LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL TECHNINIO REGLAMENTO, NUSTATANČIO ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ANALIZĖS METODUS, PATVIRTINIMO 2003 m. liepos 22 d. Nr. 3D-295 Vilnius Siekdamas įgyvendinti Europos Sąjungos teisės aktus, reglamentuojančius aliejaus ir riebalų bendrąjį rinkos organizavimą ir užtikrinti alyvuogių aliejaus kokybės įvertinimą: 1. Tvirtinu Techninį reglamentą, nustatantį alyvuogių aliejaus analizės metodus (pridedama). 2. L a i k a u netekusiu galios Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2002 m. sausio 9 d. įsakymą Nr. 10 „Dėl Vaškų kiekio augaliniame aliejuje nustatymo techninio reglamento patvirtinimo“ (Žin., 2002, Nr. 5-203). Aplinkos ministras, pavaduojantis žemės ūkio ministrą                                     Arūnas Kundrotas SUDERINTA Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2003 05 20 raštu Nr. B6-(1.8)-901 Respublikinio mitybos centro 2003 05 02 raštu Nr. 02-255 ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2003 m. liepos 22 d. įsakymu Nr. 3D-295 TECHNINIS REGLAMENTAS, NUSTATANTIS ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ANALIZĖS METODUS Šis reglamentas parengtas remiantis 1991 m. liepos 11 d. Europos Komisijos reglamentu Nr. 2568/91/EEB dėl alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejaus charakteristikų ir atitinkamų analizės metodų (su paskutiniais pakeitimais, padarytais 2002 m. gegužės 6 d. Tarybos reglamentu Nr. 796/2002/EB, papildančiu Komisijos reglamentą Nr. 2568/91/EEB dėl alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejaus charakteristikų ir atitinkamų analizės metodų. I. Bendrosios nuostatos 1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamo alyvuogių aliejaus cheminės analizės metodus. 2. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi alyvuogių aliejui, gabenamam tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse. 3. Analizuojamo aliejaus mėginiai imami pagal LST EN ISO 5555 ir paruošiami pagal LST EN ISO 661. Paimti mėginiai laikomi tamsioje, vėsioje vietoje ir išsiunčiami į laboratoriją analizei kaip įmanoma greičiau, bet ne vėliau kaip dešimtąją darbo dieną mėginius paėmus spalio–gegužės mėn. ir ne vėliau kaip penktąją darbo dieną mėginius paėmus birželio–rugsėjo mėnesį. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 1 priedas LAISVŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KIEKIO NUSTATYMAS 1. RŪGŠTINGUMO NUSTATYMAS Metodas taikomas laisvųjų riebalų rūgščių kiekiui alyvuogių aliejuje nustatyti. Laisvųjų riebalų rūgščių keikis išreiškiamas įprastiniais metodais apskaičiuotu rūgštingumu. 1.1. METODO ESMĖ Mėginys ištirpinamas tirpiklių mišinyje. Laisvosios riebalų rūgštys titruojamos kalio šarmo tirpalu etanolyje. 1.2. REAGENTAI Visi naudojami reagentai turi būti analitiškai gryni, o vanduo distiliuotas ar lygiaverčio grynumo. 1.2.1. Dietileterio ir 95% (tūrio) etanolio lygių tūrių mišinys. PASTABA. Dietileteris yra labai degus ir gali sudaryti sprogstamus peroksidus. Dirbant su juo būtina imtis specialių saugos priemonių. Prieš vartojimą tiksliai neutralizuojamas kalio šarmo tirpalu (1.2.2). 100 ml mišinio imama 0,3 ml fenolftaleino tirpalo (1.2.3). PASTABA. Jeigu negalima vartoti dietileterio, gali būti vartojamas etanolio ir tolueno mišinys. Jeigu būtina, etanolį galima pakeisti izopropilo alkoholiu. 1.2.2. Titruotasis kalio šarmo tirpalas etanolyje c(KOH) apytikriai 0,1 mol/l ar, jei būtina, c(KOH) apytikriai 0,5 mol/l. Turi būti žinoma tiksli kalio šarmo tirpalo koncentracija. Ji tikrinama prieš pat vartojimą. Vartojamas ne anksčiau kaip prieš 5 dienas paruoštas ir dekantuotas į tamsius stiklinius butelius guminiais kamščiais tirpalas. Tirpalas turi būti bespalvis ar gelsvos spalvos. PASTABA. Bespalvis stabilus kalio šarmo tirpalas ruošiamas taip: į 1000 ml etanolio įdedama 8 g kalio šarmo ir 0,5 g aliuminio drožlių ir 1 h virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Nedelsiant distiliuojama. Distiliate ištirpinamas reikiamas kalio šarmo kiekis. Paliekama stovėti kelias dienas ir nuo kalio karbonato nuosėdų nupilamas viršutinis skaidrus tirpalo sluoksnis. Tirpalas gali būti ruošiamas nedistiliuojant taip: į 1000 ml etanolio pripilama 4 ml aliuminio antrinio tributoksido (aliuminio butilato) (aluminium butylate). Mišinys palaikomas kelias dienas. Nupilamas viršutinis tirpalo sluoksnis ir jame ištirpinamas reikiamas kalio šarmo kiekis. Toks tirpalas tinka vartoti. 1.2.3. 10 g/l fenolftaleino tirpalas 95-96 % (tūrio) etanolyje ar 20 g/l šarminio mėlynojo (tiriant tamsius riebalus) tirpalas 95-96 % (tūrio) etanolyje. 1.3. ĮRANGA Įprasta laboratorinė įranga ir ypač toliau išvardyta: 1.3.1. analizinės svarstyklės; 1.3.2. 250 ml kūginė (Erlenmejerio) kolba; 1.3.3. 10 ml biuretė, sugraduota 0,05 ml padalomis. 1.4. Tyrimas 1.4.1. Mėginio ruošimas analizei (Analizuojamas filtruotas mėginys. Jei drėgmės ir priemaišų kiekis yra mažesnis kaip 1 %, mėginys analizuojamas be tolesnio apdorojimo; jei šis kiekis yra didesnis kaip 1 %, mėginį reikia filtruoti.) 1.4.2. Tiriamojo mėginio ėmimas Tiriamasis mėginys, atsižvelgiant į numatomą rūgščių skaičiaus vertę, imamas pagal lentelėje pateiktas nuorodas: Numatoma rūgščių skaičiaus vertė Tiriamojo mėginio masė, g Svėrimo tikslumas, g <1 20 0,05 1-4 10 0,02 4-15 2,5 0,01 15-75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Mėginys atsveriamas į kūginę (Erlenmejerio) kolbą (1.3.2). 1.4.3. Analizė Tiriamasis mėginys (1.4.2) ištirpinamas nuo 50 ml iki 150 ml neutralizuoto dietileterio ir etanolio mišinio (1.2.1). Nuolat maišant tirpalas titruojamas 0,1 mol/l kalio šarmo tirpalu (1.2.2) (žr. 2 pastabą), kol pasikeis indikatoriaus spalva (rožinė fenolftaleino spalva nepranyks bent 10 sekundžių). 1 PASTABA. Titruotasis kalio šarmo tirpalas etanolyje (1.2.2) gali būti pakeistas vandeniniu kalio ar natrio tirpalu tik tuo atveju, kai titruojant pripilamo vandens kiekis nesukelia fazių atsiskyrimo. 2 PASTABA. Jeigu reikia daugiau kaip 10 ml 0,1 mol/l kalio šarmo tirpalo, vartojamas 0,5 mol/l tirpalas. 3 PASTABA. Jeigu titruojant tirpalas susidrumsčia, į jį įpilamas reikiamas skaidriam tirpalui gauti tirpiklių (1.2.1) kiekis. 1.5. Rūgštingumas išreiškiamas oleino rūgtimi, masės procentais. Rūgštingumas masės procentais skaičiuojamas pagal formulę: V ´c´´ = čia: V – titravimui suvartoto kalio šarmo tirpalo tūris mililitrais; c – tiksli titruotojo kalio šarmo tirpalo koncentracija moliais litre; M – rūgšties, pagal kurią skaičiuojamas rezultatas, molio masė (282); m – mėginio masė gramais. Galutinis rezultatas yra dviejų tyrimų rezultatų aritmetinis vidurkis. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 2 priedas PEROKSIDŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS 1. APIMTIS Šiame standarte pateiktas aliejaus ir riebalų peroksidų skaičiaus nustatymo metodas. 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas taikomas gyvūniniams ir augaliniams riebalams ir aliejui. 3. APIBRĖŽIMAS Peroksidų skaičius – mėginyje esančių medžiagų, oksiduojančių kalio jodidą nurodytomis sąlygomis, kiekis, išreikštas aktyviojo deguonies miliekvivalentais kilograme. 4. METODO ESMĖ Acto rūgšties ir chloroformo mišinyje ištirpintas tiriamasis mėginys veikiamas kalio jodido tirpalu. Išsiskyręs jodas titruojamas etaloniniu natrio tiosulfato tirpalu. 5. ĮRANGA Visa naudojama įranga negali būti užteršta redukuojančiomis ar oksiduojančiomis medžiagomis. PASTABA. Šlifų negalima tepti. 5.1. 