8.4.4. Mėginio (E) chromatografinės analizės rezultatai gaunami chromatogramos forma, kurioje GMP smailė identifikuojama pagal maždaug 26 minučių sulaikymo trukmę.
\nIntegratorius (6.40.6) automatiškai skaičiuoja GMP smailės aukštį H. Kiekvienoje chromatogramoje turi būti patikrinta pagrindo linijos vieta. Analizė arba integracija turi būti kartojama, jeigu neteisingai nustatyta pagrindo linijos vieta.
\nPrieš atliekant kiekybinę interpretaciją svarbu patikrinti kiekvienos chromatogramos išvaizdą siekiant nustatyti bet kokį nukrypimą galimą arba dėl aparato ar kolonėlės veikimo sutrikimo arba dėl analizuojamo mėginio kilmės ar prigimties. Esant abejonių, analizė kartojama.
\n8.5. Kalibravimas:
\n8.5.1. etaloniniams mėginiams (5.4.1-5.4.2) taikoma procedūra, aprašyta punktuose (8.2-8.4.4). Naudojami šviežiai pagaminti tirpalai, kadangi GMP skyla 8 % trichloracto rūgšties aplinkoje kambario temperatūroje. 4°C temperatūroje tirpalas išlieka stabilus 24 valandas. Ilgos analizių serijos atveju automatiniame inžektoriuje pageidaujama naudoti šaldomą mėginių padėklą.
\nPASTABA. 8.4.2 punktas gali būti praleidžiamas, jeigu % B pradinėmis sąlygomis yra žinomas iš ankstesnės analizės.
\nEtaloninio mėginio (5) chromatograma turi būti analogiška kaip 1 paveiksle: prieš GMPA smailę yra dvi mažos smailės. Svarbu gauti panašius at(si)skyrimus.
\n1 pav.Standartinio bendrinio chromatograma 8.5.2. Prieš atliekant mėginių chromatografiją, įsiurbiama 100\\A etaloninio mėginio be fermentinių išrūgų (0) (5.4.1).
\nChromatograma neturi rodyti smailės per GMPA smailės sulaikymo trukmę.
\n8.5.3. Nustatomas perskaičiavimo koeficientas R įsiurbiant tą patį filtrato (8.5.1) tūrį, koks buvo įsiurbiamas mėginio.
\n9.1. Apskaičiavimo metodas ir formulė Perskaičiavimo koeficiento R apskaičiavimas:
\nGMP smailės: R = W/H, kur:
\nR – GMP smailės perskaičiavimo koeficientas; H – GMP smailės aukštis; W – išrūgų kiekis etaloniniame mėginyje (5).
\n9.2. Fermentinių išrūgų kiekio mėginyje apskaičiavimas:
\nW(E) = R x H(E), kur:
\nW(E) – fermentinių išrūgų kiekis mėginyje (E) masės procentais;
\nR – GMP smailės perskaičiavimo koeficientas (9.1.1);
\nH(E) – mėginio (E) GMP smailės aukštis.
\nJeigu W(E) yra didesnis kaip 1 % ir skirtumas tarp sulaikymo trukmės mėginio ir etaloninio mėginio (5) mažesnis kaip 0,2 minutės, tai mėginyje yra fermentinių išrūgų sausųjų medžiagų.
\n9.3. Tikslumas:
\n9.3.1. Pakartojamumas Skirtumas dviejų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 0,2 masės procento.
\n9.3.2. Atkuriamumas Dar nenustatytas.
\n9.3.3. Tiesinė priklausomybė Esant nuo 0 iki 16 procentų fermentinių išrūgų, turėtų būti gaunama tiesinė priklausomybė su didesniu kaip 0,99 koreliacijos koeficientu.
\n9.4. Interpretacija Laikoma, kad išrūgų turi būti, jeigu pagal 9.2 punktą gautas rezultatas didesnis kaip 1 % (masės) ir GMP smailės sulaikymo trukmė daugiau kaip 0,2 minutės skiriasi nuo etaloninio mėginio (5) sulaikymo trukmės. 1 % riba nustatyta pagal šio techninio reglamento 14 priedo nuostatas. ______________ Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės metodų taikymo techninio reglamento 16 priedas NUGRIEBTO PIENO MILTELIAI: FOSFATIDILSERINO IR FOSFATIDILETANOLAMINO KIEKIO NUSTATYMAS ATVIRKŠTINIŲ FAZIŲ ESCh METODU 1. Taikymo sritis Šiame metode aprašytas fosfatidilserino (FS) ir fosfatidiletanolamino (FE) kiekio nugriebto pieno milteliuose (NPM) tyrimas, pagal kurį nustatomas juose esantis pasukų kiekis.
\n4.1. Etaloninė medžiaga: FEDP, mažiausiai 99 % grynumo 4.2. Reagentai etaloniniam ir tiriamajam mėginiams paruošti:
\n4.2.1. metanolis, skirtas ESCh analizei;
\n4.2.2. chloroformas, skirtas ESCh analizei;
\n4.2.3. triptamino monohidrochloridas.
\n4.3. Reagentai o-ftalio dialdehido dariniams gauti:
\n4.3.1. natrio hidroksidas, 12 mol/1 vandeninis tirpalas;
\n4.3.2. boro rūgštis. 0,4 mol/1 vandeninis tirpalas, natrio hidroksidu (4.3.1) sunormintas iki pH 10,0;
\n4.3.3. 2-merkaptoetanolis;
\n4.3.4. o-oftalio dialdehidas (OFA). 4.4. ESCh eliuavimo tirpalai:
\nEliuavimo tirpalai ruošiami iš reagentų, skirtų ESCh analizei:
\n4.4.1. vanduo, skirtas ESCh analizei;
\n4.4.2. fluorescensiškai patikrinto grynumo metanolis;
\n4.4.3. tetrahidrofuranas;
\n4.4.4. natrio dihidrofosfatas;
\n4.4.5. natrio acetatas;
\n4.4.6. Acto rūgštis.
\nVisi reagentai turi būti analiziškai gryni, vanduo – distiliuotas arba tokio pat grynumo.
\nPASTABA. Etaloninė medžiaga turi būti laikoma minus 18 °C temperatūroje.
\n5.1. analizinės svarstyklės;
\n5.2. 25 ml ir 100 ml laboratorinės stiklinės;
\n5.3. lmlirlOmlpipetės;
\n5.4. magnetinė maišyklė;
\n5.5. 0,2 ml, 0,5 ml ir 5 ml graduotos pipetės;
\n5.6. 10 ml, 50 ml ir 100 ml matavimo kolbos;
\n5.7. 20 ui ir 100 ui švirkštai;
\n5.8. ultragarsinė vonia;
\n5.9. centrifuga, galinti išvystyti 27000 x g išcentrinę jėgą;
\n5.10. apie 5 ml stikliniai buteliukai;
\n5.11. 25 ml graduotas cilindras;
\n5.12. pH metras;
\n5.13. ESCh įranga:
\n5.13.1. judančiosios fazės gradiento formavimo sistema, kurios našumas 1,0 ml/min, esant 200 barų slėgiui;
\n5.13.2. automatinis mėginių ėmiklis, kuriame galima sintetinti darinius;
\n5.13.3. 30 °C temperatūrą palaikantis kolonėlės šildytuvas;
\n5.13.4. fluorescencinis detektorius, nustatytas 330 nm sužadinimo bangos ilgiui ir 440 nm emisijos bangos ilgiui;
\n5.13.5. integratorius arba duomenis apdorojanti programinė įranga, kuria galima nustatyti smailės plotą;
\n5.13.6. kolonėlė „Lichrosphere-100“ (250x4,6 mm) arba jai lygiavertė, užpildyta oktadecil-silanu (C18), dalelių dydis 5 um.
\n7.1. Vidinio etalono tirpalo ruošimas Į 100 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 30,0 g±0, l g triptamino monohidrochlorido (4.2.3) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilama į 10 ml matavimo kolbą (5.6) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Gaunamas 0,15 mmol/1 koncentracijos triptamino tirpalas.
