| Europaius

Trumpai

Šis teisės aktas patvirtina Techninį reglamentą, nustatantį alyvuogių aliejaus analizės metodus, siekiant įvertinti alyvuogių aliejaus kokybę ir įgyvendinti Europos Sąjungos teisės aktus.

Ką jis reguliuoja

Alyvuogių aliejaus cheminės analizės metodus, tiekiamo į rinką.
Laisvųjų riebalų rūgščių kiekio nustatymą alyvuogių aliejuje.
Peroksidų skaičiaus nustatymą aliejuje ir riebaluose.
Vaškų kiekio nustatymą dujų-skysčių chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu.

Kam tai aktualu

Gamintojams ir tiekėjams, tiekiantiems alyvuogių aliejų į Lietuvos Respublikos rinką.
Laboratorijoms, atliekančioms alyvuogių aliejaus kokybės tyrimus.

Pagrindiniai punktai

Reglamento reikalavimai netaikomi alyvuogių aliejui, gabenamam tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją uždarose transporto priemonėse ar pakuotėse.
Alyvuogių aliejaus mėginiai imami pagal LST EN ISO 5555 ir paruošiami pagal LST EN ISO 661.
Mėginiai į laboratoriją turi būti išsiųsti ne vėliau kaip dešimtąją darbo dieną spalio–gegužės mėn. ir ne vėliau kaip penktąją darbo dieną birželio–rugsėjo mėn.
Peroksidų skaičius išreiškiamas aktyviojo deguonies miliekvivalentais kilograme.

Įstatymo tekstas

LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL TECHNINIO REGLAMENTO, NUSTATANČIO ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ANALIZĖS METODUS, PATVIRTINIMO 2003 m. liepos 22 d. Nr. 3D-295 Vilnius Siekdamas įgyvendinti Europos Sąjungos teisės aktus, reglamentuojančius aliejaus ir riebalų bendrąjį rinkos organizavimą ir užtikrinti alyvuogių aliejaus kokybės įvertinimą:

Tvirtinu Techninį reglamentą, nustatantį alyvuogių aliejaus analizės metodus (pridedama).
L a i k a u netekusiu galios Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2002 m. sausio 9 d. įsakymą Nr. 10 „Dėl Vaškų kiekio augaliniame aliejuje nustatymo techninio reglamento patvirtinimo“ (Žin., 2002, Nr. 5-203). Aplinkos ministras, pavaduojantis žemės ūkio ministrą Arūnas Kundrotas SUDERINTA Lietuvos Respublikos valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2003 05 20 raštu Nr. B6-(1.8)-901 Respublikinio mitybos centro 2003 05 02 raštu Nr. 02-255 ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2003 m. liepos 22 d. įsakymu Nr. 3D-295 TECHNINIS REGLAMENTAS, NUSTATANTIS ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ANALIZĖS METODUS Šis reglamentas parengtas remiantis 1991 m. liepos 11 d. Europos Komisijos reglamentu Nr. 2568/91/EEB dėl alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejaus charakteristikų ir atitinkamų analizės metodų (su paskutiniais pakeitimais, padarytais 2002 m. gegužės 6 d. Tarybos reglamentu Nr. 796/2002/EB, papildančiu Komisijos reglamentą Nr. 2568/91/EEB dėl alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejaus charakteristikų ir atitinkamų analizės metodų. I. Bendrosios nuostatos
Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamo alyvuogių aliejaus cheminės analizės metodus.
Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi alyvuogių aliejui, gabenamam tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse.
Analizuojamo aliejaus mėginiai imami pagal LST EN ISO 5555 ir paruošiami pagal LST EN ISO
Paimti mėginiai laikomi tamsioje, vėsioje vietoje ir išsiunčiami į laboratoriją analizei kaip įmanoma greičiau, bet ne vėliau kaip dešimtąją darbo dieną mėginius paėmus spalio–gegužės mėn. ir ne vėliau kaip penktąją darbo dieną mėginius paėmus birželio–rugsėjo mėnesį. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 1 priedas LAISVŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KIEKIO NUSTATYMAS
RŪGŠTINGUMO NUSTATYMAS Metodas taikomas laisvųjų riebalų rūgščių kiekiui alyvuogių aliejuje nustatyti. Laisvųjų riebalų rūgščių keikis išreiškiamas įprastiniais metodais apskaičiuotu rūgštingumu. 1.
METODO ESMĖ Mėginys ištirpinamas tirpiklių mišinyje. Laisvosios riebalų rūgštys titruojamos kalio šarmo tirpalu etanolyje. 1.
REAGENTAI Visi naudojami reagentai turi būti analitiškai gryni, o vanduo distiliuotas ar lygiaverčio grynumo. 1.2.
Dietileterio ir 95% (tūrio) etanolio lygių tūrių mišinys. PASTABA. Dietileteris yra labai degus ir gali sudaryti sprogstamus peroksidus. Dirbant su juo būtina imtis specialių saugos priemonių. Prieš vartojimą tiksliai neutralizuojamas kalio šarmo tirpalu (1.2.2). 100 ml mišinio imama 0,3 ml fenolftaleino tirpalo (1.2.3). PASTABA. Jeigu negalima vartoti dietileterio, gali būti vartojamas etanolio ir tolueno mišinys. Jeigu būtina, etanolį galima pakeisti izopropilo alkoholiu. 1.2.
Titruotasis kalio šarmo tirpalas etanolyje c(KOH) apytikriai 0,1 mol/l ar, jei būtina, c(KOH) apytikriai 0,5 mol/l. Turi būti žinoma tiksli kalio šarmo tirpalo koncentracija. Ji tikrinama prieš pat vartojimą. Vartojamas ne anksčiau kaip prieš 5 dienas paruoštas ir dekantuotas į tamsius stiklinius butelius guminiais kamščiais tirpalas. Tirpalas turi būti bespalvis ar gelsvos spalvos. PASTABA. Bespalvis stabilus kalio šarmo tirpalas ruošiamas taip: į 1000 ml etanolio įdedama 8 g kalio šarmo ir 0,5 g aliuminio drožlių ir 1 h virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Nedelsiant distiliuojama. Distiliate ištirpinamas reikiamas kalio šarmo kiekis. Paliekama stovėti kelias dienas ir nuo kalio karbonato nuosėdų nupilamas viršutinis skaidrus tirpalo sluoksnis. Tirpalas gali būti ruošiamas nedistiliuojant taip: į 1000 ml etanolio pripilama 4 ml aliuminio antrinio tributoksido (aliuminio butilato) (aluminium butylate). Mišinys palaikomas kelias dienas. Nupilamas viršutinis tirpalo sluoksnis ir jame ištirpinamas reikiamas kalio šarmo kiekis. Toks tirpalas tinka vartoti. 1.2.
10 g/l fenolftaleino tirpalas 95-96 % (tūrio) etanolyje ar 20 g/l šarminio mėlynojo (tiriant tamsius riebalus) tirpalas 95-96 % (tūrio) etanolyje. 1.
ĮRANGA Įprasta laboratorinė įranga ir ypač toliau išvardyta: 1.3.
analizinės svarstyklės; 1.3.
250 ml kūginė (Erlenmejerio) kolba; 1.3.
10 ml biuretė, sugraduota 0,05 ml padalomis. 1.
Tyrimas 1.4.
Mėginio ruošimas analizei (Analizuojamas filtruotas mėginys. Jei drėgmės ir priemaišų kiekis yra mažesnis kaip 1 %, mėginys analizuojamas be tolesnio apdorojimo; jei šis kiekis yra didesnis kaip 1 %, mėginį reikia filtruoti.) 1.4.
Tiriamojo mėginio ėmimas Tiriamasis mėginys, atsižvelgiant į numatomą rūgščių skaičiaus vertę, imamas pagal lentelėje pateiktas nuorodas: Numatoma rūgščių skaičiaus vertė Tiriamojo mėginio masė, g Svėrimo tikslumas, g <1 20 0,05 1-4 10 0,02 4-15 2,5 0,01 15-75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Mėginys atsveriamas į kūginę (Erlenmejerio) kolbą (1.3.2). 1.4.
Analizė Tiriamasis mėginys (1.4.2) ištirpinamas nuo 50 ml iki 150 ml neutralizuoto dietileterio ir etanolio mišinio (1.2.1). Nuolat maišant tirpalas titruojamas 0,1 mol/l kalio šarmo tirpalu (1.2.2) (žr. 2 pastabą), kol pasikeis indikatoriaus spalva (rožinė fenolftaleino spalva nepranyks bent 10 sekundžių). 1 PASTABA. Titruotasis kalio šarmo tirpalas etanolyje (1.2.2) gali būti pakeistas vandeniniu kalio ar natrio tirpalu tik tuo atveju, kai titruojant pripilamo vandens kiekis nesukelia fazių atsiskyrimo. 2 PASTABA. Jeigu reikia daugiau kaip 10 ml 0,1 mol/l kalio šarmo tirpalo, vartojamas 0,5 mol/l tirpalas. 3 PASTABA. Jeigu titruojant tirpalas susidrumsčia, į jį įpilamas reikiamas skaidriam tirpalui gauti tirpiklių (1.2.1) kiekis. 1.
Rūgštingumas išreiškiamas oleino rūgtimi, masės procentais. Rūgštingumas masės procentais skaičiuojamas pagal formulę: V ´c´´ = čia: V – titravimui suvartoto kalio šarmo tirpalo tūris mililitrais; c – tiksli titruotojo kalio šarmo tirpalo koncentracija moliais litre; M – rūgšties, pagal kurią skaičiuojamas rezultatas, molio masė

(282); m – mėginio masė gramais. Galutinis rezultatas yra dviejų tyrimų rezultatų aritmetinis vidurkis. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 2 priedas PEROKSIDŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS 1. APIMTIS Šiame standarte pateiktas aliejaus ir riebalų peroksidų skaičiaus nustatymo metodas. 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas taikomas gyvūniniams ir augaliniams riebalams ir aliejui. 3. APIBRĖŽIMAS Peroksidų skaičius – mėginyje esančių medžiagų, oksiduojančių kalio jodidą nurodytomis sąlygomis, kiekis, išreikštas aktyviojo deguonies miliekvivalentais kilograme. 4. METODO ESMĖ Acto rūgšties ir chloroformo mišinyje ištirpintas tiriamasis mėginys veikiamas kalio jodido tirpalu. Išsiskyręs jodas titruojamas etaloniniu natrio tiosulfato tirpalu. 5. ĮRANGA Visa naudojama įranga negali būti užteršta redukuojančiomis ar oksiduojančiomis medžiagomis. PASTABA. Šlifų negalima tepti. 5.1. 3 ml stiklinis samtelis. 5.2. Apie 250 ml kolbos šlifo kaklais ir kamščiais. Kolbos turi būti sausos ir užpildytos grynomis, sausomis inertinėmis dujomis (azotu ar, geriau, anglies dioksidu). 5.3. 25 arba 50 ml biuretė, sugraduota 0,1 ml padalomis. 6. REAGENTAI 6.1. Analiziškai grynas chloroformas, išvalytas nuo deguonies, pučiant per jį švarių ir sausų inertinių dujų srovę. 6.2. Analiziškai gryna ledinė acto rūgštis, išvalyta nuo deguonies, pučiant per ją švarių ir sausų inertinių dujų srovę. 6.3. Prieš pat vartojimą paruoštas sotusis vandeninis kalio jodido tirpalas. Tirpale negali būti jodo ir jodatų. 6.4. Prieš pat vartojimą titruotasis 0,01 ar 0,002 N standartinis natrio tiosulfato tirpalas. 6.5. 10 g/l krakmolo tirpalas. Prieš pat vartojimą paruošta natūralaus tirpaus krakmolo dispersija vandenyje. 7. MĖGINYS Mėginiai turi būti imami ir laikomi apsaugotoje nuo šviesos, vėsioje vietoje, visiškai užpildytose stiklo talpyklose, hermetiškai užkimštose šlifo ar kamščiamedžio kamščiais. 8. TYRIMAS Tiriama dirbtinėje ar netiesioginėje dienos šviesoje. Į stiklinį samtelį (5.1) arba, jo neturint, kolbą (5.2) 0,001 g tikslumu, atsižvelgiant į numatomą peroksidų skaičių, pasveriama lentelėje nurodyta mėginio masė. Numatomas peroksidų skaičius, mekv/kg Tiriamojo mėginio masė, g 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3 Kolba (5.2) atkemšama ir į ją įdedamas stiklinis samtelis su tiriamuoju mėginiu. Įpilama 10 ml chloroformo (6.1). Tiriamasis mėginys greitai ištirpinamas maišant. Pripilama 15 ml ledinės acto rūgšties (6.2) ir vėliau 1 ml kalio jodido tirpalo (6.3). Kolba greitai užkemšama, purtoma vieną minutę ir lygiai penkias minutes paliekama stovėti neapšviestoje vietoje nuo 15oC iki 25oC temperatūroje. Pripilama apie 75 ml distiliuoto vandens. Išsiskyręs jodas energingai maišant titruojamas natrio tiosulfato tirpalu (6.4) (0,002 mol/l tirpalas vartojamas, jei numatoma, kad peroksidų skaičius yra mažesnis kaip 12, ir 0,01 mol/l, jei numatomos vertės yra didesnės kaip 12). Indikatoriumi naudojamas krakmolo tirpalas (6.5). Tas pats tiriamasis mėginys analizuojamas du kartus. Tuo pačiu metu atliekamas tuščiasis tyrimas. Jei tuščiajam tyrimui suvartojama daugiau kaip 0,05 ml, 0,01 mol/l natrio tiosulfato tirpalo (6.4), pakeičiami užteršti reagentai. 9. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Peroksidų skaičius (PS), išreikštas miliekvivalentais aktyviojo deguonies kilograme, apskaičiuojamas pagal formulę: PS = čia: V – tyrimui suvartoto titruotojo standartinio natrio tiosulfato tirpalo (6.4) tūris, pataisytas pagal tuščiojo tyrimo rezultatą mililitrais; T – tiksli natrio tiosulfato tirpalo (6.4) koncentracija moliais litre; m – tiriamojo mėginio masė gramais. Galutinis rezultatas yra dviejų tyrimų rezultatų aritmetinis vidurkis. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 3 priedas Vaškų kiekio nustatymas dujų-skysčių chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu 1. TAIKYMO SRITIS Metodas taikomas vaškų kiekiui kai kuriuose riebaluose ir aliejuje nustatyti laboratoriniais tyrimais. Jis gali būti taikomas spaudimo būdu gautą alyvuogių aliejų atskirti nuo ekstrahavimo būdu gauto alyvuogių aliejaus (alyvuogių išspaudų aliejaus). 2. METODO ESMĖ Į riebalus ar aliejų pridedama vidinio standarto ir frakcionuojama chromatografinėje kolonėlėje, užpildytoje hidratuotu silikageliu. Regeneruojama frakcija, kuri tyrimo sąlygomis išplaunama pirmoji (jos poliškumas yra mažesnis negu trigliceridų) ir tiesiogiai analizuojama dujų-skysčių chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu. 3. ĮRANGA 3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba. 3.2. Stiklinė chromatografinė kolonėlė. Vidinis skersmuo 15 mm, ilgis nuo 30 cm iki 40 cm. 3.3. Tinkamas dujų chromatografas su kapiliarine kolonėle ir tiesioginio įšvirkštimo sistema. Chromatografą sudaro: 3.3.1. Kolonėlių termostatas, galintis išlaikyti temperatūrą 1 o C tikslumu. 3.3.2. Šaltas inžektorius mėginiui tiesiogiai įpurkšti į kolonėlę. 3.3.3. Jonizacinis liepsnos detektorius ir konverteris-stiprintuvas. 3.3.4. Registruojantis integratorius, galintis dirbti su konverteriu-stiprintuvu (3.3.3). Reagavimo greitis mažesnis kaip 1 sekundė, popieriaus judėjimo greitis reguliuojamas. 3.3.5. Nuo 10 m iki 15 m ilgio ir nuo 0,25 mm iki 0,32 mm vidinio skersmens stiklinė ar lydyto kvarco kapiliarinė kolonėlė. Vidinis paviršius padengtas tolygia nuo 0,10 mm iki 0,30 mm storio skystos fazės SE-52 ar SE-54 ar jas atitinkančios medžiagos danga. 3.4. 10 ml mikrošvirkštas su kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įšvirkšti į kolonėlę. 4. REAGENTAI 4.1. Silikagelis, 70/230 meš, artikulas 7754 Merc. Silikagelis 4 h laikomas termostate 500 oC. Leidžiama atvėsti ir pripilama 2 % vandens. Suspensija homogenizuojama gerai sumaišant. Prieš vartojimą ne mažiau kaip 12 h laikoma tamsoje. 4.2. Tinkamas chromatografijai n-heksanas. 4.3. Tinkamas chromatografijai dietileteris. 4.4. Tinkamas chromatografijai n-heptanas. 4.5. Etaloninis 0,1% (m/

