µg/kg Nuo -50 % iki +20 % Nuo -30 % iki +10 % Nuo -20 % iki +10 % Kai PPM nėra, leidžiama matavimų teisingumą įvertinti pagal pridėto žinomo analitės kiekio išgavą tuščioje matricoje. Pagal išgavos vidurkį pakoreguoti duomenys priimtini tik tuomet, jei jie patenka į 2 lentelėje nurodytas sritis. 2.3.2.2. Kiekybinių metodų glaudumas. Daugkartinės pamatinės arba papildytos medžiagos analizės tarplaboratorinis nuokrypio koeficientas (CV) atkuriamumo sąlygomis turi neviršyti Horwitz lygtimi apskaičiuoto lygio: CV = 2(1 – 0,5 log C) čia C yra masės dalis, išreikšta skaičiaus 10 laipsnio rodikliu (pvz., 1 mg/g = 10-3). Pavyzdžiai pateikti 3 lentelėje. 3 lentelė. Kiekybinių metodų atkuriamumo CV pavyzdžiai atitinkamų masės frakcijų srityse Masės dalis Atkuriamumas CV (%) 1 µg/kg * 10 µg/kg * 100 µg/kg 23 1 000 µg/kg (1 mg/
3. kg)16 * Jei masės dalis yra mažesnė kaip 100 µg/kg, taikant Horwitz lygtį gaunamos nepriimtinai didelės vertės. Todėl jei koncentracija mažesnė kaip 100 µg/kg ir CV turi būti kuo mažesnis. Jei analizė atliekama pakartojamumo sąlygomis, tarplaboratorinis CV paprastai būna nuo pusės iki dviejų trečdalių aukščiau nurodytų verčių dydžio. Jei analizė atliekama atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis, laboratorijos CV turi būti ne didesnis už atkuriamumo CV. Jei nustatytas ribinis leistinas medžiagos kiekis, metodo atkuriamumas vienoje laboratorijoje turi būti ne didesnis už atitinkamą atkuriamumo CV, kai medžiagos koncentracija lygi pusei ribinio leistino kiekio. 2.3.3. Masių spektrometrinės detekcijos tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Masių spektrometrijos metodus galima pasirinkti kaip patvirtinamuosius metodus tik tuomet, jei prieš tai atliktas tiesioginis arba netiesioginis chromatografinis atskyrimas. 2.3.3.1. Chromatografinis atskyrimas Vykdant DCh-MS procedūras, dujų chromatografinis atskyrimas atliekamas naudojant kapiliarines kolonėles. Vykdant SCh-MS procedūras, chromatografinis atskyrimas atliekamas naudojant atitinkamas SCh kolonėles. Bet kuriuo atveju trumpiausia priimtina tiriamos analitės sulaikymo trukmė yra dvigubai ilgesnė už tą sulaikymo trukmę, kuri atitinka tuščios kolonėlės tūrį. Tiriamosios dalies analitės sulaikymo trukmė (arba santykinė sulaikymo trukmė) turi atitikti kalibracinio etalono sulaikymo trukmę ir tilpti nurodytos sulaikymo trukmės ribose. Sulaikymo trukmės ribos turi būti proporcingos chromatografinės sistemos skiriamajai gebai. Analitės chromatografinio sulaikymo trukmės santykis su vidinio etalono sulaikymo trukme, t. y. analitės santykinė sulaikymo trukmė, turi atitikti kalibracinio tirpalo santykinę trukmę taikant 5 % leistinąjį nuokrypį DCh atveju ir 2,5 % – SCh atveju. 2.3.3.2. Masių spektrometrinė detekcija. Masių spektrometrinė detekcija atliekama taikant MS metodus, pvz., registruojant visą masių spektrą (viso spektro skenavimas) arba atliekant pasirinktų jonų stebėseną (toliau – PJS), MS-MS(
4. n)metodus, pvz., atliekant pasirinktos reakcijos stebėseną (toliau – PRS), arba kitus tinkamus MS arba MS-MS(
5. n)metodus kartu su atitinkamu jonizavimo būdu. Atliekant didelės skiriamosios gebos masių spektrometriją (DSGMS), skiriamoji geba visoje masių srityje esant 10 % įdubai tarp smailių paprastai turi būti didesnė kaip 10 000. Viso spektro skenavimas. Kai masių spektrometrinis nustatymas atliekamas registruojant visą spektrą, būtina, kad visi matuojami diagnostiniai jonai (molekulinis jonas, molekuliniam jonui būdingi aduktai, būdingi fragmentiniai jonai ir izotopų jonai), kurių intensyvumas yra didesnis kaip 10 %, būtų kalibracinio etalono pamatiniame spektre. PJS. Kai masių spektrometrinis nustatymas atliekamas taikant fragmentografiją; parankiausia, jei molekulinis jonas yra vienas iš pasirinktųjų diagnostinių jonų (molekulinis jonas, molekuliniam jonui būdingi aduktai, būdingi fragmentiniai jonai ir visų jų izotopų jonai). Pasirinktieji diagnostiniai jonai neturi būti vien iš tos pačios molekulės dalies. Kiekvieno diagnostinio jono signalo ir triukšmo santykis turi būti lygus ar didesnis už 3:1. Viso spektro skenavimas ir PJS. Aptiktų jonų santykinis intensyvumas, išreikštas intensyviausio jono intensyvumo procentine dalimi arba pereiga, turi atitikti leistinu nuokrypiu kalibracinio etalono iš panašių koncentracijų kalibracinių tirpalų arba iš papildyto mėginio atitinkamus parametrus išmatuotus tokiomis pačiomis sąlygomis (4 lentelė). 4 lentelė. Santykinio jonų intensyvumo didžiausi leistini nuokrypiai naudojant skirtingus masių spektrometrijos metodus Santykinis intensyvumas (bazinės smailės dalis, %) EJ-DCh-MS (santykinis) CJ-DCh-MS, DCh-MSn, SCh-MS, SCh-MSn (santykinis) > 50 % ±10 % ±20 % nuo 20 % iki 50 % ±15 % ±25 % nuo 10 % iki 20 % ±20 % ±30 % ≤ 10 % ±50 % ±50 % Masių spektro duomenų aiškinimas: diagnostinių jonų ir/arba prekursoriaus/fragmento jonų porų intensyvumą reikia nustatyti sulyginant spektrus arba integruojant pavienių masių pėdsakų signalus. Foninė pataisa (jei taikoma) turi būti vienoda visai vienodos rūšies mėginių serijai (žr. 2.3.1 punkto ketvirtą pastraipą) ir aiškiai nurodyta. Viso spektro skenavimas: registruojant visą skenuojamą spektrą, kai atliekama pavienių masių spektrometrija, turi būti ne mažiau kaip keturi jonai, kurių santykinis intensyvumas sudaro ne mažiau 10 % bazinės smailės. Molekulinį joną galima įskaičiuoti, jei jis yra tokiame pamatiniame spektre ir jo santykinis intensyvumas sudaro ne mažiau kaip 10 %. Mažiausiai keturi jonai turi būti didžiausiais leistinais nuokrypiais apibrėžtose ribose (5 lentelė). Galima naudotis paieška kompiuterinėje bibliotekoje. Tokiu atveju tiriamųjų mėginių ir kalibracinio tirpalo masių spektro duomenų atitiktis turi viršyti ribinį atitikties koeficientą. Šis koeficientas nustatomas atliekant kiekvienos analitės įteisinimo procesą, remiantis tokiu spektru, kuris atitinka toliau aprašytus kriterijus. Tikrinamas spektro kintamumas, atsirandantis dėl mėginio matricos ir detektoriaus sąveikos. 5 lentelė. Masės fragmentų klasių kategorijų ir identifikacijos taškų santykis MS metodas Vieno jono suteikiami identifikacijos taškai Mažos skiriamosios gebos masių spektrometrija (MSG-MS) 1,0 MSG-MSn prekursorius 1,0 MSG-MSn tarpiniai produktai 1,5 DSG-MS 2,0 DSG-MSn prekursorius 2,0 DSG-MSn tarpiniai produktai 2,5 PASTABOS: 1. Kiekvieną joną galima skaičiuoti tik vieną kartą. 2. DCh-MS naudojant elektronų smūgių jonizaciją ir DCh-MS naudojant cheminę jonizaciją laikomi skirtingais metodais. 3. Naudoti skirtingas analites identifikacijos taškų skaičiui padidinti galima tik tuomet, jei dariniai susidaro dėl skirtingų cheminių reakcijų. 4. A grupės medžiagoms galima priskirti ne daugiau kaip vieną identifikacijos tašką, jei analizuojama ESCh su viso spektro skenavimo diodų matricos spektrometrija (DAD), ESCh su fluorescencine detekcija, ESCh su imunograma, dvimate PSCh su spektrometrine detekcija ir su sąlygą kad laikomasi šiems metodams taikomų kriterijų. 5. Tarpiniai produktai – pirminiai ir antriniai fragmentai. PJS: Kai masių fragmentai matuojami taikant kitus viso spektro skenavimo metodus, duomenims aiškinti naudojamasi identifikacijos taškų sistema. A grupės medžiagoms patvirtinti reikia ne mažiau kaip 4 taškų. B grupės medžiagoms patvirtinti reikia ne mažiau kaip 3 taškų. 6 lentelėje pateiktas pagrindiniais masių spektrometrijos metodais galimų gauti identifikacijos taškų skaičius 6 lentelė. Identifikacijos taškų skaičius, kurį galima gauti taikant tam tikrus metodus ar jų derinius (n – sveikasis skaičius) Metodas (-