3 ml stiklinis samtelis. 5.2. Apie 250 ml kolbos šlifo kaklais ir kamščiais. Kolbos turi būti sausos ir užpildytos grynomis, sausomis inertinėmis dujomis (azotu ar, geriau, anglies dioksidu). 5.3. 25 arba 50 ml biuretė, sugraduota 0,1 ml padalomis. 6. REAGENTAI 6.1. Analiziškai grynas chloroformas, išvalytas nuo deguonies, pučiant per jį švarių ir sausų inertinių dujų srovę. 6.2. Analiziškai gryna ledinė acto rūgštis, išvalyta nuo deguonies, pučiant per ją švarių ir sausų inertinių dujų srovę. 6.3. Prieš pat vartojimą paruoštas sotusis vandeninis kalio jodido tirpalas. Tirpale negali būti jodo ir jodatų. 6.4. Prieš pat vartojimą titruotasis 0,01 ar 0,002 N standartinis natrio tiosulfato tirpalas. 6.5. 10 g/l krakmolo tirpalas. Prieš pat vartojimą paruošta natūralaus tirpaus krakmolo dispersija vandenyje. 7. MĖGINYS Mėginiai turi būti imami ir laikomi apsaugotoje nuo šviesos, vėsioje vietoje, visiškai užpildytose stiklo talpyklose, hermetiškai užkimštose šlifo ar kamščiamedžio kamščiais. 8. TYRIMAS Tiriama dirbtinėje ar netiesioginėje dienos šviesoje. Į stiklinį samtelį (5.1) arba, jo neturint, kolbą (5.2) 0,001 g tikslumu, atsižvelgiant į numatomą peroksidų skaičių, pasveriama lentelėje nurodyta mėginio masė. Numatomas peroksidų skaičius, mekv/kg Tiriamojo mėginio masė, g 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3 Kolba (5.2) atkemšama ir į ją įdedamas stiklinis samtelis su tiriamuoju mėginiu. Įpilama 10 ml chloroformo (6.1). Tiriamasis mėginys greitai ištirpinamas maišant. Pripilama 15 ml ledinės acto rūgšties (6.2) ir vėliau 1 ml kalio jodido tirpalo (6.3). Kolba greitai užkemšama, purtoma vieną minutę ir lygiai penkias minutes paliekama stovėti neapšviestoje vietoje nuo 15oC iki 25oC temperatūroje. Pripilama apie 75 ml distiliuoto vandens. Išsiskyręs jodas energingai maišant titruojamas natrio tiosulfato tirpalu (6.4) (0,002 mol/l tirpalas vartojamas, jei numatoma, kad peroksidų skaičius yra mažesnis kaip 12, ir 0,01 mol/l, jei numatomos vertės yra didesnės kaip 12). Indikatoriumi naudojamas krakmolo tirpalas (6.5). Tas pats tiriamasis mėginys analizuojamas du kartus. Tuo pačiu metu atliekamas tuščiasis tyrimas. Jei tuščiajam tyrimui suvartojama daugiau kaip 0,05 ml, 0,01 mol/l natrio tiosulfato tirpalo (6.4), pakeičiami užteršti reagentai. 9. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Peroksidų skaičius (PS), išreikštas miliekvivalentais aktyviojo deguonies kilograme, apskaičiuojamas pagal formulę: PS = čia: V – tyrimui suvartoto titruotojo standartinio natrio tiosulfato tirpalo (6.4) tūris, pataisytas pagal tuščiojo tyrimo rezultatą mililitrais; T – tiksli natrio tiosulfato tirpalo (6.4) koncentracija moliais litre; m – tiriamojo mėginio masė gramais. Galutinis rezultatas yra dviejų tyrimų rezultatų aritmetinis vidurkis. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 3 priedas Vaškų kiekio nustatymas dujų-skysčių chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu 1. TAIKYMO SRITIS Metodas taikomas vaškų kiekiui kai kuriuose riebaluose ir aliejuje nustatyti laboratoriniais tyrimais. Jis gali būti taikomas spaudimo būdu gautą alyvuogių aliejų atskirti nuo ekstrahavimo būdu gauto alyvuogių aliejaus (alyvuogių išspaudų aliejaus). 2. METODO ESMĖ Į riebalus ar aliejų pridedama vidinio standarto ir frakcionuojama chromatografinėje kolonėlėje, užpildytoje hidratuotu silikageliu. Regeneruojama frakcija, kuri tyrimo sąlygomis išplaunama pirmoji (jos poliškumas yra mažesnis negu trigliceridų) ir tiesiogiai analizuojama dujų-skysčių chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu. 3. ĮRANGA 3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba. 3.2. Stiklinė chromatografinė kolonėlė. Vidinis skersmuo 15 mm, ilgis nuo 30 cm iki 40 cm. 3.3. Tinkamas dujų chromatografas su kapiliarine kolonėle ir tiesioginio įšvirkštimo sistema. Chromatografą sudaro: 3.3.1. Kolonėlių termostatas, galintis išlaikyti temperatūrą 1 o C tikslumu. 3.3.2. Šaltas inžektorius mėginiui tiesiogiai įpurkšti į kolonėlę. 3.3.3. Jonizacinis liepsnos detektorius ir konverteris-stiprintuvas. 3.3.4. Registruojantis integratorius, galintis dirbti su konverteriu-stiprintuvu (3.3.3). Reagavimo greitis mažesnis kaip 1 sekundė, popieriaus judėjimo greitis reguliuojamas. 3.3.5. Nuo 10 m iki 15 m ilgio ir nuo 0,25 mm iki 0,32 mm vidinio skersmens stiklinė ar lydyto kvarco kapiliarinė kolonėlė. Vidinis paviršius padengtas tolygia nuo 0,10 mm iki 0,30 mm storio skystos fazės SE-52 ar SE-54 ar jas atitinkančios medžiagos danga. 3.4. 10 ml mikrošvirkštas su kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įšvirkšti į kolonėlę. 4. REAGENTAI 4.1. Silikagelis, 70/230 meš, artikulas 7754 Merc. Silikagelis 4 h laikomas termostate 500 oC. Leidžiama atvėsti ir pripilama 2 % vandens. Suspensija homogenizuojama gerai sumaišant. Prieš vartojimą ne mažiau kaip 12 h laikoma tamsoje. 4.2. Tinkamas chromatografijai n-heksanas. 4.3. Tinkamas chromatografijai dietileteris. 4.4. Tinkamas chromatografijai n-heptanas. 4.5. Etaloninis 0,1% (m/v) laurileikozanato tirpalas heksane (vidinis etalonas). 4.6. Nešančiosios dujos: grynas vandenilis, tinkamas dujų-skysčių chromatografijai. 4.7. Pagalbinės dujos: - grynas vandenilis, tinkamas dujų-skysčių chromatografijai; - grynas oras, tinkamas dujų-skysčių chromatografijai. 5. TYRIMAS 5.1. Vaškų frakcijos atskyrimas. 5.1.1. Chromatografinės kolonėlės ruošimas. 15 g hidratuoto 2 % vandens silikagelio suspenduojama bevandeniame n-heksane ir supilama į kolonėlę. Leidžiama savaime nusėsti. Kad chromatografinis sluoksnis būtų homogeniškesnis, nusodinimas baigiamas naudojant elektrinę purtyklę. Bet kokios priemaišos pašalinamos per kolonėlę praleidžiant 30 ml n-heksano. 5.1.2. Kolonėlinė chromatografija. Į 25 ml kolbą tiksliai pasveriama 500 mg mėginio ir pridedamas reikiamas vidinio standarto kiekis, atsižvelgiant į numatomą vaškų kiekį, t. y. įdedama 0,1 ml laurileikozanato analizuojant alyvuogių aliejų ir nuo 0,25 mg iki 0,5 mg analizuojant alyvuogių išspaudų aliejų. Paruoštas mėginys dviem 2 ml n-heksano porcijomis supilamas į chromatografinę kolonėlę, paruoštą pagal 5.1.1. Tirpikliui leidžiama ištekėti iki 1 mm lygio virš viršutiniojo absorbento lygio. Tada pradedamas išplovimas. Surenkama 140 ml n-heksano ir dietileterio mišinio santykiu 99:1, esant 15 lašų per sekundę srauto greičiui (2,1 ml per minutę). Gauta frakcija džiovinama sukamajame garintuve, kol išgarinamas beveik visas tirpiklis. Paskutinieji 2 ml ar 3 ml tirpiklio pašalinami silpna azoto srove ir pripilama 10 ml n-heptano. 5.2. Dujų-skysčių chromatografinė analizė. 5.2.1. Paruošiamieji darbai, kolonėlės kondicionavimas. 5.2.1.1. Kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo, kolonėlės pradžią sujungiant su tiesioginio įšvirkštimo įrenginiu, o galą – su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografas (įšvirkštimo įrenginio, detektoriaus ir savirašio veikimas). 5.2.1.2. Jeigu kolonėlė naudojama pirmą kartą, patartina ją kondicionuoti. Per kolonėlę praleidžiama nestipri dujų srovė, tada įjungiamas dujų chromatografas. Laipsniškai keliama temperatūra, kol nepasieks 20 oC aukštesnės nei darbo temperatūros (pastaba). Ši temperatūra palaikoma ne mažiau kaip 2 h, po to nustatomos įrenginio darbo sąlygos (sureguliuojamas dujų greitis, uždegama liepsna, prijungiamas registruojantis įtaisas, nustatoma termostato temperatūra, sureguliuojamas detektorius ir t. t.). Signalas užrašomas bent du kartus didesniu nei reikalingas analizei jautrumu. Pagrindinė linija turi būti tiesi, joje neturi būti jokių smailių ir nukrypimų. Neigiama tiesinė nuokrypa rodo, kad nesandarūs kolonėlės sujungimai, teigiama nuokrypa rodo, kad kolonėlė nepakankamai kondicionuota. PASTABA. Visą laiką kondicionuojama bent 20oC žemesnėje nei didžiausia naudojamam eliuentui nurodyta temperatūra. 