Lietuvos Respublikos Lietuvos Respublikos valstybinės augalų apsaugos tarnybos viršininkas įsakymas dėl ralstonia solanacearum (smith) yabuuchi et al. diagnozavimo, aptikimo ir identifikavimo metodikos…

LIETUVOS RESPUBLIKOS LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS AUGALŲ APSAUGOS TARNYBOS VIRŠININKAS Į S A K Y M A S DĖL RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO METODIKOS PATVIRTINIMO 2007 m. balandžio 3 d. Nr. A1-092 Vilnius Vadovaudamasis Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kenksmingojo organizmo fitosanitarinės kontrolės ir fitosanitarijos priemonių taikymo taisyklių, patvirtintų Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2007 m. vasario 28 d. įsakymo Nr. 3D-98 (Žin., 2007, Nr. 29-1062), 2 punktu, tvirtinu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. diagnozavimo, aptikimo ir identifikavimo metodiką (pridedama).

VIRŠININKAS EDMUNDAS MORKEVIČIUS ______________ PATVIRTINTA Valstybinės augalų apsaugos tarnybos viršininko 2007 m. balandžio 3 d. įsakymu Nr. A1-092 RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO METODIKA Ši metodika parengta vadovaujantis ir įgyvendinant 2006 m. liepos 14 d. Komisijos direktyvą 2006/63/EB, iš dalies keičiančią Tarybos direktyvos 98/57/EB dėl Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolės II-VII priedus (OL, 2006, L 206, p. 36). Šioje metodikoje pateikiami bakterijos Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al, sukeliančios rudąjį puvinį, nustatymo ir diagnozavimo metodai.

TYRIMŲ PLANO TAIKYMO SRITIS Pateiktame plane apibūdinamos įvairios procedūros atliekamos:

BENDRIEJI PRINCIPAI Įvairios optimizuotos metodikos, patvirtinti reagentai ir duomenys apie pasiruošimą testui bei kontrolines medžiagas pateikiami priedėliuose. Laboratorijų, dalyvavusių optimizuojant ir tvirtinant darbo taisykles, sąrašas pateikiamas 1 priedėlyje.

Kadangi metodikose numatytas karantininio organizmo nustatymas ir gyvybingos R. solanacearum kultūros bus naudojamos kaip kontrolinė medžiaga, procedūras reikės atlikti karantino sąlygomis, naudojantis atitinkamais atliekų pašalinimo įrenginiais ir sąlygomis, kurias licencijavo oficialios augalų karantino institucijos.

Testavimo parametrai privalo užtikrinti nuolatinį ir atkartojamą R. solanacearum nustatymo lygmenį esant nustatytoms pasirinktų metodų nustatymo jautrumo slenkstinėms riboms.

Privaloma tiksliai paruošti teigiamas kontrolines medžiagas.

Atliekant testą atsižvelgus į reikalaujamas metodo jautrumo slenkstines ribas taip pat padaroma prielaida, kad reikia pasirinkti teisingus nustatymus, atlikti įrangos kalibravimą ir techninę priežiūrą, rūpestingai tvarkyti ir saugoti reagentus ir imtis visų priemonių, kad būtų išvengta kryžminės taršos tarp bandinių, t. y. teigiamus kontrolinius bandinius atskiriant nuo tiriamųjų bandinių. Siekiant išvengti administracinių ir kitokių klaidų, ypač susijusių su ženklinimu etiketėmis ir dokumentų tvarkymu, privaloma taikyti kokybės kontrolės standartus.

Įtarus organizmo buvimą, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 4 straipsnio 2 dalyje, daroma prielaida, kad atliekant bandinio diagnostinį arba atrankos testą gaunamas teigiamas rezultatas, kaip nurodyta vaizduojamose diagramose. Jei pirmojo atrankos testo (IF arba PGR/FISH) rezultatas teigiamas, jį privaloma patikrinti atliekant antrąjį atrankos testą, pagrįstą kitokiu biologiniu principu.

Jei pirmojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtariamas užkrėtimas R. solanacearum ir privaloma atlikti antrąjį atrankos testą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtarimas (įtariamas buvimas) patvirtinamas ir būtina toliau atlikti plane nurodytus testus. Jei antrojo atrankos testo rezultatas neigiamas, tada bandinys nėra laikomas užkrėstu R. solanacearum.

Patvirtinimo buvimas, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 5 straipsnio 1 dalyje, reiškia, kad buvo išskirta ir identifikuota grynoji R. solanacearum kultūra ir patvirtintas jos patogeniškumas.

I SKIRSNIS

TYRIMŲ PLANO TAIKYMAS 1. Nustatymo, kuriuo siekiama diagnozuoti ii. solanacearum sukeliamą bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų, turinčių rudojo puvinio ar bakterinio vytulio simptomų, rudąjį puvinį ar bakterinį vytulį, planas.

Šis tyrimas yra taikomas tiriant bulvių stiebagumbius ir bulvinių šeimos augalus, turinčius arba įtariamus turint tipinių rudojo puvinio ar vaskuliarinio vytimo simptomų. Jį sudaro greitos atrankos testas ir patogeno išskyrimas iš užkrėsto vaskuliarinio audinio, pasėjimas į (selektyvią) kultūrinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, Ralstonia solanacearum kultūros identifikavimas.

Tyrimo procedūra skirta bulvių stiebagumbių latentinėms infekcijoms nustatyti. Mažiausiai du atrankos testai, paremti skirtingais biologiniais principais, turi būti teigiami, kad papildomai būtų išskirtas patogenas ir tipiškų kolonijų išskyrimo atveju patvirtinta gryna kultūra kaip R. solanacearum štamas. Tik vieno atrankos testo teigiamo rezultato nepakanka bandiniui įtarti.

Atrankos testų ir išskyrimo testų nustatymo jautrumo slenkstinė riba turėtų siekti 103–104 ląstelių/ml pakartotinai suspenduotose nuosėdose, naudojamose kaip teigiama kontrolė atliekant kiekvieną testų seriją.

II SKIRSNIS

RALSTONIA SOLANACEARUM NUSTATYMO BULVIŲ STIEBAGUMBIUOSE IR BULVIŲ, POMIDORŲ IR KITUOSE AUGALUOSE ŠEIMININKUOSE, TURINČIUOSE RUDOJO PUVINIO ARBA BAKTERINIO VYTULIO POŽYMIŲ, IŠSAMŪS METODAI 1. Simptomai (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main) 1.1. Bulvių simptomai Bulvės augalas. Pirmoji užkrėtimo stadija – viršutinių augalo lapų vytimas esant aukštai dienos temperatūrai ir atsigavimas naktį. Ankstyvojo užkrėtimo metu vystantys lapai išlieka žali, tačiau vėliau pageltonuoja ir vystosi rudoji nekrozė. Gali pasitaikyti ir epinastijų. Tačiau labai greitai lapai negrįžtamai nuvysta ir augalas žūva. Skersai nupjautų nuvytusių augalų stiebų apytakinis audinys gali paruduoti, ir iš nupjauto paviršiaus išsiskiria arba gali būti lengvai išspaudžiamos į pieną panašios išskyros. Nupjautą stiebą vertikaliai panardinus į vandenį, iš apytakinių pluoštų nusidriekia gleivių siūlai.

Bulvės stiebagumbis. Bulvės stiebagumbis turi būti perpjaunamas skersai arti stolonų prisisegimo vietos. Ankstyvajai užkrėtimo stadijai būdingas apytakinio žiedo išblukimas, spalva keičiasi nuo blizgančios geltonos iki šviesiai rudos spalvos. Iš apytakinio žiedo po kelių minučių spontaniškai išsiveržia šviesiai kreminės spalvos išskyros. Vėliau apytakinis išblukimas paruduoja, ir nekrozė gali išsiplėsti iki parenchimos. Progresuojančios ligos stadijose užkrečiančios bakterijos išsiveržia iš stolono prisisegimo vietos ir akučių, dėl to prie bakterijų gleivių prilimpa dirvos dalelės. Dėl vidinių vaskuliarinių audinių suirimo odelėje gali atsirasti lengvai įdubusių raudonai rudų pažeidimų. Paskesnėms ligos stadijoms būdingas grybų ir bakterijų sukeliamo šlapiojo puvinio susidarymas.

1.2. Pomidorų simptomai Pomidoro augalas. Pirmasis pastebimas požymis – tai labai glebni jauniausi augalo lapeliai. Palankiomis patogenui aplinkos sąlygomis (dirvos temperatūra – apie 25 °C, dirva prisotinta drėgmės) po keleto dienų vyksta epinastija ir vienos augalo pusės arba viso augalo vytimas ir galiausiai augalas žūva. Mažiau palankiomis sąlygomis (dirvos temperatūra – mažesnė nei 21 °C) ant stiebo gali išsivystyti daug papildomų šaknų. Nuo stiebo pagrindo galima pastebėti kylančius stiebe vandeningus dryželius, kurie įrodo apytakinės sistemos nekrozę. Perpjovus stiebą, iš išblukusių rudų apytakinių stiebo audinių išsiskiria balti arba gelsvi bakterinio skysčio lašeliai.

1.3. Kitų augalų šeimininkų simptomai Solanum dulcamara ir S. nigrum augalai. Natūraliomis sąlygomis vytimo simptomai retai stebimi šiuose piktžoliniuose augaluose šeimininkuose, nebent dirvos temperatūra viršija 25 °C arba inokuliavimo laipsnis yra pernelyg didelis (pvz., S. nigrum auga šalia sergančių bulvių ar pomidorų augalų). Vytulio atveju simptomai panašūs į pomidorų simptomus. Nevystančiuose S. dulcamara augaluose, kurių stiebai ir šaknys auga vandenyje, galima pastebėti neryškų išblukimą stiebo pagrindo arba povandeninių augalo dalių vaskuliariniuose audiniuose, atlikus skersinį pjūvį. Bakterijos gali sunktis iš prapjautų vaskuliarinių audinių arba sudaryti gleivėtus siūlus, jei prapjautas stiebas įkišamas į vandenį vertikaliai, netgi nesant vytulio simptomų.

2.1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas (žr. VI skirsnio A dalies 1 punktą.) 2.2. Poli-β-hidroksibutirato (PHB) granulių aptikimas Būdingos PHB granulės stebimos R. solanacearum ląstelėse, kai iš užkrėsto audinio gautų bakterinių išskyrų karščiu fiksuoti tepinėliai stebimi mikroskopu, prieš stebėjimą tepinėlį nudažius Nile Blue A arba Sudan Black dažu (žr. VI skirsnio A dalies 2 punkte).

