Neigiamas poveikis – bet koks su poveikiu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos. Vystymosi toksikologiją plačiausia prasme sudaro bet koks poveikis, kuris trukdo apvaisinto kiaušinėlio normaliam vystymuisi, prieš gimimą ir po jo.
\nAugimo pakitimas – palikuonio organo arba kūno masės ar dydžio pakitimas.
\nPakitimai (anomalijos) – struktūriniai vystymosi pakitimai, kuriuos sudaro išsigimimai ir nukrypimai (51).
\nIšsigimimas/didelė anomalija – struktūrinis pakitimas, laikomas kenksmingu gyvūnui (be to, gali būti mirtinas) ir paprastai retas.
\nNukrypimas/maža anomalija – struktūrinis pakitimas, kurio kenksmingas poveikis gyvūnui yra mažas arba jo visai nėra; gali būti laikinas ir gana dažnai pasitaikyti kontrolinėje populiacijoje.
\nApvaisintas kiaušinėlis – apvaisinto kiaušinėlio dalių visuma bet kurioje vystymosi stadijoje nuo apvaisinimo iki gimimo, įskaitant ekstraembrionines membranas, gemalą arba vaisių.
\nImplantacija (nidacija) – blastocistos susijungimas su gimdos epitelio gleivine, įskaitant jos prasiskverbimą per gimdos epitelį ir jos įaugimą į gleivinę.
\nGemalas – visų organizmų ankstyvoji arba vystymosi stadija, tiksliau apvaisinto kiaušinėlio vystymosi produktas nuo didžiosios ašies pasirodymo iki pagrindinių struktūrų atsiradimo.
\nToksiškas poveikis gemalui – kenksmingas poveikis normaliai struktūrai, vystymuisi, augimui ir (arba) gemalo gyvybingumui.
\nVaisius – apvaisintas palikuonis postembrioniniu laikotarpiu.
\nToksiškas poveikis vaisiui – kenksmingas poveikis normaliai struktūrai, vystymuisi, augimui ir (arba) vaisiaus gyvybingumui.
\nPersileidimas – apvaisintų produktų, gemalo arba negyvybingo vaisiaus priešlaikinis pašalinimas iš gimdos.
\nRezorbcija – reiškinys, kai gimdoje implantuotas apvaisintas kiaušinėlis žūsta ir yra rezorbuojamas arba buvo rezorbuotas.
\nAnkstyvoji rezorbcija – implantacijos pėdsakai be atpažįstamo gemalo ar vaisiaus.
\nVėlyvoji rezorbcija – žuvęs gemalas arba vaisius su išoriniais išsigimimą rodančiais pakitimais.
\nNOAEL (No observed adverse effect level) – nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygio santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė arba poveikio lygis, kuris nesukelia su poveikiu susijusių neigiamų pakitimų.
\n6.1. Paprastai bandomoji medžiaga leidžiama veisiančiai patelei ne vėliau kaip nuo implantacijos iki likus vienai parai iki numatyto numarinimo, kuris turi įvykti kiek įmanoma arčiau normalaus atsivedimo dienos, nerizikuojant prarasti duomenis, jei įvyktų priešlaikinis atsivedimas.
\n6.2. Bandymų metodas nėra skirtas tik organogenezės laikotarpiui tirti (pvz., 5-15 parų graužikams, 6-18 parų triušiams), juo taip pat tiriamas poveikis visą veisimo laikotarpį nuo ikiimplantacinio laikotarpio, jei tinka, iki likus vienai parai iki cezario pjūvio darymo. Prieš pat cezario pjūvio darymą patelės numarinamos, tiriamas gimdos turinys ir įvertinamos vaisiaus išoriškai matomos anomalijos bei minkštojo audinio ir griaučių pakitimai.
\nII. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 7. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:
\n7.1. Rekomenduojama bandymams pasirinkti tinkamiausią rūšį ir naudoti tas laboratorines rūšis bei veisles, kurios yra paprastai naudojamos atliekant toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi bandymus.
\n7.2. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkė, o ne graužikų – triušis. Kitos rūšies naudojimą būtina pagrįsti.
\n8.1. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3 °C) graužikams ir 18°C (± 3 °C) triušiams. Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.
\n8.2. Poruojama šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pageidautina suporuotus gyvūnus laikyti atskirai, tačiau leidžiamas laikymas nedidelėmis grupėmis.
\n9.1. Naudojami sveiki ir ankstesniuose bandymuose nedalyvavę gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras pratinami prie laboratorinių sąlygų. Apibūdinama bandomo gyvūno rūšis, veislė, jų tiekėjas, lytis, masė ir (arba) amžius. Kiek įmanoma, visų bandymo grupių gyvūnai turi būti vienodos kūno masės ir amžiaus. Kiekvienai dozei naudojamos jaunos, suaugusios neturėjusios palikuonių patelės.
\n9.2. Patelės poruojamos su tos pačios rūšies ir veislės patinais, be to, reikėtų vengti poravimo su tų pačių tėvų palikuonimis. Graužikams 0 veisimo diena yra vaginalinio kamščio ir (arba) spermos atsiradimo diena; triušiams 0 diena paprastai yra suporavimo arba dirbtinio apvaisinimo diena, jei taikomas šis metodas.
\n9.3. Apvaisintos patelės suskirstomos „aklos atrankos“ metodu į kontrolinę ir bandomąją grupę. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Kiekvienam gyvūnui turėtų būti priskirtas savitas identifikavimo numeris. Apvaisintos patelės nešališkai paskirstomos į kontrolinę ir bandymo grupes; jei patelės apvaisinamos grupėmis, kiekvienos grupės gyvūnai turi būti tolygiai paskirstomi į grupes. Patelės, apvaisintos to paties patino, panašiu būdu tolygiai paskirstomos tarp grupių.
\nIII. DARBO EIGA 10. Gyvūnų skaičius ir lytis:
\n10.1. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti pakankamas patelių skaičius, kad skrodžiant būtų maždaug 20 patelių su implantacijos vietomis.
\n10.2. Grupės, kuriose būtų mažiau kaip 16 patelių su implantacijos vietomis, gali netikti. Patelių žūties atvejai nebūtinai turi būti bandymo rezultatų negaliojimo priežastis, jei žuvusiųjų nėra daugiau kaip 10%.
\n11.1. Jei dozių ruošimui lengvinti naudojamas nešiklis arba kitas priedas, reikėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui arba išskyrimui; poveikį bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo charakteristikos; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.
\n11.2. Nešiklis neturi turėti toksiško poveikio vystymuisi ir reprodukcijai.
\n12.1. Paprastai bandomosios medžiagos reikėtų suleisti kasdien nuo implantacijos dienos (pvz., 5 paros po suporavimo) ir baigti dieną prieš numatytą cezario pjūvį. Jei išankstiniai tyrimai, kai jie buvo atlikti, nerodo, kad galimi ikiimplantaciniai nuostoliai, bandymą galima pratęsti ir įtraukti visą veisimo laikotarpį nuo suporavimo iki vienos paros prieš numatytą numarinimą. Gerai žinoma, kad netinkama priežiūra arba įtampa nėštumo metu gali būti prenatalinio vados netekimo priežastimi. Siekiant apsisaugoti nuo prenatalinio vados netekimo dėl veiksnių, nesusijusių su bandoma medžiaga, reikėtų be reikalo neiti prie patelių arba vengti išorinių veiksnių sukeliamos įtampos, pvz., triukšmo.
\n12.2. Turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir lygiagrečiai viena kontrolinė grupė. Sveiki gyvūnai paskirstomi „aklos atrankos“ metodu į kontrolinę ir bandomų gyvūnų grupes. Dozės koncentracijos turėtų skirtis taip, kad būtų galima graduoti toksiškumo poveikį. Jei nėra apribojimų dėl fizikinių cheminių arba biologinių bandomosios medžiagos savybių, didžiausia dozė pasirenkama siekiant sukelti tam tikrą toksišką poveikį vystymuisi ir (arba) patelei (klinikiniai požymiai arba kūno masės mažėjimas), bet ne žūtį arba sunkias kančias. Mažiausiai viena tarpinė dozė turėtų sukelti mažiausią stebimą toksišką poveikį. Mažiausia dozė neturėtų sukelti jokio toksiško poveikio patelei arba vaisiaus vystymuisi. Turi būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvieną su dozės lygiu susietą reakciją ir nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL). Mažėjančioms dozės koncentracijos vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo; tačiau norint naudoti labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10), dažnai gerai būtų pridėti ketvirtą bandymo grupę. Nors siekiama nustatyti NOAEL patelei, tyrimai, kuriais tokia koncentracija nenustatoma, gali būti taip pat priimtini (24).
\n12.3. Dozių koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis ir papildomą informaciją apie bandomosios medžiagos arba giminingų medžiagų apykaitą ir toksikokinetiką. Be to, ši informacija padės parodyti dozavimo režimo tinkamumą.
\n12.4. Lygiagrečiai naudojama kontrolinė grupė. Ši grupė turėtų būti medžiagos negaunanti kontrolinė grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai suleisti naudojamas nešiklis. Visoms grupėms turėtų būti suleidžiamas vienodas bandomosios medžiagos arba nešiklio tūris. Kontrolinės (-ių) grupės (-ių) gyvūnai prižiūrimi tokiu pat būdu, kaip ir bandymo grupės gyvūnai. Nešiklio kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiekį, atitinkantį didžiausią naudojamą kiekį (kokį gauna mažiausia doze veikiama grupė).
\n13.1. Jei atliekant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas per virškinimo traktą suleidus vienetinę mažiausiai 1000 mg/kg kūno masės per parą dozę, toksiškas poveikis veisiančiai patelei arba jos palikuonims nepastebimas ir jei tokio poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis (pvz., giminingos struktūros ir (arba) apykaitos junginių duomenis), nebūtina atlikti viso tyrimo naudojant tris dozių koncentracijas.
\n13.2. Atsižvelgiant į laukiamą poveikį žmonėms, ribiniam bandymui gali tekti naudoti didesnes dozių per virškinimo traktą koncentracijas. Kalbant apie kitus patekimo būdus, pvz., įkvėpimą arba poveikį per odą, bandomosios medžiagos fizikinės cheminės savybės dažnai gali apibrėžti ir riboti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį (pvz., dėjimas ant odos neturi sukelti sunkaus vietinio toksiško poveikio).
\n14.1. Bandomoji medžiaga arba nešiklis paprastai suleidžiama per virškinimo traktą zondu. Jei naudojamas kitas patekimo būdas, bandymų laboratorija turėtų pagrįsti sprendimą ir paaiškinti pasirinkimą, be to, padaryti atitinkamus būtinus pakeitimus (25)(26)(27). Bandomoji medžiaga turėtų būti suleidžiama kiekvieną dieną maždaug tuo pačiu metu.
\n14.2. Dozė kiekvienam gyvūnui paprastai turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į patį paskutinį jo svėrimą. Tačiau reikia imtis atsargumo priemonių reguliuojant dozes paskutinius tris veisimo mėnesius. Dozė pasirenkama atsižvelgiant į turimus duomenis, kad būtų išvengta per didelio toksiško poveikio patelei. Tačiau jei pastebimas per didelis toksiškas poveikis patelėms, tie gyvūnai turi būti humaniškai numarinami. Jei per didelio toksiškumo požymiai pasireiškia kelioms veisiančioms patelėms, reikėtų spręsti dėl šios dozės grupės numarinimo.
\n14.3. Vienetinė bandomosios medžiagos dozė gyvūnams suleidžiama skrandžio zondu arba tinkamu intubaciniu vamzdeliu. Didžiausias gyvūnui suleidžiamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Tūris neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima suleisti po 2 ml/100 g kūno masės. Jei kaip nešiklis naudojamas kukurūzų aliejus, tūris neturėtų būti didesnis kaip 0,4 ml/100 g kūno masės. Bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.
\n15.1. Klinikinis tyrimas atliekamas ir užrašai vedami mažiausiai kartą per dieną, geriau kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos suleidimo.
\n15.2. Aprašoma gyvūnų būklė, įskaitant žūties atvejus, liguistumą, atitinkamus elgesio pokyčius ir visus aiškaus toksiškumo požymius.
\n16.1. Gyvūnai sveriami 0 veisimo dieną arba ne vėliau kaip 3 veisimo dieną, jei suporuoti gyvūnai tiekiami iš išorinio veislyno, pirmąją dozavimo dieną, mažiausiai kas 3 dieną dozavimo laikotarpiu ir numatyto numarinimo dieną.
\n16.2. Maisto suvartojimas turėtų būti registruojamas kas tris paras ir turi sutapti su kūno masės nustatymu.
\n17.1. Patelės numarinamos dieną prieš numatomą atsivedimą. Patelės, kurioms prieš numatomą numarinimą pasireiškia persileidimo arba priešlaikinio atsivedimo požymiai, turėtų būti numarinamos ir atliekamas bendrasis makroskopinis tyrimas.
\n17.2. Numarintai arba atliekant tyrimą žuvusiai patelei turėtų būti atliekamas makroskopinis tyrimas visoms struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Darant cezario pjūvį ir vėlesnį vaisiaus tyrimą, pateles geriau būtų vertinti nežinant bandymo grupės, kad būtų kiek įmanoma sumažinta sisteminė paklaida.
\n18.1. Iš karto po numarinimo arba kiek įmanoma greičiau po patelės žūties gimda išimama gyvūno veisimo būsenai įvertinti. Gimdos, kuriose nėra veisimo požymių, turėtų būti papildomai tiriamos (pvz., graužikų atveju apdorojant amonio sulfidu arba Salewski metodu arba taikant kitą metodą triušiams) neveisimo būsenai patvirtinti (28).