5.2.2. Darbo sąlygų parinkimas. 5.2.2.1. Paprastai darbo sąlygos yra tokios: kolonėlės temperatūra: pradinė 80oC, keliama 30oC per minutę greičiu iki 120oC, vėliau programuotas didinimas 5oC per minutę greičiu iki 340oC; - detektoriaus temperatūra: 350oC; - nešančiųjų dujų – vandenilio linijinis greitis: nuo 20 cm/s iki 35 cm/s; - prietaiso jautrumas: nuo 4 iki 16 kartų didesnis nei mažiausias silpninimas; - registruojančio įtaiso jautrumas: nuo 1 mV iki 2 mV per visą skalę; - popieriaus greitis: 30 cm/h; - įšvirkščiamos medžiagos kiekis: nuo 0,5 ml iki 1ml tirpalo. Šios sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės ir dujų chromatografo charakteristikas (kad gautos chromatogramos atitiktų šias sąlygas: C32 vidinio etalono sulaikymo trukmė turi būti 25±2 minutės ir didžiausia vaškų smailė turi užimti nuo 60 % iki 100 % visos skalės aukščio). 5.2.2.2. Smailių integravimo parametrai nustatomi taip, kad būtų gautas teisingas smailių ploto įvertinimas. 5.2.3. Analizė. 5.2.3.1. 10 ml mikrošvirkštu įsiurbiama 1 ml tirpalo. Stūmoklis ištraukiamas, kol adata ištuštėja. Adata įkišama į įšvirkštimo įrenginį ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Maždaug po penkių sekundžių adata atsargiai ištraukiama. 5.2.3.2. Registruojama, kol vaškai visiškai išplaunami. Pagrindinė linija turi visuomet atitikti reikalaujamas sąlygas (5.2.1.2). 5.2.4. Smailių identifikavimas. Smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmę, lyginant jas su žinomas sulaikymo trukmes turinčių vaškų mišiniais, analizuotais tomis pačiomis sąlygomis. 1 paveiksle pateikta pirmo spaudimo alyvų aliejaus chromatograma. 5.2.5. Kiekybinė analizė. 5.2.5.1. Suintegruojamas vidinio etalono ir C40 – C46 alifatinių esterių smailių plotas. 5.2.5.2. Kiekvieno vašką sudarančio esterio kiekis mg/kg riebalų apskaičiuojamas pagal formulę: esteris (mg/kg) = čia: Ax – kiekvieno esterio smailės plotas; As – laurileikozanatą atitinkančios smailės plotas; ms – pridėto laurileikozanato masė miligramais; m – paimto tyrimui mėginio masė gramais. 6. REZULTATŲ IŠRAIŠKA Pateikiamas atskirų vaškų kiekis ir šių kiekių suma mg/kg riebalų. ______________ Priedas Dujų linijinio greičio nustatymas Į normalioms darbo sąlygoms nustatytą chromatografą įšvirkščiama nuo 1 ml iki 3 ml metano (propano). Išmatuojamas dujų tekėjimo per kolonėlę laikas, nuo įšvirkštimo momento iki smailės išplovimo momento (tM). Linijinis greitis cm/s apskaičiuojamas pagal formulę: L/tM čia: L – kolonėlės ilgis centimetrais; tM – išmatuotas laikas sekundėmis. I. S – vidinis etalonas C32 esteris, 1 – C36 esteriai, 2 – C38 esteriai, 3 – C40 esteriai, 4 – C42 esteriai, 5 – C44 esteriai, 6 – C46 esteriai ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 4 priedas STEROLIŲ SUDĖTIES IR KIEKIO NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS KAPILIARINĖJE KOLONĖLĖJE METODU 1. TIKSLAS Metodas taikomas atskirų sterolių kiekiui ir bendrajam sterolių kiekiui riebalinėse medžiagose nustatyti. 2. METODO ESMĖ Į riebalinę medžiagą pridedama a-cholestanolio vidinio etalono. Sumuilinama kalio šarmo tirpalu etanolyje, nesumuilinamosios medžiagos ekstrahuojamos dietileteriu. Sterolių frakcija iš nesumuilinamųjų medžiagų ekstrakto išskiriama chromatografiškai ant šarmu impregnuotų silikagelio plokštelių. Iš silikagelio regeneruoti steroliai paverčiami trimetilsilileteriais ir analizuojami dujų chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu. 3. ĮRANGA 3.1. 250 ml kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi, su šlifo jungtimis. 3.2. 500 ml dalijamieji piltuvai. 3.3. 250 ml kolbos. 3.4. Įrangos plonasluoksnei chromatografinei (PSC) analizei komplektas, pritaikytas stiklinėms plokštelėms, kurių matmenys 20 x 20 cm. 3.5. UV šviesos 366 arba 254 nm bangų ilgio lempa. 3.6. Mikrošvirkštai, kuriais galima paimti 100 ir 500 ml. 3.7. Apytikriai 2 cm skersmens ir 5 cm aukščio tinkamas filtruoti vakuume G3 akytumo stiklinis filtravimo piltuvas (15-40 mm akytumas) su 12/21 šlifo mova. 3.8. 50 ml vakuuminė kolba su 12/21 šlifo įmova filtrui (3.7) prijungti. 3.9. 10 ml mėgintuvėlis su kūginiu dugnu ir kamščiu. 3.10. Tinkamas naudoti kapiliarinę kolonėlę ir turintis srauto daliklį dujų chromatografas, kurį sudaro: 3.10. 1. termostatas kolonėlėms, galinti palaikyti norimą temperatūrą ± 1 oC tikslumu; 3.10.2. termostatinis garintuvas (įpurškimo anga) su polisiloksanu dengtu stebėjimo langeliu; 3.10.3. liepsnos jonizacijos detektorius ir konverteris stiprintuvas; 3.10.4. darbui kartu su konverteriu-stiprintuvu (3.10.3) skirtas kintamo popieriaus judėjimo greičio savirašis-integratorius, kurio reagavimo greitis mažesnis kaip viena sekundė. 3.11. Stiklinė arba lydyto kvarco nuo 20 m iki 30 m ilgio kapiliarinė kolonėlė, kurios vidinis skersmuo nuo 0,25 mm iki 0,32 mm, padengta 0,10 – 0,30 mm storio SE-52 arba SE-54 arba ją atitinkančios skystos fazės plėvele. 3.12. 10 ml talpos mikrošvirkštas dujų chromatografijai su kietinta adata. 4. REAGENTAI 4.1. Apytikriai 2 N kalio šarmo tirpalas etanolyje: 130 g kalio šarmo (mažiausia koncentracija 85%) šaldant ištirpinama 200 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu iki 1 litro. Tirpalas turi būti laikomas gerai užkimštame tamsaus stiklo butelyje. 4.2. Analiziškai grynas dietileteris. 4.3. Analiziškai grynas bevandenis natrio sulfatas. 4.4. 0,25 mm storio silikagelio sluoksniu dengtos stiklinės PSC plokštelės, neužterštos fluorescencijos indikatoriumi (gali būti naudojamos pramoninės plokštelės). 4.5. Apytikriai 0,2 N kalio šarmo tirpalas etanolyje: 13 g kalio šarmo ištirpinama 20 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu iki 1 litro. 4.6. Tinkamas chromatografijai benzenas, žr. 5.2.2. 4.7. Tinkamas chromatografijai acetonas, žr. 5.2.2. 4.8. Tinkamas chromatografijai heksanas, žr. 5.2.2. 4.9. Tinkamas chromatografijai dietileteris, žr. 5.2.2. 4.10. Tinkamas chromatografijai chloroformas, žr. 5.2.2. 4.11. Standartinis tirpalas plonasluoksnei chromatografijai: 2 % cholesterolio ar fitosterolių tirpalas chloroforme. 4.12. 0,2 % 2¢,7¢-dichlorfluoresceino tirpalas etanolyje. Jis truputį pašarminamas, įlašinant kelis lašus 2 N kalio šarmo tirpalo. 4.13. Tinkamas chromatografijai bevandenis piridinas. 4.14. Heksametildisilazanas. 4.15. Trimetilchlorsilanas. 4.16. Etaloniniai sterolių trimetilsilileterių tirpalai. Ruošiami prieš pat juos naudojant iš grynų sterolių arba jų mišinių, gautų iš juos turinčių aliejų. 4.17. 0,2 % (m/v) a-cholestanolio tirpalas chloroforme (vidinis standartas). 4.18. Nešančiosios dujos: vandenilis ir helis, kurių grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus. 4.19. Pagalbinės dujos: - vandenilis, kurio grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus; - oras, kurio grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus. 5. TYRIMAS 5.1. Nesumuilinamųjų medžiagų gavimas 5.1.1. Į 250 ml talpos kolbą 500 ml mikrošvirkštu įpilamas toks 0,2 % a-cholestanolio tirpalo tūris, kuriame cholestanolio kiekis būtų lygus maždaug 10 % sterolių kiekio analizei paimtame tiriamajame mėginyje. Pvz., į 5 g mėginį įpilama 500 ml a-cholestanolio tirpalo, kai analizuojamas alyvuogių aliejus, ir 1500 ml, kai analizuojamas alyvuogių išspaudų aliejus. Vidinio standarto tirpalas N2 srovėje išgarinamas iki sauso likučio. Kolboje tiksliai pasveriama apie 5 g sauso, filtruoto mėginio. Gyvūninių ar augalinių riebalų ir aliejaus, kuriame yra nemažas cholesterolio kiekis, chromatogramose gali būti smailių, kurių sulaikymo trukmė tokia pati kaip ir cholestanolio. Tokiu atveju sterolių frakcija turi būti analizuojama du kartus, su vidiniu standartu ir be jo. Vietoj cholestanolio gali būti naudojamas betulinolis. 