v)laurileikozanato tirpalas heksane (vidinis etalonas). 4.6. Nešančiosios dujos: grynas vandenilis, tinkamas dujų-skysčių chromatografijai. 4.7. Pagalbinės dujos: - grynas vandenilis, tinkamas dujų-skysčių chromatografijai; - grynas oras, tinkamas dujų-skysčių chromatografijai. 5. TYRIMAS 5.1. Vaškų frakcijos atskyrimas. 5.1.1. Chromatografinės kolonėlės ruošimas. 15 g hidratuoto 2 % vandens silikagelio suspenduojama bevandeniame n-heksane ir supilama į kolonėlę. Leidžiama savaime nusėsti. Kad chromatografinis sluoksnis būtų homogeniškesnis, nusodinimas baigiamas naudojant elektrinę purtyklę. Bet kokios priemaišos pašalinamos per kolonėlę praleidžiant 30 ml n-heksano. 5.1.2. Kolonėlinė chromatografija. Į 25 ml kolbą tiksliai pasveriama 500 mg mėginio ir pridedamas reikiamas vidinio standarto kiekis, atsižvelgiant į numatomą vaškų kiekį, t. y. įdedama 0,1 ml laurileikozanato analizuojant alyvuogių aliejų ir nuo 0,25 mg iki 0,5 mg analizuojant alyvuogių išspaudų aliejų. Paruoštas mėginys dviem 2 ml n-heksano porcijomis supilamas į chromatografinę kolonėlę, paruoštą pagal 5.1.1. Tirpikliui leidžiama ištekėti iki 1 mm lygio virš viršutiniojo absorbento lygio. Tada pradedamas išplovimas. Surenkama 140 ml n-heksano ir dietileterio mišinio santykiu 99:1, esant 15 lašų per sekundę srauto greičiui (2,1 ml per minutę). Gauta frakcija džiovinama sukamajame garintuve, kol išgarinamas beveik visas tirpiklis. Paskutinieji 2 ml ar 3 ml tirpiklio pašalinami silpna azoto srove ir pripilama 10 ml n-heptano. 5.2. Dujų-skysčių chromatografinė analizė. 5.2.1. Paruošiamieji darbai, kolonėlės kondicionavimas. 5.2.1.1. Kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo, kolonėlės pradžią sujungiant su tiesioginio įšvirkštimo įrenginiu, o galą – su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografas (įšvirkštimo įrenginio, detektoriaus ir savirašio veikimas). 5.2.1.2. Jeigu kolonėlė naudojama pirmą kartą, patartina ją kondicionuoti. Per kolonėlę praleidžiama nestipri dujų srovė, tada įjungiamas dujų chromatografas. Laipsniškai keliama temperatūra, kol nepasieks 20 oC aukštesnės nei darbo temperatūros (pastaba). Ši temperatūra palaikoma ne mažiau kaip 2 h, po to nustatomos įrenginio darbo sąlygos (sureguliuojamas dujų greitis, uždegama liepsna, prijungiamas registruojantis įtaisas, nustatoma termostato temperatūra, sureguliuojamas detektorius ir t. t.). Signalas užrašomas bent du kartus didesniu nei reikalingas analizei jautrumu. Pagrindinė linija turi būti tiesi, joje neturi būti jokių smailių ir nukrypimų. Neigiama tiesinė nuokrypa rodo, kad nesandarūs kolonėlės sujungimai, teigiama nuokrypa rodo, kad kolonėlė nepakankamai kondicionuota. PASTABA. Visą laiką kondicionuojama bent 20oC žemesnėje nei didžiausia naudojamam eliuentui nurodyta temperatūra. 5.2.2. Darbo sąlygų parinkimas. 5.2.2.1. Paprastai darbo sąlygos yra tokios: kolonėlės temperatūra: pradinė 80oC, keliama 30oC per minutę greičiu iki 120oC, vėliau programuotas didinimas 5oC per minutę greičiu iki 340oC; - detektoriaus temperatūra: 350oC; - nešančiųjų dujų – vandenilio linijinis greitis: nuo 20 cm/s iki 35 cm/s; - prietaiso jautrumas: nuo 4 iki 16 kartų didesnis nei mažiausias silpninimas; - registruojančio įtaiso jautrumas: nuo 1 mV iki 2 mV per visą skalę; - popieriaus greitis: 30 cm/h; - įšvirkščiamos medžiagos kiekis: nuo 0,5 ml iki 1ml tirpalo. Šios sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės ir dujų chromatografo charakteristikas (kad gautos chromatogramos atitiktų šias sąlygas: C32 vidinio etalono sulaikymo trukmė turi būti 25±2 minutės ir didžiausia vaškų smailė turi užimti nuo 60 % iki 100 % visos skalės aukščio). 5.2.2.2. Smailių integravimo parametrai nustatomi taip, kad būtų gautas teisingas smailių ploto įvertinimas. 5.2.3. Analizė. 5.2.3.1. 10 ml mikrošvirkštu įsiurbiama 1 ml tirpalo. Stūmoklis ištraukiamas, kol adata ištuštėja. Adata įkišama į įšvirkštimo įrenginį ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Maždaug po penkių sekundžių adata atsargiai ištraukiama. 5.2.3.2. Registruojama, kol vaškai visiškai išplaunami. Pagrindinė linija turi visuomet atitikti reikalaujamas sąlygas (5.2.1.2). 5.2.4. Smailių identifikavimas. Smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmę, lyginant jas su žinomas sulaikymo trukmes turinčių vaškų mišiniais, analizuotais tomis pačiomis sąlygomis. 1 paveiksle pateikta pirmo spaudimo alyvų aliejaus chromatograma. 5.2.5. Kiekybinė analizė. 5.2.5.1. Suintegruojamas vidinio etalono ir C40 – C46 alifatinių esterių smailių plotas. 5.2.5.2. Kiekvieno vašką sudarančio esterio kiekis mg/kg riebalų apskaičiuojamas pagal formulę: esteris (mg/
kg)= čia: Ax – kiekvieno esterio smailės plotas; As – laurileikozanatą atitinkančios smailės plotas; ms – pridėto laurileikozanato masė miligramais; m – paimto tyrimui mėginio masė gramais. 6. REZULTATŲ IŠRAIŠKA Pateikiamas atskirų vaškų kiekis ir šių kiekių suma mg/kg riebalų. ______________ Priedas Dujų linijinio greičio nustatymas Į normalioms darbo sąlygoms nustatytą chromatografą įšvirkščiama nuo 1 ml iki 3 ml metano (propano). Išmatuojamas dujų tekėjimo per kolonėlę laikas, nuo įšvirkštimo momento iki smailės išplovimo momento (tM). Linijinis greitis cm/s apskaičiuojamas pagal formulę: L/tM čia: L – kolonėlės ilgis centimetrais; tM – išmatuotas laikas sekundėmis. I. S – vidinis etalonas C32 esteris, 1 – C36 esteriai, 2 – C38 esteriai, 3 – C40 esteriai, 4 – C42 esteriai, 5 – C44 esteriai, 6 – C46 esteriai ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 4 priedas STEROLIŲ SUDĖTIES IR KIEKIO NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS KAPILIARINĖJE KOLONĖLĖJE METODU 1. TIKSLAS Metodas taikomas atskirų sterolių kiekiui ir bendrajam sterolių kiekiui riebalinėse medžiagose nustatyti. 2. METODO ESMĖ Į riebalinę medžiagą pridedama a-cholestanolio vidinio etalono. Sumuilinama kalio šarmo tirpalu etanolyje, nesumuilinamosios medžiagos ekstrahuojamos dietileteriu. Sterolių frakcija iš nesumuilinamųjų medžiagų ekstrakto išskiriama chromatografiškai ant šarmu impregnuotų silikagelio plokštelių. Iš silikagelio regeneruoti steroliai paverčiami trimetilsilileteriais ir analizuojami dujų chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu. 3. ĮRANGA 3.1. 250 ml kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi, su šlifo jungtimis. 3.2. 500 ml dalijamieji piltuvai. 3.3. 250 ml kolbos. 3.4. Įrangos plonasluoksnei chromatografinei (PSC) analizei komplektas, pritaikytas stiklinėms plokštelėms, kurių matmenys 20 x 20 cm. 3.5. UV šviesos 366 arba 254 nm bangų ilgio lempa. 3.6. Mikrošvirkštai, kuriais galima paimti 100 ir 500 ml. 3.7. Apytikriai 2 cm skersmens ir 5 cm aukščio tinkamas filtruoti vakuume G3 akytumo stiklinis filtravimo piltuvas (15-40 mm akytumas) su 12/21 šlifo mova. 3.8. 50 ml vakuuminė kolba su 12/21 šlifo įmova filtrui (3.7) prijungti. 3.9. 10 ml mėgintuvėlis su kūginiu dugnu ir kamščiu. 3.10. Tinkamas naudoti kapiliarinę kolonėlę ir turintis srauto daliklį dujų chromatografas, kurį sudaro: 3.10. 1. termostatas kolonėlėms, galinti palaikyti norimą temperatūrą ± 1 oC tikslumu; 3.10.2. termostatinis garintuvas (įpurškimo anga) su polisiloksanu dengtu stebėjimo langeliu; 3.10.3. liepsnos jonizacijos detektorius ir konverteris stiprintuvas; 3.10.4. darbui kartu su konverteriu-stiprintuvu (3.10.3) skirtas kintamo popieriaus judėjimo greičio savirašis-integratorius, kurio reagavimo greitis mažesnis kaip viena sekundė. 3.11. Stiklinė arba lydyto kvarco nuo 20 m iki 30 m ilgio kapiliarinė kolonėlė, kurios vidinis skersmuo nuo 0,25 mm iki 0,32 mm, padengta 0,10 – 0,30 mm storio SE-52 arba SE-54 arba ją atitinkančios skystos fazės plėvele. 3.12. 10 ml talpos mikrošvirkštas dujų chromatografijai su kietinta adata. 4. REAGENTAI 4.1. Apytikriai 2 N kalio šarmo tirpalas etanolyje: 130 g kalio šarmo (mažiausia koncentracija 85%) šaldant ištirpinama 200 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu iki 1 litro. Tirpalas turi būti laikomas gerai užkimštame tamsaus stiklo butelyje. 4.2. Analiziškai grynas dietileteris. 4.3. Analiziškai grynas bevandenis natrio sulfatas. 4.4. 0,25 mm storio silikagelio sluoksniu dengtos stiklinės PSC plokštelės, neužterštos fluorescencijos indikatoriumi (gali būti naudojamos pramoninės plokštelės). 4.5. Apytikriai 0,2 N kalio šarmo tirpalas etanolyje: 13 g kalio šarmo ištirpinama 20 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu iki 1 litro. 4.6. Tinkamas chromatografijai benzenas, žr. 5.2.2. 4.7. Tinkamas chromatografijai acetonas, žr. 5.2.2. 4.8. Tinkamas chromatografijai heksanas, žr. 5.2.2. 4.9. Tinkamas chromatografijai dietileteris, žr. 5.2.2. 4.10. Tinkamas chromatografijai chloroformas, žr. 5.2.2. 4.11. Standartinis tirpalas plonasluoksnei chromatografijai: 2 % cholesterolio ar fitosterolių tirpalas chloroforme. 4.12. 0,2 % 2¢,7¢-dichlorfluoresceino tirpalas etanolyje. Jis truputį pašarminamas, įlašinant kelis lašus 2 N kalio šarmo tirpalo. 4.13. Tinkamas chromatografijai bevandenis piridinas. 4.14. Heksametildisilazanas. 4.15. Trimetilchlorsilanas. 4.16. Etaloniniai sterolių trimetilsilileterių tirpalai. Ruošiami prieš pat juos naudojant iš grynų sterolių arba jų mišinių, gautų iš juos turinčių aliejų. 4.17. 0,2 % (m/
v)a-cholestanolio tirpalas chloroforme (vidinis standartas). 4.18. Nešančiosios dujos: vandenilis ir helis, kurių grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus. 4.19. Pagalbinės dujos: - vandenilis, kurio grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus; - oras, kurio grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus. 5. TYRIMAS 5.1. Nesumuilinamųjų medžiagų gavimas 5.1.1. Į 250 ml talpos kolbą 500 ml mikrošvirkštu įpilamas toks 0,2 % a-cholestanolio tirpalo tūris, kuriame cholestanolio kiekis būtų lygus maždaug 10 % sterolių kiekio analizei paimtame tiriamajame mėginyje. Pvz., į 5 g mėginį įpilama 500 ml a-cholestanolio tirpalo, kai analizuojamas alyvuogių aliejus, ir 1500 ml, kai analizuojamas alyvuogių išspaudų aliejus. Vidinio standarto tirpalas N2 srovėje išgarinamas iki sauso likučio. Kolboje tiksliai pasveriama apie 5 g sauso, filtruoto mėginio. Gyvūninių ar augalinių riebalų ir aliejaus, kuriame yra nemažas cholesterolio kiekis, chromatogramose gali būti smailių, kurių sulaikymo trukmė tokia pati kaip ir cholestanolio. Tokiu atveju sterolių frakcija turi būti analizuojama du kartus, su vidiniu standartu ir be jo. Vietoj cholestanolio gali būti naudojamas betulinolis. 5.1.2. Į kolbą įpilama 50 ml 2 N kalio šarmo tirpalo alkoholyje, prijungiamas grįžtamasis kondensatorius. Kolba šildoma vandens vonioje, kol turinys nestipriai užvirs. Šildant nuolat maišoma, kol sumuilinama (tirpalas pasidaro skaidrus). Šildymas tęsiamas dar 20 minučių. Vėliau per šaldytuvą įpilama 50 ml distiliuoto vandens, šaldytuvas atjungiamas ir kolba atvėsinama iki apytikriai 30 oC. 5.1.3. Visas kolbos turinys supilamas į 500 ml talpos dalijamąjį piltuvą, nuplovimui per kelis kartus sunaudojant apie 50 ml distiliuoto vandens. Įpilama apie 80 ml dietileterio, turinys stipriai plakamas 30 sekundžių ir leidžiama išsisluoksniuoti (1 pastaba). Apatinis vandeninis sluoksnis perpilamas į antrąjį dalijamąjį piltuvą. Vandeninis sluoksnis ekstrahuojamas tuo pačiu būdu dar du kartus, kiekvieną kartą sunaudojant po 60–70 ml dietileterio. 1 PASTABA. Emulsiją galima suardyti, įpurškiant nedidelį kiekį etanolio arba metanolio. 5.1.4. Eteriniai ekstraktai supilami į vieną dalijamąjį piltuvą ir plaunami distiliuotu vandeniu (50 ml porcijomis), kol plovimo vanduo bus neutralus. Atskyrus vandens fazę, eterinis ekstraktas džiovinamas virš bevandenio natrio sulfato ir filtruojamas per bevandenį natrio sulfatą į 250 ml talpos pasvertą kolbą. Dalijamasis piltuvas ir filtras praplaunamas nedideliu dietileterio kiekiu. 5.1.5. Eteris garinamas, kol tūris sumažės iki kelių mililitrų. Likutis džiovinamas nedideliame vakuume arba azoto srovėje. Baigiama džiovinti laikant apie ketvirtį valandos džiovinimo spintoje 100 oC temperatūroje. Likutis atvėsinamas eksikatoriuje ir pasveriamas. 5.2. Sterolių frakcijų atskyrimas 5.2.1. Paruošiamos pagrindinės PSC plokštelės. Jos 10 s laikomos visiškai įmerktos į 0,2 N kalio šarmo tirpalą (4.5), paliekamos 2 h džiūti traukos spintoje ir 1 h džiovinamos 100oC džiovinimo spintoje. Plokštelės išimamos iš džiovinimo spintos ir laikomos eksikatoriuje su kalcio chloridu, kol jų prireikia (taip apdorotos plokštelės turi būti panaudotos per 15 dienų). 2 PASTABA. Kai sterolių frakcijai atskirti naudojamos apdorotos šarmo tirpalu silikagelio plokštelės, nesumuilinamąsias medžiagas nebūtina apdoroti Al2O3, nes visi rūgštinės prigimties junginiai (riebalų rūgštys ir kiti) sulaikomi užlašinimo linijoje ir sterolių juosta aiškiai atsiskiria nuo alifatinių ir terpenų alkoholių juostos. 5.2.2. Į chromatografavimo ar medžiagų išskirstymo indą įpilamas apie 1 cm storio benzino ir acetono mišinio (tūrių santykis 95:5) sluoksnis. Šis mišinys gali būti pakeistas heksano ir dietileterio mišiniu (tūrių santykis 65:35). Indas uždengiamas ir paliekamas ne mažiau kaip 0,5 h pusiausvyrai tarp garų ir skysčio nusistoti. Kad būtų sumažinta chromatografavimo ar analizės trukmė maždaug trečdaliu ir būtų gautas vienodesnis bei pastovesnis komponentų išplovimas, į eliuentą galima įmerkti ant vidinių indo sienelių uždėtas filtro popieriaus juosteles. 3 PASTABA. Kad būtų užtikrintas chromatografinės analizės sąlygų pakartojamumas, analizuojant kiekvieną kartą eliuentas turi būti pakeistas. 5.2.3. Paruošiamas apie 5 % nesumuilinamųjų medžiagų (5.1.5) tirpalas chloroforme. 100 ml mikrošvirkštu 0,3 ml paruošto tirpalo užlašinama vienodo ir kuo mažesnio storio juostele ant PSC plokštelės (5.2.1), apie 2 cm nuo jos apačios. Vienoje linijoje su šiuo pradiniu tašku užlašinama nuo 2ml iki 3 ml sterolių standartinio tirpalo (4.11) jų juostai identifikuoti analizės pabaigoje. 5.2.4. Plokštelė įdedama į chromatografavimo ar medžiagų išskirstymo indą, nurodytą 5.2.2 p. Palaikoma nuo 15oC iki 20oC temperatūra. Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsidurs 1 cm atstumu nuo plokštelės viršaus. Plokštelė išimama iš indo, tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje arba plokštelė trumpam paliekama traukos spintoje. 5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2¢,7¢-dichlorfloresceino tirpalu. UV šviesoje pagal etaloninio tirpalo dėmę identifikuojama sterolių juosta. Juostos ribos pagal fluorescuojančius kraštus pažymimos juodu pieštuku. 5.2.6. Į pažymėtą plotą patekęs silikagelis nugrandomas metaline mentele. Gerai susmulkinta medžiaga supilama į stiklinį filtrą (3.7). Įpilama 10 ml karšto chloroformo, mišinys kruopščiai sumaišomas metaline mentele ir filtruojamas vakuume į su filtru sujungtą kolbą (3.8). Likutis ant filtro plaunamas 3 kartus po 10 ml dietileterio į tą pačią prie filtro prijungtą kolbą. Filtratas garinamas iki 4–5 ml tūrio, likęs tirpalas supilamas į pasvertą 10 ml mėgintuvėlį (3.9). Mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant silpnoje azoto srovėje. Likutis vėl ištirpinamas keliuose lašuose acetono, džiovinamas, vėliau mėgintuvėlis su likučiu 10 min. laikomas 105 oC džiovinimo spintoje. Išėmus ataušinamas eksikatoriuje ir pasveriamas. Likutį mėgintuvėlyje sudaro sterolių frakcija. 5.3. Trimetilsilileterių paruošimas 5.3.1. Vengiant, kad nepatektų drėgmė (5 pastaba), sililinimo reagentas, sudarytas iš piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinio (tūrių santykis 9:3:1 (4 pastaba)), supilamas į mėgintuvėlį su sterolių frakcija. Vienam sterolių miligramui imama 50 ml mišinio. 4 PASTABA. Galima pirkti paruoštų naudoti tirpalų, sililinimo reagentų, pvz., N, O-di(trimetilsilil) trifluoracetamido + 1% trimetilchlorsilano mišinys, maišomas su tokiu pačiu sauso piridino tūriu. 