Oficiālie avotilikumi.lv · EUR-Lex
Europaius
Latviešu
ČeštinaDeutschFrançaisEspañolPolskiItalianoNederlandsÖsterreichBelgiquePortuguêsSvenskaDanskSuomiSlovenčinaIrelandMagyarEestiLietuviųSlovenščinaHrvatskiΚύπροςMaltiRomânăΕλληνικάLuxembourgБългарски
Latviešu

Zaudējis spēku - Dzīvnieku barības paraugu analīžu metodika

Īsumā

Šis dokuments, "Dzīvnieku barības paraugu analīžu metodika", nosaka kārtību, kādā jāveic dzīvnieku barības paraugu analīzes, lai noteiktu to sastāvu.

Ko tas regulē

  • Dzīvnieku barības paraugu sagatavošanu analīzēm.
  • Mitruma noteikšanu barības paraugos.
  • Reaģentu un laboratorijas iekārtu izmantošanu analīzēs.
  • Analīžu rezultātu aprēķināšanu un norādīšanu testēšanas pārskatā.

Kas tas attiecas

  • Laboratorijas, kas veic dzīvnieku barības paraugu analīzes.
  • Personas, kas sagatavo un analizē dzīvnieku barības paraugus.

Galvenie punkti

  • Barības paraugs jāsadala divās daļās: viena daļa (vismaz 100g) ķīmiskajām analīzēm, otra – neizmainītā veidā uzglabāšanai.
  • Barības paraugu nedrīkst malt iekārtās, kas sasilst, ja tas var ietekmēt paraugu.
  • Ļoti mitru paraugu žāvē līdz mitrums ir 8-12%.
  • Testēšanas pārskatā jānorāda izmantotā metode un vidējais rezultāts, kas aprēķināts no vismaz divu mērījumu rezultātiem.
Likuma teksts
Likuma teksts

Zemkopības ministrijas instrukcija Nr.9 Rīgā 2005.gada 22.martā Dzīvnieku barības paraugu analīžu metodika Izdota saskaņā ar Dzīvnieku barības aprites likuma

  1. panta pirmo daļu
  2. Instrukcija nosaka dzīvnieku barības (turpmāk - barība) paraugu analīžu metodiku.
  3. Mitrumu barības paraugam nosaka pirms tā sagatavošanas analīzēm un pēc tam.
  4. Barības paraugu sadala divās daļās. Paraugu rūpīgi sajauc uz tīras, sausas virsmas un sadala ar mehānisku ierīci vai ar rokām. Vienu daļu parauga pēc sadalīšanas atstāj neizmainītā veidā un nekavējoties ievieto sausā konteinerā ar cieši piegulošu vāku, bet otru (vismaz 100g) sagatavo ķīmiskajām analīzēm.
  5. Barības paraugu analīzēm sagatavo tā, lai gatavā parauga apjoms ir viendabīgs, pilnībā atbilst kopējam paraugam un bez piesārņojuma.
  6. Barības paraugus nedrīkst malt iekārtās, kuras malšanas procesā sasilst. Tādā gadījumā tie jāmaļ ar rokām.
  7. Ļoti mitru paraugu žāvē piemērotā temperatūrā, līdz tā mitrums ir 8 - 12%.
  8. Ķīmiskajām analīzēm paraugu sagatavo: 7.
  9. barību, kas sasmalcināma bez žāvēšanas, sasmalcina un izsijā caur 1mm sietu (saskaņā ar ISO 565 standarta prasībām). Izsijāto paraugu samaisa un ievieto piemērotā, tīrā un sausā konteinerā ar gaisu necaurlaidīgu vāku. Paraugu pirms svēršanas samaisa; 7.
  10. barībai, kas sasmalcināma pēc žāvēšanas, nosaka mitruma procentu un izžāvē tā, lai mitrums ir 8 - 12%. Pēc tam rīkojas, kā aprakstīts 8.
  11. apakšpunktā; 7.
  12. šķidrai vai vidēji šķidrai barībai paraugu ievieto piemērotā, tīrā, sausā konteinerā ar gaisu necaurlaidīgu vāku. Pirms iesvara nosvēršanas paraugu kārtīgi samaisa; 7.
  13. barības paraugu, kuru nevar sagatavot saskaņā ar kādu no 7.1., 7.
  14. vai 7.
  15. apakšpunktā aprakstītajām metodēm, sagatavo ar citas metodes palīdzību, kas nodrošina parauga viendabīgumu un raksturo kopējo paraugu.
  16. Barības paraugus uzglabā temperatūrā, kas neietekmē to sastāvu. Paraugus, kuros paredzēts noteikt vitamīnus vai pret gaismu jutīgas vielas, uzglabā brūnos stikla konteineros.