2.3. Serologinės agliutinacijos testai (žr. VI skirsnio A dalies 3 punktą) 2.4. Kiti testai Kiti atitinkami greitieji atrankos testai yra šie: IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą), FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą), imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) ir PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą).

III SKIRSNIS

Prieš bandinio paruošimą galima atlikti išankstinį apdorojimą:

1.1.1. Kiekvieno stiebagumbio (stolono) viršūnės oda pašalinama švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba daržovėms pjaustyti skirtu peiliu taip, kad vaskuliarinis audinys taptų matomas. Kruopščiai išpjaunama stiebagumbio viršūnės vaskuliarinio audinio šerdis, kad nevaskuliarinio audinio būtų kuo mažiau (žr. Komisijos svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main).

Pastaba. Atskirti bet kurį pūvantį stiebagumbį: stiebagumbius su įtariamais rudojo puvinio simptomais ištirti atskirai.

Jei šalinant stiebagumbio viršūnę yra stebimi įtariami rudojo puvinio simptomai, tai reikia apžiūrėti šio stiebagumbio dalį prie viršūnės. Bet kurį perpjautą stiebagumbį reikia mažiausiai dvi dienas laikyti kambario temperatūroje, kad šis sukamštėtų, ir paskiau stiebagumbį atitinkamomis karantino sąlygomis laikyti atšaldytą (4–10 °C temperatūroje). Visus stiebagumbius, įskaitant ir stiebagumbius su įtariamais simptomais, reikėtų laikyti, atsižvelgiant į III priedą.

1.1.2. Stiebagumbių viršūnių gabaliukai surenkami į nepanaudotas vienkartines talpyklas, kurias galima uždaryti ir (arba) užplombuoti. Jau panaudotas talpyklas reikėtų kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti chloro junginiais. Pirmiausia stiebagumbių viršūnių gabaliukus reikėtų apdoroti nedelsiant. Jei tai padaryti neįmanoma, jie, nepridedant buferio, šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas yra saugomi talpykloje.

Stiebagumbio viršūnės gabaliukai apdorojami pagal vieną iš šių procedūrų:

Pastaba. Bandinių kryžminės taršos rizika yra ypač didelė, kai bandiniai homogenizuojami naudojant maišyklę. Stengiantis išvengti aerozolio susidarymo arba nuotėkio išskyrimo metu yra imamasi atsargumo priemonių. Užtikrinama, kad kiekvienam bandiniui būtų naudojami atskiri ką tik sterilizuoti maišyklės peiliai ir indai. Jei atliekamas PGR testas, stengiamasi išvengti dauginamosios medžiagos pernešimo per talpyklas ar malimo aparatą. Atliekant PGR testą malimą rekomenduojama atlikti vienkartiniuose maišeliuose ir vienkartiniuose vamzdeliuose.

1.1.3. Viršnuosėdinis skystis nupilamas. Jei jis pernelyg drumstas, skaidrinamas lėtai centrifuguojant (10 minučių ne didesniu kaip 180 g greičiu 4–10 °C temperatūroje) arba filtravimu vakuume (40–100 um), perplaunant filtrą papildomu (10 ml) išskyrimo buferiniu tirpalu.

1.1.4. Bakterijos frakcija koncentruojama 15 minučių centrifuguojant 7 000 g greičiu (arba 10 minučių – 10 000 g greičiu) 4–10 °C temperatūroje, ir viršnuosėdinis skystis nupilamas nepažeidžiant nuosėdų.

1.1.5. Nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 1,5 ml nuosėdoms skirtame buferiniame tirpale (4 priedėlis). Naudojama 500 ml R. solanacearum, 500 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ir 500 ml etaloniniams tikslams. Įpilama sterilaus glicerino, kad etaloninės alikvotinės dalies ir likutinės tiriamosios alikvotinės dalies 500 ml galutinė koncentracija siektų 10–25 % (tūris/tūris), sumaišoma ir saugoma temperatūroje nuo -16 iki -24 °C (savaites) arba nuo -68 iki -86 °C (mėnesius). Tyrimo metu tiriamosios alikvotinės dalys saugomos 4–10 °C temperatūroje.

Kartotinis sušaldymas ir atitirpdinimas nerekomenduotini.

Jei ekstraktą reikia vežti, jis šaldomoje dėžėje pristatomas per 24 valandas.

1.1.6. Siekiant išvengti užkrėtimo, visus R. solanacearum teigiamus kontrolinius bandinius ir tiriamuosius bandinius būtina laikyti atskirai. Šitaip daroma paruošiant IF plokšteles ir atliekant visus testus.

1.2. Tyrimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose:

Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą) IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą) FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą) Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą) 2. R. solanacearum nustatymo ir identifikavimo besimptominių bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose išsamūs metodai 2.1. Bandinio paruošimas Pastaba. Siekiant aptikti latentines R. solanacearum populiacijas, rekomenduojama tirti sudėtinius bandinius. Ši tvarka gali būti sėkmingai taikoma tiriant 200 stiebų dalių sudėtinius bandinius. Atliekant apžiūras, rekomenduojama naudoti statistiškai patikimą tiriamąjį augalo populiacijos bandinį.

2.1.1. Nuo kiekvieno stiebo antžeminės dalies švariu dezinfekuotu peiliu arba genėjimui skirtu sekatoriumi atpjaunamas 1-2 cm segmentas.

Jauni pomidorų daigai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas.

Lauke arba šiltnamyje auginami pomidorų augalai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo pagrindinio kiekvieno augalo stiebo atpjaunama žemiausiai esanti šakelė. Nuo kiekvienoje pusėje esančios šakelės žemiausios dalies atpjaunamas 1 cm segmentas.

Kiti augalai šeimininkai: švariu dezinfekuotu peiliu arba sekatoriumi nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas. S. dulcamara ar kitų vandenyje auginamų augalų šeimininkų atveju nuo povandeninių stiebo dalių ar stolonų, turinčių vandenyje esančias šaknis, atpjaunami 1–2 cm segmentai.

Kai imtis atliekama konkrečioje vietoje, rekomenduojama tirti statistiškai reprezentatyvių 10 augalų imtį, paimtą kiekvienoje galimų piktžolinių augalų šeimininkų bandinių paėmimo vietoje. Patogeninio organizmo aptikimą patikimiausiai galima atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, nors gamtoje vykstančius užkrėtimus ištisus metus galima nustatyti tarp daugiamečių Solanum dulcamara augalų, augančių vandentakiuose. Žinomiems augalams šeimininkams priklauso savaime įsisėjantys augalai (dirvožemio tvarkytojai) Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ir kiti bulvinių šeimos augalai. Kiti šeimininkai yra Pelargonium spp. ir Portulaca oleracea. Prie kai kurių augalų šeimininkų, augančių Europoje ir tam tikromis aplinkos sąlygomis savo šaknyse ir (arba) rizosferoje galinčių turėti 2 biovarieteto 3 rasės R. solanacearum populiacijų, galima priskirti šiuos augalus: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ir Urtica dioica.

Pastaba. Vidinių simptomų (vaskuliarinio audinio dažymasis arba bakterijų išskyros) vizualinį įvertinimą reikia atlikti šio tyrimo etape. Bet kurie simptomų turintys stiebo segmentai atskiriami vieni nuo kitų ir išanalizuojami (žr. II skirsnį).

2.1.2. Stiebo segmentai trumpai dezinfekuojami 70 % etilo alkoholiu ir nedelsiant išdžiovinami sugeriamuoju popieriumi. Po to stiebo segmentai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:

2.1.3. 15 minučių leidus susidaryti nuosėdoms, viršnuosėdinis skystis nupilamas.

2.1.4. Paprastai paskiau nereikalaujama skaidrinti ekstrakto arba koncentruoti bakterinės frakcijos, tačiau tai galima atlikti filtruojant ir (arba) centrifuguojant, kaip aprašyta III.1.1.3-1.1.5 skirsniuose.

2.1.5. Neskiestas arba koncentruotas bandinio ekstraktas padalijamas į dvi lygias dalis. Viena dalis tiriama ir saugoma 4–10 °C temperatūroje, o kita saugoma 10–25 % (tūris/tūris) steriliame glicerine temperatūroje nuo -16 iki -24°C (savaites) arba nuo -68 iki -86 °C (mėnesį) tuo atveju, jeigu bus reikalingi tolesni bandymai.

2.2. Tyrimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose:

Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą) IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą) FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą) Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą)

IV SKIRSNIS

2.1. Bandinio paruošimas Pastabos:

2.1.1. Pasirinktose imties vietose paimti vandens bandinius, pripildant vienkartinius mėgintuvėlius ar butelius vandens, paimto iš 30 cm gylio ir ne daugiau kaip 2 m nuo kranto. Jei bus tiriama perdirbimo atliekos arba nuotekų vandenys, bandinius paimti nuotekų išmetimo vietoje. Rekomenduojama imties vietoje paimti iki 500 ml tūrio bandinius. Jei paimami mažesnio tūrio bandiniai, rekomenduojama paimti bandinius imties vietoje mažiausiai tris kartus, kiekvieno bandinio atlikti du poėmių pakartojimus, kurių kiekvieno tūris yra mažiausiai 30 ml. Atliekant intensyvesnį tyrimą, pasirinkti mažiausiai tris imties vietas 3 km ilgio vandentakyje ir užtikrinti, kad bandiniai taip pat bus paimami iš intakų, įtekančių į vandentakį.

2.1.2. Bandiniai vežami vėsiai (4–10 °C) tamsoje ir ištiriami per 24 valandas.

2.1.3. Jei reikia, bakterijų frakcija gali būti koncentruojama šiais metodais:

Tiriant bulvių perdirbimo arba nuotekų vandenų bandinius koncentravimas paprastai nerekomenduojamas, nes dėl padidėjusių saprofitinių bakterijų skaičiaus yra slopinamas Ralstonia solanacearum nustatymas.

2.2. Testavimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų aprašymą atitinkamuose priedėliuose.

V SKIRSNIS

Aptikimo jautrumo apribojimus, susijusius su šiuo tyrimo planu, reikėtų apsvarstyti, kai yra vertinamas bet kokių gautų neigiamų rezultatų patikimumas ir taip pat kai yra atliekami patikrinimai, siekiant nustatyti patogeno buvimą arba nebuvimą dirvožemyje ir dumble. Patikimiausias patogeninio organizmo buvimo lauko dirvožemyje tyrimas yra jautraus užkrėtimui augalo šeimininko pasodinimas ir jo užkrėtimo stebėsena, tačiau ir šio metodo nustatymo jautrumas nėra pakankamas nedideliam užkrėtimo laipsniui nustatyti.