6. ai)Jonų skaičius Identifikacijos taškai DCh-MS (EJ arba CJ) N n DCh-MS (EJ ir CJ) 2 (EJ) + 2 (CJ) 4 DCh-MS (EJ arba CJ) du dariniai 2 (A darinio) + 2 (B darinio) 4 SCh-MS N n DCh-MS-MS 1 prekursorius ir 2 fragmentai 4 SCh-MS-MS 1 prekursorius ir 2 fragmentai 4 DCh-MS-MS 2 prekursoriaus jonai, kiekvienas po 1 fragmentą 5 SCh-MS-MS 2 prekursoriaus jonai, kiekvienas po 1 fragmentą 5 SCh-MS-MS-MS 1 prekursorius, 1 pirminis fragmentas ir 2 antriniai fragmentai 5,5 DSGMS N 2 n DCh-MS ir SCh-MS 2 + 2 4 DCh-MS ir DSGMS 2 + 1 4 Tačiau tam, kad reikiami identifikacijos taškai galėtų būti patvirtinti ir būtų apskaičiuota identifikacijos taškų suma reikia:
7. a)išmatuoti bent vieną jonų santykį;
8. b)visi išmatuoti jonų santykiai turi atitikti anksčiau aprašytus kriterijus;
9. c)mažiausiam būtinam identifikacijos taškų skaičiui surinkti galima derinti ne daugiau kaip tris atskirus metodus. 2.3.4. Chromatografijos su infraraudonąja detekcija tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Būdingosios smailės – tai absorbcijos maksimumai kalibracinio etalono infraraudonųjų spindulių spektre, atitinkantys toliau nurodytus reikalavimus. 2.3.4.1. Infraraudonoji detekcija Absorbcijos maksimumas turi būti nuo 4 000 cm-1 iki 500 cm-1 bangų skaičių intervale. Absorbcijos intensyvumas turi būti ne mažesnis kaip:
10. a)savitoji molinė absorbcija, lygi 40, nustatant pagal smailės bazinę liniją; arba
11. b)santykinė absorbcija, lygi 12,5 % intensyviausios smailės, esančios intervale nuo 4 000 cm-1 iki 500 cm-1, absorbcijos, kai matuojama pagal nulinę absorbciją, ir 5 % intensyviausios smailės, esančios intervale nuo 4 000 cm-1 iki 500 cm-1, absorbcijos, kai matuojama pagal smailių bazinę liniją. PASTABA. Teoriškai priimtinesnės a punkte nurodytos smailės, praktiškai lengviau nustatyti nurodytąsias b punkte. Nustatomas analitės infraraudonųjų spindulių spektro smailių, kurių dažniai atitinka kalibracinio standarto būdingosios smailės dažnį ± 1 cm-1 nuokrypiu, skaičius. 2.3.4.2. Infraraudonųjų spindulių spektro duomenų aiškinimas. Absorbcija turi būti visose analitės spektro dalyse, kurios atitinka būdingąją smailę kalibracinio etalono pamatiniame spektre. Kalibracinio etalono infraraudonųjų spindulių spektre turi būti ne mažiau kaip šešios būdingosios smailės. Jei smailių yra mažiau [5.7], tuo spektru negalima naudotis kaip pamatiniu. „Rezultatas“, t. y. analitės infraraudonųjų spindulių spektre rastų būdingųjų smailių procentinė dalis, turi būti ne mažesnis kaip 50 %. Kai negalima tiksliai nustatyti, ar smailė yra būdinga, ta analitės spektro dalis turi turėti tinkamos smailės buvimo požymių. Tai taikoma tik toms absorbcijos smailėms mėginio spektre, kurių intensyvumas yra bent tris kartus didesnis už foninį intensyvumą. 2.3.5. Analitės nustatymo naudojant SCh su kitais detekcijos metodais tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai 2.3.5.1. Chromatografinis atskyrimas. Vidinis etalonas naudojamas turint tam tikslui tinkamos medžiagos. Geriausia, jei tai giminingas etalonas, kurio sulaikymo trukmė panaši į analitės. Analitės eliuavimo sulaikymo trukmė turi būti tokia pat kaip atitinkamo kalibracinio etalono esant vienodomis eksperimento sąlygomis. Mažiausioji priimtina analitės sulaikymo trukmė turi būti dvigubai ilgesnė už sulaikymo trukmę, atitinkančią tuščios kolonėlės tūrį. Analitės sulaikymo trukmės ir vidinio etalono sulaikymo trukmės santykis, t. y. santykinė sulaikymo trukmė, turi būti tokia pati kaip kalibracinio etalono sulaikymo trukmė atitinkamoje matricoje (leistinas ± 2,5 % nuokrypis). 2.3.5.2. Viso spektro skenavimo UV/VIS detekcija. Būtina laikytis SCh metodų tinkamumo kriterijų. Absorbcijos maksimumas analitės spektre turi būti ties tomis pačiomis bangos ilgio vertėmis kaip ir kalibracinio etalono; leistinas nuokrypis priklauso nuo detekcijos sistemos skiriamosios gebos. Taikant detekcijos diodų matrica metodą, leistinas nuokrypis paprastai būna ± 2 nm. Virš 220 nm esančios analitės spektro dalys, kurių dviejų spektrų santykinė absorbcija yra ne mažesnė nei 10 %, vizualiai neturi skirtis nuo kalibracinio etalono spektro. Šio kriterijaus reikalavimų laikomasi, jei yra vienodi maksimumai, o skirtumai tarp abiejų spektrų nė viename taške nėra didesni nei 10 % skaičiuojant nuo kalibracinio etalono absorbcijos Jei naudojamasi kompiuterizuota paieška bibliotekoje ir taikomas sulyginimas, tiriamųjų mėginių ir kalibracinio tirpalo spektro duomenų atitiktis turi viršyti ribinį atitikties koeficientą. Šis koeficientas nustatomas atliekant kiekvienos analitės įteisinimo procesą remiantis tokiu spektru, kuris atitinka toliau aprašytus kriterijus. Turi būti tikrinamas spektro kintamumas, atsirandantis dėl mėginio matricos ir detektoriaus sąveikos. 2.3.5.3. Fluorimetrinės detekcijos tinkamumo kriterijai. Būtina laikytis SCh metodų tinkamumo kriterijų. Fluorimetrinės detekcija taikoma analizuoti molekulėms, kurios natūraliai fluorescuoja arba kurios fluorescuoja po transformavimosi arba derivatizacijos. Sužadinimo ir emisijos bangų ilgiai pagal chromatografijos sąlygas parenkami taip, kad tuščių mėginių ekstraktuose atsirastų kuo mažiau trukdančių komponentų. Tarp artimiausio smailės maksimumo chromatogramoje ir priskirtosios analitės smailės ties 10 % analitės smailės maksimalaus aukščio turi būti bent vienos visos smailės pločio tarpas. 2.3.5.4. Analitės nustatymo SCh imunograma tinkamumo kriterijai. Vien SCh imunograma negali būti naudojama kaip patvirtinamasis metodas. Būtina laikytis SCh metodams taikomų kriterijų. Iš anksto nustatyti kokybės parametrai, pvz., nebūdingos jungtys, santykinės jungtys kontroliniuose mėginiuose, tuščio mėginio absorbcijos vertė, turi būti tarp ribų nustatytų įteisinimo metu. Imunogramą turi sudaryti mažiausiai penkios frakcijos. Kiekviena frakcija turi būti mažesnė kaip pusės smailės pločio. Frakcija, kurioje yra didžiausias analitės kiekis, turi būti vienoda tiriant įtariamą mėginį, teigiamą kontrolinį mėginį ir etaloną. 2.3.5.5. Analitės nustatymas taikant SCh kartu su UV/VIS detekcija (vienas bangos ilgis). Vien SCh su UV/VIS detekcija (vienas bangos ilgis) negali būti taikomos kaip patvirtinamasis metodas. Tarp artimiausio smailės maksimumo chromatogramoje ir priskirtosios analitės smailės ties 10 % analitės smailės maksimalaus aukščio turi būti bent vienos visos smailės pločio tarpas. 