  17. Reaģenti, kurus izmanto analīžu veikšanai, atbilst tīrības pakāpei " analītiski tīrs" (a.t.), ja analīžu veikšanas metodikā nav noteikts citādi. Nosakot mikroelementus, reaģenta tīrību pārbauda ar "tukšo" analīzi. Ja nepieciešams, veic reaģenta attīrīšanu.
  18. Ja nepieciešams šķīdināt, atšķaidīt, skalot vai mazgāt, bet nav norādīts šķīdinātājs vai atšķaidītājs, tādā gadījumā izmanto ūdeni. Ūdens ir demineralizēts. Atbilstoši analīžu metodikai atsevišķos gadījumos nepieciešams veikt speciālu ūdens attīrīšanu.
  19. Analīžu metodikās norāda tikai specifiskās iekārtas, kuras ir nepieciešamas analīzes veikšanai. Izmanto tīras laboratorijas iekārtas. Tas ir ļoti būtiski tajos gadījumos, kad veic mērījumus paraugiem ar ļoti zemu nosakāmās vielas koncentrāciju.
  20. Katras barības ķīmiskās sastāvdaļas noteikšanai ir izstrādāta viena vai vairākas metodes. Laboratorija testēšanas pārskatā norāda izmantoto metodi.
  21. Testēšanas pārskatā norāda vidējo rezultātu, kuru aprēķina no vismaz divu mērījumu rezultātiem, kas iegūti no dažādiem parauga iesvariem un kuriem ir pieņemama atkārtojamība. Rezultātu pārskatā norāda ar tik daudz cipariem, kā noteikts analīzes metodikā un, ja nepieciešams, to koriģē, ņemot vērā izmeklējamā parauga sākotnējo mitruma procentu. Ja nav speciālas norādes, tad rezultātu izsaka procentos no sākotnējā parauga masas.
  22. Dzīvnieku barības paraugus izmeklē saskaņā ar šīs instrukcijas
  23. līdz
  24. pielikumu.
  25. Ar šīs instrukcijas spēkā stāšanos spēku zaudē Zemkopības ministrijas 2004.gada 2.jūnija instrukcija Nr.
  26. Informatīvā atsauce uz Eiropas Savienības direktīvām Instrukcijā iekļautas tiesību normas, kas izriet no: Komisijas
  27. gada
  28. jūnija pirmās Direktīvas 71/250/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  29. gada
  30. novembra otrās Direktīvas 71/393/EEK, kas nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  31. gada
  32. aprīļa trešās Direktīvas 72/199/EEK, kas nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  33. gada
  34. decembra ceturtās Direktīvas 73/46/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  35. gada
  36. marta septītās Direktīvas 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  37. gada
  38. jūnija astotās Direktīvas 78/633/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei, Komisijas
  39. gada
  40. jūlija devītās Direktīvas 81/715/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  41. gada
  42. jūlija desmitās Direktīvas 84/425/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei; vienpadsmitās Komisijas
  43. gada
  44. jūlija Direktīvas 93/70/EEK, ar ko Kopienā ievieš analīzes metodes oficiālai lopbarības kontrolei; divpadsmitās Komisijas
  45. gada
  46. decembra Direktīvas 93/117/EK, ar ko ievieš Kopienas analīzes metodes oficiālai barības kontrolei; Komisijas
  47. gada
  48. aprīļa Direktīvas 1999/27/EK par Kopienas metožu ieviešanu amprolija, diklazurila un karbadoksa noteikšanai barībā, ar ko groza Direktīvu 71/250/EEK, 73/46/EEK, un atceļ direktīvu 74/203/EEK; Komisijas
  49. gada
  50. jūlija Direktīvas 1999/76/EK par Kopienas analīzes metodes ieviešanu nātrija lasalocīda noteikšanai lopbarībā; Komisijas 1999.gada 27.jūlija Direktīvas 1999/79/EK, ar kuru groza Komisijas 1972.gada 27.aprīļa trešo Direktīvu 72/199/EEK, kas nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei; Komisijas
  51. gada
  52. jūlija Direktīvas 2000/45/EK, kas nosaka Kopienas analīžu metodes A vitamīna, E vitamīna un triptofāna noteikšanai barībā; Komisijas
  53. gada
  54. jūlija Direktīvas 2002/70/EK, ar ko nosaka prasības dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB koncentrācijas noteikšanai barībā; Komisijas 2003.gada 23.decembra Direktīvas 2003/126/EK par dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu noteikšanas analīzes metodi oficiālai lopbarības kontrolei. Saskaņots ar Tieslietu ministriju 2005.gada 16.martā Zemkopības ministrs M.Roze 1.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Zilskābes noteikšana
  55. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka brīvo zilskābi un glikozīdu sastāvā saistīto zilskābi barībā, jo īpaši produktos, ko iegūst no linsēklām, maniokas miltiem un dažām pākšaugu sugām.
