Oficialūs šaltiniaie-seimas.lrs.lt · EUR-Lex
Europaius
Lietuvių
ČeštinaDeutschFrançaisEspañolPolskiItalianoNederlandsÖsterreichBelgiquePortuguêsSvenskaDanskSuomiSlovenčinaIrelandMagyarEestiLatviešuSlovenščinaHrvatskiΚύπροςMaltiRomânăΕλληνικάLuxembourgБългарски
Lietuvių

Trumpai

Šis teisės aktas patvirtina cheminių medžiagų ir preparatų mutageniškumo tyrimo metodus, siekiant nustatyti, ar šios medžiagos gali sukelti genetinius pakitimus.

Ką jis reguliuoja

  • Cheminių medžiagų ir preparatų mutageniškumo tyrimo metodus.
  • Konkrečius tyrimo metodus, tokius kaip žinduolių chromosomų aberacijų in vitro ir in vivo bandymai, bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymai.
  • Tyrimų atlikimo sąlygas, įskaitant ląstelių paruošimą, metabolinę aktyvaciją ir bandomosios medžiagos koncentracijas.
  • Apibrėžimus, susijusius su chromosomų pakitimais, pavyzdžiui, chromatidinė, chromosominė aberacija, poliploidija.

Kam jis skirtas

  • Asmenims ir institucijoms, atliekantiems cheminių medžiagų ir preparatų mutageniškumo tyrimus.
  • Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerijai, kuri kontroliuoja šio įsakymo vykdymą.

Pagrindiniai punktai

  • Patvirtinami 16 skirtingų cheminių medžiagų ir preparatų mutageniškumo tyrimo metodų (nuo B10 iki B39).
  • Tyrimai atliekami siekiant identifikuoti medžiagas, sukeliančias žinduolių ląstelių chromosomų aberacijas.
  • Tyrimuose in vitro privaloma naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį.
  • Didžiausia poveikio koncentracija, kai bandomoji medžiaga necitotoksinė, turėtų būti 5 ml/ml, 5,5 mg/ml arba 0,01 M, priklausomai nuo mažiausios.
Įstatymo tekstas
Įstatymo tekstas

LIETUVOS RESPUBLIKOS SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRAS Į S A K Y M A S DĖL CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ MUTAGENIŠKUMO TYRIMO MEODŲ PATVIRTINIMO 2004 m. liepos 5 d. Nr. V-507 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) 6 straipsnio 2 dalimi, Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 „Dėl cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmonių sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos“ (Žin., 2001, Nr. 3-60) 11.1 punktu ir įgyvendindamas 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų medžiagų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, Komisijos direktyvos 1988 m. lapkričio 18 d. devintąjį kartą su technikos pažanga derinančios Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo 88/302/EEB, 1999 m. gegužės 31 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyvos 1999/45/EB dėl šalių narių įstatymų, reglamentų ir administracinių nuostatų, susijusių su pavojingų preparatų klasifikavimu, pakavimu ir ženklinimu, suvienodinimo, Komisijos direktyvos 2000/32/EB 2000 m. gegužės 19 d. dvidešimt šeštą kartą derinančios su technikos pažanga Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo reikalavimus:

  1. Tvirtinu pridedamus cheminių medžiagų ir preparatų mutageniškumo tyrimo metodus: 1.
  2. Mutageniškumas. Žinduolių chromosomų aberacijų in vitro bandymas (B10); 1.
  3. Mutageniškumas. Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų in vivo bandymas (B11); 1.
  4. Mutageniškumas. Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių in vivo bandymas (B12); 1.
  5. Mutageniškumas. Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas (B13/14); 1.
  6. Mutageniškumas ir kancerogeniškumo patikrinimas. Genų mutacijos. Saccharomyces cerevisiae bandymas (B15); 1.
  7. Mitozinė rekombinacija. Saccharomyces cerevisiae bandymas (B16); 1.
  8. Mutageniškumas. Žinduolių ląstelių genų mutacijų in vitro bandymas (B17); 1.
  9. DNR pažaidos ir jų reparacija. Netaisyklinga DNR sintezė žinduolių ląstelėse in vitro (B18); 1.
  10. Seserinių chromatidžių apsikeitimo in vitro įvertinimas (B19); 1.
  11. Drosophila melanogaster nuo lyties priklausomo recesyvinio letališkumo bandymas (B20); 1.
  12. Žinduolių ląstelių transformacijos in vitro bandymai (B21); 1.
  13. Graužikų dominantinio letališkumo bandymas (B22); 1.
  14. Žinduolių spermatogonijų chromosomų aberacijų bandymas (B23); 1.
  15. Pelių taškinis bandymas (B24); 1.
  16. Pelių paveldimos translokacijos bandymas (B25); 1.
  17. Žinduolių kepenų ląstelių netaisyklingos DNR sintezės in vivo bandymas (B39).
  18. Pavedu ministerijos sekretoriui Eduardui Bartkevičiui kontroliuoti šio įsakymo vykdymą. SVEIKATOS APSAUGOS MINISTRAS JUOZAS OLEKAS ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B10 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ In vitro bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  19. Įvadas 1.
  20. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 473 metodu. 1.
  21. Chromosomų aberacijų tyrimo tikslas – identifikuoti medžiagas, sukeliančias žinduolių ląstelių, kultivuojamų in vitro, chromosomų aberacijas. Struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Tačiau šio metodo tikslas nėra nustatyti chromosomų skaičiaus pokyčius, ir paprastai tam jis nėra taikomas. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių. 1.
  22. Tiriant chromosomų aberacijas in vitro galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų, ląstelių kamienų arba pirminių ląstelių kultūras. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą augti kultūroje, kariotipų stabilumą, chromosomų skaičių, chromosomų įvairovę ir spontaninių chromosomų aberacijų dažnį. 1.
  23. Atliekant tyrimus in vitro reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinės aktyvacijos sistema negali visiškai pakeisti žinduolių in vivo sąlygų. Reikia stengtis išvengti tokių sąlygų, kurioms esant būtų gaunami teigiami rezultatai, neatspindintys vidinio mutageniškumo ir galintys atsirasti pakeitus pH, osmosinį slėgį arba dėl citotoksiškumo. 1.
  24. Tyrimas atliekamas, kai ieškoma galimų žinduolių mutagenų ar kancerogenų. Daugelis cheminių medžiagų, taikant šį tyrimą duodančių teigiamus rezultatus, yra žinduolių kancerogenai; tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio tyrimo rezultatų ir kancerogeniškumo. Ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; yra neginčijamų įrodymų, kad šio tyrimo metu negalima nustatyti tam tikrų kancerogenų, nes jie ne tiesiogiai pakenkia DNR. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
  25. Apibrėžimai 2.
  26. Chromatidinė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas. 2.
  27. Chromosominė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje. 2.
  28. Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos sintezės (S) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių. 2.
  29. Spraga (plyšys) – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių. 2.
  30. Mitozės indeksas – mitozės metafazėje esančių ląstelių ir viso ląstelių populiacijos skaičiaus santykis, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį. 2.
  31. Chromosomų skaičiaus aberacija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu toms ląstelėms. 2.
  32. Poliploidija – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis. 2.
  33. Struktūrinė aberacija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.
  34. Bandymo metodo principas 3.
  35. Ląstelių kultūros veikiamos tiriamąja chemine medžiaga esant metabolinei aktyvacijai ar be jos. 3.
  36. Ląstelių kultūras paveikus tiriamąja medžiaga, tam tikrais laiko tarpais jos veikiamos ląstelių dalijimąsi metafazėje stabdančia medžiaga (pavyzdžiui, Kolcemidu© arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromosomų aberacijos.
  37. Bandymo metodo aprašymas 4.
  38. Pasiruošimas 4.1.
  39. Ląstelės. Galima naudoti įvairiausias ląstelių linijas, kamienus arba pirmines ląstelių, tarp jų ir žmonių ląstelių, kultūras (pavyzdžiui, kiniško žiurkėno fibroblastus, žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus). 4.1.
  40. Terpė ir kultivavimo sąlygos. Kultūros turėtų būti kultivuojamos reikiamoje terpėje, esant reikiamoms inkubacijos sąlygoms (kultivavimui skirtuose induose, esant reikiamai CO2 koncentracijai, temperatūrai ir drėgmei). Nuolat tikrinama, ar gerai žinomų ląstelių linijos ir kamienai išlaiko pastovų modalinį chromosomų skaičių, ar jos neužkrėstos mikoplazmomis (jei užkrėstos, tai toliau nebenaudojamos). Turi būti žinoma ląstelių ciklo trukmė bei taikomos kultivavimo sąlygos. 4.1.
  41. Kultūrų paruošimas 4.1.3.
  42. Gerai žinomų ląstelių linijų ir kamienų ląstelės padauginamos iš kamieninių kultūrų, pasėjamos terpėje tokiu tankumu, kad, prieš ląsteles surenkant, kultūros nesusilietų, po to jos inkubuojamos 37 °C temperatūroje. 4.1.3.
  43. Kai naudojami limfocitai, į terpę, turinčią mitogeno (pavyzdžiui, fitohemagliutinino), įnešamas sveikų tiriamųjų kraujo, paveikto antikoaguliantu (pavyzdžiui, heparinu), mėginys arba iš to kraujo išskirti limfocitai ir inkubuojama 37 °C temperatūroje. 4.1.
  44. Metabolinė aktyvacija 4.1.4.
  45. Ląstelės turėtų būti paveikiamos tiriamąja medžiaga tiek esant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai, tiek ir nesant. Plačiausiai naudojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų fermentinį aktyvumą skatinančiais agentais Aroklor 1254 ar fenobarbitono ir b-naftoflavono mišiniu, postmitochondrine frakcija, praturtinta kofaktoriumi. 4.1.4.
  46. Postmitochondrinė frakcija paprastai naudojama tokių koncentracijų, kurių intervalas tyrimo metu naudojamoje galutinėje terpėje siekia 1–10 % (pagal tūrį). Metabolinės aktyvacijos sistema gali priklausyti nuo bandomosios medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti daugiau nei vieną postmitochondrinės frakcijos koncentraciją. 4.1.4.
  47. Endogeninę aktyvaciją galima pagerinti, taikant genetinės inžinerijos metodais gautas ląstelių linijas, gaminančias specifinius, aktyvacijoje dalyvaujančius fermentus. Tyrime naudojamų ląstelių linijų pasirinkimas turėtų būti moksliškai pagrįstas (pavyzdžiui, pagal citochromo P450 izofermento svarbą tiriamos cheminės medžiagos metabolizmui). 4.1.
  48. Bandomoji cheminė medžiaga ar preparatas. Kietosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai ir praskiestos prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga. Prieš bandymą į bandymo sistemą gali būti tiesiogiai suleidžiamos ir/ar praskiedžiamos skystosios bandomosios medžiagos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas. 4.2 Bandymo sąlygos 4.2.
  49. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru. 4.2.
  50. Poveikio koncentracijos 4.2.2.
  51. Parenkant pačią didžiausią koncentraciją, vadovaujamasi citotoksiškumu, tirpumu tiriamojoje sistemoje ir pH arba osmosinio slėgio pokyčiais. Citotoksiškumas turėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais ląstelių vientisumo ir augimo rodikliais, tokiais kaip ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis, gyvų ląstelių skaičius arba mitozės indeksas. Pirminio eksperimento metu naudinga nustatyti toksiškumą ir tirpumą. 4.2.2.
  52. Naudojamos mažiausiai trys koncentracijos. Jei nustatomas citotoksiškumas, tai šios koncentracijos turėtų svyruoti nuo maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; tai reiškia, kad koncentracijos turi skirtis 2–Ö10 karto. Ląstelių surinkimo metu didžiausia koncentracija turėtų parodyti, kad gerokai sumažėjo ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis ir ląstelių skaičius arba mitozės indeksas (visi rodikliai sumažėjo daugiau nei 50 %). Mitozės indeksas yra tik netiesioginis citotoksinių/citostatinių pasekmių įvertinimo matas ir priklauso nuo laiko, praėjusio po tiriamosios medžiagos poveikio. Mitozės indeksas tinka ląstelių, auginamų suspensijoje, kultūroms, kuriose kiti toksiškumo tyrimai gali būti sudėtingi ir nepraktiški. Duomenys apie ląstelių ciklo kinetinius parametrus, tokius kaip vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, gali būti panaudoti kaip pagalbinė informacija. Vidutinis ląstelių kartos susiformavimo laikas, laikomas bendru vidurkiu, ne visada parodo, kad egzistuoja sulėtinto vystymosi subpopuliacijos, ir netgi menkas ląstelių susiformavimo laiko pailgėjimas gali būti susijęs su kur kas ilgesne optimalaus aberacijų skaičiaus atsiradimo trukme. 4.2.2.
  53. Kai bandomoji medžiaga necitotoksinė, didžiausia poveikio koncentracija turėtų būti 5 ml/ml, 5,5 mg/ml arba 0,01 M, priklausomai nuo to, kuri iš išvardytų koncentracijų pati mažiausia. 4.2.2.
  54. Kai bandomoji medžiaga mažai tirpi ir netoksiška, o jos koncentracijos mažesnės už tas, kurioms esant medžiaga netirpsta, tai baigiantis veikimui bandomąja medžiaga didžiausios naudojamos dozės koncentracija turėtų viršyti tirpumo ribą paruoštoje, kultivavimui skirtoje terpėje. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, kai toksiškumas pasireiškia tik tada, kai medžiagos koncentracija šiek tiek didesnė už pačią mažiausią koncentraciją, kuriai esant medžiaga visiškai netirpsta, rekomenduojama patikrinti daugiau nei vieną koncentraciją, kuriai esant susiformuoja matomas precipitatas. Derėtų įvertinti tirpumą prieš veikimą bandomąja medžiaga ir po jo, kadangi tirpumas gali pakisti dėl ląstelių ir S9 serumo, esančių bandymo sistemoje. Netirpumą galima nustatyti vizualiai. Precipitato susidarymas neturėtų trukdyti įvertinti duomenis. 4.2.
  55. Neigiami ir teigiami kontroliniai bandiniai 4.2.3.
  56. Atliekant kiekvieną eksperimentą esant metabolinei aktyvacijai arba be jos, kartu naudojami teigiami ir neigiami (tirpikliai, tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai. Kai naudojama metabolinė aktyvacija, tai kartu su teigiamu kontroliniu bandiniu turi būti naudojama aktyvuojanti cheminė medžiaga tam, kad būtų sukuriamas atsakas į mutageną. 4.2.3.
  57. Teigiamuose kontroliniuose bandiniuose turi būti tokios žinomo elastogeno koncentracijos, kurioms esant bei veikiant bandomąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai (tai parodo bandymo sistemos jautrumą). 4.2.3.
  58. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunamas atsakas būtų aiškus, bet tyrėjas negalėtų jo iškart nustatyti. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje. 1 lentelė. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai Metabolinės aktyvacijos sąlygos Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr. Be egzogeninės metabolinės Metilmetansulfonatas 66-27-3 200-625-0 aktyvacijos Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7 Etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2 Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 4-nitrokvinolino-N- oksidas 56-57-5 200-281-1 Su egzogenine Benzpirenas 50-32-8 200-028-5 metaboline aktyvacija Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2 4.2.3.
  59. Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines medžiagas. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą. 4.2.3.
  60. Auginant kiekvieną ląstelių rinkinį, reikia naudoti neigiamus kontrolinius bandinius, sudarytus iš terpėje esančio tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio, kurie paveikiami šia terpe lygiai taip pat kaip ir ląstelių kultūros. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius bandinius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų aprašymuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio. 4.
