LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO

(22). Taikant šį būdą išvengiama gyvūnų žūties, kuri būtų poveikio įrodymas; jis pagrįstas aiškių toksiškumo požymių pasireiškimu, kai iš dozių serijos suleidžiama viena fiksuota dozė. Pasibaigus Jungtinės Karalystės

(23)ir tarptautinio

(24)tinkamumo patvirtinimo tyrimui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje tyrimų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės

(27). Kartu atliekami in vivo ir modeliavimo tyrimai įrodė metodikos atkuriamumą; ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. 3. Patarimus dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą bandymo vadove

(28). Be to, šiame vadove yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą. 4. Metodo esmę sudaro tai, kad atliekant pagrindinį tyrimą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ardančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro vadovo objektas

(29). 5. Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai sudarnintą sistemą (Globally Harmonised System, GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti

(30).

1. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksinės savybės ir numatomas(-i) medžiagos naudojimo būdas(-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.
2. Apibrėžimai: Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda gavus per virškinimo traktą vienetinę medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h. Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį. Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg). Aiškus toksiškumas – bendrasis terminas, aprašantis bandomosios medžiagos sukeltus aiškius toksiškumo požymius (pavyzdžiai pateikti

(24), rodančius, kad kita didžiausia fiksuota dozė sukels didelio skausmo, ilgalaikių didelių kančių, gaišimo būsenos požymius (kriterijai pateikti poveikio žmonėms vadove

(29)arba daugumos gyvūnų žūtį. GHS – visuotinai sudarninta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) (žmonių sveikata ir aplinka), JT (Jungtinių Tautų) pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikinės cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (International Labour Organization (ILO)) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)). Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. Daugiau detalių pateikta vadove dėl poveikio žmonėms

(29). LD50 (vidutinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuojama vienetinė medžiagos dozė per virškinimo traktą, kuri gali sukelti 50% tiriamųjų gyvūnų žūtį. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno kūno masės vienetui (mg/kg). Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg). Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms

(29). Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms

(29).

1. Bandymo metodo esmė: 8.
2. Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai suleidžiamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozės (išimtiniais atvejais galima spręsti apie papildomos fiksuotos 5000 mg/kg dozės suleidimą, žr. 17 skirsnį). Pradinė dozė pasirenkama atsižvelgiant į įvadinį tyrimą, kaip dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksiško poveikio arba žūties priežastimi. 8.
3. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame EBPO vadove

(29). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti suleidžiamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo požymius bei gyvūnų žūties atvejus. Ši procedūra tęsiama tol, kol identifikuojama dozė, sukelianti aiškų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kai nėra jokio poveikio esant didžiausiai dozei ar kai gyvūnai žūsta esant mažiausiai dozei. II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 9. Gyvūnų rūšies pasirinkimas: 9.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės

(28), kadangi tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės

(31). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai atliekami su patinais, pateikiamas kompetentingas pagrindimas. 9.

1. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš suleidžiant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20% tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.
2. Laikymo ir šėrimo sąlygos: 10.
3. Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. 10.
4. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną.
5. Gyvūnų ruošimas: 11.
6. Gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių suleidimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.
7. Dozių ruošimas: 12.
8. Visos bandomosios medžiagos dozės skiriamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui, galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias suleidžiamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima suleisti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturi būti didesnis kaip 1 ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. 12.2 Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksinės savybės. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat suleidimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu. III. DARBO EIGA
9. Dozių suleidimas: 13.
10. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma suleisti vienetinės dozės, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h. 13.
11. Prieš suleidžiant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės naktį negauna pašaro, išskyrus vandenį; pelės negauna pašaro 3-4 h, neribojant vandens gavimo). Pasibaigus minėtam laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir suleidžiama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3-4 h, pelės nešeriamos 1-2 h. Jei dozė suleidžiama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.
12. Įvadinis tyrimas: 14.
13. Įvadinio tyrimo tikslas – leisti pasirinkti atitinkamą pradinę pagrindinio tyrimo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai suleidžiama kiekvienam gyvūnui pagal 1 priedo diagramą. Įvadinis tyrimas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio tyrimo pradinės dozės (arba jei gyvūnai žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei). 14.
14. Įvadinio tyrimo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozių, kaip dozė, kuri galėtų sukelti aiškų toksiškumą, pagrįstą, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė būtų 300 mg/kg. 14.
15. Tarp dozių suleidimo kiekvienam gyvūnui turi būti mažiausiai 24 h laiko tarpas. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų. 14.
16. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę (žr. 3 priedą). Dėl priežasčių, susijusių su gyvūnų gerove, neskatinama atlikti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga. 14.
17. Tais atvejais, kai atliekant įvadinį tyrimą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), taikant įprastą procedūrą tyrimą reikia nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priede). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama ši neprivaloma papildoma procedūra. 5mg/kg dozė suleidžiama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir tyrimas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės suleidimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių suleidimas iš karto nutraukiamas ir nė vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedo klasifikavimo taisyklė esant 5mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.
18. Pagrindinis tyrimas: 15.
19. Gyvūnų skaičius ir dozės: 15.1.
20. Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priede pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, atliekant pagrindinį tyrimą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį atliekant įvadinį tyrimą (žr. 2 priedą). Patyrimas rodo, kad labiausiai tikėtinas pradinės dozės suleidimo rezultatas pasireikš tuo, kad medžiaga galės būti klasifikuota ir tolesnis bandymas nebus būtinas. 15.1.
21. Kiekvienai tiriamai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudarys vienas gyvūnas iš įvadinio tyrimo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio tyrimo dozė nebuvo įtraukta į įvadinį tyrimą). 15.1.
22. Laiko tarpą tarp dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės suleidimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvienos dozės, jei prireikia, uždelstam toksiškumui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti reguliuojamas, pvz., reakcijos be traukulių atveju. 15.1.
23. Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priede aprašytos metodikos (dar žr. 17 skirsnį). 15.
24. Ribinis bandymas: 15.2.
25. Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas. 15.2.
26. Taikant įprastą procedūrą, šiame vadove ribiniu bandymu būtų įvadinis tyrimas suleidžiant 2000 mg/kg dozę (arba išimtiniais atvejais 5000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokia pat dozė. IV. STEBĖJIMAI
27. Kiekvienas gavęs dozę gyvūnas mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti

(32). Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai aprašomi. 17. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus vadove dėl poveikio žmonėms

(29). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

1. Kūno masė. Kiekvieno gyvūno kūno masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos suleidimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas kūno masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai sveriami ir humaniškai numarinami.
2. Patologija: 19.
3. Visiems bandymo gyvūnams (įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) atliekamas bendrasis skrodimas. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. 19.
4. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos. V. DUOMENYS
5. Turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, kiekvieno gyvūno žūties laikas, toksiško poveikio aprašymas, to poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys. VI. ATASKAITOS RENGIMAS
6. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka: 21.
7. Bandomoji medžiaga: 21.1.
8. fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikinės cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą); 21.1.
9. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį. 21.
10. Nešiklis (jei tinka): jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo. 21.
11. Bandymo gyvūnai: 21.3.
12. naudota rūšis ir veislė; 21.3.
13. mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma; 21.3.
14. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą); 21.3.
15. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t. 21.
16. Bandymo sąlygos: 21.4.
17. išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant suleidžiamos medžiagos fizikinį pavidalą; 21.4.
18. išsami informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą, įskaitant dozavimo tūrį ir suleidimo laiką; 21.4.
19. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (tiekėją), vandens tiekėją); 21.4.
20. pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas. 21.
21. Rezultatai: 21.5.
22. duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal dozes lentelės (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę); 21.5.
23. kūno masės ir jos kitimo lentelės; 21.5.
24. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės suleidimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną; 21.5.
25. žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą; 21.5.
26. toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas; 21.5.
27. kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra. 21.
28. Rezultatų aptarimas ir aiškinimas. 21.
29. Išvados. VII. NUORODOS
30. British Toxicology Society Working Party on Toxicity

(1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. 23. Van den Heuvel, M. J., Dayan, A. D. and Shillaker, R. O.

(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-

2. Van den Heuvel, M. J., Clark, D. G., Fielder, R. J., Koundakjian, P. P., Oliver, G. J. A., Pelling, D., Tomlinson, N. J. and Walker, AP.

(1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. 25. Whitehead, A. and Curnow, R. N.

(1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313- 324. 26. Stallard, N. and Whitehead, A

(1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-

1. Human Exptl. Toxicol.
2. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P.

(2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196. 28. OECD

(2001). Guidance Document on Acute Orai Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 29. OECD

(2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. 30. OECD

(1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0, FF.html]. 31. Lipnick, R. L., Cotruvo, J. A, Hill, R. N., Bruce, R. D., Stitzel, K. A, Walker, AP, Chu, L, Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A and Myers, R. C.