  56. Princips Paraugu suspendē ūdenī. Zilskābi izdala fermentatīvā reakcijā, atdestilē ar tvaiku un uztver noteiktā tilpumā paskābināta sudraba nitrāta šķīduma. Sudraba cianīdu atdala filtrējot, un sudraba nitrāta pārākumu titrē ar amonija tiocianāta šķīdumu.
  57. Reaģenti 3.
  58. Saldo mandeļu suspensija: divdesmit izlobītas saldās mandeles 37 līdz 40°C temperatūrā saberž 100 ml ūdens. Ņem 10 ml suspensijas un pārbauda, vai tajā nav zilskābes, izmantojot nātrija pikrāta papīru vai veicot tukšā parauga analīzi saskaņā ar
  59. punkta pēdējā daļā doto aprakstu. 3.
  60. nātrija acetāta 10 % (m/V) šķīdums, pārbaudot ar fenolftaleīnu, neitrāls 3.
  61. Pret putu emulsija (piemēram, silikona emulsija) 3.
  62. Slāpekļskābe - d: 1,40 3.
  63. 0,02n sudraba nitrāta šķīdums 3.
  64. 0,02n amonija tiocianāta šķīdums 3.
  65. Amonija dzelzs sulfāta piesātināts šķīdums 3.
  66. Amonjaka šķīdums - d: 0,958
  67. Aparatūra 4.
  68. Žāvēšanas skapis ar termostatu, kas ieregulēts 38°C temperatūrā 4.
  69. Aparāts destilēšanai ar ūdens tvaiku, kas aprīkots ar dzesinātāju un liektu alonžu 4.
  70. 1000 ml tilpuma stāvkolbas ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem 4.
  71. Eļļas vanna 4.
  72. Birete ar 1/20 ml tilpuma iedaļām
  73. Darba gaita 5.
  74. Ņem 20g parauga iesvara ar precizitāti līdz 5mg un pārnes uz 1 litra tilpuma stāvkolbu, pievieno 50 ml ūdens un 10 ml saldo mandeļu suspensijas (3.1.). Kolbu noslēdz ar aizbāzni un uz sešpadsmit stundām ievieto žāvēšanas skapī 38°C temperatūrā. Tālāk atdzesē līdz istabas temperatūrai, pievieno 80 ml ūdens, 10 ml nātrija acetāta šķīduma (3.2.) un pilienu pretputu emulsijas (3.3.). 5.
  75. Kolbu pievieno destilēšanas aparātam ar ūdens tvaiku un ievieto eļļas vannā, ko iepriekš uzkarsē līdz temperatūrai, kas nedaudz pārsniedz 100°C. Ar spēcīgu ūdens tvaika plūsmu, ko laiž cauri kolbai, kuru uzmanīgi silda eļļas vannā, atdestilē 200 līdz 300 ml šķidruma. Destilātu uztver Erlenmeijera kolbā, kas aizsargāta no gaismas iedarbības un kurā ir precīzi 50 ml 0,02 n sudraba nitrāta šķīduma (3.5.) un 1 ml slāpekļskābes (3.4.). Pārbauda, vai dzesinātāja alonža gals ir iemērkts sudraba nitrāta šķīdumā. 5.
  76. Erlenmeijera kolbas saturu pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni, samaisa un filtrē. Ņem 250 ml filtrāta, kam pievieno apmēram 1 ml amonija dzelzs sulfāta šķīduma (3.7.), un, lietojot bireti ar 1/20 ml tilpuma iedaļām, sudraba nitrāta pārākumu attitrē ar 0,02n amonija tiocianāta šķīdumu (3.6.). 5.
  77. Ja vajadzīgs, piemērojot šo pašu procedūru, veic tukšā parauga analīzi, tai ņemot tikai 10 ml saldo mandeļu suspensijas (3.1.).
  78. Rezultātu aprēķināšana Ja tukšā parauga titrēšanai patērēts 0,02n sudraba nitrāta šķīdums, tā tilpumu atņem no parauga destilāta titrēšanai patērētā šķīduma tilpuma. 1 ml 0,02n AgNO3 atbilst 0,54mg HCN. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
  79. Piezīmes 7.
  80. Ja paraugā lielā daudzumā ir sulfīdi (piemēram, pupās), veidojas melnas sudraba sulfīda nogulsnes, kuras nofiltrē kopā ar sudraba cianīda nogulsnēm. Šo nogulšņu veidošanās dēļ rodas 0,02n sudraba nitrāta šķīduma zudumi, un šis tilpums ir jāatņem no HCN satura aprēķināšanai izmantojamā tilpuma. To izdara šādi. 7.