  61. Darbo eiga 4.3.
  62. Poveikis bandomąja medžiaga. Proliferuojančios ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga esant metabolinės aktyvacijos sistemai ar be jos. Limfocitai veikiami bandomąja medžiaga, praėjus maždaug 48 valandoms po stimuliacijos mitogenu. 4.3.
  63. Paprastai naudojamos pakartotinės kiekvienos koncentracijos kultūros, ypač rekomenduojama tai daryti, kai kultivuojamos neigiamos kontrolinės kultūros, terpėje esant vien tirpiklio. Jeigu, remiantis anksčiau atliktų eksperimentų aprašymais, galima parodyti, kad tarp kartotinio pasėjimo kultūrų egzistuoja minimalūs skirtumai, tai pavienes kultūras galima tirti terpėje esant skirtingoms tiriamosios cheminės medžiagos koncentracijoms. 4.3.
  64. Dujinės ir lakiosios medžiagos tiriamos atitinkamais metodais, tokiais kaip kultivavimas sandariuose induose. 4.3.
  65. Kultūrų surinkimo laikas. Atliekant pirmąjį eksperimentą, ląstelės, esant metabolinės aktyvacijos sistemai arba jos nesant, bandomąja medžiaga veikiamos 3–6 valandas ir yra surenkamos maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios. Jeigu esant metabolinei aktyvacijai gaunami neigiami rezultatai, reikia atlikti papildomą eksperimentą be metabolinės aktyvacijos, surenkant ląsteles maždaug kas 1,5 normalaus ląstelinio ciklo nuo poveikio pradžios. Kai kurių medžiagų poveikį lengviau nustatyti, jei jomis veikiama ilgiau, o mėginiai paimami praėjus daugiau nei 1,5 ląstelinio ciklo. Neigiami duomenys, gauti naudojant metabolinę aktyvaciją, visada turi būti patvirtinami. Jei manoma, kad nereikia patvirtinti neigiamų rezultatų, tai privalo būti pagrįsta. 4.3.
  66. Chromosomų paruošimas. Paprastai likus 1–3 valandoms iki surinkimo ląstelių kultūros yra paveikiamos Kolcemidu© arba kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama. Ruošiant chromosomas, ląstelės paveikiamos hipotoniniu šoku, fiksuojamos ir dažomos. 4.3.
  67. Analizė 4.3.6.
  68. Prieš pradedant mikroskopinę analizę, visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, atskirai koduojamos. Kadangi fiksavimo metu metafazėje esančios ląstelės dažnai suyra bei prarandamos chromosomos, tai suskaičiuotos ląstelės turės centromeras, kurių skaičius lygus visų tipų ląstelių modaliniam skaičiui ¹
  69. Jei tiriant kartotinio pasėjimo kultūras, galima naudotis ta pačia kontrole, tai nustatytas centromerų skaičius bus lygus 200 gerai matomų metafazių. Centromerų skaičius gali sumažėti, kai stebima daug aberacijų. 4.3.6.
  70. Šio tyrimo tikslas nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, tačiau reikia registruoti ir poliploidiją bei endoduplikaciją. II. Duomenys
  71. Duomenų apdorojimas 5.
  72. Ląstelė yra eksperimentinis vienetas, todėl ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas, skaičius išreiškiamas procentais. Pateikiami chromosomų struktūrinių aberacijų tipai nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį bandomosiose ir kontrolinėse ląstelių kultūrose. Atskirai registruojami chromosomų plyšiai, tačiau nustatant absoliutų aberacijų dažnį, į juos neatsižvelgiama. 5.
  73. Registruojamos tarpusavyje sutampančios priemonės, kurios naudojamos citotoksiškumui vertinti pagrindinio bandymo bandomosiose ir neigiamose kontrolinėse kultūrose. 5.
  74. Visi duomenys pateikiami apibendrinti lentelėse. Atskirai pateikiami pavieniai duomenys. 5.
  75. Aiškaus teigiamo atsako patvirtinti nebūtina. Abejotini rezultatai patvirtinami arba atmetami tiriant toliau, pakeitus bandymo sąlygas, pavyzdžiui, koncentracijas ir metabolinę aktyvaciją.
  76. Duomenų įvertinimas ir interpretacija 6.
  77. Nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas yra kriterijai, kuriais remiantis nustatoma, ar bandymo rezultatai teigiami. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. 6.
  78. Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą. 6.
  79. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 6.1 ir 6.2 punktuose nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška. 6.
  80. Po daug bandymų, gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes, remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs. 6.
  81. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų kultivuotose somatinėse žinduolių ląstelėse. III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
  82. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija: 7.
  83. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys 7.1.
  84. priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys; 7.1.
  85. tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje ar tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei žinomas. 7.
  86. Ląstelės 7.2.
  87. ląstelių tipas ir šaltinis; 7.2.
  88. panaudoto ląstelių tipo kariotipo ypatybės ir tinkamumas; 7.2.
  89. informacija apie tai, ar ląstelės neužkrėstos mikoplazmomis, jei taikytina; 7.2.
  90. informacija apie ląstelinio ciklo trukmę; 7.2.
  91. kraujo donorų, iš kurių buvo gauti viso kraujo mėginiai ar iš kurių kraujo buvo išskirti limfocitai, lytis bei panaudotas mitogenas; 7.2.
  92. ląstelių persėjimų skaičius, jei taikytina; 7.2.
  93. ląstelių kultivavimo metodai, jei taikytina; 7.2.
  94. modalinis chromosomų skaičius. 7.
  95. Bandymo sąlygos 7.3.
  96. metafazę sustabdančios cheminės medžiagos prigimtis, koncentracija bei laikas, kurį ši medžiaga veikė ląsteles; 7.3.
  97. pagrindinė priežastis, dėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos ir ląstelių kultūrų kultivavimo skaičius nurodant, jei įmanoma, citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas; 7.3.
  98. terpės sudėtis ir CO2 koncentracija, jei taikytina; 7.3.
  99. bandomosios medžiagos koncentracija; 7.3.
  100. tirpinančiojo įrenginio darbinė talpa bei į jį įleistos bandomosios medžiagos tūris; 7.3.
  101. inkubacijos temperatūra; 7.3.
  102. inkubacijos trukmė; 7.3.
  103. veikimo bandomąja medžiaga trukmė; 7.3.
  104. ląstelių tankis pasėjimo metu, jei taikytina; 7.3.
  105. metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant tinkamumo kriterijus; 7.3.
  106. teigiami ir neigiami kontroliniai bandiniai; 7.3.
  107. skaidrių paruošimo būdai; 7.3.
  108. aberacijų vertinimo kriterijai; 7.3.
  109. ištirtų metafazių skaičius; 7.3.
  110. toksiškumo įvertinimo būdai; 7.3.
  111. kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama, ar tyrimų metu gauti rezultatai teigiami, neigiami bei abejotini. 7.
  112. Rezultatai 7.4.
  113. toksiškumo požymiai, pavyzdžiui, ląstelių kultūrų kolonijų susiliejimo laipsnis, ląstelinio ciklo duomenys, ląstelių skaičius, mitozinis indeksas; 7.4.
  114. precipitacijos požymiai; 7.4.
  115. duomenys apie terpės pH ir osmosinį slėgį, jei tai buvo nustatyta; 7.4.
  116. aberacijų, įskaitant plyšius, apibūdinimas; 7.4.
  117. ląstelių, esančių tiriamąja medžiaga veiktose bei kontrolinėse kolonijose ir turinčių chromosomų aberacijas, skaičius bei chromosomų aberacijų tipas; 7.4.
  118. ploidiškumo pokyčiai, jei pastebėti; 7.4.
  119. dozės ir atsako sąryšis, jei įmanoma; 7.4.
  120. statistinės analizės, jei atliktos; 7.4.
  121. vienu metu gauti neigiamų (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) ir teigiamų kontrolinių bandinių tyrimų duomenys; 7.4.
  122. duomenys, gauti anksčiau atliktų tyrimų metu išanalizavus neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) ir teigiamus kontrolinius bandinius, nurodant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus.
  123. Bandymų protokole pateikiamas rezultatų aptarimas ir išvados. IV. NUORODOS
  124. Evans H. J.

(1976), Cheminių mutagenų aptikimo citologiniai metodai (Cheminių mutagenų aptikimo principai ir metodai, 4 t., red. Hollaender A., Plenum Press, Niujorkas, Londonas, 1–29). 10. Ishidate M. Jr., Sofumi T.
(1985), In vitro chromosomų aberacijos bandymas naudojant kinietiškų žiurkėnų plaučių (CHL) fibroblastų ląstelių kultūras (Mutacijų tyrimų progresas, 5 t., red. Ashby J. ir kt., Elsevier Science Publishers, Amsterdamas, Niujorkas, Oksfordas, 427–432). 11. Galloway S. M., Armstrong M. J., Reuben C., Colman S., Brown B., Cannon C., Bloom A. D., Nakamura F., Ahmed M., Duk S., Rimpo J., Margolin G. H., Resnick M. A., Anderson G., Zeiger E.
(1978), Chromosomų aberacijos ir seserinių chromatidžių apsikeitimai kinietiško žiurkėno kiaušidės ląstelėse. 108 cheminių medžiagų įvertinimas, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), 1–175. 12. Scott D., Galloway S. M., Marshall R. R., Ishidate M. Jr., Brusick D., Ashby J., Myhr B. C.
(1991), Genotoksiškumas ekstremaliomis kultūros sąlygomis. ICPEMC 9 darbo grupės ataskaita, Mutation Res., 257, 147–204. 13. Morita T., Nagaki T., Fukuda I., Okumura K.
(1992), Mažo pH klastogeniškumas įvairioms kultivuojamoms žinduolių ląstelėms, Mutation Res., 268, 297–305. 14. Ames B. N., McCann J., Yamasaki E.
(1975), Kancerogenų ir mutagenų nustatymo metodai naudojant Salmonella. Žinduolių mikrosomų mutageniškumo bandymas, Mutation Res., 31, 347–364. 15. Maron D. M., Ames B. N.
(1983), Patikslinti Salmonella mutageniškumo bandymai, Mutation Res., 113, 173–
  2. Natarajan A. T., Tates A. D., van Buul P. P. W., Meijers M., de Vogel N.
(1976), Mutagenų ir kancerogenų citogeniniai poveikiai po aktyvacijos mikrosominėse sistemose in vitro. I. Chromosomų aberacijų ir seserinių chromatidžių apsikeitimų CHO ląstelėse indukcija dietilnitrozaminu (DEN) ir dimetilnitrozaminu (DMN) naudojant žiurkių kepenų mikrosomas, Mutation Res., 37, 83–90. 17. Matsuoka A., Hayashi M., Ishidate M. Jr.
(1979), 29 cheminių medžiagų chromosomų tyrimas naudojant S9 mišinį in vitro, Mutation Res., 66, 277–
  2. Elliot B. M., Combes R. D., Elcombe C. R., Gatehouse D. G., Gibson G. G., Mackay J. M., Wolf, R. C.
(1992), Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. Alternatyva Aroclor 1254 indukuotam S9 in vitro genotoksiškumo įvertinime, Mutagenesis, 7, 175–177. 19. Matsushima T., Sawamura M., Hara K., Sugimura T.
(1976), Saugus polichlorintųjų bifenilų, naudojamų kaip metabolinių aktyvacijos sistemų induktorių, pakaitalas (de Serres F. J., Fouts J. R., Bend J. R., Philpot R. M. (red.), In vitro mutageniškumo tyrimų metabolinė aktyvacija, Elsevier, Šiaurės Olandija, 85–88). 20. Galloway S. M., Aardema M. J., Ishidate M. Jr., Ivett J. L., Kirkland D. J., Morita T., Mosesso P., Sofumi T.
(1994), Darbo grupės ataskaita apie chromosomų aberacijų in vitro bandymus, Mutation Res., 312, 241–
  2. Richardson C., Williams D. A., Allen J. A., Amphlett G., Chanter D. O., Phillips B.
(1989), In vitro citogeniškumo įvertinimo duomenų analizė (Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 141–154). 22. Soper K. A., Galloway S. M.
(1994), Replikavimo kolbos nereikalingos in vitro chromosomų aberacijoms CHO ląstelėse įvertinti, Mutation Res., 312, 139–149. 23. Krahn D. F., Barsky F. C., McCooey K. T.
(1982), CHO/HGPRT mutageniškumo įvertinimas. Dujų ir lakių skysčių įvertinimas (red. Tice R. R., Costa D. L., Schaich K. M., Oro veiksnių genotoksinis poveikis, Niujorkas, Plenum, 91–103. 24. Zamora P. O., Benson J. M., Li A. P., Brooks A. L.
(1983), Ląstelių augimą ant kolageno gelių labai lakiems mutagenams aptikti CHO/HGPRT mutacijų įvertinime taikančios poveikio sistemos įvertinimas, Environmental Mutagenesis, 5, 795–801. 25. Locke-Huhle C.
(1983), Kinietiško žiurkėno ląstelių endoreduplikacija alfa spinduliuotės indukuoto G2 sustabdymo metu, Mutation Res., 119, 403–413. 26. Huang Y., Change C., Trosko J. E.
(1983), Afiodikolino indukuota kinietiško žiurkėno ląstelių endoreduplikacija, Cancer Res., 43, 1362–
  1. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B11 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ kaulų čiulpų CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ In vivo bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  2. Įvadas 1.
  3. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 475 metodu. 1.
  4. Žinduolių chromosomų aberacijų bandymas in vivo naudojamas nustatyti struktūrinėms chromosomų aberacijoms, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai graužikų, kaulų čiulpų ląstelėse. Chromosomų struktūrinės aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Poliploidiškumo reiškimosi intensyvumas rodo, kad cheminė medžiaga gali sukelti chromosomų skaičiaus pasikeitimus. Dauguma cheminių mutagenų sukelia chromatidines aberacijas, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra chromosomų mutacijos bei su jomis susiję įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl chromosomų mutacijų bei su jomis susijusių įvykių. 1.
  5. Šiam bandymui paprastai naudojamas griaužikų stuburo skliautas. Pagrindinis tiriamasis audinys yra kaulų čiulpai, nes jie išvagoti daugybės kraujagyslių, be to, kaulų čiulpuose yra daug greitai besidauginančių ląstelių, kurios lengvai išskiriamos ir apdorojamos. Šiuo metodu netiriami kitų rūšių žinduoliai bei jų audiniai. 1.
  6. Šis bandymas ypač svarbus, kai vertinama mutagenų daroma žala, nes juo galima ištirti metabolizmo, farmakokinetikos ir DNR pažaidų reparacinių procesų veiksnius in vivo, nors jie gali varijuoti tarp skirtingų žinduolių rūšių ir skirtingų audinių. Tyrimas in vivo naudingas ir tuo, kad galima ištirti mutageninius poveikius, anksčiau nustatytus in vitro. 1.
  7. Jeigu įrodoma, kad bandomoji medžiaga arba reaktyvus jos metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
  8. Apibrėžimai 2.
  9. Chromatidinė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip pavienių chromatidžių suardymas arba kaip chromatidžių suardymas ir susijungimas. 2.
  10. Chromosominė aberacija – struktūrinis chromosomos pakenkimas, pasireiškiantis kaip abiejų seserinių chromatidžių trūkis arba kaip jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje. 2.
  11. Endoreduplikacija – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos sintezės (S) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidžių. 2.
  12. Spraga (plyšys) – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių. 2.
  13. Mitozės indeksas – mitozės metafazėje esančių ląstelių ir viso ląstelių populiacijos skaičiaus santykis, rodantis tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį. 2.
  14. Chromosomų skaičiaus aberacija – ląstelėse esančių chromosomų skaičiaus pokytis palyginus su normaliu jų skaičiumi, būdingu toms ląstelėms. 2.
  15. Poliploidija – haploidinio chromosomų skaičiaus (n), išskyrus diploidinį skaičių (t. y. 3n, 4n ir t. t.), kartotinis. 2.
