LIETUVOS RESPUBLIKOS

LIETUVOS RESPUBLIKOS LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS AUGALŲ APSAUGOS TARNYBOS VIRŠININKAS Į S A K Y M A S DĖL RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO METODIKOS PATVIRTINIMO 2007 m. balandžio 3 d. Nr. A1-092 Vilnius Vadovaudamasis Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kenksmingojo organizmo fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo taisyklių, patvirtintų Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2007 m. vasario 28 d. įsakymo Nr. 3D-98 (Žin., 2007, Nr. 29-1062), 2 punktu, tvirtinu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. diagnozavimo, aptikimo ir identifikavimo metodiką (pridedama). VIRŠININKAS                                                                                   EDMUNDAS MORKEVIČIUS ______________ PATVIRTINTA Valstybinės augalų apsaugos tarnybos viršininko 2007 m. balandžio 3 d. įsakymu Nr. A1-092 RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO METODIKA Ši metodika parengta vadovaujantis ir įgyvendinant 2006 m. liepos 14 d. Komisijos direktyvą 2006/63/EB, iš dalies keičiančią Tarybos direktyvos 98/57/EB dėl Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolės II-VII priedus (OL, 2006, L 206, p. 36). Šioje metodikoje pateikiami bakterijos Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al, sukeliančios rudąjį puvinį, nustatymo ir diagnozavimo metodai. TYRIMŲ PLANO TAIKYMO SRITIS Pateiktame plane apibūdinamos įvairios procedūros atliekamos: i) diagnozuojant bulvių stiebagumbių rudąjį puvinį ir bulvių, pomidorų bei kitų augalų šeimininkų bakterinį vyrulį; ii) aptinkant Ralstonia solanacearum bulvių stiebagumbių, bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose, vandenyje ir dirvožemyje; iii) identifikuojant Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). BENDRIEJI PRINCIPAI Įvairios optimizuotos metodikos, patvirtinti reagentai ir duomenys apie pasiruošimą testui bei kontrolines medžiagas pateikiami priedėliuose. Laboratorijų, dalyvavusių optimizuojant ir tvirtinant darbo taisykles, sąrašas pateikiamas 1 priedėlyje. Kadangi metodikose numatytas karantininio organizmo nustatymas ir gyvybingos R. solanacearum kultūros bus naudojamos kaip kontrolinė medžiaga, procedūras reikės atlikti karantino sąlygomis, naudojantis atitinkamais atliekų pašalinimo įrenginiais ir sąlygomis, kurias licencijavo oficialios augalų karantino institucijos. Testavimo parametrai privalo užtikrinti nuolatinį ir atkartojamą R. solanacearum nustatymo lygmenį esant nustatytoms pasirinktų metodų nustatymo jautrumo slenkstinėms riboms. Privaloma tiksliai paruošti teigiamas kontrolines medžiagas. Atliekant testą atsižvelgus į reikalaujamas metodo jautrumo slenkstines ribas taip pat padaroma prielaida, kad reikia pasirinkti teisingus nustatymus, atlikti įrangos kalibravimą ir techninę priežiūrą, rūpestingai tvarkyti ir saugoti reagentus ir imtis visų priemonių, kad būtų išvengta kryžminės taršos tarp bandinių, t. y. teigiamus kontrolinius bandinius atskiriant nuo tiriamųjų bandinių. Siekiant išvengti administracinių ir kitokių klaidų, ypač susijusių su ženklinimu etiketėmis ir dokumentų tvarkymu, privaloma taikyti kokybės kontrolės standartus. Įtarus organizmo buvimą, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 4 straipsnio 2 dalyje, daroma prielaida, kad atliekant bandinio diagnostinį arba atrankos testą gaunamas teigiamas rezultatas, kaip nurodyta vaizduojamose diagramose. Jei pirmojo atrankos testo (IF arba PGR/FISH) rezultatas teigiamas, jį privaloma patikrinti atliekant antrąjį atrankos testą, pagrįstą kitokiu biologiniu principu. Jei pirmojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtariamas užkrėtimas R. solanacearum ir privaloma atlikti antrąjį atrankos testą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtarimas (įtariamas buvimas) patvirtinamas ir būtina toliau atlikti plane nurodytus testus. Jei antrojo atrankos testo rezultatas neigiamas, tada bandinys nėra laikomas užkrėstu R. solanacearum. Patvirtinimo buvimas, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 5 straipsnio 1 dalyje, reiškia, kad buvo išskirta ir identifikuota grynoji R. solanacearum kultūra ir patvirtintas jos patogeniškumas. I SKIRSNIS TYRIMŲ PLANO TAIKYMAS 1. Nustatymo, kuriuo siekiama diagnozuoti ii. solanacearum sukeliamą bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų, turinčių rudojo puvinio ar bakterinio vytulio simptomų, rudąjį puvinį ar bakterinį vytulį, planas. Šis tyrimas yra taikomas tiriant bulvių stiebagumbius ir bulvinių šeimos augalus, turinčius arba įtariamus turint tipinių rudojo puvinio ar vaskuliarinio vytimo simptomų. Jį sudaro greitos atrankos testas ir patogeno išskyrimas iš užkrėsto vaskuliarinio audinio, pasėjimas į (selektyvią) kultūrinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, Ralstonia solanacearum kultūros identifikavimas. (1) Simptomai aprašyti II skirsnio 1 dalyje. (2) Greitieji diagnostiniai testai palengvina spėjamąją diagnozę, tačiau nėra privalomi. Neigiamas rezultatas ne visada garantuoja patogeno nebuvimą. (3) Stiebo apytakinio audinio gleivių siūlų susidarymo testas aprašytas VI skirsnio A dalies 1 punkte. (4) Olibetahidroksibutirato granulių nustatymo bakterinėse ląstelėse testas aprašytas VI skirsnio A dalies 2 punkte. (5) Bakterinių gleivių arba simptominio audinio ekstraktų serologinės agliutinacijos testai aprašyti VI skirsnio A dalies 3 punkte. (6) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų IF testas aprašytas VI skirsnio A dalies 5 punkte. (7) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų FISH testas aprašytas VI skirsnio A dalies 7 punkte. (8) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų imunofermentinės analizės testas (ELISA) aprašytas VI skirsnio A dalies 8 punkte. (9) Bakterinių gleivių vandeninės suspensijos arba simptominio audinio ekstraktų PGR aprašyta VI skirsnio A dalies 6 punkte. (10) Paprastai patogeninis organizmas išskiriamas iš simptomatinės augalinės medžiagos praskiedžiamuoju pasėjimu į terpę (II skirsnio 3 dalis). (11) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte. (12) Paskesniuose užkrėtimo etapuose organizmo auginimas gali būti slopinamas dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba peraugimo. Jei ligos simptomai tipiški, o išskyrimo testo rezultatai neigiami, tai išskyrimo testą reikia pakartoti, pirmiausia atliekant selektyvaus pasėjimo į terpę testą. (13) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti VI skirsnio B dalyje aprašytais testais. Kiekvienu nauju atveju rekomenduojama atlikti štamo apibūdinimą. (14) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje. 2. Ralstonia solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose planas Principas: Tyrimo procedūra skirta bulvių stiebagumbių latentinėms infekcijoms nustatyti. Mažiausiai du atrankos testai, paremti skirtingais biologiniais principais, turi būti teigiami, kad papildomai būtų išskirtas patogenas ir tipiškų kolonijų išskyrimo atveju patvirtinta gryna kultūra kaip R. solanacearum štamas. Tik vieno atrankos testo teigiamo rezultato nepakanka bandiniui įtarti. Atrankos testų ir išskyrimo testų nustatymo jautrumo slenkstinė riba turėtų siekti 103–104 ląstelių/ml pakartotinai suspenduotose