  81. Sudraba cianīdu izšķīdina, nogulsnes uz filtra apstrādājot ar 50 ml amonjakūdens (3.8.). Atlikumu mazgā ar atšķaidītu amonjakūdeni un tad nosaka tā sudraba saturu. Iegūto lielumu pārvērš ml 0,02n sudraba nitrāta šķīduma. 7.
  82. Parauga HCN saturu var noteikt arī, amonjakālo filtrātu pēc paskābināšanas titrējot ar slāpekļskābi. Zemkopības ministrs M.Roze 2.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Kalcija noteikšana
  83. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka kopējo kalcija saturu barībā.
  84. Princips Paraugu pārpelno, pelnus izšķīdina sālsskābē un kalciju izgulsnē kalcija oksalāta veidā. Nogulsnes izšķīdina sērskābē un radušos skābeņskābi titrē ar kālija permanganāta šķīdumu.
  85. Reagenti 3.
  86. Sālsskābe - analītiski tīra (a.t.), d: 1,14; 3.
  87. Slāpekļskābe - a.t., d: 1,40; 3.
  88. Sērskābe - a.t., d: 1,13; 3.
  89. Amonija hidroksīds - a.t., d: 0,98; 3.
  90. Aukstumā piesātināts amonija oksalāta šķīdums - a.t.; 3.
  91. Citronskābes šķīdums - a.t., 30 % (m/V); 3.
  92. Amonija hlorīda šķīdums - a.t., 5 % (m/V); 3.
  93. Bromkrezola zaļā 0,04 % (m/V) šķīdums; 3.
  94. Kālija permanganāta 0,1n šķīdums.
  95. Aparatūra 4.
  96. ventilējama elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu; 4.
  97. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi pārpelnošanai; 4.
  98. Stikla filtrtīģeļi ar G4 porainību.
  99. Darba gaita 5.
  100. Ņem apmēram 5g parauga iesvara (vai lielāku, ja vajadzīgs) ar precizitāti līdz mg, pārpelno 550 °C temperatūrā un pelnus pārnes uz 250 ml tilpuma vārglāzi. 5.
  101. Pievieno 40 ml sālsskābes (3.1.), 60 ml ūdens un dažus pilienus slāpekļskābes (3.2.). Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai un vāra 30 minūtes. Šķīdumu atdzesē un pārnes uz 250 ml tilpuma mērkolbu. Noskalo, ar ūdeni uzpilda līdz atzīmei, homogenizē un filtrē. 5.
  102. Ar pipeti 250 ml tilpuma vārglāzē pārnes šķīduma alikvoto daļu, kurā atkarībā no gaidāmā kalcija satura ir 10 līdz 40 mg kalcija. Pievieno 1 ml citronskābes šķīduma (3.6.) un 5 ml amonija hlorīda šķīduma (3.7.). Šķīdumu papildina ar ūdeni līdz apmēram 100 ml tilpumam. Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai, pievieno astoņus līdz desmit pilienus bromkrezola zaļā šķīduma (3.8.) un 30 ml silta amonija oksalāta šķīduma (3.5.). Ja veidojas nogulsnes, tās izšķīdina, pievienojot dažus pilienus sālsskābes (3.1.). 5.
  103. Ļoti lēnām, pastāvīgi maisot, nei­tralizē ar amonija hidroksīdu (3.4.) līdz pH 4,4 - 4,6 (tas ir, līdz indikatora krāsas maiņai). Vārglāzi uz 30 minūtēm ievieto verdoša ūdens vannā, līdz nogulsnējas radušās nogulsnes. Vārglāzi izņem no ūdens vannas. Stundu nostādina un filtrē caur G4 filtrtīģeli. 5.
  104. Vārglāzi un filtrtīģeli mazgā ar ūdeni, līdz pilnībā atdalīts amonija oksalāta pārākums (ja mazgāšanas ūdenī nav hlorīdu, tas liecina, ka mazgāts pietiekami). 5.
  105. Uz filtra esošās nogulsnes izšķīdina ar 50 ml silta sērskābes šķīduma (3.3.). Filtrtīģeli izskalo ar siltu ūdeni un filtrāta tilpumu papildina līdz apmēram 100 ml. Uzsilda līdz 70 - 80°C un pa pilienam titrē ar kālija permanganāta šķīdumu (3.9.), līdz parādās sārts krāsojums, kas saglabājas vienu minūti.