  16. Struktūrinė aberacija – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti, dalijimosi ciklo metafazėje esančias ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.
  17. Bandymo metodo principas. Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga pagal atitinkamą procedūrą ir atitinkamais laiko tarpais numarinami. Prieš numarinimą gyvūnai paveikiami medžiaga, sustabdančia ląstelių dalijimąsi metafazėje (pavyzdžiui, kolchicinu arba Kolcemidu©). Po to iš kaulų čiulpų ląstelių išskiriamos ir dažomos chromosomos; metafazėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu.
  18. Bandymo metodo aprašymas 4.
  19. Pasiruošimas 4.1.
  20. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Paprastai naudojamos žiurkės, pelės ir kiniški žiurkėnai, tačiau gali būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduolių rūšys. Reikia naudoti dažniausiai naudojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Bandymo pradžioje gyvūnų kūno masių skirtumai turi būti kuo mažesni ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinės masės. 4.1.
  21. Laikymo ir šėrimo sąlygos. Taikomos Bendrajame įvade nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad santykinis oro drėgnumas būtų 50–60 %. 4.1.
  22. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę ir bandomąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie bandymo sąlygų. 4.1.
  23. Dozių paruošimas. Kietosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai ir praskiestos prieš paveikiant ląsteles šia medžiaga. Prieš bandymą į bandymo sistemą gali būti tiesiogiai suleidžiamos ir/ar praskiedžiamos skystosios bandomosios medžiagos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas. 4.
  24. Bandymo sąlygos 4.2.
  25. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. Vandenį galima pašalinti molekuliniu filtru. 4.2.
  26. Kontroliniai bandiniai 4.2.2.
  27. Kiekvieno bandymo metu tiriami iš kiekvienos lyties gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai. Kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir gyvūnai, paveikti bandomąja chemine medžiaga (bandomosios grupės gyvūnai), išskyrus tą laiką, kai bandomosios grupės gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga. 4.2.2.
  28. Teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, paveiktuose tokia pačia bandomosios medžiagos doze in vivo, turi būti aptinkamos struktūrinės aberacijos, kurioms esant bei veikiant bandomąja medžiaga, būtų galima nesunkiai sumažinti pašalinį foną pakartotinai (tai parodo bandymo sistemos jautrumą). Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunamas atsakas būtų aiškus, bet tyrėjas negalėtų jo iškart nustatyti. 4.2.2.
  29. Teigiami kontroliniai bandiniai dozuojami vieną kartą ir gyvūnams suleidžiami tokiu būdu, kuris skiriasi nuo bandomosios cheminės medžiagos suleidimo būdo. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje. 1 lentelė. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr. Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7 Etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2 Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2 Trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5 4.2.2.
  30. Neigiami kontroliniai bandiniai, paveikti vien tirpikliu, vien tirpinančiuoju įrenginiu, arba kiti bandiniai, paveikti tuo pačiu būdu kaip ir bandomosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosomų aberacijos, yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai bandiniai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius bandinius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų ataskaitose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.
  31. Darbo eiga 5.
  32. Gyvūnų skaičius ir lytis. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Kai anksčiau atliktų bandymų naudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio būdą duomenys rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, pakanka tirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pavyzdžiui, jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia tirti atitinkamos lyties gyvūnus. 5.
  33. Dozavimas 5.2.
  34. Bandomąja medžiaga veikiama vieną kartą. Galima taikyti išskaidytą dozę, kai tą pačią dieną du kartus su kelių valandų pertrauka paveikiama bandomąja medžiaga. Tai gali būti reikalinga, norint įvesti pakankamai didelį bandomosios medžiagos tūrį. Taikant kitokį dozavimą, tai turi būti moksliškai pagrįsta. 5.2.
  35. Prieš poveikį bandomąja medžiaga tą pačią dieną reikia dukart atskirai paimti bandinius. Tiriant graužikus, pirmasis bandinys paimamas praėjus maždaug 1,5 ląstelinio ciklo (parprastai šis ciklas trunka 12–18 valandų) po veikimo. Kadangi tiriamosios medžiagos įsiskverbimas, metabolizmas bei įtaka ląsteliniam ciklui gali paveikti optimalų laiką, per kurį nustatomos chromosomų aberacijos, tai rekomenduojama, kad antrasis bandinys būtų paimamas praėjus 24 valandoms po veikimo. Jei dozės duodamos daugiau nei vieną dieną, bandinys paimamas po veikimo maždaug 1,5 normalaus ląstelinio ciklo trukmės. 5.2.
  36. Prieš numarinant gyvūnams į pilvaplėvės ertmę suleidžiama atitinkama dozė metafazę sustabdančios medžiagos (pavyzdžiui, Kolcemido© ar kolchicino). Po atitinkamo laiko iš gyvūnų paimami bandiniai. Pelėms tas laikas yra maždaug 3–5 valandos, kiniškiems žiurkėnams – 4–5 valandos. Iš kaulų čiulpų išskiriamos ląstelės ir analizuojamos, siekiant nustatyti chromosomų aberacijas. 5.
  37. Dozės dydis. Jeigu bandymas atliekamas siekiant surasti dozių intervalą (neturint duomenų apie jį), tai jis turi būti atliekamas toje pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei taikant tokį patį dozavimą, koks buvo naudojamas pagrindinio bandymo metu. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai, pirmąkart imant bandinius, naudojamos trys skirtingos dozės. Šios dozės turi apimti visą intervalą, pradedant nuo didžiausią toksiškumą sukeliančios ir baigiant mažiausią toksiškumą sukeliančia arba tokia doze, kuri visiškai netoksiška. Vėliau, imant bandinius, naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės, požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį patį dozavimą suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminėms medžiagos, kurių mažos ir netoksiškos dozės pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu (pavyzdžiui, hormonai ir mitogenai), taikomos dozavimo kriterijų išimtys, jų dozavimas nustatomas atskirai kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, mitozės indeksas sumažėja daugiau nei 50 %). 5.
  38. Ribinis bandymas. Jeigu bandymas atliekamas taikant vieną dozę, kuri įvedus vienu ar dviem kartais per vieną dieną, yra ne mažesnė kaip 2000 mg/kg ir nesukelia toksiškumo bei, atsižvelgiant į struktūriškai panašių medžiagų tyrimų duomenis, nesitikima jos genotoksinio poveikio, tai tikslinga atlikti pagrindinį bandymą taikant tris dozes. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 14 dienų, ribinė dozė turi būti 2000 mg/kg, kai ilgiau kaip 14 dienų – 1000 mg/kg. Atsižvelgiant į galimą bandomosios medžiagos poveikį, žmonėms gali reikėti taikyti didesnę dozę. 5.
  39. Dozių įvedimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Galima įvesti ir kitais būdais, moksliškai juos pagrindus. Didžiausias skysčio į skrandį ar pilvaplėvės ertmę suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo eksperimentinio gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 g kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių suleidimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus dirginančias ir ardančias medžiagas, kurių didesnės koncentracijos sukelia žalingas pasekmes, bandomosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad įvedant visas dozes įvedamos medžiagos tūris būtų vienodas. 5.
  40. Chromosomų paruošimas. Kai tik gyvūnai numarinami, iš jų iškart išimami kaulų čiulpai, pamerkiami į hipotoninį tirpalą ir fiksuojami. Vėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklaidomos ant tepinėlių ir nudažomos. 5.
  41. Analizė 5.7.
  42. Mitozės indeksas nustatomas įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1000 ląstelių, paimtų iš 1 gyvūno. Tai atliekama, ištiriant visus bandomąja medžiaga veiktus (įskaitant teigiamus kontrolinius) ir neveiktus (neigiamus kontrolinius) gyvūnus. 5.7.
  43. Išanalizuojama mažiausiai 100 ląstelių, gautų iš vieno gyvūno. Šis skaičius gali būti sumažinamas, jei stebima daug chromosomų aberacijų. Visos skaidrės (įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandinių skaidres) turi būti užkoduojamos nepriklausomai viena nuo kitos tolesniam mikroskopiniam tyrimui. Ruošiant skaidres dažnai suardomos metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, todėl vėliau suskaičiuotos ląstelės turi turėti 2n ± 2 centromerų. II. Duomenys
  44. Duomenų apdorojimas. Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno ląstelių, chromosomų aberacijų vienoje ląstelėje skaičių bei ląstelių, turinčių chromosomas su struktūrinėmis aberacijomis, skaičių, išreiškiamą procentais. Reikia išvardyti skirtingus chromosomų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant jų skaičių bei pasireiškimo dažnį gyvūnų, paveiktų ir nepaveiktų bandomąja medžiaga, grupėse. Atskirai registruojami plyšiai, tačiau į juos neatsižvelgiama, nustatant absoliutų aberacijų dažnį. Jeigu tarp lyčių nenustatoma jokių atsako skirtumų, tai atliekant statistinę analizę, abiejų lyčių gyvūnų tyrimo duomenys apjungiami.
  45. Duomenų įvertinimas ir interpretacija 7.
  46. Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas bei pakartojamas chromosomines aberacijas turinčių ląstelių skaičiaus padidėjimas, kuriuo remiantis nustatoma, ar gautas rezultatas yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia pakeičiant bandymo sąlygas. 7.
  47. Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji medžiaga gali slopinti mitozę ir sukelti chromosomų skaičiaus ląstelėje pakitimus. Ląstelių, turinčių endoreduplikuotas chromosomas, skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad tiriamoji medžiaga gali slopinti ląstelinį ciklą. 7.
  48. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 ir 7.2 punktuose nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška. 7.
  49. Po daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs. 7.
  50. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromosomų aberacijas gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų tirtos gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Reikia aptarti bandomosios medžiagos ar jos metabolitų galimybę į specifinį audinį patekti per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju). III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
  51. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija: 8.
  52. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys 8.1.
  53. priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys; 8.1.
  54. tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje ar tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei žinomas. 8.
  55. Eksperimentiniai gyvūnai 8.2.
  56. panaudota rūšis ar kamienas; 8.2.
  57. šaltinis, laikymo sąlygos, šėrimas; 8.2.
  58. kiekvieno gyvūno kūno masė prieš bandymą, kiekvienos grupės gyvūnų kūno masių ribos, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. 8.
  59. Bandymo sąlygos 8.3.
  60. teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai; 8.3.
  61. ribinio bandymo duomenys (jei atliktas); 8.3.
  62. pasirinkto dozavimo pagrindimas; 8.3.
  63. bandomosios medžiagos įvedimo duomenys; 8.3.
  64. pasirinkto medžiagos įvedimo būdo pagrindimas; 8.3.
  65. metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji medžiaga pateko į specifinį audinį per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu, jei jie taikyti; 8.3.
  66. bandomosios medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (md) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg per dieną), jei tai įmanoma; 8.3.
  67. pašarų ir geriamojo vandens kokybės duomenys; 8.3.
  68. detalus dozių įvedimo ir bandinių paėmimo aprašymas; 8.3.
  69. metodai toksiškumui įvertinti; 8.3.
  70. metafazę sustabdančios medžiagos prigimtis, jos koncentracija bei veikimo ja trukmė; 8.3.
  71. skaidrių paruošimo būdai; 8.3.
  72. aberacijų įvertinimo kriterijai; 8.3.
  73. iš vieno gyvūno išskirtų ir ištirtų ląstelių skaičius; 8.3.
  74. teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai. 8.
  75. Rezultatai 8.4.
  76. toksiškumo požymiai; 8.4.
  77. mitozės indeksas; 8.4.
  78. kiekvieno gyvūno ląstelėse esančių aberacijų tipas ir skaičius; 8.4.
  79. absoliutus aberacijų vienos grupės gyvūnų ląstelėse skaičius, kartu nurodant vidurkius ir standartinius nuokrypius; 8.4.
  80. ploidiškumo pasikeitimai, jei nustatyti; 8.4.
  81. dozės ir atsako sąryšis, jei tai įmanoma nustatyti; 8.4.
  82. statistinė analizė, jei atlikta; 8.4.
  83. vienu metu gauti neigiami kontroliniai duomenys; 8.4.
  84. anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius; 8.4.
  85. vienu metu gauti teigiami kontroliniai duomenys.
  86. Bandymų protokole pateikiamas rezultatų aptarimas ir išvados. IV. NUORODOS
  87. Adler I. D.
(1984), Žinduolių citogenetiniai tyrimai (Mutageniškumo tyrimas. Praktinis požiūris, red. Venitt S., Parry J. M., IRL Press, Oksfordas, Vašingtono apygarda, 275–306). 11. Preston R. J., Dean B. J., Galloway S., Holden H., McFee A. F., Shelby M.
(1987), Žinduolių citogenetiniai tyrimai in vivo. Kaulų čiulpų ląstelių chromosomų aberacijų analizė, Mutation Res., 189, 157–
  2. Richold M., Chandley A., Ashby J., Gatehouse D. G., Bootman J., Henderson L.
(1990), Citogenetiniai įvertinimai in vivo (red. Kirkland D. J., Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. UKEMS rekomenduojamos procedūros. UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, I dalis, Cambridge University Press, Kembridžas, Niujorkas, Portčesteris, Melburnas, Sidnėjus, 115–141). 13. Tice R. R., Hayashi M., MacGregaro J. T., Anderson D., Blakey D. H., Holden H. E., Kirsch-Volders M., Oleson Jr. F. B., Pacchierotti F., Preston R. J., Romagna F., Shimada H., Sutou S., Vannier B.
(1994), Žinduolių kaulų čiulpų ląstelių chromosomų aberacijų in vivo bandymų darbo grupės ataskaita, Mutation Res., 312, 305–
  2. Fielder R. J., Allen J. A., Boobis A. R., Botham P. A., Doe J., Esdaile D. J., Gatehouse D. G., Hodson-Walker G., Morton D. B., Kirkland D. J., Richold M.
(1992), Britanijos toksikologijos draugijos ir Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. In vivo mutageniškumo bandymų dozių parinkimas, Mutagenesis, 7, 313–
  2. Lovell D. P., Anderson D., Albanese R., Amphlett G. E., Clare G., Ferguson R., Richold M., Papworth D. G., Savage J. R. K.
(1989), In vivo citogenetinių įvertinimų statistinė analizė (UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, III dalis. Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 184–232. 16. Locke-Huhle C.
(1983), Kinietiško žiurkėno ląstelių endoreduplikacija alfa spinduliuotės indukuoto G2 sustabdymo metu, Mutation Res., 119, 403–413. 17. Huang Y., Change C., Trosko J. E.
(1983), Afiodikolino indukuota kinietiško žiurkėno ląstelių endoreduplikacija, Cancer Res., 43, 1362–
  1. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B12 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ eritrocitų mikrobranduolių In vivo bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  2. Įvadas 1.
  3. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 474 metodu. 1.
  4. Bandymas taikomas analizuoti gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų eritrocitus bei periferinio kraujo ląsteles, siekiant nustatyti bandomosios cheminės medžiagos sukeltus eritroblastų chromosomų arba mitozės mechanizmo pažeidimus. 1.
  5. Bandymo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgyja pirminę struktūrą („išnyksta“). 1.
  6. Kai kaulų čiulpų eritroblastas vystydamasis virsta polichrominiu eritrocitu, pagrindinis (didysis) branduolys suspaudžiamas ir bet kuris susiformavęs mikrobranduolys gali likti už citoplazmos, neturinčios branduolio, ribų. Šiose ląstelėse galima pamatyti mikrobranduolius, nes ląstelė yra praradusi savo pagrindinį branduolį. Jei gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja chemine medžiaga, padaugėja polichrominių eritrocitų su mikrobranduoliais, tai rodo, kad pažeistos chromosomos. 1.