5.3.2. Mėgintuvėlis užkemšamas ir atsargiai purtomas (neapverčiant), kol steroliai visiškai ištirps. Jis paliekamas 15 min. stovėti kambario temperatūroje ir turinys kelias minutes centrifuguojamas. Gautas skaidrus tirpalas yra paruoštas dujų chromatografinei analizei. 5 PASTABA. Nedidelė opalescencija yra įprastas reiškinys ir nesukelia trukdymų. Baltų dribsnių susidarymas ir atsiradusi rožinė spalva parodo, kad pateko drėgmė ar sugedo reagentai. Šiuo atveju analizė kartojama. 5.4. Dujų chromatografijos analizė 5.4.1. Paruošiamieji darbai, kolonėlės užpildymas 5.4.1.1. Kapiliarinė kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo. Kolonėlės įėjimas prijungiamas prie garintuvo, sujungto su mėginių dozatoriumi, išėjimas sujungiamas su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografo veikimas (sujungimų sandarumas, detektoriaus, dozatoriaus ir savirašio veikimas, t. t.). 5.4.1.2. Pirmą kartą naudojamos kapiliarinės kolonėlės turi būti kondicionuojamos. Per kolonėlę leidžiama silpna nešančiųjų dujų srovė, chromatografas įjungiamas ir laipsniškai kaitinama, kol temperatūra nepakils mažiausiai 20oC aukščiau nei darbinė temperatūra (žr. 6 pastabą). Šioje temperatūroje laikoma ne mažiau kaip 2 h, vėliau nustatomos įrenginio darbo sąlygos (reguliuojamas dujų srautas, uždegama liepsna, prijungiamas elektroninis savirašis, nustatoma kapiliarinės kolonėlės termostato, detektoriaus ir įpurškimo įrenginio temperatūra ir t. t.) ir signalo jautrumas, kuris tūri būti bent du kartus didesnis, nei analizei atlikti numatytas aukščiausias signalo lygis. Pagrindinė linija turi būti brėžiama tiesi, be jokių smailių ir nuokrypių. Neigiamas tiesinis nuokrypis parodo kolonėlės jungčių nesandarumą, tuo tarpu teigiamas nuokrypis rodo nepakankamą kolonėlės kondicionavimą. 6 PASTABA. Kondicionavimo temperatūra visuomet turi būti bent 20oC mažesnė, nei didžiausia naudojamai stacionariai fazei nustatyta temperatūra. 5.4.2. Darbo sąlygų parinkimas. 5.4.2.1. Paprastai darbo sąlygos yra tokios: – kolonėlės temperatūra: 260oC ± 5oC, – garintuvo temperatūra: 280oC, – detektoriaus temperatūra: 290oC, – nešančiųjų dujų linijinis greitis: helio 20-35 cm/s, vandenilio 30-50 cm/s, – srauto padalijimo santykis nuo 1:50 iki 1: 100, – prietaiso jautrumas: 4–16 kartų didesnis nei minimalus silpninimas, – užrašymo jautrumas: 1–2 mV per visą skalę, – popieriaus judėjimo greitis: 30–60 cm/val., – įpurkštos medžiagos kiekis: 0,5–1 ml TMSE (trimetilsilileterio) tirpalo. Nurodytos sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės ir dujų chromatografo charakteristikas, kad būtų gautos chromatogramos, atitinkančios tokias sąlygas: – b-sitosterolio sulaikymo trukmė 20 ± 5 minutės, – kampesterolio smailės aukštis turi būti: alyvuogių aliejui (vidutinis kiekis 3 %) 15 ± 5 % visos skalės aukščio; sojos aliejui (vidutinis kiekis 20 %) 80 ± 10 % visos skalės aukščio, – visi esantys steroliai turi būti atskirti. Be to, jų smailės turi būti visiškai atsiskyrusios, t. y. smailės trajektorija turi sugrįžti iki pagrindo linijos, kol prasideda kilimas atsiradus naujai smailei. Tačiau nevisiškas atsiskyrimas leidžiamas, jei smailės su santykine sulaikymo trukme 1,02 plotas gali būti apskaičiuotas naudojant statmenį. 5.4.3. Analizė 5.4.3.1. 10 ml mikrošvirkštu įsiurbiama 1ml heksano, 0,5 ml oro ir 0,5-1 ml mėginio tirpalo. Mikrošvirkšto stūmoklis adatai ištuštinti pakeliamas aukštyn. Adata įkišama per įpurškimo įtaiso membraną ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Praėjus 5 sekundėms, adata lėtai ištraukiama. 5.4.3.2. Registruojama, kol bus visiškai išplauti esančių sterolių TMSE. Pagrindo linija turi atitikti 5.4.1.2 punkto reikalavimus. 5.4.4. Smailių identifikavimas Atskiros smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes ir lyginamos su etaloniniu TMSE mišiniu, analizuojamu tomis pačiomis sąlygomis. Steroliai išplaunami tokia eilės tvarka: cholesterolis, brasikasterolis, 24-metilencholesterolis, kampesterolis, kampestanolis, stigmasterolis, D-7-kampesterolis, D-5,23-stigmastadienolis, klerosterolis, b-sitosterolis, sitostanolis, D-5-avenasterolis, D-5,24-stigmastadienolis, D-7-stigmastenolis, D-7-avenasterolis. Sitosterolio sulaikymo trukmės kolonėlėje su SE-52 ir SE-54 skystomis fazėmis pateiktos 1-ojoje lentelėje. Tipiškos kai kurių rūšių aliejaus chromatogramos pateiktos 1 ir 2 pav. 5.4.5. Kiekybinis įvertinimas 5.4.5.1. a-cholestanolio ir sterolių smailių plotai apskaičiuojami elektroniniu integratoriumi. Neatsižvelgiama į 1-ojoje lentelėje nenurodytų junginių smailes. a-cholestanolio kalibravimo koeficientas turi būti lygus 1. 5.4.5.2. Kiekvieno sterolio kiekis miligramais 100 g riebalinės medžiagos apskaičiuojamas pagal formulę: Sterolio x kiekis = čia: Ax – x sterolio smailės plotas; As – a-cholestanolio smailės plotas; ms – įdėto a-cholestanolio masė miligramais; m – tyrimui paimto mėginio masė gramais. 6. REZULTATŲ PATEIKIMAS 6.1. Pateikiamas atskirų sterolių kiekis miligramais 100 g riebalinės medžiagos ir bendras „visų alifatinių alkoholių“ kiekis. 6.2. Pagal atskiro sterolio smailės ploto santykį su visų sterolių smailių plotu apskaičiuojamas procentinis kiekvieno sterolio kiekis. Sterolis x % = , čia: Ax – x sterolio smailės plotas; SA – visų sterolių smailių plotas. ______________ PRIEDAS Dujų linijinio greičio nustatymas Į normalioms darbo sąlygoms sureguliuotą dujų chromatografą įpurškiama 1–3 ml metano (arba propano) ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės išplovimo momento (tM). Linijinis greitis cm/s gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis centimetrais, tM yra sekundėmis išmatuotas laikas. 1 lentelė. Santykinė sterolių sulaikymo trukmė Smailė Pavadinimas Santykinė sulaikymo trukmė SE 54 kolonėlė SE 52 kolonėlė 1 cholesterolis D-5-cholesten-3b-olis 0,67 0,63 2 cholestanolis 5a-cholestan-3b-olis 0,68 0,64 3 brasikasterolis [24S]-24-metil-D-5,22-cholestadien-3b-olis 0,73 0,71 4 24-metilencholesterolis 24-metilen-D-5,24-cholestadien-3b-olis 0,82 0,80 5 kampesterolis [24R]-24-metil-D-5-cholesten-3b-olis 0,83 0,81 6 kampestanolis [24R]-24-metilcholestan-3b-olis 0,85 0,82 7 stigmasterolis [24R]-24-etil-D-5,22-cholestadien-3b-olis 0,88 0,87 8 D-7-kampesterolis [24R]-24-metil-D-7-cholesten-3b-olis 0,93 0,92 9 D-5,23-stigmastadienolis [24R, S]-24-etil-D-5,23-cholestadien-3b-olis 0,95 0,95 10 klerosterolis [24S]-24-etil-D-5,25-cholestadien-3b-olis 0,96 0,96 11 b-sitosterolis [24R]-24-etil-D-5-cholesten-3b-olis 1,00 1,00 12 sitostanolis 24-etilcholestan-3b-olis 1,02 1,02 13 D-5-avenasterolis [24Z]-24-etiliden-5-cholesten-3b-olis 1,03 1,03 14 D-5,24-stigmastadienolis [24R, S]-24-etil-D-5,24-cholestadien-3b-olis 1,08 1,08 15 D-7-stigmastenolis [24R, S]-24-etil-D-7,24-cholestadien-3b-olis 1,12 1,12 16 D-7-avenasterolis [24Z]-24-etiliden-D-7-cholesten-3b-olis 1,16 1,16 1 pav. Nerafinuoto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma ______________ 2 pav. Rafinuoto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 5 priedas ERITRODIOLIO IR UVAOLIO KIEKIO NUSTATYMAS ĮVADAS Eritrodiolis (paprastai suprantamas kaip du glikoliai, eritrodiolis ir uvaolis, kartu) yra būdinga kai kurių rūšių riebalinių medžiagų nesumuilinamosios frakcijos sudedamoji dalis. Didesnės jo koncentracijos randamos tirpikliais ekstrahuotame, aliejuje, palyginti su kitų rūšių aliejumi, pvz., spaudimo būdu gautu alyvuogių aliejumi ir vynuogių kauliukų aliejumi, kuriuose jo taip pat yra. Taigi eritrodiolio buvimas gali rodyti, kad aliejus yra ekstrahuotas tirpikliais. 1. APIMTIS Pateiktas metodas eritrodiolio kiekiui riebalinėse medžiagose nustatyti. 2. METODO ESMĖ Riebalinė medžiaga sumuilinama kalio šarmo tirpalu etanolyje. Nesumuilinama dalis ekstrahuojama dietileteriu ir gryninama kolonėlėje su aliuminio oksidu. Sterolių ir eritrodiolių frakcijos iš nesumuilinamųjų medžiagų ekstrakto išskiriama chromatografiškai ant silikagelio plokštelių. Nuo plokštelės regeneruoti steroliai ir eritrodiolis paverčiami trimetilsilileteriais ir mišinys analizuojamas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu. Galutinis rezultatas yra eritrodiolio kiekis procentais eritrodiolio ir sterolių mišinyje. 3. ĮRANGA 3.1. IV priede pateikta įranga (Sterolių kiekio nustatymas). 4. REAGENTAI 4.1. IV priede pateikti reagentai (Sterolių kiekio nustatymas). 4.2. Etaloninis 0,5 % eritrodiolio tirpalas chloroforme. 5. TYRIMAS 5.1. Nesumuilinamųjų medžiagų gavimas. Kaip aprašyta IV priedo 5.1.2 punkte. 5.2. Eritrodiolio ir sterolių frakcijos atskyrimas. 5.2.1. Žr. IV priedo 5.2.1 punktą. 5.2.2. Žr. IV priedo 5.2.2 punktą. 5.2.3. Paruošiamas apie 5 % nesumuilinamųjų medžiagų tirpalas chloroforme. 0,1 ml mikrošvirkštu 0,3 ml šio tirpalo užlašinama vienodo ir kuo mažesnio storio juostele ant chromatografinės plokštelės apie 2 cm nuo jos apačios. Vienoje linijoje su pradiniu tašku užlašinami keli mikrolitrai etaloninių cholesterolio ir eritrodiolio tirpalų. 5.2.4. Plokštelė dedama į chromatografavimo ar medžiagų atskyrimo indą, paruoštą, kaip nurodyta 5.2.1 punkte. Palaikoma maždaug 20 oC aplinkos temperatūra. Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsidurs 1 cm atstumu nuo plokštelės viršaus. Plokštelė išimama iš ryškinimo indo, tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje. 5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2¢,7¢-dichlorfloresceino tirpalu. UV šviesoje pagal etaloninio tirpalo dėmę identifikuojamos sterolių ir eritrodiolių juostos. Juostų ribos pagal fluorescuojančius kraštus pažymimos juodu pieštuku. 5.2.6. Į pažymėtą plotą patekęs silikagelis nugrandomas metaline mentele. Medžiaga supilama į 50 ml kolbą. Įpilama 15 ml karšto chloroformo, gerai sumaišoma ir filtruojama per stiklinį filtrą, silikagelį supilant ant filtro. Likutis ant filtro tris kartus plaunamas chloroformu (apie 10 ml porcijomis). Filtratas kaupiamas 100 ml kolboje. Filtratas garinamas iki apie nuo 4 ml iki 5 ml tūrio, likęs tirpalas supilamas į 10 ml graduotą centrifugavimo mėgintuvėlį kūginės formos dugnu. Mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant azoto srovėje ir pasveriamas. 5.3. Trimetilsilileterių paruošimas. Kaip pateikta IV priedo 5.3 punkte. 5.4. Dujų chromatografijos analizė. Kaip pateikta anksčiau minėto metodo aprašymo 5.4 punkte. Analizuojant chromatografo darbo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima atlikti sterolių analizę ir atskirti jų TMSE (trimetilsilileterius) nuo eritrodiolio ir uvaolio. Įšvirkštus mėginį, užrašoma chromatograma, kol, išplovus sterolius, išplaus eritrodiolis ir uvaolis. Tuomet identifikuojamos smailės (santykinės eritrodiolio ir uvaolio sulaikymo trukmės pagal b-sitosterolį yra atitinkamai apie 1,45 ir 1,55) ir nustatomas jų plotas, kaip tai daroma sterolių atveju. 6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Eritrodiolis % = ia: A1 – eritrodiolio smailės plotas; A2 – uvaolio smailės plotas; SAsterolių – visų sterolių smailių plotas. Rezultatas pateikiamas dešimtosios dalies tikslumu. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 6 priedas RIEBALŲ RŪGŠČIŲ 2-OJOJE TRIGLICERIDŲ POZICIJOJE NUSTATYMAS RIEBALUOSE IR ALIEJUJE 1. APIMTIS Šiame standarte pateiktas metodas nustatyti riebaluose ir aliejuje esančių riebalų rūgščių, kurios suesterintos (esterifikuotos) 2-ojoje (arba vidinėje) glicerolio pozicijoje, frakciją (dalį). 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas dėl kasos lipazės veikimo ypatumų taikomas aliejui ir riebalams, kurie lydosi žemesnėje kaip 45oC temperatūroje. Jis, be jokių išimčių, netaikomas aliejui ir riebalams, kuriuose yra didelis kiekis: riebalų rūgščių su 12 arba mažiau anglies atomų (kokoso ir palmių branduolių aliejus, pieno riebalai) ar polinesočiųjų riebalų rūgščių (su daugiau kaip keturiomis dvigubomis jungtimis), turinčių daugiau kaip 20 anglies atomų (žuvų ir jūros gyvūnų aliejus), arba riebalų rūgščių, turinčių kitokių nei karboksilo deguoninių grupių. 3. METODO ESMĖ Jeigu reikia, rūgštus aliejus ir riebalai neutralizuojami tirpiklyje. Jie išgryninami aliuminio oksido kolonėlėje ir dalinai hidrolizuojami nustatytą laiką veikiant kasos lipazei. Susidarę monogliceridai atskiriami plonasluoksnės chromatografijos metodu ir veikiami metanoliu. Gauti metilesteriai analizuojami dujų-skysčių chromatografijos metodu. 4. ĮRANGA 4.1. 100 ml apvaliadugnė kolba. 4.2. 25 ml apvaliadugnė kolba su šlifo jungtimi. 4.3. 1 m ilgio oro kondicionierius, pritaikytas 4.2 kolbai. 4.4. 250 ml Erlenmejerio kolba. 4.5. 50 ml cheminė stiklinė. 4.6. 500 ml dalijamasis piltuvas. 4.7. Stiklinė chromatografijos kolonėlė, kurios vidinis skersmuo 13 mm, ilgis 400 mm, su sukepinto stiklo disku ir čiaupu. 4.8. 10 ml centrifugavimo mėgintuvėlis su šlifo kamščiu. 4.9. 5 ml biuretė, sugraduota 0,05 ml padalomis. 4.10. 1 ml poodinis švirkštas su plona adata. 4.11. Mikrošvirkštas 3-4 ml lašams dozuoti. 4.12. Įtaisas dengti plokštelę sorbentu plonasluoksnei chromatografijai. 4.13. Stiklinės plokštelės plonasluoksnei chromatografijai, 20 cm x 20 cm. 4.14. Stiklinis indas plonasluoksnei chromatografijai su šlifo dangčiu, pritaikytas 20 x 20 cm dydžio plokštelėms. 4.15. Purkštuvas plonasluoksnei chromatografijai. 4.16. Džiovinimo spinta, palaikanti 103 ± 2 oC temperatūrą. 4.17. Termostatas, palaikantis nuo 30 oC iki 45 oC temperatūrą 0,5 oC tikslumu. 4.18. Sukamasis garintuvas. 4.19. Vibruojanti elektrinė purtyklė, kuria būtų galima stipriai purtyti centrifugavimo mėgintuvėlį. 4.20. Ultravioletinių spindulių lempa tirti plonasluoksnės chromatografijos plokšteles. Lipazės aktyvumui tikrinti: 4.21. pH-metras. 4.22. Spiralinis maišiklis. 4.23. 5 ml biuretė. 4.24. Sekundmatis. Jei reikia gaminti lipazę: 4.25. Laboratorinė maišyklė, kuria galima disperguoti ir maišyti nevienalytes medžiagas. 5. REAGENTAI 5.1. Tinkamas chromatografijai n-heksanas arba petroleteris (virimo temperatūra nuo 30 oC iki 50 oC). 5.2. Analiziškai grynas 2-propanolis arba 95 % (tūrio visur tekste taip buvo) etanolis. 5.3. Vandeninis (1:1) 2-propanolio ar etanolio tirpalas. 5.4. Dietileteris, be peroksidų. 5.5. Acetonas. 5.6. Skruzdžių rūgštis, ne mažesnio kaip 98 % grynumo. 5.7. Eliuentas: n-heksano (5.1), dietileterio (5.4) ir skruzdžių rūgšties (5.6) mišinys santykiu 70/30/1 (v/v/v). 5.8. Aktyvintas aliuminio oksidas, tinkamas chromatografijai, neutralus, Brockmann I rūšies. 5.9. Silikagelio milteliai su rišikliu, tinkami plonasluoksnei chromatografijai. 5.10. Tinkamos kokybės kasos lipazė (1 ir 2 pastaba). 5.11. Vandeninis 120 g/l natrio šarmo tirpalas. 5.12. Vandeninis 6 N druskos rūgšties tirpalas. 5.13. Vandeninis 220 g/l kalcio chlorido (CaCl2) tirpalas. 5.14. Vandeninis 1 g/l natrio cholato (fermentų kokybės) tirpalas. 5.15. Buferinis tirpalas: vandeninis 1 mol/l tri(hidroksimetil)aminometano tirpalas parūgštinamas iki pH 8 druskos rūgštimi (5.12) (nustatoma potenciometriškai). 5.16. 10 g/l fenolftaleino tirpalas 95 % (v/