  106. Rezultātu aprēķināšana 1 ml 0,1n kālija permanganāta šķīduma atbilst 2,004mg kalcija. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
  107. Piezīmes 7.
  108. Ja kalcija saturs ir ļoti zems, rīkojas šādi: kalcija oksalāta nogulsnes filtrē caur bezpelnu filtrpapīru. Pēc mazgāšanas filtru izžāvē un pārpelno platīna tīģelī 550°C temperatūrā. Atlikumu izšķīdina dažos pilienos sērskābes (3.3.), iztvaicē sausu, atkārtoti pārpelno 550°C temperatūrā un nosver. Ja W ir iegūtā kalcija sulfāta masa, kalcija saturs alikvotajā daudzumā ir = W × 0,2944, kur: X- kalcija saturs un m - iegūtā kalcija sulfāta masa 7.
  109. Ja parauga sastāvā ir tikai minerālvielas, to izšķīdina sālsskābē, iepriekš nepārpelnojot. Analizējot skābē grūti šķīdināmus produktus, piemēram, kalcija alumīnija fosfātu, tos pirms šķīdināšanas sakausē ar sārmu: analizējamo paraugu platīna tīģelī rūpīgi sajauc ar pieckārtīgu maisījuma pārākumu, kurā līdzīgās daļās ir kālija karbonāts un nātrija karbonāts. Uzmanīgi karsē, līdz maisījums pilnīgi izkūst. Atdzesē un izšķīdina sālsskābē 7.
  110. Ja paraugos ir augsts magnija saturs, kalcija oksalātu izgulsnē otrreiz. Zemkopības ministrs M.Roze 3.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Karbonātu noteikšana
  111. Mērķis un darbības sfēra 1.
  112. Ar šo metodi nosaka karbonātu daudzumu lielākajā daļā barības veidu. Rezultātu parasti izsaka kā kalcija karbonātu. 1.
  113. Tomēr dažos gadījumos (piemēram, dzelzs karbonāta noteikšanai) izmanto speciālu metodi.
  114. Princips Karbonātus sadala ar sālsskābi, izdalījušos oglekļa dioksīdu uztver gāzu biretē un tā tilpumu salīdzina ar oglekļa dioksīda tilpumu, kas izdalās tādos pašos apstākļos, sadaloties zināmam daudzumam analītiski tīra kalcija karbonāta.
  115. Reaģenti 3.
  116. Sālsskābe - d: 1,10; 3.
  117. Kalcija karbonāts - a.k.; 3.
  118. Sērskābes aptuveni 0,1n šķīdums, kas iekrāsots ar metilsarkano.
  119. Aparatūra Šaiblera-Dītriha aparāts vai tam līdzvērtīga iekārta
  120. Procedūra 5.
  121. Analīzei ņemtā iesvara lielums ir atkarīgs no karbonātu satura paraugā: 5.1.
  122. 0,5g produktiem, kas satur 50 līdz 100% karbonātus, pārrēķinot kalcija karbonātā; 5.1.
  123. 1g produktiem, kas satur 40 līdz 50% karbonātus, pārrēķinot kalcija karbonātā; 5.1.
  124. 2 līdz 3g pārējiem produktiem. 5.
  125. Paraugu pārnes uz aparāta speciālo kolbu, kas aprīkota ar nelielu neplīstoša materiāla mēģeni, kurā ir 10 ml sālsskābes (3.1.), un kolbu pievieno aparātam. Pagriež trīsceļu krānu tā, lai gāzu birete būtu savienota ar atmosfēru. Izmantojot pārvietojamu cauruli, kas piepildīta ar iekrāsotu sērskābes šķīdumu (3.3.) un pievienota gāzu biretei, šķidruma līmeni iestāda līdz nulles atzīmei. Pagriež krānu, savienojot gāzu bireti ar cauruli, un pārbauda, vai līmenis ir pret nulles atzīmi. 5.
  126. Kolbu pagāžot uz sāna, paraugam lēni pārlej sālsskābi (3.1.). Nolaižot zemāk cauruli, izlīdzina spiedienu. Kolbu krata, līdz pilnīgi izbeidzas oglekļa dioksīda izdalīšanās. Atjauno spiedienu, izlīdzinot šķidruma līmeni biretē un caurulē. Pēc dažām minūtēm, kad gāzes tilpums kļuvis nemainīgs, izdara nolasījumu. 5.