\n7.2. Tiriamojo mėginio tirpalo ruošimas Į 25 ml laboratorinę stiklinę (5.2) pasveriama 1,000 g±0,001 g tiriamojo mėginio. Pipete (5.3) įpilama 10 ml iki 40 °C pašildyto distiliuoto vandens ir 30 min maišoma magnetinė maišykle (5.4), kad neliktų jokių neištirpusių gumuliukų. 0,2 ml regeneruoto pieno pipete (5.5) įlašinami į 10 ml matavimo kolbą (5.6), švirkštu (5.7) įšvirkščiama 100 ųl 0,15 mmol/1 triptamino tirpalo (7.1) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Kruopščiai sumaišoma, vartant kolbą, ir 15 min apdorojama ultragarsu (5.8). 10 min sukama centrifugoje (5.9), esant 27000 x g išcentrinei jėgai, gautas skystis supilamas į stiklinį buteliuką(5.10).
\nPASTABA. Mėginio tirpalas iki ESCh analizės turi būti laikomas 4 °C temperatūroje.
\n7.3. Išorinio etalono tirpalo ruošimas Į 50 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 55,4 mg FEDP (4.1) ir naudojant graduotą cilindrą (5.11) įpilama apie 25 ml chloroformo (4.2.2). Kolba užkemšama kamščiu ir, atsargiai maišant, šildoma iki 50 °C, kol ištirpsta FEDP. Kolba atvėsinama iki 20 °C, praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės ir, vartant kolbą sumaišoma. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilamas į 100 ml matavimo kolbą (5.6) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. 1 ml šio tirpalo pipete (5.3) įpilamas į 10 ml matavimo kolbą (5.6), švirkštu (5.7) įšvirkščiama 100 ųl 0,15 mmol/1 triptamino tirpalo (7.1) ir praskiedžiama metanoliu (4.2.1) iki žymės. Vartant kolbą tirpalas sumaišomas.
\nPASTABA. Etaloninis tirpalas iki chromatografmės analizės turi būti laikomas 4 °C temperatūroje.
\n7.4. Sintezuojančio reagento ruošimas Į 10 ml matavimo kolbą (5.6) pasveriama 25,0±0,1 mg OFA (4.3.4), pipete (5.5) įlašinami 0,5 ml metanolio (4.2.1) ir atsargiai maišoma, kol OFA ištirpsta. Praskiedžiama boro rūgšties tirpalu (4.3.2) iki žymės ir švirkštu (5.7) įšvirkščiama 20 ųl 2-merkaptoetanolio (4.3.3).
\nPASTABA. Sintezuojantis tirpalas turi būti laikomas tamsiame inde 4 °C temperatūroje ir yra tinkamas vieną savaitę.
\n7.5. Chromatografmis nustatymas: 7.5.1. Eliuavimo tirpalai (4.4): Eliuentas A:
\n0,3 mmol/1 natrio dihidrofosfato ir 3 mmol/1 natrio acetato tirpalas (acto rūgštimi normalizuotas iki pH6,5): metanolis: tetrahidrofuranas = 558: 440: 2 (tūrio dalimis). Eliuentas B: – metanolis 7.5.2. Siūlomas eliuento gradientas:
\nLaikas (min) Eliuentas A (%) Eliuentas B (%) Tekėjimo greitis, (ml/min) Pradžia 40 60 0 0,1 40 60 0,1 5,0 40 60 0,1 6,0 40 60 1,0 6,5 40 60 1,0 9,0 36 64 1,0 10,0 20 80 1,0 11,5 16 84 1,0 12,0 16 84 1,0 16,0 10 90 1,0 19,0 0 100 1,0 20,0 0 100 1,0 21,0 40 60 1,0 29,0 40 60 1,0 30,0 40 60 0 Kolonėlės temperatūra: 30 °C.
\nPASTABA. Norint atkartoti paveiksle pavaizduotą atskyrimą eliuento gradientą gali tekti šiek tiek pakeisti.
\n7.5.3. Įšvirkščiamas tūris: 50 ųl sintezuojančio reagento ir 50 ųl mėginio tirpalo.
\n7.5.4. Kolonėlės pusiausvyros nustatymas:
\nKiekvieną kartą paleidžiant sistemą kolonėlė 15 min plaunama grynu tirpikliu B, po to nustatomas tirpiklių santykis A: B = 40: 60 ir, nustačius 1 ml/min greitį, 15 min laukiama, kol nusistovės pusiausvyra. Atliekamas tuščiasis bandymas, įšvirkščiant metanolį (4.2.1).
\nPASTABA. Paliekant kolonėlę nenaudojamą ilgesniam laikui, ji 30 min plaunama metanolio chloroformo mišiniu = 80: 20 (tūrio dalimis).
\n7.5.5. FS + FE kiekio nustatymas tiriamajame mėginyje.
\n7.5.6. Atliekamos kelios chromatografmės analizės iš eilės vienodais laiko tarpais, siekiant gauti vienodą sulaikymo trukmę. Atlikus 5-10 mėginių tyrimus, įšvirkščiamas išorinis etaloninis tirpalas (7.3) ir pasitikslinama ar nepakito skyrimas.
\nPASTABA. Po 20-25 analizių kolonėlė mažiausiai 30 min turi būti plaunama grynu tirpikliu B (7.5.1).
\n7.6. Integravimas:
\n7.6.1. FEDP smailė FEDP atskiriama viena smaile. Smailės plotas nustatomas integruojant tarp minimumų.
\n7.6.2. Triptamino smailė Triptaminas išplaunamas viena smaile (žr. pav.). Smailės plotas nustatomas integruojant tarp minimumų.
\n7.6.3. FS ir FE smailių grupės Aprašytomis sąlygomis (žr. pav.) FS išplaunamas dviem iš dalies neatsiskyrusiomis smailėmis, prieš kurias yra mažesnė smailė. FE išplaunamas trimis iš dalies neatsiskyrusiomis smailėmis. Visas kiekvienos smailių grupės plotas nustatomas, nubrėžus pagrindo liniją, kaip parodyta paveiksle.
\nFS ir FE kiekis tiriamajame mėginyje skaičiuojamas pagal formulę: kur:
\nC – FS arba FE kiekis (mg/100 g miltelių) tiriamajame mėginyje;
\nA1 – FEDP smailės plotas etaloninio mėginio (7.3) chromatogramoje;
\nA2 – FS arba FE smailės plotas tiriamojo mėginio (7.2) chromatogramoje;
\nT1 – triptamino smailės plotas etaloninio mėginio (7.3) chromatogramoje;
\nT2 – triptamino smailės plotas tiriamojo mėginio (7.3) chromatogramoje.
\nMinutės Pav. Regeneruoto nugriebto pieno miltelių fosfatidilserino (FS)ir fosfatidiletanolamino (FE) OFA darinių ekstrakto metanolyje chromatograma. Pateiktas FS, FE ir triptamino (vidinio etalono tirpalo) smailių integravimo būdas 9. Tikslumas: 9.1. Pakartojamumas Santykinio standartinio pakartojamumo skirtumas tarp dviejų analizių rezultatų gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas, turi neviršyti 2 %. Jei šiomis sąlygomis atliekamos dvi analizės, santykinis skirtumas tarp dviejų rezultatų turi neviršyti 6 % šių rezultatų aritmetinio vidurkio.
\n9.2. Atkuriamumas Santykinis skirtumas tarp dviejų atskirų ir nepriklausomų rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, naudojant skirtingą aparatūrą ir identiškas tyrimo medžiagas, turi neviršyti 11 % jų aritmetinio vidurkio.
\nPASTABA. Pakartojamumo vertės apskaičiuotos pagal IDF standartą1. Apytikslė atkuriamumo riba apskaičiuota pagal šio reglamento 3 b priedą.
\nGavus teigiamą rezultatą, elgiamasi taip:
\nJei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima.
\nJei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinė medžiaga yra p-laktamininis antibiotikas.
\nJei gaunamas teigiamas rezultatas: šiuo metodu inhibitoriaus identifikuoti negalima. Jei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinė medžiaga yra sulfamidas/dapsonas.
\nJei gaunamas neigiamas rezultatas: inhibitorinės medžiagos yra p-laktamininis antibiotikas ir sulfamidas/dapsonas. ______________ Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės metodų taikymo techninio reglamento 18 priedas PIENO MILTELIŲ KIEKIO KOMBINUOTUOSIUOSE PAŠARUOSE NUSTATYMO FERMENTINĖS PARAKAZEINO KOAGULIACIJOS BŪDU METODAS 1. Tikslas Pieno miltelių kiekio sudėtiniuose pašaruose nustatymas fermentinės parakazeino koaguliacijos būdu.