v)etanolyje. 5.17. 2 g/l 2¢,7¢-dichlorfluoresceino tirpalas 95 % (v/
v)etanolyje. Truputį pašarminamas, į 100 ml įlašinant lašą 1 N natrio šarmo tirpalo. Lipazės aktyvumui tikrinti: 5.18. Neutralizuotas aliejus. 5.19. Vandeninis 0,1 N natrio šarmo tirpalas. 5.20. Vandeninis 200 g/l natrio cholato (fermentų kokybės) tirpalas. 5.21. Vandeninis 100 g/l gumiarabiko tirpalas. 6. MĖGINIO PARUOŠIMAS Jei pagal II priedą nustatytas mėginio rūgštingumas yra mažesnis kaip 3 %, iš karto pagal 6.2 punktą gryninama aliuminio oksidu. Jei pagal II priedą nustatytas mėginio rūgštingumas yra didesnis kaip 3 %, ištirpinus tirpiklyje pagal 6.1 punktą neutralizuojama šarmu ir pagal 6.2 punktą gryninama aliuminio oksidu. 6.1. Tirpiklyje ištirpinto mėginio neutralizavimas šarmu Į dalijamąjį piltuvą (4.6) įpilama apie 10 g neapdoroto aliejaus, 100 ml heksano (5.1), 50 ml 2-propanolio (5.2), įlašinami keli lašai fenolftaleino tirpalo (5.16) ir įpilama natrio hidroksido tirpalo (5.11), kurio kiekis atitinka laisvųjų rūgščių kiekį, ir dar 0,3 % pertekliaus. Mišinys stipriai plakamas vieną minutę, įpilama 50 ml distiliuoto vandens, vėl plakama ir paliekama nusistovėti. Sluoksniams atsiskyrus, apatinis muilo sluoksnis išpilamas. Taip pat išleidžiamas bet koks tarpinis sluoksnis (gleivės, netirpios medžiagos). Neutralizuoto aliejaus tirpalas heksane pakartotinai plaunamas nuo 25 ml iki 30 ml 2-propanolio tirpalo (5.3) porcijomis, kol pranyks rožinė fenolftaleino spalva. Didesnioji heksano dalis pašalinama distiliuojant vakuume sukamajame garintuve (4.18). Aliejus džiovinamas vakuume nuo 30 oC iki 40 oC temperatūroje, gryno azoto srovėje, kol heksanas bus visiškai pašalintas. 6.2. Gryninimas, leidžiant per aliuminio oksidą Paruošiama 15 g aktyvinto aliuminio oksido (5.8) suspensija 50 ml heksano (5.1) ir maišant supilama į chromatografijos kolonėlę (4.7). Aliuminio oksidui leidžiama vienodai nusėsti, tirpiklio išleidžiama tiek, kad jo aukštis virš absorbento būtų 1–2 mm. Į kolonėlę atsargiai supilama 5 g aliejaus tirpalo 25 ml heksano (5.1); visas iš kolonėlės ištekantis skystis surenkamas į apvaliadugnę kolbą (4.1). 7. CHROMATOGRAFINIŲ PLOKŠTELIŲ RUOŠIMAS Stiklinės plokštelės (4.13) kruopščiai nuplaunamos etanoliu, petroleteriu ir acetonu, kad būtų pašalinti visi riebalų likučiai. Į Erlenmejerio kolbą (4.4) įberiama 30 g silikagelio miltelių (5.9). Įpilama 60 ml distiliuoto vandens. Kolba užkemšama ir vieną minutę stipriai kratoma. Gauta tyrė greitai supilama į įtaisą plokštelėms dengti (4.12) ir švarios plokštelės padengiamos 0,25 mm storio sluoksniu. Plokštelės 15 minučių džiovinamos ore, valandą džiovinimo spintoje (4.16) 103 ± 2 oC temperatūroje. Prieš naudojant plokštelės atvėsinamos eksikatoriuje iki kambario temperatūros. Paruoštų plokštelių galima nusipirkti. 8. TYRIMAS 8.1. Hidrolizė kasos lipaze Centrifugavimo mėgintuvėlyje (4.8) pasveriama apie 0,1 g paruošto mėginio ir, jeigu mėginys yra skystas aliejus, iš karto daroma kaip nurodyta toliau. Įdedama 20 mg lipazės (5.10) ir 2 ml buferinio tirpalo (5.15). Gerai, tačiau atsargiai suplakama ir įpilama 0,5 ml natrio cholato tirpalo (5.14) bei 0,2 ml kalcio chlorido tirpalo (5.13). Mėgintuvėlis uždaromas šlifo kamščiu, atsargiai (kad nesusivilgytų kamštis) pakratomas ir iš karto dedamas į termostatą (4.17), kuriame palaikoma 40±0,5oC temperatūra. Lygiai vieną minutę kratoma ranka. Mėgintuvėlis išimamas iš termostato ir lygiai dvi minutes stipriai kratomas ant elektrinės purtyklės (4.19). Greitai atvėsinama iš krano tekančio vandens srovėje; įpilama 1 ml druskos rūgšties (5.12) ir 1 ml dietileterio (5.4). Užkemšama ir stipriai maišoma ant elektrinės purtyklės. Paliekama nusistovėti ir organinis sluoksnis nusiurbiamas švirkštu (4.10), jei reikia, prieš siurbiant centrifuguojama. 8.2. Monogliceridų atskyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu Ekstraktas kiek įmanoma plonesne, vienodo storio linija švirkštu (4.11) užlašinamas ant chromatografinės plokštelės, maždaug 1,5 cm nuo jos apačios. Plokštelė įdedama į gerai prisotintą chromatografavimo ar kaip kitaip pavadintą indą (4.14) ir maždaug 20 oC temperatūroje eliuojama (plaunama) tirpikliu (5.7), kol iki plokštelės viršaus liks 1 cm. Plokštelė džiovinama ore esant tokiai pačiai temperatūrai, kokia buvo chromatografavimo inde, ir apipurškiama 2¢,7¢-dichlorfluoresceino tirpalu (5.17). Monoglicerido juosta (Rf apie 0,035) identifikuojama ultravioletinėje šviesoje (4.20). 8.3. Monogliceridų analizė dujų–skysčių chromatografijos metodu Pagal 8.2 punktą gautos juostos turinys nugrandomas mentele (reikia išvengti komponentų, likusių chromatogramos pradžioje, nuėmimo) ir supilamas į metilinimo kolbą (4.2). Surinktas silikagelis tiesiogiai apdorojamas pagal X B priede aprašytus metodus, tik tiek pakeistus, kad monogliceridai paverčiami metilesteriais. Esteriai analizuojami dujų chromatografijos metodu, kaip aprašyta X A priede. 9. REZULTATŲ PATEIKIMAS Riebalų rūgščių sudėtis 2-oje padėtyje apskaičiuojama vienos dešimtosios tikslumu (3 pastaba). 10. PASTABOS 1 PASTABA. Lipazės aktyvumo tikrinimas Tinkamame maišytuve, plakant mišinį, kurį sudaro 165 ml gumiarabiko tirpalo (5.21), 15 g smulkinto ledo ir 20 ml neutralizuoto aliejaus (5.18), paruošiama aliejaus emulsija. Į cheminę stiklinę (4.5) įpilama 10 ml šios emulsijos, vėliau nurodyta tvarka 0,3 ml natrio cholato tirpalo (5.20) ir 20 ml distiliuoto vandens. Cheminė stiklinė įdedama į termostatą, kuriame palaikoma 37 ± 0,5 oC temperatūra (4 pastaba). Į stiklinę įstatomi pH-metro elektrodai (4.21) ir spiralinis maišiklis (4.22). Iš biuretės (4.23) lašinamas natrio šarmo tirpalas (5.19), kol pH vertė pasieks 8.5. Įpilamas pakankamas kiekis lipazės suspensijos (žr. toliau). Kai pH vertė pasiekia 8,3, paleidžiamas chronometras (4.24) ir natrio šarmo tirpalas (5.19) lašinamas tokiu greičiu, kad pH vertė visą laiką būtų 8,3. Pasižymimas kas minutę sunaudoto natrio šarmo tirpalo tūris. Nubraižomas grafikas, abcisėje nurodant laiką, ordinatėje – sunaudoto natrio šarmo tūrį, kurio reikia išlaikyti pastoviai pH vertei. Turi būti gauta tiesė. Anksčiau minėta lipazės suspensija yra 1:1000 (m/
m)suspensija vandenyje. Kiekvieną kartą tikrinant, turi būti naudojamas pakankamas šios suspensijos kiekis, t. y. tiek, kad per keturias penkias minutes būtų sunaudota maždaug 1 ml šarmo tirpalo. Paprastai reikia 1–5 mg miltelių. Lipazės vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris išskiria 10 mikroekvivalentų rūgšties per minutę. Taigi naudotų miltelių aktyvumas A, matuojamas lipazės vienetais miligramui lipazės, apskaičiuojamas pagal formulę: A = , čia: V – pagal grafiką apskaičiuotas per minutę sunaudoto natrio šarmo tirpalo (5.19) tūris, m – tyrimui paimtų miltelių masė miligramais. 2 PASTABA. Lipazės ruošimas Pakankamo aktyvumo lipazės galima pirkti. Tačiau taip pat galima jos pasigaminti laboratorijoje. 5 kg šviežios kiaulių kasos atšaldomi iki 0 oC, pašalinami aplinkui esantys kieti riebalai bei jungiamasis audinys ir sumalama, kad susidarytų pastos pavidalo skysta masė. Ši pasta keturias–šešias valandas maišoma maišikliu (4.25) kartu su 2,5 l absoliutaus acetono ir centrifuguojama. Likutis dar tris kartus ekstrahuojamas tuo pačiu acetono tūriu, du kartus 1:1 (v/
v)acetono ir dietileterio mišiniu ir du kartus dietileteriu. Kad gauti milteliai būtų patvarūs, likutis 48 h džiovinamas vakuume. Milteliai laikomi šaldytuve. 3 PASTABA. Kiekvienu atveju patartina nustatyti to paties mėginio bendrą riebalų rūgščių sudėtį, nes palyginimas su rūgščių 2-oje padėtyje sudėtimi padės interpretuoti gautus skaičius. 4 PASTABA. Hidrolizės temperatūra yra 37 oC, nes naudojamas skystas aliejus. Tačiau mėginiui ji nustatoma 40 oC, kad būtų galima tirti riebalus, kurių lydymosi temperatūra iki 45 oC. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 7 priedas TRILINOLATO SUDĖTIES NUSTATYMAS 1. APIMTIS Alyvuogių aliejų sudarančių trigliceridų sudėties nustatymas pagal jų ekvivalentinį anglies atomų skaičių, taikant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją. Šiame standarte pateiktas metodas augalinių aliejų trigliceridams atskirti ir kiekybinei sudėčiai nustatyti pagal molekulinę masę ir nesotumo laipsnį, kaip ekvivalentinio anglies skaičiaus funkciją (žr. 1 pastabą). 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas taikomas bet kokiam augaliniam aliejui, turinčiam trigliceridų, sudarytų iš riebalų rūgščių su ilga anglies atomų grandine. Metodas ypač tinka nustatyti nedidelį kiekį pusiau džiūstančio aliejaus (turinčio daug linolo rūgšties) augaliniame aliejuje, kuriame pagrindinė nesočioji rūgštis yra oleino rūgštis, pvz., alyvuogių. 3. METODO ESMĖ Trigliceridų atskyrimas pagal jų ekvivalentinį anglies skaičių taikant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (atvirkštinis fazių poliškumas) ir chromatogramų interpretavimas. 4. ĮRANGA 4.1. Didelio efektyvumo skysčių chromatografas, kuriame galima termostatuojant reguliuoti kolonėlės temperatūrą. 4.2. Įtaisas įpurkšti 10 ml. 4.3. Detektorius: diferencinis refraktometras. Jautrumas per visą skalę turi būti bent 10-4 lūžio rodiklio vieneto. 4.4. Kolonėlė: 250 mm ilgio nerūdijančio plieno vamzdis, vidinis skersmuo 4,5 mm, užpildytas 5 mm skersmens silikagelio dalelėmis, kurių sudėtyje nuo 22 % iki 23 % anglies yra oktadecilsilano pavidalu (2 pastaba). 4.5. Savirašis ir (arba) integratorius. 5. REAGENTAI Reagentai turi būti analiziškai gryni. Išplovimui skirti tirpikliai turi būti nudujinti ir gali būti panaudojami kelis kartus neturėdami įtakos atskyrimo kokybei. 5.1. Chloroformas. 5.2. Acetonas. 5.3. Acetonitrilas. 5.4. Išplovimo tirpiklis: acetonitrilas + acetonas (santykis nustatomas norimam atskyrimui gauti: pradedama mišiniu 50:50). 5.5. Ištirpinimui skirtas tirpiklis: acetonas arba acetono ir chloroformo mišinys tūrių santykiu 1:1. 5.6. Etaloniniai trigliceridai: gali būti naudojami parduodami trigliceridai (tripalmitatas, trioleatas ir t. t.) ir šiuo atveju sulaikymo trukmės grafiškai vaizduojamos kaip ekvivalentinio anglies skaičiaus funkcija. Kitu būdu etaloninė chromatograma gaunama panaudojant sojų aliejų (žr. 3 ir 4 pastabas bei 1 ir 2 pav.). 6. MĖGINIO RUOŠIMAS Analizuojamų mėginių 5 % tirpalas ruošiamas 0,5±0,001 g mėginio pasveriant 10 ml matavimo kolboje ir praskiedžiant iki 10 ml soliubilizavimo ištirpinimui skirtu tirpikliu (5.5). 7. TYRIMAS 7.1. Paruošiama chromatografijos sistema. Visai sistemai išplauti 1,5 ml per minutę greičiu pumpuojamas išplovimo tirpiklis (5.4). Palaukiama, kol nusistos stabili nulinė linija. Įpurškiama 10 ml paruošto pagal 6 punktą mėginio. 8. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR PATEIKIMAS Taikomas vidinio etalono metodas, t. y. daroma prielaida, kad visus trigliceridus atitinkančių visų smailių plotų suma sudaro 100 %. Santykinis kiekvieno triglicerido kiekis procentais apskaičiuojamas pagal formulę: trigliceridas % = ´ 100. Rezultatas pateikiamas vienos dešimtosios tikslumu. 1 PASTABA. Išplovimo eilė gali būti nustatyta apskaičiuojant ekvivalentinius anglies skaičius, kurie dažnai apibrėžiami priklausomybe ECN = CN – 2n, kurioje CN yra anglies atomų skaičius ir n yra dvigubų jungčių skaičius; ECN gali būti apskaičiuotas daug tiksliau, atsižvelgiant į dvigubos jungties prigimtį. Jei no, nl ir nln yra atitinkamai oleino, linolo ir linoleno rūgštims priskiriamų dvigubų jungčių skaičius, ekvivalentinis anglies skaičius gali būti apskaičiuotas naudojant tokią formulę: ECN = CN – dono – dlnl – dlnnln, kurioje koeficientai do, dl ir dln gali būti apskaičiuoti pagal etaloninius trigliceridus. Šiame metode nurodytomis sąlygomis priklausomybė artima tokiai: ECN = CN –[2,60 no] – [2,35 nl] – [2,17 nln]. 2 PASTABA. Pavyzdžiai: Lichosorb (Merck) RP18 Art 50333; Lichosphere arba atitinkamas (Merck) 100 CH18 Art 50377. 3 Pastaba. Turint kelis etaloninius trigliceridus, galima apskaičuoti santykinę sulaikymo trukmę pagal trioleatą: a = RT¢/RToleato, pasinaudojant perskaičiuota sulaikymo trukme RT¢ = RT – Rtirpiklio. Priklausomybės log a nuo f (dvigubų jungčių skaičius) grafikas leidžia nustatyti visų etaloniniuose trigliceriduose esančių riebalų rūgščių sudarytų trigliceridų sulaikymo trukmes – žr. 2 brėžinį. 4 PASTABA. Kolonėlės efektyvumas turi užtikrinti aiškų trilinolato smailės atsiskyrimą nuo trigliceridų su artima sulaikymo trukme smailių. 1 pav. Sojų aliejaus mėginio chromatograma P = palmitino rūgštis St = stearino rūgštis O = oleino rūgštis L = linolo rūgštis Ln = linoleno rūgštis Dvigubų jungčių skaičius (