  127. Tādos pašos apstākļos analizē 0,5g kalcija karbonāta (3.2.) kontrolparaugu.
  128. Rezultātu aprēķināšana Kalcija karbonātā pārrēķinātu parauga karbonātu saturu gramos aprēķina pēc šādas formulas: V x 100 -------, T x 2W kur V = no parauga iesvara izdalītais CO2 tilpums ml T = no 0,5 g a.t. CaCO3 izdalītais CO2 tilpums ml W = analizējamā parauga iesvara masa g
  129. Piezīmes 7.
  130. Ja parauga iesvars ir lielāks par 2 g, kolbā

(4)vispirms iepilda 15 ml ūdens un pirms analīzes samaisa. Kontrolparauga analīzei ņem tādu pašu ūdens daudzumu 7.2. Ja izmantotajam aparātam ir no Šaiblera-Dītriha aparāta atšķirīgs tilpums, attiecīgi jāmaina parauga un kontrolei izmantotās vielas iesvars, kā arī jākoriģē rezultātu aprēķini. Zemkopības ministrs M.Roze 4.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Koppelnu noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka koppelnu saturu barībā. 2. Princips Paraugu pārpelno 550°C temperatūrā, atlikumu nosver. 3. Reaģenti Amonija nitrāta 20 % (m/V) šķīdums 4. Aparatūra 4.1. Elektriskā plītiņa; 4.2. Termostatējama elektriskā mufeļkrāsns; 4.3. Taisnstūraini (60 × 40 × 25
  1. mm)vai apaļi (60 līdz 70 mm diametrā, augstums no 20 līdz 25
  2. mm)tīģeļi no platīna vai platīna un zelta sakausējuma (10 % Pt, 90 % Au) pārpelnošanai. 5. Darba gaita Ņem apmēram 5g lielu parauga iesvaru (2,5g - produktiem, kuriem ir tendence uzbriest) ar precizitāti līdz 1mg, ievieto iepriekš izkarsētā un nosvērtā tīģelī pārpelnošanai. Tīģeli novieto uz elektriskās plītiņas un pakāpeniski karsē, līdz materiāls pārogļojas. Tīģeli ievieto mufeļkrāsnī, kas noregulēta uz 550 ± 5°C temperatūru. Iztur šajā temperatūrā, līdz iegūst baltus, gaišpelēkus vai sarkanīgas nokrāsas pelnus, kuros nav acīmredzamu ogles daļiņu. Tīģeli ievieto eksikatorā, atdzesē un nekavējoties nosver. 6. Rezultātu aprēķināšana Atlikuma masu aprēķina, atņemot tīģeļa masu. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Piezīmes 7.1. Grūti pārpelnojamiem materiāliem vispirms veic vismaz trīs stundas ilgu sākotnējo pārpelnošanu, pēc kuras paraugu atdzesē, tam uzmanīgi pievieno dažus pilienus 20% amonija nitrāta šķīduma (raugoties, lai pelni neizkaisītos vai nesaķeptu gabalos). Pēc izžāvēšanas žāvēšanas skapī turpina dedzināšanu. Ja vajadzīgs, šo darbību atkārto, līdz paraugs ir pilnībā pārpelnots; 7.2. Materiālus, kurus nevar apstrādāt tā, kā norādīts 7.1. apakšpunktā, pārpelno šādi: pēc trīs stundas ilgas pārpelnošanas pelnus pārnes siltā ūdenī un filtrē caur nelielu bezpelnu filtru. Tajā pašā tīģelī pārpelno filtru kopā ar atlikumu uz tā. Filtrātu pārnes atdzesētā tīģelī, iztvaicē sausu, pārpelno un nosver; 7.3. Analizējot eļļas un taukus, piemērota izmēra tīģelī precīzi iesver apmēram 25g parauga. Pārogļo, materiālu aizdedzinot ar bezpelnu filtrpapīra strēmeli. Pēc sadedzināšanas samitrina ar iespējami mazu ūdens daudzumu. Izžāvē un pārpelno tā, kā aprakstīts 5. punktā. Zemkopības ministrs M.Roze 5.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Sālsskābē nešķīstošo koppelnu noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra 1.1. Ar šo metodi nosaka sālsskābē nešķīstošu minerālvielu saturu barībā. Atkarībā no parauga īpašībām izmanto A vai B metodi. 1.2. A metode: izmanto vienkāršās organiskās barības un lielākās daļas kombinētās barības veidu analīzēm; 1.3. B metode: izmanto tādas kombinētās minerālbarības, minerālvielu maisījumu un kombinētās barības analīzēm, kuru sālsskābē nešķīstošo pelnu saturs, kas noteikts pēc A metodes, ir lielāks par 1 %. 2. Princips 2.1. A metode: paraugu pārpelno, pelnus vāra sālsskābē, nešķīstošo atlikumu filtrē un sver; 2.2. B metode: paraugu apstrādā ar sālsskābi. Šķīdumu filtrē, atlikumu pārpelno un šādi iegūtos pelnus apstrādā pēc A metodes. 3. Reaģenti 3.1. Sālsskābes 3 n šķīdums; 3.2. Trihloretiķskābes 20 % (m/V) šķīdums; 3.3. Trihloretiķskābes 1 % (m/V) šķīdums. 4. Aparatūra 4.1. Elektriskā plītiņa; 4.2. Termostatējama elektriskā mufeļkrāsns; 4.3. Taisnstūraini (60 × 40 × 25
