LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO

LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ, GALINČIŲ SUKELTI PAVOJŲ SVEIKATAI, TOKSIŠKUMO TYRIMO METODŲ APRAŠŲ PATVIRTINIMO 2006 m. sausio 4 d. Nr. V-11 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) 6 straipsnio 2 dalimi, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 „Dėl Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmonių sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos“ (Žin., 2001, Nr. 3-60), 11.1 punktu ir įgyvendindamas 2004 m. balandžio 29 d. Komisijos direktyvos 2004/73/EB 29 kartą derinančios su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo nuostatas: 1. Tvirtinu pridedamus: 1.1. Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašą; 1.2. Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B. 1 tris) metodo aprašą; 1.3. Ūmaus toksiškumo. Odos dirginimo ar ardymo (B. 4) metodo aprašą; 1.4. Ūmaus toksiškumo. Akies dirginimo ar ardymo (B. 5) metodo aprašą; 1.5. Toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi tyrimo (B. 31) metodo aprašą; 1.6. Toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimo (B. 35) metodo aprašą; 1.7. Odos jautrinimo. Vietinio limfmazgio tyrimo (B. 42) metodo aprašą; 1.8. Neurotoksiško poveikio graužikams tyrimo (B. 43) metodo aprašą. 2. Pripažįstu netekusiais galios: 2.1. Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymo Nr. V-284 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 70-2472) 1.2.1, 1.2.4 ir 1.2.5 punktus; 2.2. Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymo Nr. V-508 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų ūmaus, kartotinių dozių, poūmio, lėtinio ir specifinio toksiškumo bei alternatyvių tyrimo metodų patvirtinimo“ (Žin., 2004, Nr. 122-4472) 1.1, 1.8 ir 1.12 punktus. 3. Pavedu įsakymo vykdymą kontroliuoti ministerijos sekretoriui pagal administruojamą sritį. SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRAS                                                     ŽILVINAS PADAIGA PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 ŪMAUS TOKSIŠKUMO PER VIRŠKINIMO TRAKTĄ, FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ (B.1 BIS) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šis bandymų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 420 metodą (2001 m.). 2. Taikant tradicinius metodus ūmaus toksiškumo poveikis įvertinamas pagal gyvūno žūtį. Britų toksikologų draugija (British Toxicology Society) 1984 m. pasiūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo būdą, pagrįstą kelių fiksuotų dozių suleidimu (22). Taikant šį būdą išvengiama gyvūnų žūties, kuri būtų poveikio įrodymas; jis pagrįstas aiškių toksiškumo požymių pasireiškimu, kai iš dozių serijos suleidžiama viena fiksuota dozė. Pasibaigus Jungtinės Karalystės (23) ir tarptautinio (24) tinkamumo patvirtinimo tyrimui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje tyrimų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės (25)(26)(27). Kartu atliekami in vivo ir modeliavimo tyrimai įrodė metodikos atkuriamumą; ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. 3. Patarimus dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą bandymo vadove (28). Be to, šiame vadove yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą. 4. Metodo esmę sudaro tai, kad atliekant pagrindinį tyrimą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ardančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro vadovo objektas (29). 5. Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai sudarnintą sistemą (Globally Harmonised System, GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (30). 6. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksinės savybės ir numatomas(-i) medžiagos naudojimo būdas(-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę. 7. Apibrėžimai: Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda gavus per virškinimo traktą vienetinę medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h. Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį. Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg). Aiškus toksiškumas – bendrasis terminas, aprašantis bandomosios medžiagos sukeltus aiškius toksiškumo požymius (pavyzdžiai pateikti (24), rodančius, kad kita didžiausia fiksuota dozė sukels didelio skausmo, ilgalaikių didelių kančių, gaišimo būsenos požymius (kriterijai pateikti poveikio žmonėms vadove (29) arba daugumos gyvūnų žūtį. GHS – visuotinai sudarninta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) (žmonių sveikata ir aplinka), JT (Jungtinių Tautų) pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikinės cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (International Labour Organization (ILO)) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)). Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. Daugiau detalių pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (29). LD50 (vidutinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuojama vienetinė medžiagos dozė per virškinimo traktą, kuri gali sukelti 50% tiriamųjų gyvūnų žūtį. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno kūno masės vienetui (mg/kg). Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg). Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (29). Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (29). 8. Bandymo metodo esmė: 8.1. Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai suleidžiamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozės (išimtiniais atvejais galima spręsti apie papildomos fiksuotos 5000 mg/kg dozės suleidimą, žr. 17 skirsnį). Pradinė dozė pasirenkama atsižvelgiant į įvadinį tyrimą, kaip dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksiško poveikio arba žūties priežastimi. 8.2. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame EBPO vadove (29). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti suleidžiamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo požymius bei gyvūnų žūties atvejus. Ši procedūra tęsiama tol, kol identifikuojama dozė, sukelianti aiškų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kai nėra jokio poveikio esant didžiausiai dozei ar kai gyvūnai žūsta esant mažiausiai dozei. II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 9. Gyvūnų rūšies pasirinkimas: 9.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (28), kadangi tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (31). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai atliekami su patinais, pateikiamas kompetentingas pagrindimas. 9.2. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš suleidžiant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20% tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę. 10. Laikymo ir šėrimo sąlygos: 10.1. Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. 10.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną. 11. Gyvūnų ruošimas: 11.1. Gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių suleidimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų. 12. Dozių ruošimas: 12.1. Visos bandomosios medžiagos dozės skiriamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui, galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias suleidžiamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima suleisti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturi būti didesnis kaip 1 ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. 12.2 Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksinės savybės. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat suleidimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu. III. DARBO EIGA 13. Dozių suleidimas: 13.1. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma suleisti vienetinės dozės, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h. 13.2. Prieš suleidžiant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės naktį negauna pašaro, išskyrus vandenį; pelės negauna pašaro 3-4 h, neribojant vandens gavimo). Pasibaigus minėtam laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir suleidžiama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3-4 h, pelės nešeriamos 1-2 h. Jei dozė suleidžiama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę. 14. Įvadinis tyrimas: 14.1. Įvadinio tyrimo tikslas – leisti pasirinkti atitinkamą pradinę pagrindinio tyrimo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai suleidžiama kiekvienam gyvūnui pagal 1 priedo diagramą. Įvadinis tyrimas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio tyrimo pradinės dozės (arba jei gyvūnai žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei). 14.2. Įvadinio tyrimo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg dozių, kaip dozė, kuri galėtų sukelti aiškų toksiškumą, pagrįstą, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė būtų 300 mg/kg. 14.3. Tarp dozių suleidimo kiekvienam gyvūnui turi būti mažiausiai 24 h laiko tarpas. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų. 14.4. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę (žr. 3 priedą). Dėl priežasčių, susijusių su gyvūnų gerove, neskatinama atlikti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga. 14.5. Tais atvejais, kai atliekant įvadinį tyrimą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), taikant įprastą procedūrą tyrimą reikia nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priede). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama ši neprivaloma papildoma procedūra. 5mg/kg dozė suleidžiama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir tyrimas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės suleidimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių suleidimas iš karto nutraukiamas ir nė vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedo klasifikavimo taisyklė esant 5mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo. 15. Pagrindinis tyrimas: 15.1. Gyvūnų skaičius ir dozės: 15.1.1. Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priede pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, atliekant pagrindinį tyrimą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį atliekant įvadinį tyrimą (žr. 2 priedą). Patyrimas rodo, kad labiausiai tikėtinas pradinės dozės suleidimo rezultatas pasireikš tuo, kad medžiaga galės būti klasifikuota ir tolesnis bandymas nebus būtinas. 15.1.2. Kiekvienai tiriamai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudarys vienas gyvūnas iš įvadinio tyrimo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio tyrimo dozė nebuvo įtraukta į įvadinį tyrimą). 15.1.3. Laiko tarpą tarp dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės suleidimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvienos dozės, jei prireikia, uždelstam toksiškumui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti reguliuojamas, pvz., reakcijos be traukulių atveju. 15.1.4. Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priede aprašytos metodikos (dar žr. 17 skirsnį). 