\n3.1. kombinuotuosiuose pašaruose esančio kazeino ištirpinimas ekstrahuojant natrio citrato tirpalu;
\n3.2. kalcio jonų koncentracijos reguliavimas iki reikiamo nusodinti parakazeinui lygio; kazeino pavertimas parakazeinu šliužo fermento pagalba;
\n3.3. azoto kiekis parakazeino nuosėdose nustatomas Kjeldalio metodu, kaip aprašyta LST IDF 20B; pieno miltelių kiekis paskaičiuojamas priimant, kad minimalus kazeino kiekis juose yra 27,5 % (žr. 9.1).
\n4.1. trinatrio citrato dihidrato (C6Fį07Na3-2H20) 1 % (1 g/100 ml) vandeninis tirpalas;
\n4.2. kalcio chloridas (2 mol/1 tirpalas): sveriama 20,018 g CaCOj į tinkamo dydžio (150 ml -200 ml) porcelianinį indą arba stiklinę. Užpilama distiliuotu vandeniu (kad apsemtų) ir indas su gaminamu tirpalu statomas į verdančio vandens vonią. Lėtai supilama nuo 50 ml iki 60 ml druskos rūgšties tirpalo (HCl:vanduo = 1:1), kad visiškai ištirptų karbonatas ir tirpalas nuskaidrėtų. Pagamintas tirpalas laikomas virš vandens garų vonios, kad būtų pašalinta nesureagavusi HC1 ir gaunamas sausas CaCl2. Gauta druska su distiliuotu vandeniu perpilama į 100 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės. Pamatuojamas pH, kuris turi būti ne mažesnis kaip 4,0. Tirpalas laikomas šaldytuve;
\n4.3. 0,1 mol/1 natrio hidroksidas;
\n4.4. 0,1 mol/1 druskos rūgštis;
\n4.5. skystas šliužo fermentas (standartinio aktyvumo 1:10 000), laikomas šaldytuve 4 °C -6 °C temperatūroje;
\n4.6. Reagentai, reikalingi kiekybiniam azoto nustatymui Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B.
\nVisi naudojami reagentai turi būti analizinio grynumo. Naudojamas tik distiliuotas arba ekvivalentiško grynumo vanduo. Išskyrus šliužo fermentą (4.5), visuose reagentuose turi nebūti azotinių medžiagų.
\nNaudojama įprastinė ir toliau išvardyta laboratorinė įranga:
\n5.1. piestelė arba homogenizatorius;
\n5.2. analizinės svarstyklės;
\n5.3. centrifuga 2000 aps/min – 3000 aps/min su 50 ml talpos mėgintuvėliais;
\n5.4. magnetinė maišyklė su įdedamais 10 mm-15 mm ilgio strypeliais;
\n5.5. 150 ml-200 ml talpos stiklinės;
\n5.6. 250 ml ir 500 ml talpos stiklinės;
\n5.7. 60 mm-80 mm skersmens piltuvai;
\n5.8. 150 mm skersmens reti (greitai filtruojantys) bepelemai filtrai (S. S. 5892, S. S. 595 1/2);
\n5.9. įvairaus nominalaus tūrio pipetės;
\n5.10. termostatiškai reguliuojama 37 °C vandens vonia; 5.11. pHmetras;
\n5.12. Kjeldalio aparatai deginimui ir distiliacijai bei pagalbiniai įrenginiai prie jų;
\n5.13. 25 ml graduotos biuretės;
\n5.14. plastikinė plovyklė distiliuotam vandeniui;
\n5.15. nerūdijančio plieno mentelės;
\n5.16. termometrai;
\n5.17. termostatiškai reguliuojama džiovinimo krosnis.
\n6.1. Mėginio paruošimas:
\nSugrūdama piestelėje arba sumalama malūnėliu iki vienodos konsistencijos nuo 10 g iki 20 g mėginio.
\n6.2. Pieno miltelių tirpinimas ir netirpių liekanų atskyrimas:
\n6.2.1. pasveriama 1,000 g ± 0,002 g gerai susmulkintų kombinuotųjų pašarų (6.1) tiesiai į 50 ml centrifugavimo mėgintuvėlį. Įpilama 30 ml prieš tai pašildyto iki 45 °C natrio citrato tirpalo (4.1). Maišoma magnetine maišykle ne mažiau kaip 5 minutes;
\n6.2.2. centrifuguojama 10 minučių, esant 500 x g (2000 aps/min-3000 aps/min), ir skaidrus supernatantas dekantuojamas į 150 ml-200 ml stiklines saugant, kad nuo mėgintuvėlio dugno nepakiltų purios nuosėdos;
\n6.2.3. likučiai mėgintuvėliuose ekstrahuojami dar du kartus pagal tą pačią procedūrą, o ekstraktas supilamas prie pirmojo;
\n6.2.4. jeigu paviršiuje susidaro skystų riebalų sluoksnis, ekstraktas palaikomas šaldytuve, o sukietėję riebalai nuimami mentele.
\n6.3. Kazeino sutraukdinimas šliužo fermentu:
\n6.3.1. į gautą vandeninį ekstraktą (apie 100 ml) nuolat maišant įlašinama 3,4 ml sotaus kalcio chlorido (4.2). Nustatomas pH 6,4-6,5 su NaOH (4.3) ar HC1 (4.4) tirpalu. Dedama į nustatytą 37 °C vandens vonią 15-20 minučių, kad pasiektume druskų pusiausvyrą. Tai parodo lengvas tirpalo drumstimasis;
\n6.3.2. skystis supilamas į vieną arba du centrifugavimo mėgintuvėlius ir centrifuguojamas 10 minučių, esant 2000 x g, kad būtų pašalintos nuosėdos. Supernatantas, neplaunant nuosėdų, supilamas į vieną (arba du) centrifugavimo mėgintuvėlį;
\n6.3.3. supernatantas vėl pašildomas iki 37 °C. Nuolat maišant ekstraktą įlašinama 0,5 ml skysto šliužo fermento (4.5). Sutrauka susidaro per vieną-dvi minutes;
\n6.3.4. mėginys dedamas atgal į vandens vonią ir paliekamas 15 minučių 37°C temperatūroje. Išėmus mėginį iš vandens vonios, maišant suardoma jo sutrauka. Centrifuguojama 10 minučių, esant 2000 x g. Supernatantas filtruojamas per retą bepelenį filtrą (Whatman Nr. 541 arba ekvivalentišką), filtras išsaugomas. Nuosėdos centrifugos mėgintuvėlyje, maišant perplaunamos 50 ml maždaug 35°C temperatūros vandens. Vėl centrifuguojama 10 minučių, esant 2000 x g. Supernatantas filtruojamas per anksčiau išsaugotą filtrą.
\n6.4. Kazeino azoto nustatymas:
\n6.4.1. perplautos nuosėdos, naudojant distiliuotą vandenį, be nuostolių perpilamos ant filtro, išsaugoto iš 6.3.4 punkto. Filtras įdedamas į Kjeldalio kolbą. Nustatomas azotas Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B.
\n7.1. tuščiasis bandymas turi būti atliekamas reguliariai, naudojant bepelenį filtrą (5.8), sudrėkintą mišiniu, gautu iš 90 ml natrio citrato (4.1), 1 ml sotaus kalcio chlorido (4.2) ir 0,5 ml skysto šliužo fermento (4.5), ir perplaunant 3 x 15 ml distiliuotu vandeniu prieš mineralizuojant Kjeldalio metodu pagal LST IDF 20B;
\n7.2. rūsčiajam bandymui sunaudotas rūgšties (4.4) kiekis turi būti atimamas iš mėginio titravimui sunaudoto rūgšties kiekio.
\nN – parakazeino azoto kiekis procentais;
\n27,5 – koeficientas perskaičiuoti nustatyto kazeino kiekį į nugriebto pieno miltelių kiekį procentais;
\n2,81 ir 0,908 – regresinės analizės būdu gauti pataisos koeficientai.
\n10.1. Pakartojamumas Ne mažiau kaip 95 % atvejų skirtumas dviejų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje ir naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 2,3 g nugriebto pieno miltelių 100 g kombinuotųjų pašarų.
\n10.2. Atkuriamumas Ne mažiau kaip 95 % atvejų skirtumas dviejų atskirų to paties mėginio analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant identiškas medžiagas, turi neviršyti 6,5 g nugriebto pieno miltelių 100 g kombinuotųjų pašarų.
\nR-atkuriamumas; r-pakartojamumas.
\nDvikartinio nustatymo KrN95 = 4,5 g.