nuosėdose, naudojamose kaip teigiama kontrolė atliekant kiekvieną testų seriją. (1) Standartinį bandinį sudaro 200 stiebagumbių, tačiau galima naudoti mažesnius bandinius, jeigu negalima gauti 200 stiebagumbių. (2) Patogeno ekstrakcijos ir koncentravimo metodai aprašyti III skirsnio 1 punkto 1 papunktyje. (3) Jei mažiausiai dviejų testų, besiskiriančių pagal biologinius atlikimo principus, rezultatai teigiami, būtina atlikti išskyrimą ir patvirtinimą. Atliekamas bent vienas atrankos testas. Jei šio testo rezultatas neigiamas, bandinys laikomas neigiamu. Jei šio testo rezultatas teigiamas, reikalaujama atlikti du ar daugiau atrankos testų, besiskiriančių pagal biologinius principus, pirmajam teigiamam rezultatui patvirtinti. Jei antrasis ar kiti testai yra neigiami, bandinys laikomas neigiamu. Paskesnių testų nereikalaujama atlikti. (4) IF testas aprašytas VI skirsnio A dalies 5 punkte. (5) Selektyvaus išskyrimo testas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte. (6) PGR testai aprašyti VI skirsnio A dalies 6 punkte. (7) FISH testas aprašytas VI skirsnio A dalies 7 punkte. (8) Imunofermentinės analizės (ELISA) testas aprašytas VI skirsnio A dalies 8 punkte. (9) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte. (10) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte. (11) Auginimas terpėje arba biotestai gali nepavykti dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba vykdomo slopinimo. Jei atrankos testų rezultatai teigiami, tačiau išskyrimo testų rezultatai neigiami, reikia pakartoti išskyrimo iš tų pačių nuosėdų testus arba, naudojant to paties bandinio papildomą vaskuliarinį audinį, paimtą šalia stiebagumbių viršūnės gabaliukų išpjovimo vietos, arba, jei būtina, ištirti papildomus bandinius. (12) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti atlikus VI skirsnio B dalyje aprašytus testus. (13) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje. 3. Ralstonia solanacearum nustatymo ir identifikavimo bulvių, pomidorų ar kitų augalų šeimininkų besimptominiuose bandiniuose planas (1) Žr. III skirsnio 2 dalies 1 punktą dėl rekomenduotinų bandinio dydžių. (2) Patogeninio ekstrakcijos ir koncentravimo metodai aprašyti III skirsnio 2 dalies 1 punkte. (3) Jei mažiausiai dviejų testų, besiskiriančių pagal biologinius atlikimo principus, rezultatai teigiami, būtina atlikti išskyrimą ir patvirtinimą. Atliekamas bent vienas atrankos testas. Jei šio testo rezultatas neigiamas, bandinys laikomas neigiamu. Jei šio testo rezultatas teigiamas, reikalaujama atlikti du ar daugiau atrankos testų, besiskiriančių pagal biologinius principus, pirmajam teigiamam rezultatui patvirtinti. Jei antrasis ar kiti testai yra neigiami, bandinys laikomas neigiamu. Paskesnių testų nereikalaujama atlikti. (4) Selektyvus išskyrimas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte. (5) IF testas aprašytas VI skirsnio A dalies 5 punkte. (6) PGR testas aprašytas VI skirsnio A dalies 6 punkte. (7) FISH testas aprašytas VI skirsnio A dalies 7 punkte. (8) Imunofermentinė analizė (ELISA) aprašyta VI skirsnio A dalies 8 punkte. (9) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte. (10) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte. (11) Auginimas terpėje arba biotestai gali nepavykti dėl saprofitinių bakterijų konkurencijos arba vykdomo slopinimo. Jei atrankos testų rezultatai teigiami, tačiau išskyrimo testų rezultatai neigiami, reikia pakartoti išskyrimo iš tų pačių nuosėdų testus arba, naudojant to paties bandinio papildomą vaskuliarinį audinį, paimtą šalia stiebagumbių viršūnės gabaliukų išpjovimo vietos, arba, jei būtina, ištirti papildomus bandinius. (12) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti atlikus VI skirsnio B dalyje aprašytus testus. (13) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje. II SKIRSNIS RALSTONIA SOLANACEARUM NUSTATYMO BULVIŲ STIEBAGUMBIUOSE IR BULVIŲ, POMIDORŲ IR KITUOSE AUGALUOSE ŠEIMININKUOSE, TURINČIUOSE RUDOJO PUVINIO ARBA BAKTERINIO VYTULIO POŽYMIŲ, IŠSAMŪS METODAI 1. Simptomai (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main) 1.1. Bulvių simptomai Bulvės augalas. Pirmoji užkrėtimo stadija – viršutinių augalo lapų vytimas esant aukštai dienos temperatūrai ir atsigavimas naktį. Ankstyvojo užkrėtimo metu vystantys lapai išlieka žali, tačiau vėliau pageltonuoja ir vystosi rudoji nekrozė. Gali pasitaikyti ir epinastijų. Tačiau labai greitai lapai negrįžtamai nuvysta ir augalas žūva. Skersai nupjautų nuvytusių augalų stiebų apytakinis audinys gali paruduoti, ir iš nupjauto paviršiaus išsiskiria arba gali būti lengvai išspaudžiamos į pieną panašios išskyros. Nupjautą stiebą vertikaliai panardinus į vandenį, iš apytakinių pluoštų nusidriekia gleivių siūlai. Bulvės stiebagumbis. Bulvės stiebagumbis turi būti perpjaunamas skersai arti stolonų prisisegimo vietos. Ankstyvajai užkrėtimo stadijai būdingas apytakinio žiedo išblukimas, spalva keičiasi nuo blizgančios geltonos iki šviesiai rudos spalvos. Iš apytakinio žiedo po kelių minučių spontaniškai išsiveržia šviesiai kreminės spalvos išskyros. Vėliau apytakinis išblukimas paruduoja, ir nekrozė gali išsiplėsti iki parenchimos. Progresuojančios ligos stadijose užkrečiančios bakterijos išsiveržia iš stolono prisisegimo vietos ir akučių, dėl to prie bakterijų gleivių prilimpa dirvos dalelės. Dėl vidinių vaskuliarinių audinių suirimo odelėje gali atsirasti lengvai įdubusių raudonai rudų pažeidimų. Paskesnėms ligos stadijoms būdingas grybų ir bakterijų sukeliamo šlapiojo puvinio susidarymas. 1.2. Pomidorų simptomai Pomidoro augalas. Pirmasis pastebimas požymis – tai labai glebni jauniausi augalo lapeliai. Palankiomis patogenui aplinkos sąlygomis (dirvos temperatūra – apie 25 °C, dirva prisotinta drėgmės) po keleto dienų vyksta epinastija ir vienos augalo pusės arba viso augalo vytimas ir galiausiai augalas žūva. Mažiau palankiomis sąlygomis (dirvos temperatūra – mažesnė nei 21 °C) ant stiebo gali išsivystyti daug papildomų šaknų. Nuo stiebo pagrindo galima pastebėti kylančius stiebe vandeningus dryželius, kurie įrodo apytakinės sistemos nekrozę. Perpjovus stiebą, iš išblukusių rudų apytakinių stiebo audinių išsiskiria balti arba gelsvi bakterinio skysčio lašeliai. 1.3. Kitų augalų šeimininkų simptomai Solanum dulcamara ir S. nigrum augalai. Natūraliomis sąlygomis vytimo simptomai retai stebimi šiuose piktžoliniuose augaluose šeimininkuose, nebent dirvos temperatūra viršija 25 °C arba inokuliavimo laipsnis yra pernelyg didelis (pvz., S. nigrum auga šalia sergančių bulvių ar pomidorų augalų). Vytulio atveju simptomai panašūs į pomidorų simptomus. Nevystančiuose S. dulcamara augaluose, kurių stiebai ir šaknys auga vandenyje, galima pastebėti neryškų išblukimą stiebo pagrindo arba povandeninių augalo dalių vaskuliariniuose audiniuose, atlikus skersinį pjūvį. Bakterijos gali sunktis iš prapjautų vaskuliarinių audinių arba sudaryti gleivėtus siūlus, jei prapjautas stiebas įkišamas į vandenį vertikaliai, netgi nesant vytulio simptomų. 2. Greitieji atrankos testai Greitieji atrankos testai palengvina spėjamos diagnozės nustatymą, bet jie nėra būtini. Taikykite vieną ar kelis iš šių testų: 2.1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas (žr. VI skirsnio A dalies 1 punktą.) 