2.3.6. Analitės nustatymo taikant dvimatę PSCh sykiu su viso spektro skenavimo UV/VIS spektrometrine detekcija tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Privalu atlikti dvimatę EPSCh ir kochromatografiją. Analitės Rf vertės negali skirtis nuo etalonų Rf verčių daugiau kaip ± 5 %. Analitė neturi atsiskirti nuo etalono. Jei dėmės vienodos spalvos, artimiausios dėmės centras turi būti nutolęs nuo analitės dėmės ne mažiau kaip per pusę dėmių skersmenų sumos. Analitės spektras vizualiai neturi skirtis nuo etalono spektro, kaip nurodyta viso spektro skenavimo UV/VIS detekcijai. Jei naudojamasi kompiuterizuota paieška bibliotekoje ir taikomas sulyginimas, tiriamųjų mėginių ir kalibracinio tirpalo spektro duomenų atitiktis turi viršyti ribinį atitikties koeficientą. Šis koeficientas nustatomas atliekant kiekvienos analitės įteisinimo procesą, remiantis spektru, kuris atitinka toliau aprašytus kriterijus. Turi būti tikrinamas spektro kintamumas, atsirandantis dėl mėginio matricos ir detektoriaus sąveikos. 2.3.7. Analitės nustatymo taikant DCh kartu su elektronų pagavos detekcija tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Vidinis etalonas naudojamas turint tam tikslui tinkamos medžiagos. Geriausia, jei tai giminingas etalonas, kurio sulaikymo trukmė panaši į analitės. Analitės eliuavimo sulaikymo trukmė vienodomis eksperimento sąlygomis turi būti tokia pati kaip atitinkamo kalibracinio etalono. Mažiausioji priimtina analitės sulaikymo trukmė turi būti dvigubai ilgesnė už sulaikymo trukmę, atitinkančią tuščios kapiliarinės kolonėlės tūrį. Analitės sulaikymo trukmės ir vidinio etalono sulaikymo trukmės santykis, t. y. santykinė sulaikymo trukmė, turi būti tokia pati, kaip ir kalibracinio etalono sulaikymo trukmė atitinkamoje matricoje (leistinas ± 0,5 % nuokrypis). Tarp artimiausio smailės maksimumo chromatogramoje ir priskirtosios analitės smailės ties 10 % analitės smailės maksimalaus aukščio turi būti mažiausiai vienos visos smailės pločio tarpas. 2.4. Patvirtinamieji elementų nustatymo metodai Patvirtinamieji cheminių elementų metodai grindžiami aiškios identifikacijos koncepcija ir tiksliu bei glaudžiu kiekio nustatymu pasinaudojant unikaliomis turimo cheminio elemento fizinėmis cheminėmis savybėmis (pvz., elementui būdingu skleidžiamos arba sugeriamos spinduliuotės bangos ilgiu, atomine mase) dominančiu lygiu. Cheminiams elementams identifikuoti tinkami metodai ir metodų deriniai išvardyti 7 lentelėje. 2.4.1. Bendrieji patvirtinamųjų metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai Geriausia, jei per visą procedūrą pamatinė arba papildyta medžiaga, kurioje yra žinomas analitės kiekis, lygus arba artimas leistinam kiekiui arba sprendimo ribai (teigiamas kontrolinis mėginys), kaip ir tinkamos kontrolinės medžiagos ir tuštieji reagentai, yra tiriama kartu su kiekvienu iš analizuojamų tiriamųjų mėginių. Ekstraktai analizuojami tokia tvarka: tuščiasis reagentas, neigiamas kontrolinis mėginys, patvirtintinas mėginys (ar mėginiai), vėl neigiamas kontrolinis mėginys ir galiausiai teigiamas kontrolinis mėginys. Bet koks nukrypimas nuo šios sekos turi būti pagrįstas. 7 lentelė. Tinkami patvirtinamieji cheminių elementų nustatymo metodai Metodas Matuojamas parametras Diferencinė impulsinė grįžtamojo vyksmo anodinė voltamperometrija (DIGVAV) Elektros signalas Atominė absorbcinė spektrometrija: Atomizacija liepsnoje Absorbuojamų bangų ilgis Hidrido sudarymas Absorbuojamų bangų ilgis Šaltasis garas Absorbuojamų bangų ilgis Elektroterminė atomizacija (grafito krosnis) Absorbuojamų bangų ilgis Atominė emisinė spektrometrija: Indukciškai sujungta plazma Emisijos bangų ilgis Masių spektrometrija: Indukciškai sujungta plazma Masės ir krūvio santykis Daugelyje analizės metodų prieš nustatant analitę būtina visiškai sudeginti organinę matricą. Tai galima padaryti atliekant mineralizaciją mikrobangomis, kuri labiausiai sumažina pavojų, kad dominanti analitė bus užteršta ir (arba) dalis jos prarasta. Naudojami aukštos kokybės dezaktyvuoti tefloniniai indai. Jei pasirenkami kiti drėgnojo ar sausojo sudeginimo metodai, dokumentais patvirtinama, kad juos taikant neįmanoma prarasti ar užteršti medžiagą. Analitėms iš matricos komponentų išskirti ir (arba) koncentruoti tam tikromis aplinkybėmis vietoj sudeginimo galima pasirinkti išskyrimo procedūras (pvz., ekstrahavimą). Atliekant kalibravimą – tiek išorinį, tiek taikant etaloninės priemaišos metodą, pasirūpinama, kad nebūtų viršyta nustatyta darbinė analizės riba. Jei atliekamas išorinis kalibravimas, kalibraciniai etalonai ruošiami tokiame tirpale, kurio sudėtis yra kaip galima panašesnė į mėginio tirpalo sudėtį. Susiklosčius ypatingoms analizės aplinkybėms, taikoma foninė korekcija. 2.4.2. Papildomi kiekybinių analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai 2.4.2.1. Kiekybinių metodų teisingumas Daugkartinės paliudytos pamatinės medžiagos elementų analizės atveju eksperimentiškai nustatyto kiekio vidurkis gali skirtis nuo patvirtintos vertės ne daugiau kaip ± 10 %. Kai PPM nėra, leidžiama matavimų teisingumą įvertinti pagal žinomo kiekio elemento priemaišų nežinomuose mėginiuose išgavą. Atkreiptinas dėmesys į tai, kad skirtingai nei analitė primaišomas elementas nėra chemiškai susijęs su tikrąja matrica, todėl taikant šį metodą gauti rezultatai yra mažiau patikimi nei gautieji taikant PPM. Duomenys apie išgavą priimtini tik tuomet, jei skiriasi nuo tikslinės vertės ne daugiau kaip ± 10 %. 2.4.2.2. Kiekybinių metodų glaudumas Daugkartinės mėginio analizės tarplaboratorinis nuokrypio koeficientas (CV) atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis turi neviršyti 8 lentelėje nurodytų verčių. 8 lentelė. Kiekybinių metodų CV esant įvairioms analitės masės dalims Masės dalis Atkuriamumas CV (%) nuo ≥ 10 µg/kg iki 100 µg/kg 20 nuo > 100 µg/kg iki 1 000 µg/kg 15 ≥ 1 000 µg/kg 10 2.4.3. Ypatingieji reikalavimai diferencinės impulsinės grįžtamojo vyksmo anodinės voltamperometrijos metodams (DIGVAV). Svarbiausia – iki DIGVAV tyrimo visiškai suardyti organinę medžiagą mėginiuose. Voltamperogramose neturi matytis organinių medžiagų sukeliamų plačių signalų. Neorganinės matricos sudėtinės dalys gali turėti įtakos DIGVAV smailių aukščiui. Todėl kiekis turi būti nustatomas etaloninės priemaišos metodu. Pateiktini mėginio tirpalų tipinių voltamperogramų pavyzdžiai. 2.4.4. Ypatingieji reikalavimai atominės absorbcinės spektrometrijos AAS metodams Šis metodas iš esmės yra monoelementinis ir todėl reikia optimizuoti eksperimento parametrus priklausomai nuo tiriamo elemento. Jeigu įmanoma, rezultatai tikrinami kokybiniu ir kiekybiniu būdu, pasinaudojant alternatyviomis absorbcijos linijomis (geriausia pasirinkti dvi skirtingas linijas). Kalibraciniai etalonai paruošiami tirpalo matricoje, kuri yra kaip galima panašesnė į mėginio matavimo tirpalą (pvz., rūgšties koncentracija ar modifikatoriaus sudėtimi). Tam, kad būtų mažiau negaliojančių verčių, visi reagentai turi būti kuo švaresni. Atsižvelgiant į tai, koks mėginio išgarinimo ir (arba) atomizacijos būdas pasirenkamas, išskiriamos įvairios AAS analizės rūšys. 2.4.4.1. Ypatingieji reikalavimai liepsnos AAS. Prietaisas turi būti optimaliai sureguliuojamas atitinkamai pagal kiekvieną elementą. Ypač reikia kontroliuoti dujų sudėtį ir debitą. Siekiant išvengti foninės absorbcijos sukeliamų trukdžių, naudojamas ištisinės aplinkos šaltinio korektorius. Jei matrica nežinoma, reikia patikrinti, ar būtina foninė korekcija. 