\nJeigu cheminės analizės (dvikartinio nustatymo) rezultatai skiriasi nuo deklaruojamo nugriebto sausojo pieno kiekio ne daugiau kaip 4,5 g, laikoma, kad siunta atitinka šio reglamento reikalavimus.
\nPASTABOS:
\nAptikimo riba šiuo metodu yra maždaug 0,05 g krakmolo 100 g bandinio.
\nMetodas remiasi šiomis jodometrijoje naudojamomis reakcijomis:
\n4.1. analizinės svarstyklės;
\n4.2. vandens vonia;
\n4.3. mėgintuvėliai, 25mm x 200 mm.
\nPasveriamas 1 g mėginio ir perpilamas į mėgintuvėlį (4.3). Įpilama 20 ml distiliuoto vandens ir supurtoma, kad ištirptų. Dedama į verdančio vandens vonią (4.2) ir palaikoma 5 minutes. Išimama iš vonios ir atvėsinama iki kambario temperatūros. Įpilama 0,5 ml jodo tirpalo (3.1) ir stebima susidaranti spalva.
\n3.1. analizinės svarstyklės;
\n3.2. nerūdijantys metaliniai arba stikliniai indeliai, uždengiami oro nepraleidžiančiais dangteliais, todeliai turi būti tokios talpos, kad juose būtų galima paskleisti apie 0,3 g/cm2 mėginio;
\n3.3. elektra kaitinama vakuuminė krosnelė, kurioje įtaisytas alyvos siurblys ir koks nors mechanizmas paduoti karštam orui arba džiovinimo agentui (pvz., kalcio oksidui);
\n3.4. eksikatorius su efektyviu džiovinimo agentu;
\n3.5. ventiliuojama džiovinimo krosnelė, termostatiškai palaikanti 102 °C ± 2 °C.
\nIndelis (3.2) ir jo dangtelis kaitinami krosnelėje (3.5) ne mažiau kaip 1 vai. Po to, uždengus dangteliu, indelis perkeliamas į eksikatorių (3.4), leidžiama atvėsti iki kambario temperatūros.
\nIndelis (3.2) kartu su dangteliu pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Į pasvertą indelį 1 mg tikslumu atsveriama apie 5 g mėginio ir vienodai paskleidžiama. Indelis nudengiamas ir dedamas į vakuuminę krosnelę (3.3), pašildytą iki 83 °C. Indelis įdedamas kaip galima greičiau, kad pernelyg nenukristų krosnelės temperatūra.
\nSlėgis sumažinamas iki 100 torų (13,3 kPa) ir esant šiam slėgiui džiovinama keturias valandas karšto sauso oro srove arba naudojant džiovinimo agentą (apie 300 g 20-čiai mėginių). Pasiekus reikiamą slėgį vakuuminis siurblys atjungiamas. Džiovinimo laikas skaičiuojamas nuo to momento, kai temperatūra krosnelėje pasiekia 83 °C. Po to, slėgis krosnelėje iš lėto pakeliamas iki atmosferinio. Krosnelė atidaroma, indelis tuoj pat uždengiamas ir išimamas iš krosnelės, paliekamas nuo 30 iki 45 minučių eksikatoriuje (3.4), kad atvėstų ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Dar kartą džiovinamas vakuuminėje krosnelėje (3.3), kurioje palaikoma 83 „C temperamra, 30 minučių ir vėl sveriamas. Dviejų svėrimų skirtumas turi būti ne didesnis kaip 0,1 % drėgmės kiekio.
\nW – drėgmės kiekis procentais;
\nE – pradinė mėginio masė gramais; m– išdžiovinto mėginio masė gramais.
\n6.2. Atkuriamumas Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų analizių rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų naudojant identiškas medžiagas, neturi būti didesnis kaip 0,6 g drėgmės lOOg rūgščių pasukų miltelių.
\nPASTABA. Tikslumo duomenys buvo nustatyti remiantis 1995 metais vykdyto eksperimento rezultatais. Eksperimente dalyvavo aštuonios laboratorijos ir buvo tirta 12 mėginių (6 akli dublikatai). ______________ Pieno ir pieno produktų pamatinių analizės metodų taikymo techninio reglamento 21 priedas PAMATINIS PAŠALINIŲ RIEBALŲ APTIKIMO PIENO RIEBALUOSE METODAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJA TIRIANT TRIGLICERIDUS 1. Taikymo sritis Šis metodas taikomas pašalinių augalinės ir gyvūninės kilmės riebalų (pvz., jautinių ir kiaulinių taukų) pieno ir pieno produktų riebaluose nustatyti, taikant trigliceridų dujų chromatografijos analizę.
\nAugaliniai ir gyvūniniai riebalai grynuose pieno riebaluose yra nustatomi kokybiniu ir kiekybiniu metodais taikant trigliceridų formules.
\nPASTABOS:
\nPASTABA. Galima taikyti kapiliarinę dujų chromatografiją, jei užtikrinamas rezultatų pakartojamumas.1 4. Reagentai Naudojami tik analiziškai gryni reagentai:
\n4.1. Nešančiosios dujos: azotas, grynumas >99,996%.
\n4.2. Sotieji etaloniniai trigliceridai2, taip pat cholesterolis pieno riebalams standartizuoti pagal 6.5.4 punktą.
\n4.3. Metanolis bevandenis.
\n4.4. n-heksanas.
\n4.5. n-heptanas.
\n4.6. Toluolas.
\n4.7. Dimetilchlorsilano tirpalas: 50 ml dimetilchlorsilano ištirpinama 283 ml toluolo.
\n4.8. Degiosios dujos: vandenilis ir oras.
\n4.9. Nejudančioji fazė: 125/150 m stambumo (100/120 meš) Gas ChromQ, padengto 3% OV-13.
\n4.10. 10 % kakavos sviesto tirpalas. 5. Įranga Naudojama įprastinė laboratorinė įranga ir toliau nurodyta.
\n5.1. Dujų chromatografas, tinkamas naudoti esant 400^Į50°C temperatūrai, su liepsnos jonizuojamu detektoriumi (LJD) ir nešančiųjų dujų masės pastovumo kontrole: degiosios dujos (H2) – 30 ml/min, oras – 270 ml/min. Esant dideliam nešančiųjų dujų srautui, liepsna turi būti ypatingai didelė.
\nDujų chromatografo tarpinės turi būti atsparios aukštai temperatūrai ir mažo pralaidumo. Tarpines reikia reguliariai keisti, pvz., apytikriai po 100 analizių arba pablogėjus atskyrimui (žr. 4 pav.).
\nPASTABOS:
\n5.2. Chromatografinė kolonėlė Tai U raidės formos kolonėlė (vidinis skersmuo 2 mm, ilgis 500 mm), kurios stiklinis paviršius pirmiausia inaktyvuojamas pagal 6.1 punkte aprašytą procedūrą silanizuojant dimetilchlorsilanu.
\nPASTABA. Galima naudoti ir ilgesnes (80-200 mm) užpildytas kolonėles, tada pasiekiamas truputį geresnis rezultatų pakartojamumas. Tačiau darbo metu nejudančioje fazėje atsiranda įtrūkimų, kurių pasekmė – blogesni kiekybiniai rezultatai. Be to, LJD liepsna lengvai užgęsta dėl didelio nešančiųjų dujų greičio nuo 75 ml/min iki 85 ml/min.
\n5.3. Kolonėlės užpildymo įrenginys (žr. 1 pav.):
\n5.3.1. plastikinė kolonėlė su užsukamais kamščiais bei žyma, iki kurios kolonėlė turi būti užpildyta nejudančiąja faze;
\n5.3.2. tankus sietas (tinklo akučių dydis apie 100 ixm) su užsukamu kamščiu, tinkamu užsandarinti stiklinę kolonėlę (1 pav.);
\n5.3.3. silanizuota stiklo vata;
\n5.3.4. vibratorius, skirtas tolygiam nejudančiosios fazės paskirstymui pripildymo metu.
\n1 pav. Kolonėlės pripildymas 5.4. Nuo 1 iki 3 ml Extrelut kolonėlė su silikageliu4 Ši kolonėlė naudojama alternatyviojoje pieno riebalų ekstrakcijoje;
\n5.5. 6,4 mm (1/4 colio) grafitinė tarpinė su 6 mm anga;
\n5.6. Įrenginiai kolonėlės silanizavimui pagal 6.1 punktą: 5.6.1. Vulfo kolba;
\n5.6.2. vandens siurblys.