\n18.2. Gimdos su vaisiumi, įskaitant kaklelį, pasveriamos. Gyvūnų, žuvusių atliekant tyrimą, gimdos su vaisiumi nesveriamos.
\n18.3. Turėtų būti nustatytas veisiančių patelių geltonkūnių (corpora lutea) skaičius.
\n18.4. Gimdos turinys tiriamas gemalo arba žuvusių ir gyvybingų vaisių skaičiui nustatyti. Turėtų būti apibudintas rezorbcijos laipsnis, siekiant nustatyti santykinį apvaisinto kiaušinėlio žūties laiką (žr. 4 skirsnį).
\n19.1. Nustatoma kiekvieno vaisiaus masė ir lytis. Tiriami kiekvieno vaisiaus išoriniai pakitimai (29).
\n19.2. Reikėtų ištirti vaisiaus griaučių ir minkštųjų audinių pakitimus (pvz., nukrypimus ir išsigimimus arba anomalijas) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47). Pageidautina, bet nereikalaujama klasifikuoti vaisiaus pakitimus. Jei klasifikuojama, turi būti aiškiai nurodyti kriterijai kiekvienai kategorijai apibrėži. Ypatingą dėmesį reikėtų atkreipti į lytinio dauginimosi trakto pakitimų požymius.
\n19.3. Kiekvienos graužikų vados pusė paruošiama griaučių pakitimams tirti. Likusi dalis paruošiama minkštų audinių pakitimų tyrimui ir jie tiriami taikant priimtus arba tinkamus serijinių pjūvių metodus arba kruopštaus bendrojo skrodimo metodus.
\n19.4. Jei naudojami ne graužikai, pvz., triušiai, tiriami visi vaisiai minkštų audinių ir griaučių pakitimams nustatyti. Vaisių kūnai įvertinami kruopščiai skrodžiant minkštų audinių pakitimams nustatyti, be to, gali būti įtrauktos metodikos papildomai įvertinti širdies vidinę struktūrą (48). Nupjaunama pusė tokiu būdu ištirtų vaisių galvų, kurios apdorojamos minkštųjų audinių pakitimams įvertinti (įskaitant akis, smegenis, nosies landas ir liežuvį), taikant standartinius serijinių pjūvių metodus (49) arba tokio paties jautrumo metodą. Šių vaisių kūnai ir likę sveiki vaisiai apdorojami ir tiriami jų griaučių pakitimai, taikant tuos pačius metodus, kurie aprašyti graužikams.
\nIV. DUOMENYS 20. Rezultatų apdorojimas:
\n20.1. Kiekvienos patelės bei jų palikuonių duomenys pateikiami suvedant į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei ir kiekvienai kartai nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba numarinimo laikas, veisiančių patelių skaičius, toksiško poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir bet kokio toksiško poveikio sunkumą, taikyti gemalo ar vaisiaus stebėjimų būdai ir atitinkami vados duomenys.
\n20.2. Skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti taikant atitinkamą statistinį metodą, naudojant vadą kaip duomenų analizės statistinį vienetą. Turi būti taikomas visuotinai priimtas statistinis metodas; statistiniai metodai pasirenkami kaip tyrimo schemos dalis ir turi būti pagrįsti. Turėtų būti pateikti duomenys apie gyvūnus, kurie neišgyveno iki numatyto numarinimo laiko. Prireikus šie duomenys gali būti naudojami grupių vidutinėms vertėms apskaičiuoti. Tokiems gyvūnams gautų duomenų tinkamumas ir jų įtraukimas arba neįtraukimas į kurios nors grupės vidurkį (-ius) turi būti pagrįstas kiekvienu atskiru atveju.
\n21.1. Toksiškumo prenataliniam vystymuisi tyrimas įvertinamas atsižvelgiant į stebimą poveikį. Įvertinimą turi sudaryti ši informacija:
\n21.1.1. patelės ir gemalo ar vaisiaus bandymo rezultatai, įskaitant ryšį tarp gyvūno veikimo bandomąja medžiaga ir bet kokio stebimo poveikio dažnumo ir sunkumo, arba tokio ryšio nebuvimą;
\n21.1.2. kriterijai, taikyti vaisiaus išorės, minkštųjų audinių ir griaučių pakitimams klasifikuoti, jei buvo klasifikuojama;
\n21.1.3. prireikus, ankstesni duomenys apie kontrolinius gyvūnus tyrimo rezultatų interpretavimui pagerinti;
\n21.1.4. skaičiai, naudoti visoms procentinėms dalims arba rodikliams apskaičiuoti;
\n21.1.5. atitinkama tyrimo rezultatų statistinė analizė, jei reikia, kurioje pakaktų informacijos apie analizės metodą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.
\n21.2. Visuose tyrimuose, kuriuos atliekant negauta jokio toksiško poveikio, turėtų būti numatyti papildomi tyrimai bandomosios medžiagos absorbcijai ir biologiniam kaupimuisi nustatyti.
\n22.1. Toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi tyrimas suteiks informacijos apie poveikį patelėms veisimo metu ir jų palikuonių vystymuisi gimdoje dėl kartotinio poveikio medžiaga. Tyrimo rezultatus reikėtų interpretuoti atsižvelgiant į rezultatus, gautus atliekant pusiau lėtinio toksiškumo, toksiško poveikio reprodukcijai ir toksikokinetinius tyrimus.
\n22.2. Kadangi iš esmės tiriamas bendrasis toksiškumas, kaip toksiškas poveikis patelėms, ir toksiškas poveikis vystymuisi, jo rezultatai leis tam tikru laipsniu atskirti poveikį vystymuisi, nesant bendrojo toksiškumo, ir poveikį, kuris sukeliamas esant koncentracijai, kuri sukelia toksišką poveikį patelei (50).
\nV. ATASKAITOS RENGIMAS 23. Bandymo ataskaitą turi sudaryti ši konkreti informacija:
\n23.1. Bandomoji medžiaga:
\n23.1.1. fizikinė būsena ir, jei reikia, fizikinės cheminės savybės;
\n23.1.2. identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį, jei žinomas ar priskirtas;
\n23.1.3. grynumas.
\n23.2. Nešiklis (jei naudojamas), nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.
\n23.3. Bandymo gyvūnai:
\n23.3.1. naudota rūšis ir veislė;
\n23.3.2. gyvūnų skaičius ir amžius;
\n23.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t.;
\n23.3.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje.
\n23.4. Bandymo sąlygos:
\n23.4.1. dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas;
\n23.4.2. detalės apie bandomosios medžiagos preparato ruošimą arba jos dėjimą į pašarą, gauta koncentracija, preparato stabilumas ir vienalytiškumas;
\n23.4.3. bandomosios medžiagos suleidimo detalės;
\n23.4.4. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/ kg kūno masės per parą), jei tinka;
\n23.4.5. aplinkos sąlygos;
\n23.4.6. pašaro ir vandens kokybės detalės.
\n23.5. Rezultatai:
\n23.5.1. Toksiško poveikio patelei duomenys atsižvelgiant į dozę. Neapsiriboti šiais rezultatais:
\n23.5.1.1. gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, išgyvenusių gyvūnų skaičius, veisiančių patelių skaičius, persileidimų ir priešlaikinių atsivedimų skaičius;
\n23.5.1.2. žūties atliekant tyrimą diena arba iki numarinimo išgyvenusių gyvūnų skaičius;
\n23.5.1.3. duomenys apie gyvūnus, neišgyvenusius iki numatyto numarinimo, pranešami, bet neįtraukiami į statistinį grupių palyginimą;
\n23.5.1.4. visų anomalių klinikinių požymių pastebėjimo diena ir jų vėlesnė eiga;
\n23.5.1.5. kūno masė, kūno masės kitimas ir gimdos su vaisiumi masė, įskaitant, neprivalomai, kūno masės kitimą su pataisa gimdos su vaisiumi masei;
\n23.5.1.6. pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas;
\n23.5.1.7. skrodimo rezultatai, įskaitant gimdos masę;
\n23.5.1.8. patelei ir vystymuisi gautos NOAEL vertės.
\n23.5.2. Toksiško poveikio vystymuisi duomenys pagal dozę vadoms su implantais, įskaitant:
\n23.5.2.1. geltonkūnių skaičių;
\n23.5.2.2. implantacijų skaičių, gyvų ir žuvusių vaisių bei rezorbcijų skaičių ir procentinę dalį;
\n23.5.2.3. priešimplantacinių ir poimplantacinių nuostolių skaičių ir procentinę dalį.
\n23.5.3. Toksiško poveikio vystymuisi duomenys pagal dozę vadoms su gyvais vaisiais, įskaitant:
\n23.5.3.1. gyvų palikuonių skaičių ir procentinę dalį;
\n23.5.3.2. lyčių santykį;
\n23.5.3.3. vaisiaus kūno masę, pageidautina pagal lytį ir abiejų lyčių kartu;
\n23.5.3.4. išorinius, minkštųjų audinių ir griaučių išsigimimus ir kitus svarbius pakitimus;
\n23.5.3.5. klasifikavimo kriterijus, jei tinka;
\n23.5.3.6. vaisių ir vadų, turinčių kokių nors išorinių, minkštųjų audinių arba griaučių pakitimų, visą skaičių ir procentinę dalį, be to, kiekvienos anomalijos ir kitų atitinkamų pakitimų tipus ir dažnumą.
\n23.6. Rezultatų aptarimas.
\n23.7. Išvados.
\nVI. NUORODOS 24. Kavlock R. J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for Developmental Toxicity. Risk Analysis 16; 399-410.
\n3.1. Kelioms patinų ir patelių grupėms suleidžiamos skirtingos bandomosios medžiagos dozės. P kartos patinai turėtų gauti dozę augdami ir mažiausiai vieną visą spermatogenezės ciklą (maždaug 56 paras pelėms ir 70 parų žiurkėms), kad būtų galima gauti informacijos apie neigiamą poveikį spermatogenezei. Poveikis spermai yra nustatomas pagal kelis spermos parametrus (pvz., spermos morfologiją ir spermatozoidų judrumą), audinių preparatuose ir atliekant detalų histopatologinį tyrimą. Jei duomenys apie spermatogenezę yra gauti ankstesniame pakankamos trukmės kartotinos dozės tyrime, pvz., 90 parų tyrime, P kartos patinus nebūtina įtraukti į įvertinimą. Tačiau rekomenduojama išsaugoti P kartos spermos ėminius arba skaitmeninius užrašus, kad juos vėliau galima būtų įvertinti. P kartos patelės turi gauti dozę augdamos ir kelis visus rujos ciklus, kad būtų galima nustatyti bet kokį neigiamą bandomosios medžiagos poveikį normaliam rujos ciklui. Bandomoji medžiaga suleidžiama tėvų kartos (P) gyvūnams poruojantis, veisimo metu ir iki jų F1 palikuonių atjunkymo. Po atjunkymo medžiaga toliau suleidžiama F1 palikuonims iki jų subrendimo, poravimosi ir, atsiradus F2 kartai, iki šios kartos palikuonių atjunkymo.
\n3.2. Visiems gyvūnams atliekami klinikiniai stebėjimai ir patologiniai tyrimai toksiškumo požymiams nustatyti, kreipiant ypač didelį dėmesį į poveikį patinų ir patelių reprodukcijos sistemų vientisumui ir veiksmingumui bei palikuonių augimui ir vystymuisi.
\nII. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 4. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:
\n4.1. Tinkamiausia bandymo gyvūnų rūšis yra žiurkės. Jei naudojama kita rūšis, pasirinkimas turi būti pagrįstas ir atliekami atitinkami reikalingi pakeitimai.
\n4.2. Neturi būti naudojamos mažo vaisingumo veislės arba veislės, kurioms dažnai pasireiškia vystymosi trūkumai. Tyrimo pradžioje naudojamų gyvūnų masės skirtumas turi būti kiek įmanoma mažesnis ir kiekvienai lyčiai neturi būti didesnis kaip 20% vidutinės masės.
\n5.1. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22°C (± 3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją medžiagą, jai patenkant šiuo būdu.
\n5.2. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis. Poruojama turi būti šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pasitvirtinus susiporavimui, suporuotos patelės turi būti laikomos po vieną atsivedimo arba veisimo narveliuose. Suporuotos žiurkės gali būti laikomos mažomis grupėmis ir atskiriamos likus vienai arba dviem paroms iki atsivedimo. Artėjant atsivedimui, suporuotos patelės turi būti aprūpinamos atitinkamais ir nustatytais pakratais.
\n6.1. Naudojami jauni ir sveiki, ankstesniuose bandymuose nedalyvavę gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras yra pratinami prie laboratorijos sąlygų. Apibūdinama bandymo gyvūno rūšis, veislė, jų tiekėjas, lytis, kūno masė ir (arba) amžius. Turi būti žinoma visų gyvūnų tarpusavio giminystė, kad būtų išvengta vienų tėvų gyvūnų poravimosi. Gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į kontrolinę ir bandymo grupę (rekomenduojama grupuoti taikant sluoksniavimą pagal kūno masę). Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Kiekvienas gyvūnas turi turėti savo identifikavimo numerį. P kartos gyvūnams numeris suteikiamas prieš suleidžiant bandomąją medžiagą. F1 kartos poravimui pasirinktiems gyvūnams numeris suteikiamas po jų atjunkymo. Duomenys apie visų pasirinktų F1 gyvūnų kilmės vadą turi būti registruojami. Be to, rekomenduojama kiek įmanoma anksčiau identifikuoti kiekvieną žiurkiuką, kai numatoma atskirai juos sverti arba atlikti kokius nors funkcinius bandymus.
\n6.2. Pradėjus leist dozes tėvų kartos (P) gyvūnams jie turi būti maždaug 5–9 savaičių. Visų bandomųjų grupių gyvūnai turi būti kiek įmanoma vienodos masės ir amžiaus.