2.4.4.2. Ypatingieji reikalavimai AAS su grafito krosnele. Dirbant ties pėdsakiniu lygiu su grafito krosnele, laboratorijos užterštumas neretai kenkia tikslumui. Todėl dirbant su mėginiu ir etalonu reikia naudoti labai švarius reagentus, dejonizuotą vandenį ir priemones iš inertinio plastiko. Ypač svarbu kontroliuoti išankstinio apdorojimo bei atomizacijos sąlygas (temperatūrą, trukmę) ir matricos pasikeitimą. Matricos įtaka analitės atomizacijai sumažėja dirbant izoterminio atomizavimo sąlygomis (pvz., statmenai kaitinamame grafito vamzdyje su integruota Lvov platforma [5.8]. Kiekį leidžiama nustatyti pagal kalibracinę kreivę, gautą matuojant etaloninius vandens tirpalus, jei tai atliekama derinant matricos modifikavimą ir Zeeman foninę pataisą [5.9]. 2.4.5. Ypatingieji reikalavimai atominei absorbcinei spektrometrijai sudarant hidridą. Organiniai junginiai, kuriuose yra tokių elementų kaip arsenas, bismutas, germanis, švinas, stibis, selenas, alavas ir telūras, gali būti labai stabilūs ir visam elemento kiekiui nustatyti gali prireikti oksidacinio skaidymo. Todėl rekomenduojamas sudeginimas mikrobangomis arba esant aukštame slėgyje stipriai oksiduojant. Reikia kreipti ypatingą dėmesį į tai, kad elementai visiškai, bet atkuriamai, pavirstų atitinkamais hidridais. Arseno hidrido susidarymas druskos rūgšties tirpale su NaBH4 priklauso nuo arseno oksidacijos laipsnio (As(III) susidaro greitai, As(V) formuojasi ilgiau). Tam, kad nustatant As(V) srauto įpurškimo metodu nesumažėtų jautrumas dėl trumpos reakcijos trukmės, po oksidacinio skaidymo As(V) reikia redukuoti iki As(III). Tam tinka kalio jodidas, askorbo rūgštis arba cisteinas. Tuštieji, kalibraciniai tirpalai ir mėginio tirpalai apdorojami tuo pačiu būdu. Dirbant su vienos rūšies mėginių serijomis, galima nustatyti abi arseno rūšis nepakenkiant tikslumui. Dėl uždelsto As(V) hidrido formavimosi kalibravimas atliekamas integruojant smailės plotą. Parenkami optimalūs prietaiso parametrai. Ypač svarbu kontroliuoti dujų srautą, kuris perneša hidridą į atomizatorių. 2.4.6. Ypatingieji reikalavimai šalto garo atominės absorbcinės spektrometrijos metodams. Šaltas garas naudojamas tik gyvsidabriui tirti. Dėl elementinio gyvsidabrio nuostolių dėl lakumo ir adsorbcijos viso analizės proceso metu reikalingas ypatingas atsargumas. Reikia stropiai vengti teršalų patekimo iš reagentų ar iš aplinkos. Tiksliam suminio gyvsidabrio kiekio organiniuose junginiuose nustatymui reikalingas oksidacinis skaidymas. Skaidymui reikia naudoti sandarias sudeginimo mikrobangomis sistemas arba aukšto slėgio įrenginį. Reikia itin atidžiai išvalyti įrangą, turėjusią sąlytį su gyvsidabriu. Parankiausia naudotis srauto įpurškimo metodu. Jei sprendimo ribos žemesnės, rekomenduojama naudoti elementinio gyvsidabrio adsorbciją ant auksinio (platininio) adsorberio. Po to atliekama terminė desorbcija. Reikia saugoti, kad ant adsorberio ar ant celės nepakliūtų drėgmė, kadangi tai pakenktų matavimui. 2.4.7. Ypatingieji reikalavimai indukciškai sujungtos plazmos atominei emisinei spektrometrijai (ISP-AES). Indukciškai sujungtos plazmos atominė emisinė spektrometrija [5.10] galima iškart matuoti keletą elementų. Kad būtų galima taikyti ISP-AES, iš pradžių mėginiai turi būti sudeginami siekiant suskaidyti organines matricas. Naudojamasi sandariomis sudeginimo mikrobangomis arba aukštame slėgyje sistemomis. Tam, kad ISP-AES analizė būtų atlikta tinkamai, labai svarbu sukalibruoti prietaisą ir tinkamai pasirinkti elementą ir bangos ilgį. Kalibruojant prietaisą pagal tiesines kalibracines kreives paprastai būtina išmatuoti tik keturių koncentracijų kalibracinius tirpalus, kadangi ISP-AES kalibracinės kreivės yra tiesinės per keturias – šešias koncentracijos vertės eiles. ISP- AES sistema paprastai kalibruojama tokiu daugiaelemenčio etalono tirpalu, kurio rūgšties koncentracija yra tokia pati kaip matuojamo tirpalo. Elementų koncentracija kontroliuojama nustatant tiesines kreives. Elementų koncentracijoms nustatyti reikia pasirinkti analitės emisijos matavimo bangos ilgį. Jei analitės koncentracija nebepatenka į emisijos linijos darbinę sritį, reikia naudoti kitą emisijos liniją. Iš pradžių pasirenkama jautriausia emisijos linija (be interferencijos), po to – mažiau jautri. Dirbant ties arba netoli aptikimo ribos geriausia pasirinkti atitinkamos analitės jautriausią liniją. Taikant ISP-AES, daugiausia sunkumų sukelia spektriniai ir foniniai trukdžiai. Gali pasireikšti ir tokie trukdžiai, kaip, pvz., paprastasis foninis poslinkis, nuolaidusis foninis poslinkis, tiesioginis spektro persidengimas ir sudėtinis foninis poslinkis. Kiekviena iš šių trukdžių rūšių turi savas priežastis ir kovos su ja būdus. Atsižvelgiant į matricas, taikomos pataisos dėl trukdžių ir darbo parametrų optimizacija. Tam tikrų rūšių trukdžių galima išvengti skiedžiant arba priderinant matricas. Analizuojant kiekvieną vienos rūšies mėginių seriją, su pamatine bei papildyta medžiaga, kuriose yra tam tikras žinomas analitės (analičių) kiekis, tuščiąja medžiaga dirbama taip pat kaip ir su mėginiais. Tiriant rodmenų kitimą, etalonas tikrinamas, pvz., po 10 mėginių. Visi reagentai ir plazmos dujos turi būti kaip įmanoma grynesni. 2.4.8. Ypatingieji indukciškai sujungtos plazmos masių spektrometrijos (ISP-MS) reikalavimai [5.11] Nustatant vidutinės atominės masės mikroelementus, pvz., chromą, varį ir nikelį, gali pasireikšti stipri interferencija iš kitų izobarinių ir daugiaatomių jonų. To galima išvengti tik naudojant ne mažesnę kaip 7 000-8 000 skiriamąją gebą. Taikant MS metodiką, susiduriama su tokiais sunkumais: prietaisų rodmenų kitimas, matricos efektai ir molekulinė jonų interferencija (m/z < 80). Prietaisų rodmenų kitimui ir matricos efektams koreguoti būtina atlikti daugkartinį vidinį standartizavimą, kuris tiktų elementų masei. Prieš atliekant ISP-MS matavimus, būtina visiškai išskaidyti organinę medžiagą mėginiuose. Kaip ir AAS, po sudeginimo uždaruose induose lakiems elementams, pvz., jodui, turi būti sugrąžinamas stabilus oksidacijos būvis. Stipriausia trukdžiai pasireiškia dėl molekulinių jonų derinių iš argono (plazmos dujų), vandenilio, anglies, azoto bei deguonies atomų (tirpinamosios rūgštys, plazmos dujų nešvarumai ir įtrauktos atmosferos dujos) ir mėginio matricos. Trukdžiams išvengti būtina atlikti visišką sudeginimą, foninius matavimus, tinkamai pasirinkti analizės masę ir tirpinamąsias rūgštis, pvz., azoto rūgštį. Nustatant elementus, trukdžiai šalinami tinkamai pasirenkant analitines mases, įskaitant izotopų santykių patvirtinimą. Kiekvienąsyk matuojant pagal vidinius etalonus tikrinamas prietaiso atsakas ir įvertinama Fano koeficientais. III. Analizės metodų įteisinimas 3. Įteisinimu parodoma, kad analizės metodas atitinka tinkamumo požymiams taikomus kriterijus. Įvairiais kontrolės tikslais taikomi skirtingų kategorijų metodai. 9 lentelėje nurodyta, kokius kiekvienos rūšies metodų tinkamumo požymius reikia patikrinti. 9 lentelė. Analizės metodų klasifikacija pagal nustatomus tinkamumo požymius Aptikimo riba CCβ Sprendimo riba CCα Teisingumas/Išgava Glaudumas Atrankumas, specifiškumas Pritaikomumas, atsparumas, stabilumas Kokybiniai metodai A + - - - + + P + + - - + + Kiekybiniai metodai A + - - + + P + + + + + + A – atrankos metodai; P – patvirtinamieji metodai; + – tinkamumą nustatyti privalu. 3.1. Įteisinimo procedūros Šiame skyriuje pateikti analizės metodų įteisinimo procedūrų pavyzdžiai ir (arba) nuorodos. Patvirtinti, kad analizės metodas atitinka tinkamumo požymiams taikomus kriterijus, galima ir kitais būdais, jei jais gaunama tokio paties lygio ir kokybės informacija. Įteisinti galima ir atlikus tarplaboratorinę studiją taip, kaip nurodyta Maisto kodekse (Codex Alimentarius), ISO arba IUPAC [5.12] arba alternatyviais metodais, pvz., tyrimais vienoje laboratorijoje arba pačių pripažinimu [5.13, 5.14]. Šioje dalyje daugiausia kalbama apie tyrimus vienoje laboratorijoje (pačių pripažinimą), taikant modulinį metodą. Šį metodą sudaro:
12. a)visiems įteisinimo modeliams universalus bendrųjų tinkamumo požymių komplektas;
13. b)10 lentelėje nurodytos tam tikriems modeliams skirtos labiau savitos procedūros. 3.1.1. Universalūs tinkamumo požymiai Neatsižvelgiant į pasirinktą įteisinimo būdą turi būti nustatyti toliau nurodomi tinkamumo požymiai. Darbo krūviui sumažinti galima taikyti stropiai suplanuotą ir statistiškai patikimą atliekamų eksperimentų derinimo metodą skirtingiems parametrams nustatyti. 10 lentelė. Universalūs ir tam tikriems modeliams skirti tinkamumo parametrai Įteisinimas Universalūs tinkamumo parametrai Tam tikriems modeliams skirti tinkamumo parametrai Bendrieji tinkamumo požymiai (žr. 3.1.1 punktą) Įprastinis pripažinimo būdas (žr. 3.1.2 punktą) Pačių pripažinimo būdas (žr. 3.1.3 punktą) Specifiškumas Teisingumas Atsparumas: nežymūs pokyčiai Stabilumas Išgava Pakartojamumas Atkuriamumas vienoje laboratorijoje Atkuriamumas Sprendimo riba (CCα) Aptikimo geba (CCβ) Kalibracinės kreivės Atsparumas: žymūs pokyčiai Išgava Pakartojamumas Atkuriamumas vienoje laboratorijoje Atkuriamumas Sprendimo riba (CCα) Aptikimo geba (CCβ) Kalibracinė kreivė Atsparumas 3.1.1.1. Specifiškumas Taikant analizės metodus, svarbi analitės ir į ją panašių medžiagų (izomerų, skilimo produktų, endogeninių medžiagų, matricos sudedamųjų dalių ir pan.) atskyrimo galia (įrangos skiriamoji geba). Trukdžių buvimui patikrinti reikia dviejų metodų. Siekiant nustatyti, ar nėra galimų trukdžių, bei įvertinti trukdžių poveikį pasirenkamos potencialiai trukdančios medžiagos ir išanalizuojami atitinkami tuštieji mėginiai: pasirenkama chemiškai giminingų junginių serija (metabolitai, dariniai ir kt.) ar kitos medžiagos, kurios galėjo turėti sąlytį su dominančiu junginiu ir kurių gali būti mėginiuose; išanalizuojamas reikiamas tipiškų tuščiųjų mėginių skaičius (n => 20) ir patikrinama, ar dominančioje srityje, kurioje turėtų būti išplauta tikslinė analitė, nėra trukdžių (signalų, smailių, jonų pėdsakų); tipiški tuštieji mėginiai papildomi iki reikiamos koncentracijos medžiagomis, kurios galėtų trukdyti identifikuoti ir (arba) nustatyti analitės kiekį; atlikus analizę, patikrinama, ar: esami trukdžiai negali būti klaidingo identifikavimo priežastimi; identifikuoti tikslinę analitę trukdo vienas ar daugiau trukdžių; žymiai pakinta kiekybinio nustatymo rezultatai. 3.1.1.2. Teisingumas Teisingumą galima nustatyti tik pasinaudojus paliudyta pamatine medžiaga (PPM). PPM naudojama visuomet, jei tik jos turima. Procedūra išsamiai aprašyta ISO 5725-4 [5.5]. Toliau pateikiamas pavyzdys: laikantis taikomo metodo tyrimo nurodymų, padaromos šešios kartotinės PPM analizės; nustatomas kiekviename kartotiniame mėginyje esančios analitės kiekis; apskaičiuojamas koncentracijų vidurkis, standartinis nuokrypis ir nuokrypio koeficientas procentais; teisingumas apskaičiuojamas padalinant gautą koncentracijos vidurkį iš patvirtintos vertės (koncentracija) ir padauginant iš 100, siekiant rezultatą išreikšti procentais. Teisingumas (%) = (koncentracijos vidurkis, patikslintas pagal išgavą x 100)/patvirtinta vertė. Jei PPM nėra, vietoj teisingumo galima nustatyti išgavą taip, kaip aprašyta 4.1.2.1. punkte. 3.1.1.3. Pritaikomumas, atsparumas (nežymūs pokyčiai) Tokiuose tyrimuose laboratorija specialiai padaro keletą pagrįstų nedidelių pakeitimų ir stebi jų pasekmes. Pirminiai tyrimai turi būti atliekami pasirenkant tokius mėginių išankstinio paruošimo, gryninimo ir analizės veiksnius, kurie gali turėti įtakos matavimo rezultatams. Tie veiksniai gali būti tyrėjas, reagentų kilmė bei amžius, tirpikliai, etalonai bei mėginio ekstraktai, kaitinimo intensyvumas, temperatūra, pH vertė ir daugelis kitų veiksnių, galinčių pasireikšti laboratorijoje. Tuos veiksnius reikia pakoreguoti tiek, kad jie atitiktų skirtumus, paprastai galinčius būti tarp laboratorijų: identifikuojami galimi veiksniai, kurie gali turėti įtakos rezultatams; kiekvienas veiksnys šiek tiek pakeičiamas; Youdeno metodu atliekamas atsparumo bandymas [5.15, 5.16]. (Galima naudoti ir kitus patvirtintus metodus, tačiau Youdeno metodas yra trumpiausias ir reikalaujantis mažiausiai pastangų.) Youdeno metodas grindžiamas daliniais veiksniais. Sąveikos tarp skirtingų veiksnių nustatyti negalima; kai nustatoma, kad veiksnys žymiai pakeičia matavimo rezultatus, atliekami papildomi eksperimentai, siekiant nustatyti veiksnio priimtinumo ribas; veiksniai, kurie žymiai pakeičia matavimo rezultatus, turi būti aiškiai nurodyti metodo protokole. Pagrindinė mintis – pakeitimų netyrinėti atskirai po vieną, o padaryti iškart keletą pakeitimų. Pavyzdžiui, imami septyni skirtingi veiksniai, kurie gali turėti įtakos rezultatams, jei bus šiek tiek pakeistos jų nominalios vertės. Tos vertės pažymimos raidėmis A, B, C, D, E, F ir G. Alternatyvios vertės pažymimos atitinkamomis mažosiomis raidėmis a, b, c, d, e, f ir g. Taip susidaro 2-7 arba 128 galimi skirtingi deriniai. Galima pasirinkti poaibį, kurį sudaro aštuoni iš šių derinių, turinčių po lygiai didžiųjų ir mažųjų raidžių (11 lentelė). Reikia atlikti aštuonis nustatymus, kuriuose bus panaudoti pasirinktų veiksnių deriniai (nuo A iki G). Nustatymų rezultatai pažymėti 11 lentelėje raidėmis nuo S iki Z. 3.1.1.4. Pastovumas Yra pastebėta, kad dėl mėginio analitės ar matricos sudėtinių dalių nepakankamo pastovumo mėginio laikymo ar analizės metu gali žymiai kisti analizės rezultatai. Be to, reikia kontroliuoti kalibracinio etalono pastovumą. Paprastai analitės pastovumas gerai apibūdinamas pagal įvairias laikymo sąlygas. Laikymo sąlygų stebėsena sudaro dalį įprastinės laboratorijos akreditavimo sistemos. Toliau pateikiami pavyzdžiai, kaip galima nustatyti pastovumą. 