2.2. Poli-β-hidroksibutirato (PHB) granulių aptikimas Būdingos PHB granulės stebimos R. solanacearum ląstelėse, kai iš užkrėsto audinio gautų bakterinių išskyrų karščiu fiksuoti tepinėliai stebimi mikroskopu, prieš stebėjimą tepinėlį nudažius Nile Blue A arba Sudan Black dažu (žr. VI skirsnio A dalies 2 punkte). 2.3. Serologinės agliutinacijos testai (žr. VI skirsnio A dalies 3 punktą) 2.4. Kiti testai Kiti atitinkami greitieji atrankos testai yra šie: IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą), FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą), imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) ir PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą). 3. Išskyrimo tvarka a) Paimti bulvių stiebagumbio apytakinio žiedo dalį arba bulvių, pomidorų ar kitų vystančių augalų šeimininkų stiebų apytakinio pašviesėjusio audinio segmentus arba išskyras. Suspenduoti nedideliame sterilaus distiliuoto vandens kiekyje arba 50 mM fosfatinio buferinio tirpalo (4 priedėlis) ir palikti 5–10 minučių. b) Paruošti seką suspensijos dešimtainių tirpalų. c) Pernešti 50–100 ml suspensijos ir tirpalų kiekį į pagrindinę mitybinę terpę (NA, YPGA ir SPA, 2 priedėlis) ir (arba) ant Kelmano tetrazolio terpės (2 priedėlis) ir (arba) į selektyvią SMSA terpę (2 priedėlis). Paskleisti arba ruožuoti taikant tinkamą pasėjimo į terpę metodą. Jei reikia, paruošti atskiras lėkšteles kaip teigiamą kontrolę naudojant Ralstonia solanacearum 2 biotipo ląstelių atskiestą suspensiją. d) Lėkšteles inkubuoti 2–6 dienas 28 °C temperatūroje. – Pagrindinėje mitybinėje terpėje virulentiški R. solanacearum izoliatai sudaro perlines, kremines baltas, plokščias, netaisyklingas ir takias kolonijas, dažnai su būdingais menturiais centre. Nevirulentinės R. solanacearum formos sudaro mažas, apskritas, netakias, riebias kolonijas, kurios yra tiktai baltos spalvos. – Kelmano tetrazolio arba SMSA terpėje menturiai yra ryškiai raudonos spalvos. Nevirulentinės Ralstonia solanacearum formos sudaro mažas, apskritas, netakias, riebias tamsiai raudonas kolonijas. 4. R. solanacearum identifikavimo testai Spėjamų R. solanacearum izoliatų tapatybės patvirtinimo testai aprašyti VI skirsnio B dalyje. III SKIRSNIS 1. Ralstonia solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose išsamūs metodai 1.1. Bandinio paruošimas Pastabos: – Standartinis vienam testui skirto bandinio dydis – 200 stiebagumbių. Intensyvesnės imties atveju reikia atlikti daugiau šio dydžio bandinio testų. Dėl didesnio stiebagumbių skaičiaus viename bandinyje neįmanoma arba sunku aiškinti rezultatus. Tačiau turint vos keletą stiebagumbių šią procedūrą galima taikyti mažiau nei 200 stiebagumbių bandiniams. – Visų toliau aprašytų aptikimo metodų patvirtinimas pagrįstas 200 stiebagumbių bandinių tyrimu. – Toliau aprašytą bulvių ekstraktą taip pat galima naudoti aptinkant bulvių žiedinio puvinio sukėlėją – bakteriją Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Prieš bandinio paruošimą galima atlikti išankstinį apdorojimą: a) 2 savaites prieš tyrimą bandinius inkubuoti 25–30 °C temperatūroje, kad būtų paskatintas R. solanacearum kolonijų dauginimasis. b) Nuplauti stiebagumbius. Naudoti atitinkamus dezinfektantus (chloro junginius, kai PGR naudojama visiškai pašalinti patogeno DNR) ir detergentus tarpuose tarp bandinių plovimų. Stiebagumbiai išdžiovinami oru. Ši plovimo tvarka ypač naudinga (bet kurio naudoti nereikalaujama), kai naudojami bandiniai, turintys dirvožemio perteklių ir kai būtina atlikti PGR testą arba taikyti kitą tiesioginį DNR išskyrimo metodą. 1.1.1. Kiekvieno stiebagumbio (stolono) viršūnės oda pašalinama švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba daržovėms pjaustyti skirtu peiliu taip, kad vaskuliarinis audinys taptų matomas. Kruopščiai išpjaunama stiebagumbio viršūnės vaskuliarinio audinio šerdis, kad nevaskuliarinio audinio būtų kuo mažiau (žr. Komisijos svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Pastaba. Atskirti bet kurį pūvantį stiebagumbį: stiebagumbius su įtariamais rudojo puvinio simptomais ištirti atskirai. Jei šalinant stiebagumbio viršūnę yra stebimi įtariami rudojo puvinio simptomai, tai reikia apžiūrėti šio stiebagumbio dalį prie viršūnės. Bet kurį perpjautą stiebagumbį reikia mažiausiai dvi dienas laikyti kambario temperatūroje, kad šis sukamštėtų, ir paskiau stiebagumbį atitinkamomis karantino sąlygomis laikyti atšaldytą (4–10 °C temperatūroje). Visus stiebagumbius, įskaitant ir stiebagumbius su įtariamais simptomais, reikėtų laikyti, atsižvelgiant į III priedą. 1.1.2. Stiebagumbių viršūnių gabaliukai surenkami į nepanaudotas vienkartines talpyklas, kurias galima uždaryti ir (arba) užplombuoti. Jau panaudotas talpyklas reikėtų kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti chloro junginiais. Pirmiausia stiebagumbių viršūnių gabaliukus reikėtų apdoroti nedelsiant. Jei tai padaryti neįmanoma, jie, nepridedant buferio, šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas yra saugomi talpykloje. Stiebagumbio viršūnės gabaliukai apdorojami pagal vieną iš šių procedūrų: a) gabaliukai pamerkiami į pakankamą (apie 40 ml) išskyrimo buferinio tirpalo tūrį (4 priedėlis) ir 4 valandas žemesnėje nei 24 °C temperatūroje kratomi rotorine kratykle (50–100 rpm), arba 16–24 valandas šaldytuve, arba b) gabaliukai homogenizuojami pakankame (apie 40 ml) išskyrimo buferinio tirpalo tūryje (4 priedėlis) arba naudojant maišykle (pvz., Waring arba Ultra Thurax), arba užplombuotame vienkartiniame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher ar Bioreba tvirto polietileno maišelyje, 150 mm x 250 mm; sterilizuotame apšvita) juos sutraiškant guma apkaltu mediniu plaktuku arba atitinkamu malimo prietaisu (pvz., Homex). Pastaba. Bandinių kryžminės taršos rizika yra ypač didelė, kai bandiniai homogenizuojami naudojant maišyklę. Stengiantis išvengti aerozolio susidarymo arba nuotėkio išskyrimo metu yra imamasi atsargumo priemonių. Užtikrinama, kad kiekvienam bandiniui būtų naudojami atskiri ką tik sterilizuoti maišyklės peiliai ir indai. Jei atliekamas PGR testas, stengiamasi išvengti dauginamosios medžiagos pernešimo per talpyklas ar malimo aparatą. Atliekant PGR testą malimą rekomenduojama atlikti vienkartiniuose maišeliuose ir vienkartiniuose vamzdeliuose. 1.1.3. Viršnuosėdinis skystis nupilamas. Jei jis pernelyg drumstas, skaidrinamas lėtai centrifuguojant (10 minučių ne didesniu kaip 180 g greičiu 4–10 °C temperatūroje) arba filtravimu vakuume (40–100 um), perplaunant filtrą papildomu (10 ml) išskyrimo buferiniu tirpalu. 1.1.4. Bakterijos frakcija koncentruojama 15 minučių centrifuguojant 7 000 g greičiu (arba 10 minučių – 10 000 g greičiu) 4–10 °C temperatūroje, ir viršnuosėdinis skystis nupilamas nepažeidžiant nuosėdų. 1.1.5. Nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 1,5 ml nuosėdoms skirtame buferiniame tirpale (4 priedėlis). Naudojama 500 ml R. solanacearum, 500 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ir 500 ml etaloniniams tikslams. Įpilama sterilaus glicerino, kad etaloninės alikvotinės dalies ir likutinės tiriamosios alikvotinės dalies 500 ml galutinė koncentracija siektų 10–25 % (tūris/tūris), sumaišoma ir saugoma temperatūroje nuo -16 iki -24 °C (savaites) arba nuo -68 iki -86 °C (mėnesius). Tyrimo metu tiriamosios alikvotinės dalys saugomos 4–10 °C temperatūroje. Kartotinis sušaldymas ir atitirpdinimas nerekomenduotini. Jei ekstraktą reikia vežti, jis šaldomoje dėžėje pristatomas per 24 valandas. 