\nIII. DARBO EIGA 7. Gyvūnų skaičius ir lytis:
\n7.1. Kiekvienoje bandymo ir kontrolinėje grupėje turi būti pakankamas patelių skaičius, kad atsivedimo momentu arba jam artėjant būtų ne mažiau kaip 20 veisiančių patelių. Tai gali būti neįmanoma bandant medžiagas, sukeliančias nepageidaujamą su bandoma medžiaga siejamą poveikį (pvz., nevaisingumą, per didelį toksiškumą esant didelei dozei).
\n7.2. Tikslas – gauti pakankamą atsivedančių patelių skaičių, kad būtų galima reikšmingai įvertinti, kokia yra bandomosios medžiagos geba paveikti vaisingumą, veisimą, motinos elgesį, žindymą, F1 palikuonio augimą ir vystymąsi nuo apvaisinimo iki subrendimo ir jo palikuonių (F2) vystymąsi iki atjunkymo. Todėl nepavykus gauti norimą veisiančių patelių skaičių (t.y. 20), tyrimas nebūtinai bus netinkamas ir turi būti vertinamas atsižvelgiant į kiekvieną individualų atvejį.
\n8.1. Rekomenduojama bandomąją medžiagą duoti šeriant, girdant arba suleidžiant zondu, išskyrus kai manoma, kad tinkamesnis būtų kitas patekimo būdas (pvz., per odą arba įkvepiant).
\n8.2. Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama visais įmanomais atvejais iš pradžių tirti galimybę naudoti vandeninį tirpalą ar suspensiją, vėliau tirpalą ar emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi būti žinomos nešiklio, išskyrus vandenį, toksiškumo savybės. Turėtų būti nustatytas bandomosios medžiagos stabilumas nešiklyje.
\n9.1. Turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir lygiagrečiai viena kontrolinė grupė. Jei nėra apribojimų dėl fizikinių cheminių arba biologinių bandomosios medžiagos savybių, didžiausia dozė pasirenkama siekiant sukelti tam tikrą toksišką poveikį, bet ne žūtį arba sunkias kančias. Nelaukto žūstamumo atveju, tyrimai, kuriuose tėvų kartos (P) gyvūnų žūstamumas yra maždaug kaip 10% mažesnis, paprastai yra dar priimtini. Turi būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka, siekiant parodyti kiekvieną su doze susietą reakciją ir nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL – no observed adverse effect level). Mažėjančioms dozės koncentracijos vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo ir dažnai geriau būtų papildomai naudoti ketvirtą bandymo grupę, užuot naudojus labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Atliekant su pašaru duodamos medžiagos tyrimus, dozės neturėtų skirtis daugiau kaip 3 kartus. Dozė turėtų būti pasirenkama atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis, ypač kartotinų dozių tyrimo rezultatus. Be to, reikėtų nagrinėti visą papildomą informaciją apie bandomojo junginio arba giminingų medžiagų apykaitą ir kinetiką. Kartu ši informacija padėtų parodyti dozavimo režimo tinkamumą.
\n9.2. Kontrolinė grupė turėtų būti medžiagos negaunanti grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai medžiagai suleisti naudojamas nešiklis. Išskyrus tai, kad kontrolinės grupės gyvūnai nepaveikiami bandomąja medžiaga, jie prižiūrimi tokiu pat būdu, kaip ir bandymo grupės gyvūnai. Jei naudojamas nešiklis, kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiekį, atitinkanti didžiausią naudojamą tūrį. Jei bandomoji medžiaga duodama šeriant ir dėl to sumažėja pašaro suvartojimas arba įsisavinimas, gali tekti naudoti lygiagrečiai šeriamą kontrolinę grupę. Vietoj lygiagrečiai šeriamos kontrolinės grupės galima naudoti duomenis, gautus kontroliuojamuose tyrimuose, skirtuose įvertinti sumažėjusio pašaro suvartojimo įtaką reprodukcijos parametrams.
\n9.3. Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kitų priedų savybes: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui; poveikį bandomosios medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.
\n10.1. Jei atliekant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas per virškinimo traktą suleista vienetinė mažiausiai 1000 mg/kg kūno masės per parą dozė arba atitinkamos procentinės dalies dozė duodama šeriant arba girdant nesukelia pastebimo neigiamo toksiško poveikio tėvų grupių gyvūnams arba jų palikuonims ir jei tokio poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis apie giminingos struktūros ir (arba) apykaitos junginius, nebūtina atlikti visą tyrimą, naudojant kelias dozių koncentracijas.
\n10.2. Kai poveikis žmonėms rodo, kad reikia per virškinimo traktą suleisti didesnes dozes, ribinis bandymas neatliekamas. Kalbant apie kitus patekimo būdus, pvz., įkvėpimą arba poveikį per odą, bandomosios medžiagos fizikinės cheminės savybės dažnai gali apibrėžti ir riboti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį.
\n11.1. Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos dozę septynias dienas per savaitę. Geriau suleisti zondu arba duoti šeriant ar girdant. Jei medžiaga patenka kitu būdu, jis turi būti pagrįstas, be to, gali tekti atlikti atitinkamus pakeitimus. Atitinkamu bandymo laikotarpiu medžiagos dozės patekimo būdas turi būti tas pats. Kai bandomoji medžiaga suleidžiama zondu, reikia naudoti skrandžio vamzdelį. Vienu metu suleidžiamo skysčio tūris neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės (0,4 ml/100 g kūno masės yra didžiausias kiekis naudojant kukurūzų aliejų), išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima suleisti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ardančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus. Atliekant tyrimus su zondu, žiurkiukai dažniausiai gauna bandomosios medžiagos netiesiogiai su pienu tol, kol atjunkyti patys pradeda gauti dozes. Jei tyrimai atliekami medžiagą dedant į pašarą arba geriamąjį vandenį, žiurkiukai papildomai gauna bandomosios medžiagos tiesiogiai, kai paskutinę laktacijos laikotarpio savaitę jie pradeda ėsti patys.
\n11.2. Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrukdytų įprastam maitinimuisi arba vandens pusiausvyrai. Kai bandomoji medžiaga duodama šeriant, galima naudoti pastovią koncentraciją (ppm) arba pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudotas variantas turi būti nurodytas. Jei medžiaga suleidžiama zondu, dozė turėtų būti suleidžiama kiekvieną dieną panašiu laiku ir reguliuojama mažiausiai kartą per savaitę pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Reikėtų atsižvelgti į informaciją dėl placentinio pasiskirstymo, reguliuojant zondu suleidžiamą dozę, nustatomą pagal gyvūno masę.
\n12.1. Kasdieninės dozės tėvų kartos (P) patinams ir patelėms pradedamos leisti, kai jie sulaukia 5–9 savaičių. Kasdieninės F1 patinų ir patelių dozės pradedamos leisti po atjunkymo; reikėtų turėti omenyje, kad tais atvejais, kai bandomoji medžiaga patenka su pašaru arba geriamuoju vandeniu, tiesioginis F1 kartos žiurkiukų poveikis bandomąja medžiaga gali vykti laktacijos laikotarpiu. Abiem lytims (P ir F1) dozės turi būti toliau leidžiamos mažiausiai 10 savaičių prieš poravimo laikotarpį. Dozės toliau leidžiamos abiem lytims 2 savaites poravimosi laikotarpiu. Kai patinai nebereikalingi įvertinant poveikį reprodukcijai, jie turi būti humaniškai numarinami ir ištiriami. Tėvų kartos (P) patelėms dozės leidžiamos toliau visą veisimo laiką ir iki F1 palikuonių atjunkymo. Reikėtų atsižvelgti į dozavimo programos pakeitimus, pagrįstus turima informacija apie bandomąją medžiagą, įskaitant turimus toksiškumo, medžiagų apykaitos indukcijos arba biologinio kaupimosi duomenis. Kiekvieno gyvūno dozė paprastai turėtų būti pagrįsta pačiu paskutiniu kiekvieno gyvūno kūno masės nustatymu. Tačiau reikia imtis atsargumo priemonių reguliuojant dozes paskutinius tris veisimo mėnesius.
\n12.2. P ir F1 kartų patinų ir patelių veikimas tęsiamas iki jų numarinimo. Visi P ir F1 suaugę patinai ir patelės turi būti humaniškai numarinami, kai jų nebereikia norint įvertinti poveikį reprodukcijai. Visi poravimui nepasirinkti F1 palikuonys ir visi F2 palikuonys po atjunkymo turi būti humaniškai numarinami.
\n13.1. Tėvų kartos (P) poravimas:
\n13.1.1. Kiekvienam suporavimui patelė atskirai uždaroma į narvelį su vienu tą pačią dozę gaunančiu patinu (1:1 poravimas) tol, kol jie susiporuoja, arba 2 savaitėms. Kiekvieną dieną patelės tiriamos dėl spermos arba makšties kamščių atsiradimo. 0 veisimo diena apibrėžiama kaip diena, kai randama spermos arba makšties kamštis.
\n13.1.2. Jei poravimas nesėkmingas, galima būtų spręsti dėl pakartotino patelių poravimo su patikrintais tos pačios grupės patinais. Pateikiant duomenis poruojamos poros turi būti aiškiai identifikuotos. Reikėtų vengti vienų tėvų palikuonių poravimo.
\n13.2. F1 kartos poravimas:
\n13.2.1. Norint poruoti F1 kartos palikuonis F2 kartai gauti, atjunkimo metu iš kiekvienos vados pasirenkamas mažiausiai vienas patinas ir viena patelė poravimui su kitais tą pačią dozę gavusiais kitos vados žiurkiukais. Kiekvienos vados žiurkiukai pasirenkami „aklos atrankos“ metodu, jei vienoje vadoje nėra reikšmingų kūno masės arba išvaizdos skirtumų. Tais atvejais, kai skirtumų yra, pasirenkami geriausi kiekvienos vados atstovai. Praktiškai tai geriausiai būtų daryti pagal kūno masę, bet gali labiau tikti atranka pagal išvaizdą. F1 palikuonys poruojami tik pasiekę lytinę brandą.
\n13.2.2. Turėtų būti įvertintos poros be palikuonių, siekiant nustatyti aiškią nevaisingumo priežastį. Šiam tikslui galbūt reikėtų taikyti metodikas, numatančias papildomo poravimo galimybes su kitais patikrintais patinais arba patelėmis, dauginimosi organų mikroskopinį tyrimą ir rujos ciklų arba spermatogenezės tyrimą.
\n13.3. Antrasis poravimas:
\n13.3.1. Tam tikrais atvejais, pvz., kai dėl poveikio pakinta vados dydis arba pastebimas neaiškus poveikis per pirmąjį poravimą, rekomenduojama P arba F1 kartų suaugusius gyvūnus dar kartą poruoti naujai vadai gauti.
\n13.3.2. Rekomenduojama dar kartą poruoti palikuonių neturėjusias pateles arba patinus su patikrintais priešingos lyties gyvūnais, skirtais veisimui. Jei laikoma, kad yra būtina bet kurios kartos antroji vada, gyvūnai turėtų būti poruojami praėjus savaitei nuo paskutinės vados atjunkymo.
\n13.4. Vados dydis:
\n13.4.1. Gyvūnams leidžiama normaliai atsivesti vadą ir auginti palikuonis iki atjunkymo.
\n13.4.2. Standartizuoti vados dydį neprivaloma. Standartizavus vados dydį, detaliai aprašomas taikytas metodas.
\nIV. STEBĖJIMAI 14. Klinikiniai stebėjimai:
\n14.1. Bendrasis klinikinis stebėjimas atliekamas kasdieną, o nustatant suleidimo zondu laiką, reikėtų atsižvelgti į didžiausio laukiamo poveikio po medžiagos suleidimo laiką. Turi būti aprašomi visi elgesio pokyčiai, sunkaus arba ilgesnio atsivedimo požymiai ir visi toksiškumo požymiai.
\n14.2. Mažiausiai kas savaitę turėtų būti atliekamas papildomas detalesnis kiekvieno gyvūno tyrimas, kurį patogu atlikti gyvūną sveriant. Du kartus per dieną ir prireikus kartą per dieną savaitgaliais visi gyvūnai turi būti stebimi liguistumo požymiams ir mirtingumui nustatyti.
\n15.1. Tėvų kartų (P ir F1) gyvūnai sveriami pirmąją dozės suleidimo dieną ir vėliau mažiausiai kartą per savaitę. Tėvų kartos (P ir F1) patelės sveriamos ne mažiau kaip 0, 7, 14, ir 20 arba 21 veisimo dieną, laktacijos metu sveriamos tomis pačiomis dienomis, kaip ir vada, ir gyvūnų numarinimo dieną. Šie rezultatai turi būti pateikiami ataskaitoje atskirai apie kiekvieną suaugusį gyvūną.
\n15.2. Poravimo ir veisimo laikotarpiu pašaro suvartojimas turi būti matuojamas mažiausiai kas savaitę. Vandens suvartojimas matuojamas mažiausiai kas savaitę, jei bandomoji medžiaga patenka su vandeniu.
\n16.1. P ir F1 kartų patelių rujos ciklo trukmė ir normalumas įvertinamas prieš suporavimą ir, nebūtinai, poravimo metu darant makšties tepinėlius tol, kol bus gautas suporavimo įrodymas.
\n16.2. Makšties ar gimdos kaklelio ląstelės turi būti imamos atsargiai, kad nebūtų pažeista gleivinė ir tokiu būdu nebūtų sukeltas netikras veisimas (27).