n)2 pav. Priklausomybės log a nuo f (dvigubų jungčių skaičiaus) grafikas La = lauro rūgštis My = miristo rūgštis P = palmitino rūgštis St = stearino rūgštis O = oleino rūgštis L = linolo rūgštis Ln = linoleno rūgštis ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 8 priedas SPEKTROFOTOMETRINIS TYRIMAS ULTAVIOLETINĖJE SPEKTRO DALYJE ĮVADAS Spektrofotometrinis tyrimas ultravioletinėje spektro dalyje gali suteikti informacijos apie riebalų kokybę, jų išsilaikymo būklę ir technologinių procesų metu įvykusius pasikeitimus. Absorbcija metode nurodytų bangų ilgių srityje vyksta dėl esančių konjuguotų dienų ir trienų sistemų. Ši absorbcija reiškiama savitąja ekstinkcija(1 cm sluoksnio storio 1 % riebalų tirpalo tam tikrame tirpiklyje ekstinkcija), sutartinai žymima K raide (taip pat vadinama „ekstinkcijos koeficientu“). 1. APIMTIS Pateiktas riebalų tyrimo ultravioletinėje spektro dalyje metodas. 2. METODO ESMĖ Riebalai ištirpinami reikiamame tirpiklyje. Esant nustatytam bangos ilgiui, išmatuojama šio tirpalo ekstinkcija, lyginant su grynu tirpikliu. Pagal spektrofotometrinius duomenis apskaičuojamos savitosios ekstinkcijos vertės. 3. ĮRANGA 3.1. Spektrofotometras ekstinkcijai ultravioletinėje spektro dalyje esant bangos ilgiui nuo 220 nm iki 360 nm matuoti, kuriuo galima gauti nanometro eilės rodmenis. 3.2. Stačiakampės 1 cm storio kiuvetės iš kvarcinio stiklo su dangčiais. Ekstinkcijos skirtumas tarp vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu užpildytų kiuvečių neturi būti didesnis kaip 0,01 ekstinkcijos vieneto. 3.3. 25 ml matavimo kolbos. 3.4. 270 mm ilgio ir 35 mm skersmens chromatografinė kolonėlė, su apytikriai 10 mm skersmens išleidimo vamzdeliu apačioje. 4. REAGENTAI 4.1. Spektrofotometriškai grynas izooktanas (2,2,4-trimetilpentanas). Pagal distiliuotą vandenį jo pralaidumas turi būti ne mažesnis kaip 60 %, esant 220 nm, ir ne mažesnis kaip 95 %, esant 250 nm bangos ilgiui, arba kitas tinkamas tirpiklis, kuriame riebalai visiškai ištirpsta (pvz., etanolis analizuojant ricinos aliejų). 4.2. Bazinis (šarminis) aliuminio oksidas chromatografijai kolonėlėje, paruoštas ir tikrinamas kaip pateikta I priede. 4.3. Chromatografijai tinkamas n-heksanas. 5. TYRIMAS 5.1. Analizuojamas mėginys turi būti visiškai vienalytis ir be įtartinų priemaišų. Kambario temperatūroje skystas aliejus turi būti nufiltruotas per filtro popierių, esant apie 30 oC temperatūrai. Kieti riebalai turi būti homogenizuoti ir nufiltruoti, esant temperatūrai ne aukštesnei kaip 10 oC virš lydymosi temperatūros. 5.2. Apie 0,25 g taip paruošto mėginio tiksliai pasveriama 25 ml matavimo kolboje, praskiedžiama iki žymės nurodytu tirpikliu ir sumaišoma. Gautas tirpalas turi būti visiškai skaidrus. Jei atsiranda opalescencija arba drumstumas, reikia greitai nufiltruoti per filtro popierių. 5.3. Kiuvetė užpildoma gautu tirpalu ir, esant reikiamam bangos ilgiui tarp 232 ir 276 nm, matuojama tirpalo ekstinkcija, palyginimui naudojant tirpiklį. Gaunamos ekstinkcijos vertės turi būti 0,1–0,8 dydžių intervale. Jei taip nėra, matavimai kartojami, naudojant labiau praskiestus arba labiau koncentruotus tirpalus. 5.4. Kai reikia nustatyti savitąją ekstinkciją po apdorojimo aliuminio oksidu, daroma taip: 30 g bazinio aliuminio oksido suspensijos heksane supilama į chromatografinę kolonėlę. Adsorbentui nusėdus, heksano perteklius išleidžiamas maždaug iki 1 cm lygio virš aliuminio oksido sluoksnio viršaus. 10 g homogenizuotų ir filtruotų, kaip pateikta 5.1 punkte, riebalų, ištirpinama 100 ml heksano ir tirpalas supilamas į kolonėlę. Eliuatas surenkamas, visas tirpiklis išgarinamas vakuume, esant žemesnei kaip 25 oC temperatūrai. Gauti riebalai tiriami kaip pateikta 5.2 punkte. 6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Užrašomos savitosios ekstinkcijos (ekstinkcijos koeficientų) vertės, kurios įvairiems bangos ilgiams apskaičiuojamos pagal formulę: Kλ = , čia: Kλ – savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui λ; Eλ – ekstinkcija, išmatuota esant bangos ilgiui λ; c – tirpalo koncentracija g/100 ml; s – kiuvetės storis centimetrais. Rezultatai pateikiami šimtosios dalies tikslumu. 6.2. Analizuojant alyvuogių aliejų pagal oficialų metodą, pateiktą EEB reglamentuose, savitoji ekstinkcija turi būti išmatuojama izooktano tirpale, esant 232 nm ir 270 nm bangos ilgiams, ir pagal žemiau pateiktą lygtį apskaičiuojama DK: DK = Km – čia: Km – savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui m. Tai yra didžiausios absorbcijos 270 nm srityje bangos ilgis. I PRIEDAS. Aliuminio oksido paruošimas ir jo aktyvumo tikrinimas A.1.1. Aliuminio oksido paruošimas Išdžiovintas tris valandas krosnyje 380–400 oC temperatūroje aliuminio oksidas supilamas į hermetiškai uždaromą indą ir įpilama distiliuoto vandens, santykiu 5 ml vandens 100 g aliuminio oksido. Indas tuojau pat uždaromas, kelis kartus pakratomas ir prieš naudojant paliekamas stovėti mažiausiai 12 valandų. A.1.2. Aliuminio oksido aktyvumo tikrinimas Paruošiama chromatografinė kolonėlė su 30 g aliuminio oksido. Pagal 5.4 punkte pateiktą aprašymą per kolonėlę leidžiamas mišinys, sudarytas iš: – 95 % pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus, kurio savitoji ekstinkcija, esant 268 nm bangos ilgiui, mažesnė kaip 0,18, – 5 % rafinuoto, naudojant diatomitą, žemės riešutų aliejaus, kurio savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui 268 nm, ne mažesnė kaip 4. Jei, mišiniui praėjus per kolonėlę, jo savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui 268 nm, yra didesnė kaip 0,11, aliuminio oksidas tinkamas naudoti, jei ne – jame reikia sumažinti vandens kiekį. II PRIEDAS. Spektrofotometro kalibravimas A.2. Po tam tikro laiko tarpo (ne rečiau kaip kas šeši mėnesiai) turi būti tikrinamos prietaiso bangos ilgio ir tikslumo charakteristikos. A.2.1. Bangos ilgis gali būti tikrinamas, naudojant gyvsidabrio garų lempą arba atitinkamus filtrus. A.2.2. Norint patikrinti fotocėlės ir fotodaugintuvo veikimą, daroma taip: pasveriama 0,2000 g spektrofotometriškai gryno kalio chromato, ištirpinama 1000 ml matavimo kolboje 0,05 N kalio šarmo tirpale ir praskiedžiama iki žymės. Paimama lygiai 25 ml gauto tirpalo ir tuo pačiu kalio šarmo tirpalu 500 ml matavimo kolboje praskiedžiama iki žymės. Esant 275 nm bangos ilgiui, matuojama gauto tirpalo ekstinkcija, palyginamuoju tirpalu naudojant kalio šarmo tirpalą. 1 cm storio kiuvetėje išmatuota ekstinkcijos vertė turi būti 0,200 ± 0,005. Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 9 A priedas RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ ANALIZĖ DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU 1. APIMTIS Pateiktas riebalų rūgščių metilesterių mišinio, gauto pagal IX B priede nurodytą metodą, kokybinės ir kiekybinės dujų chromatografijos analizės metodas, naudojant įkrautines arba kapiliarines kolonėles. Metodas netaikomas polimerizuotoms riebalų rūgštims. 2. REAGENTAI 2.1. Nešančiosios dujos Visiškai sausos inertinės dujos (azotas, helis, argonas, vandenilis ir t. t.), kuriose yra mažiau kaip 10 mg/kg deguonies. 1 PASTABA. Kapiliarinėse kolonėlėse nešančiomis dujomis vartojant vandenilį, dvigubai pagreitėja analizė, tačiau tai yra pavojinga. Galima pirkti saugių įtaisų. 2.2. Pagalbinės dujos 2.2.1. Vandenilis (grynumas ³ 99,9 %) be organinių priemaišų. 2.2.2. Oras arba deguonis be organinių priemaišų. 2.3. Pamatinė medžiaga. Laisvųjų riebalų rūgščių metilesterių mišinys arba žinomos sudėties, pageidautina tos pačios rūšies, kaip analizuojamų, riebalų metilesteriai. Būtina imtis priemonių, kad nevyktų polinesočiųjų riebalų rūgščių oksidacija. 3. ĮRANGA Visi pateikti nurodymai taikomi įprastinei dujų chromatografijos įrangai su įkrautinomis ir (
ar)kapiliarinėmis kolonėlėmis ir liepsnos jonizaciniu detektoriumi. Gali būti naudojama ir bet kuri kita įranga, kurios efektyvumas atitinka 4.1.2 reikalavimus. 3.1. Dujų chromatografas: Dujų chromatografą sudaro: 3.1.1. Įšvirkštimo sistema Naudojama viena šių įšvirkštimo sistemų:
a)įkrautinių kolonėlių įšvirkštimo sistema, turinti mažiausias įmanomas sujungimo erdves (sistemos temperatūra nuo 20 oC iki 50 oC aukštesnė už kolonėlės temperatūrą); arba
b)specialiai pritaikyta kapiliarinių kolonėlių įšvirkštimo sistema. Gali būti naudojama chromatografinė kilpa ar kilpa ant kolonėlės inžektoriaus. 2 PASTABA. Jeigu analizuojamame mišinyje nėra riebalų rūgščių su trumpesne kaip 16 anglies atomų angliavandenilių grandine, gali būti naudojamas judantis adatinis purkštuvas. 3.1.2. Termostatas Termostatas, kuriame galima pasiekti ne žemesnę kaip 260 oC kolonėlės temperatūrą ir ją palaikyti 1 oC tikslumu, naudojant įkrautines kolonėles, ir 0,1 oC tikslumu, naudojant kapiliarines kolonėles. Pastarasis reikalavimas labai svarbus, kai naudojamas lydyto kvarco vamzdelis. Visais atvejais, o ypač kai yra riebalų rūgštys su trumpesne kaip 16 anglies atomų grandine, rekomenduojama programuoti temperatūrą. 3.1.3. Įkrautinė kolonėlė 3.1.3.1. Pagaminta iš inertiškų tiriamajai medžiagai žaliavų, pvz., stiklo ar nerūdijančio plieno. Jos matmenys:
a)ilgis nuo 1 m iki 3 m. Trumpa (sąlyginai) kolonėlė gali būti naudojama, kai mėginyje yra ilgos angliavandenilių grandinės (daugiau kaip C20) riebalų rūgštys. Analizuojant 4 ar 6 anglies atomų grandinės rūgštis, rekomenduojama naudoti 2 m ilgio kolonėlę;
b)vidinis skersmuo – nuo 2 mm iki 4 mm. 3 PASTABA. Jeigu mėginyje yra polinesočių komponentų su daugiau negu trimis dvigubomis jungtimis, jie nerūdijančio plieno kolonėlėje gali skilti. 4 PASTABA. Gali būti naudojamos sistemos su dvigubomis įkrautinėmis kolonėlėmis. 3.1.3.2. Įkrova, kurią sudaro:
a)Nešiklis. Perplautas rūgštimi ir silanizuotas diatomitas ar kitas tinkamas inertinis nešiklis, grūdelių dydis nuo 125 mm iki 200 mm su 25 mm nuokrypa. Vidutinis grūdelių dydis priklauso nuo kolonėlės vidinio skersmens ir ilgio.
b)Nuostovioji fazė. Skysti poliesteriai (pvz., dietilenglikolio polisukcinatas, butandiolio polisukcinatas, etilenglikolio poliadipatas ir t. t.), cianosilikonai ar kiti skysčiai, kuriuos naudojant gaunamas reikiamas chromatografinis atskyrimas (žr. 4 skyrių). Nuostovioji fazė sudaro nuo 5 % iki 20 % įkrovos kiekio. Atskirais atvejais gali būti naudojama nepolinė nuostovioji fazė. 3.1.3.3. Kolonėlės kondicionavimas Termostatas su naujai paruošta ir atjungta nuo detektoriaus (jei galima) kolonėle lėtai įkaitinamas iki 185oC temperatūros. Atsukamos inertinės dujos, nustatomas nuo 20 ml/min iki 60 ml/min dujų, einančių per kolonėlę, greitis, kolonėlė 16 h kaitinama 185 oC temperatūroje ir 2 h 195 oC temperatūroje. 3.1.4. Kapiliarinė kolonėlė 3.1.4.1. Vamzdelis, pagamintas iš inertiškų tiriamai medžiagai žaliavų (paprastai stiklo ar lydyto kvarco). Vidinis skersmuo – nuo 0,2 mm iki 0,8 mm. Prieš padengiant nuostoviąja faze, vidinis paviršius atitinkamai apdorojamas (paviršius paruošiamas, inaktyvinamas). Daugeliu atvejų pakanka 25 m kolonėlės. 3.1.4.2. Nuostovioji fazė. Poliglikolis [poli(etileno glikolis) 20 000], poliesteris (butandiolio polisukcinatas) ar polinis polisiloksanas (cianosiloksanai). Gali būti naudojamos mišrios kolonėlės. 5 PASTABA. Naudojant polinius polisiloksanus iškyla sunkumų identifikuojant ir atskiriant linoleno ir C20 rūgštis. Dangos turi būti plonos – nuo 0,1 mm iki 0,2 mm. 3.1.4.3. Kolonėlės montavimas ir kondicionavimas Tvirtinant kolonėlę į termostatą, pasirenkant jungtis (jų pralaidumą), tvirtinant kolonėlės galus prie įšvirkštimo sistemos ir detektoriaus (mažiausios tuščios erdvės), t. y. atliekant kolonėlės montavimo darbus, laikomasi įprastų saugos taisyklių. Kolonėlė prapučiama nešančiųjų dujų srove [0,3 bar (30 kPa) slėgis 25 m ilgio ir 0,3 mm vidutinio skersmens kolonėlei]. Kolonėlė kondicionuojama termostate, programuojant temperatūrą 3 oC/min greičiu, pradedant aplinkos ir baigiant 10 °C žemesne temperatūra už nuostoviosios fazės skilimo temperatūrą. Šioje temperatūroje kolonėlė išlaikoma 1 h, kol stabilizuojasi prietaiso nulinė linija. Temperatūra sumažinama iki 180 oC darbui izoterminėmis sąlygomis. 6 PASTABA. Gali būti naudojamos tinkamos kondicionuotos pramoninės kolonėlės. 3.1.4. Detektorius, pageidautina toks, kurį galima įkaitinti iki aukštesnės negu kolonėlės temperatūra. 3.2. Švirkštas Graduotas, didžiausias tūris 10 ml, padalos vertė – 0,1 ml. 3.3. Savirašis Kai pagal gautas kreives apskaičiuojama tiriamojo mišinio sudėtis, turi būti naudojamas didelio tikslumo, suderintas su naudojama įranga elektroninis savirašis. Jo charakteristikos turi būti tokios:
a)reagavimo greitis mažesnis kaip 1,5 s, pageidautina 1 s (reagavimo greitis – tai laikas, per kurį savirašio rašiklis, gavęs staigų 100 % impulsą, nueina kelią nuo 0 % iki 90 %);
b)popieriaus plotis ne mažesnis kaip 20 cm;
c)popieriaus greitis reguliuojamas nuo 0,4 cm/min iki 2,5 cm/min. 3.4. Integratorius Elektroniniu integratoriumi ar skaičiuotuvu greitai apskaičiuojami tikslūs rezultatai. Jis turi jautriai ir tiesiogiai reaguoti į signalą ir nuokrypiai nuo pagrindinės linijos turi būti priimtini. 4. TYRIMAS 4.1–4.3 aprašyti veiksmai taikomi naudojant liepsnos jonizacinį detektorių. Jis gali būti pakeistas katarometru (detektoriaus veikimas pagrįstas terminiais laidumo pokyčiais). Tuo atveju tyrimo sąlygos keičiamos kaip aprašyta 6 punkte. 4.1. Tyrimo sąlygos 4.1.1. Palankiausių darbo sąlygų pasirinkimas 4.1.1.1. Įkrautinė kolonėlė Pasirenkant palankiausias darbo sąlygas, turi būti atsižvelgiama į šiuos kintamuosius:
a)kolonėlės ilgį ir skersmenį;
b)nuostoviosios fazės prigimtį ir kiekį;
c)kolonėlės temperatūrą;
d)nešančiųjų dujų srovę;
e)reikalinga atskiriamoji galia;
f)mėginio tiriamosios dalies dydį, parinktą taip, kad detektoriaus ir elektrometro signalai būtų susiję tiesine priklausomybe;
g)analizės trukmę. Paprastai sąlygos, pateiktos 1 ir 2 lentelėse, užtikrina reikiamą rezultatą, t. y. mažiausiai 2000 teorinių lėkščių metrui kolonėlės ilgio metilstearatui ir jo eliuavimo trukmę apie 15 min. Įšvirkštimo sistemos temperatūra turi būti apie 200 oC, o detektoriaus temperatūra tokia pati ar aukštesnė už kolonėlės temperatūrą. Vandenilio, patenkančio į liepsnos jonizacinį detektorių, ir nešančiųjų dujų greičių santykis, atsižvelgiant į kolonėlės ilgį, keičiamas nuo 1:2 iki 1:1. Deguonies greitis yra nuo 5 iki 10 kartų didesnis už vandenilio greitį. 1 lentelė Vidinis kolonėlės skersmuo, mm Nešančiųjų dujų greitis, ml/min. 2 15–25 3 20–40 4 40–60 2 lentelė Nuostoviosios fazės koncentracija % (m/
m)Kolonėlės temperatūra, oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapiliarinė kolonėlė Kapiliarinės kolonėlės efektyvumas ir pralaidumas turi įtakos nešančiųjų dujų greičiui kolonėlėje, o tai lemia sudėtinių mišinio dalių atskyrimą ir analizės trukmę. Todėl tyrimo sąlygos optimizuojamos atsižvelgiant į tai, ar norima pagerinti atskyrimo kokybę, ar sutrumpinti analizės trukmę. 4.1.2. Teorinių lėkščių skaičiaus (efektyvumo) ir atskyrimo laipsnio nustatymas (žr. 1 pav.) Tiriamas metilstearato ir metiloleato mišinys, kuriame yra apytiksliai vienodi jų kiekiai (pvz., kakavos sviesto metilo esteriai). Pasirenkama kolonėlės temperatūra ir nešančiųjų dujų greitis taip, kad metilstearato smailė būtų registruojama maždaug po 15 min nuo tirpiklio smailės. Naudojamas toks metilesterių mišinio kiekis, kad metilstearato smailė apimtų 3/4 visos registruojančio įtaiso skalės. Teorinių lėkščių skaičius n (efektyvumas) apskaičiuojamas pagal formulę: n = 16 ir atskyrimo laipsnis R apskaičiuojamas pagal formulę: R = , čia: dr1 – atstumas nuo chromatogramos pradžios iki metilstearato smailės maksimumo milimetrais; w1 ir w2 – metilstearato ir metiloleato smailių pločiai, išmatuoti tarp kreivių liestinių susikirtimo su nuline linija taškų, milimetrais; D – atstumas tarp metilstearato ir metiloleato smailių viršūnių, milimetrais. 1 pav. Teorinių lėkščių skaičiaus (efektyvumo) ir atskyrimo laipsnio nustatymo chromatograma Pasirenkamos tokios tyrimo sąlygos: ne mažiau kaip 2000 teorinių lėkščių metrui kolonėlės ilgio metilstearatui, atskyrimo laipsnis ne mažesnis kaip 1,25. 4.2. Tiriamoji dalis Švirkštu (3.2) įsiurbiama nuo 1ml iki 2 ml metilesterių tirpalo, paruošto pagal IXB priedą, ir įšvirkščiama į kolonėlę. Jeigu esteriai neištirpinti, paruošiamas apytiksliai 100 mg/ml esterių tirpalas chromatografinio švarumo heptane. Nuo 0,1ml iki 1 ml šio tirpalo įšvirkščiama į kolonėlę. Jei mišinyje tiriamų medžiagų yra tik pėdsakai, tiriamosios dalies tūris didinamas (iki 10 kartų). 