  7. Atliekant šį bandymą, paprastai naudojami griaužikų kaulų čiulpai, nes būtent šiame audinyje susiformuoja polichrominiai eritrocitai. Periferinio kraujo polichrominių (nesubrendusių, turinčių mikrobranduolius) eritrocitų tyrimą galima atlikti su bet kuria rūšimi, kurios blužnis nesugebėjo pašalinti eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, arba kuri buvo pakankamai jautri žinomoms medžiagoms, sukeliančioms chromosomų aberacijas. Mikrobranduolius galima atskirti pagal daugelį kriterijų. Vienas jų yra kinetochorų arba centromerinės DNR, esančios arba nesančios mikrobranduoliuse, nustatymas. Bandymo, kai gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga kelias ar daugiau savaičių, pagrindinis tikslas taip pat gali būti periferiniame kraujyje esančių subrendusių (normochrominių) eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičiaus palyginimas su subrendusių eritrocitų skaičiumi. 1.
  8. Šis bandymas ypač svarbus, įvertinant mutagenų daromą žalą, pagal kurią galima spręsti apie metabolizmą, farmakokinetiką bei DNR pažaidų reparaciją in vivo nulemiančius veiksnius, nors jie gali skirtis priklausomai nuo gyvūnų rūšies, audinio ir genetinio lygmens. Tyrimas in vivo taip pat naudingas, toliau tiriant mutageninius atsakus, nustatytus in vitro. 1.
  9. Jeigu įrodoma, kad bandomoji medžiaga arba reaktyvus jos metabolitas neįsiskverbia į audinį, į kurį buvo nukreiptas, jis nėra naudojamas šiam tyrimui. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
  10. Apibrėžimai 2.
  11. Centromera (kinetochoras) – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose. 2.
  12. Mikrobranduoliai – papildomi branduoliai, atsiskyrę nuo didžiojo ląstelės branduolio, susidarantys tada, kai mitozės telofazės metu chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos įgauna pirminę struktūrą („išnyksta“). 2.
  13. Normochrominis eritrocitas – subrendęs, neturintis ribosomų eritrocitas, kuris skiriasi nuo nesubrendusio polichrominio eritrocito pagal ribosomų nusidažymą specifiniais dažais. 2.
  14. Polichrominis eritrocitas – nesubrendęs, tarpinėje vystymosi stadijoje esantis eritrocitas, kuris vis dar tebeturi ribosomas ir gali būti atskirtas nuo subrendusio normochrominio eritrocito ribosomų nusidažymą specifiniais dažais.
  15. Bandymo metodo principas. Gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga pasirinktu būdu. Jeigu naudojami kaulų čiulpai, tai, praėjus tam tikriems laiko tarpams po veikimo tiriamąja medžiaga, gyvūnai numarinami, iš jų išimami kaulų čiulpai, paruošiami jų preparatai ir nudažomi. Kai naudojamas periferinis kraujas, tai po veikimo tiriamąja medžiaga praėjus atitinkamiems laiko tarpams, paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi. Tiriant periferinį kraują, kaip galima mažiau laiko turi praeiti tarp paskutinio veikimo ir ląstelių surinkimo. Preparatai analizuojami, siekiant identifikuoti mikrobranduolius.
  16. Bandymo metodo aprašymas 4.
  17. Pasiruošimas 4.1.
  18. Gyvūnų rūšies pasirinkimas. Kai tiriami kaulų čiulpai, rekomenduojama naudoti peles ar žiurkes, nors galima pasirinkti ir bet kokias kitas žinduolių rūšis. Kai tiriamas periferinis kraujas, rekomenduojama pasirinkti peles. Tačiau galima naudoti bet kokias kitas žinduolių rūšis, jeigu įrodoma, kad tos rūšies žinduolių blužnis nesugeba pašalinti eritrocitų su mikrobranduoliais arba tos rūšies žinduoliai pakankamai jautrūs žinomoms medžiagoms, sukeliančioms struktūrines chromosomų aberacijas ar chromosomų skaičiaus viename chromosomų rinkinyje pakitimus. Reikia naudoti dažniausiai naudojamus jaunų sveikų suaugusių gyvūnų laboratorinius kamienus. Bandymo pradžioje gyvūnų kūno masių skirtumai turi būti kuo mažesni ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūnų vidutinės masės. 4.1.
  19. Laikymo ir šėrimo sąlygos. Taikomos Bendrajame įvade nurodytos sąlygos, nors stengiamasi, kad santykinis oro drėgnumas būtų 50–60 %. 4.1.
  20. Gyvūnų paruošimas. Sveiki jauni subrendę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolinę ir bandomąją grupes. Narvai išdėstomi taip, kad būtų iki minimumo sumažinti aplinkos poveikiai, susiję su narvų laikymu. Kiekvienas gyvūnas individualiai paženklinamas. Gyvūnams ne mažiau kaip 5 dienas leidžiama prisitaikyti prie bandymo sąlygų. 4.1.
  21. Dozių paruošimas. Kietosios medžiagos ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinančiuosiuose įrenginiuose, o jeigu reikia, tai ir praskiestos. Skystųjų bandomųjų medžiagų dozės ruošiamos iškart arba prieš įvedimą gyvūnams jos praskiedžiamos. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas. 4.
  22. Bandymo sąlygos 4.2.
  23. Tirpiklis ir tirpinantysis įrenginys. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant, reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. 4.2.
  24. Kontroliniai bandiniai 4.2.2.
  25. Kiekvieno bandymo metu tiriami iš kiekvienos lyties gyvūnų paimti bei tuo pačiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai. Kontrolinės grupės gyvūnai turi būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir gyvūnai, paveikti bandomąja chemine medžiaga (bandomosios grupės gyvūnai), išskyrus tą laiką, kai bandomosios grupės gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga. 4.2.2.
  26. Teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, paveiktuose tokia pačia bandomosios medžiagos doze in vivo, užgožiančia pašalinį foną, turi susidaryti mikrobranduoliai.. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolinės dozės, kad gaunamas atsakas būtų aiškus, bet tyrėjas negalėtų jo iškart nustatyti. 4.2.2.
  27. Teigiami kontroliniai bandiniai dozuojami vieną kartą ir gyvūnams suleidžiami tokiu būdu, kuris skiriasi nuo bandomosios medžiagos suleidimo būdo. Kai įmanoma, reikia apsvarstyti teigiamų kontrolinių medžiagų, priklausančių konkrečiai klasei, panaudojimą. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje. 1 lentelė. Teigiamų kontrolinių bandinių medžiagų pavyzdžiai Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr. Etilmetansulfonatas 62-50-0 200-536-7 Etilnitrošlapalas 759-73-9 212-072-2 Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2 Trietilenmelaminas 51-18-3 200-083-5 4.2.2.
  28. Neigiami kontroliniai bandiniai, paveikti vien tirpikliu, vien tirpinančiuoju įrenginiu, arba kiti bandiniai, paveikti tuo pačiu būdu kaip ir bandomosios grupės, turi būti paimami kiekvieną kartą, nekreipiant dėmesio į anksčiau atliktų tyrimų metu gautus kontrolinius duomenis, rodančius, kad variacijos laipsnis tarp gyvūnų ir eritrocitų su mikrobranduoliais yra tinkamas. Jei neigiami kontroliniai bandiniai paimami tik vieną kartą, tai pirmojo paėmimo laikas yra tinkamiausias. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontrolinius bandinius, nekreipiant dėmesio į tai, kad anksčiau atliktų eksperimentų ataskaitose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys nesukėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio. 4.2.2.
  29. Jei naudojamas periferinis kraujas, tai bandinys prieš veikimą bandomąja medžiaga gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė, tačiau tik trumpai trunkančių periferinio kraujo tyrimų metu (pavyzdžiui, 1–3 kartus veikiant bandomąja medžiaga), nes taip gaunami duomenys atitinka anksčiau naudotos kontrolės intervalą.
  30. Darbo eiga 5.
  31. Gyvūnų skaičius ir lytis. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turi būti ne mažiau kaip 5 vienos lyties gyvūnai. Kai anksčiau atliktų bandymų, naudojant tą pačią gyvūnų rūšį ir tą patį poveikio būdą, duomenys rodo, kad toksiškumo tarp atskirų lyčių skirtumai yra labai nedideli, pakanka tirti vienos lyties gyvūnus. Jeigu žmogaus jautrumas cheminėms medžiagoms, kuriomis jis yra veikiamas, priklauso nuo lyties, pavyzdžiui, jautrumas kai kurioms farmakologiškai aktyvioms medžiagoms, tai reikia tirti atitinkamos lyties gyvūnus. 5.
  32. Dozavimas 5.2.
  33. Taikyti standartinio dozavimo (t. y. 1, 2 ar daugiau veikimų atliekami kas 24 valandos) nerekomenduojama. Geriau dozuoti tol, kol nustatomas teigiamas atsakas arba, atliekant neigiamą kontrolinį bandymą, tol, kol nustatomas toksiškumas arba, naudojant ribinę dozę, iki bandinio paėmimo. Siekiant įvesti didesnį bandomosios medžiagos tūrį, ji gali būti įvedama ir išskaidyta doze, t. y per 1 dieną atliekami 2 poveikiai bandomąja medžiaga ir abi procedūras skiria ne ilgesnis kaip kelių valandų laikas. 5.2.
  34. Bandymas gali būti atliekamas dviem būdais: 5.2.2.
  35. gyvūnai vienąkart veikiami bandomąja medžiaga. Kaulų čiulpų bandiniai paimami mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip 24 valandos ir ne vėliau kaip 48 valandos po veikimo bandomąja medžiaga. Jeigu mėginiai imami anksčiau nei praėjus 24 valandoms po veikimo, tai turi būti nurodomos priežastys, paskatinusios imtis tokių veiksmų. Periferinio kraujo bandiniai imami atitinkamais intervalais mažiausiai 2 kartus, ne anksčiau kaip 36 valandos ir ne vėliau kaip 72 valandos po veikimo bandomąja medžiaga. Kai nustatomas teigiamas atsakas viename bandinyje, kitų bandinių imti nereikia; 5.2.2.
  36. jei per dieną atliekami du ir daugiau veikimų (pavyzdžiui, atliekami du ir daugiau veikimų kas 24 valandos), tai bandiniai paimami vieną kartą, praėjus 18–24 valandoms po paskutinio kaulų čiulpų paveikimo bandomąja medžiaga, ir praėjus 36–48 valandoms po paskutinio periferinio kraujo ląstelių paveikimo tiriamąja medžiaga. Bandiniai, jei reikia, gali būti papildomai paimami ir kitu laiku. 5.
  37. Dozės dydis. Jeigu bandymas atliekamas, siekiant surasti dozių intervalą (neturint duomenų apie jį), tai jis turi būti atliekamas to pačioje laboratorijoje, naudojant tos pačios rūšies, kamieno ir lyties gyvūnus bei taikant tokį patį dozavimą, koks buvo naudojamas pagrindinio bandymo metu. Jeigu nustatomas toksiškumas, tai pirmąkart imant mėginius naudojamos trys skirtingos dozės. Šios dozės turi apimti visą intervalą, pradedant nuo didžiausią toksiškumą sukeliančios ir baigiant mažiausią toksiškumą sukeliančia arba tokia doze, kuri visiškai netoksiška. Vėliau imant bandinius naudojama tik pati didžiausia dozė. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kuriai esant, išryškėja toksiškumo, priklausomo nuo dozės požymiai, pasirodantys, kai naudojant tokį patį dozavimą, suleidžiama didžiausia dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina. Cheminėms medžiagos, kurių mažos ir netoksiškos dozės pasižymi specifiniu biologiniu aktyvumu (pavyzdžiui, hormonai ir mitogenai), taikomos dozavimo kriterijų išimtys, jų dozavimas nustatomas atskirai kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia dozė, kurią suleidus į kaulų čiulpus, pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (nesubrendusių eritrocitų skaičius, lyginant su absoliučiu visų eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir periferiniame kraujyje, skaičiumi, sumažėja). 5.
  38. Ribinis bandymas. Jeigu tyrimas atliekamas taikant vieną dozę, kuri įvedus vienu ar dviem kartais per vieną dieną, yra ne mažesnė kaip 2000 mg/kg ir nesukelia toksiškumo bei, atsižvelgiant į struktūriškai panašių medžiagų tyrimų duomenis, nesitikima jos genotoksinio poveikio, tai tikslinga atlikti pagrindinį bandymą, taikant tris dozes. Atliekant ilgiau trunkančius tyrimus ir bandomąja medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 14 dienų, ribinė dozė turi būti 2000 mg/kg, kai ilgiau kaip 14 dienų – 1000 mg/kg. Atsižvelgiant į galimą bandomosios medžiagos poveikį, žmonėms gali reikėti taikyti didesnę dozę. 5.
  39. Dozių įvedimas. Bandomoji medžiaga paprastai suleidžiama į skrandį zondu arba į pilvaplėvės ertmę švirkštu. Galima įvesti ir kitais būdais, moksliškai juos pagrindus. Didžiausias skysčio į skrandį ar pilvaplėvės ertmę suleidžiamo skysčio tūris priklauso nuo eksperimentinio gyvūno dydžio. Tūris neturi viršyti 2 ml/100 g kūno masės. Didesnių nei šitų tūrių suleidimas turi būti pagrindžiamas. Išskyrus dirginančias ir ardančias medžiagas, kurių didesnės koncentracijos sukelia žalingas pasekmes, bandomosios medžiagos tūrio kitimas turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentraciją taip sureguliuojant, kad, įvedant visas dozes, įvedamos medžiagos tūris būtų vienodas. 5.
  40. Kaulų čiulpų ir kraujo paruošimas. Kaulų čiulpų ląstelės paprastai išskiriamos iš numarintų gyvūnų šlaunikaulių ir blauzdikaulių. Gerai žinomais metodais paruošiami ir vėliau nudažomi išskirtų ląstelių preparatai. Periferinis kraujas imamas iš uodeginės venos ar kitos kraujagyslės. Iš kraujo išskirtos ląstelės arba iškart dažomos supravitaliniais dažais, arba paruošiami tepinėliai, kurie vėliau nudažomi DNR specifiniais dažais. Akridino oranžinis arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y, gali pašalinti kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda, naudojant DNR nespecifinius dažus, tačiau galima naudoti ir įprastinius dažus (pavyzdžiui, Giemsa dažą). Galima naudoti ir papildomas sistemas, pavyzdžiui, celiulioze užpildytas chromatografines kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti, kadangi įrodyta, kad šiomis sistemomis mikrobranduolius galima tinkamai išskirti laboratorinėmis sąlygomis. 5.
  41. Analizė. Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis, suskaičiuojant mažiausiai 200 eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir 1000 eritrocitų, esančių periferiniame kraujyje. Prieš mikroskopinę analizę visos skaidrės, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, nepriklausomai užkoduojamos. Identifikuojant nesubrendusius eritrocitus, turinčius mikrobranduolius, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Papildoma informacija gali būti gaunama, kai skaičiuojami subrendę eritrocitai su mikrobranduoliais. Nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykis turi būti ne mažesnis kaip 20 % kontrolinė vertės. Jeigu gyvūnai buvo veikiami bandomąja medžiaga mėnesį ir ilgiau, reikia suskaičiuoti mažiausiai 2000 eritrocitų, gautų iš vieno gyvūno. Vietoj rankinio skaičiavimo, atitinkamai pagrindus, galima naudoti patvirtintas automatizuotas analizės sistemas (vaizdo analizės ir ląstelių suspensijos srauto tėkmės citometrinės analizės sistemas). II. Duomenys
  42. Duomenų apdorojimas. Kiekvieno gyvūno tyrimų rezultatai turi būti pateikiami lentelėse. Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų ir nesubrendusių eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičių bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykį. Jeigu gyvūnai veikiami bandomąja medžiaga mėnesį ar ilgiau, turi būti pateikti duomenys apie subrendusius eritrocitus, jei tokie duomenys buvo renkami. Jeigu įmanoma, pateikiamas kiekvieno gyvūno nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis bei eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičius, išreikštas procentais. Jeigu tarp lyčių nenustatoma jokių atsako skirtumų, tai, atliekant statistinę analizę, abiejų lyčių gyvūnų tyrimo duomenys apjungiami.