\n17.1. Užrašoma visų numarintų P ir F1 patinų sėklidžių ir antsėklidžių masė ir vienas kiekvieno organo pavyzdys paliekamas histopatologiniam tyrimui (žr. 20, 21, 22 skirsnius). Iš kiekvienos P ir F1 patinų grupės bent 10 gyvūnų pogrupio sėklidės ir antsėklidžiai naudojami homogenizavimui atsparioms spermatidėms ir antsėklidžių uodegoje sukauptiems spermatozoidams suskaičiuoti. Turi būti surinkta to paties pogrupio patinų sperma iš antsėklidžių uodegos arba iš sėklinio latako spermos judrumui ir morfologijai įvertinti. Jei pastebimas su bandoma medžiaga susijęs poveikis arba jei yra kituose tyrimuose gautų duomenų apie galimą poveikį spermatogenezei, turėtų būti tiriama visų kiekvienos dozės grupės patinų sperma; priešingu atveju galima apsiriboti kontrolinės grupės ir didžiausios dozės grupės P ir F1 patinų spermatozoidų skaičiavimu.
\n17.2. Skaičiuojamas bendras homogenizavimui atsparių sėklidžių spermatidžių ir antsėklidžių uodegos spermatozoidų skaičius (28)(29). Spermos atsargas uodegoje galima apskaičiuoti pagal suspensijos, naudojamos kokybiniam įvertinimui, spermatozoidų koncentraciją ir tūrį, ir spermatozoidų, išgautų vėliau sumalant ir (arba) homogenizuojant likusį uodegos audinį, skaičių. Visų dozių patinų grupių pasirinktų pogrupių gyvūnų spermatozoidai skaičiuojami iškart po gyvūnų numarinimo, išskyrus kai filmuojama analoginiu arba skaitmeniniu būdu arba kai bandiniai yra užšaldomi ir analizuojami vėliau. Šiais atvejais kontrolinės ir didelės dozės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei su bandomąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio spermatozoidų skaičiui, judrumui arba morfologijai) nėra, kitų grupių analizuoti nebūtina. Jei didelę dozę gavusioje grupėje pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis, reikia įvertinti ir mažesnių dozių grupes.
\n17.3. Antsėklidžio (arba sėklinio latako) spermatozoidų judrumas įvertinimas arba filmuojamas iš karto po numarinimo. Sperma turi būti išgauta, kiek įmanoma mažinant galimybę jai pakenkti ir skiedžiama judrumui analizuoti, taikant tinkamus metodus (30). Subjektyviai arba objektyviai įvertinama vis labiau judresnių spermatozoidų procentinė dalis. Kai daroma kompiuterinė judėjimo analizė (31)(32)(33)(34)(35)(36), didėjantis judrumas nustatomas pagal vartotojo nustatytas ribines vertes vidutiniam greičiui išilgai trajektorijos ir tiesiškumui arba tiesiškumo indeksui. Jei ėminiai filmuojami (37) arba skrodimas įrašinėjamas kitu būdu, vėliau galima analizuoti tik kontrolinę ir didelę dozę gavusių P ir F1 patinų grupes, išskyrus kai pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis; šiuo atveju dar reikia įvertinti mažesnių dozių grupes. Neturint analoginio arba skaitmeninio vaizdo įrašo, visi visų bandomųjų grupių ėminiai analizuojami atliekant skrodimą.
\n17.4. Daromas antsėklidžio (arba sėklinio latako) spermos ėminio morfologinis įvertinimas. Spermatozoidai (bent 200 vienam ėminiui) ištiriami kaip fiksuoti preparatai bei skystoje terpėje (38) ir klasifikuojami kaip normalūs arba nenormalūs. Morfologinės spermatozoidų anomalijos būtų spermatozoidų sulipimas, izoliuotos galvutės ir deformuotos galvutės ir (arba) uodegėlės. Įvertinami visų dozių grupių pasirinktų pogrupių patinai iš karto po gyvūnų numarinimo arba vėliau pagal analoginius arba skaitmeninius vaizdo įrašus.
\n17.5. Fiksuotus tepimus galima analizuoti ir vėliau. Šiais atvejais kontrolinių ir didžiausios dozės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei su bandomąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio spermatozoidų morfologijai) nėra, kitų grupių analizuoti nebūtina. Jei didelę dozę gavusioje grupėje pastebimas su bandomąja medžiaga susijęs poveikis, reikia įvertinti ir mažesnių dozių grupes.
\n17.6. Jei kuris nors iš pirmiau išvardytų spermos įvertinimo parametrų jau buvo tiriamas atliekant bent 90 parų sisteminio toksiškumo tyrimą, šio įvertinimo nebūtina kartoti atliekant dviejų kartų tyrimą. Tačiau rekomenduojama pasilikti P kartos spermos ėminius arba skaitmeninius vaizdo įrašus, kad prireikus būtų galima įvertinti vėliau.
\n18.1. Kiekviena vada tiriama kiek įmanoma greičiau po atsivedimo (0 laktacijos para) norint nustatyti žiurkiukų skaičių ir lytį, negyvagimius, gyvus palikuonis ir tai, ar yra išsigimimų. Nulinę parą rasti negyvi žiurkiukai, jei jie nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir žūties priežasčiai nustatyti, vėliau užkonservuojami. Gyvi žiurkiukai suskaičiuojami, kiekvienas pasveriamas atsivedimo metu (0 laktacijos para) arba pirmą parą, o vėliau – reguliariai, pvz., 4, 7, 14, ir 21 laktacijos parą. Aprašomos pastebėtos patelių arba palikuonių fizinės ir elgesio anomalijos.
\n18.2. Palikuonių fizinis vystymasis daugiausia registruojamas pagal kūno masės padidėjimą. Kiti fiziniai parametrai (pvz., ausų ir akių atsivėrimas, dantų prasikalimas, kailio augimas) gali suteikti papildomos informacijos, tačiau šiuos duomenis būtų geriau vertinti registruojant lytinio brendimo duomenis (pvz., amžius ir kūno masė makšties atsidarymo arba apyvarpės atsiskyrimo metu) (39). Rekomenduojama atlikti F1 palikuonių funkcinius tyrimus (pvz., motorinio aktyvumo, sensorinės funkcijos, refleksų ontogenezės) prieš ir po atjunkimo, visų pirma, susietus su lytiniu brendimu, jei tokia analizė neįtraukta į atskirus tyrimus. Nustatomas poravimui pasirinktų F1 atjunkytų gyvūnų makšties atsidarymo ir apyvarpės atsiskyrimo laikas. Išmatuojamas F2 žiurkiukų anogenitalinis atstumas nulinę parą po gimimo, jei buvo nustatytas F1 lyčių santykio arba lytinio subrendimo laiko pakitimas.
\n18.3. Funkcinių stebėjimų galima neatlikti tose grupėse, kuriose yra aiškių neigiamo poveikio požymių (pvz., reikšmingas masės didėjimo sumažėjimas ir t. t.). Jei atliekami funkciniai tyrimai, jie neatliekami poravimui atrinktiems žiurkiukams.
\n19.1. Numarinti arba atliekant tyrimą žuvę visi tėvų kartos (P ir F1) gyvūnai, visi žiurkiukai su išorinėmis anomalijomis arba klinikiniais požymiais, be to, „aklos atrankos“ metodu pasirinktas iš kiekvienos F1 ir F2 kartos žiurkiukas ar lyties atstovas ar vada tiriama makroskopiškai struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Ypatingas dėmesys kreipiamas į reprodukcijos sistemos organus. Humaniškai numarinti leisgyviai žiurkiukai ir negyvi žiurkiukai, jei nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir žūties priežasčiai nustatyti, vėliau užkonservuojami.
\n19.2. Tiriama visų pirmą kartą gimdžiusių patelių gimda implantavimo vietų buvimui ir skaičiui nustatyti, stengiantis nepakenkti histopatologiniam įvertinimui.
\n20.1. Numarinus nustatoma visų P ir F1 kartų tėvų kūno ir šių organų masė (poriniai organai sveriami atskirai): gimdos, kiaušidžių; sėklidės, antsėklidžio (viso ir uodegos); prostatos; sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis ir jų skysčiais ir prostatos (kaip vieno vieneto); smegenų, kepenų, inkstų, blužnies, hipofizio, skydliaukės, antinksčių liaukų ir žinomų veikiamų organų.
\n20.2. Po numarinimo nustatoma skrodimui pasirinktų F1 ir F2 žiurkiukų kūno masė. Sveriami šie vieno „aklos atrankos“ metodu pasirinkto žiurkiuko ar lyties ar vados (žr. 19 skirsnį) organai: smegenys, blužnis ir užkrūčio liauka.
\n20.3. Bendrojo skrodimo ir organų masės rezultatai įvertinami atsižvelgiant į stebėjimus kitų kartotinės dozės tyrimų metu, jei įmanoma.
\n21.1. Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir atitinkamoje terpėje konservuojami šie tėvų (P ir F1) kartos gyvūnų organai ir audiniai arba jų tipiniai ėminiai:
\n21.1.1. makštis, gimda ir kaklelis, kiaušidės (konservuojamos atitinkame fiksatoriuje);
\n21.1.2. viena sėklidė (konservuojama Bouino arba panašiame fiksatoriuje), vienas antsėklidis, sėklinės pūslelės, prostata ir koagulianto liaukos;
\n21.1.3. visų poravimui pasirinktų P ir F1 gyvūnų organas (-ai), ankstesniuose tyrimuose identifikuotas (-i) kaip organas (-i) – taikinys (-iai).
\n21.2. Atliekami išsamūs histopatologiniai visų poravimui pasirinktų P ir F1 gyvūnų, priklausančių kontrolinėms ir didelės dozės grupėms, užkonservuotų organų ir audinių tyrimai. P gyvūnų kiaušidžių tyrimas neprivalomas. Dar tiriami mažos bei vidutinės dozės grupių organai, kuriems pasireiškia su bandomąja medžiaga siejami pakitimai, kad būtų lengviau nustatyti NOAEL. Be to, atliekamas histopatologinis mažos ir vidutinės dozės grupių gyvūnų, kuriems įtariamas sumažėjęs vaisingumas, pvz., kurie negalėjo susiporuoti, pastoti, būti reproduktoriumi arba atsivesti sveikus palikuonis, arba kurių rujos ciklas arba spermatozoidų skaičius, judrumas arba morfologija buvo paveikti, reprodukcijos organų įvertinimas. Turi būti ištirti visi dideli pažeidimai, pvz., atrofija arba augliai.
\n21.3. Atliekamas išsamus sėklidžių histopatologinius tyrimas (pvz., naudojant Bouino fiksatorių, į parafiną įlietus ėminius ir 4–5 mium storio skersinius pjūvius), siekiant nustatyti su bandomąja medžiaga susietą poveikį, pvz., spermatidžių sulaikymą, gemalų ląstelių sluoksnių arba tipų trūkumą, daugiabranduoles dideles ląsteles arba spermatogeninių ląstelių atitrūkimą į prošvaisą (40). Nepaliesto antsėklidžio tyrimas, tiriant galvutę, kūną ir uodegą, gali būti atliekamas įvertinant išilginį pjūvį. Antsėklidis įvertinamas leukocitų infiltracijai, ląstelių vyraujančių tipų pokyčiui, netipiškoms ląstelėms ir spermatozoidų fagocitozei nustatyti. Patinų reprodukcijos organų tyrimui gali būti naudojamas dažymas jodo perrūgšties ir Šifo reagentu arba hematoksilinu.
\n21.4. Po laktacijos kiaušidėje turi būti pirminiai ir augantys folikulai ir dideli laktacijos geltonkūniai. Atliekant histopatologinį tyrimą turėtų būti nustatytas kokybinis pirminių folikulių populiacijos sumažėjimas. F1 patelėms atliekamas kiekybinis pirminių folikulų įvertinimas; gyvūnų skaičius, kiaušidės skerspjūvio pasirinkimas ir pjūvių ėminių dydis turi statistiškai atitikti taikomą įvertinimo metodiką. Tyrimą sudaro pirminių folikulų, kurie gali būti sujungti su mažais augančiais folikulais, skaičiaus nustatymas, siekiant palyginti paveiktas ir kontrolines kiaušides (41) (42) (43) (44) (45).
\n22.1. Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir tinkamoje terpėje laikomi audiniai, turintys makroskopinių anomalijų, ir visų žiurkiukų veikiami organai, turintys išorinių anomalijų arba klinikinių požymių, be to, „aklos atrankos“ metodu pasirinktas vienas F1 ir F2 kartų žiurkiukas ar lytis ar vada, nepasirinkta poravimui.
\n22.2. Histopatologinis konservuotas audinys išsamiai apibūdinamas, ypatingą dėmesį kreipiant reprodukcijos sistemai.
\nV. DUOMENYS 23. Rezultatų apdorojimas:
\n23.1. Duomenys pateikiami atskirai ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei ir kiekvienai kartai nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba numarinimo laikas, vaisingų gyvūnų skaičius, veisiančių patelių skaičius, toksiško poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir bet kokio toksiško poveikio sunkumą, taikyti tėvų ir palikuonių stebėjimo būdai, histopatologinių pakitimų tipai ir atitinkami vados duomenys.
\n23.2. Skaitmeniniai rezultatai turi būti įvertinti taikant atitinkamą visuotinai priimtą statistinį metodą; statistiniai metodai pasirenkami kaip tyrimo schemos dalis ir turi būti pagrįsti. Duomenims analizuoti gali padėti dozės ar reakcijos statistiniai modeliai. Ataskaitoje turi būti pakankamas kiekis informacijos apie analizės metodą ir taikytą kompiuterio programą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos specialistas galėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analizės eigą.