2.1. Bandinio paruošimas 2.1.1. Imant lauko dirvožemio bandinius, reikia laikytis nematodų imčiai taikomų standartinių principų. Kiekvienam bandiniui reikia surinkti 0,5–1 kg dirvožemio 60 imties vietų 0,3 ha ploto lauke 10–20 cm gylyje (arba iš 7 x 7 m žemės ploto). Įtarus patogeninio organizmo buvimą, bandinių imties vietų skaičių 0,3 ha plote reikia padidinti iki 120. Iki tyrimo bandiniai laikomi 12–15 °C temperatūroje. Bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandinių bendras svoris siekia 1 kg ir jie imami tiek imties vietų, kad būtų atitinkamas viso reikiamo ištirti dumblo tūris. Prieš tiriant kiekvienas bandinys sumaišomas.

2.1.2. 10–25 g dirvožemio arba dumblo poėmių dispergavimas 2 valandas atliekamas rotorine kratykle 250 rpm greičiu 60–150 ml išskyrimo buferiniame tirpale (4 priedėlis). Jei dispergavimą reikia pagreitinti, galima pripilti 0,02 % sterilaus Tween-20 ir įberti 10–20 g sterilaus žvirždo.

2.1.3. Tyrimo metu suspensiją laikyti 4 °C temperatūroje.

2.2. Tyrimas Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų aprašymą atitinkamuose priedėliuose.

VI SKIRSNIS

R. SOLANACEARUM NUSTATYMO IR IDENTIFIKAVIMO OPTIMIZUOTOS METODIKOS A. DIAGNOSTINIAI IR NUSTATYMO TESTAI 1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas Ralstonia solanacearum bakterijos buvimą vystančiuose bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų stiebuose galima įvertinti atlikus šį paprastą spėjamąjį bandymą: nupjauti stiebą truputį virš dirvos paviršiaus. Įmerkti nupjautą stiebą į menzūrą su vandeniu. Po kelių minučių stebėti būdingą spontaninį bakterijų gleivių siūlų tekėjimą iš apytakinių pluoštų.

Nile Blue dažo testas:

Sudan Black dažo testas:

Naudojamasi atitinkama patvirtinta selektyvią terpe, tokia kaip SMSA (kaip modifikuota Elphinstone et al., 1996; žr. 2 priedėlį).

Reikia rūpestingai atlikti R. solanacearum atskyrimą nuo kitų bakterijų, nes terpėje gali augti ir kitų rūšių bakterijos. Be to, gali išaugti netipiškos morfologijos R. solanacearum kolonijos dėl peraugimo ar bakterijų antagonistų. Įtarus konkurencijos ar antagonizmo atvejus, bandinys pakartotinai tiriamas kitu metodu.

Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti, tiriant ekstraktus, laikytus glicerine temperatūroje nuo -68 iki -86 °C.

Kaip teigiamą kontrolinį bandinį paruošti R. solanacearum virulentiško 2 biovarieteto štamo (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 kolonijų sudarančių vienetų viename mililitre suspensijos praskiedimų seką santykiu 1:10. Siekiant išvengti taršos, paruošiami teigiami kontroliniai bandiniai atskirai nuo tiriamųjų bandinių.

Kiekvienos selektyvios terpės partija patikrinama pagal patogeno sugebėjimą augti joje prieš pradedant įprastinių bandinių tyrimą.

Kontrolinė medžiaga tiriama taip pat, kaip ir bandinys.

4.1.1. Atlikti atitinkamą pasėjimo praskiedžiant operaciją, siekiant užtikrinti bet kokių pašalinių saprofitinių bakterijų populiacijų praskiedimą. Į kiekvieną lėkštelę pasėti po 50–100 ml kiekvieno praskiedimo bandinio.

4.1.2. Lėkštelės inkubuojamos 28 °C temperatūroje. Plokštelės analizuojamos po 48 valandų ir po to kasdien – auginimas trunka 6 dienas. Tipiškos R. solanacearum kolonijos SMSA terpėje būna pieno baltumo, lygios, netaisyklingos formos bei takios ir po 3 inkubacijos dienų kolonijų centre atsiranda nuo rausvos iki kraujo spalvos centrinis vidinis ruožuotumas arba menturiai (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/MembersPublic/irc/sanco/sancoeurophyt/libraryHome/main).

Pastaba. Kartais šioje terpėje išauga netipiškos R. solanacearum kolonijos. Jos gali būti mažos, apvalios, visiškai raudonos ir netakios arba iš dalies takios, todėl jas būna sunku atskirti nuo saprofitinių kolonijas sudarančių bakterijų.

4.1.3. R. solanacearum spėjamos kolonijos išgryninamos po pasėjimo į pagrindinę mitybinę terpę brėžimo arba praskiedimo būdu atskiroms kolonijoms gauti (žr. 2 priedėlį).

4.1.4. Kolonijos trumpai laikomos tamsoje steriliame kambario temperatūros vandenyje (pH 6–8, neturinčiame chloro) arba ilgą laiką – kriogeninėje apsauginėje terpėje esant temperatūrai nuo -68 iki -86 °C arba liofilizuojamos.

4.1.5. Spėjamos kultūros identifikuojamos (žr. VI skirsnio B dalį) ir atliekamas patogeniškumo testas (žr. VI skirsnio C dalį).

Selektyvaus pasėjimo rezultatų aiškinimas Selektyvaus pasėjimo testo rezultatai laikomi neigiamais, jei po 6 dienų auginimo bakterijų kultūros nestebimos arba tipiškų R. solanacearum kolonijų nėra, laikantis nuostatos, kad slopinimas nevyko dėl kitų bakterijų konkurencijos ar antagonizmo ir kad tipiškos R. solanacearum kolonijos aptinkamos tik teigiamuose bandiniuose.

Selektyvaus pasėjimo testas teigiamas, jei išskiriamos spėjamos R. solanacearum kolonijos.

4.2. Praturtinimo procedūra Naudoti tokią patvirtintą terpę, kaip modifikuotas Wilbrink buljonas (žr. 2 priedėlį).

Ši procedūra gali būti taikoma R. solanacearum populiacijų bandinyje atrankai pagerinti ir aptikimo jautrumui padidinti. Sios procedūros metu PGR reakcijos inhibitoriai tinkamai praskiedžiami (1:100). Tačiau reikėtų pažymėti, kad R. solanacearum praturtinimas gali nepasisekti dėl saprofitinių bakterijų praturtinamų tuo pačiu metu, konkurencijos ar antagonizmo. Dėl šios priežasties R. solanacearum išskyrimas is praturtintų buljono terpėje auginamų kultūrų gali būti problemiškas. Be to, kadangi serologiškai giminingų saprofitų populiacijos gali padidėti, rekomenduojama imunofermentinei analizei atlikti vietoj specifinių monokloninių antikūnų naudoti polikloninius antikūnus.

4.2.1. Praturtinant PGR, 100 ml bandinio ekstrakto įpilama į 10 ml praturtinamojo sultinio (2 priedėlis), prieš tai išpilstyto alikvotinėmis dalimis į mėgintuvėlius ar kolbutes, neužkrėstas DNR. Praturtinant imunofermentinę analizę (ELISA), į praturtinamąjį sultinį galima įpilti didesnio tūrio tiriamųjų bandinių (pvz., 100 ml į 1,0 ml praturtinamojo sultinio).

4.2.2. Kultūros 72 valandas inkubuojamos 27–30 °C ant kratyklės arba nekratant kolbose, neužkimštose aklinai tam, kad šios vėdintųsi.

4.2.3. Prieš atliekant imunofermentinę analizę ar PGR gerai sumaišyti.

4.2.4. Atliekant abu testus, praturtinamasis sultinys paveikiamas lygiai taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.

Pastaba. Jei R. solanacearum praturtinimas slopinamas dėl didelio konkuruojančių saprofitinių bakterijų populiacijų skaičiaus, bandinių ekstraktų praturtinimą geriau atlikti prieš centrifugavimo ar koncentravimo kitu būdu operaciją.

Kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, išskyrimo, PGR ar FISH testą reikia atlikti kaip antrąjį atrankos testą. Kai IF testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, reikia atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad analizė būtų baigta.

Pastaba. Naudojami patvirtinti antikūniai, specifiški R. solanacearum (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnių partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta reakcija, tiriant homologinio R. solanacearum štamo 105–106 ląstelių/ml suspensiją ir naudojant atitinkamą gamintojo rekomenduojamą fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatą. Neišgrynintų polikloninių arba monokloninių antikūnių titras turėtų būti ne mažesnis kaip 1:2 000. Tyrimo metu antikūnius reikėtų praskiesti iki darbinio praskiedimo (DP), artimo ar lygaus jų titrui. Reikėtų tirti tik šviežiai pagamintus ekstraktus. Jei būtina, galima tirti glicerine temperatūroje nuo -68 iki -86 °C laikomus ekstraktus. Gliceriną iš bandinio galima pašalinti, įpylus 1 ml nuosėdų buferinio tirpalo (4 priedėlis), pakartotinai 15 minučių centrifuguoti 7 000 g greičiu ir pakartotinai suspenduoti, pripylus nuosėdų buferinio tirpalo lygų tūrį. Dažnai šitai atlikti nebūtina, ypač jei bandiniai fiksuojami ant plokštelės liepsna.

Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles su homologiniu arba bet kuriuo etaloniniu R. solanacearum štamu, suspenduotu bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3 priedėlio B dalyje, ir pirmiausia buferiniame tirpale.

Jei įmanoma, į tos pačios plokštelės duobutes turėtų būti pripilama natūraliai užkrėsto audinio preparato (palaikomo liofilizacijos arba šaldymo būdu nuo -16 iki -24 °C temperatūroje) kaip panašaus kontrolinio bandinio.

Anksčiau nustatytų kaip neigiamų bandinių ekstraktų alikvotinės dalys galėtų būti naudojamos kaip neigiamos kontrolės.

Prieinamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos išvardytos 3 priedėlyje.

Naudoti daug duobučių turinčias mikroskopines plokšteles, mažiausiai 6 mm storio ir geriausia turinčias 10 langelių.

Kontrolinis bandinys tiriamas taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.

5.1. Tyrimui skirtos plokštelės paruošiamos taikant vieną iš šių procedūrų:

Standartinis tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) 1:100 praskiestų pakartotinai suspenduotų bulvių nuosėdų lašinamas į pirmąjį langelį. Paskiau nepraskiestų (1/1) pakartotinai suspenduotų nuosėdų panašus tūris lašinamas į vienos tos pačios eilės langelius. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 1 pav.