(1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. 32. Chan P. K and A. W. Hayes

(1994)Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 1 priedas ĮVADINIO TYRIMO SCHEMA ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 2 priedas PAGRINDINIO TYRIMO SCHEMA ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 3 priedas I. BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEATLIEKANT BANDYMO

1. Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per virškinimo traktą arba odą yra 2000–5000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2000 mg/kg < LD50 < 5000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: 1.1 jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų žūties atvejais; 1.
2. jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; 1.
3. gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir: 1.3.
4. yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, 1.3.
5. arba bandymo metu per virškinimo traktą suleidžiant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, nustatomi žūties atvejai arba 1.3.
6. jei, tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių, ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba 1.3.
7. jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį atliekant kitus tyrimus su gyvūnais. II. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS NEGU 2000 MG/KG DOZĖMS
8. Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas skiriant 5000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga

(30).

1. Įvadinis tyrimas: 3.
2. Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 1 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama įvadinio tyrimo pradinė 5000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (žūtis) reikės atlikti bandymą su antru gyvūnu, skiriant 2000 mg/kg; gavus B ir C rezultatus (aiškus toksiškumas arba jokio toksiškumo) pradinė pagrindinio tyrimo dozė gali būti 5000 mg/kg. 3.
3. Panašiai, jei skiriama kita nei 5000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5000 mg/kg, jei esant 2000 mg/kg dozei gaunami B arba C rezultatai; gavus A rezultatą, esant 5000 mg/kg, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 2000 mg/kg, o gavus B ir C rezultatus, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 5000 mg/kg.
4. Pagrindinis tyrimas: 4.
5. Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 2 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama pagrindinio tyrimo pradinė 5000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (≥ 2 žūtys) reikės atlikti 2 grupės bandymą, skiriant 2000 mg/kg; gavus B rezultatą (aiškus toksiškumas ir (arba) ≤ 1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga nebus klasifikuojama pagal GHS. 4.
6. Panašiai, jei naudojama kita nei 5000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5000 mg/kg, jei esant 2000 mg/kg dozei gaunamas C rezultatas; gavus A rezultatą, esant 5000 mg/kg, medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS laikoma neklasifikuota. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 4 priedas KLASIFIKAVIMO PAGAL EUROPOS SĄJUNGOS SCHEMĄ REKOMENDACIJOS, TAIKOMOS PEREINAMAJAM LAIKOTARPIUI IKI VISIŠKO VISUOTINAI SUDARNINTOS SISTEMOS (GHS) ĮGYVENDINIMO (PAIMTA IŠ

(29)NUORODOS) ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 ŪMAUS TOKSIŠKUMO PERVIRŠKINIMO TRAKTĄ. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASIŲ (B.1 TRIS) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis bandymų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 423 metodą (2001 m.).
2. Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasių metodas

(24)– tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gyvūnų žūties atvejus ir (arba) jų gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2–4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasių metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais

(28), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima klasifikuoti ir įvertinti jos pavojų. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu

(29)ir tarptautiniu mastu

(30)atliekant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD50 duomenimis. 3. Patarimus dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą bandymo vadove

(31). Be to, šiame vadove yra papildomos informacijos apie B. l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą. 4. Nereikia leisti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ardančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro vadovo objektas

(32). 5. Metode naudojamos iš anksto nustatytos dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai sudarnintą sistemą (Globally Harmonised System, GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti

(33).

1. Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD50 vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD50 vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamų gyvūnų žūčių yra daugiau kaip 0% ir mažiau kaip 100%. Kai skiriamos iš anksto pasirinktos dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų.
2. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksinės savybės ir numatomas(-i) medžiagos naudojimo būdas(-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.
3. Apibrėžimai: Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda gavus per virškinimo traktą vienetinę medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h. Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį. Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg). GHS – visuotinai sudarninta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). EBPO (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikinės cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (International Labour Organization (ILO)) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)). Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms

(32). LD50 (vidutinė mirtina dozė) – tai statistiškai apskaičiuojama vienetinė medžiagos dozė per virškinimo traktą, kuri gali sukelti 50% tiriamųjų gyvūnų žūtį. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno kūno masės vienetui (mg/kg). Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg). Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms

(32). Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms

(32).

1. Bandymo metodo esmė: 9.
2. Šio bandymo esmę sudaro nuosekli metodika, pagal kurią vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galima ją klasifikuoti. Grupė bandymo gyvūnų per virškinimo traktą gauna vieną iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklią metodiką, kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai (paprastai patelės). Su junginiu siejamas dozę gavusių gyvūnų gaišimas arba negaišimas per vieną iš pakopų lemia kitą pakopą, t.y.: 9.1.
3. toliau bandyti nereikia; 9.1.
4. suleisti tokią pat dozę dar trims gyvūnams; 9.1.
5. trims papildomiems gyvūnams suleisti kitą didesnę arba mažesnę dozę. 9.
6. Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priede. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD50 intervalo ribinėmis vertėmis. II. METODO APRAŠYMAS
7. Gyvūnų rūšies pasirinkimas: 10.
8. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės

(32). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės

(34). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai atliekami su patinais, turėtų būti pateikti atitinkami tai patvirtinantys duomenys. 10.

1. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20% tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.
2. Laikymo ir šėrimo sąlygos: 11.
3. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. 11.
4. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną.
5. Gyvūnų ruošimas: gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių suleidimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.
6. Dozių ruošimas: 13.
7. Visos bandomosios medžiagos dozės suleidžiamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima suleisti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturėtų būti didesnis negu 1 ml/100 g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100 g kūno masės. 13.
8. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksinės savybės. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat suleidimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu. III. DARBO EIGA
9. Dozių suleidimas: 14.
10. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma suleisti vienetinės dozės, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h. 14.
11. Prieš suleidžiant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės naktį negauna pašaro, išskyrus vandenį; pelės negauna pašaro 3–4 h, neribojant vandens suvartojimo). Pasibaigus minėtam laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir suleidžiama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė suleidžiama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.
12. Gyvūnų skaičius ir dozės: 15.
13. Kiekvienai pakopai imami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dozių: 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta dozė, kuriai esant tikrai nugaištų kai kurie iš dozę gavusių gyvūnų. Schemose, pateiktose 1 priede, aprašyta procedūra, kurios reikėtų laikytis kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo. 15.
14. Kai turimoje informacijoje nurodoma, kad gyvūnai neturėtų gaišti esant didžiausiai pradinei dozei (2000 mg/kg kūno masės), reikėtų atlikti ribinį bandymą. Neturint informacijos apie bandomąją medžiagą, bet rūpinantis gyvūnų gerove, pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės. 15.
15. Laiko tarpus tarp poveikių lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės suleidimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. 15.
16. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę (žr. 2 priedą). Dėl su gyvūnų gerove susijusių priežasčių, neskatinama atlikti bandymą taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.
17. Ribinis bandymas: 16.
18. Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos visai nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas. 16.
19. Kai skiriama viena 2000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedą). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti atlikti bandymą esant gretimai mažesnei dozei. IV. STEBĖJIMAI
20. Kiekvienas gyvūnas, gavęs dozę mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimas visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti

(35). Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai aprašomi. 18. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to, kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus vadove dėl poveikio žmonėms

(32).

1. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.
2. Kūno masė: 20.
3. Kiekvieno gyvūno kūno masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos suleidimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas kūno masės pokytis. 20.
4. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.
5. Patologija: 21.
6. Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) atliekamas bendrasis skrodimas. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. 21.
7. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos. V. DUOMENYS
8. Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, kiekvieno gyvūno žūties laikas, toksiškumo poveikio aprašymas, tokio poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys. VI. ATASKAITOS RENGIMAS
9. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka: 23.
10. Bandomoji medžiaga: 23.1.
11. fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikinės cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą); 23.1.
12. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį. 23.
13. Nešiklis (jei tinka): jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo. 23.
14. Bandomieji gyvūnai: 23.3.
15. naudota rūšis ar veislė; 23.3.
16. mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma; 23.3.
17. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą); 23.3.
18. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t. 23.
19. Bandymo sąlygos: 23.4.
20. išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant suleidžiamos medžiagos fizikinį pavidalą; 23.4.
21. išsami informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą, įskaitant dozavimo turį ir suleidimo laiką; 23.4.
22. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą ar tiekėją, vandens tiekėją); 23.4.
23. pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas. 23.
24. Rezultatai: 23.5.
25. duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal dozes lentelės (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę); 23.5.
26. kūno masės ir jos kitimo lentelės; 23.5.
27. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės suleidimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną; 23.5.
28. žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą; 23.5.
29. toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas; 23.5.
30. kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra. 23.
31. Rezultatų aptarimas ir aiškinimas. 23.
32. Išvados. VII. NUORODOS
33. Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D.

(1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett, Suppl. 31,

2. Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D.

(1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-

2. Diener W, Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E.

(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 68, 559-610. 27. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E.