\n24.1. Šio toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimo duomenys įvertinami atsižvelgiant į pastebimą poveikį, įskaitant skrodimą ir mikroskopinio tyrimo rezultatus. Įvertinamas ryšis tarp bandomosios medžiagos ir anomalijų buvimo, nebuvimo, dažnumo ir sunkumo, įskaitant makroskopinius pakitimus, nustatytus veikiamus organus, paveiktą vaisingumą, klinikines anomalijas, paveiktą reprodukavimo gebą ir vados charakteristikas, kūno masės pokyčius, poveikį gaištamumui ir bet kokį kitą toksišką poveikį arba tokio ryšio nebuvimas. Įvertinant rezultatus reikia atsižvelgti į bandomosios medžiagos fizikines chemines savybes ir toksikokinetinius duomenis, jei tokie būtų.
\n24.2. Tinkamai atliekant toksiško poveikio reprodukcijai bandymą turi būti gautas patenkinamas poveikio nesukeliančios dozės įvertis ir neigiamo poveikio reprodukcijai, atsivedimui, laktacijai, postnataliniam vystymuisi, įskaitant augimą ir lytinį brendimą, supratimas.
\n25.1. Toksiško poveikio dviejų kartų reprodukcijai tyrimas suteiks informacijos apie kartotinio medžiagos naudojimo poveikį visais reprodukcijos ciklo tarpsniais. Pirmiausia tyrimas suteikia informacijos apie reprodukcijos parametrus ir palikuonių vystymąsi, augimą, brendimą ir išlikimą. Tyrimo rezultatai turėtų būti aiškinami atsižvelgiant į pusiau lėtinio toksiško poveikio, toksiško poveikio prenataliniam vystymuisi ir į toksikokinetinių bei kitų atliktų tyrimų rezultatus.
\n25.2. Šio tyrimo rezultatai gali būti naudojami įvertinant cheminės medžiagos papildomų tyrimų būtinumą. Tyrimo rezultatų ekstrapoliavimas žmonėms gali tikti tik tam tikru laipsniu. Jie labiausiai tinka, kai reikia gauti informacijos apie poveikio nesukeliančias dozes ir leistiną poveikį žmonėms (46) (47) (48) (49).
\nVI. ATASKAITOS RENGIMAS 26. Bandymo ataskaitą turi sudaryti ši informacija:
\n26.1. Bandomoji medžiaga:
\n26.1.1. fizikinė būsena ir, jei reikia, fizikinės cheminės savybės;
\n26.1.2. identifikavimo duomenys;
\n26.1.3. grynumas.
\n26.2. Nešiklis (jei naudojamas), jo pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.
\n26.3. Bandymo gyvūnai:
\n26.3.1. naudota rūšis ir veislė;
\n26.3.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;
\n26.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras, kraiko medžiagos ir t.t.;
\n26.3.4. kiekvieno gyvūno kūno masė bandymo pradžioje.
\n26.4. Bandymo sąlygos:
\n26.4.1. dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas;
\n26.4.2. detali informacija apie bandomosios medžiagos preparato ruošimą arba jos dėjimą į pašarą, gautos koncentracijos vertės;
\n26.4.3. preparato stabilumas ir vienalytiškumas;
\n26.4.4. detali informacija apie bandomosios medžiagos suleidimą;
\n26.4.5. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei tinka;
\n26.4.6. detali informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
\n26.5. Rezultatai:
\n26.5.1. pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas, pašaro efektyvumas (kūno masės padidėjimas vienam suvartoto pašaro gramui), P ir F1 gyvūnų atveju nurodomas suvartotos bandomosios medžiagos kiekis, išskyrus bendrojo buvimo laikotarpį ir mažiausiai paskutinį laktacijos laikotarpio trečdalį;
\n26.5.2. absorbcijos duomenys (jei yra);
\n26.5.3. P ir F1 gyvūnų, pasirinktų poravimui, kūno masės duomenys;
\n26.5.4. vados ir žiurkiukų kūno masės duomenys;
\n26.5.5. tėvų kartų kūno masė numarinant ir absoliučios bei santykinės organų masės duomenys;
\n26.5.6. klinikinių požymių tipas, sunkumas ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami);
\n26.5.7. žūties atliekant tyrimą laikas arba gyvūnai, išgyvenę iki numarinimo;
\n26.5.8. toksiškumo duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant poravimo, vaisingumo, veisimo, gimstamumo, gyvybingumo ir laktacijos rodiklius; ataskaitoje nurodomi skaičiai, naudojami rodikliams apskaičiuoti;
\n26.5.9. toksiškas arba kito tipo poveikis reprodukcijai, palikuonims, postnataliniam augimui ir t.t.;
\n26.5.10. skrodimo rezultatai;
\n26.5.11. detalus visų histopatologinių rezultatų aprašymas;
\n26.5.12. P ir F1 patelių, turinčių normalų ciklą, skaičius ir ciklo trukmė;
\n26.5.13. suminis spermatozoidų antsėklidžio uodegoje skaičius, vis labiau judresnių spermatozoidų procentinė dalis, morfologiškai normalių spermatozoidų procentinė dalis ir spermatozoidų, su kiekviena identifikuota anomalija, procentinė dalis;
\n26.5.14. poravimosi laikas, įskaitant parų iki poravimosi skaičių;
\n26.5.15. veisimo trukmė;
\n26.5.16. implantacijų, geltonkūnių skaičius, vados dydis;
\n26.5.17. gimusių gyvų žiurkiukų skaičius ir poimplantaciniai nuostoliai;
\n26.5.18. žiurkiukų su aiškiai matomais išsigimimais skaičius; pateikiamas silpniausių žiurkiukų skaičius, jei buvo nustatomas;
\n26.5.19. žiurkiukų fiziniai duomenys ir kiti postnatalinio vystymosi duomenys; įvertinti fiziniai parametrai turi būti pagrįsti;
\n26.5.20. žiurkiukų ir suaugusių gyvūnų funkcinių stebėjimų duomenys, kai tinka;
\n26.5.21. statistinis duomenų apdorojimas, jei reikia.
\n26.6. Rezultatų aptarimas.
\n26.7. Išvados, įskaitant patelėms ir palikuonims gautas NOAEL vertes.
\nVII. NUORODOS 27. Sadleir, R. M. F. S. (1979). Cycles and Seasons, In: Reproduction in Mammals: L Germ Cells and Fertilization, C. R. Auston and R. V. Short (eds.), Cambridge, New York.
\n6.1. Pagrindinis principas, kuriuo pagrįstas VLT metodas, yra jautrinančiųjų medžiagų sukelta pirminė limfocitų proliferacija cheminės medžiagos uždėjimo vietą drenuojančiame limfmazgyje. Ši proliferacija yra proporcinga naudojamai dozei (ir alergeno gebai jautrinti), taigi tai yra paprastas būdas objektyviai ir kiekybiškai išmatuoti jautrinimą. Taikant VLT, ši proliferacija įvertinama kaip dozės ir reakcijos santykis, lyginant proliferaciją bandymo grupėse ir nešiklį gavusiose kontrolinėse grupėse. Nustatomas proliferacijos bandomosiose grupėse ir kontrolinėse nešiklio grupėse santykis, vadinamas stimuliavimo indeksu, kuris turi būti lygus mažiausiai trims, kad bandomoji medžiaga galėtų būti toliau vertinama kaip galinti odą jautrinti medžiaga.
\n6.2. Čia aprašyti metodai yra pagrįsti radioaktyviųjų indikatorių naudojimu ląstelių proliferacijai išmatuoti. Tačiau gali būti naudojami kiti parametrai proliferacijai įvertinti, jei jie pagrįsti atitinkamais moksliniais duomenimis, įskaitant išsamias nuorodas ir metodo aprašymą.
\nII. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 7. Pasiruošimas:
\n7.1. Laikymo ir šėrimo sąlygos:
\n7.1.1. Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandomieji gyvūnai, temperatūra turi būti 20°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.
\n7.1.2. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.
\n7.2. Gyvūnų ruošimas:
\n7.2.1. Gyvūnai pasirenkami „aklos atrankos“ metodu, ženklinami, kad būtų įmanoma kiekvieną identifikuoti (tačiau netaikomas joks ausų ženklinimas), ir laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras prieš pradedant veikti medžiagomis, kad galėtų priprasti prie laboratorijos sąlygų.
\n7.2.2. Prieš poveikį visi gyvūnai tiriami, siekiant įsitikinti, ar jie neturi pastebimų odos pažeidimų.
\n8.1. Bandymo gyvūnai:
\n8.1.1. Šiam bandymui pasirinkta gyvūnų rūšis – pelės. Naudojamos jaunos suaugusios CBA/Ca arba CBA/J veislės pelių patelės neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Pradedant tyrimą, gyvūnų amžius turi būti 8-12 savaičių, o gyvūnų kūno masės skirtumas turi būti kiek įmanoma mažesnis ir neviršyti 20% vidutinės masės.
\n8.1.2. Galima naudoti kitas veisles ir patinus, jei yra gauta pakankamai duomenų, kurie rodytų, kad nėra esminių veislei ir (arba) lyčiai būdingų reakcijos į VLT skirtumų.
\n8.2. Patikimumo tikrinimas:
\n8.2.1. Teigiamos kontrolės naudojamos siekiant parodyti gerą bandymo atlikimą ir laboratorijos kompetenciją sėkmingai atlikti bandymą. Teigiamos kontrolės veikimo dozė gyvūnams turi sukelti teigiamą VLT reakciją ir turėtų padidinti stimuliavimo indeksą (SI) > 3 palyginus su neigiama kontrole. Teigiamos kontrolės dozė pasirenkama taip, kad indukcija būtų aiški, bet ne per didelė. Tinkamiausios medžiagos yra heksilcinamono aldehidas (CAS Nr. 101-86-0, EINECS Nr. 202-983-3) ir merkaptobenztiazolas (CAS Nr. 149-30-4, EINECS Nr. 205-736-8). Gali pasitaikyti aplinkybės, kai pateikus pakankamai įrodymų galima naudoti kitas kontrolines medžiagas, atitinkančias pirmiau nurodytus kriterijus.
\n8.2.2. Nors paprastai teigiamos kontrolės grupė gali būti reikalinga atliekant kiekvieną tyrimą, gali būti situacijų, kai bandymų laboratorijos turės ankstesnius teigiamos kontrolės duomenis, kurie leistų parodyti patenkinamos reakcijos pastovumą šešis mėnesius arba ilgesnį laikotarpį. Tokiais atvejais gali pakakti rečiau atliekamo teigiamos kontrolės bandymo, esant ne didesniems kaip 6 mėnesių intervalams. Nors teigiamos kontrolės medžiaga turi būti bandoma nešiklyje, kuris būtų žinomas, kaip sukeliantis vienodą reakciją (pvz., acetonas, alyvuogių aliejus), gali būti reikalaujama bandyti naudojant netipinį nešiklį (klinikiniu arba cheminiu požiūriu atitinkantį mišinį). Tokiu atveju reikia patikrinti galimą teigiamos kontrolės medžiagos ir tokio netipinio nešiklio sąveiką.
\n8.3. Gyvūnų skaičiaus, dozės ir nešiklio pasirinkimas:
\n8.3.1. Vienos dozės grupėje naudojami mažiausiai keturi gyvūnai, esant ne mažiau kaip trims bandomosios medžiagos koncentracijos vertėms, taip pat neigiamos kontrolės grupė, paveikiama tik bandomosios medžiagos nešikliu, ir, prireikus, teigiamos kontrolės grupė. Tais atvejais, kai reikia surinkti kiekvieno gyvūnų duomenis, vienos dozės grupėje turi būti ne mažiau kaip penki gyvūnai. Kontrolinių grupių gyvūnai prižiūrimi kaip ir medžiaga veikiamų grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie negauna bandomosios medžiagos.
\n8.3.2. Dozė ir nešiklis turi būti pasirenkami atsižvelgiant į rekomendacijas, pateiktas nuorodoje (1). Dozės pasirenkamos iš koncentracijos verčių eilutės 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% ir t.t. Pasirenkant tris nuoseklias koncentracijos vertes, turėtų būti atsižvelgta į turimus ūmaus toksiškumo ir odos dirginimo duomenis, kad didžiausia koncentracija turėtų kiek įmanoma didesnį poveikį, bet būtų išvengta sisteminio toksiškumo ir per didelio vietinio odos dirginimo (14) (23).
\n8.3.3. Nešiklis pasirenkamas taip, kad bandymo koncentracijos vertės ir tirpumas būtų kiek įmanoma didesni ir kad tirpalas ar suspensija tiktų bandomajai medžiagai uždėti. Pirmumo tvarka rekomenduojamas nešiklis yra acetonas arba alyvuogių aliejus (4:1 V/V), dimetilformamidas, metiletilketonas, propilenglikolis ir dimetilsulfoksidas (14) (22), tačiau galima naudoti kitus nešiklius, jei tai būtų tinkamai moksliškai pagrįsta. Tam tikrais atvejais papildomai kontrolei gali tekti naudoti klinikiniu požiūriu atitinkantį tirpiklį arba komercinį preparatą, turintį bandomosios medžiagos. Reikia ypač stengtis užtikrinti, kad į nešiklį būtų dedama hidrofilinių medžiagų, kurios drėkintų odą ir iš karto nenutekėtų. Taigi reikėtų vengti naudoti grynai vandeninius nešiklius.