  43. Duomenų įvertinimas ir interpretacija 7.
  44. Rezultatą priskirti teigiamam galima pagal kelis kriterijus: nuo dozės priklausomas ląstelių su mikrobranduoliais skaičiaus padidėjimas arba akivaizdus ląstelių su mikrobranduoliais skaičiaus padidėjimas po vienkartinio poveikio. Pirmiausia reikia aptarti gautų rezultatų biologinę reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. Abejotini rezultatai turėtų būti išsiaiškinti toliau tęsiant tyrimą ir pirmiausia, pakeičiant bandymo sąlygas. 7.
  45. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 punkte nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška. 7.
  46. Po daug bandymų, gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes, remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs. 7.
  47. Šiuo metodu gauti teigiami rezultatai rodo, kad tiriamoji medžiaga sukelia mikrobranduolių atsiradimą, kurį sąlygoja tiriamosios rūšies gyvūnų eritroblastų chromosomų ar mitozinio mechanizmo pažeidimai. Neigiami rezultatai rodo, kad šiame metode aprašytomis bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia mikrobranduolių atsiradimo tiriamos rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritroblastuose. Reikia aptarti bandomosios medžiagos ar jos metabolitų galimybę į specifinį audinį patekti per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju). III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
  48. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija: 8.
  49. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys 8.1.
  50. priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys; 8.1.
  51. tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje ar tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei žinomas. 8.
  52. Eksperimentiniai gyvūnai 8.2.
  53. panaudota rūšis ar kamienas; 8.2.
  54. šaltinis, laikymo sąlygos, šėrimas; 8.2.
  55. kiekvieno gyvūno kūno masė prieš bandymą, kiekvienos grupės gyvūnų kūno masių ribos, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. 8.
  56. Bandymo sąlygos 8.3.
  57. teigiami ir neigiami (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) kontroliniai bandiniai; 8.3.
  58. ribinio bandymo duomenys (jei atliktas); 8.3.
  59. pasirinkto dozavimo pagrindimas; 8.3.
  60. bandomosios medžiagos įvedimo duomenys; 8.3.
  61. pasirinkto medžiagos įvedimo būdo pagrindimas; 8.3.
  62. metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji medžiaga pateko į specifinį audinį per bendrąją medžiagų apykaitos sistemą arba specifiniu būdu, jei jie taikyti; 8.3.
  63. bandomosios medžiagos, esančios pašaruose ir geriamajame vandenyje, koncentracijos (md) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg per dieną), jei tai įmanoma; 8.3.
  64. pašarų ir geriamojo vandens kokybės duomenys; 8.3.
  65. detalus dozių įvedimo ir bandinių paėmimo aprašymas; 8.3.
  66. skaidrių paruošimo būdai; 8.3.
  67. metodai toksiškumui įvertinti; 8.3.
  68. nesubrendusių eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičiavimo kriterijai; 8.3.
  69. iš vieno gyvūno išskirtų ir ištirtų ląstelių skaičius; 8.3.
  70. teigiamų, neigiamų ar abejotinų rezultatų nustatymo kriterijai. 8.
  71. Rezultatai 8.4.
  72. toksiškumo požymiai; 8.4.
  73. nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis; 8.4.
  74. kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičius; 8.4.
  75. kiekvienos grupės gyvūnų nesubrendusių eritrocitų, turinčių mikrobranduolius, skaičiaus vidurkis ir standartinis nuokrypis; 8.4.
  76. dozės ir atsako sąryšis, jei tai įmanoma nustatyti; 8.4.
  77. statistinė analizė, jei atlikta; 8.4.
  78. vienu metu gauti neigiami kontroliniai duomenys; 8.4.
  79. anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant jų intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius; 8.4.
  80. vienu metu gauti teigiami kontroliniai duomenys.
  81. Bandymų protokole pateikiamas rezultatų aptarimas ir išvados. IV. NUORODOS
  82. Heddle J. A.
(1973), Greitas Chromosomų aberacijų in vivo bandymas, Mutation Res., 18, 187–190. 11. Schmid W.
(1975), Mikrobranduolių bandymas, Mutation Res., 31, 9–
  2. Heddle J. A., Salamone M. F., Hite M., Kirkhart B., Mavournin K., MacGregor J. G., Newell G. W.
(1983), Mikrobranduolių indukcija kaip genotoksiškumo matas, Mutation Res. 123, 61–
  2. Mavournin K. H., Blakey D. H., Cimino M. C., Salamone M. F., Heddle J. A.
(1990), Žinduolių kaulų čiulpų ir periferinio kraujo mikrobranduolių in vivo įvertinimas, JAV Aplinkos apsaugos agentūros Gene-Tox programos ataskaita, Mutation Res., 239, 29–80. 14. MacGregor J. T., Schlegel R., Choy W. N., Wehr C. M.
(1983), Cirkuliuojančių eritrocitų mikrobranduoliai. Greitas chromosomų pažeidimo įvertinimas atliekant standartinius toksiškumo tyrimus su pelėmis (Toksikologijos mokslo ir praktikos pasiekimai, red. Hayes a. W., Schnell R. C.,. Miya T. S., Elsevier, Amsterdamas, 555–558. 15. MacGregor J. T., Heddle J. A., Hite M., Margolin G. H., Ramel C., Salamone M. F., Tice R. R., Wild D.
(1987), Žinduolių kaulų čiulpų eritrocitų mikrobranduolių įvertinimo atlikimo vadovas, Mutation Res., 189, 103–112. 16. MacGregor J. T., Wehr C. M., Henika P. R., Shelby, M. E.
(1990), Eritrocitų mikrobranduolių in vivo bandymas. Pastovios fazės matavimai padidina įvertinimo efektyvumą ir sudaro sąlygas integruoti į toksikologinius tyrimus, Fund. Appl. Toxicol. 14, 513–522. 17. Hayashi M., Morita T., Kodama Y., Sofumi T., Ishidate M. Jr.
(1990), Pelių periferinio kraujo retikuliocitų mikrobranduolių įvertinimas naudojant oranžiniu akridinu dažytas skaidres, Mutation Res., 245, 245–249 18. Mikrobranduolių bandymo bendra tyrimo grupė
(1992), Pelių periferinio kraujo eritrocitų mikrobranduolių supravitalinis dažymas oranžiniu akridinu. CSGMT/JEMMS ir MMS 5 bendro tyrimo ataskaitos santrauka, Mutation Res., 278, 83–
  2. Mikrobranduolių bandymo bendra tyrimo grupė (CSGMT/JEMMS, MMS. Japonijos aplinkos mutagenų draugijos Žinduolių mutagenezės tyrimo grupė)
(1995), Rekomenduojama trumpoji pelių periferinio kraujo mikrobranduolių bandymo procedūra, Mutagenesis, 10, 53–
  2. Hayashi M., Tice R. R., MacGregor J. T., Anderson D., Blackey D. H., Kirsch-Volders M., Oleson Jr. F. B., Pacchicrotti F., Romagna F., Shimada H., Sutou S., Vannier B.
(1994), Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių in vivo įvertinimas, Mutation Res., 312, 293–304. 21. Higashikuni N., Sutou S.
(1995), Pelių periferinių mikrobranduolių bandymo optimalus bendrųjų bandinių paėmimo laikas 30 ± 6 valandos po dviejų dozių, Mutagenesis, 10, 313–
  2. Fielder R. J., Allen J. A., Boobis A. R., Botham P. A., Doe J., Esdaile D. J., Gatehouse D. G., Hodson-Walker G., Morton D. B., Kirkland D. J., Richold M.
(1992), Britanijos toksikologijos draugijos ir Jungtinės Karalystės aplinkos mutagenų draugijos darbo grupės ataskaita. In vivo mutageniškumo bandymų dozių parinkimas, Mutagenesis, 7, 313–319. 23. Hayashi M., Sofumi T., Ishidate M. Jr.
(1983), Oranžinio akridino taikymas fluorescentiniam dažymui mikrobranduolių bandyme, Mutation Res., 120, 241–247. 24. MacGregor J. T., Wehr C. M., Langlois R. G.
(1983), Paprasta mikrobranduolių ir RNR fluorescentinio dažymo procedūra naudojant Hoechst 33258 ir Pyromin Y, Mutation Res., 120, 269–275. 25. Romagna F., Staniforth, C. D.
(1989), Automatizuotas kaulų čiulpų mikrobranduolių bandymas, Mutation Res., 213, 91–104. 26. Gollapudi B., McFadden L. G.
(1995), Kaulų čiulpų mikrobranduolių bandymo bandinių dydis santykiui tarp polichrominių ir normochrominių eritrocitų nustatyti, Mutation Res., 347, 97–99. 27. Richold M., Chandley A., Ashby J., Gatehouse D. G., Bootman J., Henderson L.
(1990), Citogenetiniai įvertinimai in vivo (red. Kirkland D. J., Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. UKEMS rekomenduojamos procedūros. UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, I dalis, Cambridge University Press, Kembridžas, Niujorkas, Portčesteris, Melburnas, Sidnėjus, 115–141). 28. Lovell D. P., Anderson D., Albanese R., Amphlett G. E., Clare G., Ferguson R., Richold M., Papworth D. G., Savage J. R. K.
(1989), In vivo citogenetinių įvertinimų statistinė analizė (UKEMS mutageniškumo tyrimų vadovo pakomitetis. Ataskaita, III dalis. Mutageniškumo tyrimų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, Kembridžas, 184–
  1. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B13/14 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  2. Įvadas 1.
  3. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 471 metodu. 1.
  4. Tiriant grįžtamąsias mutacijas bakterijose, naudojami amino rūgščių reikalaujantys Salmonella typhimurium ir Escherichia coli kamienai, kad būtų galima nustatyti taškines mutacijas, tokias kaip vienos ar kelių DNR bazių porų pakaitos, intarpai ar delecijos. Šio grįžtamųjų mutacijų bakterijose bandymo principas yra tai, kad jo metu nustatomos mutacijos, kurios pakeičia tiriamuosiuose kamienuose esančias mutacijas taip, kad atstato bakterijų funkcinį sugebėjimą sintetinti pagrindinę amino rūgštį. Bakterijos-revertantai aptinkamos pagal sugebėjimą augti terpėje, kurioje nėra amino rūgšties, reikalingos jų tėviniam tiriamajam kamienui. 1.
  5. Daugelio žmonių genetiškai paveldimų ligų priežastis yra taškinės mutacijos bei su jomis susiję įvykiai. Pakanka įrodymų, kad žmonių ir eksperimentinių gyvūnų vėžį sukelia somatinėse ląstelėse esančių onkogenų bei navikų supresorinių genų struktūriniai pokyčiai, atsiradę dėl taškinių mutacijų. Grįžtamųjų mutacijų bakterijose bandymas yra nebrangus ir greitai bei pakankamai lengvai atliekamas. Dauguma tiriamųjų kamienų pasižymi keletu ypatybių, pagal kurias, analizuojant mutacijas DNR sekose, esančiose grįžtamųjų mutacijų vyksmo vietose bei sukuriančiose atsaką į signalą, galima lengvai nustatyti padidintą ląstelių pralaidumą didelės molekulinės masės molekulėms ir DNR pažaidų atstatymo sistemų sunaikinimą arba pažaidoms atsparių DNR atstatymo procesų suintensyvėjimą. Tiriant kamienų specifiškumą, gaunama vertingos informacijos apie genotoksiškų medžiagų sukeltų mutacijų tipus. Tiriant chemines medžiagas, tarp jų ir lakius junginius, pasižyminčius skirtingomis fizikinėmis bei cheminėmis savybėmis, buvo sukaupta didelė duomenų apie įvairiausias struktūras bazė, kuri naudojama atliekant grįžtamųjų mutacijų bakterijose bandymus visuotinai pripažintais metodais. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
  6. Apibrėžimai 2.
  7. Grįžtamųjų mutacijų bandymu naudojant Salmonella typhimurium arba Escherichia coli nustatoma kamieno, kuriam reikalinga amino rūgštis (atitinkamai histidinas ar triptofanas), mutacija, dėl kurios atsiranda kamienas, kuriam nereikalinga amino rūgštis, tiekiama egzogeniniu būdu. 2.
  8. Mutagenai, sukeliantys bazių porų pakaitas – medžiagos, sukeliančios DNR bazių porų pakaitas. Atliekant reversijos tyrimą, pakaita gali vykti pradinės mutacijos ar kitoje bakterijos genomo vietoje. 2.
  9. Mutagenai, sukeliantys grandinės pasislinkimą – medžiagos, sukeliančios vienos ar kelių DNR bazių porų intarpus ar delecijas, dėl to pasislenka RNR molekulės grandinė.
  10. Metodo aptarimas 3.
  11. Atliekant bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymą, naudojamos prokariotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduolių ląstelių pagal medžiagų transportą į ląstelę, metabolizmą, chromosomų struktūrą bei DNR pažaidų atstatymo procesus. Paprastai, atliekant tyrimus in vitro, reikia naudoti metabolinės aktyvacijos egzogeninį šaltinį. Metabolinės aktyvacijos sistemos in vitro negali absoliučiai imituoti žinduolių metabolinės aktyvacijos sąlygų in vivo. Taigi, atliekant tyrimą, negaunama tiesioginės informacijos apie cheminių medžiagų mutageniškumą ir kancerogeniškumą žinduoliams. 3.
  12. Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas paprastai naudojamas pirmiausia medžiagų atrankai pagal genotoksiškumą, konkrečiai, pagal sugebėjimą sukelti taškines mutacijas. Gausi duomenų bazė parodė, kad daugelio cheminių medžiagų genotoksiškumas buvo nustatytas tiek bakterijų grįžtamųjų mutacijų, tiek ir kitų bandymų metu. Tačiau šiuo bandymu negalima nustatyti keleto mutagenų, taip yra dėl bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymo pagrindinio tikslo savitumo, metabolinės aktyvacijos skirtumų bei mutagenų paplitimo gamtoje skirtumų. Kita vertus, dėl sąlygų, padidinančių bandymo jautrumą, galima pervertinti mutageninį medžiagų aktyvumą. 3.
  13. Metodas netinka konkrečių cheminių medžiagų klasėms, pavyzdžiui, junginiams, pasižymintiems pernelyg dideliu baktericidiniu aktyvumu (konkretūs antibiotikai) ir tiems junginiams, kurie, kaip manoma, blokuoja žinduolių ląstelių DNR replikacijos sistemą (keletas topoizomerazių inhibitorių ir nukleozidų analogų). Tokiais atvejais labiau tinka tirti žinduolių mutacijas. 3.
  14. Nors šiuo metodu gavus teigiamus rezultatus dažnai medžiaga ir žinduolių kancerogenas, šio tarpusavio ryšio nereikia suabsoliutinti. Tai priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; atliekant šį bandymą neįmanoma nustatyti tam tikrų kancerogenų, kadangi jų veikimo mechanizmas nesiremia genotoksiškumu arba jie veikia visai kitaip nei bakterinėse ląstelėse.