4.3. Analizė Analizės sąlygos pateiktos 4.1.1 punkte. Kai tiriamos trumpesnės kaip 12 anglies atomų grandinės riebalų rūgštys, kolonėlių temperatūra gali būti žemesnė, ir jų temperatūra gali būti aukštesnė, kai tiriamos ilgesnės kaip 20 anglies atomų grandinės rūgštys. Abiem atvejais (jei įmanoma) temperatūrą galima programuoti. Pavyzdžiui, jei mėginyje yra riebalų rūgščių su trumpesne kaip 12 anglies atomų grandine, mėginys įšvirkščiamas 100 oC temperatūroje [arba nuo 50 oC iki 60 oC, kai yra butilo (sviesto) rūgštis] ir nedelsiant nuo 4 oC iki 8 oC/min greičiu temperatūra keliama iki optimalios. Atskirais atvejais gali būti sujungiami du tyrimai (žemesnėje ir aukštesnėje temperatūroje). Po programuoto kaitinimo, atskyrimas tęsiamas pastovioje temperatūroje, kol išplaunami visi komponentai. Jeigu įranga yra be temperatūros programavimo, tiriama dviejose fiksuotose temperatūrose tarp 100 0C ir 195 0C. Jeigu būtina, rekomenduojama tirti naudojant dvi atskiras skirtingo poliškumo fazes, kad būtų patikrinta, ar nėra paslėptų smailių (pvz., žuvų riebalams, kai tuo pačiu metu egzistuoja C18:3 ir C20:0 ar C18:3 ir konjuguotoji C18:2 rūgštis). 4.4. Etaloninių chromatogramų ir diagramų paruošimas Tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamasis mėginys, analizuojamas pamatinis etalonas (2.3). Išmatuojama mišinyje esančių riebalų rūgščių esterių sulaikymo trukmė ir atstumas. Ant pusiau logaritminio popieriaus nubraižomos sulaikymo trukmės ir atstumo logaritmo priklausomybės nuo anglies atomų skaičiaus grandinėje kreivės. Izoterminėmis sąlygomis vienodo nesotumo laipsnio grandinės rūgščių grafikai turi būti tiesios ir apytiksliai lygiagrečios viena kitai linijos. Svarbu vengti sąlygų, kuriomis egzistuoja maskuotos smailės, t. y. kai atskyrimo laipsnis nepakankamas perskirti du komponentus. 5. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS 5.1. Kokybinė analizė Pagal kreivę paruoštą pagal 4.4 punktą identifikuojamos, jei reikia interpeliuojant, tiriamojo mėginio metilesterių smailės. 5.2. Kiekybinė analizė 5.2.1. Sudėties nustatymas Išskyrus ypatingus atvejus, naudojamas vidinės normalizacijos metodas, t. y. daroma prielaida, kad visos tiriamojo mėginio komponentų smailės matomos chromatogramoje ir bendras visų komponentų smailių plotas yra 100 % (visiškas išplovimas). Jeigu įrangoje yra integratorius, apskaičiavimui naudojami jo rodmenys. Kitu atveju nustatomas kiekvienos smailės plotas, padauginant jos aukštį iš pločio per statinio vidurį ir įvertinant visus nukrypimus registravimo metu. 5.2.2. Apskaičiavimo metodas 5.2.2.1. Bendrasis metodas Procentinė pasirinktojo i komponento koncentracija (pagal metilesterių masę), nustačius i atitinkančios smailės ploto santykį su bendru visų smailių plotu, apskaičiuojama pagal formulę: , čia: Ai – i komponento smailės plotas; SA – visų smailių plotų suma. Rezultatai pateikiami dešimtosios dalies tikslumu. 7 PASTABA. Šiuo atveju skaičiavimo rezultatai paremti santykiniais plotais, priėmus prielaidą, kad jie atspindi procentinę koncentraciją. Tais atvejais, kai ši prielaida neleistina, žr. 5.2.2.2. 5.2.2.2. Pataisos koeficientų vartojimas Atskirais atvejais, pvz., kai tiriamajame mėginyje yra rūgščių su trumpesne kaip 8 anglies atomai grandine ar rūgščių su antrinėmis grupėmis, kai naudojamas terminio laidumo detektorius ar kai siekiama gauti tikslesnius rezultatus, procentinei smailių plotų išraiškai perskaičiuoti į procentinę komponentų masių išraišką turi būti vartojami pataisos koeficientai. Pataisos koeficientai nustatomi iš chromatogramų, gautų analizuojant pamatinius etalonus ar žinomos sudėties metilesterius tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir analizuojant tiriamąjį mėginį. Pamatiniame etalone procentinė i komponento koncentracija apskaičiuojama pagal formulę: , čia: mi – i komponento masė pamatiniame etalone; Sm – bendra visų pamatinio etalono komponentų masė miligramais. Iš pamatinio etalono chromatogramos (4.4) apskaičiuojama procentinė i komponento koncentracija (plotas/plotas) pagal formulę: , čia: Ai – i komponento smailės plotas; SA – visų smailių plotų suma. Pataisos koeficientas apskaičiuojamas pagal formulę: Ki = Paprastai pateikiama santykinė komponentų pataisos koeficientų išraiška pagal KC16. Ji lygi: = . Procentinė kiekvieno i komponento koncentracija tiriamajame mėginyje pagal metilesterių masę yra: . Rezultatai pateikiami dešimtosios dalies tikslumu. 5.2.2.3. Vidinio standarto vartojimas Atskirais atvejais (pvz., kai nustatomos ne visos riebalų rūgštys, taip pat kai mėginyje yra 4 ir 6 anglies atomų grandinės riebalų rūgštys kartu su 16 ir 18 anglies atomų grandinės rūgštimis arba kai būtina nustatyti tikrąjį riebalų rūgšties kiekį mėginyje) turi būti vartojamas vidinis standartas. Dažniausiai vartojamos 5, 15 ar 17 anglies atomų grandinės riebalų rūgštys. Turi būti nustatomas vidinio standarto pataisos koeficientas. Procentinė i komponento koncentracija (pagal metilesterius) apskaičiuojama pagal formulę: , čia: Ai – i komponento smailės plotas; As – vidinio standarto plotas; K’i – i komponento pataisos koeficientas (pagal KC16); K’s – vidinio standarto pataisos koeficientas (pagal KC16); m – mėginio tiriamosios dalies masė miligramais; ms – vidinio standarto masė miligramais. Rezultatai pateikiami dešimtosios dalies tikslumu. 6. SPECIALUS ATVEJIS – KATAROMETRO (VEIKIANČIO ŠILUMOS LAIDUMO POKYČIŲ MATAVIMO PRINCIPU) NAUDOJIMAS Riebalų rūgščių metilesterių mišinio kokybinei ir kiekybinei analizei gali būti naudojamas dujinis chromatografas su detektoriumi, veikiančiu šilumos laidumo pokyčių matavimo principu. Tuo atveju tyrimo sąlygos, pateiktos 3 ir 4 punktuose, modifikuojamos pagal 3 lentelę. Atliekant kiekybinę analizę, vartojami 5.2.2.2 aprašyti pataisos koeficientai. 3 lentelė Kintamasis Vertė ir sąlygos Kolonėlė Ilgis – nuo 2 m iki 4 m Vidinis skersmuo – 4 mm Įkrova Nuo 160 mm iki 200 mm grūdeliai Nuostoviosios fazės koncentracija Nuo 15 % iki 25 % (m/
m)Nešančiosios dujos Helis arba, jo trūkstant, vandenilis su kuo mažesniu deguonies kiekiu Pagalbinės dujos Nėra Įšvirkštimo sistemos temperatūra Nuo 40 oC iki 60 oC aukštesnė nei kolonėlės Kolonėlės temperatūra Nuo 180 oC iki 200 oC Nešančiųjų dujų greitis Paprastai nuo 60 ml/min iki 80 ml/min Įšvirkšto mėginio tūris Paprastai nuo 0,5 ml iki 2 ml 7. ANALIZĖS ATASKAITA Ataskaitoje turi būti nurodytas taikytas metilesterių paruošimo ir tyrimo metodas bei gauti rezultatai. Joje turi būti suminėtos visos darbo sąlygos, nenurodytos standarte ar laikomos neprivalomomis, taip pat visos aplinkybės, galėjusios turėti įtakos rezultatams. Ataskaitoje turi būti pateikti visi duomenys, būtini mėginiui išsamiai apibūdinti. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 9 B priedas ALYVUOGIŲ IR ALYVUOGIŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ PARUOŠIMAS ĮVADAS Alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejaus metilestriams ruošti rekomenduojami du toliau pateikti metodai: A metodas: esterinimas šaltu kalio šarmo tirpalu; B metodas: metilinimas kaitinant su natrio metilato tirpalu metanolyje ir tolesnis esterinimas rūgščioje terpėje. Metodas pasirenkamas priklausomai nuo analizės rodiklio ir toliau pateiktos aliejaus rūšies. (
a)skirtumo tarp tikrojo ir teorinio trigliceridų su ECN42 (D ECN42) nustatymas: - visų rūšių aliejaus mėginiams, aliejų išvalius praleidžiant per silikagelio kolonėlę, taikomas A metodas; (
b)riebalų rūgščių sudėties nustatymas: - A metodas taikomas tiesiogiai toliau išvardytų rūšių aliejaus mėginiams: - pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus, kurio rūgštingumas mažesnis kaip 3,3 %, - rafinuoto alyvuogių aliejaus, - alyvuogių aliejaus (pirmojo spaudimo ir rafinuoto alyvuogių aliejaus mišinio), - rafinuoto alyvuogių išspaudų aliejaus, - alyvuogių išspaudų aliejaus (pirmojo spaudimo ir rafinuoto alyvuogių išspaudų aliejaus mišinio); - B metodas taikomas tiesiogiai toliau išvardytų rūšių aliejaus mėginiams: - pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus, kurio rūgštingumas didesnis kaip 3,3 %, - alyvuogių išspaudų aliejaus; (
c)riebalų rūgščių trans-izomerų nustatymas: - A metodas taikomas tiesiogiai toliau išvardytų rūšių aliejaus mėginiams: - pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus, kurio rūgštingumas mažesnis kaip 3,3 %, - rafinuoto alyvuogių aliejaus, - alyvuogių aliejaus (pirmojo spaudimo ir rafinuoto alyvuogių aliejaus mišinio), - rafinuoto alyvuogių išspaudų aliejaus, - alyvuogių išspaudų aliejaus (pirmojo spaudimo ir rafinuoto alyvuogių išspaudų aliejaus mišinio); - A metodas taikomas toliau išvardyto aliejaus rūšių mėginiams, aliejų išvalius praleidžiant per silikagelio kolonėlę: - pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus, kurio rūgštingumas didesnis kaip 3,3 %, - alyvuogių išspaudų aliejaus. ALIEJAUS MĖGINIŲ VALYMAS Jeigu reikia, mėginiai valomi aliejų praleidžiant per silikagelio kolonėlę. Plaunama heksano ir dietileterio mišiniu (87:13 tūrių dalimis), kaip pateikta IUPAC 2.507 metode. Kaip alternatyva gali būti taikomas kietafazio ekstrahavimo naudojant silikagelio fazės kasetes metodas. Silikagelio kasetė (1 g, 6
ml)įdedama į vakuuminio eliuavimo aparatą ir plaunama 6 ml heksano. Kad kolonėlė neišdžiūtų, vakuumas išjungiamas ir į kolonėlę supilamas aliejaus (apie 0,12
g)tirpalas heksane. Įjungiamas vakuumas. Tirpalas nusiurbiamas žemyn ir vakuume plaunama 10 ml heksano ir dietileterio mišiniu (87:13 tūrių dalimis). Sujungtos eliuato porcijos homogenizuojamos ir padalijamos į dvi vienodo tūrio dalis. Viena gauto tirpalo dalis sumažintame slėgyje kambario temperatūroje sausai išgarinama naudojant sukamąjį garintuvą. Likutis ištirpinamas 1 ml heptano. Toks tirpalas yra tinkamas riebalų rūgščių analizei dujų chromatografijos (GC) metodu. Kita gauto tirpalo dalis išgarinama, likutis ištirpinamas 1 ml acetono. Šiame tirpale, jei būtina, trigliceridų sudėtis analizuojama efektyviosios skysčių chromatografijos (DESCh) metodu. RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ PARUOŠIMO METODAI 1. A METODAS: PERESTERINAMAS ŠALTU KALIO ŠARMO TIRPALU METANOLYJE 1.1. TAIKYMO SRITIS Greitas metodas tinka alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejui, kuriame laisvųjų riebalų rūgščių kiekis mažesnis kaip 3,3 %. Laisvosios riebalų rūgštys neesterinamos vartojant kalio šarmą. Riebalų rūgščių etilesteriai yra peresterinami žemesniu lygiu nei gliceridų esteriai ir metilinami tik iš dalies. 1.2. METODO ESMĖ Metilesteriai gaunami peresterinant kalio šarmo tirpalu metanolyje tarpinėje stadijoje prieš įvykstant sumuilinimui (5 antraštė, pateikta ISO 5509:2000, 5 antraštė, pateikta IUPAC 2.301 metode). 1.3. REAGENTAI 1.3.1. Metanolis, kuriame yra ne daugiau kaip 0,5 % (masės) vandens. 1.3.2. Heptanas chromatografijai. 1.3.3. Apytikriai 2 N kalio šarmo tirpalas metanolyje. 11,2 g kalio šarmo ištirpinama 100 metanolio. 1.4. ĮRANGA 1.4.1. Užsukami 5 ml mėgintuvėliai su dangteliu, turinčiu polietilenteraftalato (PTFE) tarpinę. 1.4.2. Graduotos ar automatinės 2 ml ir 0,2 ml pipetės. 1.5. DARBO EIGA 1.5.1. Į užsukamą 5 ml mėgintuvėlį pasveriama apie 0,1 g aliejaus mėginio. Pripilama 2 ml heksano ir supurtoma. Pripilama 0,2 ml 2 N kalio šarmo tirpalo metanolyje, užsukamas dangtelis, turintis PTFE tarpinę, ir 30 sekundžių energingai purtoma. Leidžiama išsisluoksniuoti, kol viršutinis tirpalas taps skaidrus. Viršutinis sluoksnis, kuriame yra metilesteriai, dekantuojamas. Tirpalas heptane yra tinkamas švirkšti į dujų chromatografą. Prieš dujų chromatografijos analizę tirpalą patartina laikyti šaldytuve. Nerekomenduojama laikyti tirpalą ilgiau kaip 12 h. 2. B METODAS: METILINIMAS KAITINANT SU NATRIO METILATO TIRPALU METANOLYJE IR TOLESNIS ESTERINIMAS RŪGŠČIOJE TERPĖJE 2.1. TAIKYMO SRITIS Šis metodas taikomas alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejui, kuriame laisvųjų riebalų rūgščių kiekis didesnis kaip 3,3 %. 2.2. METODO ESMĖ Neutralizuojamos laisvosios riebalų rūgštys, vykdoma gliceridų šarminė metanolizė, kurią seka laisvųjų riebalų rūgščių esterinimas rūgščioje terpėje (4.2 antraštė, pateikta IUPAC 2.301 metode). 2.3. REAGENTAI 2.3.1. Heptanas chromatografijai. 2.3.2. Metanolis, kuriame yra ne daugiau kaip 0,5 % (masės) vandens. 2.3.3. 0,2 N natrio metilato tirpalas metanolyje. 5 g natrio ištirpinama 1000 ml metanolio (gali būti naudojami pramoniniai tirpalai). 2.3.4. 0,2 % fenolftaleino tirpalas metanolyje. 2.3.5. 1 N sieros rūgšties tirpalas metanolyje. 3 ml 95 % sieros rūgšties sumaišoma su 100 ml metanolio. 2.3.6. Sotusis vandeninis natrio chlorido tirpalas. 2.4. ĮRANGA 2.4.1. 50 ml plokščiadugnė matavimo kolba ilgu, siauru, šlifo kakleliu. 2.4.2. Grįžtamasis kondensatorius. Oro kondensatorius (1 m ilgio) su šlifo jungtimi, tinkama prijungti prie kolbos. 2.4.3. Virimą reguliuojančios drožlės. 2.4.4. Stiklinis piltuvas. 2.5. DARBO EIGA Į 50 ml matavimo kolbą su šlifo kakleliu įpilama apie 0,25 g aliejaus mėginio. Naudojant piltuvą, pripilama 10 ml 0,2 n natrio metilato tirpalo metanolyje ir įberiama virimą reguliuojančių drožlių. Prijungiamas grįžtamasis šaldytuvas, supurtoma ir virinama. Tirpalas turi nuskaidrėti. Tai paprastai įvyksta per 10 min. Reakcija baigiasi po 15 min. Kolba nuimama nuo kaitinimo šaltinio ir palaukiama, kol metanolis nustos kondensuotis šaldytuve. Nuimamas šaldytuvas ir įpilami du lašai fenolftaleino tirpalo. Pripilama keletas mililitrų 1 N sieros rūgšties tirpalo metanolyje, kol tirpalas taps bespalvis, ir dar 1 ml pertekliaus. Prijungiamas šaldytuvas ir vėl verdama 20 min. Nuimama nuo kaitinimo šaltinio ir atvėsinama tekančio vandens srove. Nuimamas šaldytuvas, įpilama 20 ml sočiojo natrio chlorido tirpalo ir supurtoma. Pripilama 5 ml heptano, kolba užkemšama ir energingai purtoma 15 sekundžių. Leidžiama nusistoti, kol fazės atsiskirs. Vėl pilama sočiojo natrio chlorido tirpalo, kol vandeninis sluoksnis pasieks kolbos kaklelį. Viršutinis sluoksnis, kuriame yra metilesteriai, užpildo kolbos kaklelį. Šis tirpalas yra tinkamas švirkšti į dujų chromatografą. ĮSPĖJIMAS. Metilinimas B metodu turi būti atliekamas traukos spintoje. 3. B METODO ALTERNATYVOS 3.1. C METODAS 3.1.1. METODO ESMĖ Riebalinė medžiaga, kurią ruošiamasi analizuoti, užlydytoje ampulėje veikiama metanolio-hidrochlorido mišiniu, esant 100 oC temperatūrai. 3.1.2 ĮRANGA 3.1.2.1. Apie 5 ml talpos (aukštis nuo 40 mm iki 45 mm, skersmuo nuo 14 mm iki 16
mm)ampulė, pagaminta iš atsparaus stiklo. 3.1.2.2. 1 ir 2 ml matavimo pipetės. 3.1.3. REAGENTAI 3.1.3.1. 2 % druskos rūgšties tirpalas metanolyje. Ruošiamas iš dujinio vandenilio chlorido ir absoliučiojo metanolio (1 pastaba). 3.1.3.2. Heksanas chromatografijai. 1 PASTABA. Gali būti vartojami pramoniniai vandenilio chlorido tirpalai metanolyje. Nedideli kiekiai dujinio vandenilio chlorido gali būti lengvai pagaminti laboratorijoje paprasto išstūmimo būdu, į parduodamą druskos rūgštį (r = 1,18 g/