(1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 69, 729-734. 28. Diener W., and Schlede E.

(1999)Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-

2. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D.

(1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. 30. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D.

(1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 69, 659-670. 31. OECD

(2001)Guidance Document on Acute Orai Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 32. OECD

(2000)Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. 33. OECD

(1998)Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0, FF. html]. 34. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C

(1995)Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. 35. Chan P. K. and A. W. Hayes.

(1994). Chap.

1. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. Al Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1 priedas PROCEDŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIENĄ PRADINĘ DOZĘ
2. Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis: 1.
3. 1a priedas: pradinė dozė 5 mg/kg kūno masės; 1.
4. 1b priedas: pradinė dozė 50 mg/kg kūno masės; 1.
5. 1c priedas: pradinė dozė 300 mg/kg kūno masės; 1.
6. 1d priedas: pradinė dozė 2000 mg/kg kūno masės.
7. Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba žuvusių gyvūnų skaičių, bandymo eiga žymima rodyklėmis. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1a priedas PROCEDŪRA, ESANT 5 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1b priedas PROCEDŪRA, ESANT 50 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1c priedas PROCEDŪRA, ESANT 300 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1d priedas PROCEDŪRA, ESANT 2000 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B. l tris) metodo aprašo 2 priedas BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEATLIEKANT BANDYMO
8. Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per virškinimo traktą arba odą yra 2000–5000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2000 mg/kg < LD50 < 5000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: 1.
9. jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 1a-1d prieduose pateiktų bandymo schemų, pagrįstų žūčių dažnumu; 1.
10. jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; 1.
11. gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir: 1.3.
12. yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, 1.3.
13. arba bandymo metu per virškinimo traktą suleidžiant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, nustatomi žūties atvejai arba 1.3.
14. jei, tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių, ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba 1.3.
15. jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį atliekant kitus tyrimus su gyvūnais. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS KAIP 2000 MG/KG DOZĖMS
16. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas su gyvūnais skiriant 5 kategorijos intervalo dozes (5000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga

(18). Neturi būti atliekamas joks bandymas esant didesnėms dozėms. 3. Kai reikia bandyti naudojant 5000 mg/kg dozę, reikalinga tik viena pakopa (t.y. trys gyvūnai). Jei žūsta pirmas dozę gavęs gyvūnas, dozavimas tęsiamas skiriant 2000 mg/kg dozę pagal 1 priede pateiktas schemas. Jei pirmas gyvūnas lieka gyvas, dozę gauna kiti du gyvūnai. Jei žūsta tik vienas iš trijų gyvūnų, daroma prielaida, kad LD50 vertė yra didesnė negu 5000 mg/kg. Jei žūsta abu gyvūnai, dozavimas tęsiamas skiriant 2000 mg/kg dozę. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 3 priedas KLASIFIKAVIMO PAGAL ES SCHEMĄ REKOMENDACIJOS, TAIKOMOS PEREINAMAJAM LAIKOTARPIUI IKI VISIŠKO VISUOTINAI SUDARNINTOS SISTEMOS (GHS) ĮGYVENDINIMO (PAIMTA IŠ

(31)NUORODOS) – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – ∞: neklasifikuota – GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – ∞: neklasifikuota – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – GHS (Globally Harmonised System):visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) –* pirmoje pakopoje – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – WHMIS (Workplace Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – ∞: neklasifikuota – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) –* pirmoje pakopoje – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – ∞: neklasifikuota – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) –* pirmoje pakopoje ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 ŪMAUS TOKSIŠKUMO. ODOS DIRGINIMO AR ARDYMO (B. 4) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 404 metodą (2002 m.). 2. Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš atliekant aprašytą medžiagos ardymo ar dirginimo in vivo bandymą atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę. Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti atliekant nuoseklųjį bandymą

(13). Į bandymo strategiją, pateikiamą kaip šio metodo priedas, įtraukti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, jei tinka, atliekant pradinį in vivo bandymą vietoj vienalaikio rekomenduojamas nuoseklusis trijų bandomųjų tamponų uždėjimo gyvūnui bandymas. 3. Siekiant užtikrinti ir duomenų mokslinį patikimumą, ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neatliekami tol, kol atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį odai. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ardymo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba apie jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes

(15), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo bandymų rezultatai

(18). Ši analizė turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tas medžiagas, apie kurių odos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį jau turima pakankamai kitų tyrimų metu gautų duomenų. 4. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ardymo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo EBPO seminaro dalyviai

(19), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai sudarnintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (Globally Harmonised System, GHS) bandymų strategija

(20). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ardymo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ardymo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.

1. Jei ardymo arba dirginimo savybių negalima nustatyti, atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę, atitinkančią nuoseklaus bandymo strategiją, reikėtų spręsti klausimą apie in vivo bandymą (žr. priedą).
2. Apibrėžimai: Odos dirginimas – išnykstantis odos pažeidimas, bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 4 h. Odos ardymas – neišnykstantis odos pažeidimas; būtent, matomoji nekrozė per epidermį ir odos nekrozė po bandomosios medžiagos uždėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Ardymo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos šutimo, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą.
3. Bandymo metodo esmė: 7.
4. Ant bandomo gyvūno odos dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveiktos gyvūno odos vietos naudojamos kontrolei. Nustatytais laiko tarpais nustatomas ir balais įvertinamas dirginimo ar ardymo laipsnis, kuris papildomai aprašomas, siekiant išsamiai įvertinti poveikį. Tyrimo trukmės turi pakakti stebimo poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti. 7.
5. Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai numarinami, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų numarinimo, aprašyti