11 lentelė. Eksperimentinė atsparumo tyrimo (nežymūs pokyčiai) sistema Veiksnio vertė F Nustatymo derinio numeris 1 2 3 4 5 6 7 8 A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E e E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Gautas rezultatas R S T U V W X Y Z Skaičiavimai pateikti atsparumo tyrimų pavyzdžiuose 3.3 punkte. Analitės pastovumo tirpale nustatymas: paruošiami nauji analitės (ar analičių) tirpalai ir atskiedžiami taip, kaip apibūdinta tyrimo nurodymuose reikiamam kiekvienos pasirinktos koncentracijos (jei medžiagai nenustatytas ribinis leistinas kiekis – maždaug ties mažiausiojo privalomo aptikti kiekio riba, kitų medžiagų – ties ribiniu leistinu kiekiu) alikvočių kiekiui gauti (pvz., 40). Paruošiami papildymui skirto analitės bei galutinės analizės tirpalai ir visi kiti reikalingi tirpalai (pvz., derivatiniai etalonai); pagal tyrimo nurodymus išmatuojamas analitės kiekis šviežiai paruoštame tirpale; reikiamas tūris supilstomas į tinkamas talpyklas, jos paženklinamos ir laikomos pagal programą (12 lentelė); 12 lentelė. Analitės pastovumo tirpale nustatymo programa - 20°C + 4°C + 20°C Tamsa Šviesa 10 mėginių 10 mėginių 10 mėginių 10 mėginių laikymo trukmė gali būti viena, dvi, trys ar keturios savaitės, o jei reikia – dar ilgesnė, pvz., kol identifikuojant ir (arba) nustatant kiekį bus pastebėti pirmieji irimo požymiai. Ilgiausiąją laikymo trukmę ir optimalias saugojimo sąlygas reikia užregistruoti; analitės koncentracija kiekviename mėginyje skaičiuojama panaudojant analizės metu šviežiai paruoštą analitės tirpalą ir prilyginant jį 100 %. Likusi analitė (%) = Ci x 100/Cšviež. Ci – koncentracija matavimo metu; Cšviež.. – šviežio tirpalo koncentracija. Analitės (-ių) pastovumo tirpale nustatymas: jei tik įmanoma, reikia naudoti neapdorotus mėginius. Jei neapdorotos medžiagos nėra, reikia naudoti matricą, papildytą analite; kai yra neapdorotos medžiagos, koncentracija joje nustatoma kol medžiaga dar šviežia. Kitos medžiagos alikvotės gali būti imamos po vienos, dviejų, keturių arba 20 savaičių, po to taip pat nustatoma koncentracija. Audiniai laikomi -20°C, o jei reikia – dar žemesnėje temperatūroje; jei neapdorotos medžiagos nėra, imama tuščioji medžiaga ir homogenizuojama. Medžiaga padalijama į penkias alikvotes. Kiekvienas mėginys papildomas tokia analite, kurią geriausia paruošti mažame kiekyje vandens tirpalo. Viena alikvotė tuoj pat išanalizuojamas. Likusios laikomos -20°C, o jei reikia – dar žemesnėje temperatūroje ir analizuojami po vienos, dviejų, keturių arba 20 savaičių. 3.1.1.5. Kalibracinės kreivės Kai kiekiui nustatyti naudojamos kalibracinės kreivės: kreivei sudaryti naudojami ne mažiau kaip penki lygiai (įskaitant nulį); turi būti nurodyta kreivės darbinė sritis; turi būti nurodyta kreivės matematinė formulė ir duomenų atitikties su kreive laipsnis; turi būti nurodyta kreivės parametrų priimtinumo sritis. Kai būtina atlikti serijinį kalibravimą pagal etaloninį tirpalą, nurodoma kalibracinės kreivės, parametrų priimtinumo ribos, kurios gali skirtis skirtingose serijose. 3.1.2. Įprastinės įteisinimo procedūros Skaičiuojant parametrus įprastiniais metodais, reikia atlikti keletą atskirų eksperimentų. Reikia nustatyti kiekvieno žymaus pokyčio kiekvieną tinkamumo požymį (žr. 1.3.3.1 punktą). Daugiaanalitiniais metodais vienu metu galima analizuoti keletą analičių, jei prieš tai panaikinta potencialių trukdžių galimybė. Panašiu būdu galima nustatyti keletą tinkamumo savybių. Siekiant sumažinti darbo krūvį, patartina kuo labiau sujungti eksperimentus (pvz., pakartojamumo ir atkuriamumo vienoje laboratorijoje su specifiškumo, tuščiųjų mėginių analizės sprendimo ribai nustatyti ir specifiškumo tyrimo). 3.1.2.1. Išgavos nustatymas Jei nėra PPM, išgava turi būti nustatyta eksperimentais, naudojant papildytą tuščiąją matricą: pasirenkami 18 tuščiosios medžiagos alikvočių, o šešios alikvotės papildomos iki koncentracijos, 1, 1,5 ir 2 kartus didesnės už mažiausią privalomą aptikti koncentraciją arba 0,5, 1 ir 1,5 karto didesnės už ribinį leistiną kiekį; mėginiai išanalizuojami ir apskaičiuojama kiekviename mėginyje esanti koncentracija; pagal toliau pateiktą lygtį kiekvienam mėginiui apskaičiuojama išgava; atitinkamai pagal kiekvieno lygio šešis rezultatus apskaičiuojamas išgavos vidurkis ir CV; išgava, % = 100 x išmatuotas kiekis/papildytas lygis. Šis įprastinis išgavos nustatymo metodas yra 3.5 punkte aprašyto etaloninės priemaišos metodo variantas, kai: mėginys laikomas ne analizuojamuoju, o tuščiuoju mėginiu; abiejų tiriamųjų dalių išeiga[2] ir išgava[3] laikomos esančiomis panašaus dydžio; mėginių masė yra vienoda, todėl ir tiriamųjų dalių ekstraktai yra vienodo tūrio; į antrą tiriamąją dalį (papildytą) pridėto kalibracinio etalono kiekis pažymimas xADD. (xADD = ρAVA); x1 yra išmatuota tuščiojo mėginio vertė, o x2 – antros tiriamosios dalies (papildytos) vertė; tuomet: išgava, % = 100 (x1 – x2)/xADD. Jei kurios nors iš pirmiau nurodytų sąlygų yra neįmanoma patenkinti, tuomet reikia atlikti visą 3.5 punkte aprašytą išgavos nustatymo, taikant etaloninės priemaišos metodą, procedūrą. 3.1.2.2. Pakartojamumo nustatymas: paruošiamas komplektas vienodų matricų mėginių, papildytų analite iki koncentracijos, 1, 1,5 ir 2 kartus didesnės už mažiausią privalomą aptikti koncentraciją arba 0,5, 1 ir 1,5 karto didesnės už ribinį leistiną kiekį; visų koncentracijų papildyti mėginiai analizuojami ne mažiau kaip šešis kartus (šešios kartotinės analizės); išanalizuojami mėginiai; apskaičiuojama kiekviename mėginyje esanti koncentracija; apskaičiuojamas papildytų mėginių koncentracijos vidurkis, standartinis nuokrypis ir nuokrypio koeficientas (%); ši procedūra pakartojama mažiausiai du kartus; apskaičiuojamas papildytų mėginių bendrasis koncentracijų vidurkis ir CV. 3.1.2.3. Atkuriamumo vienoje laboratorijoje nustatymas: paruošiamas komplektas nurodytos tiriamosios medžiagos (vienodų arba skirtingų) matricų mėginių, papildytų analite iki koncentracijos, 1, 1,5 ir 2 kartus didesnės už mažiausią privalomą aptikti koncentraciją arba 0,5, 1 ir 1,5 karto didesnę už ribinį leistiną kiekį; visų koncentracijų papildyti mėginiai analizuojami ne mažiau kaip šešis kartus (šešios kartotinės analizės); ši procedūra pakartojama mažiausiai du kartus, jei įmanoma, dirbant skirtingiems tyrėjams ir skirtingomis aplinkos sąlygomis, pvz., skirtingos reagentų, tirpiklių partijos ir pan., skirtingoje patalpos temperatūroje, su skirtingais prietaisais ir pan.; išanalizuojami mėginiai; apskaičiuojama kiekviename mėginyje esanti koncentracija; nustatomas papildytų mėginių koncentracijų vidurkis, standartinis nuokrypis ir nuokrypio koeficientas (%). 3.1.2.4. Atkuriamumo nustatymas Kai tikrinamas atkuriamumas, laboratorijos turi dalyvauti jungtiniame tyrime pagal ISO 5725-2 [5.5]. 3.1.2.5. Sprendimo ribos (CCα) nustatymas Sprendimo riba turi būti nustatoma pagal identifikacijos arba identifikacijos bei kiekio nustatymo reikalavimus taip, kaip nurodyta 2 punkte „Analizės metodų tinkamumo kriterijai ir kiti reikalavimai“. Jei medžiagos ribinis leistinas kiekis nenustatytas, CCα galima nustatyti: taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.17] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ir virš mažiausiojo privalomo aptikti kiekio koncentracijos. Mėginiai išanalizuojami. Po identifikavimo nubraižoma signalo funkcijos priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Sprendimo riba yra koncentracija ties sankirta su y ašimi plius 2,33 karto padaugintas atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis ties sankirta. Tai galioja tik kiekybinei analizei (α = 1 %); analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, siekiant apskaičiuoti signalo ir fono santykį tuo laiko tarpu, kuriuo tikimasi analitės pasirodymo. Sprendimo riba gali būti triguba signalo ir fono santykio vertė. Tai galioja kiekybinei ir kokybinei analizei. Jei medžiagoms ribinis leistinas kiekis nustatytas, CCα galima nustatyti: taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.1] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ribinio leistino kiekio. Mėginiai išanalizuojami. Po identifikavimo nubraižoma signalo funkcijos priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Sprendimo riba yra koncentracija ties ribiniu leistinu kiekiu plius 1,64 karto padidintas atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis (α = 5 %); analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, papildytoje analite (ar analitėmis) iki ribinio leistino kiekio. Sprendimo riba yra koncentracija ties ribiniu leistinu kiekiu plius 1,64 karto padidintas atitinkamas standartinis nuokrypis (α = 5 %). Taip pat žr. Bendrųjų nuostatų 4 punktą ir šio priedo 3.2 punktą. 