5.1.2. Į kolbą įpilama 50 ml 2 N kalio šarmo tirpalo alkoholyje, prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Kolba šildoma vandens vonioje, kol turinys nestipriai užvirs. Šildant nuolat maišoma, kol sumuilinama (tirpalas pasidaro skaidrus). Šildymas tęsiamas dar 20 minučių. Vėliau per šaldytuvą įpilama 50 ml distiliuoto vandens, šaldytuvas atjungiamas ir kolba atvėsinama iki apytikriai 30 oC. 5.1.3. Visas kolbos turinys supilamas į 500 ml talpos dalijamąjį piltuvą, nuplovimui per kelis kartus sunaudojant apie 50 ml distiliuoto vandens. Įpilama apie 80 ml dietileterio, turinys stipriai plakamas 30 sekundžių ir leidžiama išsisluoksniuoti (1 pastaba). Apatinis vandeninis sluoksnis perpilamas į antrąjį dalijamąjį piltuvą. Vandeninis sluoksnis ekstrahuojamas tuo pačiu būdu dar du kartus, kiekvieną kartą sunaudojant po 60–70 ml dietileterio. 1 PASTABA. Emulsiją galima suardyti, įpurškiant nedidelį kiekį etanolio arba metanolio. 5.1.4. Eteriniai ekstraktai supilami į vieną dalijamąjį piltuvą ir plaunami distiliuotu vandeniu (50 ml porcijomis), kol plovimo vanduo bus neutralus. Atskyrus vandens fazę, eterinis ekstraktas džiovinamas virš bevandenio natrio sulfato ir filtruojamas per bevandenį natrio sulfatą į 250 ml talpos pasvertą kolbą. Dalijamasis piltuvas ir filtras praplaunamas nedideliu dietileterio kiekiu. 5.1.5. Eteris garinamas, kol tūris sumažės iki kelių mililitrų. Likutis džiovinamas nedideliame vakuume arba azoto srovėje. Baigiama džiovinti laikant apie ketvirtį valandos džiovinimo spintoje 100 oC temperatūroje. Likutis atvėsinamas eksikatoriuje ir pasveriamas. 5.2. Sterolių frakcijų atskyrimas 5.2.1. Paruošiamos pagrindinės PSC plokštelės. Jos 10 s laikomos visiškai įmerktos į 0,2 N kalio šarmo tirpalą (4.5), paliekamos 2 h džiūti traukos spintoje ir 1 h džiovinamos 100oC džiovinimo spintoje. Plokštelės išimamos iš džiovinimo spintos ir laikomos eksikatoriuje su kalcio chloridu, kol jų prireikia (taip apdorotos plokštelės turi būti panaudotos per 15 dienų). 2 PASTABA. Kai sterolių frakcijai atskirti naudojamos apdorotos šarmo tirpalu silikagelio plokštelės, nesumuilinamąsias medžiagas nebūtina apdoroti Al2O3, nes visi rūgštinės prigimties junginiai (riebalų rūgštys ir kiti) sulaikomi užlašinimo linijoje ir sterolių juosta aiškiai atsiskiria nuo alifatinių ir terpenų alkoholių juostos. 5.2.2. Į chromatografavimo ar medžiagų išskirstymo indą įpilamas apie 1 cm storio benzino ir acetono mišinio (tūrių santykis 95:5) sluoksnis. Šis mišinys gali būti pakeistas heksano ir dietileterio mišiniu (tūrių santykis 65:35). Indas uždengiamas ir paliekamas ne mažiau kaip 0,5 h pusiausvyrai tarp garų ir skysčio nusistoti. Kad būtų sumažinta chromatografavimo ar analizės trukmė maždaug trečdaliu ir būtų gautas vienodesnis bei pastovesnis komponentų išplovimas, į eliuentą galima įmerkti ant vidinių indo sienelių uždėtas filtro popieriaus juosteles. 3 PASTABA. Kad būtų užtikrintas chromatografinės analizės sąlygų pakartojamumas, analizuojant kiekvieną kartą eliuentas turi būti pakeistas. 5.2.3. Paruošiamas apie 5 % nesumuilinamųjų medžiagų (5.1.5) tirpalas chloroforme. 100 ml mikrošvirkštu 0,3 ml paruošto tirpalo užlašinama vienodo ir kuo mažesnio storio juostele ant PSC plokštelės (5.2.1), apie 2 cm nuo jos apačios. Vienoje linijoje su šiuo pradiniu tašku užlašinama nuo 2ml iki 3 ml sterolių standartinio tirpalo (4.11) jų juostai identifikuoti analizės pabaigoje. 5.2.4. Plokštelė įdedama į chromatografavimo ar medžiagų išskirstymo indą, nurodytą 5.2.2 p. Palaikoma nuo 15oC iki 20oC temperatūra. Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsidurs 1 cm atstumu nuo plokštelės viršaus. Plokštelė išimama iš indo, tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje arba plokštelė trumpam paliekama traukos spintoje. 5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2¢,7¢-dichlorfloresceino tirpalu. UV šviesoje pagal etaloninio tirpalo dėmę identifikuojama sterolių juosta. Juostos ribos pagal fluorescuojančius kraštus pažymimos juodu pieštuku. 5.2.6. Į pažymėtą plotą patekęs silikagelis nugrandomas metaline mentele. Gerai susmulkinta medžiaga supilama į stiklinį filtrą (3.7). Įpilama 10 ml karšto chloroformo, mišinys kruopščiai sumaišomas metaline mentele ir filtruojamas vakuume į su filtru sujungtą kolbą (3.8). Likutis ant filtro plaunamas 3 kartus po 10 ml dietileterio į tą pačią prie filtro prijungtą kolbą. Filtratas garinamas iki 4–5 ml tūrio, likęs tirpalas supilamas į pasvertą 10 ml mėgintuvėlį (3.9). Mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant silpnoje azoto srovėje. Likutis vėl ištirpinamas keliuose lašuose acetono, džiovinamas, vėliau mėgintuvėlis su likučiu 10 min. laikomas 105 oC džiovinimo spintoje. Išėmus ataušinamas eksikatoriuje ir pasveriamas. Likutį mėgintuvėlyje sudaro sterolių frakcija. 5.3. Trimetilsilileterių paruošimas 5.3.1. Vengiant, kad nepatektų drėgmė (5 pastaba), sililinimo reagentas, sudarytas iš piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinio (tūrių santykis 9:3:1 (4 pastaba)), supilamas į mėgintuvėlį su sterolių frakcija. Vienam sterolių miligramui imama 50 ml mišinio. 4 PASTABA. Galima pirkti paruoštų naudoti tirpalų, sililinimo reagentų, pvz., N, O-di(trimetilsilil) trifluoracetamido + 1% trimetilchlorsilano mišinys, maišomas su tokiu pačiu sauso piridino tūriu. 5.3.2. Mėgintuvėlis užkemšamas ir atsargiai purtomas (neapverčiant), kol steroliai visiškai ištirps. Jis paliekamas 15 min. stovėti kambario temperatūroje ir turinys kelias minutes centrifuguojamas. Gautas skaidrus tirpalas yra paruoštas dujų chromatografinei analizei. 5 PASTABA. Nedidelė opalescencija yra įprastas reiškinys ir nesukelia trukdymų. Baltų dribsnių susidarymas ir atsiradusi rožinė spalva parodo, kad pateko drėgmė ar sugedo reagentai. Šiuo atveju analizė kartojama. 5.4. Dujų chromatografijos analizė 5.4.1. Paruošiamieji darbai, kolonėlės užpildymas 5.4.1.1. Kapiliarinė kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo. Kolonėlės įėjimas prijungiamas prie garintuvo, sujungto su mėginių dozatoriumi, išėjimas sujungiamas su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografo veikimas (sujungimų sandarumas, detektoriaus, dozatoriaus ir savirašio veikimas, t. t.). 5.4.1.2. Pirmą kartą naudojamos kapiliarinės kolonėlės turi būti kondicionuojamos. Per kolonėlę leidžiama silpna nešančiųjų dujų srovė, chromatografas įjungiamas ir laipsniškai kaitinama, kol temperatūra nepakils mažiausiai 20oC aukščiau nei darbinė temperatūra (žr. 6 pastabą). Šioje temperatūroje laikoma ne mažiau kaip 2 h, vėliau nustatomos įrenginio darbo sąlygos (reguliuojamas dujų srautas, uždegama liepsna, prijungiamas elektroninis savirašis, nustatoma kapiliarinės kolonėlės termostato, detektoriaus ir įpurškimo įrenginio temperatūra ir t. t.) ir signalo jautrumas, kuris tūri būti bent du kartus didesnis, nei analizei atlikti numatytas aukščiausias signalo lygis. Pagrindinė linija turi būti brėžiama tiesi, be jokių smailių ir nuokrypių. Neigiamas tiesinis nuokrypis parodo kolonėlės jungčių nesandarumą, tuo tarpu teigiamas nuokrypis rodo nepakankamą kolonėlės kondicionavimą. 