(21)nuorodoje. II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1. Pasiruošimas in vivo bandymui: 8.
2. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – triušis albinosas. Naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas. 8.
3. Gyvūnų ruošimas: 8.2.
4. Maždaug 24 h prieš bandymą nuo gyvūno kūno juosmens nugaros srityje reikia pašalinti vilną, ją nukerpant arba nuskutant. Reikia stengtis nepažeisti odos ir naudoti tik tuos gyvūnus, kurių oda yra sveika ir nepažeista. 8.2.
5. Kai kurių veislių triušiai turi tankių plaukų vietas, kurios labiau matomos tam tikrais metų laikais. Tokios tankių plaukų vietos neturi būti naudojamos bandymui. 8.
6. Laikymo ir šėrimo sąlygos: 8.3.
7. Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji triušiai, temperatūra turi būti 20°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. 8.3.
8. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.
9. Bandymo eiga: 9.
10. Bandomosios medžiagos uždėjimas: 9.1.
11. Bandomoji medžiaga uždedama ant mažo odos ploto (maždaug 6 cm2) ir uždengiama marlės tamponu, kuris tvirtinamas nedirginančia juosta. Jei tiesiogiai uždėti neįmanoma (pvz., skysčiai arba kai kurios pastos), bandomąją medžiagą reikėtų dėti ant marlės tampono, kuris butų dedamas ant odos. Visą poveikio laikotarpį tamponas turi laisvai liesti odą, naudojant pusiau pralaidų tvarstį. Jei bandomoji medžiaga dedama ant tampono, jis dedamas ant odos taip, kad medžiaga gerai liestųsi su oda ir tolygiai pasiskirstytų ant jos. Gyvūnai neturi pasiekti tampono ir praryti arba įkvėpti bandomosios medžiagos. 9.1.
12. Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. Bandant kietąsias medžiagas (kurios gali būti purškiamos, jei būtų manoma, kad tai daryti yra būtina), bandomąją medžiagą reikėtų sudrėkinti kiek įmanoma mažesniu vandens kiekiu (arba prireikus kitu tinkamu nešikliu), kurio pakaktų geram sąlyčiui su oda užtikrinti. Kai nešiklis yra ne vanduo, galima nešiklio įtaka bandomosios medžiagos dirginamajam poveikiui turi būti kiek įmanoma mažesnė. 9.1.
13. Pasibaigus poveikio laikotarpiui, kurio trukmė paprastai yra 4 h, bandomosios medžiagos likutis turi būti nuplautas, jei įmanoma, vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu, nepakeičiant odos reakcijos arba epidermio vientisumo. 9.
14. Dozės. Ant bandymo vietos dedama 0,5 ml skysčio arba 0,5 g kietosios medžiagos arba pastos dozė. 9.
15. Pradinis bandymas (in vivo odos dirginimo ar ardymo bandymas su vienu gyvūnu): 9.3.
16. Labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių atlikti su vienu gyvūnu, ypač kai yra įtarimas dėl ardančiųjų medžiagos savybių. Tai atitinka nuosekliųjų bandymų strategiją (žr. 1 priedą). 9.3.
17. Kai po duomenų įrodomosios vertės analizės padaroma išvada, kad medžiaga yra ardanti, bandymų su gyvūnais atlikti nereikia. Didesnei daliai medžiagų, kurias galima laikyti ardančiomis, in vivo bandymai paprastai nebūtini. Tačiau tais atvejais, kai turimi duomenys atrodo nepakankamai įrodantys, galima atlikti ribotą bandymą su gyvūnais, taikant šį būdą: ant gyvūno paeiliui dedami ne daugiau kaip trys tamponai. Pirmasis tamponas nuimamas po trijų minučių. Jei jokios sunkios odos reakcijos nėra, dedamas antras tamponas, kuris nuimamas po valandos. Jei šioje stadijoje stebėjimai rodo, kad poveikį galima humaniškai pratęsti keturioms valandoms, dedamas trečias tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų, ir odos reakcija įvertinama balais. 9.3.
18. Jei ardomasis poveikis pastebimas po bet kurio iš trijų nuoseklių poveikių, bandymas nedelsiant baigiamas. Jei ardomojo poveikio nėra, nuėmus paskutinį tamponą, gyvūnas stebimas 14 parų, jei ardymo požymių neatsiranda anksčiau. 9.3.
19. Tai atvejais, kai nesitikima, kad bandomoji medžiaga sukels ardomąjį poveikį, o tik dirginantį, vienam gyvūnui keturioms valandoms dedamas vienas tamponas. 9.
20. Patvirtinamasis bandymas (in vivo odos dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais): 9.4.
21. Jei atliekant pradinį bandymą ardomojo poveikio nėra, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus su vienu tamponu ir esant keturių valandų poveikio trukmei. Jei dirginantis poveikis pastebimas atliekant pradinį bandymą, patvirtinamąjį bandymą galima daryti nuosekliu būdu arba veikiant du papildomus gyvūnus vienu metu. 9.4.
22. Išimtiniais atvejais, kai pradinis bandymas neatliekamas, dviem arba trims gyvūnams gali būti dedamas vienas tamponas, kuris nuimamas po keturių valandų. Kai naudojami du gyvūnai ir abiejų reakcija vienoda, toliau bandyti nereikia. Priešingu atveju dar atliekamas bandymas su trečiu gyvūnu. Neaiškias reakcijas gali tekti įvertinti naudojant papildomą gyvūną. 9.
23. Stebėjimo laikotarpis: 9.5.
24. Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti pastebėto poveikio grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti nutrauktas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai. 9.5.
25. Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai po tamponų nuėmimo stebimi iki 14 parų. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau kaip po 14 parų, bandymas nutraukiamas tuo momentu. 9.
26. Klinikiniai stebėjimai ir odos reakcijos įvertinimas balais: 9.6.
27. Stebima, ar visi gyvūnai neturi paraudimo (eritemos) ir patinimo (edemos) požymių, o reakcija įvertinama po 60 minučių nuėmus tamponą, vėliau – po 24, 48 ir 72 valandų. Atliekant pradinį bandymą su vienu gyvūnu, bandymo vieta taip pat tiriama iškart po tampono nuėmimo. Odos reakcija įvertinama balais ir aprašoma pagal lentelėje pateiktą gradavimo skalę. Jei odai padarytas pažeidimas po 72 h negali būti identifikuotas kaip dirginimas arba ardymas, poveikio grįžtamumui nustatyti stebėjimą gali tekti tęsti iki 14 parų. Be dirginamojo poveikio stebėjimo, turi būti išsamiai apibūdintas ir užrašytas bet koks vietinis toksiškas poveikis, pvz., odos džiūvimas, ir bet koks sisteminis neigiamas poveikis (pvz., poveikis, pasireiškiantis kaip klinikiniai toksiškumo požymiai, ir poveikis kūno masei). Neaiškiems pažeidimams išaiškinti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą. 9.6.
28. Odos reakcijos įvertinimas balais yra neišvengiamai subjektyvus. Siekiant labiau suderinti odos reakcijos įvertinimą balais, padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai apmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą (žr. toliau pateiktą lentelę). Tam galėtų būti naudingas iliustruotas odos dirginimo ir kitų pažeidimų įvertinimo vadovas

(22). III. DUOMENYS

1. Rezultatų pateikimas. Galutinėje ataskaitoje tyrimo rezultatai turi būti apibendrinti lentelėje, į kurią būtų įtraukti visi 7.1 skirsnio punktai.
2. Rezultatų įvertinimas: 11.
3. Odos sudirginimas balais turi būti įvertintas pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. Kiekvienas įvertinimas balais nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar vertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į kiekvieną įvertinimą balais reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, kurios turi būti vertinamos kartu su visais kitais stebėjimo rezultatais. 11.
4. Vertinant sudirginimą turėtų būti atsižvelgta į odos pažeidimų grįžtamumą. Kai reakcija, pvz., plikimas (ribotame plote), hiperkeratozė, hiperplazija ir pleiskanojimas, pasireiškia baigiantis stebėjimo laikotarpio 14 parai, bandomoji medžiaga priskiriama dirginančioms. IV. ATASKAITOS RENGIMAS
5. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija: 12.
6. In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus: 12.1.
7. ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas; 12.1.
8. duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje; 12.1.
9. atliktų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie metodikas, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagą; 12.1.
10. duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui atlikti. 12.
11. Bandomoji medžiaga: 12.2.
12. identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, gamintojas, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris); 12.2.
13. fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas); 12.2.
14. sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys. 12.
15. Nešiklis: jo identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris; nešiklio pasirinkimo pagrindimas. 12.
16. Bandymo gyvūnai: 12.4.
17. naudota rūšis ir veislė, kitų, ne baltųjų triušių, naudojimo pagrindimas; 12.4.
18. kiekvienos lyties gyvūnų skaičius; 12.4.
19. kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje; 12.4.
20. amžius tyrimo pradžioje; 12.4.
21. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t. 12.
22. Bandymo sąlygos: 12.5.
23. tampono dėjimo vietos ruošimo technika; 12.5.
24. išsami informacija apie naudojamas tampono medžiagas ir tampono dėjimo techniką; 12.5.
25. išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą, dėjimą ir nuėmimą. 12.
26. Rezultatai: 12.6.
27. kiekvieno gyvūno dirginimo ar ardymo reakcijos balų, gautų visuose matavimo laiko taškuose, lentelių sudarymas; 12.6.
28. visų pastebėtų pažeidimų aprašymas; 12.6.
29. pastebėto dirginimo arba ardymo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas ir visi histopatologinio tyrimo rezultatai; 12.6.
30. kito kartu su dirginimu arba ardymu pasireiškiančio neigiamo vietinio (pvz., odos džiūvimo) ir sisteminio poveikio aprašymas. 12.
31. Rezultatų aptarimas. V. NUORODOS
32. Barratt, M. D., Castell, J. V, Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, L, Giuliani, A, Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P.

(1995)The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report

1. ATLA 23, 410-
3. Young, J. R., How, M. J., Walker, AP, Worth W. M. H.

(1988)Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-

2. Worth, AP, Fentem, J. H., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Liebsch, M.

(1998)Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720. 16. ECETOC

(1990)Monograph No. 15, „Skin Irritation“, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. 17. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Esdaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M.

(1998)The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity.

1. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-
3. Testing Method B.40 Skin Corrosion.
4. OECD

(1996)OECD Test Guidelines Programme: Finai Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). 20. OECD

(1998)Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd. org/ehs/Class/HCL6.htm). 21. OECD

(2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http: //www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm). 22. EPA

(1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August

1. [Paprašius, galima gauti EBPO sekretoriate]. ______________ 1 lentelė. Odos reakcijos vertinimo balais skalė Paraudimas ir šašo formavimasis Paraudimo nėra ........................................................................................ 0 Vos matomas paraudimas ........................................................................ 1 Aiškiai matomas paraudimas ................................................................... 2 Paraudimas nuo vidutinio iki didelio intensyvumo ................................. 3 Ypač ryškus paraudimas (jautienos raudonumo) arba šašo formavimasis, neleidžiantis stebėti paraudimo 4 Didžiausias įmanomas: 4 Patinimas Patinimo nėra ............................................................................................ 0 Vos apčiuopiamas patinimas .................................................................... 1 Nedidelis patinimas (plotelio kraštai aiškiai apibrėžti, nes yra pakilę) ..... 2 Vidutinis patinimas (kraštai pakilę maždaug 1 mm) ................................ 3 Stiprus patinimas (pakilęs daugiau kaip 1 mm ir išplitęs už veikiamo ploto ribų) ... 4 Didžiausias įmanomas: 4 Neaiškiems pažeidimams paaiškinti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą. ______________ Ūmaus toksiškumo. Odos dirginimo ar ardymo (B.4) metodo aprašo priedas NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA ODOS DIRGINIMUI IR ARDYMUI NUSTATYTI I. BENDROSIOS NUOSTATOS
2. Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali sukelti sunkias reakcijas. Visa informacija apie medžiagos galimą ardomąjį ar dirginamąjį poveikį odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant, ar atlikti in vivo bandymus. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios medžiagos ardomajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Taigi taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją, sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad medžiaga gali sukelti sunkias reakcijas.
3. Turimai informacijai apie medžiagų dirginamąjį ir ardomąjį poveikį įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo odos tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Norint gauti duomenų apie nebandytas medžiagas, reikalingų jų ardomajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priede aprašyta bandymų strategija buvo parengta EBPO seminare

(5)ir vėliau patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje

(6).