ml)lašinant koncentruotą sieros rūgštį (r = 1,84 g/ml). Išsiskyrusios dujos lengvai išdžiovinamos, leidžiant per koncentruotą sieros rūgštį. Atsižvelgiant į tai, kad vandenilio chloridas metanolyje tirpsta labai greitai, patartina imtis tirpinant įprastų saugos priemonių, pvz., dujas leisti per mažą apverstą piltuvą, kurio kraštas tik šiek tiek liestų skysčio paviršių. Dideli vandenilio chlorido tirpalo metanolyje kiekiai gali būti ruošiami iš anksto, nes tirpalas gerai išsilaiko šlifo kamščiais užkimštuose ir laikomuose tamsoje buteliuose. Kaip alternatyva, šis reagentas gali būti ruošiamas ištirpinant acetilchloridą bevandeniame metanolyje. 3.1.4. DARBO EIGA 3.1.4.1. Į stiklinę ampulę įdedama 0,2 g riebalinės medžiagos, kuri prieš tai išdžiovinama virš natrio sulfato ir nufiltruojama. Įpilama 2 ml druskos rūgšties tirpalo metanolyje. Ampulė užlydoma. 3.1.4.2. Ampulė 40 minučių panardinama į 100 oC vonią. 3.1.4.3. Ampulė ataušinama vandentiekio vandens srove, atidaroma, įpilama 2 ml distiliuoto vandens ir 1 ml heksano. 3.1.4.4. Centrifuguojama, nupilamas heksano sluoksnis, kuris yra paruoštas naudoti. 3.2. D METODAS 3.2.1. METODO ESMĖ Riebalinė medžiaga, kurią ruošiamasi analizuoti, prijungus grįžtamąjį kondensatorių kaitinama su metanolio-heksano-sieros rūgšties mišiniu. Gauti metilesteriai ekstrahuojami petroleteriu. 3.2.2. ĮRANGA 3.2.1. Apie 20 ml talpos mėgintuvėlis, šlifo jungtimis sujungtas su apie 1 m ilgio oriniu grįžtamuoju kondensatoriumi. 3.2.2. 5 ml graduota pipetė. 3.2.3. 50 ml dalijamasis piltuvas. 3.2.4. 10 ir 25 ml menzūros. 3.2.5. 15 ml mėgintuvėlis kūginiu dugnu. 3.2.3. REAGENTAI 3.2.3.1. Metilinimo reagentas: bevandenio metanolio, heksano ir koncentruotos sieros rūgšties (r = 1,84 g/
ml)mišinys tūrių santykiu 75:25:1. 3.2.3.2. Petroleteris, virimo temperatūra nuo 40oC iki 60oC. 3.2.3.3. Bevandenis natrio sulfatas. 3.2.4. DARBO EIGA 3.2.4.1. 0,1 g aliejaus supilama į 20 ml mėgintuvėlį ir įpilama 5 ml metilinimo reagento. 3.2.4.2. Prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir šildoma 30 minučių verdančio vandens vonioje (2 pastaba). 3.2.4.3. Mišinys kiekybiškai supilamas į 50 ml dalijamąjį piltuvą, tam sunaudojant 10 ml vandens ir 10 ml petroleterio. Stipriai purtoma, sluoksniams leidžiama atsiskirti, vandeninis sluoksnis išleidžiamas, eterinis sluoksnis du kartus plaunamas 20 ml vandens. Į dalijamąjį piltuvą įdedama truputis bevandenio natrio sulfato, suplakama, kelioms minutėms paliekama nusistovėti ir filtruojama, filtratą surenkant 15 ml mėgintuvėlyje su kūginiu dugnu. Tirpiklis išgarinamas ant vandens vonios azoto srovėje. 2 PASTABA. Virimo temperatūrai kontroliuoti į mėgintuvėlį įstatoma stiklinė lazdelė ir vandens vonios temperatūra apribojama 90oC. 4. TIKSLUMAS Statistinis A ir B metodų tikslumo įvertinimas buvo publikuotas Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos metode COI/T.20/CO Nr. 24. REKOMENDACIJOS ALYVUOGIŲ IR ALYVUOGIŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ ANALIZEI DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU 1. DARBO EIGA Riebalų rūgščių tirpalas heksane analizuojamas dujų chromatografijos metodu pagal ISO 5508, naudojant kapiliarinę kolonėlę (ilgis 50 m, vidinis skersmuo 0,25 mm ar 0,32 mm), impregnuotą cianopropilsilikono faze, kaip nurodyta riebalų rūgščių transizomerų nustatymo metode (COI/T.20/Dok. Nr. 17). 1 pav. pateikta tipinė alyvuogių išspaudų aliejaus, kuriame yra riebalų rūgščių metil- ir etilesterių bei metilesterių transizomerų, chromatograma. 2. APSKAIČIAVIMAS 2.1. Riebalų rūgščių sudėtis ir D ECN42 apskaičiuojamos atsižvelgiant į toliau pateiktas riebalų rūgštis: Miristo (C14:0). Palmitino (C16:0). Metil ir etilesterių smailių plotų suma. Palmitoleino (C16:1). Metilesterių w9 ir w7 izomerų smailių plotų suma. Margarino (C17:0). Stearino (C18:0). Oleino (C18:1). Metilesterių w9 ir w7 izomerų, etilesterių ir metilesterių trans-izomerų smailių plotų suma. Linolo (C18:2). Metil- ir etilesterių bei metilesterių trans-izomerų smailių plotų suma. Eikozano (C20:0). Linoleno (C18:3). Metil- ir etilesterių bei metilesterių trans-izomerų smailių plotų suma. Gadoleino (C20:1). Beheno (C22:0). Lignocero (C24:0). Į bendrąjį smailių plotą neįeina skvaleno smailės plotas. 1 pav. Šaltuoju metodu metilinto alyvuogių išspaudų aliejaus chromatograma. Chromatografinės smailės atitinka metil- ir etilesterius, jeigu kitaip nenurodyta. 2.2. Trans C18:1 procentinė koncentracija apskaičiuojama pagal šios rūgšties metilesterių smailės plotą. Bendroji trans C18:2 ir trans C18:3 procentinė koncentracija apskaičiuojama susumavus visų šių dviejų rūgščių trans-izomerų smailių plotus. Bendrasis plotas apskaičiuojamas sumuojant 2.1 punkte nurodytų rūgščių esterių smailių plotus (žr. COI/T.20/Dok. Nr. 17). Procentinė atskirų riebalų rūgščių koncentracija apskaičiuojama pagal formulę: X% = (X smailės plotas ´ 100)/(bendrasis smailių plotas). ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 10 priedas LAKIŲJŲ HALOGENINTŲ TIRPIKLIŲ KIEKIO NUSTATYMAS ALYVUOGIŲ ALIEJUJE 1. METODAS Dujų chromatografinė analizė, taikant lakiųjų medžiagų nustatymo erdvėje virš mėginio (arba garų fazėje virš produkto) metodą. 2. ĮRANGA 2.1. Dujų chromatografijos įrenginys su elektronų pagavos detektoriumi (EPD). 2.2. Lakiųjų medžiagų nustatymo erdvėje virš mėginio įrenginys. 2.3. Stiklinė dujų chromatografinė kolonėlė, ilgis 2 m, skersmuo 2 mm. Nuostovioji fazė paruošiama 10 % OV101 arba atitinkama medžiaga impregnuojant iškaitintą, rūgštyje išplautą diatomitą, kurio dalelių dydis nuo 80 mešų iki 100 mešų. 2.4. Nešančiosios ir pagalbinės dujos: azotas dujų chromatografijai, tinkamas dirbti su elektronų pagavos detektoriumi. 2.5. 10–15 ml padengtos teflonu stiklinės kolbos su aliuminio gaubtuliais ir tarpinėmis švirkštui įdurti. 2.6. Hermetiškai uždarantys fiksatoriai. 2.7. 0,5–2 ml dujų švirkštas. 3. REAGENTAI Standartas: halogeninti tirpikliai, pagal grynumą tinkami dujų chromatografinei analizei. 4. TYRIMAS 4.1. Į stiklinę kolbą (pakartotinai nenaudoti) tiksliai pasveriama apie 3 g aliejaus; kolba sandariai uždaroma. Ji įdedama vienai valandai į termostatą, esant 70 oC temperatūrai. Švirkštu paimama tiksliai nuo 0,2 ml iki 0,5 ml erdvės virš mėginio turinio. Jis įpurškiamas į dujų chromatografinę kolonėlę. Dujų chromatografas turi būti sureguliuojamas taip: – įšvirkštimo sistemos temperatūra – 150 oC, – kolonėlės temperatūra – nuo 70 oC iki 80 oC, – detektoriaus temperatūra – nuo 200 oC iki 250 oC. Temperatūra gali būti kitokia, jei gaunami tokie patys rezultatai. 4.2. Etaloniniai tirpalai. Paruošiami nuo 0,05 mg/kg iki 1 mg/kg halogenintų tirpiklių tirpalai rafinuotame alyvuogių aliejuje, kuriame nėra tirpiklių pėdsakų, etaloniniai tirpalai. Jų koncentracija turi atitikti numatomą koncentraciją mėginyje. Halogeninti tirpikliai gali būti skiedžiami pentanu. 4.3. Kiekybinis vertinimas. Lyginami mėginio ir etaloninio tirpalo, kurio koncentracija laikoma arčiausia nustatomai, smailių plotai arba aukščiai. Jei nuokrypis yra didesnis kaip 10 %, analizė kartojama, lyginant su kitu etaloniniu tirpalu, kol nuokrypis bus 10 % ribose. Kiekis nustatomas pagal atskirų įšvirkštimų rezultatų vidurkį. Rezultatai išreiškiami miligramais kilograme. Metodo tikslumo riba – 0,01 mg/kg. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 11 priedas JUSLINIS PIRMOJO SPAUDIMO ALYVUOGIŲ ALIEJAUS VERTINIMAS 1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS Šiame priede pateikti kriterijai jusliniam tyro aliejaus vertinimui ir nurodyti aliejaus klasifikavimo būdai pagal jo charakteristikas. Šis metodas taikomas jusliškai vertinti ir klasifikuoti pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų pagal malonius pojūčius ir neigiamų pojūčių intensyvumą. Juslinį vertinimą atlieka grupė atrinktų apmokytų degustatorių, kaip nurodyta 4 punkte. 2. BENDRIEJI REIKALAVIMAI Rekomenduojama, kad bendrasis juslinės analizės žodynas, analizės kambarys, bendroji metodologija ir stiklinė aliejui ragauti atitiktų Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos nuorodas. 3. SPECIFINIS ŽODYNAS 3.1. Neabejotini pojūčiai: Vaisių: aromatų grupė (priklausomai nuo rūšies), charakteringa sveikų, šviežių, žalių ar baltų vaisių aliejui, juntama tiesiogiai ar pauosčius. Kartus: skonis, būdingas aliejui, pagamintam iš žalių arba iš pradedančių nokti alyvuogių. Aštrus: geliantis pojūtis, būdingas aliejui, pagamintam derliaus nuėmimo metų pradžioje, pirmiausia iš per žalių alyvuogių. 3.2. Neigiami pojūčiai: „Atrojado“ (sudvisęs): prieskonis, būdingas aliejui, pagamintas iš alyvuogių, kuriose gerokai pasistūmėjo į priekį fermentavimo procesas. Pelėsių-drėgmės: prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam iš alyvuogių, kuriose užsiveisė didelis kiekis grybelių ir mielių bakterijų po to, kai kelias dienas buvo laikomos drėgnos. Purvo nuosėdų: prieskonis, būdingas aliejui, turėjusiam sąlyčio su nuosėdomis cisternose ir požeminėse talpyklose. Vyno-acto: būdingas kai kurių rūšių aliejaus aromatas, primenantis vyną arba actą. Atsiranda daugiausia dėl acto rūgšties, etilacetato ir etanolio susidarymo alyvuogių fermentavimo proceso metu. Metalo: prieskonis, primenantis metalą. Būdingas aliejui, kuris ilgą laiką kontaktavo su metaliniais paviršiais gniuždymo, maišymo, spaudimo arba laikymo metu. Apkartęs: prieskonis, būdingas aliejui, kuriame įvyko oksidacija. Pakaitintas arba pridegęs: prieskonis, būdingas aliejui, kuris buvo per stipriai ir (arba) per ilgai kaitinamas gamybos metu, ypač jei buvo maišoma šiltai ir netinkamomis sąlygomis. Šieno-medžio: prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam iš sudžiūvusių alyvuogių. Sunkus: būdingas kai kurio aliejaus jutimas, kuris ragaujant visoje burnoje sukelia tirštumo, klampumo pojūtį. Tepalo: aromatas, primenantis dyzeliną, tepalą ar mineralinę alyvą. Augalinio vandens: būdingas aliejaus įgautas prieskonis, kuris atsiranda dėl ilgo kontakto su augaliniu vandeniu. Sūrymo: aliejaus, išgauto iš alyvuogių, kurios buvo konservuojamos sūryme, prieskonis. Esparto: prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam alyvuoges spaudžiant naujuose dembliuose iš esparto žolės. Prieskonis gali skirtis pagal tai, ar dembliai pagaminti iš žalios, ar iš džiovintos žolės. Žemių: prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam iš alyvuogių, surinktų kartu su žemėmis arba purvinų ir nenuplautų. Kirmėlių: prieskonis, būdingas aliejui, pagamintam iš alyvuogių, kurias stipriai puolė alyvmedžių musės (Dacus oleae) lervos. Agurkų: aromatas, kuris atsiranda, jei aliejus per ilgai laikomas hermetiškai supakuotas, ypač alavinėse skardinėse, ir kuris priskiriamas 2,6-nonadienaliui. 4. DEGUSTATORIŲ GRUPĖ Degustatorių grupę tvirtina Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos vadovas. Į jos sudėtį gali būti įtraukiami Sveikatos apsaugos ministerijos Respublikinio mitybos centro maisto saugos skyriaus specialistai. Ją turi sudaryti grupės vadovas ir nuo aštuonių iki dvylikos narių. Degustatorių grupės organizatorius turi būti tinkamai parengtas įvairių aliejaus rūšių ekspertas. Jis arba ji yra atsakinga už grupės organizavimą ir veiklą, įskaitant mėginių paruošimą, kodavimą, pateikimą degustatoriams, gautų duomenų surinkimą ir apdorojimą. Jis arba ji atrenka degustatorius, organizuoja jų parengimą ir kontroliuoja, siekdama įsitikinti, ar jų sugebėjimai atitinka reikalavimus. Degustatoriai rengiami ir atrenkami pagal jų sugebėjimus justi skirtumus tarp panašių mėginių. Turi būti laikomasi Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos vadovo nuostatų, susijusių su kvalifikuotų alyvuogių aliejaus degustatorių atranka, parengimu ir monitoringu. Degustatorių grupė turi įsipareigoti dalyvauti nacionaliniuose, Sąjungos ir tarptautiniuose juslinės analizės bandymuose, organizuojamuose atliekant periodinį monitoringą ir harmonizuojant vertinimo kriterijus. Degustatorių grupė kasmet turi pateikti visą informaciją apie grupės sudėtį ir analizių skaičių ją patvirtinusiai šalies narės organizacijai. 5. ALIEJAUS JUSLINIO VERTINIMO IR KLASIFIKAVIMO PROCEDŪRA 5.1. Diagraminio lapo pildymas A priede pateiktas diagraminis lapas, kurį pildo degustatorius. Degustatorius uosto ir ragauja1 analizei skirtą mėginį, kuris yra ragavimo stiklinėje. Jis registruoja uoslės, skonio, lytėjimo ir kinestezinius pojūčius A priede pateiktame diagraminiame lape, užrašydamas skiriamuosius bruožus ir jų stiprumo laipsnį. Jei degustatorius aptinka kokių nors kitų dirgiklių, kurie neatitinka išvardytų aprašymų, jis pažymi juos žemiau skiltyje „kiti“, aprašydamas požymius 3.2 punkte pateiktais terminais, kurie kuo tiksliau apibūdintų dirgiklį. 5.2. Duomenų apdorojimas, atliekamas grupės vadovo Degustatorių grupės vadovas surenka degustatorių užpildytas formas ir patikrina jutimo stiprumą. Jei yra pastebimos anomalijos, grupės vadovas prašo degustatorių patikrinti savo vertinimo lapą ir prireikus pakartoti analizę. Degustatorių grupės vadovas kiekvieno degustatoriaus duomenis apdoroja kompiuterine programa, apskaičiuodamas vidutinę vertę (B priedas). Kiekvieno mėginio tyrimo duomenys registruojami juos pateikiant 10 vertikalių stulpelių lentele 10-čiai juslinių rodiklių ir viena horizontalia eilute kiekvienam degustatoriui. Jeigu daugiau kaip 50 % degustatorių pažymi neigiamą požymį skiltyje „kiti“, vadovas turi apskaičiuoti šio rodiklio vidutinę vertę ir atitinkamai nurodyti mėginio kategoriją. Jeigu analizuojama siekiant nustatyti atitikimą standartams ar atliekant prekybinį vertinimą, grupės vadovas turi organizuoti du analizės pakartojimus ne daugiau kaip vienos dienos intervalais. Rezultatų aritmetinis vidurkis apskaičiuojamas iš trijų vertinimų duomenų, pateiktų diagraminiuose lapuose. 5.3. Aliejaus klasifikavimas Aliejus klasifikuojamas pagal defektų vidutinę vertę ir „vaisių“ pojūčio vidutinę vertę, kaip nurodyta toliau. Suprantama, kad didžiausią įtaką turi intensyviausiai suvokto neigiamo pojūčio vidutinė vertė. Šio neigiamo pojūčio variacijos koeficiento vertė turi būti ne didesnė kaip 20 %. (
a)Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus: defektų vidutinė vertė – 0, „vaisių“ pojūčio vidutinė vertė – daugiau kaip 0. (
b)pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus: defektų vidutinė vertė – daugiau kaip 0, bet ne daugiau kaip 2,5 ir „vaisių“ pojūčio vidutinė vertė – daugiau kaip 0. (
c)paprastasis pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus: defektų vidutinė vertė – daugiau kaip 2,5, bet ne daugiau kaip 6,0; arba defektų vidutinė vertė – ne daugiau kaip 2,5 ir „vaisių“ pojūčio vidutinė vertė – 0. (
d)klasikinis alyvuogių aliejus (Lampante): defektų vidutinė vertė – daugiau kaip 6,0. Nuo 2003 m. lapkričio mėn.