\n9.1. Eksperimentinis bandymo planas vykdomas taip:
\n9.1.1. 1 diena: nustatoma ir užrašoma kiekvieno gyvūno kūno masė. Ant kiekvienos ausies išorinės pusės užlašinama 25 miul atitinkamai atskiesto bandomosios medžiagos tirpalo, vien tik nešiklio arba teigiamos kontrolės medžiagos (prireikus);
\n9.1.2. 2 ir 3 dienos: kartojama 1 dieną atlikta procedūra;
\n9.1.3. 4 ir 5 dienos: bandomoji medžiaga nenaudojama;
\n9.1.4. 6 diena:
\n9.1.4.1. Užrašoma kiekvieno gyvūno masė. Į visų pelių uodegos veną suleidžiama 250 miul valgomosios druskos ir fosfatinio buferio tirpalo (FBT), turinčio 20 miuCi (7,4e + 8Bq)3H-metiltimidino. Galima suleisti 250 miuL (FBT), turinčio 2 miuCi (7,4e + 7Bq) 125I-joddeoksiuridino ir 10-5 mol/l fluordeoksiuridino.
\n9.1.4.2. Po penkių valandų gyvūnai numarinami. Drenuojamieji ausų limfmazgiai išpjaunami iš kiekvienos ausies ir kiekvienos bandymo grupės išpjovos sudedamos į FBT (jungtinis bandomosios grupės metodas); taikant kitą metodą, galima išpjauti kiekvieno gyvūnų limfmazgius ir kiekvieno gyvūno atskirai sudėti į FBT (kiekvieno gyvūno metodas). Limfmazgių identifikavimo ir skrodimo aprašymą bei schemas galima rasti I priedo 10 nuorodoje.
\n9.2. Ląstelių suspensijos ruošimas:
\n9.2.1. Ruošiama jungtinių bandomųjų grupių arba kiekvieno gyvūno poros limfmazgių ląstelių suspensija, švelniai mechaniniškai susmulkinant per 200 mium nerūdijančio plieno tinklelį.
\n9.2.2. Limfmazgių ląstelės du kartus plaunamos (FBT) pertekliumi ir 18 h nusodinamos 5% trichloracto rūgštimi esant 4 °C (14). Nuosėdos vėl suspenduojamos 1 ml 5% trichloracto rūgštimi ir suspensija supilama į scintiliacinius mėgintuvėlius, turinčius 10 ml scintiliacinio skysčio, kai reikia skaičiuoti 3H, arba tiesiai į mėgintuvėlius gama impulsams skaičiuoti, kai reikia nustatyti 125I.
\n9.3. Ląstelių proliferacijos nustatymas (radioaktyviųjų junginių patekimas):
\n9.3.1. 3H-metiltimidino patekimas matuojamas skaičiuojant beta scintiliacijas kaip dezintegracijų (skilimų) skaičių per minutę (DPM – disintegrations per minute). 125I-joddeoksiuridino patekimas matuojamas skaičiuojant 125I ir išreiškiamas kaip DPM.
\n9.3.2. Atsižvelgiant į taikomą metodą, patekimas bus išreiškiamas DPM/bandomajai grupei (jungtinis metodas) arba DPM/ gyvūnui (kiekvieno gyvūno metodas).
\n9.4. Stebėjimai:
\n9.4.1. Klinikiniai stebėjimai: gyvūnai kruopščiai apžiūrimi kartą per dieną bet kokiems klinikiniams požymiams (vietiniam dirginimui lašinimo vietoje arba sisteminiam toksiškumui) nustatyti. Visi kiekvieno gyvūno stebėjimai yra sistemingai registruojami.
\n9.4.2. Kūno masė: kiekvieno gyvūno kūno masė nustatoma bandymo pradžioje ir po numatyto gyvūno numarinimo (kaip nurodyta 9.1 skirsnyje).
\n10.1. Rezultatai išreiškiami kaip stimuliavimo indeksas (SI). Taikant jungtinį metodą, SI gaunamas bendrą visos bandomosios grupės gautą radioaktyviųjų junginių patekimo dydį dalijant iš visai nešiklio kontrolinei grupei gauto patekimo dydžio; šis dalmuo yra vidutinė SI vertė. Taikant kiekvieno gyvūno metodą, SI gaunamas dalijant kiekvienos bandomosios medžiagos grupės vidutinę DPM/gyvūnui vertę ir teigiamos kontrolės grupės vidutinę DPM/gyvūnui vertę iš tirpiklio/nešiklio kontrolinės grupės vidutinės DPM/gyvūnui vertės. Taigi nešiklio kontrolinės grupės vidutinė SI vertė lygi 1.
\n10.2. Jei SI apskaičiuoti taikomas kiekvieno gyvūno metodas, galima daryti statistinę duomenų analizę. Pasirinkdamas tinkamą statistinės analizės metodą, tyrėjas turi suvokti netolygios sklaidos ir kitų susijusių problemų galimybę, dėl to gali tekti duomenis transformuoti arba taikyti neparametrinę statistinę analizę. Tinkamas būdas duomenims interpretuoti – įvertinti visus individualius duomenis, gautus tiriant bandomosios grupės ir kontrolinės grupės, kurioje naudojamas nešiklis, gyvūnus, ir iš šių duomenų gauti geriausiai atitinkančią dozės ir reakcijos santykio kreivę, atsižvelgiant į pasikliautinuosius intervalus (20)(24)(25). Tačiau tyrėjas turi būti pasiruošęs galimiems grupės kiekvieno gyvūno reakcijos išsiskyrimams, ir dėl to gali tekti taikyti kitą reakcijos matą (pvz., medianinę, bet ne vidutinę vertę) arba pašalinti išsiskyrimą.
\n10.3. Sprendžiant dėl teigiamos reakcijos, stimuliavimo indeksas turi būti > 3, kartu būtina atsižvelgti į dozės ir reakcijos santykį ir, jei tinka, statistinį reikšmingumą (15)(18)(20)(24)(26).
\n10.4. Jei gauti rezultatai nėra visiškai aiškūs, reikėtų atsižvelgti į įvairias bandomosios medžiagos savybes, įskaitant tai, ar jos struktūra gimininga žinomų odą jautrinančių medžiagų struktūrai, ar ji sukelia per didelį odos dirginimą, ir pasireiškusiu dozės ir reakcijos santykio tipą. Šie ir kiti klausimai yra išsamiai aptarti kitur (19).
\nIII. DUOMENYS 11. Duomenys turi būti suvesti į lenteles, kuriose nurodomos vidutinės bei kiekvienos DPM vertės ir stimuliavimo indeksai, taikomi kiekvienos dozės grupei (įskaitant nešiklio kontrolinę grupę).
\nIV. ATASKAITOS RENGIMAS 12. Bandymo ataskaitą turi sudaryti ši informacija:
\n12.1. Bandomoji medžiaga:
\n12.1.1. identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris, jei yra; grynumas; žinomos priemaišos; siuntos numeris);
\n12.1.2. fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., lakumas, stabilumas, tirpumas);
\n12.1.3. jei mišinys, jo sudėtis ir komponentų procentinė dalis.
\n12.2. Nešiklis: jo identifikavimo duomenys [grynumas; koncentracija (jei tinka); naudojamas tūris]; nešiklio pasirinkimo pagrindimas.
\n12.3. Bandymo gyvūnai:
\n12.3.1. naudota pelių veislė;
\n12.3.2. gyvūno mikrobiologinė būsena, jei žinoma;
\n12.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, pašaras ir t.t.;
\n12.3.4. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;
\n12.4. Bandymo sąlygos:
\n12.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošimą ir dėjimą;
\n12.4.2. dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas, įskaitant intervalo nustatymo tyrimo rezultatus, jei tyrimas buvo atliekamas; naudotos nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos vertės, suminis dedamos medžiagos kiekis;
\n12.4.3. išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą ar tiekėją, vandens tiekėją).
\n12.5. Patikimumo tikrinimas:
\n12.5.1. paskutinės patikimumo patikros rezultatų santrauka, įskaitant informaciją apie medžiagą, koncentraciją ir naudojamą nešiklį;
\n12.5.2. lygiagrečiai ir (arba) anksčiau bandymo laboratorijoje gauti teigiamos ir neigiamos kontrolės duomenys.
\n12.6. Rezultatai:
\n12.6.1. kiekvieno gyvūno kūno masė dozės gavimo ir numatyto numarinimo dieną;
\n12.6.2. vidutinių DPM verčių (jungtinis metodas) ir individualių verčių (kiekvieno gyvūno metodas) lentelės, taikant abu metodus gautų verčių intervalas ir stimuliavimo indeksai kiekvienos dozės grupei (įskaitant nešiklio kontrolinę grupę);
\n12.6.3. statistinė analizė, jei tinka;
\n12.6.4. toksiškumo atsiradimo laikas ir požymiai, įskaitant kiekvieno gyvūno odos dirginimą medžiagos uždėjimo vietoje, jei yra.
\n12.7. Rezultatų aptarimas: trumpas rezultatų, dozės ir reakcijos santykio analizės ir statistinės analizės, jei tinka, aiškinimas, padarant išvadą, ar bandomoji medžiaga turėtų būti laikoma odą jautrinančia medžiaga.
\nV. NUORODOS 13. Kimber, I. and Basketter, D. A (1992). The murinę local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.
\n3.1. neurologinių požymių arba neuropatologinių pažeidimų stebėjimas, atliekant kitus nei kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimus, arba 3.2. struktūros panašumų buvimas arba kita informacija, kuri leistų medžiagas susieti su kitomis neurotoksiškomis medžiagomis.
\n10.1. identifikuoti, ar nervų sistema yra visam laikui arba grįžtamai veikiama bandomąja chemine medžiaga;
\n10.2. papildomai apibūdinti nervų sistemos pakitimus, susijusius su cheminės medžiagos veikimu, ir suprasti veikiančio mechanizmo esmę;
\n10.3. nustatyti dozės ir reakcijos bei laiko ir reakcijos santykius, kad būtų galima įvertinti nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (kuris gali būti naudojamas nustatant cheminės medžiagos saugos kriterijus).
\nNeigiamas poveikis – bet koks su poveikiu susijęs pakitimas palyginti su etalonu, mažinantis organizmo gebą išgyventi, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos.
\nDozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg) arba kaip pastovios koncentracijos pašare vertės (ppm).
\nDozavimas – bendrasis terminas dozei, jos suleidimo dažnumui ir suleidimo laikotarpiui apibūdinti.
\nNeurotoksiškumas – nervų sistemos struktūros arba funkcijos neigiamas pakitimas dėl veikimo chemine, biologine arba fizikine medžiaga.
\nNeurotoksiška medžiaga – bet kuri cheminė, biologinė arba fizikinė medžiaga, galinti sukelti neurotoksiškumą.
\nNOAEL (No observed adverse effect level) – nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygio santrumpa, ir tai yra didžiausia dozė, kuri nesukelia su poveikiu susijusių neigiamų pakitimų.
\n13.1. Bandomoji cheminė medžiaga suleidžiama kelioms laboratorinių graužikų grupėms į virškinimo traktą, naudojant kelias dozių koncentracijas. Paprastai tenka suleisti kartotines dozes ir dozavimo režimas gali būti 28 parų, pusiau lėtinis (90 parų) arba lėtinis (1 metai arba ilgiau). Be to, šiam bandymo metodui parengtos metodikos gali būti taikomos atliekant ūmaus neurotoksiškumo tyrimą. Gyvūnai bandomi siekiant aptikti arba apibūdinti elgesio ir (arba) neurologines anomalijas. Kiekvienu stebėjimo laikotarpiu įvertinami įvairūs elgesio, kuriam neurotoksiškos medžiagos galėtų daryti įtaką, aspektai. Pasibaigus bandymui, kiekvienos grupės kiekvienos lyties gyvūnų pogrupio gyvūnams daroma perfuzija in situ ir ruošiami bei tiriami galvos bei stuburo smegenų ir periferiniai nervų preparatai.
\n13.2. Kai atliekamas atskiras (stand-alone) tyrimas neurotoksiškumui aptikti arba neurotoksiškam poveikiui apibūdinti, kiekvienos grupės gyvūnai, kurie nebuvo panaudoti perfuzijai ir vėlesniam histopatologiniam tyrimui (žr. 1 lentelę), gali būti naudojami atliekant specialius elgesio tyrimo, neuropatologinius, neurocheminius arba elektrofiziologinius tyrimus, kuriais galima būtų papildyti duomenis, gautus atliekant šiame bandymo metode numatytus tipinius tyrimus (32). Šie papildomi tyrimai gali būti ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifinį cheminės medžiagos neurotoksiškumo tipą arba veikiamą organą. Be to, likusieji gyvūnai gali būti naudojami vertinimams, kurie yra numatyti taikant graužikų kartotinės dozės toksiškumo tyrimų metodus.
\n13.3. Kai šis bandymo metodas vykdomas kartu su kitais bandymo metodais, reikia turėti pakankamą gyvūnų skaičių norint vykdyti abiem tyrimams reikalingus stebėjimus.
\nII. BANDYMO METODO APRAŠYMAS 14. Gyvūnų rūšies pasirinkimas:
\n14.1. Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti kitas graužikų rūšis, jei toks naudojimas būtų pagrįstas. Paprastai naudojamos laboratorinės jaunų, suaugusių ir sveikų gyvūnų veislės. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.
\n14.2. Dozė paprastai pradedama leisti kiek įmanoma greičiau po atjunkymo, ir būtų gerai, kad gyvūnui būtų ne daugiau kaip šešios savaitės, tačiau bet kuriuo atveju anksčiau nei gyvūnas sulaukia devynių savaičių. Vis dėl to kai tyrimas atliekamas kartu su kitais tyrimais, šį amžiaus reikalavimą gali tekti keisti.
\n14.3. Naudojamų gyvūnų masė ir vidutinė kiekvienos lyties masė tyrimo pradžioje neturi skirtis daugiau kaip ± 20%. Kai prieš ilgalaikį tyrimą atliekamas trumpalaikis kartotinės dozės tyrimas, abiem tyrimams turi būti naudojami tos pačios veislės ir tiekėjo gyvūnai.