6 PASTABA. Kondicionavimo temperatūra visuomet turi būti bent 20oC mažesnė, nei didžiausia naudojamai stacionariai fazei nustatyta temperatūra. 5.4.2. Darbo sąlygų parinkimas. 5.4.2.1. Paprastai darbo sąlygos yra tokios: – kolonėlės temperatūra: 260oC ± 5oC, – garintuvo temperatūra: 280oC, – detektoriaus temperatūra: 290oC, – nešančiųjų dujų linijinis greitis: helio 20-35 cm/s, vandenilio 30-50 cm/s, – srauto padalijimo santykis nuo 1:50 iki 1: 100, – prietaiso jautrumas: 4–16 kartų didesnis nei minimalus silpninimas, – užrašymo jautrumas: 1–2 mV per visą skalę, – popieriaus judėjimo greitis: 30–60 cm/val., – įpurkštos medžiagos kiekis: 0,5–1 ml TMSE (trimetilsilileterio) tirpalo. Nurodytos sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės ir dujų chromatografo charakteristikas, kad būtų gautos chromatogramos, atitinkančios tokias sąlygas: – b-sitosterolio sulaikymo trukmė 20 ± 5 minutės, – kampesterolio smailės aukštis turi būti: alyvuogių aliejui (vidutinis kiekis 3 %) 15 ± 5 % visos skalės aukščio; sojos aliejui (vidutinis kiekis 20 %) 80 ± 10 % visos skalės aukščio, – visi esantys steroliai turi būti atskirti. Be to, jų smailės turi būti visiškai atsiskyrusios, t. y. smailės trajektorija turi sugrįžti iki pagrindo linijos, kol prasideda kilimas atsiradus naujai smailei. Tačiau nevisiškas atsiskyrimas leidžiamas, jei smailės su santykine sulaikymo trukme 1,02 plotas gali būti apskaičiuotas naudojant statmenį. 5.4.3. Analizė 5.4.3.1. 10 ml mikrošvirkštu įsiurbiama 1ml heksano, 0,5 ml oro ir 0,5-1 ml mėginio tirpalo. Mikrošvirkšto stūmoklis adatai ištuštinti pakeliamas aukštyn. Adata įkišama per įpurškimo įtaiso membraną ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Praėjus 5 sekundėms, adata lėtai ištraukiama. 5.4.3.2. Registruojama, kol bus visiškai išplauti esančių sterolių TMSE. Pagrindo linija turi atitikti 5.4.1.2 punkto reikalavimus. 5.4.4. Smailių identifikavimas Atskiros smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes ir lyginamos su etaloniniu TMSE mišiniu, analizuojamu tomis pačiomis sąlygomis. Steroliai išplaunami tokia eilės tvarka: cholesterolis, brasikasterolis, 24-metilencholesterolis, kampesterolis, kampestanolis, stigmasterolis, D-7-kampesterolis, D-5,23-stigmastadienolis, klerosterolis, b-sitosterolis, sitostanolis, D-5-avenasterolis, D-5,24-stigmastadienolis, D-7-stigmastenolis, D-7-avenasterolis. Sitosterolio sulaikymo trukmės kolonėlėje su SE-52 ir SE-54 skystomis fazėmis pateiktos 1-ojoje lentelėje. Tipiškos kai kurių rūšių aliejaus chromatogramos pateiktos 1 ir 2 pav. 5.4.5. Kiekybinis įvertinimas 5.4.5.1. a-cholestanolio ir sterolių smailių plotai apskaičiuojami elektroniniu integratoriumi. Neatsižvelgiama į 1-ojoje lentelėje nenurodytų junginių smailes. a-cholestanolio kalibravimo koeficientas turi būti lygus 1. 5.4.5.2. Kiekvieno sterolio kiekis miligramais 100 g riebalinės medžiagos apskaičiuojamas pagal formulę: Sterolio x kiekis = čia: Ax – x sterolio smailės plotas; As – a-cholestanolio smailės plotas; ms – įdėto a-cholestanolio masė miligramais; m – tyrimui paimto mėginio masė gramais. 6. REZULTATŲ PATEIKIMAS 6.1. Pateikiamas atskirų sterolių kiekis miligramais 100 g riebalinės medžiagos ir bendras „visų alifatinių alkoholių“ kiekis. 6.2. Pagal atskiro sterolio smailės ploto santykį su visų sterolių smailių plotu apskaičiuojamas procentinis kiekvieno sterolio kiekis. Sterolis x % = , čia: Ax – x sterolio smailės plotas; SA – visų sterolių smailių plotas. ______________ PRIEDAS Dujų linijinio greičio nustatymas Į normalioms darbo sąlygoms sureguliuotą dujų chromatografą įpurškiama 1–3 ml metano (arba propano) ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės išplovimo momento (tM). Linijinis greitis cm/s gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis centimetrais, tM yra sekundėmis išmatuotas laikas. 1 lentelė. Santykinė sterolių sulaikymo trukmė Smailė Pavadinimas Santykinė sulaikymo trukmė SE 54 kolonėlė SE 52 kolonėlė 1 cholesterolis D-5-cholesten-3b-olis 0,67 0,63 2 cholestanolis 5a-cholestan-3b-olis 0,68 0,64 3 brasikasterolis [24S]-24-metil-D-5,22-cholestadien-3b-olis 0,73 0,71 4 24-metilencholesterolis 24-metilen-D-5,24-cholestadien-3b-olis 0,82 0,80 5 kampesterolis [24R]-24-metil-D-5-cholesten-3b-olis 0,83 0,81 6 kampestanolis [24R]-24-metilcholestan-3b-olis 0,85 0,82 7 stigmasterolis [24R]-24-etil-D-5,22-cholestadien-3b-olis 0,88 0,87 8 D-7-kampesterolis [24R]-24-metil-D-7-cholesten-3b-olis 0,93 0,92 9 D-5,23-stigmastadienolis [24R, S]-24-etil-D-5,23-cholestadien-3b-olis 0,95 0,95 10 klerosterolis [24S]-24-etil-D-5,25-cholestadien-3b-olis 0,96 0,96 11 b-sitosterolis [24R]-24-etil-D-5-cholesten-3b-olis 1,00 1,00 12 sitostanolis 24-etilcholestan-3b-olis 1,02 1,02 13 D-5-avenasterolis [24Z]-24-etiliden-5-cholesten-3b-olis 1,03 1,03 14 D-5,24-stigmastadienolis [24R, S]-24-etil-D-5,24-cholestadien-3b-olis 1,08 1,08 15 D-7-stigmastenolis [24R, S]-24-etil-D-7,24-cholestadien-3b-olis 1,12 1,12 16 D-7-avenasterolis [24Z]-24-etiliden-D-7-cholesten-3b-olis 1,16 1,16 1 pav. Nerafinuoto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma ______________ 2 pav. Rafinuoto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 5 priedas ERITRODIOLIO IR UVAOLIO KIEKIO NUSTATYMAS ĮVADAS Eritrodiolis (paprastai suprantamas kaip du glikoliai, eritrodiolis ir uvaolis, kartu) yra būdinga kai kurių rūšių riebalinių medžiagų nesumuilinamosios frakcijos sudedamoji dalis. Didesnės jo koncentracijos randamos tirpikliais ekstrahuotame, aliejuje, palyginti su kitų rūšių aliejumi, pvz., spaudimo būdu gautu alyvuogių aliejumi ir vynuogių kauliukų aliejumi, kuriuose jo taip pat yra. Taigi eritrodiolio buvimas gali rodyti, kad aliejus yra ekstrahuotas tirpikliais. 1. APIMTIS Pateiktas metodas eritrodiolio kiekiui riebalinėse medžiagose nustatyti. 2. METODO ESMĖ Riebalinė medžiaga sumuilinama kalio šarmo tirpalu etanolyje. Nesumuilinama dalis ekstrahuojama dietileteriu ir gryninama kolonėlėje su aliuminio oksidu. Sterolių ir eritrodiolių frakcijos iš nesumuilinamųjų medžiagų ekstrakto išskiriama chromatografiškai ant silikagelio plokštelių. Nuo plokštelės regeneruoti steroliai ir eritrodiolis paverčiami trimetilsilileteriais ir mišinys analizuojamas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu. Galutinis rezultatas yra eritrodiolio kiekis procentais eritrodiolio ir sterolių mišinyje. 3. ĮRANGA 3.1. IV priede pateikta įranga (Sterolių kiekio nustatymas). 4. REAGENTAI 4.1. IV priede pateikti reagentai (Sterolių kiekio nustatymas). 4.2. Etaloninis 0,5 % eritrodiolio tirpalas chloroforme. 5. TYRIMAS 5.1. Nesumuilinamųjų medžiagų gavimas. Kaip aprašyta IV priedo 5.1.2 punkte. 5.2. Eritrodiolio ir sterolių frakcijos atskyrimas. 5.2.1. Žr. IV priedo 5.2.1 punktą. 5.2.2. Žr. IV priedo 5.2.2 punktą. 5.2.3. Paruošiamas apie 5 % nesumuilinamųjų medžiagų tirpalas chloroforme. 0,1 ml mikrošvirkštu 0,3 ml šio tirpalo užlašinama vienodo ir kuo mažesnio storio juostele ant chromatografinės plokštelės apie 2 cm nuo jos apačios. Vienoje linijoje su pradiniu tašku užlašinami keli mikrolitrai etaloninių cholesterolio ir eritrodiolio tirpalų. 5.2.4. Plokštelė dedama į chromatografavimo ar medžiagų atskyrimo indą, paruoštą, kaip nurodyta 5.2.1 punkte. Palaikoma maždaug 20 oC aplinkos temperatūra. Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsidurs 1 cm atstumu nuo plokštelės viršaus. Plokštelė išimama iš ryškinimo indo, tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje. 5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2¢,7¢-dichlorfloresceino tirpalu. UV šviesoje pagal etaloninio tirpalo dėmę identifikuojamos sterolių ir eritrodiolių juostos. Juostų ribos pagal fluorescuojančius kraštus pažymimos juodu pieštuku. 5.2.6. Į pažymėtą plotą patekęs silikagelis nugrandomas metaline mentele. Medžiaga supilama į 50 ml kolbą. Įpilama 15 ml karšto chloroformo, gerai sumaišoma ir filtruojama per stiklinį filtrą, silikagelį supilant ant filtro. Likutis ant filtro tris kartus plaunamas chloroformu (apie 10 ml porcijomis). Filtratas kaupiamas 100 ml kolboje. Filtratas garinamas iki apie nuo 4 ml iki 5 ml tūrio, likęs tirpalas supilamas į 10 ml graduotą centrifugavimo mėgintuvėlį kūginės formos dugnu. Mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant azoto srovėje ir pasveriamas. 5.3. Trimetilsilileterių paruošimas. Kaip pateikta IV priedo 5.3 punkte. 5.4. Dujų chromatografijos analizė. Kaip pateikta anksčiau minėto metodo aprašymo 5.4 punkte. Analizuojant chromatografo darbo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima atlikti sterolių analizę ir atskirti jų TMSE (trimetilsilileterius) nuo eritrodiolio ir uvaolio. Įšvirkštus mėginį, užrašoma chromatograma, kol, išplovus sterolius, išplaus eritrodiolis ir uvaolis. Tuomet identifikuojamos smailės (santykinės eritrodiolio ir uvaolio sulaikymo trukmės pagal b-sitosterolį yra atitinkamai apie 1,45 ir 1,55) ir nustatomas jų plotas, kaip tai daroma sterolių atveju. 6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Eritrodiolis % = ia: A1 – eritrodiolio smailės plotas; A2 – uvaolio smailės plotas; SAsterolių – visų sterolių smailių plotas. Rezultatas pateikiamas dešimtosios dalies tikslumu. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 6 priedas RIEBALŲ RŪGŠČIŲ 2-OJOJE TRIGLICERIDŲ POZICIJOJE NUSTATYMAS RIEBALUOSE IR ALIEJUJE 1. APIMTIS Šiame standarte pateiktas metodas nustatyti riebaluose ir aliejuje esančių riebalų rūgščių, kurios suesterintos (esterifikuotos) 2-ojoje (arba vidinėje) glicerolio pozicijoje, frakciją (dalį). 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas dėl kasos lipazės veikimo ypatumų taikomas aliejui ir riebalams, kurie lydosi žemesnėje kaip 45oC temperatūroje. Jis, be jokių išimčių, netaikomas aliejui ir riebalams, kuriuose yra didelis kiekis: riebalų rūgščių su 12 arba mažiau anglies atomų (kokoso ir palmių branduolių aliejus, pieno riebalai) ar polinesočiųjų riebalų rūgščių (su daugiau kaip keturiomis dvigubomis jungtimis), turinčių daugiau kaip 20 anglies atomų (žuvų ir jūros gyvūnų aliejus), arba riebalų rūgščių, turinčių kitokių nei karboksilo deguoninių grupių. 3. METODO ESMĖ Jeigu reikia, rūgštus aliejus ir riebalai neutralizuojami tirpiklyje. Jie išgryninami aliuminio oksido kolonėlėje ir dalinai hidrolizuojami nustatytą laiką veikiant kasos lipazei. Susidarę monogliceridai atskiriami plonasluoksnės chromatografijos metodu ir veikiami metanoliu. Gauti metilesteriai analizuojami dujų-skysčių chromatografijos metodu. 4. ĮRANGA 4.1. 100 ml apvaliadugnė kolba. 4.2. 25 ml apvaliadugnė kolba su šlifo jungtimi. 4.3. 1 m ilgio oro kondicionierius, pritaikytas 4.2 kolbai. 4.4. 250 ml Erlenmejerio kolba. 4.5. 50 ml cheminė stiklinė. 4.6. 500 ml dalijamasis piltuvas. 4.7. Stiklinė chromatografijos kolonėlė, kurios vidinis skersmuo 13 mm, ilgis 400 mm, su sukepinto stiklo disku ir čiaupu. 4.8. 10 ml centrifugavimo mėgintuvėlis su šlifo kamščiu. 4.9. 5 ml biuretė, sugraduota 0,05 ml padalomis. 4.10. 1 ml poodinis švirkštas su plona adata. 4.11. Mikrošvirkštas 3-4 ml lašams dozuoti. 4.12. Įtaisas dengti plokštelę sorbentu plonasluoksnei chromatografijai. 4.13. Stiklinės plokštelės plonasluoksnei chromatografijai, 20 cm x 20 cm. 4.14. Stiklinis indas plonasluoksnei chromatografijai su šlifo dangčiu, pritaikytas 20 x 20 cm dydžio plokštelėms. 4.15. Purkštuvas plonasluoksnei chromatografijai. 4.16. Džiovinimo spinta, palaikanti 103 ± 2 oC temperatūrą. 4.17. Termostatas, palaikantis nuo 30 oC iki 45 oC temperatūrą 0,5 oC tikslumu. 4.18. Sukamasis garintuvas. 4.19. Vibruojanti elektrinė purtyklė, kuria būtų galima stipriai purtyti centrifugavimo mėgintuvėlį. 4.20. Ultravioletinių spindulių lempa tirti plonasluoksnės chromatografijos plokšteles. Lipazės aktyvumui tikrinti: 4.21. pH-metras. 4.22. Spiralinis maišiklis. 4.23. 5 ml biuretė. 4.24. Sekundmatis. Jei reikia gaminti lipazę: 4.25. Laboratorinė maišyklė, kuria galima disperguoti ir maišyti nevienalytes medžiagas. 5. REAGENTAI 5.1. Tinkamas chromatografijai n-heksanas arba petroleteris (virimo temperatūra nuo 30 oC iki 50 oC). 5.2. Analiziškai grynas 2-propanolis arba 95 % (tūrio visur tekste taip buvo) etanolis. 5.3. Vandeninis (1:1) 2-propanolio ar etanolio tirpalas. 5.4. Dietileteris, be peroksidų. 5.5. Acetonas. 5.6. Skruzdžių rūgštis, ne mažesnio kaip 98 % grynumo. 5.7. Eliuentas: n-heksano (5.1), dietileterio (5.4) ir skruzdžių rūgšties (5.6) mišinys santykiu 70/30/1 (v/v/v). 5.8. Aktyvintas aliuminio oksidas, tinkamas chromatografijai, neutralus, Brockmann I rūšies. 5.9. Silikagelio milteliai su rišikliu, tinkami plonasluoksnei chromatografijai. 5.10. Tinkamos kokybės kasos lipazė (1 ir 2 pastaba). 5.11. Vandeninis 120 g/l natrio šarmo tirpalas. 5.12. Vandeninis 6 N druskos rūgšties tirpalas. 5.13. Vandeninis 220 g/l kalcio chlorido (CaCl2) tirpalas. 5.14. Vandeninis 1 g/l natrio cholato (fermentų kokybės) tirpalas. 5.15. Buferinis tirpalas: vandeninis 1 mol/l tri(hidroksimetil)aminometano tirpalas parūgštinamas iki pH 8 druskos rūgštimi (5.12) (nustatoma potenciometriškai). 5.16. 10 g/l fenolftaleino tirpalas 95 % (v/v) etanolyje. 5.17. 2 g/l 2¢,7¢-dichlorfluoresceino tirpalas 95 % (v/v) etanolyje. Truputį pašarminamas, į 100 ml įlašinant lašą 1 N natrio šarmo tirpalo. Lipazės aktyvumui tikrinti: 5.18. Neutralizuotas aliejus. 5.19. Vandeninis 0,1 N natrio šarmo tirpalas. 5.20. Vandeninis 200 g/l natrio cholato (fermentų kokybės) tirpalas. 5.21. Vandeninis 100 g/l gumiarabiko tirpalas. 6. MĖGINIO PARUOŠIMAS Jei pagal II priedą nustatytas mėginio rūgštingumas yra mažesnis kaip 3 %, iš karto pagal 6.2 punktą gryninama aliuminio oksidu. Jei pagal II priedą nustatytas mėginio rūgštingumas yra didesnis kaip 3 %, ištirpinus tirpiklyje pagal 6.1 punktą neutralizuojama šarmu ir pagal 6.2 punktą gryninama aliuminio oksidu. 6.1. Tirpiklyje ištirpinto mėginio neutralizavimas šarmu Į dalijamąjį piltuvą (4.6) įpilama apie 10 g neapdoroto aliejaus, 100 ml heksano (5.1), 50 ml 2-propanolio (5.2), įlašinami keli lašai fenolftaleino tirpalo (5.16) ir įpilama natrio hidroksido tirpalo (5.11), kurio kiekis atitinka laisvųjų rūgščių kiekį, ir dar 0,3 % pertekliaus. Mišinys stipriai plakamas vieną minutę, įpilama 50 ml distiliuoto vandens, vėl plakama ir paliekama nusistovėti. Sluoksniams atsiskyrus, apatinis muilo sluoksnis išpilamas. Taip pat išleidžiamas bet koks tarpinis sluoksnis (gleivės, netirpios medžiagos). Neutralizuoto aliejaus tirpalas heksane pakartotinai plaunamas nuo 25 ml iki 30 ml 2-propanolio tirpalo (5.3) porcijomis, kol pranyks rožinė fenolftaleino spalva. Didesnioji heksano dalis pašalinama distiliuojant vakuume sukamajame garintuve (4.18). Aliejus džiovinamas vakuume nuo 30 oC iki 40 oC temperatūroje, gryno azoto srovėje, kol heksanas bus visiškai pašalintas. 