15.2. Ribinis bandymas: 15.2.1. Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas. 15.2.2. Taikant įprastą procedūrą, šiame vadove ribiniu bandymu būtų įvadinis tyrimas suleidžiant 2000 mg/kg dozę (arba išimtiniais atvejais 5000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokia pat dozė. IV. STEBĖJIMAI 16. Kiekvienas gavęs dozę gyvūnas mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (32). Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai aprašomi. 17. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus vadove dėl poveikio žmonėms (29). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau. 18. Kūno masė. Kiekvieno gyvūno kūno masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos suleidimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas kūno masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai sveriami ir humaniškai numarinami. 19. Patologija: 19.1. Visiems bandymo gyvūnams (įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) atliekamas bendrasis skrodimas. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. 19.2. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos. V. DUOMENYS 20. Turi būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, kiekvieno gyvūno žūties laikas, toksiško poveikio aprašymas, to poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys. VI. ATASKAITOS RENGIMAS 21. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka: 21.1. Bandomoji medžiaga: 21.1.1. fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikinės cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą); 21.1.2. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį. 21.2. Nešiklis (jei tinka): jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo. 21.3. Bandymo gyvūnai: 21.3.1. naudota rūšis ir veislė; 21.3.2. mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma; 21.3.3. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą); 21.3.4. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t. 21.4. Bandymo sąlygos: 21.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant suleidžiamos medžiagos fizikinį pavidalą; 21.4.2. išsami informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą, įskaitant dozavimo tūrį ir suleidimo laiką; 21.4.3. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (tiekėją), vandens tiekėją); 21.4.4. pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas. 21.5. Rezultatai: 21.5.1. duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal dozes lentelės (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę); 21.5.2. kūno masės ir jos kitimo lentelės; 21.5.3. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės suleidimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną; 21.5.4. žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą; 21.5.5. toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas; 21.5.6. kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra. 21.6. Rezultatų aptarimas ir aiškinimas. 21.7. Išvados. VII. NUORODOS 22. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92. 23. Van den Heuvel, M. J., Dayan, A. D. and Shillaker, R. O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291. 24. Van den Heuvel, M. J., Clark, D. G., Fielder, R. J., Koundakjian, P. P., Oliver, G. J. A., Pelling, D., Tomlinson, N. J. and Walker, AP. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482. 25. Whitehead, A. and Curnow, R. N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313- 324. 26. Stallard, N. and Whitehead, A (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315- 323. Human Exptl. Toxicol. 27. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196. 28. OECD (2001). Guidance Document on Acute Orai Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 29. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. 30. OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0, FF.html]. 31. Lipnick, R. L., Cotruvo, J. A, Hill, R. N., Bruce, R. D., Stitzel, K. A, Walker, AP, Chu, L, Goddard, M., Segal, L., Springer, J. A and Myers, R. C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231. 32. Chan P. K and A. W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A. W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 1 priedas ĮVADINIO TYRIMO SCHEMA ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 2 priedas PAGRINDINIO TYRIMO SCHEMA ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 3 priedas I. BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEATLIEKANT BANDYMO 1. Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per virškinimo traktą arba odą yra 2000–5000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2000 mg/kg < LD50 < 5000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: 1.1 jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų žūties atvejais; 1.2. jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; 1.3. gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir: 1.3.1. yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, 1.3.2. arba bandymo metu per virškinimo traktą suleidžiant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, nustatomi žūties atvejai arba 1.3.3. jei, tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių, ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba 1.3.4. jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį atliekant kitus tyrimus su gyvūnais. II. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS NEGU 2000 MG/KG DOZĖMS 2. Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas skiriant 5000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (30). 3. Įvadinis tyrimas: 3.1. Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 1 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama įvadinio tyrimo pradinė 5000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (žūtis) reikės atlikti bandymą su antru gyvūnu, skiriant 2000 mg/kg; gavus B ir C rezultatus (aiškus toksiškumas arba jokio toksiškumo) pradinė pagrindinio tyrimo dozė gali būti 5000 mg/kg. 3.2. Panašiai, jei skiriama kita nei 5000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5000 mg/kg, jei esant 2000 mg/kg dozei gaunami B arba C rezultatai; gavus A rezultatą, esant 5000 mg/kg, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 2000 mg/kg, o gavus B ir C rezultatus, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 5000 mg/kg. 4. Pagrindinis tyrimas: 4.1. Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 2 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama pagrindinio tyrimo pradinė 5000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (≥ 2 žūtys) reikės atlikti 2 grupės bandymą, skiriant 2000 mg/kg; gavus B rezultatą (aiškus toksiškumas ir (arba) ≤ 1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga nebus klasifikuojama pagal GHS. 4.2. Panašiai, jei naudojama kita nei 5000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5000 mg/kg, jei esant 2000 mg/kg dozei gaunamas C rezultatas; gavus A rezultatą, esant 5000 mg/kg, medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS laikoma neklasifikuota. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Fiksuotųjų dozių (B.1 bis) metodo aprašo 4 priedas KLASIFIKAVIMO PAGAL EUROPOS SĄJUNGOS SCHEMĄ REKOMENDACIJOS, TAIKOMOS PEREINAMAJAM LAIKOTARPIUI IKI VISIŠKO VISUOTINAI SUDARNINTOS SISTEMOS (GHS) ĮGYVENDINIMO (PAIMTA IŠ (29) NUORODOS) ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 ŪMAUS TOKSIŠKUMO PERVIRŠKINIMO TRAKTĄ. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASIŲ (B.1 TRIS) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šis bandymų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 423 metodą (2001 m.). 2. Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasių metodas (24) – tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gyvūnų žūties atvejus ir (arba) jų gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2–4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasių metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais (25)(26)(27)(28), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima klasifikuoti ir įvertinti jos pavojų. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu (29) ir tarptautiniu mastu (30) atliekant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD50 duomenimis. 3. Patarimus dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą bandymo vadove (31). Be to, šiame vadove yra papildomos informacijos apie B. l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą. 4. Nereikia leisti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ardančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro vadovo objektas (32). 5. Metode naudojamos iš anksto nustatytos dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai sudarnintą sistemą (Globally Harmonised System, GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (33). 6. Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD50 vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD50 vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamų gyvūnų žūčių yra daugiau kaip 0% ir mažiau kaip 100%. Kai skiriamos iš anksto pasirinktos dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų. 7. Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksinės savybės ir numatomas(-i) medžiagos naudojimo būdas(-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę. 8. Apibrėžimai: Ūmus toksiškumas per virškinimo traktą – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda gavus per virškinimo traktą vienetinę medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h. Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį. Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg). GHS – visuotinai sudarninta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). EBPO (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikinės cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (International Labour Organization (ILO)) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)). Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (32). LD50 (vidutinė mirtina dozė) – tai statistiškai apskaičiuojama vienetinė medžiagos dozė per virškinimo traktą, kuri gali sukelti 50% tiriamųjų gyvūnų žūtį. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno kūno masės vienetui (mg/kg). Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2000 arba 5000 mg/kg). Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (32). Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. Daugiau informacijos pateikta vadove dėl poveikio žmonėms (32). 9. Bandymo metodo esmė: 9.1. Šio bandymo esmę sudaro nuosekli metodika, pagal kurią vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galima ją klasifikuoti. Grupė bandymo gyvūnų per virškinimo traktą gauna vieną iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklią metodiką, kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai (paprastai patelės). Su junginiu siejamas dozę gavusių gyvūnų gaišimas arba negaišimas per vieną iš pakopų lemia kitą pakopą, t.y.: 9.1.1. toliau bandyti nereikia; 9.1.2. suleisti tokią pat dozę dar trims gyvūnams; 9.1.3. trims papildomiems gyvūnams suleisti kitą didesnę arba mažesnę dozę. 9.2. Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priede. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD50 intervalo ribinėmis vertėmis. II. METODO APRAŠYMAS 10. Gyvūnų rūšies pasirinkimas: 10.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (32). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (34). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai atliekami su patinais, turėtų būti pateikti atitinkami tai patvirtinantys duomenys. 10.2. Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20% tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę. 11. Laikymo ir šėrimo sąlygos: 11.1. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. 11.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti sugrupuoti narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti atidžiai stebėti kiekvieną gyvūną. 12. Gyvūnų ruošimas: gyvūnai atrenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių suleidimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų. 13. Dozių ruošimas: 13.1. Visos bandomosios medžiagos dozės suleidžiamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima suleisti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturėtų būti didesnis negu 1 ml/100 g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100 g kūno masės. 13.2. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksinės savybės. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat suleidimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu. III. DARBO EIGA 14. Dozių suleidimas: 14.1. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma suleisti vienetinės dozės, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h. 14.2. Prieš suleidžiant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės naktį negauna pašaro, išskyrus vandenį; pelės negauna pašaro 3–4 h, neribojant vandens suvartojimo). Pasibaigus minėtam laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir suleidžiama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė suleidžiama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę. 15. Gyvūnų skaičius ir dozės: 15.1. Kiekvienai pakopai imami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dozių: 5, 50, 300 ir 2000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta dozė, kuriai esant tikrai nugaištų kai kurie iš dozę gavusių gyvūnų. Schemose, pateiktose 1 priede, aprašyta procedūra, kurios reikėtų laikytis kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo. 15.2. Kai turimoje informacijoje nurodoma, kad gyvūnai neturėtų gaišti esant didžiausiai pradinei dozei (2000 mg/kg kūno masės), reikėtų atlikti ribinį bandymą. Neturint informacijos apie bandomąją medžiagą, bet rūpinantis gyvūnų gerove, pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės. 15.3. Laiko tarpus tarp poveikių lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės suleidimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. 15.4. Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5000 mg/kg dozę (žr. 2 priedą). Dėl su gyvūnų gerove susijusių priežasčių, neskatinama atlikti bandymą taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2000–5000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga. 16. Ribinis bandymas: 16.1. Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos visai nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas. 16.2. Kai skiriama viena 2000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedą). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti atlikti bandymą esant gretimai mažesnei dozei. IV. STEBĖJIMAI 17. Kiekvienas gyvūnas, gavęs dozę mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimas visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (35). Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai aprašomi. 18. Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to, kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus vadove dėl poveikio žmonėms (32). 19. Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau. 20. Kūno masė: 20.1. Kiekvieno gyvūno kūno masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos suleidimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas kūno masės pokytis. 20.2. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami. 21. Patologija: 21.1. Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius atliekant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) atliekamas bendrasis skrodimas. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. 21.2. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos. V. DUOMENYS 22. Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, kiekvieno gyvūno žūties laikas, toksiškumo poveikio aprašymas, tokio poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys. VI. ATASKAITOS RENGIMAS 23. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka: 23.1. Bandomoji medžiaga: 23.1.1. fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikinės cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą); 23.1.2. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį. 23.2. Nešiklis (jei tinka): jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo. 23.3. Bandomieji gyvūnai: 23.3.1. naudota rūšis ar veislė; 23.3.2. mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma; 23.3.3. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą); 23.3.4. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t. 23.4. Bandymo sąlygos: 23.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant suleidžiamos medžiagos fizikinį pavidalą; 23.4.2. išsami informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą, įskaitant dozavimo turį ir suleidimo laiką; 23.4.3. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą ar tiekėją, vandens tiekėją); 23.4.4. pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas. 23.5. Rezultatai: 23.5.1. duomenų apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal dozes lentelės (t. y. toksiškumo požymiai, įskaitant žūčių skaičių, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę); 23.5.2. kūno masės ir jos kitimo lentelės; 23.5.3. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės suleidimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną; 23.5.4. žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą; 23.5.5. toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas; 23.5.6. kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra. 23.6. Rezultatų aptarimas ir aiškinimas. 23.7. Išvados. VII. NUORODOS 24. Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett, Suppl. 31, 86. 25. Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341. 26. Diener W, Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 68, 559-610. 27. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 69, 729-734. 28. Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129-134. 29. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470. 30. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Orai). Arch. Toxicol. 69, 659-670. 31. OECD (2001) Guidance Document on Acute Orai Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 32. OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. 33. OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no-24-no-0, FF. html]. 34. Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231. 35. Chan P. K. and A. W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. Al Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1 priedas PROCEDŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIENĄ PRADINĘ DOZĘ 1. Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis: 1.1. 1a priedas: pradinė dozė 5 mg/kg kūno masės; 1.2. 1b priedas: pradinė dozė 50 mg/kg kūno masės; 1.3. 1c priedas: pradinė dozė 300 mg/kg kūno masės; 1.4. 1d priedas: pradinė dozė 2000 mg/kg kūno masės. 2. Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba žuvusių gyvūnų skaičių, bandymo eiga žymima rodyklėmis. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1a priedas PROCEDŪRA, ESANT 5 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1b priedas PROCEDŪRA, ESANT 50 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1c priedas PROCEDŪRA, ESANT 300 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 1d priedas PROCEDŪRA, ESANT 2000 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B. l tris) metodo aprašo 2 priedas BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEATLIEKANT BANDYMO 1. Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per virškinimo traktą arba odą yra 2000–5000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2000 mg/kg < LD50 < 5000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: 1.1. jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 1a-1d prieduose pateiktų bandymo schemų, pagrįstų žūčių dažnumu; 1.2. jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; 1.3. gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir: 1.3.1. yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, 1.3.2. arba bandymo metu per virškinimo traktą suleidžiant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, nustatomi žūties atvejai arba 1.3.3. jei, tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių, ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba 1.3.4. jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį atliekant kitus tyrimus su gyvūnais. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS KAIP 2000 MG/KG DOZĖMS 2. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas su gyvūnais skiriant 5 kategorijos intervalo dozes (5000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (18). Neturi būti atliekamas joks bandymas esant didesnėms dozėms. 3. Kai reikia bandyti naudojant 5000 mg/kg dozę, reikalinga tik viena pakopa (t.y. trys gyvūnai). Jei žūsta pirmas dozę gavęs gyvūnas, dozavimas tęsiamas skiriant 2000 mg/kg dozę pagal 1 priede pateiktas schemas. Jei pirmas gyvūnas lieka gyvas, dozę gauna kiti du gyvūnai. Jei žūsta tik vienas iš trijų gyvūnų, daroma prielaida, kad LD50 vertė yra didesnė negu 5000 mg/kg. Jei žūsta abu gyvūnai, dozavimas tęsiamas skiriant 2000 mg/kg dozę. ______________ Ūmaus toksiškumo per virškinimo traktą. Ūmaus toksiškumo klasių (B.1 tris) metodo aprašo 3 priedas KLASIFIKAVIMO PAGAL ES SCHEMĄ REKOMENDACIJOS, TAIKOMOS PEREINAMAJAM LAIKOTARPIUI IKI VISIŠKO VISUOTINAI SUDARNINTOS SISTEMOS (GHS) ĮGYVENDINIMO (PAIMTA IŠ (31) NUORODOS) – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – ∞: neklasifikuota – GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – ∞: neklasifikuota – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – GHS (Globally Harmonised System):visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) –* pirmoje pakopoje – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – WHMIS (Workplace Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – ∞: neklasifikuota – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) –* pirmoje