1. Nors ši nuosekliųjų bandymų strategija nėra sudėtinė B.4 metodo dalis, ji apibūdina rekomenduojamą būdą odos dirginimo ar ardymo charakteristikoms nustatyti. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra odos dirginimo ar ardymo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Strategijoje siūlomas būdas, kaip įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų medžiagų odos dirginimo ar ardymo savybes, kad būtų galima gauti reikiamų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Be to, rekomenduojama atlikti įteisintus ir priimtus odos ardymo ar dirginimo in vitro arba ex vivo bandymus esant konkrečioms aplinkybėms. II. ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS
2. Siekiant nustatyti in vivo odos bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima informacija. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant vienintelį parametrą (pvz., pH ribines vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Sprendimui priimti turi būti daroma visų atitinkamų duomenų apie konkrečios medžiagos arba jos analogų poveikį įrodomosios vertės analizė, kuri pagrįstų priimamą sprendimą. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į duomenis apie medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų duomenis. Ardančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Bandymų strategijos veiksniai: 4.
3. Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir gyvūnus, įvertinimas (1 pakopa). Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) bandymų su gyvūnais duomenys, pvz., vienkartinio arba kartotinio poveikio odai toksiškumo tyrimai, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu odai. Medžiagų, kurios yra žinomos kaip dirginančios arba ardančios, ir medžiagų, kurios akivaizdžiai nėra ardančios arba dirginančios, nereikia bandyti atliekant in vivo tyrimus. 4.
4. Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa). Analizuojami giminingą struktūrą turinčių medžiagų bandymo rezultatai, jei tokie būtų. Kai tiriant žmones ir gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka, norint įrodyti medžiagų gebą ardyti ar jautrinti odą, galima daryti prielaidą, kad įvertinimui pateiktos bandomosios medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos nebūtina bandyti. Taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga nėra ardanti ar jautrinanti. Medžiagų geba ardyti ir dirginti odą nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR metodus. 4.
5. Fizikinės cheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa). Medžiagos, turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 ir ≥ 11,5, gali turėti didelį vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kurią medžiaga identifikuojama kaip odą ardanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (arba buferinę talpą)

(8). Jei buferinė talpa leidžia daryti prielaidą, kad medžiaga gali nebūti odą ardanti medžiaga, tai turi būti patvirtinta atliekant papildomus bandymus ir geriau būtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas). 4.4. Toksiškumas per odą (4 pakopa). Jei buvo įrodyta, kad cheminė medžiaga yra labai toksiška per odą, in vivo odos dirginimo ar ardymo tyrimas gali būti neįmanomas, nes bandomosios medžiagos kiekis, kuris įprastai dedamas ant odos, gali būti didesnis už labai didelio toksiškumo dozę, taigi gyvūnas gali žūti arba sunkiai kentėti. Be to, jei jau yra atlikti toksiškumo per odą tyrimai su baltaisiais triušiais, naudojant 2000 mg/kg kūno masės arba didesnę ribinę dozę, ir nebuvo pastebėta odos dirginimo ar ardymo, papildomas odos dirginimo ar ardymo bandymas gali būti nereikalingas. Vertinant ūmų toksiškumą pirmiau atliktuose tyrimuose, reikėtų atsižvelgti į kelias aplinkybes. Pvz., paskelbta informacija apie odos pažeidimus gali būti neišsami. Gali būti bandomi ir stebimi gyvūnai kitų, ne triušių, rūšių, o rūšių jautrumas poveikiui gali labai skirtis. Be to, bandomosios medžiagos taikymo būdas gali netikti odos dirginimui ar ardymui įvertinti (pvz., medžiagų skiedimas bandant toksiškumą per odą)

(9). Tačiau tais atvejais, kai toksiškumo per odą tyrimai su triušiais buvo gerai suplanuoti ir atlikti, neigiami rezultatai gali būti laikomi pakankamu įrodymu, kad medžiaga ardanti arba dirginanti. 4.5. In vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (5 ir 6 pakopos). Medžiagų, kurios, kaip įrodyta, veikia kaip ardančios arba labai dirginančios atliekant patvirtinto tinkamumo ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą

(10)(ll), skirtą šiam konkrečiam poveikiui įvertinti, nereikia bandyti su gyvūnais. Galima daryti prielaidą, kad tokios medžiagos turės panašų sunkų poveikį in vivo. 4.

1. Bandymas su triušiais in vivo (7 ir 8 pakopos). Jei atlikus duomenų įrodomosios vertės analizę priimamas sprendimas atlikti bandymą in vivo, jį reikėtų pradėti pradiniu bandymu su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad medžiaga yra odą ardanti, toliau bandyti nereikia. Jei atliekant pradinį bandymą ardomasis poveikis nepastebimas, dirginimo arba ardymo poveikis patvirtinamas naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus, veikiamus keturias valandas. Jei atliekant pradinį bandymą pastebimas dirginamasis poveikis, patvirtinamasis bandymas gali būti atliekamas nuosekliu būdu arba tuo pat metu veikiant du papildomus gyvūnus. III. NUORODOS
2. OECD

(1996). Test Guidelines Programme: Finai Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). 6. OECD

(1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6. htm). 7. Worth, A. P., Fentem J. H., Balis M., Botham PA., Curren R. D., Earl L. K., Esdail D. J., Liebsch M.

(1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-

2. Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth, W. M. H.

(1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2

(1)p. 19-

2. Patil, S. M., Patrick, E., Maibach, H. I.

(1996)Animal, Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411-

2. Testing Method B.
4. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M.

(1998)The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity.

1. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-
2. ______________ Schema. Odos dirginimo ar ardymo bandymo ir įvertinimo strategija Veikla Rezultatas Išvada 1 Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo poveikį odai ir gleivinei Ardo Galutinis sprendimas; laikoma ardančia. Bandyti nereikia. Dirgina Galutinis sprendimas; laikoma dirginančia. Bandyti nereikia. Neardo/nedirgina Galutinis sprendimas; laikoma neardančia arba nedirginančia. Bandyti nereikia. ↓ Informacijos nėra arba turima informacija neįtikinanti ↓ 2 Įvertinami SAR dėl odos ardymo ar dirginimo Numatomas sunkus odos pažeidimas Laikoma ardančia. Bandyti nereikia. Numatomas odos dirginimas Laikoma dirginančia. Bandyti nereikia. ↓ Negalima prognozuoti arba prognozės neįtikinančios arba neigiamos ↓ 3 Matuojama pH vertė (jei tinka, atsižvelgiama į buferinę talpą) pH ≤ 2 arba ≥ 11.5 (esant didelei buferinei talpai, jei tinka) Daroma prielaida apie ardymą. Bandyti nereikia. ↓ 2< pH < 11.5, arba pH ≤ 2,0 arba ≥ 11,5, esant mažai ar didelei buferinei talpai, jei tinka ↓ 4 Įvertinami sisteminio toksiškumo per odą duomenys

(1)Labai toksiška Daugiau bandyti nereikia. Neardo arba nedirgina, kai atliekamas bandymas su triušiais, naudojant ribinę 2000 mg/kg kūno masės arba didesnę dozę Daroma prielaida, kad nėra ardanti arba dirginanti. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Tokios informacijos nėra arba ji nėra {tikinanti ↓ 5 Atliekamas patvirtinto tinkamumo ir priimtas in vitro arba ex vivo odos ardymo bandymas Ardo Daroma prielaida apie ardymą in vivo. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Medžiaga neardo ↓ 6 Atliekamas įteisintas ir priimtas in vitro arba ex vivo odos dirginimo bandymas Dirgina Daroma prielaida apie dirginimą in vivo. Daugiau bandyti nereikia. ↓

(1)Galima nagrinėti prieš 2 ir 3 pakopą. Dar nėra įteisintų in vitro arba ex vivo metodų odos dirginimui bandyti arba medžiaga nėra dirginanti ↓ 7 Atliekamas pradinis in vivo bandymas su vienu triušiu Sunkus odos pažeidimas Laikoma ardančia. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Nėra sunkaus pažeidimo ↓ 8 Atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant vieną arba du papildomus gyvūnus Ardo arba dirgina Laikoma ardančia arba dirginančia. Daugiau bandyti nereikia. Neardo arba nedirgina Laikoma neardančia arba nedirginančia. Daugiau bandyti nereikia. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 ŪMAUS TOKSIŠKUMO. AKIES DIRGINIMO AR ARDYMO (B.5) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS

1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 405 metodą (2002 m.).
2. Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš atliekant aprašytą medžiagos ūmaus akių ardymo ar dirginimo bandymą in vivo atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę

(13). Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti atliekant nuoseklųjį bandymą

(15). Į bandymo strategiją įtraukti šio metodo priede aprašyti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, prieš numatant atlikti in vivo akių bandymą akių ardymui prognozuoti, rekomenduojama taikyti in vivo odos dirginimo ar ardymo bandymą. 3. Siekiant vienu metu užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol darant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ardymo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes

(17), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ardymo ir dirginimo bandymų rezultatai

(19). Tyrimai gali būti atliekami prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas. 4. Tokia kai kurių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia atlikti medžiagos akių ardymo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš numatant atlikti in vivo akių bandymą, iš pradžių reikėtų atlikti medžiagos poveikio odai in vivo tyrimą ir ją įvertinti pagal B.4 bandymo metodą

(20). Duomenų įrodomosios vertės analizės ir nuosekliųjų bandymų strategijos taikymas turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tokių medžiagų, apie kurias jau yra gauta pakankamai duomenų atliekant kitus tyrimus, akių ardymo ar dirginimo poveikį. Jei, taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, akių ardymo arba dirginimo geba negali būti nustatyta net po odos ardymo ir dirginimo in vivo tyrimo, galima atlikti in vivo akių ardymo ar dirginimo bandymą. 5. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ardymo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo EBPO seminaro dalyviai

(21), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai sudarnintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (Globally Harmonised System, GHS) bandymų strategija

(22). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ardymo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ardymo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų.. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas.