\n15.1. Eksperimentinių gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22°C (± 3°C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30% ir pageidautina ne didesnė kaip 70%, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50-60%. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai.
\n15.2. Reikia kiek įmanoma mažinti didelį su pertrūkiais triukšmą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją medžiagą, patenkant jai šiuo būdu. Gyvūnai narveliuose gali būti laikomi atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis.
\n16.1. Sveiki ir jauni gyvūnai „aklos atrankos“ metodu suskirstomi į bandomąsias ir kontrolines grupes. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos.
\n16.2. Gyvūnai paženklinami, kad juos būtų įmanoma identifikuoti, ir laikomi narveliuose mažiausiai penkias (36) paras prieš tyrimo pradžią, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.
\n17.1. Taikant šį bandymo metodą, bandomoji medžiaga suleidžiama į virškinimo traktą. Medžiaga suleidžiama zondu arba duodama šeriant, girdant ar duodant kapsules. Galima naudoti kitus patekimo būdus (pvz., per odą arba įkvepiant), bet tada gali tekti keisti rekomenduojamas metodikas. Patekimo būdo pasirinkimas priklauso nuo poveikio žmonėms aplinkybių ir turimos informacijos apie toksikologiją ar kinetiką. Reikia pagrįsti patekimo būdo pasirinkimą ir nurodyti dėl to daromus šio bandymo metodo procedūrų pakeitimus.
\n17.2. Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama iš pradžių tirti galimybę naudoti vandeninį tirpalą ar suspensiją, vėliau tirpalą ar emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi būti žinomos nešiklio toksiškumo savybės. Be to, reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio charakteristikas: poveikį absorbcijai, pasiskirstymui, medžiagų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulaikymui, dėl ko gali keistis bandomosios medžiagos cheminės savybės; poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui.
\nIII. DARBO EIGA 18. Gyvūnų skaičius ir lytis:
\n18.1. Atliekant atskirą tyrimą kiekvienos dozės grupei ir kontrolinei grupei turi būti naudojama mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinų) norint išsamiai įvertinti klinikinių ir funkcinių stebėjimų rezultatus. Baigus tyrimą mažiausiai penkiems patinams ir penkioms patelėms iš šių 10 patinų ir 10 patelių daroma perfuzija in situ ir jie naudojami išsamiam neurohistopatologiniam tyrimui. Tais atvejais, kai neurotoksiško poveikio požymiai pasireiškia tik ribotam tam tikros dozės grupės gyvūnų skaičiui, reikėtų numatyti šiuos gyvūnus įtraukti į pasirinktųjų perfuzijai gyvūnų skaičių.
\n18.2. Kai tyrimas atliekamas kartu su kartotinės dozės toksiškumo tyrimu, abiejų tyrimų tikslams pasiekti turi būti naudojamas atitinkamas gyvūnų skaičius. Įvairiems tyrimų deriniams reikalingas mažiausias gyvūnų skaičius grupėje pateiktas 1 lentelėje. Jei numatomi tarpiniai numarinimai arba planuojama sudaryti grupes poveikio grįžtamumui, jo išsilaikymui arba po paveikimo vėluojančiam toksiškam poveikiui stebėti, arba kai numatoma papildomai stebėti, gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas siekiant užtikrinti, kad būtų gyvūnų, reikalingų stebėjimams ir histopatologiniam tyrimui.
\n19.1. Paprastai turi būti naudojamos mažiausiai trijų dozių grupės ir kontrolinė grupė, tačiau, jei įvertinus kitus duomenis nelaukiama poveikio esant kartotinei 1000 mg/kg kūno masės/parą dozei, galima atlikti ribinį bandymą. Jei atitinkamų duomenų nėra, galima atlikti intervalo nustatymo tyrimą, siekiant palengvinti naudojamos dozės pasirinkimo kelią.
\n19.2. Kontrolinės grupės gyvūnai prižiūrimi kaip ir medžiagą gaunančių grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie nepaveikiami bandomąja medžiaga. Jei suleidžiant bandomąją medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turi gauti didžiausią naudojamą nešiklio tūrį.
\n20.1. Tyrimą atliekanti laboratorija turi pateikti duomenis, įrodančius jos kompetenciją atlikti tyrimą ir naudojamų metodikų jautrumą. Tokie duomenys turi patvirtinti įrodymus dėl sugebėjimo rasti ir prireikus kiekybiškai įvertinti stebėti skirtų skirtingų parametrų pakitimus, pvz., autonominių požymių, jutiminio aktyvumo, grybšnio jėgos ir motorinio aktyvumo.
\n20.2. Informacija apie chemines medžiagas, kurios sukelia įvairių tipų nerotoksišką poveikį ir kurios galėtų būti naudojamos kaip teigiamos kontrolės medžiagos, pateikta 11-18 nuorodose. Galima naudoti anksčiau gautus duomenis, jei nebus keičiami esminiai bandymo metodikų aspektai.
\n20.3. Rekomenduojama periodiškai atnaujinti anksčiau gautus duomenis. Kiekvieną kartą kai bandymus atliekanti laboratorija keičia kurį nors bandymo arba jo metodikų esminį elementą, reikėtų gauti naujų duomenų, kurie rodytų nekintamą metodikų jautrumą.
\n21.1. Dozės koncentracijos vertes reikėtų pasirinkti atsižvelgiant į visus anksčiau gautus toksiškumo ir kinetinius duomenis apie bandomąją medžiagą arba giminingas medžiagas. Didžiausia dozė turėtų būti pasirinkta siekiant sukelti neurotoksišką poveikį arba aiškų sisteminį toksišką poveikį.
\n21.2. Vėliau turėtų būti pasirinkta mažėjanti dozės koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvieną su doze susietą reakciją ir nesukeliančio pastebimo neigiamo poveikio lygį (NOAEL), atitinkantį mažiausią dozę.
\n21.3. Iš esmės turėtų būti nustatytos tokios dozės, kad būtų įmanoma atskirti pirminį toksišką poveikį nervų sistemai ir sisteminį toksišką poveikį. Paprastai pakanka nuo dviejų iki trijų dozių intervalų, ir dažnai gerai būtų naudoti ketvirtą bandymo grupę, norint naudoti labai didelius intervalus tarp dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Jei yra patikimų poveikio žmonėms duomenų, į tai irgi reikia atsižvelgti.
\n22.1. Jei atliekant bandymą pagal šiame tyrime aprašytas metodikas su viena mažiausiai 1000 mg/kg kūno masės/parą doze neurotoksiškas poveikis nepastebimas arba jei toksiško poveikio nelaukiama, atsižvelgiant į turimus duomenis apie giminingos struktūros junginius, nėra nebūtina atlikti visą tyrimą, naudojant tris dozių koncentracijas. Atsižvelgiant į laukiamą poveikį žmonėms gali tekti naudoti didesnes suleidžiamas per virškinimo traktą ribinio bandymo dozės.
\n22.2. Kalbant apie kitus patekimo būdus, pvz., įkvėpimą arba veikimą per odą, bandomosios medžiagos fizikinės cheminės savybės dažnai gali apibrėžti didžiausią pasiekiamą poveikio lygį. Atliekant ūmaus poveikio per virškinimo traktą tyrimą ribinio bandymo dozė turi būti mažiausiai 2000 mg/kg.
\n23.1. Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos dozę kasdien, septynias dienas per savaitę, ne trumpiau kaip 28 paras; penkių parų dozės režimas arba trumpesnė veikimo trukmė turi būti pagrįsti. Kai bandomoji medžiaga suleidžiama zondu, naudojamas skrandžio zondas arba tinkamas intubacinis vamzdelis. Didžiausias gyvūnui suleidžiamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės. Tačiau vandeninių tirpalų atveju galima suleisti 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ardančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo tūrio nepastovumas turi būti kiek įmanoma sumažintas, keičiant koncentraciją taip, kad visų dozių tūris būtų pastovus.
\n23.2. Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrukdytų įprastam maitinimuisi arba vandens pusiausvyrai. Kai bandomoji medžiaga patenka su pašaru, galima naudoti pastovią koncentraciją (ppm) arba pastovią dozę pagal gyvūno kūno masę; naudotas variantas turi būti nurodytas. Jei medžiaga suleidžiama zondu, dozė turėtų būti suleidžiama kiekvieną dieną panašiu laiku ir reguliuojama pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Jei prieš ilgalaikį tyrimą atliekamas kartotinės dozės tyrimas, atliekant abu tyrimus turi būti naudojamas panašus pašaras. Jei atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus neįmanoma suleisti vienetinę dozę, ji gali būti suleidžiama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.
\nIV. STEBĖJIMAI 24. Stebėjimų ir bandymų dažnumas:
\n24.1. Atliekant kartotinės dozės tyrimus, stebėjimo laikotarpis turi atitikti dozavimo laikotarpį. Atliekant ūmaus toksiškumo tyrimus, stebima 14 parų po medžiagos suleidimo. Pagalbinių grupių gyvūnai, kurie negauna bandomosios medžiagos pasibaigus veikimo laikotarpiui, irgi turi būti stebimi tokį laikotarpį.
\n24.2. Stebima turi būti pakankamu dažniu siekiant kiek įmanoma padidinti tikimybę aptikti bet kokį elgesio ir (arba) neurologines anomalijas. Reikėtų stebėti kasdien vienodu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo laiką po medžiagos suleidimo. Klinikinių stebėjimų ir funkcinių bandymų dažnis apibendrintas 2 lentelėje. Jei ankstesniuose tyrimuose gauti kinetiniai duomenys rodo, kad stebėjimų, bandymų arba stebėjimų po bandymų laikas turi būti kitas, reikėtų patvirtinti kitą laiko grafiką didžiausiam informacijos kiekiui gauti. Padaryti grafiko pakeitimai turi būti pagrįsti.
\n24.3. Bendrosios sveikatos būklės ir gaištamumo ar liguistumo stebėjimas. Visi gyvūnai turi būti bent kartą per dieną apžiūrėti jų sveikatos būklei nustatyti ir bent du kartus per dieną liguistumui ir gaištamumui nustatyti.
\n24.4. Išsamūs klinikiniai stebėjimai:
\n24.4.1. Nuodugniai turi būti apžiūrimi visi šiam tikslui atrinkti gyvūnai (žr. 1 lentelę) – kartą prieš pirmą veikimą medžiaga (kad būtų galima palyginti to paties gyvūno duomenis) ir vėliau skirtingais intervalais, atsižvelgiant į tyrimo trukmę (žr. 2 lentelę). Pagalbinės sveikstančių gyvūnų grupės nuodugniai kliniškai apžiūrimos baigiantis pasveikimo laikotarpiui. Nuodugniai kliniškai apžiūrima ne narvelyje, bet standartiškai įrengtoje vietoje. Stebėjimų rezultatai turi būti kruopščiai užrašyti, naudojant įvertinimo balais sistemas, kurias sudaro kiekvienos apžiūros matavimų kriterijai arba įvertinimo balais skalės. Bandymų laboratorija turi aiškiai apibrėžti taikomus kriterijus arba balų skales. Reikia stengtis užtikrinti, kad bandymo sąlygų skirtumai būtų kiek įmanoma mažesni (išskyrus pagal metodiką susietas su poveikiu) ir apžiūrėtų patyrę specialistai, kurie nežinotų apie faktinį poveikį.
\n24.4.2. Rekomenduojama apžiūrėti struktūriniu būdu, kai kiekvienos apžiūros metu kiekvienam gyvūnui sistemingai taikomi aiškiai apibrėžti kriterijai (įskaitant normalaus „intervalo“ apibrėžimą). „Normalus intervalas“ turi būti tinkamai dokumentuojamas. Turi būti užrašyti visi pastebėti požymiai. Be to, visais įmanomais atvejais turi būti užrašytas pasireiškiančių požymių sunkumas. Klinikiniai stebėjimai turi apimti odos, kailio, akių, gleivinių, sekrecijų ir ekskrecijų dažnį ir autonominį aktyvumą (pvz., ašarojimą, drebulį, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą ir (arba) kvėpavimą per burną, visus neįprastus šlapinimosi arba tuštinimosi požymius, šlapimo išblukimą), tačiau neapsiriboti vien tuo.
\n24.4.3. Turi būti pažymėta bet kokia neįprasta reakcija dėl kūno padėties, aktyvumo lygio (pvz., naudojimosi tipiniu plotu sumažėjimas arba padidėjimas) ir judesių koordinacijos. Aprašomi eisenos (pvz., krypuojanti eisena, ataksija), laikysenos (pvz., kuprojimasis) ir reakcijos į priežiūrą, apgyvendinimą arba kitus aplinkos dirgiklius pakitimai, taip pat kloninių arba toninių judesių, traukulių arba drebulio buvimas, stereotipinis elgesys (per dažnas kūno prisižiūrėjimas, neįprasti galvos judesiai, nuolatinis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., kandžiojimasis arba per didelis laižymasis, savęs žalojimas, vaikščiojimas atbulomis, vokalizacija) arba agresija.
\n24.5. Funkciniai bandymai:
\n24.5.1. Visiems šiam tikslui atrinktiems gyvūnams dar atliekami į nuodugnius klinikinius stebėjimus panašūs funkciniai bandymai vieną kartą prieš poveikį bandomąja medžiaga ir dažnai vėliau (žr. 1 lentelę). Be to, funkcinių bandymų dažnumas priklauso nuo tyrimo trukmės (žr. 2 lentelę). Be 2 lentelėje nustatytų stebėjimo laikotarpių, turėtų būti funkciniai pagalbinių grupių sveikimo stebėjimai kiek įmanoma prieš pat numatytą numarinimą.