\n5.7. Vandens vonia, palaikanti (50 ± 2)°C temperatūrą;
\n5.8. Džiovinimo spinta, palaikanti (50 ± 2)°C ir (100 ± 2)°C temperatūrą.
\n5.9. Mikropipetė.
\n5.10. Graduota 5 ml pipetė, skirta dozuoti 1,5 ml metanolio.
\n5.11. 50 ml apvaliadugnė kolba.
\n5.12. 50 ml Erlenmejerio kolba.
\n5.14. Filtras smulkiomis poromis.
\n5.15. Rotacinis garintuvas.
\n5.16. 1 ml buteliukai, užsandarinti aliumininiu kamščiu su tarpine.
\n5.17. Įpurškimo švirkštas: švirkšto stūmoklis neturi liesti adatos galo.
\nAdatos smaigalį reikia nuolatos tikrinti (pvz, stereomikroskopu), kad nepažeistų tarpinės.
\nPASTABA. Naudojant švirkštus yra geresnis rezultatų pakartojamumas.
\n6.2. Kolonėlės pripildymas Kolonėlės pripildymas atliekamas po kolonėlės plovimo su 75 ml toluolo, 50 ml metanolio ir apytikriai 30 min džiovinimo spintoje, esant apie 100°C temperatūrai. Kolonėlė pripildoma pagal 1 pav. pateiktą schemą. Plastikinė kolonėlė iki žymės užpildoma nejudančiąja faze (4.9). Apatinis stiklinės kolonėlės galas užkemšamas apie 1 cm ilgio iš anksto silanizuotos stiklo vatos gabaliuku, kuris įspaudžiamas plieniniu strypeliu. Po to kolonėlės galas užsandarinamas sietu su kamščiu (5.3.2). Kolonėlė nejudančiąja faze pildoma esant 3 barų slėgiui N2 atmosferoje. Proceso metu vibratorius turi judėti aukštyn-žemyn, kad nejudančioji fazė stiklinėje kolonėlėje pasiskirstytų vienodai.
\nPripildžius nejudančiąja faze, kitas kolonėlės galas užkemšamas tvirtai suspaustos silanizuotos stiklo vatos gabaliuku, išlindęs pluoštas nupjaunamas ir kamštelis mentele įstumiamas keletą milimetrų į kolonėlę.
\nStiklinė kolonėlė 3 pav. Plovimo įranga.
\n6.3. Mėginių paruošimas Mėginių paruošimui naudojamas vienas iš trijų pateiktų metodų:
\n6.3.1. pieno riebalų išskyrimas iš sviesto. 5-10 g sviesto išlydoma inde, įstatytame į 50°C temperatūros vandens vonią (5.7). 50 ml Erlenmejerio kolba ir piltuvas su filtru (5.14) pašildomi džiovinimo spintoje iki 50°C temperatūros. Išlydyto sviesto riebalinis sluoksnis nufiltruojamas per pašildytą įrangą. Šiuose pieno riebaluose beveik nėra fosfolipidų;
\n6.3.2. riebalų ekstrakcija Rose-Gotllieb metodu. Ekstrakcija atliekama pagal LST ISO 1211:2000, LST EN ISO 2450:2000, LST EN ISO 7328:2000, LST EN ISO 7208:2000. Taip paruoštuose pieno riebaluose esantys fosfolipidai cholesterolio smailę padidina 0,1 %. Jeigu chromatogramoje trigliceridų ir cholesterolio smailių plotas bus laikomas 100, tai šis cholesterolio smailės padidėjimas neturės žymesnės įtakos trigliceridų analizės rezultatams;
\n6.3.3. ekstrakcija naudojant silikagelio kolonėles. 0,7 ml 20°C temperatūros pieno mėginio mikropipete supilama į Extrelut kolonėlę (5.4) ir paliekama maždaug 5 minutėms, kad tolygiai pasiskirstytų ant silikagelio. Baltymų-lipidų komplekso denatūravimui pipete įlašinama 1,5 ml metanolio. Po to mėginys ekstrahuojamas su 20 ml n-heksano. n-heksanas pilamas mažais kiekiais, o ištekantis tirpalas surenkamas į iki pastovaus svorio iškaitintą 50 ml apvaliadugnę kolbą. Po ekstrakcijos visas tirpalas išleidžiamas iš kolonėlės. Tirpiklis iš apvaliadugnės kolbos išdistiliuojamas rotaciniu garintuvu esant vandens vonios temperatūrai nuo 40 iki 50°C. Kolba išdžiovinama, o joje esančių riebalų kiekis nustatomas svėrimo būdu.
\nPASTABA. Pieno riebalų ekstrakcijos pagal Gerber, Weibull-Berntrop, Schmid-Bondzynski-Ratzlaff ar detergentiniu (BDI) metodais trigliceridų analizei taikyti negalima. Taikant šiuos metodus, į riebalų fazę pereina didesnė ar mažesnė dalis nevisiškai esterifikuotų gliceridų ar fosfolipidų.
\n6.4. Mėginio tirpalo paruošimas Dujų chromatografijoje naudojamas riebalų (6.3) 5% tirpalas n-heptane. Ruošiant šį mėginio tirpalą, pasveriami atitinkami mėginių (6.3.1 ir 6.3.2) kiekiai ir ištirpinami atitinkamame kiekyje n-heptano. Ruošiant mėginio (6.3.3) tirpalą, pirmiausia apskaičiuojamas išskirtų riebalų kiekis, po to – reikalingo jų ištirpinimui n-heptano kiekis. Apytiksliai 1 ml mėginio tirpalo perpilama į buteliuką(5.16).
\n6.5. Chromatografinis trigliceridų nustatymas Aukštoje, 350°C temperatūroje eliuojant ilgų grandinių C52-C56 trigliceridus, šiek tiek pakyla nulinė linija, ypač tais atvejais, jei kolonėlės nebuvo tinkamai apdorotos. Šio bazinės linijos pakilimo galima išvengti naudojant dvi kolonėles arba kitaip koreguojant nulinę liniją. Pasirinkus nulinės linijos koregavimo kompensacinį būdą ar dirbant su viena kolonėle, įpurškimo sistemos ir detektoriaus stiklo įdėklams reikia naudoti grafitines tarpines (5.5).
\n6.5.1. nulinės linijos korekcija Siekiant išvengti nulinės linijos pakilimo reikia taikyti vieną iš šių keturių metodų:
\n6.5.1.1. kolonėlių derinimas Taikant kompensacinį metodą naudojamos dvi kolonėlės;
\n6.5.1.2. nulinės linijos koregavimas dujų chromatografu Atliekant bandymą be riebalų tirpalo, dujų chromatografu nustatoma ir koreguojama nulinė linija, išvengiant jos pakilimo;
\n6.5.1.3. nulinės linijos koregavimas kompiuterine programa Atliekant bandymą be riebalų tirpalo, kompiuterine programa nustatoma ir koreguojama nulinė linija, išvengiant jos pakilimo;
\n6.5.1.4. nulinės linijos koregavimas atliekant tinkamą išankstinį kolonėlės kondicionavimą Tinkamai kondicionavus kolonėlę ir maždaug 20 kartų atlikus pieno riebalų tirpalo dujų chromatografiją, nulinės linijos pakilimas aukštoje temperatūroje dažniausiai yra toks nežymus, kad galima atsisakyti jos koregavimo.
\n6.5.2. įpurškimo technika Siekiant geresnių kiekybinių rezultatų ir užtikrinti, kad aukštoje temperatūroje verdantys trigliceridai būtų atskirti, taikoma „karšto įpurškimo technika“. Riebalų tirpalas įtraukiamas į švirkštą, šalta adata apytikriai 3s šildoma įpurškimo sistemoje, po to švirkšto turinys greitai įpurkščiamas.
\nPASTABA. Taikant šią įpurškimo techniką, išvengiama riebalų sustingimo švirkšte ir įpurškimo sistemoje. Neatliekamas tiesioginis įpurškimas viršutinėje, labiau šildomoje kolonėlės dalyje, nes čia gali kauptis tarpinės fragmentai ir teršalai, kuriuos galima lengvai pašalinti, reguliariai keičiant įpurškimo sistemos įdėklus, neišardant kolonėlės.
\nReikia vengti adatos smaigalio lietimosi su indo, kuriame yra mėginys, dugnu, kad sulinkusi adata (net jeigu vizualiai tai nepastebima) nepažeistų tarpinės.