Pakartotinai suspenduotos nuosėdos praskiedžiamos santykiu 1:10 ir 1:100 nuosėdų buferiniame tirpale. Standartinis pakartotinai suspenduotų nuosėdų tūris (15 ml tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) lašinamas į langelį ir vienoje langelių eilutėje atliekamas praskiedimas. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 2 pav.

5.2. Lašeliai išdžiovinami kambario temperatūroje arba šildomi 40–45 °C temperatūroje. Bakterinės ląstelės fiksuojamas prie plokštelės arba kaitinant (15 minučių 60 °C temperatūroje), arba liepsna, 95 % etilo alkoholiu arba bet kuria kita antikūnių tiekėjų nurodyta tvarka.

Jei būtina, fiksuotos plokštelės paskiau iki tyrimo gali būti kiek galima trumpiau (ilgiausiai 3 mėnesius) saugomos šaltai sausoje dėžėje.

5.3. IF tvarka

Paruošiamas antikūnių, dukart praskiestų IF buferiniu tirpalu, rinkinys. Į pirmąją duobutę įpilama 1/2 titro (T/2), į kitas – 1/4 titro (T/4), 1/2 titro (T/2), 1 titras (T) ir dukart titro antikūnių (2T).

Atliekamas antikūnų darbinis praskiedimas (DP) IF buferiniame tirpale. Praskiedimas turi įtakos antikūnų specifiškumui.

1 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio i punktą ir 5.3 skirsnio i punktą Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimai 2 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio ii punktą ir 5.3 skirsnio ii punktą Antiserumo/antikūnių darbinis praskiedimas 5.3.1. Plokštelės išdėliojamos ant sudrėkinto sugeriamojo popieriaus. Kiekvienas testuojamasis langelis sklidinai pripildomas praskiestų antikūnų tirpalo. Į kiekvieną langelį įpilamo antikūnių tirpalo tūris turi atitikti bent mažiausiai tiriamojo ekstrakto tūrį.

Antikūnių tiekėjams nepateikus vartojimo instrukcijų, laikomasi šios tvarkos:

5.3.2. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).

5.3.3. Nukratyti antikūnių lašelius nuo kiekvienos plokštelės ir atsargiai nuplauti su IF buferiniu tirpalu. Plaunama panardinant plokštelę į IF buferinį tirpalą, turintį Tween (4 priedėlis), ir palaikoma 5 minutes, o po to įpilama IF buferinio tirpalo ir laikoma dar 5 minutes. Vengti aerozolio susidarymo arba lašelių pernešimo, dėl kurio gali įvykti kryžminė tarša. Perteklinis vanduo atsargiai pašalinamas nusausinant.

5.3.4. Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus ir į duobutes įpilama FITC konjugato, atskiesto tiek, kiek jo tirpalas buvo panaudotas titrui nustatyti. Į duobutes įpilamo konjugato turis turi atitikti įpilamo antikūnio tirpalo tūrį.

5.3.5. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).

5.3.6. Konjugato lašeliai pašalinami iš plokštelės juos nukratant. Plokštelė skalaujama ir plaunama, kaip pirmiau aprašyta (5.3.3).

Atsargiai pašalinamas perteklinis vanduo.

5.3.7. Į kiekvieną tiriamąjį langelį pipete įlašinama po 5–10 ml 0,1 M glicerino fosfatinio buferinio tirpalo arba komercinio priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio tirpalo (4 priedėlis) ir plokštelė uždengiama dengiamuoju stikleliu.

5.4. IF testo rezultatai:

5.4.1. Tiriamąsias plokšteles stebėti epifluorescenciniu mikroskopu naudojant filtrus, tinkamus FITC sužadinimui, aliejaus ar vandens imersinius tirpalus bei 500-1 000 kartų padidinus. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių.

Pirmiausia stebima teigiama kontrolinė plokštelė. Ląstelės turi šviesiai fluorescuoti ir būti visiškai nusidažiusios esant nustatytam antikūnių titrui ar darbiniam praskiedimui. Jei dažymasis nepavyko, IF testą (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) reikia pakartoti.

5.4.2. Tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos R. solanacearum ląstelės (žr. žiniatinklio svetainę: http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą esant tam pačiam antikūnių praskiedimui. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančios ląsteles nekreipiama dėmesio.

Įtarus bet kokį užkrėtimą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad ant plokštelės dangtelio stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų).

5.4.3. Yra keletas būdingų IF testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų, panašių į R. solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, pasitaikančių bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų segmentų nuosėdose.

5.4.4. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles esant antikūnių titrui arba darbiniam praskiedimui, kaip nurodyta 5.3 skirsnyje.

5.4.5. IF rezultatų aiškinimas:

Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 x 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau.

Šio metodo, kaip pagrindinio atrankos testo, visas galimybes rekomenduojama panaudoti tik turint patirties tam tikroje srityje.

Pastaba. Išankstinio testavimo taikant šį metodą nustatymo geba 1 mililitre turėtų siekti 103–104 R. solanacearum ląstelių bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami. Kad visose laboratorijose būtų pasiektas didžiausias metodo nustatymo jautrumas ir specifiškumas, gali būti reikalaujama atlikti optimizavimo eksperimentus.

Naudoti patvirtintus PGR reagentus ir metodikas (žr. 6 priedėlį). Pirmiausia pasirinkti metodą, kurį taikant naudojama vidinė kontrolė.

Siekiant išvengti bandinio užteršimo tiriamąja DNR, imtis atitinkamų atsargumo priemonių. Kad būtų sumažinta taršos tiriamąja DNR galimybė, PGR testą turėtų atlikti prityręs molekulinės biologijos srityje dirbančių laboratorijų techninis personalas.

Neigiami kontroliniai bandiniai (DNR išskyrimo ir PGR atlikimo metu) visada turėtų būti laikomi galutiniais bandiniais, kuriais įrodoma, ar įvyko tarša DNR.

Atliekant PGR testą reikėtų taikyti šiuos neigiamus kontrolinius bandinius:

Reikėtų naudoti šiuos teigiamus kontrolinius bandinius:

Siekiant išvengti galimos taršos, teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių.

Reikėtų stengtis, kad bandinių ekstraktuose nebūtų dirvožemio. Todėl tam tikrais atvejais rekomenduotina išskyrimą atlikti naudojant plautas bulves, jei dirbama pagal PGR metodikas. Standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlyje.

6.1. DNR gryninimo metodai Naudoti teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, kaip aprašyta pirmiau 3 priedėlyje.

Kontrolinę medžiagą tirti taip pat, kaip ir bandinį.

Tiriamoji DNR iš sudėtingų bandinių substratų išskiriama įvairiais metodais, taigi PGR ir kitų fermentinių reakcijų inhibitoriai pašalinami ir tiriamoji DNR sukoncentruojama bandinio ekstrakte. Paskesnis metodas buvo optimizuotas tam, kad būtų panaudotas su patvirtintais PGR metodais, aprašytais 6 priedėlyje.

6.2. PGR 6.2.1. Tiriamosios ir kontrolinės PGR matricos paruošiamos pagal patvirtintą metodiką (VI. A.6 skirsnis). Bandinio DNR ekstraktas praskiedžiamas ypač grynu vandeniu santykiu 1:10.

6.2.2. Pagal paskelbtą metodiką paruošiamas atitinkamas PGR reakcijos mišinys taršai atsparioje aplinkoje (6 priedėlis). Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti daugybinę PGR metodiką, kurioje yra panaudojama ir vidinė kontrolė.

6.2.3. 2-5 ml DNR ekstrakto įpilama į PGR reakcijos mišinį, esantį steriliuose PGR skirtuose mėgintuvėliuose (žr. 6 priedėlis), kad bendras PGR reakcijos tūris būtų 25 ml.

6.2.4. Naudojamas neigiamas kontrolinis bandinys, sudarytas tik iš PGR reakcinio mišinio, ir vietoj bandinio į jį įpilama ypač gryno vandens.

6.2.5. Mėgintuvėliai įdedami į tą patį PGR reaktorių, kuris buvo naudojamas išankstinio tyrimo metu, ir atliekama atitinkamai optimizuota PGR reakcija (6 priedėlis).

6.3. PGR produkto analizė 6.3.1. Padaugintos matricinės DNR bandiniai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu. Kiekvieno bandinio į gelį įnešama mažiausiai po 12 ml padaugintos DNR reakcinio mišinio, sumaišyto su 3 ml įnešimo buferinio tirpalo (6 priedėlis). Naudojami 2,0 % (svoris/tūris) agarozės geliai, pagaminti taikant TRIS-acetato-EDTA (TAE) buferinį tirpalą (6 priedėlis), ir elektroforezė atliekama esant 5-8 V/cm. Naudojama atitinkamo ilgio DNR žymė, pvz., 100bp ilgio fragmentas.

6.3.2. DNR juostelės išryškinamos dažant etidiumo bromido dažu (0,5 mg/l) 30–60 minučių, imantis atsargumo priemonių, dirbant su šiuo mutagenu.

6.3.3. Gelis apžiūrimas, apšviečiant jį trumpųjų UV bangų peršvietėju (pvz., bangos ilgiui siekiant λ = 302 nm), stebimi numatomo ilgio padaugintos DNR fragmentai (6 priedėlis) ir nufotografuojami.

6.3.4. Gavus naujų duomenų arba esant naujiems atvejams, nustatomas padaugintos DNR autentiškumas atliekant likusios padaugintos DNR bandinio analizę restriktaze, jį inkubuojant kambario temperatūroje atitinkamo fermento ir buferinio tirpalo mišinyje (žr. 6 priedėlį). Suskaldyti fragmentai analizuojami agarozės gelio elektroforezės metodu ir stebimas būdingas restrikcijos fragmentas, gelį apšviečiant UV peršvietėju, nudažius etidiumo bromidu ir palyginant su nesuskaldytu ir suskaldytu teigiamu kontroliniu bandiniu.

PGR testo rezultato aiškinimas:

PGR testas neigiamas, jei specifinės padaugintas R. solanacearum DNR fragmentas tiriamajame bandinyje nenustatomas, bet jis nustatomas visuose teigiamuose kontroliniuose bandiniuose (kai daugybinė PGR atliekama naudojant augalo atžvilgiu specifinius vidinius kontrolinius pradmenis: antrasis PGR produktas numatomo dydžio turėtų būti padaugintas kartu su tiriamuoju bandiniu).