  15. Bandymo metodo principas 4.
  16. Bakterinės ląstelės veikiamos bandomąja medžiaga naudojant arba nenaudojant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemą. Pagal inkorporacijos į lėkštelę būdą bakterijų suspensijos padengiamos agaru ir užliejamos ant minimalios terpės. Pagal išankstinės inkubacijos būdą suspensija iš pradžių inkubuojama su medžiaga, kuria bus veikiamos bakterinės ląstelės, o vėliau padengiama agaru ir po to užpilama ant minimalios terpės. Taikant abu metodus, po 2–3 inkubacijos dienų skaičiuojamos revertantų kolonijos ir lyginamos su spontaninių revertantų kolonijų, auginamų kontrolinėse lėkštelėse su tirpikliu, skaičiumi. 4.
  17. Šiame metode dažniausiai naudojama keletas procedūrų: inkorporacijos į lėkštelę, išankstinės inkubacijos, fliuktuacijos ir suspendavimo. Aprašytos ir dujinių bei lakiųjų medžiagų tyrimo modifikacijos. 4.
  18. Šio metodo aprašyme pateiktos bandymo atlikimo procedūros pirmiausia siejasi su inkorporacijos į lėkštelę ir išankstinės inkubacijos būdais. Šie būdai tinka atliekant eksperimentus, kai naudojama arba nenaudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Alifatinius aminus, turinčius trumpąją grandinę, dvivalenčius metalus, turinčius NO grupę, alkaloidus, turinčius pirolizidiną, alilo grupę turinčius junginius bei azoto junginius geriau tirti taikant išankstinės inkubacijos būdą. Naudojant inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos būdus, ne visada galima nustatyti tam tikroms klasėms priklausančius mutagenus. Šie mutagenai yra laikomi „ypatingais atvejais“ ir ypač rekomenduojama, kad jų nustatymui būtų panaudojamos ir kitos, alternatyvios bandymo atlikimo procedūros. Šiuos „ypatingus atvejus“ (pavyzdžiui, azo dažai, diazo grupę turintys junginiai, dujos, lakiosios medžiagos ir glikozidai) galima identifikuoti, kartu pateikiant ir jų nustatymo metodus. Nukrypimas nuo standartinio bandymo atlikimo metodo turi būti moksliškai pagrįstas.
  19. Bandymo metodo aprašymas 5.
  20. Pasiruošimas 5.1.
  21. Bakterijos 5.1.1.
  22. Grynos bakterijų kultūros auginamos tol, kol pasiekia vėlyvąją eksponentinę ir ankstyvąją plato augimo fazę (apie 109 ląstelių/ml). Kultūros, pasiekusios vėlyvąją plato augimo fazę, neturi būti naudojamos. Bakterijų kultūrose, kurios naudojamos eksperimentams, turi būti didelis gyvų bakterijų ląstelių titras. Titras nustatomas arba pagal anksčiau gautas augimo kreives, arba kiekvieno bandymo metu nustatant gyvų ląstelių skaičių pagal jų augimą lėkštelėje. 5.1.1.
  23. Rekomenduojama inkubacijos temperatūra yra 37 °C. 5.1.1.
  24. Turi būti naudojami mažiausiai 5 bakterijų kamienai. Tarp jų turi būti 4 Salmonella typhimurium kamienai (TA 1535, TA 1537 arba TA 97a, arba TA 97; TA 98 ir TA 100), kurie, kaip įrodyta daugelyje laboratorijų, duoda patikimai pakartojamus duomenis. Šių 4 Salmonella typhimurium kamienų G-C bazių pora lokalizuota pirminės reversijos vietoje; žinoma, kad panaudojant šiuos kamienus, negalima identifikuoti kryžmiškai rišančių mutagenų ir hidrazinų. Šios medžiagos nustatomos, panaudojant Escherichia coli WP2 ir Salmonella typhimurium TA 102 kamienus, kurių pirminėje reversijos vietoje lokalizuota A-T bazių pora. Todėl rekomenduojama naudoti S. typhimurium TA 1535, S. typhimurium TA 1537 arba TA 97, arba TA 97a, S. typhimurium TA 98, S. typhimurium TA 100, E. coli WP 2 uvr A arba WP 2 uvr A (pkM 101), arba S. typhimurium TA 102 kamienų derinį. 5.1.1.
  25. Kryžmiškai surišantiems mutagenams nustatyti reikia papildomai naudoti S. typhimurium TA 102 arba E. coli WP 2, arba WP 2 (pKM 101) kamienus, sugebančius atstatyti DNR pažaidas. 5.1.1.
  26. Naudojamos gerai žinomos pagrindinės kultūros paruošimo, žymės patvirtinimo bei saugojimo metodikos. Reikia parodyti, kad amino rūgštis būtina kiekvieno preparato, paruošto iš užšaldytos pradinės kultūros, augimui (histidinas S. typhimurium kamienams, triptofanas E. coli kamienams). Kitos fenotipinės charakteristikos, būtent plazmidžių, turinčių R-faktorių, buvimas ar nebuvimas, jei tai reikalinga (kamienų TA 98, TA 100 ir TA 97a arba TA 97, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM 101) atsparumas ampicilinui bei kamieno TA 102 atsparumas ampicilinui ir tetraciklinui), būdingos mutacijos (S. typhimurium rfa mutacija, apsprendžianti jautrumą violetinei šviesai, E. coli uvr A mutacija arba S. typhimurium uvr B mutacija, nulemianti jautrumą ultravioletinei šviesai). Kamienai turi spontaniškai sukurti revertantų kolonijas, kurių skaičius turi būti dažnumo ribose ir kuris numatomas, remiantis anksčiau gautais laboratorijoje duomenimis, ir pirmiausia turi atitikti literatūroje nurodytas ribas. 5.1.
  27. Terpė. Naudojamas atitinkamas minimalus agaras (pavyzdžiui, turintis minimalios Vogel-Bonner terpės E ir gliukozės) ir ant viršaus užliejamas agaras, turintis histidino ir biotino arba triptofano tam, kad vyktų keleto ląstelių dalijimasis. 5.1.
  28. Metabolinė aktyvacija. Bakterijos turi būti veikiamos bandomąja medžiaga esant ir nesant atitinkamai metabolinės aktyvacijos sistemai. Plačiausiai vartojama sistema yra iš graužikų kepenų, paveiktų fermentinį aktyvumą skatinančiomis medžiagomis – AROCLOR 1254 ar fenobarbitono ir b-naftoflavono mišiniu, post-mitochondrine frakcija, praturtinta kofaktoriumi. Post-mitochondrinė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, kurių intervalas S9 mišinyje siekia nuo 5 iki 30 % pagal tūrį. Metabolinės aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo tiriamosios cheminės medžiagos klasės. Kai kuriais atvejais tikslinga varoti daugiau nei post-mitochondrinės frakcijos koncentraciją. Tiriant azo dažus ir diazo grupę turinčias medžiagas, geriau naudoti redukcinę metabolinę aktyvacijos sistemą. 5.1.
  29. Bandomoji medžiaga (preparatas) 5.1.4.
  30. Kietosios medžiagos turi būti ištirpinamos arba suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar tirpinančiuosiuose įrenginiuose ir, jei reikia, praskiedžiamos prieš paveikiant bakterijas. Skystosios medžiagos įvedamos tiesiogiai į tyrimo sistemas, jei reikia, jas praskiedus. Bandomieji preparatai naudojami naujai pagaminti, išskyrus atvejus, kai tyrimais įrodytas jų stabilumas. 5.1.4.
  31. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys neturi chemiškai reaguoti su bandomąja medžiaga. Turi būti užtikrinta, kad ląstelės liks išsaugotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami kiti nežinomi tirpikliai ar tirpinantieji įrenginiai, tai juos naudojant reikia pateikti jų tinkamumą įrodančius duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti skystosios fazės tirpiklį arba tirpinantįjį įrenginį. Kai tiriamos vandenyje netirpios cheminės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpikliuose neturėtų būti vandens. 5.
  32. Bandymo sąlygos 5.2.
  33. Bandyme naudotini kamienai nurodyti šio metodo 5.1.1 punkte 5.2.
  34. Poveikio koncentracijos 5.2.2.
  35. Kriterijai, į kuriuos reikia atsižvelgti nustatant didžiausią tiriamosios medžiagos koncentraciją, yra medžiagos citotoksiškumas ir tirpumas galutiniame veikimo mišinyje. Naudinga nustatyti toksiškumą bei netirpumą išankstiniu eksperimentu. Citotoksiškumas gali būti nustatomas pagal revertantų skaičiaus sumažėjimą, šalutinės terpės praskaidrėjimą ar sunykimą arba pagal kultūrų, paveiktų tiriamąja medžiaga, išgyvenimo laipsnį. Medžiagos citotoksiškumas gali kisti dėl metabolinės aktyvacijos sistemų. Netirpumas gali būti įvertinamas plika akimi stebint precipitato susidarymą galutiniame veikimo mišinyje atliekant bandymą. 5.2.2.
  36. Didžiausia rekomenduojama tirpių bandomųjų medžiagų, nepasižyminčių citotoksiškumu, koncentracija yra 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje. Jei necitotoksiškos medžiagos netirpsta, jų koncentracijoms esant 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje, tai turi būti ištirta viena ar kelios netirpios šių medžiagų koncentracijos. Bandomosios medžiagos, kurios yra citotoksiškos, kai jų koncentracijos yra mažesnės nei 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje, turi būti tiriamos įvairiomis koncentracijomis, įskaitant citotoksinę. Precipitato susidarymas neturi trukdyti įvertinti duomenis. 5.2.2.
  37. Reikia panaudoti mažiausiai 5 išanalizuojamas tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurių vertes pradinio eksperimento metu skirtų intervalai, lygūs ½ log (Ö10). Mažesni skiriamieji intervalai tinka tada, kai tiriama atsako priklausomybė nuo koncentracijos. Koncentracija, mažesnė už 5 mg/lėkštelėje arba 5 ml/lėkštelėje, pasirenkama tuo atveju, jei bandomosios medžiagos mutageniškumas neaiškus. 5.2.
  38. Neigiami ir teigiami kontroliniai bandiniai 5.2.3.
  39. Atliekant kiekvieną bandymą, kartu su metaboline aktyvacija arba be jos būtina vienu metu naudoti neigiamus (tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys) bei teigiamus kontrolinius bandinius, specifiškus bakterijų kamienui. 5.2.3.
  40. Kai bandymų metu naudojama metabolinės aktyvacijos sistema, tai teigiama kontrolinė pamatinė medžiaga pasirenkama pagal naudojamą bakterinio kamieno tipą. 1 lentelėje pateikiami tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, naudojamų esant metabolinei aktyvacijai, pavyzdžiai. 1 lentelė. Teigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos esant metabolinei aktyvacijai Medžiagos pavadinimas CAS Nr. EINECS Nr. 9,10-dimetilantracenas 781-43-1 212-308-4 7,12-dimetilbenzaantracenas 57-97-6 200-359-5 Benzpirenas 50-32-8 200-028-5 2-aminoantracenas 613-13-8 210-330-9 Ciklofosfamidas 50-18-0 200-015-4 Ciklofosfamido monohidratas 6055-19-2 5.2.3.
  41. Tinkama teigiama kontrolinė medžiaga, kai naudojamas redukcinės metabolinės aktyvacijos metodas, yra Kongo raudonasis (CAS Nr. 573-58-0, EINECS Nr. 209-358-4). 5.2.3.
  42. 2-aminoantracenas neturi būti naudojamas kaip vienintelis S9 mišinio veikimo efektyvumo indikatorius. Jei 2-aminoantracenas naudojamas, tai kiekviena S9 mišinio partija išanalizuojama panaudojant mutageną, kuriam reikalinga metabolinė aktyvacija mikrosominiais fermentais, pavyzdžiui, benzpireną ar dimetilbenzaantraceną. 5.2.3.
  43. Tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų, specifiškų bakterijų kamienui, naudojamų nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos, pavyzdžiai pateikti 2 lentelėje. 2 lentelė. Specifiškos bakterijų kamienui teigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos Medžiagos pavadinimas CAS Nr. Einecs Nr. Bakterijų kamienas Natrio azidas 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 ir TA 100 2-nitrofluorenas 607-57-8 210-138-5 TA 98 9-aminoakridinas 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 ir TA 97a ICD 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 ir TA 97a Kumeno hidroksiperoksidas 80-15-9 201-254-7 TA 102 Mitomicinas C 50-07-7 200-008-6 WP 2 uvrA ir TA 102 N-etil-N-nitro-N-nitrozoguanidinas 70-25-7 200-730-1 WP 2, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM101) 4-nitrokvinolino-1-oksidas 56-57-5 200-281-1 WP 2, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM101) Furilfuramidas (AF2) 3688-53-7 Kamienai su plazmidėmis 5.2.3.
  44. Kitas kontrolines medžiagas irgi galima naudoti kaip teigiamus kontrolinius mėginius. Jei įmanoma, pagrindžiamas konkrečios klasės cheminių medžiagų, kaip teigiamų kontrolinių bandinių, naudojimas. 5.2.3.
  45. Būtina naudoti ir neigiamus kontrolinius bandinius, sudarytus vien tik iš tirpiklio ar tirpinančiojo įrenginio be bandomosios medžiagos, veiktus tokiu pat būdu kaip ir tiriamieji bandiniai. Reikia naudoti ir bandomąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius bandinius, išskyrus tuos atvejus, kai anksčiau gauti kontroliniai duomenys rodo, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir mutageniškas. 5.
  46. Darbo eiga 5.3.
  47. Atliekant bandymą inkorporacijos į lėkštelę būdu 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml šviežiai išaugintos bakterijų kultūros (turinčios apie 108 gyvų ląstelių) ir 0,5 ml sterilaus buferio. Įprastiniu atveju atliekant bandymą, kai naudojama metabolinė aktyvacija, 0,5 ml metabolinės aktyvacijos mišinio, turinčio pakankamą post-mitochondrinės frakcijos kiekį (5–30% pagal tūrį metabolinės aktyvacijos mišinyje), sumaišoma su 2 ml padengiančiojo agaro, bakterijomis ir bandomąja medžiaga. Kiekvieno mėgintuvėlio turinys suplakamas ir užpilamas ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Prieš inkubaciją padengiančiajam agarui leidžiama sukietėti. 5.3.
  48. Atliekant bandymą išankstinės inkubacijos būdu, bandomoji medžiaga iš anksto inkubuojama su naudojamu bakterijų kamienu (turinčiu apie 108 gyvų ląstelių) ir steriliu buferiu arba metabolinės aktyvacijos sistema (0,5 ml), ir paprastai inkubuojama 20 ar daugiau minučių 30–37 °C temperatūroje prieš sumaišant su padengiančiuoju agaru ir užpilant ant minimalaus agaro, esančio lėkštelėje, paviršiaus. Paprastai 2 ml padengiančiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml bandomosios medžiagos, 0,1 ml bakterijų ir 0,5 ml S9 mišinio ar sterilaus buferio. Atliekant išankstinę inkubaciją, mėgintuvėliai purtomi ant kratytuvo, kad jų turinys prisisotintų oro. 5.3.
  49. Tiriant kiekvieną dozę, turi būti gautas patenkinamas variacijos koeficientas, todėl bakterijos pasėjamos į 3 lėkšteles. Jeigu sėjama tik į 2 lėkšteles, tai reikia moksliškai pagrįsti. Atsitiktinis lėkštelės praradimas nereiškia, kad bandymas nepavyko. 5.3.