3.1.2.6. Aptikimo gebos (CCβ) nustatymas Aptikimo geba turi būti nustatyta pagal apibrėžtus atrankos, identifikacijos arba identifikacijos bei kiekio nustatymo reikalavimus (žr. 2 punktą). Jei medžiagoms ribinis leistinas kiekis nenustatytas, CCβ galima nustatyti: taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.17] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ir žemiau mažiausiojo privalomo aptikti kiekio. Mėginiai išanalizuojami. Identifikavus nubraižoma signalo funkcijos priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Aptikimo geba yra koncentracija ties sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas išmatuoto kiekio vidurkio atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis ties sprendimo riba (β = 5 %); analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, papildytoje analite (ar analitėmis) iki sprendimo ribos koncentracijos. Aptikimo geba yra sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas išmatuoto kiekio vidurkio atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis ties sprendimo riba (β = 5 %); kai kiekybinių rezultatų nėra, aptikimo ribą galima nustatyti tiriant tuščiąją medžiagą, papildytą iki ir virš sprendimo ribos koncentracijos. Tokiu atveju metodo aptikimo geba yra koncentracijos lygis, kuriame lieka tik nedaugiau kaip 5 % neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato. Siekiant patikimo nustatymo, reikia atlikti ne mažiau kaip 20 tyrimų ties bent vienu koncentracijos lygiu; taikant kalibracinės kreivės procedūrą pagal ISO 11843 [5.17] (čia vadinama galutinio būvio ribine verte). Naudojama tuščioji medžiaga, kuri tolygiais žingsniais papildoma iki ribinio leistino kiekio. Mėginiai išanalizuojami ir identifikuojama analitė (ar analitės). Apskaičiuojamas išmatuoto kiekio vidurkio standartinis nuokrypis ties sprendimo riba. Aptikimo geba yra koncentracija ties sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas atkuriamumo vienoje laboratorijoje standartinis nuokrypis (β = 5 %); analizuojant ne mažiau kaip po 20 tuščių medžiagų vienoje matricoje, papildytoje analite (ar analitėmis) iki sprendimo ribos koncentracijos. Aptikimo riba yra sprendimo riba plius 1,64 karto padidintas atitinkamas standartinis nuokrypis (β = 5 %). Taip pat žr. 3.2 punktą. 3.1.2.7. Atsparumas (žymūs pokyčiai) Analizės metodas turi būti patikrintas įvairiomis eksperimentinėmis sąlygomis, pvz., su skirtingomis biologinėmis rūšimis, skirtingomis matricomis ar skirtingomis mėginių ėmimo sąlygomis. Pokyčiai turi būti žymūs. Šių pokyčių svarbą galima įvertinti, pvz., pritaikius Youdeno metodą [5.15, 5.16]. Reikia nustatyti visų žymių pokyčių, kurie smarkiai keičia analizės charakteristikas, tinkamumo požymius. 3.1.3. Įteisinimas alternatyviais būdais Kai vykdomos alternatyvios vertinimo procedūros, jų būdas, strategija, išankstinės sąlygos, prielaidos ir formulės surašomos vertinimo protokole arba bent pateikiamos nuorodos, kur visa tai yra pateikta. Toliau pateikiamas alternatyvaus metodo pavyzdys. Taikant, pvz., pačių vertinimo metodą, tinkamumo požymiai nustatomi tokiu būdu, kad taikant tą pačią vertinimo procedūrą galima būtų įvertinti žymius pokyčius. Tam reikia sudaryti eksperimentinį vertinimo planą. 3.1.3.1. Eksperimentinis planas Eksperimentinis planas turi būti sudarytas atsižvelgiant į skirtingų biologinių rūšių skaičių ir įvairius tiriamus veiksnius. Pirmuoju visos vertinimo procedūros žingsniu įvertinama tų mėginių, kurie ateityje bus analizuojami laboratorijoje, įvairovė, kad būtų pasirinktos svarbiausios biologinės rūšys ir veiksniai, kurie gali turėti įtakos matavimų rezultatams. Todėl pagal tikslą, atsižvelgus į dominantį lygį, pasirenkama koncentracijos sritis. Pavyzdys: vertinant analizės metodą galima kartu tyrinėti keletą analičių; identifikuojamos dvi pagrindinių veiksnių variacijos (A ir B). Pagrindiniai veiksniai sudaro veiksnių lygių derinimo pamatą. Tokie pagrindiniai veiksniai gali būti biologinės rūšys ar matrica (13 lentelė). Šiame pavyzdyje pagrindinis veiksnys buvo varijuotas dviem lygiais, t. y. buvo nagrinėtos dvi skirtingos biologinės rūšys (A ir B rūšys). Paprastai įmanoma varijuoti pagrindinius veiksnius daugiau kaip dviem lygiais, tačiau reikia atlikti daugiau analizių; pasirinkti veiksniai varijuojami dviem lygiais (pažymėtais + arba -) (14 lentelė). Kiekvieną mėginį (kiekvieno veiksnio lygio derinį) reikia papildyti iki keturių skirtingų koncentracijų ties dominančiu lygiu, o kiekvienam lygiui analizuojamas vienas tuščiasis mėginys; visame įteisinimo eksperimente atliekama 5 x 16 = 80 analizių. 13 lentelė. Vertinimo procedūrai svarbiais laikomų veiksnių pavyzdžiai Gyvūno lytis (1 veiksnys) Veislė (2 veiksnys) Vežimo sąlygos (3 veiksnys) Laikymo sąlygos (4 veiksnys) Mėginio šviežumas (5 veiksnys) Šėrimo sąlygos (6 veiksnys) Skirtingi laborantai, turintys nevienodą patirtį (7 veiksnys) 14 lentelė. Galimas pateikto pavyzdžio eksperimentinis planas Rūšis 1 veiksnys 2 veiksnys 3 veiksnys 4 veiksnys 5 veiksnys 6 veiksnys 7 veiksnys Mėginio Nr. A + + + + - + - 1 A + + - - + - - 2 A + - + - - - + 3 Iš šių 80 matavimų [5.13, 5.14] galima apskaičiuoti: pakartojamumą ties koncentracijos lygiu (sir); atkuriamumą vienoje laboratorijoje ties koncentracijos lygiu (sir); sprendimo ribą (CCα); aptikimo gebą (CCβ); pajėgumo kreivę (b paklaidos rodiklio priklausomybę nuo koncentracijos (žr. 3.1.3.2 punktą); atsparumą žymiems pokyčiams; atsparumą nežymiems pokyčiams galima nustatyti, kaip nurodyta 3.1.1.3 punkte; 16 su mėginiais susijusių kalibracinių kreivių; vieną bendrąją kalibracinę kreivę; bendrosios kalibracinės kreivės prognozės intervalą; matricos sukeltus nuokrypius(smat); procedūros sukeltus nuokrypius (sprot); atskirų veiksnių poveikį matavimo rezultatams. Pagal šiuos tinkamumo požymius galima išsamiai įvertinti metodo tinkamumo lygį, kadangi ištiriama ne tik atskirų veiksnių įtaka, bet ir galimi jų deriniai. Pagal šią eksperimento sistemą galima nuspręsti, ar išbraukti vieną ar kitą pasirinktą veiksnį iš bendrosios kalibracinės kreivės, jei jie žymiai skiriasi nuo kitų veiksnių nuokrypių. 3.1.3.2. Pajėgumo kreivė Pajėgumo kreivė suteikia informacijos apie metodo aptikimo gebą pasirinktoje koncentracijos srityje. Ji paremta β paklaidos rizika taikant ištirtąjį metodą. Pagal pajėgumo kreivę galima apskaičiuoti metodų kategorijų (atrankos, patvirtinimo) ar tipų (kokybinio ar kiekybinio) aptikimo gebą su tam tikra b paklaida (pvz., 5 %). 