PGR testas yra teigiamas, jei aptinkama specifinė padaugintos R. solanacearum numatomo dydžio DNR ir jos fragmentas, suskaldytas restriktaze (kai reikalaujama), ir laikomasi nuostatos, kad jis negaunamas iš bet kurio neigiamo kontrolinio bandinio. Patikimas teigiamo rezultato patvirtinimas gali būti gaunamas pakartojant testą ir naudojant antrąjį DNR pradmenų rinkinį (6 priedėlis).

Pastaba. PGR inhibiciją galima įtarti, jei padaugintos matricinės DNR gaunama iš teigiamo kontrolinio bandinio, turinčio R. solanacearum vandenyje, tačiau neigiami rezultatai gaunami naudojant teigiamą kontrolinį bandinį, turintį R. solanacearum bulvių ekstrakte. Daugybinę PGR atliekant ir naudojant vidinę PGR kontrolę, reakcijos inhibicija stebima negavus abiejų padaugintų matricinių DNR.

Taršą galima įtarti, jei numatoma padauginta DNR gaunama iš daugiau nei vieno neigiamo kontrolinio bandinio.

Pastaba. Naudoti patvirtintus oligonukleotidų, specifiškų R. solanacearum bandinius (7 priedėlis). Taikant šį metodą, išankstinio testavimo nustatymo geba turėtų siekti 103–104 R. solanacearum ląstelių viename mililitre bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami.

Ši tvarka pirmiausia turėtų būti taikoma šviežiai paruoštam bandinio ekstraktui, tačiau ją taip pat galima taikyti bandinio ekstraktui, kuris buvo laikomas glicerine nuo -16 iki -24 °C arba nuo -68 iki -86 °C temperatūroje.

Bandinio ekstrakto, nustatyto kaip neturinčio R. solanacearum ląstelių, alikvotines dalis naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.

3-5 dienų amžiaus kultūrų suspensijas, turinčias R. solanacearum (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 štamo) 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale 105–106 ląstelių/ml, reikėtų naudoti kaip teigiamus kontrolinius bandinius (apie paruošimą žr. 3 priedėlyje). Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, skirtas homologiniam arba bet kuriam etaloniniam R. solanacearum štamui, suspenduotam bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3B priedėlyje.

Fluoresceino izotiocianato (FITC) žyme pažymėti oligonukleotidiniai bandiniai, specifiški eubakterijoms, labai naudingi kontroliuojant hibridizavimo procesą, kadangi jais nudažomos visos bandinyje esančios bakterijos.

Įsigyjamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlio A dalyje.

Kontrolinis bandinys tiriamas tokiu pat būdu, kaip ir tiriamasis bandinys.

7.1. Bulvių ekstrakto fiksavimas Paskesnė metodika pagal Wullings et al. (1998):

7.1.1. Paruošti fiksavimo tirpalą (žr. 7 priedėlį).

7.1.2. Į Eppendorf mėgintuvėlį įlašinama po 100 ml kiekvieno bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlis 7 minutes centrifuguojamas 7 000 g greičiu.

7.1.3. Nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos ištirpinamos 200 ml fiksažo, paruošto prieš trumpiau kaip 24 valandas. Mėgintuvėlis sumaišomas ir 1 valandą inkubuojamas šaldytuve.

7.1.4. 7 minutes centrifuguojama 7 000 g, nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 75 ml 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale (žr. 7 priedėlį).

7.1.5. Į švarios daug duobučių turinčios plokštelės duobutes įlašinama po 16 ml fiksuotų suspensijų taip, kaip parodyta 3 pav. Kiekviena plokštelė skiriama 2 bandiniams ištirti, įlašinant juos nepraskiestus po 10 ml, ir paskiau padaryti 1:100 praskiedimą (0,01 M fosfatiniu buferiniu tirpalu). Likusį bandinio tirpalą (49 ml) galima saugoti 20 °C temperatūroje, pripylus 1 tūrį 96 % etilo alkoholio. Jei reikia pakartoti FISH testą, etilo alkoholis pašalinamas, centrifuguojant ir pripilant tokį pat tūrį 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo (sumaišoma, pavartant aukštyn ir žemyn).

7.1 pav. FISH testui skirtos plokštelės išklotinė 7.1.6. Plokštelės džiovinamos ore (arba plokštelių džiovintuve 37 °C temperatūroje) ir fiksuojamos liepsna.

Šiame etape darbą galima nutraukti ir hibridizavimą atlikti kitą dieną. Plokštelės turi būti nedulkėtos ir jas reikia laikyti sausas kambario temperatūroje.

7.2. Hibridizavimas 7.2.1. Vanduo pašalinamas iš ląstelių, kas minutę įpilant laipsniškai didėjančios koncentracijos – 50 %, 80 % ir 96 % – etilo alkoholio. Plokštelės džiovinamos, įdėjus jas į plokštelėms skirtą laikiklį.

7.2.2. Parengiama drėgna inkubavimo kamera, oro nepraleidžiančios dėžės dugną uždengus sugeriamuoju arba filtriniu popieriumi, išmirkytu 1x hybmix (7 priedėlis). Dėžė mažiausiai 10 minučių paliekama hibridizavimui skirtoje krosnelėje 45 °C temperatūroje.

7.2.3. Paruošti hibridizacijos tirpalą (7 priedėlis), į vienos plokštelės 8 duobutes (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 ir 10 duobutes, žr. 7.1 pav.) įpilti 10 ml ir 2 centrines duobutes (3 ir 8) palikti laisvas.

7.2.4. Kiekviena plokštelė uždengiama dviem apsauginėmis juostelėmis (24 x 24 mm), kad neprasiskverbtų oras. Plokštelės sudedamos į pašildytą drėgną kamerą ir 5 valandas krosnelėje 45 °C temperatūroje tamsoje atliekamas hibridizavimas.

7.2.5. Į tris laboratorines kolbas įpilama po 1 l Milli Q (molekulinės biologijos darbams skirto) vandens, po 1 1 lx hybmix tirpalo (334 ml 3x hybmix ir 666 ml Milli Q vandens) ir 1 1 l/8x hybmix (42 ml 3x hybmix ir 958 ml Milli Q vandens). Kiekviena kolba pašildoma vandens vonioje 45 °C temperatūroje.

7.2.6. Plokštelės atidengiamos ir įdedamos į plokštelių laikiklį.

7.2.7. Bandinio perteklius pašalinamas 15 minučių inkubuojant plokštelę laboratorinėje kolboje, į ją įpylus lx hybmix, 45 °C temperatūroje.

7.2.8. Plokštelių laikiklis pamerkiamas į 1/8 hybmix plovimo tirpalą ir inkubuojamas dar 15 minučių.

7.2.9. Plokštelės trumpam pamerkiamos į Milli Q vandenį ir padedamos ant filtrinio popieriaus. Perteklinis vanduo pašalinamas, paviršių padengiant filtriniu popieriumi. Į kiekvieną langelį pipete įlašinama po 5–10 ml priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškintojo tirpalo (pvz., Vectashield, Vecta Laboratories, CA, JAV, arba jam lygiaverčio) ir visa plokštelė uždengiama viena (24 x 60 mm) dengiančiąja juostele.

7.3. FISH testo rezultatai 7.3.1. Plokšteles, pamerktas į imersinį aliejų, nedelsiant stebėti mikroskopu, tinkančiu epifluorescencinei mikroskopijai, ir padidinus 630 ir 1 000 kartų. Bandinyje esančias eubakterines ląsteles (įskaitant Gram(-) ląsteles) stebint per filtrą, tinkantį fluoresceino izotiocianatui (FITC), jos atrodo fluorescuojančiai žaliai. Cy3 dažu dažytas R. solanacearum ląsteles stebint per filtrą, skirtą tetrametilrodamino-5-izotiocianatui, jos fluorescuoja raudonai. Palyginti tiriamųjų ir teigiamų kontrolinių ląstelių morfologiją. Ląstelės turi fluorescuoti šviesia spalva ir būti visiškai nusidažiusios. FISH testą (VI. A.7 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių.

7.3.2. Stebėti būdingos morfologijos šviesiai fluorescuojančias R. solanacearum ląsteles tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.

7.3.3. Įtarus bet kokią taršą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai dėl buferinio tirpalo taršos visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės, arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų) ant plokštelės dangtelio.

7.3.4. Yra keletas būdingų FISH testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į R. solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, nors tokie atvejai gerokai retesni nei IF testo atveju tiriant bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų segmentų nuosėdas.

7.3.5. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles.

7.3.6. FISH testo rezultatų aiškinimas:

Pastaba. Naudoti tik patvirtintus antikūnus, specifiškus R. solanacearum (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnų partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta optimali reakcija, kai tiriama R. solanacearum homologinio štamo 105–106 ląstelių viename mililitre suspensija, naudojant atitinkamus antrinių antikūnų konjugatus, remiantis gamintojo rekomendacijomis. Tyrimo metu antikūnų titras turi būti darbinis ir artimas arba lygus komercinio preparato titrui. Nustatyti antikūnų titrą R. solanacearum homologinio štamo suspensijoje, kurios 1 ml yra 105–106 ląstelių.

Bandinio ekstraktą, kuris, kaip anksčiau įrodyta, buvo neigiamas R. solanacearum atžvilgiu, ir kryžmiškai nereaguojančių bakterijų fosfatiniame buferiniame tirpale suspensiją naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.

Bandinio ekstrakto alikvotines dalis, kurias sumaišius su 103–104 R. solanacearum 2 biovarieteto (pvz., štamo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, žr. 2A ir B priedus) suspensija ir nustačius, kad jos buvo neigiamos R. solanacearum atžvilgiu, naudoti kaip neigiamą kontrolinį bandinį. Atliekant kiekvienos plokštelės rezultatų palyginimą naudojama standartinė R. solanacearum 105–106 ląstelių fosfatiniame buferiniame tirpale suspensija. Užtikrinti, kad atliekant testą plokštelės duobutėse įpilti teigiami kontroliniai bandiniai būtų tinkamai atskirti nuo tiriamųjų bandinių Standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, skirtos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlio A dalyje.

Testui skirtą kontrolinę medžiagą tirti taip pat, kaip ir bandinį (bandinius).

Patvirtintos dvi imunofermentinės analizės metodikos.

Į mažiausiai dvi duobutes įpilti po 190 ml bandinio ekstrakto. Į kiekvienos plokštelės dvi duobutes įpilti teigiamų ir neigiamų kontrolinių tirpalų ir 16 valandų inkubuoti 4 °C temperatūroje.