  50. Dujinės bei lakios medžiagos turi būti tiriamos atitinkamais metodais, jas laikant sandariuose induose. 5.
  51. Inkubacija. Atliekant konkretų bandymą, visos lėkštelės turi būti inkubuojamos 48–72 valandas 37° C temperatūroje. Po inkubacijos nustatomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje, skaičius. II. Duomenys
  52. Duomenų apdorojimas 6.
  53. Pateikiant duomenis, nurodomas revertantų kolonijų, esančių 1 lėkštelėje, skaičius. Taip pat reikia nurodyti revertantų kolonijų, esančių tiek teigiamose, tiek ir neigiamose (tirpiklio kontrolinis bandinys ir bandomąja medžiaga neveiktas kontrolinis bandinys) kontrolinėse lėkštelėse, skaičių. Pateikiant duomenis apie bandomąją medžiagą ir teigiamus bei neigiamus (tirpiklio kontrolinis bandinys ir/ar bandomąja medžiaga neveiktas kontrolinis bandinys) kontrolinius bandinius, nurodomas revertantų kolonijų, esančių kiekvienoje lėkštelėje, skaičius, jo vidurkis bei standartinis nuokrypis. 6.
  54. Gauto aiškaus teigiamo rezultato patvirtinti nebūtina. Abejotini rezultatai išaiškinami, tęsiant bandymus pakeitus eksperimento sąlygas. Neigiami rezultatai patvirtinami kiekvienu atskiru atveju. Tais atvejais, kai manoma, jog nebūtina patvirtinti neigiamų rezultatų, tai reikia pagrįsti. 6.
  55. Tęsiant eksperimentus, apsvarstoma, ar reikia keisti bandymo sąlygas siekiant išplėsti vertinamų sąlygų ribas. Sąlygos, kurias galima keisti, yra koncentracijas skiriančios ribos, bandymo atlikimo būdai (inkorporacijos į lėkštelę bei išankstinės inkubacijos) bei metabolinės aktyvacijos sąlygos.
  56. Duomenų įvertinimas ir interpretacija 7.
  57. Teigiamo rezultato įvertinimo kriterijai yra nuo koncentracijos priklausomas mažiausiai vieno kamieno revertantų kolonijų, esančių vienoje lėkštelėje, skaičiaus padidėjimas virš tiriamos ribos, kai naudojama arba nenaudojama metabolinės aktyvacijos sistema ir/ar jį atkartojant, kai naudojama viena ar daugiau koncentracijų. Pirmiausia reikia aptarti biologinę rezultatų reikšmę. Vertinant tyrimo rezultatus, galima taikyti statistinius metodus. Statistinis reikšmingumas neturėtų būti vienintelis kriterijus, pagal kurį sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar neigiamas. 7.
  58. Jei gauti rezultatai neatitinka šio metodo 7.1 punkte nurodytų kriterijų, tai bandomoji medžiaga pagal šio metodo sąlygas laikoma nemutageniška. 7.
  59. Po daug bandymų gavus aiškius teigiamus ir aiškius neigiamus rezultatus, dažniausiai galima padaryti išvadą apie bandomosios medžiagos savybes, remiantis gautų duomenų visuma. Net ir daug kartų pakartojus konkretų bandymą, jo rezultatai gali likti abejotini ir neaiškūs. 7.
  60. Rezultatai, gauti tiriant bakterijų grįžtamąsias mutacijas, rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia taškines mutacijas (bazių pakaitas arba grandinės pasislinkimą) Salmonella typhimurium ir/ar Escherichia coli genome. Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo sąlygomis bandomoji medžiaga nesukelia mutacijų tirtose bakterijų rūšyse. III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
  61. Bandymo protokole turi būti pateikta tokia informacija: 8.
  62. Tirpiklis ar tirpinantysis įrenginys 8.1.
  63. priežastys, dėl kurių buvo pasirinktas tirpinantysis įrenginys; 8.1.
  64. tiriamosios medžiagos, esančios tirpiklyje ar tirpinančiajame įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei žinomas. 8.
  65. Bakterijos 8.2.
  66. naudoti kamienai; 8.2.
  67. ląstelių, esančių vienoje kultūroje, skaičius; 8.2.
  68. kamieno charakteristikos. 8.
  69. Bandymo sąlygos 8.3.
  70. bandomosios medžiagos kiekis vienoje lėkštelėje (mg arba ml lėkštelėje), nurodant pagrindinę priežastį, dėl kurios tiriant vieną koncentraciją, buvo pasirinkta konkreti dozė bei lėkštelių skaičius; 8.3.
  71. naudota terpė; 8.3.
  72. metabolinės aktyvacijos sistemos tipas ir sudėtis, įskaitant ir sistemos tinkamumo kriterijus; 8.3.
  73. poveikio bandomąja medžiaga atlikimo būdas. 8.
  74. Rezultatai 8.4.
  75. toksiškumo požymiai; 8.4.
  76. precipitacijos požymiai; 8.4.
  77. kolonijų vienoje lėkštelėje skaičius; 8.4.
  78. revertantų kolonijų vienoje lėkštelėje skaičiaus vidurkis bei standartinis nuokrypis; 8.4.
  79. dozės ir atsako sąryšis, jei jį įmanoma nurodyti; 8.4.
  80. statistinės analizės, jei atliktos; 8.4.
  81. vienu metu naudojamų neigiamų (tirpiklis ar tirpinantysis įrengimas) ir teigiamų kontrolinių bandinių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nuokrypius; 8.4.
  82. anksčiau gauti neigiamų (tirpiklis/tirpinantysis įrengimas) ir teigiamų kontrolinių bandinių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nuokrypius.
  83. Bandymų protokole pateikiamas rezultatų aptarimas ir išvados. IV. NUORODOS
  84. Ames B. N., McCann J., Yamasaki E.
(1975), Kancerogenų ir mutagenų nustatymo metodai naudojant Salmonella ir žinduolių mikrosomų mutageniškumo bandymą, Mutation Res., 31, 347–364. 11. Maron D. M., Ames B. N.
(1983), Patikslinti Salmonella mutageniškumo bandymo metodai, Mutation Res., 113, 173–
  2. Gatehouse D., Haworth S., Cebula T., Gocke E., Kier L., Matsushima T., Melcion C., Nohmi T., Venitt S., Zeiger E.
(1994), Bakterijų mutacijų įvertinimo rekomendacijos, Mutation Res., 312, 217–
  2. Kier L. D., Brusick D. J., Auletta A. E., Von Halle E. S., Brown M. M., Simmon V. F., Dunkel V., McCann J., Mortelmans K., Prival M., Rao T. K., Ray V.
(1986), Salmonella typhimurium ir žinduolių mikrosomų įvertinimas. JAV Aplinkos apsaugos agentūros Gene-Tox programos ataskaita, Mutation Res., 168, 69–240. 14. Yahagi T., Degawa M., Seino Y. Y., Matsushima T., Nagao M., Sugimura T., Hashimoto, Y.
(1975), Kancerogeninių azodažiklių ir jų junginių mutageniškumas, Cancer Letters 1, 91–
  2. Matsushima M., Sugimura T., Nagao M., Yahagi T., Shirai A., Sawamura M.
(1980), Mikroorganizmų mutageniškumo bandymus įtakojantys veiksniai (kancerogenų aptikimo trumpalaikės sistemos, red. Norpoth K. H., Garner R. C., Springer, Berlynas, Heidelbergas, Niujorkas, 273–285). 16. Gatehouse D. G., Rowland I. R., Wilcox P., Callender R. D., Foster R.
(1980), Bakterijų mutacijų įvertinimai (Pagrindiniai mutageniškumo bandymai. Patikslinta UKEMS 1 dalis, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, 13–61). 17. Aeschacher H. U., Wolleb U., Porchet, L.
(1987), Maisto skystosios preinkubacijos mutageniškumo bandymai, J. Food Safety, 8, 167–177. 18. Green M. H. L., Muriel W. J., Bridges B. A.
(1976), Supaprastinto fliuktuacijos bandymo taikymas mažiems mutagenų kiekiams aptikti, Mutation Res., 38, 33–42. 19. Hubbard S. A., Green M. H. L., Gatehouse D., Bridges J. W.
(1984), Bakterijų fliuktuacijos bandymas (Mutageniškumo bandymų procedūrų vadovas, 2 leidimas, red. Kilbey B. J., Legator M., Nichols W., Ramel, C., Elsevier, Amsterdamas, Niujorkas, Oksfordas, 141–161). 20. Thompson E. D., Melampy P. J.
(1981), An Examination of the Suspensijos kiekybinio įvertinimo taikymo Salmonella typhimurium kamienų mutageniškumui tyrimas, Environmental Mutagenesis, 3, 453–465. 21. Araki A., Noguchi T., Kato F., Matsushima T.
(1994), Dujinių medžiagų mutageniškumo bandymo pagerintas metodas, naudojant dujų bandinių paėmimo kamerą, Mutation Res., 307, 335–344. 22. Prival M. J., Bell S. J., Mitchell V. D., Reipert M. D., Vaughan V. L.
(1984), Benzidino ir benzidinui giminingų dažiklių bei tam tikrų monoazodažiklių mutageniškumas taikant modifikuotą Salmonella įvertinimą, Mutation Res., 136, 33–47. 23. Zeiger E., Anderson B. E., Haworth S., Lawlor T., Mortelmans K.
(1992), Salmonella mutageniškumo bandymai. V. 311 chemikalų bandymų rezultatai, Environ. Mol. Mutagen., 19, 2–141. 24. Simmon V., Kauhanen K., Tardiff R. G.
(1977), Geriamąjame vandenyje aptinkamų chemikalų mutageniškumas (Genetinės toksikologijos vystymasis, red. Scott D., Bridges B., Sobels F., Amsterdamas, 249–258). 25. Hughes T. J., Simmons D. M., Monteith I. G., Claxton L. D.
(1987), Lakių organinių junginių garinimas siekiant nustatyti mutageniškumą Ames (Salmonella) įvertinime, Environmental Mutagenesis, 9, 421–441. 26. Matsushima T., Matsumoto A., Shirai M., Sawamura M., Sugimura T.
(1979), Natūralaus kancerogeno kikazino ir sintetinių metilazoksimetano junginių mutageniškumas Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, 3780–3782. 27. Tamura G., Gold C., Ferro-Luzzi A., Ames B. N.
(1980), Fekalazė. Maisto glikozidų aktyvavimo į mutagenus žarnyno flora modelis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4961–4965. 28. Wilcox P., Naidoo A., Wedd D. J., Gatehouse D. G.
(1990), Salmonella typhimurium TA 102 ir Escherichia coli WP2 kamienų bandomasis palyginimas, Mutagenesis, 5, 285–291. 29. Matsushima T., Sawamura M., Hara K., Sugimura T.
(1976), Saugus polichlorintųjų bifenilų, naudojamų kaip metabolinių aktyvacijos sistemų induktorių, pakaitalas (de Serres F. J., Fouts J. R., Bend J. R., Philpot R. M. (red.), In vitro mutageniškumo tyrimų metabolinė aktyvacija, Elsevier, Šiaurės Olandija, 85–88). 30. Elliot B. M., Combes R. D., Elcombe C. R., Gatehouse D. G., Gibson G. G., Mackay J. M., Wolf R. C.
(1992), Aroclor 1254 indukuoto S9 alternatyvos in vitro genotoksiškumo įvertinimuose, Mutagenesis, 7, 175–177. 31. Maron D., Katzenellenbogen J., Ames B. N.
(1981), Compatibility of Organinių tirpiklių ir Salmonella mikrosomų bandymo suderinamumas, Mutation Res., 88, 343–
  2. Claxton L. D., Allen J., Auletta A., Mortelmans K., Nestmann E., Zeiger E.
(1987), Guide for the Salmonella typhimurium ir žinduolių mikrosomų bandymų vadovas bakterijų mutageniškumui nustatyti, Mutation Res., 189, 83–
  2. Mahon G. A. T., Green M. H. L., Middleton B., Mitchel I., Robinson W. D., Tweats D. J.
(1989), Mikroorganizmų kolonijų įvertinimo duomenų analizė (UKEMS mutageniškumo bandymų vadovo pakomitetis. II dalis. Mutageniškumo bandymų duomenų statistinis įvertinimas, red. Kirkland D. J., Cambridge University Press, 28–65). ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B15 metodas: MUTAGENIŠKUMAS ir kancerogeniškumo patikrinimas. GENŲ MUTACIJOS. SACCHAROMYCES CEREVISIAE bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  1. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472)
  2. Sąvokos. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade
  3. Pamatinės medžiagos. Nėra
  4. Bandymo metodo principas 4.
  5. Siekiant įvertinti cheminių medžiagų, esant arba nesant metabolinės aktyvacijos sistemai, sukeliamas genų mutacijas, gali būti naudojami įvairiausi haploidiniai ir diploidiniai Saccharomyces cerevisiae kamienai. 4.
  6. Haploidiniuose kamienuose gali būti naudojamos tiesioginės mutacinės sistemos, pavyzdžiui, mutacinis virsmas iš raudonos spalvos mutantų, kurių augimui reikalingas adeninas (ade-1, ade-2) į dvigubus baltos spalvos mutantus, kurių augimui reikalingas adeninas bei atrankos sistemos, pavyzdžiui, atsparumo kanavalinui ir cikloheksimidui indukcinė sistema. 4.
  7. Plačiausiai naudojamą grįžtamųjų mutacijų tyrimo sistemą sudaro haploidinis kamienas XV 185-14C, kuris turi geno, koduojančio ochros spalvą, beprasmes mutacijas ade-2-1, arg 4-17, lys 1-1, trp 5-48, kurios tampa grįžtamosiomis mutacijomis atlikus bazių pakeitimą mutagenais, sukeliančiais vietos atžvilgiu specifines mutacijas arba geno, koduojančio ochros spalvą, veiklą slopinančias mutacijas. Kamienas XV 185-14C taipogi turi žymę bis 1-7 – beprasmę mutaciją, kuri gali virsti grįžtamąja mutacija, įvykus mutacijai antroje vietoje, bei žymę bom 3-10, kuri tampa grįžtamąja mutacija, paveikus ją mutagenais, sukeliančiais grandinės pasislinkimą. 4.
  8. Tarp diploidinių S. cerevisiae kamienų plačiausiai naudojamas vienas D kamienas, kuris yra homozigotiškas pagal ilv 1-
  10. Kokybės kriterijai. Nėra
  11. Bandymo metodo aprašymas 6.
  12. Pasiruošimas. Prieš bandymą, naudojant atitinkamą prietaisą, paruošiami bandomųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalai. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, tai reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % pagal tūrį organinių tirpiklių, pavyzdžiui, etanolio, acetono ar dimetilsulfoksido (DMSO) tirpalus (v/v). Galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų. 6.
  13. Metabolinė aktyvacija 6.2.
  14. Ląstelės veikiamos bandomosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemai. 6.2.
  15. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus indukuojančiomis medžiagomis, kepenų postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi, yra plačiausiai naudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Metabolinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras. 6.
  16. Bandymo sąlygos 6.3.
  17. Bandomieji kamienai. Atliekant genų mutacijų tyrimus labiausiai yra naudojami haploidinis kamienas XV 185-14C ir diploidinis kamienas D
  18. Galima naudoti ir kitus kamienus. 6.3.
  19. Terpė. Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos, skaičių, naudojama atitinkama kultivavimo terpė. 6.3.
  20. Teigiama ir neigiama kontrolė. Vienu metu naudojamos teigiamos, nepaveiktos bandomąja medžiaga ir tirpiklio kontrolės. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę mutaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės. 6.3.
  21. Koncentracijos. Naudojamos mažiausiai penkios tinkamai atskirtos bandomosios medžiagos koncentracijos. Toksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo daugiau nei iki 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju. 6.3.
  22. Inkubacijos sąlygos. Lėkštelės inkubuojamos tamsoje 4–7 dienoms 28–30 °C temperatūroje. 6.3.
  23. Spontaninių mutacijų dažnis. Turi būti naudojamos subkultūros, kuriose spontaninių mutacijų dažniai yra normalūs. 6.3.