\n4 pav. Pieno riebalų trigliceridų chromatograma: a – blogas atskyrimas dėl tarpinės pažeidimo; b – geras atskyrimas 6.5.3. pripildytos kolonėlės kondicionavimas Atliekant operacijas nuo a) iki c) kolonėlė su detektoriumi nesujungiama, siekiant išvengti jo užteršimo.
\nPagal 6.2 punktą pripildyta kolonėlė kondicionuojama taip:
\nPASTABA. Kakavos sviestas sudarytas beveik vien iš aukštose temperatūrose verdančių C50-C56 trigliceridų. Naudojant kakavos sviestą, kolonėlė specialiai paruošiama ilgų grandinių trigliceridų analizei. Aukštose temperatūrose verdančių trigliceridų C50-C54 analizės duomenų pataisos koeficientas yra iki 1,20. Pakartotinai atliekant pieno riebalų tirpalo analizę, pradinis aukštas analizės duomenų pataisos koeficientas, gautas tiriant trigliceridų kurių anglies atomų skaičius nuo C50 iki C54, sumažėja. Trigliceridų kurių riebalų rūgščių anglies atomų skaičius yra mažas, šis koeficientas yra 1. Paprastai paruošiamos trys poros pripildytų kolonėlių (6.2). Kondicionuotų kolonėlių poros tikrinamos atliekant įprastinę pieno riebalų analizę.
\nTolesnei analizei naudojama ta kolonėlių pora, su kuria gauti geriausi kiekybiniai rezultatai (analizės duomenų pataisos koeficientas yra artimiausias 1). Kolonėlės, kurių pataisos koeficientas > 1,20, nenaudojamos.
\n6.5.4. kalibravimas Trigliceridų ir cholesterolio analizės duomenų pataisos koeficientų nustatymui naudojami etaloniniai trigliceridai (bent jau sotieji C24, C30, C36, C42, C48 ir C54 trigliceridai, bei cholesterolis; dar geriau, jei bus papildomai panaudoti C50 ir C52 etaloniniai trigliceridai). Tarpinių trigliceridų analizės duomenų pataisos koeficientai nustatomi matematinės interpoliacijos būdu. Naudojant etaloninius riebalus, kalibravimą reikia atlikti 2-3 kartus per dieną. Jei gaunami identiški rezultatai, tai atliekant mėginių trigliceridų analizę, pasiekiamas geras kiekybinių rezultatų pakartojamumas. Etaloniniai pieno riebalai, laikant ne aukštesnėje nei -18 °C temperatūroje, tinkami naudojimui keletą mėnesių.
\nPASTABA. Kiekvienos iš sudedamųjų dalių pataisos koeficientas gali būti nustatomas naudojant etaloninius pieno riebalus su sertifikuota trigliceridų sudėtimi, pavyzdžiui, CRM 519 (bevandeniai pieno riebalai), kuriuos galima įsigyti Belgijoje (Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium).
\n6.5.5. temperatūros režimas, nešančiosios dujos ir kitos trigliceridų analizės sąlygos Temperatūros režimas: 210°C pradinė kolonėlės temperatūra išlaikoma 1 min, tada keliama 6 °C/min iki 350°C ir laikoma šioje temperatūroje 5 minutes. Detektoriaus ir įpurškimo sistemos temperatūra 370°C.
\nNešančiosios dujos: azotas, srauto greitis 40 ml/min.
\nAnalizės trukmė 29,3 minutės; įpurškimo tūris 0,5 ui.
\nLiepsnos jonizuojamo detektoriaus režimas: turi atitikti 5.1 punktą. Jis įkaitinamas kiekvienos darbo dienos pradžioje.
\nPASTABOS:
\nChromatogramos smailės ploto įvertinimui naudojamas integratorius, kuris nubrėžia nulinę liniją. Taip pat galima nulinės linijos reintegracija su optimizuotais integraciniais parametrais.
\n5 ir 6 pav. pateikti du trigliceridų chromatogramų pavyzdžiai. 5 pav. pavaizduota taisyklinga chromatograma, o 6 pav. vaizduojama atsitiktinė klaida tarp C50 ir C54 smailių, nes nulinė linija, palyginti su 5 pav., yra netaisyklinga. Tik naudojant integratorių, kuris nubrėžia nulinę liniją yra didelė tikimybė pastebėti tokias klaidas ir jų išvengti.
\nMatavimo sąlygoms kontroliuoti gali būti naudojami santykiniai standartiniai nuokrypiai RSD: (variacijos koeficientas x 100), gauti atlikus tų pačių riebalų 19 analizių kurių vertės skirtingiems trigliceridams pateiktos 1 lentelėje.
\n1 lentelė. Trigliceridų kiekio santykinis standartinis nuokrypis (RSD), n=19 Trigliceridas RSD (%) C24 C26 C28 C30 C32 C34 C36 C38 C40 C42 C44 C46 C48 C50 C52 C54 10,00 2,69 1,76 3 03 1,03 0,79 0,25 0,42 0,20 0,26 0,34 0,37 0,53 0,38 0,54 0,60 5 pav. Pieno riebalų trigliceridų chromatograma su teisingai nubrėžta nuline linija 6 pav. Klaidingai integruota pieno riebalų chromatograma Esant didesniems santykiniams standartiniams nuokrypiams (RSD), nei nurodyta 1 lentelėje, chromatografijos atlikimo sąlygos nėra tinkamos ir reikia patikrinti tarpinę ar nešančiųjų dujų srautą. Smulkios tarpinės dalelės gali nusėsti ant stiklo vatos kolonėlės pradžioje arba kolonėlė yra nebetinkama naudoti dėl nusidėvėjimo, temperatūros poveikio ir 1.1, (žr. 3 pav.).
\nPASTABA. 1 lentelėje pateiktos vertės nėra privalomos, bet suteikia informaciją apie kokybę. Tačiau jei yra priimamos didesnės RSD vertės, pakartojamumo ir atitikimo ribos, nurodytos 11 punkte, vis dėlto turi atitikti.
\nTiksliausia formulė, padedanti nustatyti kiaulinių taukų priemaišą yra ši:
\n6,5125 x C26 + 1,2052 x C32 + 1,7336 x C34 + 1,7557 x C36 + 2,2325 x C42 + 2,8006 x C46 + 2,5432 x C52 + 0,9892 xC54 = S (1) PASTABA. 755-iems pieno riebalų mėginiams nustatytas S pasikliovimo intervalas 97,96-102,04, esant visų grynųjų pieno riebalų pavyzdžių S verčių standartiniam nuokrypiui SD 0,39897, esant 99 % tikimybei.
\nJei reikia ištirti nežinomos sudėties riebalų mėginį, tai ši formulė suteikia galimybę paprastomis priemonėmis, nenaudojant kompiuterio, įsitikinti, ar trigliceridų kiekio suma, čia pateikta su atitinkamais pataisos koeficientais, išeina už 97,96-102,04 intervalo ribų, ir jeigu taip, tai yra didelė pašalinių riebalų priemaišų tikimybė.
\n2 lentelėje pateiktos atitinkamos trigliceridų formulės pašalinių sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejaus, hidrogenizuotų žuvies taukų, kokoso ir palmių riešutų aliejaus, taip pat palmių aliejaus ir galvijų lajaus priemaišoms kokybiškai nustatyti.
\nPašalinių riebalų trigliceridų sudėtis kinta, todėl atliekama iki keturių skirtingų to paties tipo trigliceridų matavimų. (Naudojant tuos pačius pašalinių riebalų tipus, įskaitoma „nepalankiausia“ nustatymo riba (žr. 4 lentelę)).
\nGeri visų pašalinių riebalų nustatymo rezultatai gaunami pagal šią bendrąją formulę: -2,7575 x C26 + 6,4077 x C28 + 5,5437 x C30 – 15,3247 x C32 + 6,2600 x C34 + 8,0108 x C40 –5,0336 x C42 + 0,6356 x C44 + 6,0171 x C46 = S (2) Skaičiavimai bet kokių pašalinių riebalų deriniui nustatyti pieno riebaluose parodė, kad, pvz., taikant 2 lentelėje nurodytą kiaulinių taukų formulę, kiaulinių taukų nustatymo riba yra nuo 2,7%, bet taikant šią formulę kitiems riebalams, pvz., kokoso, palmių, palmių riešutų aliejui nustatyti, nustatymo riba yra atitinkamai nuo 26,8%, 12,5% ar 19,3%, t. y. šių aliejų priemaiša gali būti nustatyta pagal kiaulinių taukų formulę tik tada, jeigu jų į pieno riebalus pridedami labai dideli kiekiai. Tai pasakytina ir apie kitas 2 lentelėje pateiktas formules.