  3. mm)vai apaļi (60 līdz 70 mm diametrā, augstums no 20 līdz 25
  4. mm)tīģeļi pārpelnošanai no platīna vai platīna un zelta sakausējuma (10 % Pt, 90 % Au). 5. Darba gaita 5.1. A metode 5.1.1. Paraugu pārpelno pēc koppelnu noteikšanai aprakstītās metodes. Var izmantot arī pelnus, kas iegūti, nosakot koppelnu saturu. 5.1.2. Pelnus ar 75 ml 3n sālsskābes šķīduma (3.1.) pārnes uz 250 līdz 400 ml tilpuma vārglāzi. Lēnām uzkarsē līdz viršanas temperatūrai un lēni vāra 15 minūtes. Siltu šķīdumu filtrē caur bezpelnu filtrpapīru un atlikumu mazgā ar siltu ūdeni līdz neitrālai reakcijai. Filtru ar atlikumu izžāvē un nosvērtā tīģelī pārpelno 550 līdz 700°C temperatūrā. Atdzesē eksikatorā un nosver. 5.2. B metode 5.2.1. Ņem 5g lielu parauga iesvaru ar precizitāti līdz 1mg, to pārnes uz 250 līdz 400 ml tilpuma vārglāzi. Pievieno vispirms 25 ml ūdens, tad 25 ml 3 n sālsskābes šķīdumu (3.1.), samaisa un gaida, līdz beidz izdalīties burbuļi. Pievieno vēl 50 ml 3n sālsskābes (3.1.). Nogaida, līdz beidzas gāzu izdalīšanās, tad vārglāzi ievieto verdoša ūdens vannā uz 30 minūtēm, vai ilgāk, lai iespējami pilnīgi hidrolizētu visu cietes daudzumu, kas var būt paraugā. 5.2.2. Siltu šķīdumu filtrē caur bezpelnu filtru un mazgā filtru ar 50 ml silta ūdens (skatīt 7. punktu). Filtru ar atlikumu ieliek nosvērtā tīģelī, izžāvē un pārpelno 550 līdz 700°C temperatūrā. Pelnus ar 75 ml 3n sālsskābes šķīduma (3.1.) pārnes uz 250 līdz 400 ml tilpuma vārglāzi un analīzi turpina tā, kā aprakstīts 5.1.2. apakšpunktā. 6. Rezultātu aprēķināšana Aprēķina atlikuma masu, atņemot tīģeļa masu. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Piezīme Ja atlikums filtrējas slikti, analīzi atkārto, 50 ml 3 n sālsskābes šķīduma (3.1.) vietā ņemot 50 ml 20% trihloretiķskābes (3.2.), bet filtru mazgājot ar siltu 1% trihloretiķskābes šķīdumu (3.3.). Zemkopības ministrs M.Roze 6.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Hlora satura noteikšana hlorīdos 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka hlora saturu ūdenī šķīstošiem hlorīdiem, ko izsaka nātrija hlorīda veidā. To izmanto visu veidu barības analīzēm. 2. Princips Hlorīdus šķīdina ūdenī. Ja produkts satur organiskās vielas, šķīdumu dzidrina. Šķīdumu nedaudz paskābina ar slāpekļskābi un hlorīdus ar sudraba nitrāta šķīdumu izgulsnē sudraba hlorīda veidā. Sudraba nitrāta pārākumu attitrē ar amonija tiocianāta šķīdumu pēc Volharda metodes. 3. Reaģenti 3.1. Amonija tiocianāta 0,1n šķīdums; 3.2. Sudraba nitrāta 0,1n šķīdums; 3.3. Amonija dzelzs sulfāta piesātināts šķīdums; 3.4. Slāpekļskābe - d: 1.38; 3.5. Dietilēteris - a.t.; 3.6. Acetons - a.t.; 3.7. Kareca I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9g cinka acetāta Zn (CH3COO)2·2H2O un 3g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml; 3.8. Kareca II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6g kālija heksacianoferāta K4[Fe (CN)6]·3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml; 3.9. Aktīvā ogle - a.t., kas nesatur un neabsorbē hlorīdus. 4. Iekārtas Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min. 5. Darba gaita 5.1. Šķīduma sagatavošana - atbilstoši parauga īpašībām sagatavo šķīdumu tā, kā aprakstīts 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3. apakšpunktā. Vienlaikus veic "tukšā" parauga analīzi. 