pakopoje – ES: Europos Sąjunga; – OSHA (Occupational Safety and Health Administration): Saugos ir sveikatos darbe agentūra; – vienai pakopai naudojami 3 gyvūnai (paprastai patelės) – JT: Jungtinės Tautos; – WHMIS (Workplace Hazardous Materials Information System): Darbo vietos pavojingų medžiagų informacinė sistema – 0, 1, 2, 3: kiekvienoje pakopoje gaištančių arba žuvusių gyvūnų skaičius – CPSC (Consumer Product Safety Commision): Vartotojams skirtų gaminių saugumo komisija – ∞: neklasifikuota – AAA: Aplinkos apsaugos agentūra; crk (council resourse kit): išteklių taryba; – GHS (Globally Harmonised System): visuotinai sudarninta sistema (mg/kg k. m.) –* pirmoje pakopoje ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2006 m. sausio 4 d. įsakymu Nr. V-11 ŪMAUS TOKSIŠKUMO. ODOS DIRGINIMO AR ARDYMO (B. 4) METODO APRAŠAS I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šis metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 404 metodą (2002 m.). 2. Rengiant šį atnaujintą metodą ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimą gyvūnų gerovės pagerinimą ir į visos turimos informacijos apie bandomąją medžiagą įvertinimą, siekiant išvengti nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais. Šiame metode rekomenduojama prieš atliekant aprašytą medžiagos ardymo ar dirginimo in vivo bandymą atlikti turimų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę. Jei duomenų nepakanka, jų galima gauti atliekant nuoseklųjį bandymą (13). Į bandymo strategiją, pateikiamą kaip šio metodo priedas, įtraukti įteisinti ir priimti in vitro bandymai. Be to, jei tinka, atliekant pradinį in vivo bandymą vietoj vienalaikio rekomenduojamas nuoseklusis trijų bandomųjų tamponų uždėjimo gyvūnui bandymas. 3. Siekiant užtikrinti ir duomenų mokslinį patikimumą, ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neatliekami tol, kol atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą medžiagos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį odai. Tokius duomenis sudarys turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ardymo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba apie jų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (14)(15), be to, įteisintų ir priimtų in vitro arba ex vivo bandymų rezultatai (16)(17)(18). Ši analizė turėtų sumažinti poreikį in vivo bandyti tas medžiagas, apie kurių odos ardomąjį ar dirginamąjį poveikį jau turima pakankamai kitų tyrimų metu gautų duomenų. 4. Pirmenybė teikiama į šio metodo priedą įtrauktai nuosekliųjų bandymų strategijai, kurią sudaro įteisinti ir priimti in vitro arba ex vivo odos ardymo ar dirginimo bandymai. Strategiją parengė ir vienbalsiai rekomendavo EBPO seminaro dalyviai (19), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai sudarnintos cheminių medžiagų klasifikavimo sistemos (Globally Harmonised System, GHS) bandymų strategija (20). Rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos prieš pradedant in vivo bandymus. Naujoms medžiagoms rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagrįstiems duomenims apie medžiagos ardymo ar dirginimo savybes gauti. Turimoms medžiagoms, apie kurių odos ardymo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija turėtų būti taikoma, jei trūksta duomenų. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba sprendimas netaikyti nuoseklaus bandymų metodo turi būti pagrįstas. 5. Jei ardymo arba dirginimo savybių negalima nustatyti, atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę, atitinkančią nuoseklaus bandymo strategiją, reikėtų spręsti klausimą apie in vivo bandymą (žr. priedą). 6. Apibrėžimai: Odos dirginimas – išnykstantis odos pažeidimas, bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 4 h. Odos ardymas – neišnykstantis odos pažeidimas; būtent, matomoji nekrozė per epidermį ir odos nekrozė po bandomosios medžiagos uždėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Ardymo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas dėl jos šutimo, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti galima būtų atlikti histopatologinį tyrimą. 7. Bandymo metodo esmė: 7.1. Ant bandomo gyvūno odos dedama viena bandomosios medžiagos dozė; nepaveiktos gyvūno odos vietos naudojamos kontrolei. Nustatytais laiko tarpais nustatomas ir balais įvertinamas dirginimo ar ardymo laipsnis, kuris papildomai aprašomas, siekiant išsamiai įvertinti poveikį. Tyrimo trukmės turi pakakti stebimo poveikio grįžtamumui arba negrįžtamumui įvertinti. 7.2. Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuolatiniai sunkių kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi būti humaniškai numarinami, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal kuriuos priimamas sprendimas dėl humaniško gaištančių ir labai kenčiančių gyvūnų numarinimo, aprašyti (21) nuorodoje. II. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 8. Pasiruošimas in vivo bandymui: 8.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – triušis albinosas. Naudojami sveiki, jauni ir suaugę triušiai. Kitų rūšių naudojimas turi būti pagrįstas. 8.2. Gyvūnų ruošimas: 8.2.1. Maždaug 24 h prieš bandymą nuo gyvūno kūno juosmens nugaros srityje reikia pašalinti vilną, ją nukerpant arba nuskutant. Reikia stengtis nepažeisti odos ir naudoti tik tuos gyvūnus, kurių oda yra sveika ir nepažeista. 8.2.2. Kai kurių veislių triušiai turi tankių plaukų vietas, kurios labiau matomos tam tikrais metų laikais. Tokios tankių plau …