\n2 lentelė. Trigliceridų formulės pašalinių riebalų priemaišoms nustatyti pieno riebaluose S vertės ir jų standartiniai nuokrypiai SD Pašalinių sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejaus ir žuvų taukų nustatymo formulės:
\n2,0983 x C30 + 0,7288 x C34 + 0,6927 x C36 + 0,6353 x C38 + 3,7452 xC40 – 1,2929 x C42 + 1,3544 x C44 + 1,7013 x C46 + 2,5283 x C50 = S; SD = 0,38157 Pašalinių kokoso ir palmių riešutų aliejaus nustatymo formulės:
\n3,7453 x C32 + 1,1134 x C36 + 1,3648 x C38 + 2,1544 xC42 + 0,4273 x C44 + 0,5809 x C46 + 1,1226 x C48 + 1,0306 x C50 + 0,9953 x C52 + 1,2396 x C54 = S; SD = 0,11323 Pašalinių palmių aliejaus ir j autinių taukų arba taukų nustatymo formulės:
\n3,6644 x C28 + 5,2297 x C30 – 12,5073 x C32 + 4,4285 x C34 – 0,2010 xC36 + 1,2791 x C38 + 6,7433 x C40 -4,2714 x C42 + 6,3739 x C46 = S; SD = 0,81094 Pašalimų kiaulinių taukų nustatymo formulė:
\n6,5125 x C26 + 1,2052 x C32 + 1,7336 x C34 + 1,7557 x C36 + 2,2325 x C42 + 2,8006 x C46 + 2,5432 x C52 + 0,9892 x C54 = S; SD = 0,39897 Tiriant nežinomų riebalų mėginį (jei mėginyje yra pieno riebalų ir vienas iš (arba visų) 14 pašalinių riebalų mišinys), taikomos visos 2 lentelėje pateiktos formulės ir bendroji formulė (2). Jei nors pagal vieną iš penkių formulių apskaičiuotos S vertės yra už 3 lentelėje pateiktų verčių ribų, tai daroma prielaida, kad mėginyje yra modifikuotų pieno riebalų. Pašalinių riebalų nustatymas piene, remiantis viena iš keturių formulių pagal 2 lentelę, neleidžia daryti išvados, kokių pašalinių riebalų pridėta.
\n3 lentelė. Pieno riebalų S-ribos Formulė pašaliniams riebalams nustatyti:
\nS – ribos Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, linų sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų Kokoso ir palmių riešutų aliejų Palmių aliejaus ir jautiniai taukai Kiaulinių taukų Bendroji formulė 98,05-101, 95 99, 42-100, 58 95, 90-104, 10 97,96-102, 04 95,68-104,32 4 lentelėje nurodytos įvairių pašalinių riebalų nustatymo ribos, kai tikimybė – 99 %. Pirmoje skiltyje pateiktos minimalios nustatymo ribos, taikant 2 lentelės formules, antroje skiltyje – bendrąją formulę. Vien pastarosios formulės pakanka nustatyti nežymius pašalinių riebalų kiekius. Taikant visas formules, nustatomi įvairių pašalinių riebalų deriniai. Pašalinių riebalų trigliceridų sudėties fliuktuacija neturi žymesnės įtakos nustatymo ribai.
\n4 lentelė. Pašalinių riebalų nustatymo ribos (%), esant tikimybei 99 % Pašaliniai riebalai Individuali formulė Bendroji formulė Sojų aliejus 2,1 4,4 Saulėgrąžų aliejus 2,3 4,8 Alyvų aliejus 2,4 4,7 Kokoso aliejus 3,5 4,3 Palmių aliejus 4,4 4,7 Palmių riešutų aliejus 4,6 5,9 Rapsų aliejus 2,0 4,4 Sėmenų aliejus 2,0 4,0 Kviečių gemalų aliejus 2,7 6,4 Kukurūzų gemalų aliejus 2,2 4,5 Medvilnės aliejus 3,3 4,4 Kiauliniai taukai 2,7 4,7 Jautiniai taukai 5,2 5,4 Hidrogenizuoti žuvų taukai 5,4 6,1 PASTABA. Tokiu būdu S ribos yra apskaičiuojamos tuomet, kai daroma prielaida, kad yra pašalinių riebalų priemaiša arba nustatymo pagal individualias formules ribų viršijimas (žr. 4 lentelę).
\nŠioje formulėje X reiškia nežinomų pašalimų riebalų arba pašalimų riebalų mišinio kiekį nežinomuose pieno riebaluose. S apskaičiuojamas į bendrąją formulę įrašius pašalinių riebalų ar pašalinių riebalų ir pieno riebalų mišinio trigliceridų analizės rezultatus. Jei pašaliniai riebalai nežinomi, tai nustatomos grynųjų pašalinių riebalų S vertės, į bendrąją formulę įrašius grynųjų pašalinių riebalų trigliceridų analizės rezultatus, ir apskaičiuojamas S vidurkis (SF = 7,46). Geri kiekybiniai pašalinių riebalų nustatymo rezultatai gaunami pagal palmių aliejaus ir jautinių taukų formulę (2 lentelė) ir SF = 10,57.
\nJei pašaliniai riebalai žinomi, tai į formulę (3) įrašomos SF vertės, paimtos iš 5 lentelės, ir parenkama atitinkama pašalinių riebalų formulė apskaičiuoti S iš 2 lentelės.
\n5 lentelė. Įvairių pašalinių riebalų SF vertės Pašaliniai riebalai SF Kokoso aliejus 118,13 Palmių aliejus 7,55 Palmių riešutų aliejus 112,32 Rapsų aliejus 3,30 Sėmenų aliejus 4,44 Kviečių gemalų aliejus 27,45 Kukurūzų gemalų aliejus 9,29 Medvilnės aliejus 41,18 Kiauliniai taukai 177,55 Jautiniai taukai 17,56 Žuvų taukai 64,12 10. Metodo taikymo sritis:
\nAprašytasis metodas taikomas pieno partijai ir gavus reprezentatyvųjį mėginį.
\nGalimas specialus reprezentatyviojo mėginio tyrimas, jei mėginys sudarytas skirtingose šalyse pagal aukščiau nurodytas formules.
\nGalimybės nustatymui galėtų būti labai geros, jeigu skirtingų šalių formulėse, kurios aprašytos šiame dokumente, būtų nustatytas reprezentatyvus pieno riebalų mėginių kiekis.
\nJei yra taikomi 2 lentelėje pateikti trigliceridų deriniai, nereikia sudėtingų kompiuterinių programų, o pataisos koeficientai yra nustatomi iš naujo, taikant mažiausių kvadratų metodą.
\nTaikant 3 lentelėje pateiktas S ribas, formules galima taikyti bendrai, esant ypatingoms šėrimo sąlygoms, pvz., jei šeriama nepakankamai arba pašarinėmis mielėmis, kalcio muilu. Tik esant ekstremalioms šėrimo sąlygoms (pvz., sušertas didelis kiekis aliejingų pašarų, kalcio muilų kartu su pašarų riebalais ir t. t), pritaikius formules randama pieno riebalų modifikaciją.
\nPASTABA. Viršijus ribinius dydžius ir darant prielaidą, kad gali būti modifikacija, frakcionuoti pieno riebalai iš esmės atpažįstami kaip nemodifikuoti riebalai. Pieno riebalų frakcijos su neįprasta pieno riebalų sudėtimi (pvz., kietoji frakcija, gaunama fizikiniais metodais esant apie 30°C temperatūrai ir mažai išeigai arba naudojant ypatingas sąlygas C02 atmosferoje) identifikuojamos kaip modifikuoti riebalai.
\nPieno riebalų frakcionavimą galima nustatyti taikant ir kitus metodus, pvz., diferencinę skanavimo kalorimetriją.
\n11.1. Pakartojamumas Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų tuo pat metu arba su nedidelėmis pertraukomis to paties analitiko, toje pačioje laboratorijoje, naudojant tą pačią įrangą ir identiškas medžiagas.