1.1.6. Siekiant išvengti užkrėtimo, visus R. solanacearum teigiamus kontrolinius bandinius ir tiriamuosius bandinius būtina laikyti atskirai. Šitaip daroma paruošiant IF plokšteles ir atliekant visus testus. 1.2. Tyrimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose: Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą) IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą) FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą) Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą) 2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose išsamūs metodai 2.1. Bandinio paruošimas Pastaba. Siekiant aptikti latentines R. solanacearum populiacijas, rekomenduojama tirti sudėtinius bandinius. Ši tvarka gali būti sėkmingai taikoma tiriant 200 stiebų dalių sudėtinius bandinius. Atliekant apžiūras, rekomenduojama naudoti statistiškai patikimą tiriamąjį augalo populiacijos bandinį. 2.1.1. Nuo kiekvieno stiebo antžeminės dalies švariu dezinfekuotu peiliu arba genėjimui skirtu sekatoriumi atpjaunamas 1-2 cm segmentas. Jauni pomidorų daigai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas. Lauke arba šiltnamyje auginami pomidorų augalai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo pagrindinio kiekvieno augalo stiebo atpjaunama žemiausiai esanti šakelė. Nuo kiekvienoje pusėje esančios šakelės žemiausios dalies atpjaunamas 1 cm segmentas. Kiti augalai šeimininkai: švariu dezinfekuotu peiliu arba sekatoriumi nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas. S. dulcamara ar kitų vandenyje auginamų augalų šeimininkų atveju nuo povandeninių stiebo dalių ar stolonų, turinčių vandenyje esančias šaknis, atpjaunami 1–2 cm segmentai. Kai imtis atliekama konkrečioje vietoje, rekomenduojama tirti statistiškai reprezentatyvių 10 augalų imtį, paimtą kiekvienoje galimų piktžolinių augalų šeimininkų bandinių paėmimo vietoje. Patogeninio organizmo aptikimą patikimiausiai galima atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, nors gamtoje vykstančius užkrėtimus ištisus metus galima nustatyti tarp daugiamečių Solanum dulcamara augalų, augančių vandentakiuose. Žinomiems augalams šeimininkams priklauso savaime įsisėjantys augalai (dirvožemio tvarkytojai) Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ir kiti bulvinių šeimos augalai. Kiti šeimininkai yra Pelargonium spp. ir Portulaca oleracea. Prie kai kurių augalų šeimininkų, augančių Europoje ir tam tikromis aplinkos sąlygomis savo šaknyse ir (arba) rizosferoje galinčių turėti 2 biovarieteto 3 rasės R. solanacearum populiacijų, galima priskirti šiuos augalus: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ir Urtica dioica. Pastaba. Vidinių simptomų (vaskuliarinio audinio dažymasis arba bakterijų išskyros) vizualinį įvertinimą reikia atlikti šio tyrimo etape. Bet kurie simptomų turintys stiebo segmentai atskiriami vieni nuo kitų ir išanalizuojami (žr. II skirsnį). 2.1.2. Stiebo segmentai trumpai dezinfekuojami 70 % etilo alkoholiu ir nedelsiant išdžiovinami sugeriamuoju popieriumi. Po to stiebo segmentai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų: a) segmentai pamerkiami į pakankamo tūrio (apytiksliai 40 ml) išskyrimo buferinį tirpalą (4 priedėlis) ir 4 valandas maišomi besisukančia kratykle (50–100 rpm greičiu) mažesnėje nei 24 °C temperatūroje arba 16–24 valandas šaldomi, arba b) apdorojami nedelsiant guma apkaltu plaktuku arba atitinkamu malimo aparatu (pvz., Homex), segmentus sumalant tvirtame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher arba Bioreba), įpylus atitinkamą išskyrimo buferinio tirpalo kiekį (4 priedėlis). Jei šito padaryti neįmanoma, tai stiebo segmentai saugomi šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas. 2.1.3. 15 minučių leidus susidaryti nuosėdoms, viršnuosėdinis skystis nupilamas. 2.1.4. Paprastai paskiau nereikalaujama skaidrinti ekstrakto arba koncentruoti bakterinės frakcijos, tačiau tai galima atlikti filtruojant ir (arba) centrifuguojant, kaip aprašyta III.1.1.3-1.1.5 skirsniuose. 2.1.5. Neskiestas arba koncentruotas bandinio ekstraktas padalijamas į dvi lygias dalis. Viena dalis tiriama ir saugoma 4–10 °C temperatūroje, o kita saugoma 10–25 % (tūris/tūris) steriliame glicerine temperatūroje nuo -16 iki -24°C (savaites) arba nuo -68 iki -86 °C (mėnesį) tuo atveju, jeigu bus reikalingi tolesni bandymai. 2.2. Tyrimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose: Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą) IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą) FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą) Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą) IV SKIRSNIS 1. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo vandenyje planas (1) Žr. IV skirsnio 2 punkto 1 papunktį dėl rekomenduojamos bandinių ėmimo tvarkos. (2) Patogeninio organizmo koncentravimo metodai aprašyti IV skirsnio 2 punkto 1 papunktyje. Koncentravimas, kurio metu padidinamos tiek patogeninio organizmo ir konkuruojančių saprofitinių bakterijų populiacijos, rekomenduojamas, jei dėl to nepablogėja išskyrimo testo rezultatai. (3) Selektyvus išskyrimas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte. (4) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte. (5) Praturtintos PGR metodai VI skirsnio A dalies 4 punkto 2 papunktyje ir VI skirsnio A dalies 6 punkte. (6) Praturtintos imunofermentinės analizės metodai (ELISA) VI skirsnio A dalies 4 punkto 2 papunktyje ir VI skirsnio A dalies 8 punkte. (7) Tipiška kolonijos morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte. (8) Auginimas gali nevykti dėl saprofitinių bakterijų keliamos konkurencijos ar slopinimo. Jei įtariama, kad didelis saprofitinių bakterijų skaičius gali sumažinti išskyrimo patikimumą, praskiedus bandinį steriliu vandeniu pakartojami išskyrimo testai. (9) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti taikant VI skirsnio B dalyje aprašytus metodus. (10) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje. 2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo vandenyje metodai Principas Pagal šiame skirsnyje aprašytą aptikimo planą ligos sukėlėjas aptinkamas paviršiniame vandenyje ir taip pat bulvių perdirbimo atliekose arba nuotekų vandenyse. Tačiau reikia pabrėžti, kad aptikimo skirtingame substrate jautrumas kinta. Išskyrimo testo nustatymo jautrumui didelės įtakos turi konkuruojančios saprofitinės bakterijos, kurių skaičius bulvių perdirbimo atliekose ir nuotekų vandenyse yra gerokai didesnis nei paviršiniame vandenyje. Kadangi pagal paskesnį planą 1 litre paviršinio vandens tikimasi aptikti ne mažiau kaip 103 ląstelių, tai atrodo, kad organizmo aptikimo bulvių perdirbimo atliekose ar nuotekų vandenyse jautrumas bus gerokai mažesnis. Atsižvelgiant į tai, nuotekų vandenis siūloma tirti baigus visas gryninimo operacijas (pvz., nusodinimą arba filtravimą), kurių metu sumažinamas saprofitinių bakterijų kolonijų skaičius. Aptikimo pagal šį tyrimo planą jautrumo apribojimus reikia apsvarstyti atlikus gautų neigiamų rezultatų patikimumo įvertinimą. Kadangi pagal šį tyrimo planą atlikti patogeninio organizmo buvimo ar nebuvimo paviršiniame vandenyje tyrimai buvo sėkmingi, reikia atsižvelgti į šio plano trūkumus, kai atliekamas patogeninio organizmo buvimo bulvių perdirbimo atliekose ir nuotekų vandenyse tyrimas. 