6.2. Gryninimas, leidžiant per aliuminio oksidą Paruošiama 15 g aktyvinto aliuminio oksido (5.8) suspensija 50 ml heksano (5.1) ir maišant supilama į chromatografijos kolonėlę (4.7). Aliuminio oksidui leidžiama vienodai nusėsti, tirpiklio išleidžiama tiek, kad jo aukštis virš absorbento būtų 1–2 mm. Į kolonėlę atsargiai supilama 5 g aliejaus tirpalo 25 ml heksano (5.1); visas iš kolonėlės ištekantis skystis surenkamas į apvaliadugnę kolbą (4.1). 7. CHROMATOGRAFINIŲ PLOKŠTELIŲ RUOŠIMAS Stiklinės plokštelės (4.13) kruopščiai nuplaunamos etanoliu, petroleteriu ir acetonu, kad būtų pašalinti visi riebalų likučiai. Į Erlenmejerio kolbą (4.4) įberiama 30 g silikagelio miltelių (5.9). Įpilama 60 ml distiliuoto vandens. Kolba užkemšama ir vieną minutę stipriai kratoma. Gauta tyrė greitai supilama į įtaisą plokštelėms dengti (4.12) ir švarios plokštelės padengiamos 0,25 mm storio sluoksniu. Plokštelės 15 minučių džiovinamos ore, valandą džiovinimo spintoje (4.16) 103 ± 2 oC temperatūroje. Prieš naudojant plokštelės atvėsinamos eksikatoriuje iki kambario temperatūros. Paruoštų plokštelių galima nusipirkti. 8. TYRIMAS 8.1. Hidrolizė kasos lipaze Centrifugavimo mėgintuvėlyje (4.8) pasveriama apie 0,1 g paruošto mėginio ir, jeigu mėginys yra skystas aliejus, iš karto daroma kaip nurodyta toliau. Įdedama 20 mg lipazės (5.10) ir 2 ml buferinio tirpalo (5.15). Gerai, tačiau atsargiai suplakama ir įpilama 0,5 ml natrio cholato tirpalo (5.14) bei 0,2 ml kalcio chlorido tirpalo (5.13). Mėgintuvėlis uždaromas šlifo kamščiu, atsargiai (kad nesusivilgytų kamštis) pakratomas ir iš karto dedamas į termostatą (4.17), kuriame palaikoma 40±0,5oC temperatūra. Lygiai vieną minutę kratoma ranka. Mėgintuvėlis išimamas iš termostato ir lygiai dvi minutes stipriai kratomas ant elektrinės purtyklės (4.19). Greitai atvėsinama iš krano tekančio vandens srovėje; įpilama 1 ml druskos rūgšties (5.12) ir 1 ml dietileterio (5.4). Užkemšama ir stipriai maišoma ant elektrinės purtyklės. Paliekama nusistovėti ir organinis sluoksnis nusiurbiamas švirkštu (4.10), jei reikia, prieš siurbiant centrifuguojama. 8.2. Monogliceridų atskyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu Ekstraktas kiek įmanoma plonesne, vienodo storio linija švirkštu (4.11) užlašinamas ant chromatografinės plokštelės, maždaug 1,5 cm nuo jos apačios. Plokštelė įdedama į gerai prisotintą chromatografavimo ar kaip kitaip pavadintą indą (4.14) ir maždaug 20 oC temperatūroje eliuojama (plaunama) tirpikliu (5.7), kol iki plokštelės viršaus liks 1 cm. Plokštelė džiovinama ore esant tokiai pačiai temperatūrai, kokia buvo chromatografavimo inde, ir apipurškiama 2¢,7¢-dichlorfluoresceino tirpalu (5.17). Monoglicerido juosta (Rf apie 0,035) identifikuojama ultravioletinėje šviesoje (4.20). 8.3. Monogliceridų analizė dujų–skysčių chromatografijos metodu Pagal 8.2 punktą gautos juostos turinys nugrandomas mentele (reikia išvengti komponentų, likusių chromatogramos pradžioje, nuėmimo) ir supilamas į metilinimo kolbą (4.2). Surinktas silikagelis tiesiogiai apdorojamas pagal X B priede aprašytus metodus, tik tiek pakeistus, kad monogliceridai paverčiami metilesteriais. Esteriai analizuojami dujų chromatografijos metodu, kaip aprašyta X A priede. 9. REZULTATŲ PATEIKIMAS Riebalų rūgščių sudėtis 2-oje padėtyje apskaičiuojama vienos dešimtosios tikslumu (3 pastaba). 10. PASTABOS 1 PASTABA. Lipazės aktyvumo tikrinimas Tinkamame maišytuve, plakant mišinį, kurį sudaro 165 ml gumiarabiko tirpalo (5.21), 15 g smulkinto ledo ir 20 ml neutralizuoto aliejaus (5.18), paruošiama aliejaus emulsija. Į cheminę stiklinę (4.5) įpilama 10 ml šios emulsijos, vėliau nurodyta tvarka 0,3 ml natrio cholato tirpalo (5.20) ir 20 ml distiliuoto vandens. Cheminė stiklinė įdedama į termostatą, kuriame palaikoma 37 ± 0,5 oC temperatūra (4 pastaba). Į stiklinę įstatomi pH-metro elektrodai (4.21) ir spiralinis maišiklis (4.22). Iš biuretės (4.23) lašinamas natrio šarmo tirpalas (5.19), kol pH vertė pasieks 8.5. Įpilamas pakankamas kiekis lipazės suspensijos (žr. toliau). Kai pH vertė pasiekia 8,3, paleidžiamas chronometras (4.24) ir natrio šarmo tirpalas (5.19) lašinamas tokiu greičiu, kad pH vertė visą laiką būtų 8,3. Pasižymimas kas minutę sunaudoto natrio šarmo tirpalo tūris. Nubraižomas grafikas, abcisėje nurodant laiką, ordinatėje – sunaudoto natrio šarmo tūrį, kurio reikia išlaikyti pastoviai pH vertei. Turi būti gauta tiesė. Anksčiau minėta lipazės suspensija yra 1:1000 (m/m) suspensija vandenyje. Kiekvieną kartą tikrinant, turi būti naudojamas pakankamas šios suspensijos kiekis, t. y. tiek, kad per keturias penkias minutes būtų sunaudota maždaug 1 ml šarmo tirpalo. Paprastai reikia 1–5 mg miltelių. Lipazės vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris išskiria 10 mikroekvivalentų rūgšties per minutę. Taigi naudotų miltelių aktyvumas A, matuojamas lipazės vienetais miligramui lipazės, apskaičiuojamas pagal formulę: A = , čia: V – pagal grafiką apskaičiuotas per minutę sunaudoto natrio šarmo tirpalo (5.19) tūris, m – tyrimui paimtų miltelių masė miligramais. 2 PASTABA. Lipazės ruošimas Pakankamo aktyvumo lipazės galima pirkti. Tačiau taip pat galima jos pasigaminti laboratorijoje. 5 kg šviežios kiaulių kasos atšaldomi iki 0 oC, pašalinami aplinkui esantys kieti riebalai bei jungiamasis audinys ir sumalama, kad susidarytų pastos pavidalo skysta masė. Ši pasta keturias–šešias valandas maišoma maišikliu (4.25) kartu su 2,5 l absoliutaus acetono ir centrifuguojama. Likutis dar tris kartus ekstrahuojamas tuo pačiu acetono tūriu, du kartus 1:1 (v/v) acetono ir dietileterio mišiniu ir du kartus dietileteriu. Kad gauti milteliai būtų patvarūs, likutis 48 h džiovinamas vakuume. Milteliai laikomi šaldytuve. 3 PASTABA. Kiekvienu atveju patartina nustatyti to paties mėginio bendrą riebalų rūgščių sudėtį, nes palyginimas su rūgščių 2-oje padėtyje sudėtimi padės interpretuoti gautus skaičius. 4 PASTABA. Hidrolizės temperatūra yra 37 oC, nes naudojamas skystas aliejus. Tačiau mėginiui ji nustatoma 40 oC, kad būtų galima tirti riebalus, kurių lydymosi temperatūra iki 45 oC. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 7 priedas TRILINOLATO SUDĖTIES NUSTATYMAS 1. APIMTIS Alyvuogių aliejų sudarančių trigliceridų sudėties nustatymas pagal jų ekvivalentinį anglies atomų skaičių, taikant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. Šiame standarte pateiktas metodas augalinių aliejų trigliceridams atskirti ir kiekybinei sudėčiai nustatyti pagal molekulinę masę ir nesotumo laipsnį, kaip ekvivalentinio anglies skaičiaus funkciją (žr. 1 pastabą). 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas taikomas bet kokiam augaliniam aliejui, turinčiam trigliceridų, sudarytų iš riebalų rūgščių su ilga anglies atomų grandine. Metodas ypač tinka nustatyti nedidelį kiekį pusiau džiūstančio aliejaus (turinčio daug linolo rūgšties) augaliniame aliejuje, kuriame pagrindinė nesočioji rūgštis yra oleino rūgštis, pvz., alyvuogių. 3. METODO ESMĖ Trigliceridų atskyrimas pagal jų ekvivalentinį anglies skaičių taikant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (atvirkštinis fazių poliškumas) ir chromatogramų interpretavimas. 4. ĮRANGA 4.1. Didelio efektyvumo skysčių chromatografas, kuriame galima termostatuojant reguliuoti kolonėlės temperatūrą. 4.2. Įtaisas įpurkšti 10 ml. 4.3. Detektorius: diferencinis refraktometras. Jautrumas per visą skalę turi būti bent 10-4 lūžio rodiklio vieneto. 