  24. Replikatų skaičius. Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl genų mutacijų, bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, vienai koncentracijai tirti naudojamos mažiausiai trys replikatų lėkštelės. Jei bandyme naudojamos žymės hom 3-10, pasižyminčios nedideliu mutacijų dažniu, tai reikėtų naudoti daugiau replikatų lėkštelių, kad gaunami duomenys būtų statistiškai patikimi.
  25. Darbo eiga 7.
  26. S. cerevisiae kamienai paprastai veikiami bandomąja medžiaga, ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių eksperimentai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1-5×107 ląstelių/ml veikiamos bandomąja medžiaga 18 valandų 28–37 °C temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, tai veikimo metu į terpę įvedamas atitinkamas metabolinės aktyvacijos sistemos kiekis. Po poveikio ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimo terpę. Po inkubacijos nustatomas kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko genų mutacijos, skaičius. 7.
  27. Jei pirmojo bandymo rezultatai yra neigiami, tai antrasis bandymas atliekamas naudojant ląsteles, esančias stacionarinėje fazėje. Jeigu pirmojo bandymo rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkamą nepriklausomą bandymą. II. Duomenys
  28. Duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mutacijos, skaičių ir mutacijos dažnį.
  29. Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti atlikus nepriklausomą bandymą.
  30. Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais. III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
  31. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija: 11.
  32. naudotas kamienas; 11.
  33. bandymo sąlygos (ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema); 11.
  34. dozavimas (veikimo laipsnis, procedūra, trukmė ir temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės); 11.
  35. kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mutacijos skaičius bei mutacijų dažnis, dozės ir atsako sąryšis, jei tai įmanoma nustatyti, statistinis duomenų įvertinimas; 11.
  36. duomenų aptarimas; 11.
  37. duomenų interpretavimas.
  38. Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo rezultatų įvertinimas ir aiškinimas pateiktas Bendrajame įvade. IV. NUORODOS
  39. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B16 metodas: mitozinė rekombinacija. SACCHAROMYCES CEREVISIAE bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  40. Įvadas. Šio metodo įvadas pateiktas Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472)
  41. Sąvokos. Šio metodo sąvokų apibrėžimai pateikti Bendrajame įvade
  42. Pamatinės medžiagos. Nėra
  43. Bandymo metodo principas. Saccharomyces cerevisiae mitozinė rekombinacija gali būti nustatoma tarp genų (tarp geno ir jo centromeros) ir genų viduje. Ši rekombinacija, vykstanti tarp genų, vadinama mitoziniu krosingoveriu, kurio susiformuoja atvirkštiniai produktai, tuo tarpu kai rekombinacijos metu genų viduje metu susidaro neatvirkštiniai produktai, vadinami genų konversijomis. Apskritai, krosingoveris įvertinamas pagal homozigotinių kolonijų arba sektorių, turinčių recesyvinius genų alelius, produkcijos laipsnį heterozigotiniame kamiene, tuo tarpu genų konversija vertinama pagal prototrofinių revertantų, susiformavusių auksotrofiniame heteroaleliniame kamiene, turinčiame du neveiklius to paties geno alelius, skaičių. Siekiant nustatyti mitozinio geno konversiją, dažniausiai naudojami D4 (heteroalelinis pagal ade 2 ir trp 5), D7 (heteroalelinis pagal trp 5), BZ34 (heteroalelinis pagal arg 4) ir JD1 (heteroalelinis pagal his 4 ir trp 5) kamienai. Raudonos ir violetinės spalvos homozigotiniai sektoriai, sukuriantys mitozinį krosingoverį, gali būti vertinami naudojant D5 arba D7 kamienus (taip pat galima įvertinti mitozinę genų konversiją ir grįžtamąją mutaciją, vykstančią ilv 1-92), kurie yra heteroaleliški pagal papildančiuosius geno ade 2 alelius
  44. Kokybės kriterijai. Nėra
  45. Bandymo metodo aprašymas 6.
  46. Pasiruošimas. Prieš bandymą, naudojant atitinkamą, prietaisą paruošiami bandomųjų ir kontrolinių medžiagų tirpalai. Jei tiriami organiniai, vandenyje netirpūs junginiai, tai reikėtų naudoti ne daugiau kaip 2 % pagal tūrį organinių tirpiklių, pavyzdžiui, etanolio, acetono ar dimetilsulfoksido (DMSO) tirpalus. Galutinė tirpalo koncentracija neturėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo bei augimo parametrų. 6.
  47. Metabolinė aktyvacija 6.2.
  48. Ląstelės veikiamos bandomosiomis medžiagomis, esant arba nesant egzogeninės metabolinės aktyvacijos sistemai. 6.2.
  49. Graužikų, iš anksto paveiktų fermentus indukuojančiomis medžiagomis, kepenų postmitochondrinė frakcija, praturtinta kofaktoriumi, yra plačiausiai naudojama metabolinė aktyvacijos sistema. Metabolinei aktyvacijai galima naudoti ir kitų rūšių bei audinių postmitochondrines frakcijas bei procedūras. 6.
  50. Bandymo sąlygos 6.3.
  51. Bandomieji kamienai. Dažniausiai naudojami diploidiniai D4, D5, D7 ir JD1 kamienai. Galima naudoti ir kitus kamienus. 6.3.
  52. Terpė. Nustatant kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko mitozinės rekombinacijos, skaičių, naudojama atitinkama kultivavimo terpė. 6.3.
  53. Teigiama ir neigiama kontrolė. Vienu metu naudojamos teigiamos, nepaveiktos bandomąja medžiaga ir tirpiklio kontrolės. Nustatant kiekvieną specifinę galutinę rekombinaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrolės. 6.3.
  54. Koncentracijos 6.3.4.
  55. Naudojamos mažiausiai penkios tinkamai atskirtos bandomosios medžiagos koncentracijos. Reikėtų apsvarstyti citotoksiškumą ir tirpumą. Mažiausia koncentracija neturi įtakoti ląstelių gyvybingumo. Toksiškų medžiagų didžiausia tiriamoji koncentracija neturėtų sumažinti kolonijų išgyvenimo daugiau nei iki 5–10 %. Reikėtų tirti santykinai vandenyje netirpstančių medžiagų tirpumo ribą pagal atitinkamas procedūras. Lengvai vandenyje tirpstančių netoksiškų medžiagų didžiausia koncentracija turėtų būti nustatoma kiekvienu atveju. 6.3.4.
  56. Ląstelės gali būti veikiamos bandomąja medžiaga stacionarioje arba augimo stadijoje iki 18 valandų. Ilgo bandymo metu kutūros turi būti tiriamos mikroskopiškai, nes sporų susiformavimas panaikina bandymo rezultatus. 6.3.
  57. Inkubacijos sąlygos. Lėkštelės inkubuojamos tamsoje 4–7 dienoms 28–30 °C temperatūroje. Analizei naudojamos plokštelės, kuriose dėl mitozinio krosingoverio atsiranda raudonos ir violetinės spalvos sektoriai, turėtų būti laikomos šaldytuve (apie 4 °C temperatūroje) papildomai vieną arba dvi dienas prieš nustatant atitinkamai nusidažiusių kolonijų skaičių. 6.3.
  58. Spontaninės mitozinės rekombinacijos dažnis. Turi būti naudojamos subkultūros, kuriose spontaninių mitozinių rekombinacijų dažniai yra normalūs. 6.3.
  59. Replikatų skaičius. Atliekant prototrofų, atsirandančių dėl mitozinio geno konversijos, bei ląstelių gyvybingumo tyrimą, vienai koncentracijai tirti naudojamos mažiausiai trys replikatų lėkštelės. Tiriant recesyvinį homozigotiškumą, atsirandantį dėl mitozinio krosingoverio, reikėtų panaudoti daugiau lėkštelių, kad būtų galima nustatyti tinkamą kolonijų skaičių.
  60. Darbo eiga 7.
  61. S. cerevisiae kamienai paprastai veikiami bandomąja medžiaga ląstelėms esant stacionarinėje arba augimo stadijoje skystoje terpėje. Iš pradžių bandymai atliekami su ląstelėmis, esančiomis augimo stadijoje; 1-5×107 ląstelių/ml veikiamos bandomąja medžiaga 18 valandų 28–37 °C temperatūroje ant kratyklės; jeigu reikia, tai veikimo metu į terpę įvedamas atitinkamas metabolinės aktyvacijos sistemos kiekis. 7.
  62. Po poveikio ląstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pasėjamos į atitinkamą kultivavimo terpę. Po inkubacijos nustatomas kolonijų, kuriose neįvyko arba įvyko mitozinė rekombinacija, skaičius. 7.
  63. Jei pirmojo bandymo rezultatai yra neigiami, tai antrasis bandymas atliekamas naudojant ląsteles, esančias stacionarinėje fazėje. Jeigu pirmojo bandymo rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkamą nepriklausomą bandymą. II. Duomenys
  64. Duomenys pateikiami lentelėse, nurodant kolonijų skaičių, kolonijų, kuriose neįvyko ir kuriose įvyko mitozinės rekombinacijos, skaičių ir rekombinacijos dažnį.
  65. Visi rezultatai turėtų būti patvirtinti atlikus nepriklausomą bandymą.
  66. Duomenis reikėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais. III. ATASKAITOS PATEIKIMAS
  67. Bandymo protokole, jei įmanoma, turi būti pateikta tokia informacija: 11.
  68. naudotas kamienas; 11.
  69. bandymo sąlygos (ląstelių stacionarioji ar augimo fazė, terpės sudėtis, inkubacijos temperatūra ir trukmė, metabolitinės aktyvacijos sistema); 11.
  70. dozavimas (veikimo laipsnis, procedūra, trukmė ir temperatūra, teigiamos ir neigiamos kontrolės); 11.
  71. kolonijų skaičius, kolonijų, kuriose neįvyko ir įvyko rekombinacijos skaičius bei rekombinacijų dažnis, dozės ir atsako sąryšis, jei tai įmanoma nustatyti, statistinis duomenų įvertinimas; 11.
  72. duomenų aptarimas; 11.
  73. duomenų interpretavimas.
  74. Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas. Šio metodo rezultatų įvertinimas ir aiškinimas pateiktas Bendrajame įvade. IV. NUORODOS
  75. Šio metodo nuorodos pateiktos Bendrajame įvade. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. liepos 5 d. įsakymu Nr. V-507 B17 metodas: MUTAGENIŠKUMAS. ŽINDUOLIŲ ląsteliŲ genų mutacijų In vitro bandymas I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  76. Įvadas 1.
  77. Metodas remiasi Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) chemikalų tyrimo vadovo (OECD Guidelines for Testing of Chemicals) 476 metodu. 1.
  78. Žinduolių ląstelių genų mutacijų in vitro bandymas naudojamas aptikti cheminių medžiagų sukeltas mutacijas. Tinkamoms ląstelių linijoms priklauso pelių limfomos ląstelių linija L5178Y, kiniškojo žiurkėno ląstelių linijos CHO, CHO-ASS2 bei V79 ir žmogaus limfoblastų linija TK. Naudojant šias linijas, dažniausiai įvertinamos timidinkinazę (TK) bei hipoksantinguaninfosforiboziltransferazę (HFRT) koduojančių genų bei ksantinguaninfosforiboziltransferazę (KFRT) koduojančio transgeno mutacijos. Atliekant TK, KFRT bei HFRT koduojančių genų mutacijų tyrimus, nustatomi ir skirtingi genetinių įvykių spektrai. TK ir KFRT koduojantys genai lokalizuoti autosominėse chromosomose, todėl galima nustatyti genetinius įvykius (pavyzdžiui, didelių genų segmentų delecijas), kurie nenustatomi HFRT koduojančio geno, esančio X chromosomose, lokuse. 1.
  79. Atliekant šį bandymą galima naudoti gerai žinomas ląstelių linijas ar kamienus. Tyrimo metu naudojamos ląstelės atrenkamos pagal sugebėjimą augti kultūroje bei stabilumą spontaniškai vykstančių mutacijų atžvilgiu. 1.
  80. Atliekant in vitro bandymus, paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinės aktyvacijos šaltinį. Ši metabolinė aktyvacijos sistema negali absoliučiai atitikti žinduolių sąlygų in vivo. Reikia stengtis vengti tokių sąlygų, kurioms esant bus gaunami rezultatai, neatspindintys tikrojo mutageniškumo. Teigiami rezultatai, neatspindintys tikrojo mutageniškumo, gali būti gaunami dėl pH ir osmosinio slėgio pokyčių bei didelio citotoksiškumo. 1.
  81. Bandymas naudojamas atrinkti galimus žinduolių mutagenus bei kancerogenus. Daugelis medžiagų, kurias ištyrus šiuo metodu gaunami teigiami rezultatai, yra žinduolių kancerogenai, tačiau nėra aiškaus ryšio tarp šio bandymo rezultatų ir kancerogeniškumo. Tarpusavio ryšys priklauso nuo cheminių medžiagų klasės; vis daugėja įrodymų, kad šiuo bandymu negalima nustatyti kai kurių kancerogenų, galbūt dėl to, kad jie nepasižymi genotoksiškumu arba bakterinėse ląstelėse veikia visiškai kitaip. Kitos įvadinės nuostatos pateiktos Cheminių medžiagų ir preparatų toksiškumo ir kitų poveikių sveikatai tyrimo metodų bendrajame įvade (toliau – Bendrasis įvadas), patvirtintame Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2004 m. balandžio 28 d. įsakymu Nr. V-284 (Žin., 2004, Nr. 70-2472).
  82. Apibrėžimai 2.
  83. Tiesioginė mutacija – geno tėvinio tipo mutantinės formos mutacija, dėl kurios šio geno koduojamas baltymas praranda fermentinį aktyvumą arba šis pakinta. 2.
  84. Bazių porų pakaitas sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar kelių bazių porų, esančių DNR molekulėje, pakaitas. 2.
  85. Grandinės pasislinkimą sukeliantys mutagenai – medžiagos, sukeliančios vienos ar daugelio bazių porų intarpus ar iškritas. 2.
  86. Fenotipinės ekspresijos laikas – laikas, per kurį nepakitusio geno produktai pašalinami iš naujai mutavusių ląstelių. 2.
  87. Mutavimo dažnis – mutantinių ir gyvų ląstelių skaičiaus santykis. 2.
  88. Absoliutus santykinis augimas – per konkretų laiką padidėjęs ląstelių, lyginant su kontroline populiacija, skaičius, įvertinamas kaip suspensijos augimas, lyginant su neigiamos kontrolinės ląstelių grupės kloninio augimo efektyvumu, o pastarasis lyginamas su neigiamu kontroliniu mėginiu. 2.
  89. Santykinis suspensijos augimas – fenotipinės ekspresijos periodu padidėjęs ląstelių, lyginant su neigiamu kontroliniu bandiniu, skaičius. 2.
  90. Gyvybingumas – ląstelių, paveiktų bandomąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai, pasibaigus ekspresijai, jos pasėjamos į terpę esant atrankos sąlygoms. 2.
  91. Išgyvenimas – ląstelių, paveiktų bandomąja medžiaga, kloninio augimo efektyvumas tuo metu, kai, baigiantis veikimui bandomąja medžiaga, jos pasėjamos į terpę; paprastai išgyvenimas lyginamas su kontrolinės ląstelių populiacijos išgyvenimu.
  92. Bandymo metodo principas 3.
  93. Ląstelės, nesugebančios sintetinti timidinkinazės (TK) dėl mutacijos TK+/- ir/ar TK-/-, yra atsparios pirimidino analogo – trifluortimidino (TFT) – sukeliamiems citotoksiniams efektams. Ląstelės, sugebančios sintetinti TK, yra jautrios TFT, kuris blokuoja ląstelės metabolizmą bei sustabdo tolimesnį jos dalijimąsi. Mutantinės ląstelė

DI paaiškinimas pagal oficialų įstatymo tekstą. Orientacinis, nepakeičia teisinės konsultacijos.