2.1. Bandinio paruošimas Pastabos: – R. solanacearum aptikimą paviršiniame vandenyje geriausia atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, kai vandens temperatūra viršija 15 °C. – Dėl pakartotinio bandinių ėmimo skirtingu laiku pirmiau nurodytu laikotarpiu nustatytose imties vietose padidės aptikimo patikimumas, kartu sumažinant klimato kaitos sukeltą poveikį. – Siekiant išvengti praskiedimų, užmaskuojančių patogeną, reikia atsižvelgti į liūčių laikotarpį ir vandentakio geografinę padėtį. – Paimti paviršinio vandens, esančio netoli augalų šeimininkų, jei šie šeimininkai tebeegzistuoja, bandinius, jei šis vanduo yra netoliese augalų šeimininkų. 2.1.1. Pasirinktose imties vietose paimti vandens bandinius, pripildant vienkartinius mėgintuvėlius ar butelius vandens, paimto iš 30 cm gylio ir ne daugiau kaip 2 m nuo kranto. Jei bus tiriama perdirbimo atliekos arba nuotekų vandenys, bandinius paimti nuotekų išmetimo vietoje. Rekomenduojama imties vietoje paimti iki 500 ml tūrio bandinius. Jei paimami mažesnio tūrio bandiniai, rekomenduojama paimti bandinius imties vietoje mažiausiai tris kartus, kiekvieno bandinio atlikti du poėmių pakartojimus, kurių kiekvieno tūris yra mažiausiai 30 ml. Atliekant intensyvesnį tyrimą, pasirinkti mažiausiai tris imties vietas 3 km ilgio vandentakyje ir užtikrinti, kad bandiniai taip pat bus paimami iš intakų, įtekančių į vandentakį. 2.1.2. Bandiniai vežami vėsiai (4–10 °C) tamsoje ir ištiriami per 24 valandas. 2.1.3. Jei reikia, bakterijų frakcija gali būti koncentruojama šiais metodais: a) 30–50 ml tūrio bandiniai centrifuguojami 10 000 g greičiu 10 minučių (arba 7 000 g greičiu 15 minučių) 4–10 °C temperatūroje, viršnuosėdinį skystį nupilant ir nuosėdas pakartotinai suspenduojant 1 ml nuo sėdų buferiniame tirpale (4 priedėlis). b) Atliekamas filtravimas per membraną (mažiausiam skylučių dydžiui esant 0,45 mM), paskiau atliekamas filtro perplovimas 5–10 ml nuosėdų buferiniu tirpalu ir nuoplovų išsaugojimas. Šis metodas tinkamas atlikti naudojant vandenį, kuriame yra nedaug saprofitinių bakterijų. Tiriant bulvių perdirbimo arba nuotekų vandenų bandinius koncentravimas paprastai nerekomenduojamas, nes dėl padidėjusių saprofitinių bakterijų skaičiaus yra slopinamas Ralstonia solanacearum nustatymas. 2.2. Testavimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų aprašymą atitinkamuose priedėliuose. V SKIRSNIS 1. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo dirvožemyje planas (1) Žr. V skirsnio 2 punkto 1 papunktį dėl rekomenduojamos ėmimo tvarkos. (2) Selektyvus išskyrimas aprašytas VI skirsnio A dalies 4 punkte. (3) Praturtintos PGR metodai aprašyti VI skirsnio A dalies 4 punkto 2 papunktyje ir VI skirsnio A dalies 6 punkte. (4) Biotestas aprašytas VI skirsnio A dalies 9 punkte. (5) Tipiška kolonijų morfologija aprašyta II skirsnio 3 dalies d punkte. (6) Auginimas gali nevykti dėl saprofitinių bakterijų keliamos konkurencijos ar slopinimo. Jei įtariama, kad didelis saprofitinių bakterijų skaičius gali sumažinti išskyrimo patikimumą, praskiedus bandinį steriliu vandeniu yra pakartojami išskyrimo testai. (7) Galimų R. solanacearum izoliatų grynas kultūras galima patikimai identifikuoti taikant VI skirsnio B dalyje aprašytus metodus. (8) Patogeniškumo testas aprašytas VI skirsnio C dalyje. 2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo dirvožemyje metodai Principai Pagal šiame skirsnyje aprašytą patvirtintą aptikimo planą dirvožemio bandiniuose yra aptinkamas ligos sukėlėjas ir taip pat tiriami bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandiniai. Tačiau reikia pažymėti, kad taikant šiuos metodus nustatymo jautrumas nėra pakankamas, kad būtų galima garantuoti nedidelio skaičiaus ir (arba) nevienodai išplitusių Ralstonia solanacearum populiacijų, randamų šiuose natūraliai užkrėstuose substratuose, aptikimą. Aptikimo jautrumo apribojimus, susijusius su šiuo tyrimo planu, reikėtų apsvarstyti, kai yra vertinamas bet kokių gautų neigiamų rezultatų patikimumas ir taip pat kai yra atliekami patikrinimai, siekiant nustatyti patogeno buvimą arba nebuvimą dirvožemyje ir dumble. Patikimiausias patogeninio organizmo buvimo lauko dirvožemyje tyrimas yra jautraus užkrėtimui augalo šeimininko pasodinimas ir jo užkrėtimo stebėsena, tačiau ir šio metodo nustatymo jautrumas nėra pakankamas nedideliam užkrėtimo laipsniui nustatyti. 2.1. Bandinio paruošimas 2.1.1. Imant lauko dirvožemio bandinius, reikia laikytis nematodų imčiai taikomų standartinių principų. Kiekvienam bandiniui reikia surinkti 0,5–1 kg dirvožemio 60 imties vietų 0,3 ha ploto lauke 10–20 cm gylyje (arba iš 7 x 7 m žemės ploto). Įtarus patogeninio organizmo buvimą, bandinių imties vietų skaičių 0,3 ha plote reikia padidinti iki 120. Iki tyrimo bandiniai laikomi 12–15 °C temperatūroje. Bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandinių bendras svoris siekia 1 kg ir jie imami tiek imties vietų, kad būtų atitinkamas viso reikiamo ištirti dumblo tūris. Prieš tiriant kiekvienas bandinys sumaišomas. 2.1.2. 10–25 g dirvožemio arba dumblo poėmių dispergavimas 2 valandas atliekamas rotorine kratykle 250 rpm greičiu 60–150 ml išskyrimo buferiniame tirpale (4 priedėlis). Jei dispergavimą reikia pagreitinti, galima pripilti 0,02 % sterilaus Tween-20 ir įberti 10–20 g sterilaus žvirždo. 2.1.3. Tyrimo metu suspensiją laikyti 4 °C temperatūroje. 2.2. Tyrimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų aprašymą atitinkamuose priedėliuose. VI SKIRSNIS R. SOLANACEARUM NUSTATYMO IR IDENTIFIKAVIMO OPTIMIZUOTOS METODIKOS A. DIAGNOSTINIAI IR NUSTATYMO TESTAI 1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas Ralstonia solanacearum bakterijos buvimą vystančiuose bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų stiebuose galima įvertinti atlikus šį paprastą spėjamąjį bandymą: nupjauti stiebą truputį virš dirvos paviršiaus. Įmerkti nupjautą stiebą į menzūrą su vandeniu. Po kelių minučių stebėti būdingą spontaninį bakterijų gleivių siūlų tekėjimą iš apytakinių pluoštų. 2. Poli-β-hidroksibutirato granulių aptikimas 1. Ant mikroskopo objektinio stiklelio paruošti išskyrų arba suspenduoto audinio tepinėlį, arba 48 valandas YPGA ar SPA terpėje augintos kultūros tepinėlį (2 priedėlis). 2. Paruošti 2 biovarieteto R. solanacearum teigiamų kontrolinių bandinių tepinėlius ir, jei manoma, kad tai naudinga, paruošti heterologiško biovarieteto neigiamo kontrolinio bandinio kontrolės tepinėlį. 3. Leisti išdžiūti ore ir keletą kartų greitai perleisti apatinį stiklelio paviršių per liepsną, kol tepinėlis užsifiksuos. 4. Preparatą dažyti arba Nile Blue, arba Sudan Black dažu ir stebėti mikroskopu, kaip aprašyta toliau: Nile Blue dažo testas: a) Fiksuotą tepinėlį pamerkti į 1 % vandeninį Nile Blue A tirpalą. 