Imunofermentinės analizės rezultatų aiškinimas Imunofermentinė analizė laikoma neigiama, jei bandinių, esančių dviejose duobutėse (bandinys ir jo pakartojimas), vidutinis optinis tankis (OT) dukart mažesnis už neigiamo bandinio ekstrakto, esančio 1 duobutėje, optinį tankį, laikantis nuostatos, kad visų teigiamų kontrolinių bandinių optinis tankis didesnis nei 1,0 (pasibaigus 90 minučių trukusiai inkubacijai su substratu) ir dukart didesnis už neigiamų bandinių ekstraktų optinį tankį.

Imunofermentinė analizė laikoma teigiama, jei bandinių, esančių dviejose duobutėse (bandinys ir jo pakartojimas), vidutinis optinis tankis (OT) dukart didesnis už neigiamo bandinio ekstrakto, esančio 1 duobutėje, optinį tankį, laikantis nuostatos, kad visų neigiamų kontrolinių bandinių optinis tankis dukart mažesnis už visų teigiamų kontrolinių bandinių optinį tankį.

Teigiamo kontrolinio bandinio optinio tankio rodmenims esant neigiamiems, įrodoma, kad testas nebuvo tinkamai atliktas arba jo metu įvyko slopinimas. Neigiamų kontrolinių bandinių teigiami optinio tankio rezultatai rodo, kad įvyko kryžminė tarša arba prisijungė nespecifiniai antikūnai.

Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti tiriant ekstraktus, laikytus glicerine nuo -68 iki -86 °C temperatūroje.

Taikoma Janse metodika (1988):

9.1. Auginti 10 tiriamųjų jautrios veislės pomidorų augalų (pvz., veislę „Moneymaker“ arba lygiaverčio jautrumo užkrėtimui veislę, kaip nustatyta tyrimų laboratorijoje), kiekvienam bandomajam augalui esant trečiojo tikrojo lapelio stadijoje. Dėl auginimo žr. 8 priedėlį. Panašiai naudoti baklažanus (pvz., veislę „Black Beauty“ arba lygiavertę užkrėtimui jautrią veislę). Naudoti tik augalus, esančius 2–3 lapelio stadijoje, iki bus visiškai pasiekta trečiojo tikrojo lapelio stadija. Nustatyta, kad simptomai pasireiškia ne taip ūmiai ir lėčiau pasireiškia baklažanuose. Kai įmanoma, rekomenduojama auginti pomidorų daigus.

9.2. 100 ml bandinio ekstrakto paskirstoma po lygiai visiems tiriamiesiems augalams.

9.2.1. Inokuliavimas švirkštu Augalų stiebai virš sėklaskilčių inokuliuojami naudojant švirkštą su hipodermine adata (ne mažiau kaip 23G). Inokuliuojant visus augalus bandinio ekstraktas padalijamas po lygiai.

9.2.2. Inokuliavimas įpjovos vietoje Laikant augalą dviem pirštais, suspenduotų nuosėdų lašas (apytiksliai 5–10 ml) užlašinamas ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio.

Steriliu skalpeliu padaromas įstrižinis 1 cm ilgio ir 2/3 stiebo storio gylio pjūvis nuo tos vietos, kur buvo užlašintas suspenduotų nuosėdų lašas.

Naudojant švirkštą, pjūvis užsandarinamas steriliu vazelinu.

9.3. Taikant tą patį inokuliavimo metodą, 5 daigai inokuliuojami R. solanacearum virulentiško 2 biovarieteto štamo kultūros 105–106 ląstelių/ml vandenine suspensija 48 val., kaip teigiamu kontroliniu bandiniu, ir nuosėdų buferiniu tirpalu (4 priedėlis), kaip neigiamu kontroliniu bandiniu. Siekiant išvengti kryžminės taršos, teigiami ir neigiami kontroliniai augalai atskiriami nuo kitų augalų.

9.4. Augalai testams karantino sąlygomis 4 savaites laikomi 25–30 °C temperatūroje ir esant didelei santykinei drėgmei, tinkamai drėkinant, kad būtų išvengta vytimo, skurdimo dėl vandens trūkumo. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai ir neigiami kontroliniai augalai auginami aiškiai atskirtuose loveliuose šiltnamyje arba auginimui skirtoje patalpoje, o jei trūksta erdvės, juos prižiūrint yra užtikrinama atskirtis. Jei skirtingais bandiniais inokuliuojamus augalus reikia auginti kartu, jie atskiriami skydeliais. Tręšimo, laistymo, tikrinimo ir kitų operacijų metu labai rūpinamasi išvengti kryžminės taršos. Būtina užtikrinti, kad į šiltnamius ir auginimui skirtas patalpas nepatektų jokie vabzdžiai kenkėjai, nes jie gali pernešti bakteriją nuo vieno bandinio prie kito.

Stebėti vytimo, epinastijos, chlorozės ir (arba) žemaūgiškumo simptomus.

9.5. Atskirti užkrėstus augalus (II.3 skirsnis) ir identifikuoti grynas kultūras iš spėjamos R. solanacearum (VI. B skirsnis).

9.6. Jei simptomų nepastebima, po trijų savaičių atliekamas IF/PGR testas, naudojant sudėtinį bandinį, gautą iš kiekvieno tiriamojo augalo aukščiau inokuliavimo vietos paėmus 1 cm dydžio stiebo segmentą. Jei testo rezultatai teigiami, atliekamas selektyvaus pasėjimo į auginimo terpę testas (4.1 skirsnis).

9.7. Identifikuoti bet kurias išgrynintas spėjamas R. solanacearum kultūras (VI. B skirsnis).

Biotesto rezultatų aiškinimas Biotesto patikimi rezultatai gaunami, kai teigiamuose kontroliniuose augaluose pasireiškia tipiški simptomai, iš šių augalų galima išskirti bakteriją ir neigiamuose kontroliniuose augaluose simptomų pastebėta nebuvo.

Biotestas neigiamas, jei tiriamieji augalai neužkrečiami R. solanacearum, laikantis nuostatos, kad R. solanacearum aptinkama teigiamuose kontroliniuose augaluose.

Biotestas teigiamas, jei tiriamieji augalai užkrečiami R. solanacearum.

B. IDENTIFIKAVIMO TESTAI Spėjamų R. solanacearum izoliatų grynos kolonijos identifikuojamos taikant bent šiuos du testus, pagrįstus skirtingais biologiniais principais.

Atliekant kiekvieną testą, naudojami atitinkami etaloniniai štamai (žr. 3 priedėlį).

Testas Numatomas rezultatas Fluorescuojančio pigmento sintezė - Polibetahidroksibutirato intarpai + Oksidavimo/Fermentacijos (O/F) testas O+/F- Katalazės aktyvumas + Kovac'o oksidazės testas + Nitrato redukavimas + Citrato sunaudojimas + Augimas 40 °C temperatūroje - Augimas esant 1 % NaCl + Augimas esant 2 % NaCl - Arginino dihidrolazės aktyvumas - Želatinos skystėjimas - Krakmolo hidrolizė - Eskulino hidrolizė - Levano sintezė - 2. Imunofluorescencinė analizė (IF) 2.1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/l ml IF buferinio tirpalo suspensiją(4 priedėlis).

2.2. Atitinkamą antiserumą dukart praskiesti (žr. svetainę http://forum. europa. eu. int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Taikyti IF procedūrą (VI. A.5 skirsnis).

2.4. Imunofluorescencinės analizės rezultatas laikomas teigiamu, jei jos metu nustatytas kultūros titras yra lygiavertis kontrolinio bandinio titrui.

3.1. Paruošti apytiksliai 108 ląstelių vienąkart koncentruotame fosfatiniame buferiniame tirpale suspensiją (4 priedėlis).

3.2. Atitinkamai atlikti imunofermentinę analizę, naudojant monokloninį antikūną, specifišką R. solanacearum.

3.3. Imunofermentinės analizės rezultatas laikomas teigiamu, jei iš kultūros gauto bandinio optinis tankis yra lygus ne mažiau kaip pusei teigiamo kontrolinio bandinio optinio tankio.

4.2. 100 ml ląstelių suspensijos 4 minutes pakaitinti uždaruose mėgintuvėliuose termostate arba vandens vonelėje 100 °C temperatūroje. Paskui bandinius galima saugoti -16–24 °C temperatūroje tol, kol jų prireiks.

4.3. Atitinkamomis PGR procedūromis padauginami atitinkami R. solanacearum matricinės DNR fragmentai (pvz., Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4. R. solanacearum identifikuojama, jei padauginti matricinės DNR fragmentai yra to paties dydžio ir pasižymi tuo pačiu restrikcinio fragmento ilgio polimorfizmu, kaip ir teigiamas kontrolinis štamas.

5.2. Taikyti FISH procedūrą (VI. A.7 skirsnis) naudojant mažiausiai du oligonukleotidinius bandinius, specifiškus R. solanacearum (7 priedėlis).

5.3. FISH testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei tiriant kultūrą ir teigiamą kontrolinį bandinį gaunamas tas pats rezultatas.

6.2. Riebiųjų rūgščių tipą nustatyti taip, kaip nurodyta (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymo testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei spėjamos kultūros riebiųjų rūgščių tipas atitinka teigiamo kontrolinio bandinio riebiųjų rūgščių tipą. Būdingų riebiųjų rūgščių – 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ir 18:1 2OH – buvimas ir 16:0 3OH nebuvimas visiškai patvirtina užkrėtimą Ralstonia sp.

Atliekant kiekvieną testą, prireikus naudojamasi etaloniniais štamais (žr. 3 priedėlį).

7.1. Biovarieteto nustatymas R. solanacearum skirstoma į biovarietetus pagal sugebėjimą panaudoti ir (arba) oksiduoti tris disacharidus ir tris heksozės alkoholius (Hayward, 1964 ir Hayward et al., 1990). Atliekant biovarieteto nustatymo testą, naudojamasi auginimo terpe, aprašyta 2 priedėlyje. Testas atliekamas sėkmingai, jei terpė inokuliuojama grynomis R. solanacearum izoliatų kultūromis dūrio metodu ir inkubuojama 28 °C temperatūroje. Jei terpė išpilstoma į sterilias 96 duobučių plokšteles (1 duobutės tūriui siekiant 200 ml), tai per 72 valandas galima stebėti spalvos pokytį nuo alyvų žalumo iki geltonumo, įrodantį teigiamą testo rezultatą.

Biovertas 1 2 3 4 5 Sugebėjimas sunaudoti:

Maltozę - + + - + Laktozę - + + - + D (+) Celiobiozę - + + - + Manitolį - - + + + Sorbitolį - - + + - Dulcitolį - - + + - Nustatant 2 biovarieteto subfenotipus, atliekami papildomi testai.