1. Apibrėžimai: Akių dirginimas – akių pokyčių sukėlimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo. Akių ardymas – akies audinių pažeidimas arba sunkus regėjimo pablogėjimas, paveikus bandomąja medžiaga priekinį akies paviršių, kai pažeidimai ne visiškai išnyksta per 21 parą po veikimo.
2. Bandymo metodo esmė: 7.
3. Ant bandomo gyvūno vienos akies dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveikta gyvūno akis naudojama kontrolei. Apibrėžtais laiko tarpais nustatomi ir balais įvertinami junginės, ragenos ir rainelės pažeidimai. Be to, poveikio išsamiam įvertinimui aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakankama poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti. 7.
4. Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai numarinami, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų numarinimo, aprašyti

(23)nuorodoje. II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1. Pasiruošimas in vivo bandymui: 8.
2. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – triušis albinosas. Naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas. 8.
3. Gyvūnų ruošimas. Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys patikrinamos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturi būti naudojami. 8.
4. Laikymo ir šėrimo sąlygos: 8.3.
5. Gyvūnai turi būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turi būti 20°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. 8.3.
6. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.
7. Bandymo eiga: 9.
8. Bandomosios medžiagos dėjimo būdas. Bandomoji medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad būtų išvengta medžiagos nuostolių. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei. 9.
9. Akių plovimas: 9.2.
10. Bandomo gyvūno akių, įdėjus bandomosios medžiagos, reikėtų neplauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 9.3.2 skirsnį) ir jei iš karto pasireiškia ardymo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti. 9.2.
11. Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du gyvūnus. Kruopščiai aprašomos plovimo sąlygos, pvz., plovimo laikas, plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra, trukmė, tūris ir tiekimo greitis. 9.
12. Dozės: 9.3.
13. Skysčių bandymas. Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio medžiagai tiesiai į akį purkšti. Prieš įpurškiant 0,1 ml į akį, skystis iš pradžių pumpuojamas ir surenkamas į indą. 9.3.
14. Kietųjų medžiagų bandymas: 9.3.2.
15. Bandant kietąsias medžiagas, pastą ir daleles, naudojamos medžiagos tūris turi būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji medžiaga turi būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūris matuojamas ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą. 9.3.2.
16. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji medžiaga nepašalinama iš bandomo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu. 9.3.
17. Aerozolių bandymas: 9.3.3.
18. Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis daroma slėginiuose aerozolių purkštuvuose esančioms medžiagoms, kurių negalima sukaupti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis atmerkiama ir bandomoji medžiaga maždaug vieną sekundę tiesiog švirkščiama į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali būti kitoks, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga galimybę. 9.3.3.
19. Aerozolio dozei įvertinti galima modeliuoti šį įpurškimo bandymą: per triušio akies dydžio angą medžiaga purškiama ant pasverto popieriaus lapo, dedamo tiesiai prieš akį. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su medžiaga prieš įpurškimą ir po jo. 9.
20. Pradinis bandymas (in vivo akies dirginimo ar ardymo bandymas su vienu gyvūnu): 9.4.
21. Kaip aiškiai nurodyta nuosekliųjų bandymų strategijos aprašyme (žr. 1 priedą), labai rekomenduojama in vivo bandymą iš pradžių atlikti su vienu gyvūnu. 9.4.
22. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją metodiką medžiaga yra akį ardanti arba labai ją dirginanti, kiti akies dirginimo bandymai neturi būti atliekami. 9.
23. Vietinis nuskausminimas: 9.5.
24. Galima naudoti vietinio nuskausminimo priemones atsižvelgiant į kiekvieną individualų atvejį. Jei duomenų įrodomosios vertės analizė rodo, kad medžiaga gali sukelti skausmą arba pradinis bandymas rodo skausmingą gyvūno reakciją, prieš įlašinant bandomąją medžiagą galima naudoti vietinio nuskausminimo priemonę. 9.5.
25. Reikia kruopščiai parinkti vietinio nuskausminimo priemonės tipą, koncentraciją ir dozę, siekiant užtikrinti, kad dėl jos naudojimo nebūtų reakcijos į bandomosios medžiagos poveikį skirtumų. Kontrolinė akis nuskausminama panašiu būdu. 9.
26. Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais): 9.6.
27. Jei atliekant pradinį bandymą ardantis poveikis nepastebimas, dirginantis poveikis arba neigiama reakcija turi būti patvirtinta naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus. 9.6.
28. Jei atliekant pradinį bandymą pastebimas labai didelis dirginantis poveikis, rodantis galimą stiprų (neišnykstantį) poveikį atliekant patvirtinamąjį bandymą, šį bandymą rekomenduojama atlikti nuosekliu būdu ir vietoj dviejų papildomų gyvūnų vienu metu naudoti vieną gyvūną. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ardomasis arba sunkus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas. 9.6.
29. Silpnam arba vidutinio dydžio dirginamajam poveikiui patvirtinti gali būti reikalingi papildomi gyvūnai. 9.
30. Stebėjimo laikotarpis: 9.7.
31. Stebėjimo laikotarpio trukmės turi pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymas turi būti baigtas bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio skausmo arba kančios požymiai

(22). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios medžiagos suleidimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei baigiantis 21 parai, bandymas nutraukiamas tuo momentu. 9.7.

1. Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais: 9.7.2.
2. Akys tiriamos praėjus 1, 24, 48, ir 72 h po bandomosios medžiagos įdėjimo. Gyvūnai bandomi ne ilgiau, nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia ilgalaikis didelis skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai numarinti, o medžiaga atitinkamai įvertinta. Turi būti humaniškai numarinami gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai: ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas, kuris nepraeina po 48 h; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės reakcija) ilgiau kaip 72 h; junginės membranos opos; junginės arba niktitacinės membranos nekrozė arba nekrozinio audinio lupimasis. Numarinti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami. 9.7.2.
3. Bandymas su gyvūnais, kuriems akių pažeidimų nepastebima, gali būti baigti ne anksčiau kaip ketvirtą parą po įlašinimo. Gyvūnai su nedideliais ir vidutiniais pažeidimais turi būti stebimi tol, kol pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, t.y. iki tyrimo pabaigos. Apžiūrėti reikia po 7, 14 ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų tipą ir jų grįžtamumą arba negrįžtamumą. 9.7.2.
4. Akių pažeidimo balai (junginės, ragenos ir rainelės) užrašomi kiekvienos apžiūros metu (1 lentelė). Be to, nurodomi visi kiti akies pažeidimai (pvz., panuso, dėmių atsiradimas) arba sisteminis neigiamas poveikis. 9.7.2.
5. Tikrinant reakciją galima naudoti binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti tiriamos naudojant fluoresceiną. 9.7.2.
6. Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai mokomas taikyti įvertinimo balais sistemą. III. DUOMENYS
7. Rezultatų įvertinimas: 10.
8. Akių dirginimas balais įvertinamas pagal pažeidimų tipą ir sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvimą. 10.
9. Kiekvienas įvertinimas balais nėra medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į kiekvieną įvertinimą balais reikėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas. IV. ATASKAITOS RENGIMAS
10. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija: 11.
11. In vivo bandymo pagrindimas: jau turimų bandymo duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus: 11.1.
12. ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas; 11.1.
13. duomenys, gauti kiekvienoje bandymų strategijos stadijoje; 11.1.
14. atliktų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie procedūras, rezultatus, gautus tiriant bandomąją ar etaloninę medžiagą; 11.1.
15. atlikto in vivo odos dirginimo ar ardymo tyrimo aprašymas, įskaitant gautus rezultatus; 11.1.
16. duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui atlikti. 11.
17. Bandomoji medžiaga: 11.2.
18. jos identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, gamintojas, grynumas, žinomos priemaišos, siuntos numeris); 11.2.
19. fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpurnas, stabilumas, reagavimas su vandeniu); 11.2.
20. sudėtis ir komponentų procentinė dalis, jei tai mišinys; 11.2.
21. jei naudojama vietinio nuskausminimo priemonė: identifikavimas, grynumas, tipas, dozė ir galima sąveika su bandomąja medžiaga. 11.
22. Nešiklis: jo identifikavimas, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris; nešiklio pasirinkimo pagrindimas. 11.
23. Bandymo gyvūnai: 11.4.
24. naudota rūšis ar veislė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrindimas; 11.4.
25. kiekvieno gyvūno amžius tyrimo pradžioje; 11.4.
26. kiekvienos lyties gyvūnų skaičius bandymo ir kontrolinėje (jei reikia) grupėje; 11.4.
27. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje; 11.4.
28. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir kt. 11.
29. Rezultatai: 11.5.
30. metodo, taikyto dirginimui kiekvienu stebėjimo momentu įvertinti balais (pvz., rankinė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, fluoresceinas), aprašymas; 11.5.
31. kiekvieno gyvūno dirginimo ar ardymo reakcijos duomenų, gautų kiekvienu stebėjimo momentu iki gyvūno pašalinimo iš bandymo, lentelių sudarymas; 11.5.
32. stebimo dirginimo arba ardymo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas; 11.5.
33. visų kitų akies pažeidimų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, panuso susidarymas, sąaugų, dėmių atsiradimas); 11.5.
34. bet kokio ne akims daromo neigiamo vietinio ir sisteminio poveikio aprašymas, visi histopatologinio tyrimo rezultatai, jei yra. 11.
35. Rezultatų aptarimas.
36. Rezultatų aiškinimas: 12.
37. Akių dirginimo rezultatų, gautų laboratoriniams gyvūnams, ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru laipsniu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ardančioms medžiagoms nei žmonės. 12.
38. Aiškinant rezultatus reikia neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo. V. NUORODOS
39. Barratt, M. D., Castell, J. V, Chamberlain, M., Combes, R. D., Dearden, J. C., Fentem, J. H., Gerner, L, Giuliani, A, Gray, T. J. B., Livingston, D. J., Provan, W. M., Rutten, F. A. J. J. L., Verhaar, H. J. M., Zbinden, P.

(1995)The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report

1. ATLA 23, 410-
3. de Silva, O., Cottin, M., Darni, N., Roguet, R., Catroux, P, Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K. G., Gerner, L, Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K. C., Hill, R. N.

(1997)Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159-164. 15. Worth AP. and Fentem J. H.

(1999)A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-

2. Young, J. R., How, M. J., Walker, AP, Worth W. M. H.

(1988)Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26. 17. Neun, D. J.

(1993)Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 –

2. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Edsaile, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M.

(1998)The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity.

1. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-
3. Testing Method B.40 Skin Corrosion.
4. Testing method B.
5. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.
6. OECD

(1996)OECD Test Guidelines Programme: Finai Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http: // www. oecd. org/ehs/test/background. htm). 22. OECD

(1998)Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http: //www. oecd. org/ehs/Class/HCL

1. htm).
2. Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm). ______________ 1 lentelė. Akių pažeidimo vertinimo balais skalė Ragena Drumstis: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) (*) Opėjimo arba drumsties nėra .................................................................................... 0 Išsibarsčiusios arba išsklaidytos drumsties sritys (išskyrus nedidelį normalaus blizgesio sumažėjimą), rainelės elementai aiškiai matomi .............................................................................. 1 Lengvai įžiūrima pusiau skaidri sritis, rainelės elementai šiek tiek dulsvi ................. 2 Perlamutrinės sritys, rainelės elementai nematomi, vyzdžio ribos vos įžiūrimos ...... 3 Ragena matinė, dėl drumsties rainelės nesimato ....................................................... 4 Didžiausias įmanomas: 4 Rainelė Normali ..................................................................................................................... 0 Labai pagilėjusios raukšlės, kraujo priplūdimas, pabrinkimas, vidutinė junginės apie rageną hiperemija; arba injekcija; rainelė vis dar reaguoja į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu)............................ 1 Kraujavimas, stiprus rainelės audinių suardymas arba nėra reakcijos į šviesą............ 2 Didžiausias įmanomas: 2 Junginė Raudonumas (taikoma voko ir obuolio junginei, išskyrus rageną ir rainelę) Normali...................................................................................................................... 0 Kai kurie kraujo indai aiškiai hiperemiški (įšvirkšta)................................................. 1 Išsklaidyta tamsiai raudona spalva, atskiri indai sunkiai įžiūrimi.............................. 2 Išsklaidyta jautienos raudonumo spalva.................................................................... 3 Didžiausias įmanomas: 3 Chemozė Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacinėms membranoms) Paburkimo nėra.......................................................................................................... 0 Nedidelis paburkimas, didesnis nei normalus............................................................ 1 Akivaizdus paburkimas, vokai iš dalies išvirsta......................................................... 2 Paburkimas, pusiau užmerkti vokai............................................................................ 3 Paburkimas, vokai užmerkti daugiau nei per pusę..................................................... 4 Didžiausias įmanomas: 4 ______________ Ūmaus toksiškumo. Akies dirginimo ar ardymo (B.5) metodo aprašo priedas NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA AKIŲ DIRGINIMUI IR ARDYMUI NUSTATYTI I. BENDROSIOS NUOSTATOS
3. Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali iššaukti sunkias reakcijas. Visa informacija apie medžiagą dėl jos galimo ardomojo ar dirginamojo poveikio odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant dėl in vivo bandymų. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios medžiagos ardomajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia bandymų su laboratoriniais gyvūnais Taigi taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad medžiaga gali iššaukti sunkias reakcijas.
4. Turimai informacijai apie medžiagų dirginamąjį ir ardomąjį poveikį akims įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo akių tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Norint gauti duomenų apie nebandytas medžiagas, reikalingų jų ardomajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priede aprašyta bandymų strategija buvo parengta EBPO seminare

(5). Vėliau ji buvo patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema, 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje

(6). 3. Nors ši nuosekliųjų bandymų strategija nėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, ji apibūdina rekomenduojamą būdą akių dirginimo ar ardymo charakteristikoms nustatyti. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra akių dirginimo ar ardymo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Nuosekliųjų bandymų strategijoje siūlomas duomenų įrodomosios vertės analizės būdas, kuris leistų įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų medžiagų akių dirginimo ar ardymo savybes, kad būtų galima nuosekliai gauti reikiamų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Strategijoje nurodoma iš pradžių atlikti įteisintus ir priimtus in vitro arba ex vivo bandymus ir tik po to naudoti odos ardymo ar dirginimo bandymo metodą B.4 konkrečiomis aplinkybėmis

(8). II. ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS

1. Siekiant nustatyti in vivo akių bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima informacija. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant vienintelį parametrą (pvz., pH ribines vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Sprendimui priimti turėtų būti daroma visų atitinkamų duomenų apie konkrečios medžiagos arba jos struktūrinių analogų poveikį įrodomosios vertės analizė, kuri pagrįstų priimamą sprendimą. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į duomenis apie medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų duomenis. Ardomųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Bandymų strategijos veiksniai: 4.
2. Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir gyvūnus, įvertinimas (1 pakopa). Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) akių tyrimų su gyvūnais duomenys, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu akims. Toliau įvertinami turimi odos ardymo ar dirginimo duomenys, gauti atliekant tyrimus su žmonėmis ir (arba) gyvūnais. Medžiagos, kurios yra žinomos kaip ardančios arba labai dirginančios akis, neturėtų būti lašinamos į gyvūnų akis, be to, nereikėtų lašinti medžiagų, kurios ardo arba dirgina odą; tokios medžiagos laikomos ardančiomis ir (arba) dirginančiomis akis. Medžiagos, apie kurias yra pakankamai duomenų, kad jos nėra ardančios arba dirginančios, atsižvelgiant į ankstesnius akių tyrimus, irgi neturėtų būti bandomos atliekant in vivo akių tyrimus. 4.
3. Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa). Analizuojami giminingą struktūrą turinčių medžiagų bandymo rezultatai, jei tokie būtų. Kai tiriant žmones ir gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka, norint įrodyti medžiagų gebą ardyti ar jautrinti akis, galima daryti prielaidą, kad įvertinimui pateiktos bandomosios medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos nebūtina bandyti. Taikant nuosekliųjų bandymų strategiją, neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga nėra ardanti ar jautrinanti. Medžiagų geba ardyti ir dirginti odą bei akis turi būti nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR metodus. 4.
4. Fizikinės cheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa). Medžiagos, turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 ir ≥ 11,5, gali turėti didelį vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kuria medžiaga identifikuojama kaip akis ardanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (arba buferinę talpą)

(10). Jei buferinė talpa leidžia daryti prielaidą, kad medžiaga gali nebūti akis ardanti medžiaga, tai turi būti patvirtinta atliekant papildomus bandymus ir geriau būtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas). 4.