10 minučių laikyti 55 °C temperatūroje. b) Nupilti dažantį tirpalą. Nuplauti, trumpai palaikant po silpna vandens srovele, ir filtriniu popieriumi pašalinti vandens perteklių. c) Užpilti tepinėlį 8 % acto rūgštimi ir 1 minutę laikyti kambario temperatūroje. d) Nuplauti silpna vandens srovele ir nusausinti tepinėlį sugeriamuoju popieriumi. e) Pakartotinai sudrėkinti lašu vandens ir uždengti dengiamuoju stikleliu. f) Nudažytą tepinėlį stebėti epifluorescenciniu mikroskopu, šviesos bangos ilgiui siekiant 450 nm po aliejine imersija, padidinus 600–1 000 kartų ir naudojant imersinį aliejaus ar vandens objektyvą. g) Stebėti ryškiai oranžinį polibetahidroksibutirato granulių švytėjimą. Taip pat stebėti įprastinėje šviesoje, kad būtų įsitikinta, jog nuosėdos yra ląstelės viduje ir ląstelių morfologija yra būdinga R. solanacearum. Sudan Black dažo testas: a) Kiekvieną fiksuotą tepinėlį pamerkti į 0,3 % Sudan Black B tirpalą 70 % etanolyje ir 10 minučių palaikyti kambario temperatūroje. b) Nupilti dažantį tirpalą, trumpai palaikyti po vandeniu iš čiaupo ir filtriniu popieriumi pašalinti vandens perteklių. c) Tepinėlį trumpam panardinti į ksilolą ir nusausinti filtravimo popieriumi. Atsargiai! Ksilolas yra kenksmingas sveikatai. Imtis visų atsargumo priemonių ir dirbti traukos spintoje. d) Užpilti tepinėlį 0,5 % (g/ml) vandeniniu safranino tirpalu ir 10 minučių palikti kambario temperatūroje. Atsargiai! Safraninas yra kenksmingas sveikatai. Imtis visų atsargumo priemonių ir dirbti traukos spintoje. e) Nuplauti silpna vandens srovele. Nusausinti tepinėlį filtravimo popieriumi ir uždengti dengiamuoju stikleliu. f) Šviesos mikroskopu stebėti nudažytą tepinėlį, naudojant išsklaidytą šviesą, imersinį aliejų ir 1 000 kartų didinantį imersinį aliejaus objektyvą. g) Stebėti polibetahidroksibutirato granulių Ralstonia solanacearum bakterijos ląstelėje dažymąsi mėlynai juoda spalva. Ląstelės sienelė nusidažo rausva spalva. 3. Serologinės agliutinacijos testai R. solanacearum ląstelių bakterinėse išskyrose arba simptominių audinių ekstraktuose serologinė agliutinacija geriausiai stebima naudojant patvirtintus antikūnus (žr. 3 priedėlį), žymėtus atitinkamomis spalvinėmis žymėmis, tokiomis kaip raudonos Staphylococcus aureus ląstelės arba dažyto latekso dalelės. Jei naudojamasi nusipirktu rinkiniu (žr. 3 priedėlį), vadovaujamasi gamintojo instrukcijomis. Kitais atvejais operacija atliekama šia tvarka: a) Žymėtų antikūnių suspensijos ir bakterinių išskyrų lašai (kiekvieno apytiksliai po 5 ml) sumaišomi mikrotitravimo plokštelių duobutėse. b) Naudojant R. solanacearum 2 biovarieteto ir heterologinio štamo suspensijas, paruošiami teigiami ir neigiami kontroliniai bandiniai. c) Agliutinacija teigiamuose bandiniuose stebima po 15 sekundžių trukmės švelnaus maišymo. 4. Selektyvus pasėjimas 4.1. Selektyvus pasėjimas Pastaba. Prieš pradedant taikyti šį metodą pirmąkart, atliekami išankstiniai testai, užtikrinant atkartojamą 103–104 R. solanacearum kolonijas sudarančių vienetų, pridėtų prie bandinių, kurie pirmiau buvo įvertinti kaip neigiami, nustatymą viename mililitre. Naudojamasi atitinkama patvirtinta selektyvią terpe, tokia kaip SMSA (kaip modifikuota Elphinstone et al., 1996; žr. 2 priedėlį). Reikia rūpestingai atlikti R. solanacearum atskyrimą nuo kitų bakterijų, nes terpėje gali augti ir kitų rūšių bakterijos. Be to, gali išaugti netipiškos morfologijos R. solanacearum kolonijos dėl peraugimo ar bakterijų antagonistų. Įtarus konkurencijos ar antagonizmo atvejus, bandinys pakartotinai tiriamas kitu metodu. Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti, tiriant ekstraktus, laikytus glicerine temperatūroje nuo -68 iki -86 °C. Kaip teigiamą kontrolinį bandinį paruošti R. solanacearum virulentiško 2 biovarieteto štamo (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 kolonijų sudarančių vienetų viename mililitre suspensijos praskiedimų seką santykiu 1:10. Siekiant išvengti taršos, paruošiami teigiami kontroliniai bandiniai atskirai nuo tiriamųjų bandinių. Kiekvienos selektyvios terpės partija patikrinama pagal patogeno sugebėjimą augti joje prieš pradedant įprastinių bandinių tyrimą. Kontrolinė medžiaga tiriama taip pat, kaip ir bandinys. 4.1.1. Atlikti atitinkamą pasėjimo praskiedžiant operaciją, siekiant užtikrinti bet kokių pašalinių saprofitinių bakterijų populiacijų praskiedimą. Į kiekvieną lėkštelę pasėti po 50–100 ml kiekvieno praskiedimo bandinio. 4.1.2. Lėkštelės inkubuojamos 28 °C temperatūroje. Plokštelės analizuojamos po 48 valandų ir po to kasdien – auginimas trunka 6 dienas. Tipiškos R. solanacearum kolonijos SMSA terpėje būna pieno baltumo, lygios, netaisyklingos formos bei takios ir po 3 inkubacijos dienų kolonijų centre atsiranda nuo rausvos iki kraujo spalvos centrinis vidinis ruožuotumas arba menturiai (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/MembersPublic/irc/sanco/sancoeurophyt/libraryHome/main). Pastaba. Kartais šioje terpėje išauga netipiškos R. solanacearum kolonijos. Jos gali būti mažos, apvalios, visiškai raudonos ir netakios arba iš dalies takios, todėl jas būna sunku atskirti nuo saprofitinių kolonijas sudarančių bakterijų. 4.1.3. R. solanacearum spėjamos kolonijos išgryninamos po pasėjimo į pagrindinę mitybinę terpę brėžimo arba praskiedimo būdu atskiroms kolonijoms gauti (žr. 2 priedėlį). 4.1.4. Kolonijos trumpai laikomos tamsoje steriliame kambario temperatūros vandenyje (pH 6–8, neturinčiame chloro) arba ilgą laiką – kriogeninėje apsauginėje terpėje esant temperatūrai nuo -68 iki -86 °C arba liofilizuojamos. 4.1.5. Spėjamos kultūros identifikuojamos (žr. VI skirsnio B dalį) ir atliekamas patogeniškumo testas (žr. VI skirsnio C dalį). Selektyvaus pasėjimo rezultatų aiškinimas Selektyvaus pasėjimo testo rezultatai laikomi neigiamais, jei po 6 dienų auginimo bakterijų kultūros nestebimos arba tipiškų R. solanacearum kolonijų nėra, laikantis nuostatos, kad slopinimas nevyko dėl kitų bakterijų konkurencijos ar antagonizmo ir kad tipiškos R. solanacearum kolonijos aptinkamos tik teigiamuose bandiniuose. Selektyvaus pasėjimo testas teigiamas, jei išskiriamos spėjamos R. solanacearum kolonijos. 4.2. Praturtinimo procedūra Naudoti tokią patvirtintą terpę, kaip modifikuotas Wilbrink buljonas (žr. 2 priedėlį). Ši procedūra gali būti taikoma R. solanacearum populiacijų bandinyje atrankai pagerinti ir aptikimo jautrumui padidinti. Sios procedūros metu PGR reakcijos inhibitoriai tinkamai praskiedžiami (1:100). Tačiau reikėtų pažymėti, kad R. solanacearum praturtinimas gali nepasisekti dėl saprofitinių bakterijų praturtinamų tuo pačiu metu, konkurencijos ar antagonizmo. Dėl šios priežasties R. solanacearum išskyrimas is praturtintų buljono terpėje auginamų kultūrų gali būti problemiškas. Be to, kadangi serologiškai giminingų saprofitų populiacijos gali padidėti, rekomenduojama imunofermentinei analizei atlikti vietoj specifinių monokloninių antikūnų naudoti polikloninius antikūnus. 4.2.1. Praturtinant PGR, 100 ml bandinio ekstrakto įpilama į 10 ml praturtinamojo sultinio (2 priedėlis), prieš tai išpilstyto alikvotinėmis dalimis į mėgintuvėlius ar kolbutes, neužkrėstas DNR. Praturtinant imunofermentinę analizę (ELISA), į praturtinamąjį sultinį galima įpilti didesnio tūrio tiriamųjų bandinių (pvz., 100 ml į 1,0 ml praturtinamojo sultinio). 4.2.2. Kultūros 72 valandas inkubuojamos 27–30 °C ant kratyklės arba nekratant kolbose, neužkimštose aklinai tam, kad šios vėdintųsi. 4.2.3. Prieš atliekant imunofermentinę analizę ar PGR gerai sumaišyti. 