Biovarietetas 2A (paplitęs visame pasaulyje) Biovarietetas 2A (aptinkamas Čilėje ir Kolumbijoje) Biovarietetas 2T (aptinkamas tropikuose) Trehalozės sunaudojimas - + + Mezo-inozitolio sunaudojimas + - + D ribozės sunaudojimas - - + Pektino skaldymo aktyvumas (1) mažas mažas didelis

7.2. Genominis „pirštų antspaudų“ metodas R. solanacearum štamų nustatymas molekulinės biologijos metodais apskritai atliekamas taikant šiuos tris metodus:

7.2.1. Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo analizė (Cook et al., 1989).

7.2.2. Pakartojamos sekos PGR naudojant pradmenis, specifiškus bakterinėms REP, BOX ir ERIC sekoms (Louws et al. 1995; Smithetal, 1995).

7.2.3. Padauginto fragmento ilgio polimorfizmo analizė (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. PGR metodai Specifiniai PGR pradmenys (Pastrik et al., 2002; žr. 6 priedėlį) gali būti naudojami nustatant R. solanacearum atskirus štamus, priklausančius 1 skyriui (3, 4 ir 5 biovarietetai) ir 2 skyriui (1, 2A ir 2T biovarietetai), kai anksčiau buvo nustatyta, atlikus restrikcijos fragmentų polimorfizmo analizę (Cook et al, 1989) bei nustatant 16S rDNR nukleotidų seką (Taghavi et al., 1996).

C. Patvirtinimo metodas Patogeniškumo testą privaloma atlikti galiausiai diagnozuojant R. solanacearum ir įvertinant kultūrų, identifikuojamų kaip R. solanacearum, virulentiškumą.

Mielių peptono gliukozės agaras (MPGA) Mielių ekstraktas (Difco) 5,0 g „Bacto“ peptonas (Difco) 5,0 g D(+) gliukozė (monohidratas) 10,0 g „Bacto“agaras (Difco) 15,0 g Distiliuotas vanduo 1,0 l Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.

Sacharozės peptono agaras (SPA) Sacharozė 20,0 g „Bacto“ peptonas (Difco) 5,0 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g „Bacto“agaras (Difco) 15,0 g Distiliuotas vanduo 1,0 l pH 7,2–7,4 Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.

Kelmano tetrazolio terpė Kazamino rūgštys (Difco) 1,0 g „Bacto“ peptonas (Difco) 10,0 g Dekstrozė 5,0 g „Bacto“ agaras (Difco) 15,0 g Distiliuotas vanduo 1,0 l Ingredientus ištirpinti ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.

Atvėsinti iki 50 °C ir pripilti steriliai perfiltruoto 2,3,5-trifeniltetrazoliumo chlorido (Sigma) tirpalo, kad galutinė koncentracija siektų 50 mg/l.

Atvėsinti iki 50 °C ir įpilti šių ingredientų tirpalų, prieš tai juos steriliai perfiltravus, kad būtų gautos nurodytos galutinės koncentracijos:

Kristalvioleto (Sigma) 5 mg/l Polimiksino B sulfato (Sigma P-1004) 600 000 U/l (apytiksliai 100 mg) Bacitracino (Sigma B-0125) 1 250 U/l (apytiksliai 25 mg) Chloramfenikolo (Sigma C- 317 5) 5 mg/l Penicilino G (Sigma P-3032) 825 U/l (apytiksliai 0,5 mg) 2,3,5-trifeniltetrazoliumo chlorido (Sigma) 50 mg/l Pastaba.

Terpę ir antibiotikų koncentruotus tirpalus saugoti 4 °C temperatūroje tamsoje ir sunaudoti per vieną mėnesį. Prieš naudojimą lėkštelių paviršiuje neturi būti vandens lašelių. Vengti perteklinio plokštelių perdžiovinimo.

Kokybės kontrolę reikėtų atlikti paruošus kiekvienos naujos partijos terpę ir, pasėjus į ją R. solanacearum etaloninio štamo ląstelių suspensijos (žr. 3 priedėlį), pasibaigus 2-5 dienų trukmės inkubacijai 28 °C temperatūroje, stebėti tipiškų kolonijų susidarymą.

Modifikuotas Wilbrink buljonas (Caruso et al., 2002) Sacharozė 10 g Proteazės peptonas 5 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 0,25 g NaNO3 0,25 g Distiliuotas vanduo 1 l 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje ir atvėsinti iki 50 °C.

Antibiotikų koncentruotų tirpalų įpilama tiek, kiek pilama ruošiant SMSA buljono terpę. ______________ 3 priedėlis A. Parduodama standartizuota kontrolinė medžiaga

1 lentelė. Etaloninių standartinių (SMT) R. solanacearum izoliatų rinkinys NCPPB kodas SMT # Kiti kodai Kilmės šalis Biovarietetas NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Egiptas 2 NCPPB 4154 10 CFBP4585, 550, EURS21 Turkija 2 NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Anglija 2 NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Kipras 2 NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Švedija 2 NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Belgija 2 NCPPB 4156 (*) 71(*) PD 2762, CFBP 3857 Nyderlandai 2 NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 Prancūzija 2 NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS80 Portugalija 2 NCPPB 4160 69 IVIA-1632-2 Ispanija 2 NCPPB 4161 76 B3B Vokietija 2 NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 JAV 1 NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Kosta Rika 1 NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 Kolumbija 2 NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Peru 2T NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Brazilija 2T NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 Peru 3 NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a Australija 3 NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 Šri Lanka 4 NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Filipinai 4 NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 Kinija 5 (*) Kaip standartinį etaloninį štamą naudoti R. solanacearum 2 biovarietetą (3 rasės).

Pastaba. Pirmiau pateiktų štamų autentiškumas garantuojamas, jei šie įsigyjami tik iš autentiškos kultūrų kolekcijos.

2 lentelė. Serologiškai ar genetiškai giminingų bakterijų, naudojamų testų optimizavimui, standartinis etaloninis rinkinys NCPPB kodas SMT # Kitas kodas Identifikavimas NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa (1) NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. marginalis (1) NCPPB 4164 – CFBP 2227 Burkholderia cepacia (2) NCPPB 4165 – CFBP 2459 Ralstonia pickettii (3) NCPPB 4166 58 CFBP 3567 CSLPr1150 Ralstonia pickettii f) NCPPB 4167 60 CFBP 4618 PD 2778 Ralstonia sp. f) NCPPB 1127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis (1) NCPPB 35354CFBP3 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli (1) NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia (1) NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae (1) NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii (1) NCPPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3) NCPPB 4168 61 CFBP 4619 IPOS339 Enterobacter sp. (1) NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp. (1) NCPPB 4170 63 CFBP 4621 IPO S306 Ochrobactrum anthropi (1) (2) NCPPB 4171 64 CFBP 4622 IPO 1693 Curtobacterium sp. f) (2) NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp. (1) NCPPB 4173 – PD 2318 Aureobacterium sp. (2) NCPPB 4174 81 IVIA 1844.06 Flavobacterium sp. f) (2)

Atliekant visus testus kaip neigiamą kontrolę naudoti šalčiu išdžiovinto bulvių ekstrakto, gauto iš 200 sveikų bulvių stiebagumbių, nuosėdas.

Atliekant serologinius testus ir PGR kaip teigiamą kontrolę naudoti šalčiu išdžiovinto bulvių ekstrakto, gauto iš 200 sveikų bulvių stiebagumbių, turinčio 103–104 ir 104–106 R. solanacearum 2 biovarieteto (štamo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) ląstelių, nuosėdas. Kadangi džiovinimas šalčiu daro įtaką ląstelių gyvybingumui, šie ekstraktai nėra tinkama standartinė kontrolinė medžiagą atliekant išskyrimą biotestu.

Atliekant serologinius testus kaip teigiama kontrolė naudojamos R. solanacearum 2 biovarieteto (štamas 156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 ląstelių/ml koncentracijos suspensijos, fiksuotos formalinu.

B. Pagrindinių atrankos testų PGR/IF ir FISH teigiamų ir neigiamų kontrolinių bandinių paruošimas R. solanacearum 3 rasės/2 biovarieteto virulentiškas štamas (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 48 valandas auginamas SMSA terpėje ir suspenduojamas 10 mM fosfatiniame buferiniame tirpale, kad ląstelių tankis siektų apie 2 x 108 ksv/ml. Paprastai gaunama šiek tiek drumsta suspensija, kurios optinis tankis, matuojant 600 nm bangų ilgio spektre, siekia 0,15.

Kūgio formos gabaliukai išpjaunami iš 200 stiebagumbių, kurie, kaip žinoma, neužkrėsti R. solanacearum.

Kūgio formos gabaliukai susmulkinami kaip įprasta ir gautos nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 10 ml.

Į kiekvieną iš dešimties 1,5 ml tūrio miniatiūrinių mėgintuvėlių įpilama po 900 ml pakartotinai suspenduotų nuosėdų.

100 ml R. solanacearum suspensijos įpilama į pirmąjį miniatiūrinį mėgintuvėlį. Suplakama.

Naudoti dešimtainius užkrato praskiedimus, santykiu 1:10, atliekant praskiedimus penkiuose paskesniuose miniatiūriniuose mėgintuvėliuose.

Šeši miniatiūriniai mėgintuvėliai su užkratu bus naudojami kaip teigiami kontroliniai bandiniai. Keturi miniatiūriniai mėgintuvėliai be užkrato bus neigiami kontroliniai bandiniai. Šie mėgintuvėliai atitinkamai paženklinami.

Į sterilius 1,5 ml tūrio miniatiūrinius mėgintuvėlius įpilama po 100 ml alikvotinių dalių ir gaunama po 9 kiekvieno kontrolinio bandinio pakartojimus, iki panaudojimo saugomus -16-24 °C temperatūroje.

Atliekant IF testą, R. solanacearum buvimas ir kiekis pirmiausia nustatomi kontroliniuose bandiniuose.

Atliekant kiekvienos serijos tiriamųjų bandinių PGR testą, DNR išskiriama tiek iš teigiamų, tiek iš neigiamų kontrolinių bandinių.

Atliekant kiekvienos serijos tiriamųjų bandinių IF ir FISH testą, tiriami ir teigiami, ir neigiami kontroliniai bandiniai.