\n6 lentelė. Pakartojamumo (r) ribos, taikant skirtingas trigliceridų formules Formulė pašaliniams riebalams nustatyti r Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų 0,67 Kokosų ir palmių riešutų aliejų 0,12 Palmių aliejaus ir jautinių taukų 1,20 Kiaulinių taukų 0,58 Bendroji 1,49 11.2. Atkuriamumas Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas.
\n7 lentelė. Atkuriamumo ribos (R), taikant skirtingas trigliceridų formules Formulė pašaliniams riebalams nustatyti R Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų 1,08 Kokosų ir palmių riešutų aliejų 0,40 Palmių aliejaus ir jautinių taukų 1,81 Kiaulinių taukų 0,60 Bendroji 2,07 11.3. Leistinas nuokrypis Remiantis pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) vertėmis, galima apskaičiuoti visų 3 lentelėje pateiktų S verčių leistinąjį nuokrypį (du analizės pakartojimai). Atitinkamos vertės pateiktos 8 lentelėje.
\n8 lentelė. Visų trigliceridų formulių leistini nuokrypiai Formulė pašaliniams riebalams nustatyti Ribos Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų 97,43-102,57 Kokosų ir palmių riešutų aliejų 99,14-100,86 Palmių aliejaus ir jautinių taukų 94,91-105,09 Kiaulinių taukų 97,65-102,35 Bendroji 94,58-105,42 11.4. Rezultatų priimtinumas Visi apskaičiuoti ir suapvalinti šimtųjų tikslumu C24, C26, C28 iki C54 trigliceridų kiekiai turi būti pakoreguoti taip, kad jų suma atitiktų 100.
\nDviejų analizės pakartojimų rezultatai taikomi pakaitojamumui patikrinti. Pakartojamumas laikomas priimtinu, jei absoliutusis S verčių, apskaičiuotų pagal visas 5 trigliceridų formules, skirtumas tarp dviejų analizių neviršija pakartojamumo (r) ribų pagal 6 lentelę.
\nKad būtų užtikrintos optimalios dujų chromatografijos sąlygos, ypač kolonėlės kokybė, 10 kartų pakartotų analizių metu apskaičiuotos pagal penkias trigliceridų formules maksimalios ir minimalios S vertės turi neviršyti X x r ribos, čia X = 1,58 (žr.: 10 analizės pakartojimų – [16], r – 6 lentelėje).
\nLST ISO 1211:2000 Pienas. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nLST EN ISO 2450:2000 Grietinė. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nLST EN ISO 7328:2000 Pieniniai valgomieji ledai ir ledų mišiniai. Riebalų kiekio nustatymas.
\nGravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nLST EN ISO 7208:2000 Liesas pienas, išrūgos ir pasukos. Riebalų kiekio nustatymas.
\nGravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\n6 lentelė. Pakartojamumo (r) ribos, taikant skirtingas trigliceridų formules Formulė pašaliniams riebalams nustatyti r Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų 0,67 Kokosų ir palmių riešutų aliejų 0,12 Palmių aliejaus ir jautinių taukų 1,20 Kiaulinių taukų 0,58 Bendroji 1,49 11.2. Atkuriamumas Skirtumas dviejų atskirų ir nepriklausomų S verčių, gautų skirtingose laboratorijose dviejų analitikų, naudojant skirtingą įrangą ir identiškas medžiagas.
\n7 lentelė. Atkuriamumo ribos (R), taikant skirtingas trigliceridų formules Formulė pašaliniams riebalams nustatyti R Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų 1,08 Kokosų ir palmių riešutų aliejų 0,40 Palmių aliejaus ir jautinių taukų 1,81 Kiaulinių taukų 0,60 Bendroji 2,07 11.3. Leistinas nuokrypis Remiantis pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) vertėmis, galima apskaičiuoti visų 3 lentelėje pateiktų S verčių leistinąjį nuokrypį (du analizės pakartojimai). Atitinkamos vertės pateiktos 8 lentelėje.
\n8 lentelė. Visų trigliceridų formulių leistini nuokrypiai Formulė pašaliniams riebalams nustatyti Ribos Sojų, saulėgrąžų, alyvų, rapsų, sėmenų, kviečių gemalų, kukurūzų gemalų, medvilnės aliejų, žuvų taukų 97,43-102,57 Kokosų ir palmių riešutų aliejų 99,14-100,86 Palmių aliejaus ir jautinių taukų 94,91-105,09 Kiaulinių taukų 97,65-102,35 Bendroji 94,58-105,42 11.4. Rezultatų priimtinumas Visi apskaičiuoti ir suapvalinti šimtųjų tikslumu C24, C26, C28 iki C54 trigliceridų kiekiai turi būti pakoreguoti taip, kad jų suma atitiktų 100.
\nDviejų analizės pakartojimų rezultatai taikomi pakaitojamumui patikrinti. Pakartojamumas laikomas priimtinu, jei absoliutusis S verčių, apskaičiuotų pagal visas 5 trigliceridų formules, skirtumas tarp dviejų analizių neviršija pakartojamumo (r) ribų pagal 6 lentelę.
\nKad būtų užtikrintos optimalios dujų chromatografijos sąlygos, ypač kolonėlės kokybė, 10 kartų pakartotų analizių metu apskaičiuotos pagal penkias trigliceridų formules maksimalios ir minimalios S vertės turi neviršyti X x r ribos, čia X = 1,58 (žr.: 10 analizės pakartojimų – [16], r – 6 lentelėje).
\nLST ISO 1211:2000 Pienas. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nLST EN ISO 2450:2000 Grietinė. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nLST EN ISO 7328:2000 Pieniniai valgomieji ledai ir ledų mišiniai. Riebalų kiekio nustatymas.
\nGravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nLST EN ISO 7208:2000 Liesas pienas, išrūgos ir pasukos. Riebalų kiekio nustatymas.
\nGravimetrinis metodas (pamatinis metodas).
\nToliau nurodytų medžiagų pėdsakai skaičiuojami 100 kg tiesiogiai vartoti skirto koncentruoto sviesto.
\nI formulė:
\nII formulė:
\nRSDR(%) = 21-05,° kur:
\nRSDR – santykinis standartinis atkuriamumo nuokrypis; c – koncentracija, išreikšta dešimtaine trupmena (pvz., 10 g/100 g = 0,1). R = 0,0283 jc-RSDr; kur x – aritmetinis gautų rezultatų vidurkis. Keletas apskaičiuotų RSDR verčių pavyzdžių:
\nKoncentracija RSDr, % 1 g/100 g 4 0,01 g/100 g 8 1 mg/l 000 g 16 Kai analitės koncentracija yra 1 g/100 g, gaunama:
\nR = 0,0283*1*4 = 0,11 g/100 g.
\nNaudota literatūra:
\nPeeler J. T., Honvitz W., Albert R. Journal of the Association of Official Analytical Chemists. 1989. Vol. 72, No.5. P. 784-806. *) „PASTABA. Pavyzdžiui, jeigu yra gauti y11, y12, y21 ir y22 rezultatai, turi būti apskaičiuojamiy11/y12 ir y12/y22 aritmetiniai vidurkiai.
\n1 „M. Thompson and R. Wood. Pure and Applied Chemistry, 67 (4), P. 649-666 (1995) 1 KPN 2309 kodu klasifikuojamuose produktuose, kurių sudėtyje yra KPN kodus 0401, 0402, 0403, 0404 atitinkančių pieno produktų.
\n1 IDF 135B/1991. Pienas ir pieno produktai. Analizės metodų tikslumo charakteristikos. Bendrų tyrimų metodikos apžvalga. (International Dairy Federation Standard 135B/1991. Milk and milk products. Precision characteristics of analytical methods. Outline ofcollaborative study procedure).
\n1 PASTABA. Analizuojant pieno miltelius, gali būti gauti klaidingi teigiami rezultatai. Todėl labai svarbu tikrinti, kad, taikant naudoj amą bandymo sistemą, nebūtą gauti klaidingi teigiami rezultatai.
\n1 Tinkamą metodą aprašė D. Precht and J. Molkentin: Quantative triglyceride analysis using short capillary columns, ChrompackNews 4, 16-17 (1993).
\n2 Tinkamas produktas yra prekyboje.
\n3Tinkamas naudoti produktas, kurio prekinis pavadinimas Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack, yra specializuotoje prekyboje. Ši informacija palengvina standarto naudojimą tačiau neprivaloma. Nurodyta dalelių dydžio dimensija gali būti paversta į SI sistemos vienetus pagal BS 410:1988 „British Standard Speciflcation for tęst sieves“.