4.2.4. Atliekant abu testus, praturtinamasis sultinys paveikiamas lygiai taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys. Pastaba. Jei R. solanacearum praturtinimas slopinamas dėl didelio konkuruojančių saprofitinių bakterijų populiacijų skaičiaus, bandinių ekstraktų praturtinimą geriau atlikti prieš centrifugavimo ar koncentravimo kitu būdu operaciją. 5. Imunofluorescencinės analizės (IF) testas Principas Imunofluorescencinės analizės testas, kaip pagrindinis atrankos testas, rekomenduojamas taikyti dėl to, kad jį atliekant yra pasiekiamos reikalaujamos slenkstinės vertės. Kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, išskyrimo, PGR ar FISH testą reikia atlikti kaip antrąjį atrankos testą. Kai IF testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, reikia atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad analizė būtų baigta. Pastaba. Naudojami patvirtinti antikūniai, specifiški R. solanacearum (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnių partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta reakcija, tiriant homologinio R. solanacearum štamo 105–106 ląstelių/ml suspensiją ir naudojant atitinkamą gamintojo rekomenduojamą fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatą. Neišgrynintų polikloninių arba monokloninių antikūnių titras turėtų būti ne mažesnis kaip 1:2 000. Tyrimo metu antikūnius reikėtų praskiesti iki darbinio praskiedimo (DP), artimo ar lygaus jų titrui. Reikėtų tirti tik šviežiai pagamintus ekstraktus. Jei būtina, galima tirti glicerine temperatūroje nuo -68 iki -86 °C laikomus ekstraktus. Gliceriną iš bandinio galima pašalinti, įpylus 1 ml nuosėdų buferinio tirpalo (4 priedėlis), pakartotinai 15 minučių centrifuguoti 7 000 g greičiu ir pakartotinai suspenduoti, pripylus nuosėdų buferinio tirpalo lygų tūrį. Dažnai šitai atlikti nebūtina, ypač jei bandiniai fiksuojami ant plokštelės liepsna. Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles su homologiniu arba bet kuriuo etaloniniu R. solanacearum štamu, suspenduotu bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3 priedėlio B dalyje, ir pirmiausia buferiniame tirpale. Jei įmanoma, į tos pačios plokštelės duobutes turėtų būti pripilama natūraliai užkrėsto audinio preparato (palaikomo liofilizacijos arba šaldymo būdu nuo -16 iki -24 °C temperatūroje) kaip panašaus kontrolinio bandinio. Anksčiau nustatytų kaip neigiamų bandinių ekstraktų alikvotinės dalys galėtų būti naudojamos kaip neigiamos kontrolės. Prieinamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos išvardytos 3 priedėlyje. Naudoti daug duobučių turinčias mikroskopines plokšteles, mažiausiai 6 mm storio ir geriausia turinčias 10 langelių. Kontrolinis bandinys tiriamas taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys. 5.1. Tyrimui skirtos plokštelės paruošiamos taikant vieną iš šių procedūrų: i) Nuosėdos, turinčios palyginti nedaug krakmolo: Standartinis tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) 1:100 praskiestų pakartotinai suspenduotų bulvių nuosėdų lašinamas į pirmąjį langelį. Paskiau nepraskiestų (1/1) pakartotinai suspenduotų nuosėdų panašus tūris lašinamas į vienos tos pačios eilės langelius. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 1 pav. ii) Esant kitoms nuosėdoms: Pakartotinai suspenduotos nuosėdos praskiedžiamos santykiu 1:10 ir 1:100 nuosėdų buferiniame tirpale. Standartinis pakartotinai suspenduotų nuosėdų tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) lašinamas į langelį ir vienoje langelių eilutėje atliekamas praskiedimas. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 2 pav. 5.2. Lašeliai išdžiovinami kambario temperatūroje arba šildomi 40–45 °C temperatūroje. Bakterinės ląstelės fiksuojamas prie plokštelės arba kaitinant (15 minučių 60 °C temperatūroje), arba liepsna, 95 % etilo alkoholiu arba bet kuria kita antikūnių tiekėjų nurodyta tvarka. Jei būtina, fiksuotos plokštelės paskiau iki tyrimo gali būti kiek galima trumpiau (ilgiausiai 3 mėnesius) saugomos šaltai sausoje dėžėje. 5.3. IF tvarka i) Plokštelė paruošta, kaip nurodyta 5.1 skirsnio i punkte: Paruošiamas antikūnių, dukart praskiestų IF buferiniu tirpalu, rinkinys. Į pirmąją duobutę įpilama 1/2 titro (T/2), į kitas – 1/4 titro (T/4), 1/2 titro (T/2), 1 titras (T) ir dukart titro antikūnių (2T). ii) Plokštelė paruošta, kaip nurodyta 5.1 skirsnio ii punkte: Atliekamas antikūnų darbinis praskiedimas (DP) IF buferiniame tirpale. Praskiedimas turi įtakos antikūnų specifiškumui. 1 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio i punktą ir 5.3 skirsnio i punktą Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimai 2 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio ii punktą ir 5.3 skirsnio ii punktą Antiserumo/antikūnių darbinis praskiedimas 5.3.1. Plokštelės išdėliojamos ant sudrėkinto sugeriamojo popieriaus. Kiekvienas testuojamasis langelis sklidinai pripildomas praskiestų antikūnų tirpalo. Į kiekvieną langelį įpilamo antikūnių tirpalo tūris turi atitikti bent mažiausiai tiriamojo ekstrakto tūrį. Antikūnių tiekėjams nepateikus vartojimo instrukcijų, laikomasi šios tvarkos: 5.3.2. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C). 5.3.3. Nukratyti antikūnių lašelius nuo kiekvienos plokštelės ir atsargiai nuplauti su IF buferiniu tirpalu. Plaunama panardinant plokštelę į IF buferinį tirpalą, turintį Tween (4 priedėlis), ir palaikoma 5 minutes, o po to įpilama IF buferinio tirpalo ir laikoma dar 5 minutes. Vengti aerozolio susidarymo arba lašelių pernešimo, dėl kurio gali įvykti kryžminė tarša. Perteklinis vanduo atsargiai pašalinamas nusausinant. 5.3.4. Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus ir į duobutes įpilama FITC konjugato, atskiesto tiek, kiek jo tirpalas buvo panaudotas titrui nustatyti. Į duobutes įpilamo konjugato turis turi atitikti įpilamo antikūnio tirpalo tūrį. 5.3.5. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C). 5.3.6. Konjugato lašeliai pašalinami iš plokštelės juos nukratant. Plokštelė skalaujama ir plaunama, kaip pirmiau aprašyta (5.3.3). Atsargiai pašalinamas perteklinis vanduo. 5.3.7. Į kiekvieną tiriamąjį langelį pipete įlašinama po 5–10 ml 0,1 M glicerino fosfatinio buferinio tirpalo arba komercinio priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio tirpalo (4 priedėlis) ir plokštelė uždengiama dengiamuoju stikleliu. 5.4. IF testo rezultatai: 5.4.1. Tiriamąsias plokšteles stebėti epifluorescenciniu mikroskopu naudojant filtrus, tinkamus FITC sužadinimui, aliejaus ar vandens imersinius tirpalus bei 500-1 000 kartų padidinus. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių. Pirmiausia stebima teigiama kontrolinė plokštelė. Ląstelės turi šviesiai fluorescuoti ir būti visiškai nusidažiusios esant nustatytam antikūnių titrui ar darbiniam praskiedimui. Jei dažymasis nepavyko, IF testą (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) reikia pakartoti. 5.4.2. Tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos R. solanacearum ląstelės (žr. žiniatinklio svetainę: http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą esant tam pačiam antikūnių praskiedimui. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančios ląsteles nekreipiama dėmesio. Įtarus bet kokį užkrėtimą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad ant plokštelės dangtelio stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų). 