c)ir
d)kategorijos pakeičiamos į; (
c)klasikinis alyvuogių aliejus (Lampante): defektų vidutinė vertė – daugiau kaip 2,5; arba defektų vidutinė vertė – ne daugiau kaip 2,5 ir „vaisių“ pojūčio vidutinė vertė – 0. 5.4. Ypatingas atvejis Jeigu kitų nei „vaisių“ neabejotinų pojūčių vidutinė vertė yra didesnė kaip 5,0, degustatorių grupės vadovas turi tai nurodyti analizės sertifikate. ______________ A PRIEDAS Diagraminis lapas (degustatoriui) PASTEBĖTI DEFEKTAI INTENSYVUMAS ® „Atrojado“ (sudvisęs) I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––––– ® Pelėsių-drėgmės I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Vyno-acto I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Purvo nuosėdų I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Metalo I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Apkartęs I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Kiti (nurodyti) I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– PASTEBĖTI NEABEJOTINI POŽYMIAI ® Vaisių I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Kartus I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Aštrus I¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾––––––––––––––– ® Degustatoriaus pavardė Mėginio kodas Data ______________ B PRIEDAS VIDUTINĖS VERTĖS IR PASIKLIAUTINIŲ INTERVALŲ APSKAIČIAVIMO METODAS Vidutinė vertė Me = [ P (X < Xm) < 1/2 Ù P (X ≤ Xm) ≥ 1/2] Vidutinė vertė yra realus skaičius Xm, apibrėžiamas sąlyga, kad tikimybė (P), jog pasiskirstymo X vertės yra mažesnės už šią vertę (Xm) yra ne didesnė kaip 0,5 ir tuo pačiu tikimybė (P), kad sklaidos (X) vertės yra didesnės už Xm yra ne mažesnė kaip 0,5. Kitame apibrėžime nurodoma, kad vidutinė vertė yra 50-asis skaičių, išrikiuotų didėjimo tvarka, pasiskirstymo procentilis. Kitais terminais, vidutinė vertė yra centrinė vertė tvarkingoje nevienodų skaičių serijoje arba dviejų tvarkingų nevienodų skaičių serijų centrinių verčių vidurkis. Standartinis nuokrypis S = Kad būtų realiai įvertintas pasiskirstymas apie vidutinę vertę, turi būti taikomas Stiuartio ir Kendalio standartinio nuokrypio apskaičiavimo metodas. Asimptotinio standartinio nuokrypio apskaičiavimo formulėje pateiktos N ir IQR vertės. N yra vertinimų skaičius, IQR – interkvartilio sritis, t. y. nagrinėjamų duomenų kintamumo įvertinimas (interkvartilio sritis apima tiksliai 50 % atvejų su bet kuria pasiskirstymo tikimybe). Interkvartilio sritis randama, apskaičiuojant skirtumą tarp 75-tojo ir 25-tojo procentilio. IQR = 75-asis procentilis – 25-asis procentilis Procentilis yra vertė Xpc, apibrėžiama tuo faktu, kad pasiskirstymo žemiau Xpc tikimybė (P) yra ne didesnė kaip šimtoji dalis (nustatytoji) ir tuo pačiu pasiskirstymo aukščiau Xpc tikimybė (P) yra ne mažesnė kaip šimtoji dalis (numatytoji). Šimtoji dalis parodo naudotą pasiskirstymo frakciją. Vidutinės vertės atveju šimtoji dalis yra 50/100. Procentilis = [ P (X < Xpc) ≤ Ù P (X ≤ Xpc) ≥ ] Kitais žodžiais procentilis yra pasiskirstymo vertė, atitinkanti nustatytą plotą pasiskirstymo ar tankio kreivėje. Pvz., 25-asis procentilis parodo pasiskirstymo vertę, atitinkančią 0,25 ar 25/100 ploto. Variacijos koeficientas CVR = 100 RVC yra bedimensinis skaičius, parodantis procentinį analizuotų skaičių serijų kintamumo santykį su vidutinės vertės Av. Todėl variacijos koeficientas labai naudingas patikrinti grupės narių patikimumą. Pasikliautiniai 95 % vidutinės vertės intervalai Pasikliautiniai 95 % vidutinės vertės intervalai (C. I.) (pirmosios rūšies paklaidos vertė lygi 0,05 ar 5 %) parodo sritį, kurioje gali kisti vidutinė vertė, atliekant neribotą skaičių eksperimentų. Praktiškai šis intervalas parodo pasirinktomis sąlygomis atliekamo tyrimo variantiškumo sritį, kurioje tyrimą galima pakartoti keletą kartų. Intervalai, kaip ir RVC, padeda patikrinti analizės patikimumą. Apatinis C. I= Av + (c. S) Viršutinis C. I. = Av – (c. S) Čia: c, esant 0,95 pasikliautiniam intervalui, yra lygus 1,96. Aliejus klasifikuojamas lyginant vidutines vertes su vertėmis, pateiktomis 5.3 punkte. Naudojantis kompiuterinėmis programomis galima klasifikuoti vizualiai, naudojantis statistinėmis – lentelėmis ar grafiškai. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 12 priedas ALYVUOGIŲ ALIEJAUS NEUTRALIZAVIMAS IR BALINIMAS LABORATORIJOJE 1. ALIEJAUS NEUTRALIZAVIMAS 1.1. ĮRANGA - aukšta 300 ml cheminė stiklinė, – laboratorinė centrifuga su 100 ml mėgintuvėliais, – 250 ml cheminė stiklinė, – 100 ml apvaliadugnės kolbos, – 1 l dalijamasis piltuvas. 1.2. REAGENTAI – 12 % natrio šarmo vandeninis tirpalas, – 1 % fenolftaleino tirpalas etanolyje, – analitiškai grynas heksanas, – analiziškai grynas 2-propanolis. 1.3. DARBO EIGA (
a)Aliejus, kuriame laisvųjų riebalų rūgščių kiekis pagal oleino rūgšį, mažesnis kaip 30 % 50 g neapdoroto aliejaus įpilama į aukštą 300 ml stiklinę ir pašildoma vandens vonioje iki 65 oC. Visą laiką nestipriai maišant, įpilama 12 % natrio šarmo tirpalo, kurio kiekis atitiktų laisvųjų rūgščių kiekį aliejuje, ir dar 5 % pertekliaus. Maišoma dar penkias minutes, palaikant 65 oC temperatūrą. Mišinys supilamas į 100 ml centrifugavimo mėgintuvėlius, muilo pavidalo masė atskiriama centrifuguojant. Dekantuotas aliejus supilamas į 250 ml cheminę stiklinę ir plaunamas 50–60 ml verdančio distiliuoto vandens, vandenį nusiurbiant sifonu. Plovimas kartojamas tol, kol visiškai nelieka muilo pėdsakų (išnyksta rožinė fenolftaleino spalva). Aliejus centrifuguojamas, kad būtų pašalinti visi maži likusio vandens kiekiai. (
b)Aliejus, kuriame laisvųjų riebalų rūgščių kiekis pagal oleino rūgštį didesnis kaip 30 % Į dalijamąjį piltuvą įpilama 50 g neapdoroto aliejaus, 200 ml heksano, 100 ml 2-propanolio ir 12 % natrio šarmo tirpalo, kurio kiekis atitiktų laisvosios rūgšties kiekį aliejuje, ir dar 0,3 % pertekliaus. Mišinys vieną minutę energingai maišomas. Įpilama 100 ml distiliuoto vandens, vėl maišoma ir paliekama stovėti. Sluoksniams atsiskyrus, apatinis sluoksnis su muilu išpilamas. Tarp dviejų sluoksnių (aliejingas viršuje ir vandeninis apačioje) dažnai susidaro tarpinis gleivių ir netirpių medžiagų sluoksnis, kuris taip pat turi būti pašalintas. 2. NEUTRALIZUOTO ALIEJAUS BALINIMAS 2.1. ĮRANGA – apvaliadugnė kolba su trimis šlifo kaklais, į kuriuos įstatomi: (
a)graduotas termometras, kuriuo būtų galima matuoti 90 oC temperatūrą; (
b)mechaninis maišiklis, dirbantis 250–300 apsisukimų per minutę greičiu ir pritaikytas dirbti vakuume; (
c)vakuuminio siurblio jungtis, – vakuuminis siurblys, galintis sukurti 15–30 milibarų liekamąjį slėgį, su manometru. 2.2. DARBO EIGA Trikaklėje kolboje pasveriama apie 100 g neutralizuoto aliejaus. Įstatomi termometras ir maišiklis, prijungiamas vakuuminis siurblys ir šildoma iki 90oC, visą laiką maišant. Nenustojant maišyti ši temperatūra laikoma tol, kol iš analizuojamo aliejaus visiškai pašalinamas vanduo (apie 30 minučių). Tuomet vakuumas atjungiamas ir įdedama 2-3 g aktyvinto diatomito. Vėl prijungiamas vakuumas, kol gaunamas 15–30 milibarų liekamasis slėgis, ir, palaikant 90 oC temperatūrą, 30 minučių maišoma maždaug 250 apsisukimų per minutę greičiu. Kol dar karštas, aliejus filtruojamas termostatuojamoje džiovinimo spintoje (50-60oC). ______________ Techninio reglamento nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 13 priedas ALIEJAUS KIEKIO ALYVUOGIŲ IŠSPAUDOSE NUSTATYMAS 1. ĮRANGA – tinkamas ekstrahavimo aparatas su 200–250 ml apvaliadugne kolba, – elektra kaitinama vonia (pvz., smėlio vonia, vandens vonia) arba elektrinė viryklė, – analizinės svarstyklės, – džiovinimo spinta, reguliuojama iki ne aukštesnės kaip 80 oC temperatūros, – elektrinė džiovinimo spinta su termostatu 103 ± 2 oC temperatūrai palaikyti, per kurią būtų galima pūsti orą ir dirbti sumažintame slėgyje, – mechaninis, lengvai valomas malūnas, kuriame alyvuogių atliekos gali būti sumaltos nepakeliant jų temperatūros arba jose žymiai nepakeičiant drėgnio, lakiųjų arba heksanu ekstrahuojamų medžiagų kiekio, – ekstrahavimo tūta ir vata arba filtravimo popierius, iš kurių yra pašalintos heksanu ekstrahuojamos medžiagos, – eksikatorius, – sietas su 1 mm skersmens akutėmis, – iš anksto išdžiovintos pemzos gabaliukai. 2. REAGENTAI Techninis n-heksanas, kurio 100 ml visiškai išgarinus turi likti ne didesnės kaip 0,002 g masės likutis. 3. DARBO EIGA 3.1. Tiriamojo mėginio ruošimas Prireikus sumalti tiriamąjį mėginį, kad visos jo dalelės sumažėtų iki sijojamo dydžio, naudojamas mechaninis malūnas, kuris prieš tai gerai išvalomas. Apie dvidešimtoji mėginio dalis sunaudojama išvalyti malūną, sumalta medžiaga išmetama, likusi dalis malama, surenkama, kruopščiai sumaišoma ir iš karto analizuojama. 3.2. Tiriamoji dalis Sumalus tyrimui 0,01 g tikslumu pasveriama apie 10 g bandinio. 3.3. Ekstrahavimo tūtos ruošimas Tiriamoji dalis sudedama į tūtą, kuri užkemšama vata. Jei naudojamas filtruojamasis popierius, tiriamoji dalis suvyniojama į jį. 3.4. Išankstinis džiovinimas Jei alyvuogių išspaudos yra labai drėgnos (t. y. drėgnio ir lakiųjų medžiagų kiekis didesnis kaip 10 %), jos iš anksto džiovinamos, užpildytą tūtą (arba filtruojamąjį popierių) laikant reikiamą laiką džiovinimo spintoje, ne aukštesnėje kaip 80 oC temperatūroje, kad drėgnio ir lakiųjų medžiagų kiekis būtų mažesnis kaip 10 %. 3.5. Apvaliadugnės kolbos ruošimas Kolba su vienu arba dviem gabaliukais pemzos, prieš tai išdžiovinta džiovinimo spintoje 103 ± 2 oC temperatūroje ir ne trumpiau kaip valandą atvėsinta eksikatoriuje, pasveriama 1 mg tikslumu. 3.6. Pradinis ekstrahavimas Į ekstrahavimo aparatą įdedama tūta (arba filtruojamasis popierius) su tiriamąja dalimi. Į kolbą įpilamas reikiamas kiekis heksano. Kolba prijungiama prie ekstrahavimo aparato ir įstatoma į elektra šildomą vonią. Šildoma taip, kad tekėjimo atgal greitis būtų ne mažesnis kaip trys lašai per sekundę (vidutinis, ne audringas virimas). Po keturių ekstrahavimo valandų paliekama atvėsti. Tūta išimama iš ekstrahavimo aparato ir įsigėrusio didesnei tirpiklio daliai pašalinti pakišama po oro srove. 3.7. Antrasis ekstrahavimas Tūtos turinys iškratomas į mažą grūstuvę ir kiek galima smulkiau sumalamas. Sumaltas mišinys be nuostolių vėl supilamas į tūtą, kuri dedama atgal į ekstrahavimo aparatą. Ekstrahuojama dar dvi valandas toje pačioje apvaliadugnėje kolboje su pradiniu ekstraktu. Ekstrahavimo kolboje gautas tirpalas turi būti skaidrus. Jei taip nėra, tirpalas filtruojamas per filtruojamąjį popierių, kolba, kurioje jis buvo laikomas, bei filtravimui naudotas popierius kelis kartus plaunami heksanu. Filtratas ir plovimo tirpiklis supilami į antrą išdžiovintą ir pasvertą 1 mg tikslumu apvaliadugnę kolbą. 3.8. Tirpiklio šalinimas ir ekstrakto svėrimas Didesnė tirpiklio dalis pašalinama distiliuojant ant elektra šildomos vonios. Paskutiniai tirpiklio pėdsakai šalinami kolbą 20 minučių kaitinant džiovinimo spintoje 103 ± 2 oC temperatūroje. Tirpiklis greičiau pašalinimas pučiant orą, geriausia inertines dujas, arba džiovinant sumažintame slėgyje. Kolba ne trumpiau kaip valandą paliekama atvėsti eksikatoriuje ir pasveriama 1 mg tikslumu. Kolba dar kartą šildoma 10 minučių tomis pačiomis sąlygomis, ataušinama eksikatoriuje ir vėl pasveriama. Dviejų svėrimų skirtumas neturi viršyti 10 mg. Jei jis didesnis, šildoma dar po 10 minučių, paskui aušinama ir sveriama, kol skirtumas sumažėja iki 10 mg arba mažiau. Paskutinė kolbos masės vertė užrašoma. Atliekama pakartotinė to paties mėginio analizė. 4. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS 3.1. Apskaičiavimo metodas ir formulė (
a)Ekstrakto kiekis analizei gauto mėginio masės procentais skaičiuojamas pagal formulę: S = m1 ´ , čia: S – ekstrakto kiekis analizei gauto mėginio masės procentais, m0 – mėginio tiriamosios dalies masė gramais, m1 – išdžiovinto ekstrakto masė gramais. Rezultatu imamas pakartotinių nustatymų vidurkis, jei buvo laikomasi pakartojamumo sąlygų. Rezultatas skaičiuojamas vieno ženklo po kablelio tikslumu. (
b)Ekstrakto kiekis išdžiovinto mėginio masės procentais apskaičiuojamas pagal formulę: S ´ = aliejaus ekstrakto kiekis sausos medžiagos procentais čia: S – ekstrakto kiekis analizei gauto bandinio masės procentais (žr. (a)), U – drėgnio ir lakiųjų medžiagų kiekis bandinyje. 4.2. Pakartojamumas Vieno analitiko vienas po kito atliktų dviejų atskirų tyrimų rezultatų skirtumas neturi viršyti 0,2 g heksano ekstrakto 100 gramų bandinio. Jei ši sąlyga neįvykdoma, analizė pakartojama su kitomis dviem mėginio dalimis. Jei ir šiuo atveju skirtumas didesnis kaip 0,2 g, rezultatu imamas šių keturių nustatymų aritmetinis vidurkis. ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 14 priedas JODO SKAIČIAUS NUSTATYMAS 1. TAIKYMO SRITIS Šiame tarptautiniame standarte pateiktas gyvūninių ir augalinių riebalų bei aliejaus, toliau vadinamų riebalais, jodo skaičiaus nustatymo metodas. 2. APIBRĖŽIMAS Šiame standarte pavartotas terminas: Jodo skaičius. Standarte nurodytomis sąlygomis absorbuoto jodo masė. Jodo skaičius išreiškiamas jodo gramais 100 g mėginio. 3. METODO ESMĖ Tiriamoji mėginio dalis ištirpinama tirpiklyje ir pripilama Wijs reagento. Praėjus nustatytam laikui, įpilama kalio jodido tirpalo bei vandens ir išsiskyręs jodas titruojamas natrio tiosulfato tirpalu. 4. REAGENTAI Visi reagentai turi būti analiziškai gryni. 4.1. Vanduo, atitinkantis ISO 3696 3 rūšies reikalavimus. 4.2. 100 g/l vandeninis kalio jodido tirpalas. Tirpale negali būti laisvo jodo ar jodytų. 4.3. Krakmolo tirpalas. 5 g tirpaus krakmolo ištirpinama 30 ml vandens. Mišinys supilamas į 1000 ml verdančio vandens, tris minutes virinama ir paliekama atvėsti. 4.4. 0,1 mol/l standartinis titruotasis natrio tiosulfato c (Na2S2O3 * 5H2O) tirpalas. Standartizuotas ne anksčiau kaip prieš 7 dienas iki vartojimo. 4.5. Tirpiklis, paruošiamas sumaišant lygias cikloheksano ir acto rūgšties tūrio dalis. 4.6. „Wijs“ reagentas, jodo monochlorido tirpalas acto rūgštyje. Gali būti vartojamas pramoninis „Wijs“ reagentas. 5. ĮRANGA Įprasta laboratorinė įranga, ir ypač toliau išvardyta: 5.1. Tinkami mėginiui pasverti ir telpantys į kolbas (5.2) stikliniai svėrimo samteliai. 5.2. Visiškai sausos 500 ml Erlenmejerio kolbos su šlifo kamščiais. 6. TIRIAMOJO MĖGINIO RUOŠIMAS Homogenizuotas mėginys džiovinamas virš natrio sulfato ir filtruojamas. 7. TYRIMAS 7.1. Tiriamoji dalis Tiriamosios dalies masė priklauso nuo numatomo jodo skaičiaus, kaip pateikta 1-ojoje lentelėje. 1 lentelė Numatomas jodo skaičius Tiriamosios dalies masė, g mažesnis kaip 5 3,00 5–20 1,00 2–50 0,40 51–100 0,20 101–150 0,13 151–200 0,10 Tiriamoji dalis 0,1 mg tikslumu pasveriama stikliniame samtelyje (5.1). 7.2. Analizė Tiriamoji dalis supilama į 500 ml kolbą (6.2). Ji ištirpinama 20 ml tirpiklio (4.5). Pripilama tiksliai 25 ml Wijs reagento (4.6), užkemšama kamščiu, turinys sumaišomas ir kolba pastatoma tamsioje vietoje. Wijs reagento negalima siurbti į pipetę burna. Taip pat paruošiamas ir tuščiasis mėginys. Jam imamas tik tirpiklis ir Wijs reagentas. Jei mėginio jodo skaičius mažesnis kaip 150, kolba tamsoje paliekama vieną valandą. Jei jodo skaičius didesnis kaip 150 arba produktai yra polimerizuoti arba smarkiai oksiduoti, kolba paliekama stovėti dvi valandas. Pasibaigus reakcijos laikui, į kiekvieną kolbą įpilama 20 ml kalio jodido tirpalo (4.2) ir 150 ml vandens (4.1). Titruojama standartiniu titruotuoju natrio tiosulfato tirpalu (4.4), kol geltona jodo spalva beveik išnyksta. Įlašinami keli lašai krakmolo tirpalo (4.3) ir titravimas tęsiamas intensyviai maišant, kol išnyksta mėlyna spalva. PASTABA. Gali būti taikomas potenciometrinis ekvivalentinio taško nustatymo metodas. 7.3. Tyrimų skaičius Tas pats mėginys analizuojamas du kartus. 8. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Jodo skaičius apskaičiuojamas pagal formulę: , čia: c – tiksli suvartoto standartinio titruotojo natrio tiosulfato tirpalo (4.4) koncentracija moliais litre; V1 – tuščiajam tyrimui suvartoto standartinio titruotojo natrio tiosulfato tirpalo (4.4) tūris mililitrais; V2 – tyrimui suvartoto standartinio titruotojo natrio tiosulfato tirpalo (4.4) tūris mililitrais; m – tiriamosios dalies (7.1) masė gramais. Rezultatu imamas dviejų tyrimų aritmetinis vidurkis, jei atitinka pakartojamumo sąlygas ______________ Techninio reglamento, nustatančio alyvuogių aliejaus analizės metodus, 15 priedas STIGMASTADIENŲ KIEKIO NUSTATYMAS AUGALINIAME ALIEJUJE 1. APIMTIS Pateiktas stigmastadienų kiekio nustatymas augaliniame aliejuje, turinčiame mažą šių angliavandenilių kiekį, ypač tyrame alyvuogių aliejuje ir alyvuogių išspaudų aliejuje. 2. TAIKYMO SRITIS Šis standartas taikomas visų rūšių augaliniam aliejui, nors matavimai yra patikimi tik tuo atveju, kai šių angliavandenilių kiekis yra nuo 0,01 mg/kg iki 4,0 mg/kg. Metodas ypač tinka nustatyti rafinuoto augalinio aliejaus (alyvuogių, alyvuogių išspaudų aliejaus, saulėgrąžų aliejaus, palmių aliejaus ir t. t.) buvimą pirmojo spaudimo alyvuogių aliejuje, nes rafinuotame aliejuje randama stigmastadienų, o pirmojo spaudimo aliejuje jų nerandama. 3. METODO ESMĖ Atskiriamos nesumuilinamosios medžiagos. Silikageliu užpildytoje stiklinėje chromatografijos kolonėlėje išskiriama steroidinių angliavandenilių frakcija, kuri analizuojama dujų chromatografijos kapiliarinėje kolonėlėje metodu. 4. ĮRANGA 4.1. 250 ir 500 ml kolbos, pritaikytos naudoti su grįžtamuoju kondenstoriumi. 4.2. Dalijamieji 500 ml piltuvai. 4.3. 100 ml apvaliadugnės kolbos. 4.4. Sukamasis garintuvas. 4.5. Stiklinė chromatografinė kolonėlė (vidinis skersmuo nuo 1,5 cm iki 2,0 cm, ilgis 50
cm)su teflono čiaupu ir stiklo vatos kamščiu arba sukepinto stiklo disku apačioje. Ruošiant kolonėlę su silikageliu, į ją įpilama apie 5 cm heksano, vėliau užpildoma silikagelio suspensija

DI paaiškinimas pagal oficialų įstatymo tekstą. Orientacinis, nepakeičia teisinės konsultacijos.