1 paveiksle pavaizduotas analizės metodo aptikimo gebos (CCb) grafikas. Taikant šį metodą, kai koncentracija yra 0,50 µg/kg, išlieka 5 % rizika, kad bus priimtas neteisingas sprendimas. Kai koncentracija yra 0,55 µg/kg, rizika, kad bus priimtas neteisingas sprendimas dėl neigiamo rezultato, sumažėja iki 1 %. 3.1.3.3. Atkuriamumas Metodo atkuriamumo nustatymo vienos laboratorijos tyrimais (pačių pripažinimo) koncepcija reikalauja, kad būtų dalyvaujama daugkartiniuose kvalifikacijos tyrimuose pagal ISO vadovą 43-1 [5.3] ir 43-2 [5.4]. Laboratorijoms leidžiama pasirinkti savus metodus, jei jie taikomi įprastomis sąlygomis. Metodo atkuriamumui įvertinti galima naudoti standartinį laboratorijos nuokrypį. 3.2. Grafinis skirtingų analizės ribų vaizdavimas 2 pav. Medžiagoms, kurių ribinis leistinas kiekis nenustatytas: S – Užteršto mėginio reakcijos vidutinė vertė, SB – tuščiojo mėginio standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), SS – užteršto mėginio standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), α – procentinė neteisingų sprendimų dėl teigiamo rezultato dalis, b – procentinė neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato dalis, CCα – atsakas su nustatyta a paklaida ir 50 % β paklaida, CCβ – atsakas su labai mažomis a ir b paklaidomis. 3 pav. Medžiagoms, kurių nustatytas ribinis leistinas kiekis: B – tuščiojo mėginio vidutinė „koncentracija“, PL – mėginio, kuriame yra ribinis leistinas analitės kiekis, vidutinė koncentracija, S – užteršto mėginio vidutinė koncentracija, SPL – mėginio, kuriame yra ribinis leistinas analitės kiekis, standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), SS – mėginio, kuriame yra analitė, standartinis nuokrypis (nustatytas atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis), α – procentinė neteisingų sprendimų dėl teigiamo rezultato dalis, β – procentinė neteisingų sprendimų dėl neigiamo rezultato dalis, CCα – atsakas su nustatyta a paklaida ir 50 % b paklaida, CCβ – atsakas su labai maža a paklaida ir nustatyta β paklaida. 3.3. Atsparumo nežymiems pokyčiams tyrimo taikant Youden metodą [5.16] skaičiavimo pavyzdys Vidurkių (A) palyginimas: AA = Σ (Ai)/4 Palyginkite didžiųjų raidžių vidurkius (nuo AA iki AG) su atitinkamų mažųjų raidžių vidurkiais (nuo Aa iki Ag). Jei veiksnys turi poveikį, skirtumas bus žymiai didesnis už kitų veiksnių skirtumus. Jei metodas patikimas, jam neturi turėti įtakos neišvengiamai esantys skirtumai tarp laboratorijų. Jei išskirtinių skirtumų nėra, atsitiktinės paklaidos matas realiausiai nurodomas septyniais skirtumais. AB = Σ (Bi)/4 AC = Σ (Ci)/4 AD = Σ (Di)/4 AE = Σ (Ei)/4 AF = Σ (Fi)/4 AG = Σ (Gi)/4 Aa = Σ (ai)/4 Ab = Σ (bi)/4 Ac = Σ (ci)/4 Ad = Σ (di)/4 Ae = Σ (ei)/4 Af = Σ (fi)/4 Ag = Σ (gi)/4 Skirtumai (Di) Skirtumų kvadratai Da = A – a = Σ (Ai) – Σ (
14. ai)(Di-2) Db = B – b = Σ (Bi) – Σ (
15. bi)Da2 = a vertė Dc = C – c = Σ (Ci) – Σ (
16. ci)Db2 = b vertė Dd = D – d = Σ (Di) – Σ (
17. di)Dc2 = c vertė De = E – e = Σ (Ei) – Σ (
18. ei)Dd2 = d vertė Df = F – f = Σ (Fi) – Σ (
19. fi)De2 = e vertė Dg = G – g = Σ (Gi) – Σ (
20. gi)Df2 = f vertė Dg2 = g vertė Skirtumų Di standartinis nuokrypis (SDi): Kai SDi yra žymiai didesnis už metodo, taikomo atkuriamumo vienoje laboratorijoje sąlygomis, standartinį nuokrypį, iš anksto daroma išvada, kad visi veiksniai kartu turi poveikį rezultatui, net jei kiekvienas veiksnys atskirai žymios įtakos ir neturi, taip pat kad metodas nėra pakankamai atsparus pasirinktiems pokyčiams. 3.4. Pačių įteisinimo procedūros skaičiavimo pavyzdžiai Pavyzdžiai ir pačių įteisinimo protokolui skirti skaičiavimai aprašyti 3.1.3 punkte „Įteisinimas alternatyviais būdais“ bei naudojant šaltinius [5.13, 5.14]. 3.5. Etaloninės priemaišos metodo pavyzdžiai Tiriamasis mėginys, kuriame yra T kiekis analitės, padalijamas į dvi tiriamąsias dalis: 1 ir 2, kurių masės atitinkamai yra m1 ir m2. Tiriamoji dalis 2 papildoma ρA koncentracijos analite, kurios tūris yra VA. Ekstrahavus ir išgryninus gaunami du tiriamųjų dalių ekstraktai, kurių tūris yra atitinkamai V1 ir V2. Analitės išgava yra rc. Abu ekstraktai išanalizuojami taikant b jautrumo matavimo metodą, o jų analitinis atsakas yra atitinkamai x1 ir x2. Daroma prielaida, kad analitės rc ir b yra vienodi tiek pradinio mėginio atveju, tiek ir papildyto mėginio atveju; tuomet kiekis T apskaičiuojamas taip: T = x1. V1. ρA. VA/(x2. V2. m1 – x1. V1. m2) Taikant šį metodą, galima nustatyti išgavą rc. Atlikus pirmiau aprašytą analizę, 1 tiriamosios dalies ekstrakto dalis (tūris V3) papildoma žinomu analitės kiekiu ρB. VB ir išanalizuojama. Analitinis atsakas yra x3, o išgava: rc = x2. V1. V2. ρB. VB/[x3. V1. V3(T. m2 + ρA. VA) – - x2. V2. T. m1(V3. VB)] Be to, galima apskaičiuoti jautrumą b: b = x1. V1/rc. T. m1 Visos taikymo sąlygos ir informacija aprašyta [5.18]. IV. Santrumpos 4. Šioje metodikoje vartojamos tokios raidinės santrumpos: AES atominė emisinė spektrometrija; AOAC tarptautinė oficialių chemikų analitikų asociacija; AAS atominė absorbcinė spektrometrija; B susijusi frakcija (imuninė analizė); CJ cheminė jonizacija; DCh dujų chromatografija; DDM detektavimas diodų matrica; DEP detektavimas elektronų pagava; DIAPV Diferencialinio impulso anodinė pašalinamoji voltamperometrija; DSGMS didelės skiriamosios gebos masių spektrometrija; EPSCh efektyvioji plonasluoksnė chromatografija; ESCh efektyvioji skysčių chromatografija; EJ elektroninė smūgio jonizacija; IR infraraudonoji spinduliuotė; ISO tarptautinė standartizacijos organizacija; ISP-AES indukciškai sujungtos plazmos atominė emisinė spektrometrija; ISP-MS indukciškai sujungtos plazmos masių spektrometrija; m/z masės ir krūvio santykis; MPAK mažiausiasis privalomas aptikti kiekis; MS masių spektrometrija; MSGMS mažos skiriamosios gebos masių spektrometrija; VIS regimoji spinduliuotė; PJS pasirinktų jonų stebėsena; CV nuokrypio koeficientas; PPM paliudytoji pamatinė medžiaga; PSCh plonasluoksnė chromatografija; SCh skysčių chromatografija; SELN santykinis etaloninis laboratorijos nuokrypis; SM santykinė migracija link tirpiklio (PSCh); UV ultravioletinė spinduliuotė. V. Literatūra 5. Literatūra naudojama pašarų tyrimo cheminės analizės metodų įteisinimo metodikai parengti: 5.1. ISO 17025: 1999 General requirement for the competence of calibration and testing laboratories. 5.2. ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control – Vol. 1 vocabulary and symbols. 5.3. ISO Guide 43-1: 1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons – Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes. 5.4. ISO Guide 43-2: 1997 Proficiency testing by interlaboratory comparisons – Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by laboratory accreditation bodies. 5.5. ISO 5725: 1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 1: General principles, and definitions; ISO 5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method. 5.6. ISO 78-2: 1999 Chemistry – Layouts for standards – Part 2: Methods of chemical analysis. 5.7. W. G de Ruig and J. M Weseman „A new approach to confirmation by infrared spectrometry“ J. Chemometrics 4