5.4.3. Yra keletas būdingų IF testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų, panašių į R. solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, pasitaikančių bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų segmentų nuosėdose. 5.4.4. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles esant antikūnių titrui arba darbiniam praskiedimui, kaip nurodyta 5.3 skirsnyje. 5.4.5. IF rezultatų aiškinimas: i) Jei stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos ląstelės, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (5 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau. ii) IF testo rezultatai laikomi neigiamais, kai viename bandinių mililitre yra mažiau nei 5 x 103 ląstelių, ir toks bandinys laikomas neigiamu. Toliau tirti nereikalaujama. 6. PGR testai Principas Kai PGR testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, išskyrimo arba IF testą būtina atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai PGR testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, tai paskesnį testavimą reikia atlikti pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad būtų baigtas diagnozavimas. Šio metodo, kaip pagrindinio atrankos testo, visas galimybes rekomenduojama panaudoti tik turint patirties tam tikroje srityje. Pastaba. Išankstinio testavimo taikant šį metodą nustatymo geba 1 mililitre turėtų siekti 103–104 R. solanacearum ląstelių bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami. Kad visose laboratorijose būtų pasiektas didžiausias metodo nustatymo jautrumas ir specifiškumas, gali būti reikalaujama atlikti optimizavimo eksperimentus. Naudoti patvirtintus PGR reagentus ir metodikas (žr. 6 priedėlį). Pirmiausia pasirinkti metodą, kurį taikant naudojama vidinė kontrolė. Siekiant išvengti bandinio užteršimo tiriamąja DNR, imtis atitinkamų atsargumo priemonių. Kad būtų sumažinta taršos tiriamąja DNR galimybė, PGR testą turėtų atlikti prityręs molekulinės biologijos srityje dirbančių laboratorijų techninis personalas. Neigiami kontroliniai bandiniai (DNR išskyrimo ir PGR atlikimo metu) visada turėtų būti laikomi galutiniais bandiniais, kuriais įrodoma, ar įvyko tarša DNR. Atliekant PGR testą reikėtų taikyti šiuos neigiamus kontrolinius bandinius: – bandinio ekstraktą, kuris per ankstesnį tyrimą buvo rastas neužkrėstas R. solanacearum, – buferinius kontrolinius tirpalus, naudojamus išskirti iš bandinio bakterijai ir DNR, – PGR reakcinį mišinį. Reikėtų naudoti šiuos teigiamus kontrolinius bandinius: – pakartotinai suspenduotų nuosėdų, prie kurių pridėta R. solanacearum, alikvotines dalis (apie paruošimą žr. 3B priedėlyje), – virulentiško R. solanacearum izoliato (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; žr. 3B priedėlyje) 106 ląstelių/ml vandeninę suspensiją – jei įmanoma, atliekant PGR testą reikėtų taip pat naudoti DNR, išskirtą iš teigiamų kontrolinių bandinių. Siekiant išvengti galimos taršos, teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių. Reikėtų stengtis, kad bandinių ekstraktuose nebūtų dirvožemio. Todėl tam tikrais atvejais rekomenduotina išskyrimą atlikti naudojant plautas bulves, jei dirbama pagal PGR metodikas. Standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlyje. 6.1. DNR gryninimo metodai Naudoti teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, kaip aprašyta pirmiau 3 priedėlyje. Kontrolinę medžiagą tirti taip pat, kaip ir bandinį. Tiriamoji DNR iš sudėtingų bandinių substratų išskiriama įvairiais metodais, taigi PGR ir kitų fermentinių reakcijų inhibitoriai pašalinami ir tiriamoji DNR sukoncentruojama bandinio ekstrakte. Paskesnis metodas buvo optimizuotas tam, kad būtų panaudotas su patvirtintais PGR metodais, aprašytais 6 priedėlyje. a) Pastrik (2000) metodas: 1) 220 ml lizės buferinio tirpalo (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) įpilama į 1,5 ml tūrio Eppendorfo mėgintuvėlį. 2) Įpilti 100 ml bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlį 10 minučių laikyti termostate arba vandens vonelėje 95 °C temperatūroje. 3) Mėgintuvėlį 5 minutes palaikyti ant ledo. 4) Įpilti 80 ml lizocimo pradinio tirpalo (50 mg lizocimo/ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0 buferiniame tirpale) ir 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje. 5) Įpilti 220 ml Easy DNA® tirpalo A (Invitrogen), gerai sumaišyti maišyklėje ir 30 minučių inkubuoti 65 °C temperatūroje. 6) Įpilti 100 ml Easy DNA® tirpalo B (Invitrogen), intensyviai maišyti maišyklėje, kol nuosėdos gausiai susidarys mėgintuvėlyje, ir bandinys taps visiškai klampus. 7) Įpilti 500 ml chloroformo ir maišyti tol, kol sumažėja klampumas ir mišinys tampa homogeniškas. 8) 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje, kad būtų atskirtos fazės ir susidarytų interfazė. 9) Perpilti viršutinę fazę į naujai paruoštą Eppendorfo mėgintuvėlį. 10) Įpilti 1 ml 100 % etilo alkoholio (-20 °C), trumpai pakratyti ir 10 minučių inkubuoti ant ledo. 11) 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir pašalinti etilo alkoholį iš nuosėdų. 12) Įpilti 500 ml 80 % etilo alkoholio (-20 °C) ir sumaišyti pavartant mėgintuvėlį. 13) 10 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir išsaugoti nuosėdas bei pašalinti etilo alkoholį. 14) Leisti nuosėdoms išdžiūti ore arba greitajame DNR siurblyje. 15) Pakartotinai suspenduoti nuosėdas 100 ml steriliame ypač gryname vandenyje ir mažiausiai 20 minučių palikti kambario temperatūroje. 16) Laikyti -20 °C temperatūroje tol, kol bus atliekama PGR. 17) Centrifuguojant išsodinti bet kurį baltos spalvos precipitatą ir 5 ml supernatanto, turinčio DNR, panaudoti PGR atlikti. b) Kiti metodai Kiti DNR išskyrimo metodai (pvz., Qiagen DNeasy Plant Kit) galėtų būti taikomi, jei įrodoma, kad jie tokie pat veiksmingi, išskiriant DNR iš kontrolinių bandinių, kurių 1 ml yra 103–104 patogeno ląstelių. 6.2. PGR 6.2.1. Tiriamosios ir kontrolinės PGR matricos paruošiamos pagal patvirtintą metodiką (VI. A.6 skirsnis). Bandinio DNR ekstraktas praskiedžiamas ypač grynu vandeniu santykiu 1:10. 6.2.2. Pagal paskelbtą metodiką paruošiamas atitinkamas PGR reakcijos mišinys taršai atsparioje aplinkoje (6 priedėlis). Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti daugybinę PGR metodiką, kurioje yra panaudojama ir vidinė kontrolė. 6.2.3. 2-5 ml DNR ekstrakto įpilama į PGR reakcijos mišinį, esantį steriliuose PGR skirtuose mėgintuvėliuose (žr. 6 priedėlis), kad bendras PGR reakcijos tūris būtų 25 ml. 6.2.4. Naudojamas neigiamas kontrolinis bandinys, sudarytas tik iš PGR reakcinio mišinio, ir vietoj bandinio į jį įpilama ypač gryno vandens. 6.2.5. Mėgintuvėliai įdedami į tą patį PGR reaktorių, kuris buvo naudojamas išankstinio tyrimo metu, ir atliekama atitinkamai optimizuota PGR reakcija (6 priedėlis). 6.3. PGR produkto analizė 6.3.1. Padaugintos matricinės DNR bandiniai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu. Kiekvieno bandinio į gelį įnešama mažiausiai po 12 ml padaugintos DNR reakcinio mišinio, sumaišyto su 3 ml įnešimo buferinio tirpalo (6 priedėlis). Naudojami 2,0 % (svoris/tūris) agarozės geliai, pagaminti taikant TRIS-acetato-EDTA (TAE) buferinį tirpalą (6 priedėlis), ir elektroforezė atliekama esant 5-8 V/cm. Naudojama atitinkamo ilgio DNR žymė, pvz., 100bp ilgio fragmentas. 6.3.2. DNR juostelės išryškinamos dažant etidiumo bromid …