4.4. Kolonėlė: 250 mm ilgio nerūdijančio plieno vamzdis, vidinis skersmuo 4,5 mm, užpildytas 5 mm skersmens silikagelio dalelėmis, kurių sudėtyje nuo 22 % iki 23 % anglies yra oktadecilsilano pavidalu (2 pastaba). 4.5. Savirašis ir (arba) integratorius. 5. REAGENTAI Reagentai turi būti analiziškai gryni. Išplovimui skirti tirpikliai turi būti nudujinti ir gali būti panaudojami kelis kartus neturėdami įtakos atskyrimo kokybei. 5.1. Chloroformas. 5.2. Acetonas. 5.3. Acetonitrilas. 5.4. Išplovimo tirpiklis: acetonitrilas + acetonas (santykis nustatomas norimam atskyrimui gauti: pradedama mišiniu 50:50). 5.5. Ištirpinimui skirtas tirpiklis: acetonas arba acetono ir chloroformo mišinys tūrių santykiu 1:1. 5.6. Etaloniniai trigliceridai: gali būti naudojami parduodami trigliceridai (tripalmitatas, trioleatas ir t. t.) ir šiuo atveju sulaikymo trukmės grafiškai vaizduojamos kaip ekvivalentinio anglies skaičiaus funkcija. Kitu būdu etaloninė chromatograma gaunama panaudojant sojų aliejų (žr. 3 ir 4 pastabas bei 1 ir 2 pav.). 6. MĖGINIO RUOŠIMAS Analizuojamų mėginių 5 % tirpalas ruošiamas 0,5±0,001 g mėginio pasveriant 10 ml matavimo kolboje ir praskiedžiant iki 10 ml soliubilizavimo ištirpinimui skirtu tirpikliu (5.5). 7. TYRIMAS 7.1. Paruošiama chromatografijos sistema. Visai sistemai išplauti 1,5 ml per minutę greičiu pumpuojamas išplovimo tirpiklis (5.4). Palaukiama, kol nusistos stabili nulinė linija. Įpurškiama 10 ml paruošto pagal 6 punktą mėginio. 8. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR PATEIKIMAS Taikomas vidinio etalono metodas, t. y. daroma prielaida, kad visus trigliceridus atitinkančių visų smailių plotų suma sudaro 100 %. Santykinis kiekvieno triglicerido kiekis procentais apskaičiuojamas pagal formulę: trigliceridas % =  ´ 100. Rezultatas pateikiamas vienos dešimtosios tikslumu. 1 PASTABA. Išplovimo eilė gali būti nustatyta apskaičiuojant ekvivalentinius anglies skaičius, kurie dažnai apibrėžiami priklausomybe ECN = CN – 2n, kurioje CN yra anglies atomų skaičius ir n yra dvigubų jungčių skaičius; ECN gali būti apskaičiuotas daug tiksliau, atsižvelgiant į dvigubos jungties prigimtį. Jei no, nl ir nln yra atitinkamai oleino, linolo ir linoleno rūgštims priskiriamų dvigubų jungčių skaičius, ekvivalentinis anglies skaičius gali būti apskaičiuotas naudojant tokią formulę: ECN = CN – dono – dlnl – dlnnln, kurioje koeficientai do, dl ir dln gali būti apskaičiuoti pagal etaloninius trigliceridus. Šiame metode nurodytomis sąlygomis priklausomybė artima tokiai: ECN = CN –[2,60 no] – [2,35 nl] – [2,17 nln]. 2 PASTABA. Pavyzdžiai: Lichosorb (Merck) RP18 Art 50333; Lichosphere arba atitinkamas (Merck) 100 CH18 Art 50377. 3 Pastaba. Turint kelis etaloninius trigliceridus, galima apskaičuoti santykinę sulaikymo trukmę pagal trioleatą: a = RT¢/RToleato, pasinaudojant perskaičiuota sulaikymo trukme RT¢ = RT – Rtirpiklio. Priklausomybės log a nuo f (dvigubų jungčių skaičius) grafikas leidžia nustatyti visų etaloniniuose trigliceriduose esančių riebalų rūgščių sudarytų trigliceridų sulaikymo trukmes – žr. 2 brėžinį. 4 PASTABA. Kolonėlės efektyvumas turi užtikrinti aiškų trilinolato smailės atsiskyrimą nuo trigliceridų su artima sulaikymo trukme smailių. 1 pav. Sojų aliejaus mėginio chromatograma P = palmitino rūgštis                                     St = stearino rūgštis                                 O = oleino rūgštis L = linolo rūgštis                                                                Ln = linoleno rūgštis Dvigubų jungčių skaičius (n) 2 pav. Priklausomybės log a nuo f (dvigubų jungčių skaičiaus) grafikas La = lauro rūgštis   My = miristo rūgštis      P = palmitino rūgštis St = stearino rūgštis O = oleino rūgštis       L = linolo rūgštis Ln = linoleno rūgštis ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 8 priedas SPEKTROFOTOMETRINIS TYRIMAS ULTAVIOLETINĖJE SPEKTRO DALYJE ĮVADAS Spektrofotometrinis tyrimas ultravioletinėje spektro dalyje gali suteikti informacijos apie riebalų kokybę, jų išsilaikymo būklę ir technologinių procesų metu įvykusius pasikeitimus. Absorbcija metode nurodytų bangų ilgių srityje vyksta dėl esančių konjuguotų dienų ir trienų sistemų. Ši absorbcija reiškiama savitąja ekstinkcija(1 cm sluoksnio storio 1 % riebalų tirpalo tam tikrame tirpiklyje ekstinkcija), sutartinai žymima K raide (taip pat vadinama „ekstinkcijos koeficientu“). 1. APIMTIS Pateiktas riebalų tyrimo ultravioletinėje spektro dalyje metodas. 2. METODO ESMĖ Riebalai ištirpinami reikiamame tirpiklyje. Esant nustatytam bangos ilgiui, išmatuojama šio tirpalo ekstinkcija, lyginant su grynu tirpikliu. Pagal spektrofotometrinius duomenis apskaičuojamos savitosios ekstinkcijos vertės. 3. ĮRANGA 3.1. Spektrofotometras ekstinkcijai ultravioletinėje spektro dalyje esant bangos ilgiui nuo 220 nm iki 360 nm matuoti, kuriuo galima gauti nanometro eilės rodmenis. 3.2. Stačiakampės 1 cm storio kiuvetės iš kvarcinio stiklo su dangčiais. Ekstinkcijos skirtumas tarp vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu užpildytų kiuvečių neturi būti didesnis kaip 0,01 ekstinkcijos vieneto. 3.3. 25 ml matavimo kolbos. 3.4. 270 mm ilgio ir 35 mm skersmens chromatografinė kolonėlė, su apytikriai 10 mm skersmens išleidimo vamzdeliu apačioje. 4. REAGENTAI 4.1. Spektrofotometriškai grynas izooktanas (2,2,4-trimetilpentanas). Pagal distiliuotą vandenį jo pralaidumas turi būti ne mažesnis kaip 60 %, esant 220 nm, ir ne mažesnis kaip 95 %, esant 250 nm bangos ilgiui, arba kitas tinkamas tirpiklis, kuriame riebalai visiškai ištirpsta (pvz., etanolis analizuojant ricinos aliejų). 4.2. Bazinis (šarminis) aliuminio oksidas chromatografijai kolonėlėje, paruoštas ir tikrinamas kaip pateikta I priede. 4.3. Chromatografijai tinkamas n-heksanas. 5. TYRIMAS 5.1. Analizuojamas mėginys turi būti visiškai vienalytis ir be įtartinų priemaišų. Kambario temperatūroje skystas aliejus turi būti nufiltruotas per filtro popierių, esant apie 30 oC temperatūrai. Kieti riebalai turi būti homogenizuoti ir nufiltruoti, esant temperatūrai ne aukštesnei kaip 10 oC virš lydymosi temperatūros. 5.2. Apie 0,25 g taip paruošto mėginio tiksliai pasveriama 25 ml matavimo kolboje, praskiedžiama iki žymės nurodytu tirpikliu ir sumaišoma. Gautas tirpalas turi būti visiškai skaidrus. Jei atsiranda opalescencija arba drumstumas, reikia greitai nufiltruoti per filtro popierių. 5.3. Kiuvetė užpildoma gautu tirpalu ir, esant reikiamam bangos ilgiui tarp 232 ir 276 nm, matuojama tirpalo ekstinkcija, palyginimui naudojant tirpiklį. Gaunamos ekstinkcijos vertės turi būti 0,1–0,8 dydžių intervale. Jei taip nėra, matavimai kartojami, naudojant labiau praskiestus arba labiau koncentruotus tirpalus. 5.4. Kai reikia nustatyti savitąją ekstinkciją po apdorojimo aliuminio oksidu, daroma taip: 30 g bazinio aliuminio oksido suspensijos heksane supilama į chromatografinę kolonėlę. Adsorbentui nusėdus, heksano perteklius išleidžiamas maždaug iki 1 cm lygio virš aliuminio oksido sluoksnio viršaus. 10 g homogenizuotų ir filtruotų, kaip pateikta 5.1 punkte, riebalų, ištirpinama 100 ml heksano ir tirpalas supilamas į kolonėlę. Eliuatas surenkamas, visas tirpiklis išgarinamas vakuume, esant žemesnei kaip 25 oC temperatūrai. Gauti riebalai tiriami kaip pateikta 5.2 punkte. 6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Užrašomos savitosios ekstinkcijos (ekstinkcijos koeficientų) vertės, kurios įvairi …