Atliekant IF, FISH ir PGR testus, R. solanacearum būtina aptikti mažiausiai 106 ląstelių ir esant 104 ląstelių/ml tankiui tik teigiamuose kontroliniuose bandiniuose, o ne neigiamuose kontroliniuose bandiniuose. ______________ 4 priedėlis Buferiniai tirpalai tyrimui Bendra pastaba. Neatidarius talpyklų, buferinius tirpalus galima saugoti iki vienerių metų.

Na2HPO4 (bevandenis) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Distiliuotas vanduo 1,0 l Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje. Galima panaudoti šiuos papildomus junginius:

Naudojimo tikslas Kiekis 1 litre Lubrolio dribsnius Deflokuliantas (*) 0,5 g DC (tiesioginio stingimo) silicio priešputis Priešputis (*) 1,0 ml Tetranatrio pirofosfatas Antioksidantas 1,0 g Polivinilpirolidonas-40000 (PVP-40) PGR inhibitorių surišėjas 50 g ____________________ (*) Naudoti išskiriant homogenizacijos metodu.

1.2. Buferinis tirpalas nuosėdoms suspenduoti (10 mM fosfatinis buferinis tirpalas, pH 7,2) Šis buferinis tirpalas naudojamas bulvių stiebagumbių viršūnių kūgio formos gabaliukų ekstraktų pakartotiniam suspendavimui ir praskiedimui baigus nuosėdų koncentravimą centrifuguojant.

Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Distiliuotas vanduo 1,0 l Ištirpinti ingredientus, patikrinti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.

2.2. IF-buferinis tirpalas, turintis Tween Šis buferinis tirpalas naudojamas plokštelėms plauti. Įpilti 0,1 % Tween-20 į IF buferinį tirpalą.

2.3. Fosfatinis buferinis glicerino tirpalas, pH 7,6 Šis buferinis tirpalas naudojamas kaip dengiamųjų stiklelių sukibimo su IF plokštelėmis skystis fluorescencijai sustiprinti.

Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glicerinas 50 ml Distiliuotas 100 ml vanduo Priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčius sukibimą skatinančius tirpalus galima įsigyti prekyboje, pvz., komercinį tirpalą Vectashield® (Vector Laboratories) arba Citifluor® (Leica).

Na2CO3 6,36 g NaHCO3 11,72 g Distiliuotas vanduo 1,0 l Ištirpinti ingredientus, nustatyti pH ir 15 minučių sterilizuoti autoklave 121 °C temperatūroje.

Kaip antioksidanto galima įpilti natrio sulfito (0,2 %), jei reikalaujama apsisaugoti nuo oksiduotų aromatinių junginių susidarymo.

3.2. 10X fosfatinis buferinis tirpalas (PBS), pH 7,4 NaCL 80,0 g KH2PO4 2,0 g Na2HPO4.12H2O 29,0 g KCl 2,0 g Distiliuotas vanduo 1,0 l 3.3. PBS-Tween 10XPBS 100 ml 10% Tween 20 5 ml Distiliuotas vanduo 895 ml 3.4. Antikūnų blokavimo buferinis tirpalas (privaloma paruošti šviežią) 10XPBS 10,0 ml Polivinilpirolidonas-44000 2,0 g (PVP-44) 10% Tween 20 0,5 ml Pieno milteliai 0,5 g Distiliuotas vanduo įpilti iki 100 ml 3.5. Šarminės fosfatazės substrato tirpalas, pH 9,8 Dietanolaminas 9 7 ml Distiliuotas vanduo 800 ml Sumaišyti ir, įpilant koncentruotos HCl, nustatyti pH 9,8.

Įpilti distiliuoto vandens iki 1 litro.

Ištirpinti 0,2 g MgC12.

Dvi 5 mg masės fosfatazės tabletes (Sigma) ištirpinti 15 ml tirpale.

Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g Distiliuotas vanduo 1 000 ml Ištirpinti ingredientus ir nustatyti pH 9,6.

4.2. 10X fosfatinis buferinis tirpalas(PBS) pH 7,2-7,4 NaCl 80,0 g NaH2PO4.2 H2O 4,0 g Na2HPO4.12H2O 27,0 g Distiliuotas vanduo 1 000 ml 4.3. PBS-Tween 10XPBS 50 ml 10%Tween 20 5ml Distiliuotas vanduo 950 ml 4.4. Substrato buferinis tirpalas, pH 9,8 Dietanolaminas 100 ml Distiliuotas vanduo 900 ml Sumaišyti ir, įpilant koncentruotos HC1, nustatyti pH 9,8. ______________ 5 priedėlis Užkrėtimo laipsnio nustatymas IF ir FISH testais 1. Nustatyti tipiškų fluorescuojančių ląstelių skaičiaus viename matymo laukelyje vidurkį (c).

Atliekant išankstinį tyrimą auginant pasirinktą bakterijų štamų rinkinį taip pat neturėtų būti gaunama netikrųjų teigiamų rezultatų (3 priedėlis).

1.3. PGR reakcijos sąlygos Atlikti pagal šią programą:

1 ciklas: i) 2 minutės 96 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).

35 ciklai: ii) 20 sekundžių 94 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija). iii) 20 sekundžių 68 °C temperatūroje (pradmenų surišimas su matricine DNR).

1 ciklas: v) 10 minučių 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas),

Pastaba. Ši programa optimizuota naudojant Perkin Elmer 9600 šiluminį reaktorių. Naudojant kitų modelių reaktorius, ii, iii ir iv ciklus galima pakeisti.

1.4. Padaugintos matricinės DNR restrikcinė analizė.

Padauginus R. solanacearum DNR, gauti PGR produktai buvo veikiami restriktaze Ava II inkubuojant 37 °C temperatūroje ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas.

2.2. PGR reakcinis mišinys Reagentas Reakcinis kiekis Galutinė koncentracija Sterilus YGV 16,025 ml 10X PGR buferinis tirpalas (1) 2,5 ui 1X (1,5 mM MgCl2) GSA (V frakcija) (10%) 0,25 ml 0,1 % d-nTP mišinys (20 mM) 0,125 ml 0,1 mM Pradmuo Ps-1 (10 mM) 0,5 ml 0,2 mM Pradmuo Ps-2 (10 mM) 0,5 ml 0,2 mM Taq polimerazė (5 V/ml) (1) 0,1 ml 0,5 U Bandinio tūris 5,0 ml Bendras tūris 25,0 ml

Pastaba. Iš pradžių optimizuota naudojant MJ Research PTC 200 šiluminį reaktorių ir Gibco Taq polimerazę. Galima naudoti tos pačios koncentracijos Perkin Elmer AmpliTaq ir buferinį tirpalą.

2.3. PGR reakcijos sąlygos Atlikti šią programą:

1 ciklas: i) 5 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).

35 ciklai: ii) 30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija). iii) 30 sekundžių 68 °C temperatūroje (pradmenų surišimas su matricine DNR).

1 ciklas: v) 5 minutės 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas).

Pastaba. Ši programa buvo optimizuota naudojant MJ Research PTC 200 šiluminį reaktorių. Naudojant kitų modelių reaktorius, ii, iii ir iv ciklus galima pakeisti.

2.4. Padaugintos matricinės DNR restrikcinė analizė.

Padauginus R. solanacearum DNR gauti PGR produktai buvo veikiami restriktaze Taq I, 30 minučių inkubuojant 65 °C temperatūroje, ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas. R. solanacearum padaugintos matricinės DNR fragmentą suskaldžius restriktazėmis, buvo gauti 457 bp ir 96 bp fragmentai.

3.2. PGR reakcinis mišinys Reagentas Reakcinis kiekis Galutinė koncentracija Sterilus YGV 12,625 ml 10X PGR buferinis tirpalas (1) (15 mM MgCl2) 2,5 ui 1X(1,5 mM MgCl2) GSA (V frakcija) (10%) 0,25 ml 0,1 % d-nTP mišinys (20mM) 0,125 ml 0,1 mM Pradmuo RS-1-F (10MM) 2,0 ml 0,8 mM Pradmuo RS-1-R (10 mM) 2,0 ml 0,8 mM Pradmuo NS-5-F (10 mM) (2) 0,15 ml 0,06 mM Pradmuo NS-6-R (10 mM) (2) 0,15 ml 0,06 mM Taq polimerazė (5V/ml) (1) 0,2 ml 1,0 U Mėginio tūris 5,0 ml Bendras tūris 25,0 ml

3.3. PGR reakcijos sąlygos Atlikti šią programą:

1 ciklas: i) 5 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).

35 ciklai: ii) 30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija). iii) 30 sekundžių 58 °C temperatūroje (pradmenų sujungimas su matricine DNR).

1 ciklas: v) 5 minutės 72 °C temperatūroje (galutinis liginimas).

Pastaba. Ši programa buvo optimizuota naudojant MJ Research PTC 200 šiluminį reaktorių. Naudojant kitų modelių reaktorius, ii, iii ir iv ciklus galima pakeisti.

3.4. Padaugintos DNR kopijos restrikcinė analizė Padauginus R. solanacearum DNR gauti PGR produktai buvo veikiami restriktaze Bsm I arba jos izomeru (Mva 1269 I) I, 30 minučių inkubuojant 65 °C temperatūroje, ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas.

4.3. PGR reakcijos sąlygos Atlikti šią programą 1/2 ir 3/4/5 biovarietetų atveju:

1 ciklas: i) 5 minutės 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija).

35 ciklas: ii) 30 sekundžių 95 °C temperatūroje (matricinės DNR denatūracija) iii) 30 sekundžių 58 °C temperatūroje (pradmenų sujungimas su matricine DNR)

4.4. Padaugintos DNR kopijos restrikcinė analizė R. solanacearum padaugintos DNR gauti PGR produktai, gauti naudojant pradmenis Rs-1-F ir Rs-1-R, buvo veikiami restriktaze Bsm I arba jos izomeru (pvz., Mva 1269 I) 30 minučių inkubuojant 65 °C temperatūroje ir buvo stebimas skirtingo ilgio restrikcinio fragmento polimorfizmas.

Taip pat galima įsigyti (Invitrogen ar panašioje bendrovėje). ______________ 7 priedėlis Patvirtinti reagentai FISH testui 1. Oligonukleotidiniai bandiniai R. solanacearum – specifinis bandinys OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3' Nespecifinis Eubacteriaceae bandinys EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3' 2. Fiksavimo tirpalas (DĖMESIO! FIKSAVIMO TIRPALE YRA NUODINGO PARAFORMALDEHIDO. DIRBDAMI MŪVĖKITE PIRŠTINES IR NEĮKVĖPKITE. REKOMENDUOJAMA DIRBTI TRAUKOS SPINTOJE)