1. Kitos turimos informacijos nagrinėjimas (4 pakopa). Šioje stadijoje įvertinama visa turima informacija apie sisteminį toksiškumą per odą. Nagrinėjamas ūmus bandomosios medžiagos toksiškumas per odą. Jei buvo įrodyta, kad bandomoji medžiaga yra labai toksiška per odą, nebūtina bandyti jos poveikio akims. Nors nebūtinai turi būti ryšys tarp ūmaus toksiškumo per odą ir akių dirginimo ar ardymo, galima daryti prielaidą, kad medžiagai esant labai toksiškai per odą, ji taip pat bus labai toksiška jos įlašinus į akis. Be to, tokie duomenys gali būti nagrinėjami tarp 2 ir 3 pakopų. 4.
2. In vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (5 ir 6 pakopos). Medžiagų, kurios pasirodė ardančios arba labai dirginančios atliekant patvirtinto tinkamumo ir priimtą in vitro arba ex vivo bandymą

(12), skirtą šiam konkrečiam poveikiui akims arba odai įvertinti, nereikia bandyti su gyvūnais. Galima padaryti prielaidą, kad tokios medžiagos turės panašų sunkų poveikį in vivo. Jei įteisintų ir priimtų in vitro ar ex vivo bandymų nėra, 5 ir 6 pakopos praleidžiamos ir iš karto pereinama prie 7 pakopos. 4.6. Medžiagos dirginamojo arba ardomojo poveikio odai įvertinimas in vivo (7 pakopa). Jei pirmiau išvardytų tyrimų duomenų nepakanka, norint atlikti įtikinamą duomenų įrodomosios vertės analizę apie medžiagos gebą dirginti ar ardyti akis, iš pradžių įvertinama in vivo medžiagos geba dirginti ar ardyti odą, taikant bandymo metodą B.4

(8)ir jo priedą

(13). Jei įrodoma, kad medžiaga ardo arba labai dirgina odą, ji laikoma akis ardančia ir dirginančia medžiaga, jei kita informacija nepatvirtina priešingos išvados. Taigi in vivo akių bandymo atlikti nereikėtų. Jei medžiaga nėra ardanti arba labai dirginanti odą, turėtų būti atliekamas in vivo akių bandymas. 4.

1. Bandymas su triušiais in vivo (8 ir 9 pakopos). In vivo akių bandymą reikėtų pradėti atliekant pradinį bandymą su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad medžiaga yra labai dirginanti arba ardanti akis, toliau bandyti nereikia. Jei atliekant pradinį bandymą ardymo arba sunkus dirginantis poveikis nepastebimas, atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant du papildomus gyvūnus. III. NUORODOS
2. OECD

(1996)OECD Test Guidelines Programine: Finai Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Tęst Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). 6. OECD

(1998)Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). 7. Worth, A. P. and Fentem J. H.

(1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-

2. Testing method B.
3. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.
4. Young, J. R., How, M. J., Walker, AP, Worth W. M. H.

(1988)Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19-26. 10. Neun, D. J.

(1993)Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227-

2. Fentem, J. H., Archer, G. E. B., Balis, M., Botham, PA, Curren, R. D., Earl, L. K., Edsail, D. J., Holzhutter, H. G. and Liebsch, M.

(1998)The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity.

1. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483-
3. Testing Method B.40 Skin Corrosion.
4. Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion. ______________ Schema. Akių dirginimo ar ardymo bandymo ir įvertinimo strategija Veikla Rezultatas Išvada 1 Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo poveikį akims Ardo akis Galutinis sprendimas; laikoma akis ardančia. Bandyti nereikia. Dirgina akis Galutinis sprendimas; laikoma akis dirginančia. Bandyti nereikia. Akių neardo ir nedirgina Galutinis sprendimas; laikoma, kad akių neardo ir nedirgina. Bandyti nereikia. Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo ardantį poveikį odai Ardo odą Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia. Yra duomenų apie žmones ir (arba) gyvūnus, kurie rodo labai dirginantį poveikį odai Labai dirgina odą Daroma prielaida apie akių dirginimą. Bandyti nereikia ↓ Informacijos nėra arba turima informacija neįtikinanti ↓ 2 Įvertinami SAR dėl akių ardymo ar dirginimo Numatomas sunkus akių pažeidimas Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia Numatomas akių dirginimas Daroma prielaida apie akių dirginimą. Bandyti nereikia. Įvertinami SAR dėl odos ardymo Numatomas odos ardymas Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia. ↓ Negalima prognozuoti arba prognozės neįtikinančios arba neigiamos ↓ 3 Matuojama pH vertė (jei tinka, atsižvelgiama į buferinę talpą) pH≤2 arba ≥ 11,5 (esant didelei buferinei talpai, jei tinka) Daroma prielaida apie akių ardymą. Bandyti nereikia. ↓ 2 < pH < 11,5, arba pH ≤ 2,0 arba ≥ 11,5, esant mažai ar didelei buferinei talpai, jei tinka ↓ 4 Įvertinami sisteminio toksiškumo per odą duomenys Labai toksiška, esant koncentracijai, kuri būtų bandoma akims Medžiaga būtų per daug nuodinga, kad galima būtų bandyti. Bandyti nereikia. ↓ Tokios informacijos nėra arba medžiaga nėra labai toksiška ↓ 5 Atliekamas įteisintas ir priimtas in vitro arba ex vivo akių ardymo bandymas ardo Daroma prielaida apie akių ardymą. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Medžiaga neardo arba įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo akių ardymo bandymo metodų ↓ 6 Atliekamas įteisintas ir priimtas in vitro arba ex vivo akių dirginimo bandymas Dirgina Daroma prielaida apie akių dirginimą. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Medžiaga nedirgina arba nėra įtvirtintų ir priimtų in vitro arba ex vivo akių dirginimo bandymo metodų ↓ 7 Bandymu įvertinamas in vivo odos dirginimas ar ardymas (žr. bandymo metodą B.4 ir jo priedą) Ardo arba labai dirgina Daroma prielaida apie akių ardymą. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Medžiaga odos neardo arba labai nedirgina ↓ 8 Atliekamas pradinis in vivo triušio akių bandymas, naudojant vieną gyvūną Sunkus akių pažeidimas Laikoma akis ardančia. Daugiau bandyti nereikia. ↓ Nėra sunkaus pažeidimo arba jokio reakcijos ↓ 9 Atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant vieną arba du papildomus gyvūnus Ardo arba dirgina Laikoma akis ardančia arba dirginančia. Daugiau bandyti nereikia. Neardo arba nedirgina Laikoma akių neardančia ir nedirginančia. Daugiau bandyti nereikia ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 TOKSIŠKO POVEIKIO PRENATALINIAM VYSTYMUISI TYRIMO (B. 31) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS
5. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 414 metodą (2001 m.).
6. Šis toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi bandymo metodas skirtas suteikti bendros informacijos apie poveikį veisiančios patelės gimdoje augančio vaisiaus prenataliniam vystymuisi; tai gali būti poveikio motinai, iškaitant žūtį, įvertinimas, struktūrinės anomalijos arba vaisiaus augimo pakitimai. Funkciniai trūkumai, nors ir yra svarbi vystymosi dalis, nėra šio bandymo metodo sudėtinė dalis. Jie gali būti bandomi atliekant atskirą tyrimą arba kaip šio tyrimo papildymas, taikant neurotoksiško poveikio vystymuisi bandymo metodą. Prireikus gauti informacijos apie funkcinių trūkumų ir kito postnatalinio poveikio bandymą, reikėtų susipažinti su toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimu ir neurotoksiško poveikio vystymuisi tyrimu.
7. Gali tekti šį bandymo metodą specialiai pritaikyti atskiriems atvejams atsižvelgiant į konkrečias žinias, pvz., bandomosios medžiagos fizikinės chemines arba toksines savybes. Toks pritaikymas priimtinas, kai įrodantys moksliniai duomenys rodo, kad dėl to bandymas bus informatyvesnis. Tokiais atvejais šie moksliniai įrodymai turi būti kruopščiai aprašyti tyrimo ataskaitoje.
8. Apibrėžimai: Vystymosi toksikologija – organizmo vystymuisi neigiamo poveikio, galinčio atsirasti dėl medžiagos veikimo prieš apvaisinimą, prenataliniu arba postnataliniu metu iki lytinio subrendimo, tyrimas. Pagrindinius toksiško poveikio vystymuisi požymius sudaro: 1) organizmo žūtis, 2) struktūros anomalijos, 3) augimo pakitimas ir 4) funkciniai trūkumai. Vystymosi toksikologija anksčiau buvo vadinama teratologija. Neigiamas poveikis – bet koks su poveikiu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos. Vystymosi toksikologiją plačiausia pr