\n24.5.2. Funkcinius bandymus turi sudaryti jutiminio aktyvumo bandymai įvairių dirgiklių atžvilgiu [pvz., garsinių, regėjimo ir proprioceptinių dirgiklių (36)(37)(38)], galūnių grybšnio jėgos įvertinimas (39) ir motorinio aktyvumo įvertinimas (40). Motorinis aktyvumas matuojamas naudojant mechanizuotą įtaisą, kuriuo galima nustatyti aktyvumo didėjimą ir mažėjimą. Jei naudojama kita apibrėžta sistemą, ji turi būti kiekybinio įvertinimo sistema ir turi būti įrodytas jos jautrumas ir patikimumas. Kiekvienas įtaisas tikrinamas siekiant užtikrinti jų patikimumą bėgant laikui ir įtaisų tarpusavio suderinamumą. Kitos metodikų detalės pateiktos atitinkamose nuorodose.
\n24.5.3. Jei nėra duomenų (pvz., informacijos apie struktūros ir aktyvumo santykį, epidemiologinių duomenų, kitų toksikologinių tyrimų), kurie rodytų galimą neurotoksiškąį poveikį, reikėtų numatyti įtraukti labiau specializuotus jutiminės ir motorinės funkcijos arba mokymo ir atminties bandymus šiam poveikiui išsamiau ištirti. Daugiau informacijos apie specializuotus bandymus pateikta (32).
\n24.5.4. Išimtiniais atvejais funkcinių bandymų su gyvūnais galima neatlikti, jei gyvūnams pasireiškia tokio laipsnio toksiškumo požymiai, koks labai trukdytų tyrimui. Sprendimas neįtraukti gyvūnų į funkcinį bandymą turi būti pagrįstas.
\n25.1. Jei tyrimai vyksta mažiau kaip 90 parų, visi gyvūnai turi būti sveriami mažiausiai kartą per savaitę, be to, mažiausiai kas savaitę matuojamas pašaro suvartojimas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga patenka su vandeniu).
\n25.2. Atliekant ilgalaikius tyrimus, visi gyvūnai sveriami mažiausiai kartą per savaitę pirmąsias 13 savaičių ir vėliau mažiausiai kas 4 savaites. Pašaro suvartojimas matuojamas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga patenka su vandeniu) mažiausiai kartą per savaitę pirmąsias 13 savaičių ir vėliau maždaug kas tris mėnesius, išskyrus kai sveikatos būklė arba kūno masės kitimas reikalauja daryti kitaip.
\n26.1. Jei tyrimas trunka ilgiau kaip 28 paras, prieš bandomosios medžiagos suleidimą ir pasibaigus tyrimui būtina ištirti visų gyvūnų arba bent vieno didelės dozės grupės ir kontrolinės grupės gyvūno akis, naudojant oftalmoskopą arba lygiavertį tinkamą prietaisą.
\n26.2. Jei nustatomi akių pakitimai arba jei klinikiniai požymiai rodo oftalmologinio tyrimo būtinumą, turi būti ištirti visi gyvūnai. Atliekant ilgalaikius tyrimus, akys tiriamos po 13 savaičių. Oftalmologinių tyrimų atlikti nebūtina, jei šie duomenys yra gauti atliekant kitus panašios trukmės ir panašių dozių tyrimus.
\n27.1. Kai neurotoksiškumo tyrimas atliekamas kartu su kartotinės dozės sisteminio toksiškumo tyrimu, hematologiniai tyrimai ir klinikiniai biocheminės analizės atliekami taip, kaip nurodyta atitinkamame sisteminio toksiškumo tyrimo metode.
\n27.2. Ėminius reikia imti taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks neurologinis poveikis elgesiui.
\n28.1. Turi būti planuojamas neuropatologinis tyrimas, siekiant papildyti ir išplėsti stebėjimų rezultatus, gautus tyrimo in vivo stadijoje. Mažiausiai 5 kiekvienos lyties ar grupės gyvūnai (žr. 1 lentelę ir kitą pastraipą) fiksuojami in situ, taikant visuotinai pripažintus perfuzijos ir fiksavimo metodus (žr. 34 nuorodos 5 skyrių ir 35 nuorodos 50 skyrių). Turi būti užrašyti visi pastebėti dideli pakitimai. Kai tyrimas atliekamas kaip atskiras tyrimas neuro toksiškoms medžiagoms atrinkti arba neuro toksiškam poveikiui apibūdinti, likusieji gyvūnai gali būti panaudoti specifiniams neurologinio elgesio (41) (42), neuropatologiniams (41) (42) (43) (44), neurocheminiams (41) (42) (45) (46) arba elektrofiziologiniams tyrimams (41) (42) (47) (48), kurie gali papildyti čia aprašytas metodikas ir tyrimus, arba padidinti histopatologiniuose tyrimuose naudojamų gyvūnų skaičių. Šie papildomi tyrimai yra ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifinį neurotoksiškumo tipą arba veikiamą organą (33) (34). Be to, likusieji gyvūnai gali būti panaudoti įprastiems patologiniams įvertinimams, kaip aprašyta kartotinių dozių tyrimų metode.
\n28.2. Visi į parafiną įlieti audinio mėginiai dažomi įprastu būdu, pvz., hematoksilinu ir eozinu (H&E), ir atliekamas mikroskopinis tyrimas. Jei pasireiškia arba įtariami periferinės neuropatijos požymiai, tiriami į plastiką įlieti periferinių nervų audinio ėminiai. Be to, klinikiniai požymiai gali nurodyti papildomas tyrimo vietas arba poreikį naudoti specialias dažymo metodikas. Papildomos vietos, kurias reikėtų ištirti, aprašytos nuorodose (34) (35). Be to, konkretiems patologinių pakitimų tipams parodyti gali būti naudojami atitinkami specialūs dažai (49).
\n28.3. Tipiniai centrinės ir periferinės nervų sistemos pjūviai tiriami histologiškai (žr. 34 nuorodos 5 skyrių ir 35 nuorodos 50 skyrių). Tiriamas vietas paprastai sudaro: priekinės smegenys, didžiųjų smegenų pusrutulių vidurys, įskaitant hipokampo pjūvį, viduriniosios smegenys, smegenėlės, tiltas, pailgosios smegenys, akis su regos nervu ir tinklaine, stuburo smegenys kaklo ir juosmens sustorėjimų vietose, užpakalinės nugaros smegenų šaknelės mazgai, užpakalinės ir priekinės nugaros smegenų šaknelės pluoštai, proksimalinis sėdmens nervas, proksimalinis blauzdikaulio nervas (prie kelio) ir blauzdikaulio nervo šakos į blauzdos raumenį. Daromas stuburo smegenų ir periferinių nervų skersinis arba įstrižas ir išilginis pjūvis. Reikia atkreipti dėmesį į nervų sistemos vaskuliarizaciją. Be to, turi būti tiriamas raumenų ėminys, visų pirma, blauzdos raumuo. Ypatingą dėmesį reikia kreipti į centrinės ir periferinės nervų sistemų vietas su ląsteline ir pluoštine struktūra, kurios yra žinomos kaip ypač veikiamos neurotoksiškomis medžiagomis.
\n28.4. Informacija apie neuropatologinius pakitimus, paprastai atsirandančius dėl poveikio toksiškomis medžiagomis, pateikta nuorodose (34) (35). Rekomenduojamas audinio ėminių tyrimas etapais, kai iš pradžių lyginami didelės dozės ir kontrolinės grupės gyvūnų audinių pjūviai. Jei lyginant šias grupes neuropatologinių pakitimų nenustatoma, toliau analizuoti nereikia. Jei didelės dozės grupėje pastebimi neuropatologiniai pakitimai, reikia koduoti ir nuosekliai tirti visų galbūt paveiktų audinių ėminius, gautus tarpinės ir mažos dozės grupėms.
\n28.5. Jei kokie nors neuropatologinių pakitimų įrodymai gaunami atliekant kokybinį tyrimą, atliekamas antras visų pakitimus turinčių nervų sistemos sričių tyrimas. Visų dozių grupių galimai paveiktų sričių pjūviai koduojami ir „aklos atrankos“ metodu paskiriami tirti, nenurodant kodo. Turi būti užrašytas kiekvieno pažeidimo dažnumas ir sunkumas. Įvertinus visas visų dozių grupių sritis, kodą galima atskleisti ir daroma statistinė analizė dozės ir reakcijos santykiui įvertinti. Turi būti aprašyti kiekvieno pažeidimo įvairaus sunkumo laipsnio pavyzdžiai.
\n28.6. Neuropatologinių tyrimų rezultatai įvertinami atsižvelgiant į elgesio stebėjimus ir matavimus, be to, į duomenis, gautus atliekant ankstesnius ir lygiagrečius bandomosios medžiagos sisteminio toksiškumo tyrimus.
\nV. DUOMENYS 29. Rezultatų apdorojimas:
\n29.1. Pateikiami kiekvieno gyvūno duomenys.
\n29.2. Papildomai visi duomenys apibendrinami ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo arba kontrolinei grupei nurodomas gyvūnų skaičius, atliekant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, stebimų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant bet kokio toksiško poveikio pradžios laiką, trukmę, tipą ir sunkumą, pažeidimų turinčių gyvūnų skaičius, įskaitant pažeidimo(-ų) tipą ir sunkumą.
\n30.1. Tyrimo rezultatai įvertinami kaip neuropatologinio poveikio ir poveikio elgesiui (be to, neurocheminio arba elektrofiziologinio poveikio, jei vykdomi papildomi tyrimai) dažnumas, sunkumas ir jų koreliacija ir bet koks kitas pastebimas neigiamas poveikis.
\n30.2. Jei įmanoma, skaitmeniniai rezultatai įvertinami taikant tinkamą ir visuotinai priimtą statistinį metodą. Statistiniai metodai pasirenkami rengiant tyrimo planą.
\nVI. ATASKAITOS RENGIMAS 31. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija:
\n31.1 Bandomoji medžiaga: jos fizikinė būsena (įskaitant izomerizavimą, grynumą ir fizikines chemines savybes); identifikavimo duomenys.
\n31.2 Nešiklis (jei naudojamas): jo pasirinkimo pagrindimas.
\n31.3. Bandomi gyvūnai:
\n31.3.1. naudota rūšis ir veislė;
\n31.3.2. gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;
\n31.3.3. gyvūnų tiekėjas, laikymo sąlygos, aklimatizavimas, maistas ir t.t.;
\n31.3.4. kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.
\n31.4. Bandymo sąlygos:
\n31.4.1. išsami informacija apie bandomosios medžiagos ar preparato ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentraciją, preparato stabilumą ir vienalytiškumą;
\n31.4.2. suleidžiamos dozės specifikacija, įskaitant išsamią informaciją apie nešiklį, suleidžiamos medžiagos tūrį ir fizikinį pavidalą;
\n31.4.3. bandomosios medžiagos patekimo būdo detalės;
\n31.4.4. pasirinktos dozės pagrindimas;
\n31.4.5. poveikio būdo ir trukmės pasirinkimo pagrindimas;
\n31.4.6. bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės/parą), jei tinka;
\n31.4.7. išsami informacija apie maisto ir vandens kokybę.
\n31.5. Stebėjimo ir bandymo metodikos:
\n31.5.1. išsami informacija apie kiekvienos grupės gyvūnų atranką į pogrupį perfuzijai daryti;
\n31.5.2. išsami informacija apie vertinimo balais sistemas, įskaitant kiekvieno matavimo vykdant nuodugnius klinikinius stebėjimus kriterijus ir balų skales;
\n31.5.3. išsami informacija apie funkcinius bandymus nustatant jutiminį aktyvumą įvairių dirgiklių atžvilgiu (pvz., garsinių, regėjimo ir proprioceptinių dirgiklių); galūnių grybšnio jėgos įvertinimo, motorinio aktyvumo įvertinimo (įskaitant išsamią informaciją apie aktyvumui nustatyti naudojamus automatizuotus įtaisus) ir kitos taikytos metodikos;
\n31.5.4. išsami informacija apie oftalmologinius tyrimus ir, jei tinka, hematologiniai tyrimai ir klinikinės biochemijos bandymai, nurodant atitinkamas etalonines vertes;
\n31.5.5. išsami informacija apie specifinius elgesio, neuropatologinių, neurocheminių arba elektrofiziologinių tyrimų metodikas.
\n31.6. Rezultatai:
\n31.6.1. kūno masė ar kūno masės pokyčiai, įskaitant kūno masę numarinant;
\n31.6.2. maisto ir vandens suvartojimas, jei tinka;
\n31.6.3. duomenys apie kiekvieno gyvūno atsaką pagal lytį ir dozes, įskaitant toksiškumo požymius ar žūčių skaičių;
\n31.6.4. nuodugnių klinikinių stebėjimų tipas, sunkumas ir trukmė (pradžios laikas ir vėlesnė eiga) (nurodyti grįžtamumą arba negrįžtamumą);
\n31.6.5. visų funkcinio bandymo rezultatų išsamus aprašymas;
\n31.6.6. skrodimo rezultatai;
\n31.6.7. išsamus visų turimų elgesio, neuropatologinių, neurocheminių arba elektrofiziologinių rezultatų aprašymas;
\n31.6.8. absorbcijos ir medžiagos apykaitos duomenys, jei yra;
\n31.6.9. statistinis rezultatų apdorojimas, jei daromas.
\n31.7. Rezultatų aptarimas:
\n31.7.1. informacija apie dozės ir reakcijos santykį;
\n31.7.2. ryšys su bet kokiu kitu toksišku poveikiu ir išvada apie bandomosios cheminės medžiagos neurotoksiškumą;
\n31.7.3. nesukeliantis pastebimo neigiamo poveikio lygis.
\n31.8. Išvados: prašoma pateikti bandomosios cheminės medžiagos bendrojo neurotoksiškumo įvertinimą.
\nVII. NUORODOS 32. OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
\n