5.1.1. paraugi, kas nesatur organiskās vielas - ar precizitāti līdz miligramam ņem ne vairāk kā 10g iesvara, kurā ir ne vairāk par 3g hlorīdu hlora veidā un iepilda 500 ml mērkolbā, pievieno 400 ml apmēram 20°C siltu ūdeni. Maisa trīsdesmit minūtes maisītājā, uzpilda līdz atzīmei, samaisa un filtrē. 5.1.2. Paraugi, kas satur organiskās vielas, izņemot 5.1.3. punktā uzskaitītos produktus - nosver 5g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 1g aktīvās ogles pārnes uz 500 ml mērkolbu. Pievieno 400 ml ūdens ar temperatūru apmēram 20°C un 5 ml Karreza I šķīduma (3.7.), maisa, un tad pievieno 5 ml Karreza II šķīduma (3.8.). Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā, uzpilda līdz atzīmei, samaisa un filtrē. 5.1.3. Termiski apstrādāti barības līdzekļi, linu rauši un linu milti, produkti, kuros ir daudz linu miltu, un citi produkti, kuros ir daudz gļotvielu vai koloīdu vielu (piemēram, dekstrinēta ciete). Sagatavo šķīdumu saskaņā ar 5.1.2. punktā doto aprakstu, tikai to nefiltrē. Dekantē (ja vajadzīgs, centrifugē), ņem 100 ml šķidruma no virsējā slāņa, ko pārnes 200 ml mērkolbā. Samaisa ar acetonu (3.6.), kolbu uzpilda līdz atzīmei ar šo šķīdinātāju, samaisa un filtrē. 5.2. Titrēšana 5.2.1. Ar pipeti uz Erlenmeijera kolbu pārnes 25 ml līdz 100 ml filtrāta (atkarībā no gaidāmā hlora satura), ko iegūst saskaņā ar aprakstu 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3.apakš­punktā. Analīzei ņemtajā šķīduma tilpumā hlora (Cl) daudzumam jābūt ne vairāk par 150 mg. Ja nepieciešams, atšķaida ar vismaz 50 ml ūdens, pievieno 5 ml slāpekļskābes (3.4.), 20 ml piesātināta amonija dzelzs sulfāta šķīduma (3.3.) un divus pilienus amonija tiocianāta šķīduma (3.1.), ko ņem ar bireti, kas uzpildīta līdz nulles atzīmei. Lietojot citu bireti, šķīdumu titrē ar sudraba nitrāta šķīdumu (3.2.), līdz izzūd sarkani brūnā nokrāsa, un tad vēl papildus pievieno 5 ml šī šķīduma (3.2.). Pievieno 5 ml dietilētera (3.5.) un stipri sakrata, lai koagulētu nogulsnes. 5.2.2. Sudraba nitrāta pārākumu titrē ar amonija tiocianāta šķīdumu (3.1.), līdz veidojas sarkanbrūns krāsojums, kas saglabājas vienu minūti. 6. Rezultātu aprēķināšana Hlora daudzumu (m), ko izsaka kā nātrija hlorīdu, kas ir titrēšanai ņemtajā filtrāta tilpumā, aprēķina pēc šādas formulas: m = 5,845 (V1 - V2) mg, kur V1 = pievienotā 0,1 n sudraba nitrāta šķīduma tilpums, ml; V2 = titrēšanai izlietotais 0,1 n amonija tiocianāta šķīduma tilpums, ml. Ja "tukšā" parauga titrēšanai ir izlietots 0,1 n sudraba nitrāta šķīdums, atņemiet šo vērtību no tilpuma (V1 - V2). 7. Piezīmes 7.1. var veikt arī potenciometrisku titrēšanu; 7.2. analizējot produktus ar ļoti lielu eļļu un tauku saturu, tos vispirms attauko ar dietilēteri vai petrolēteri; 7.3. analizējot zivju miltus, titrēšanu var izdarīt arī pēc Mora metodes. Zemkopības ministrs M.Roze 7.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Laktozes noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka laktozes saturu barībā, kurā ir vairāk nekā 0,5 % laktozes. 2. Princips Cukurus šķīdina ūdenī. Šķīdumu fermentē ar raugu Saccharomyces cerevisiae, kas nešķeļ laktozi. Pēc dzidrināšanas un filtrēšanas laktozes saturu filtrātā nosaka pēc Lufa-Šorla metodes. 3. Reaģenti 3.1. Saccharomyces cerevisiae suspensija: 25g svaiga rauga suspendē 100 ml ūdens. Suspensiju var glabāt ledusskapī ne ilgāk par vienu nedēļu; 3.2. Kareca I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9g cinka acetāta Zn(CH3COO)2·2H2O un 3g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml tilpumam; 3.3. Kareca II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6g kālija heksacianoferāta K4[Fe(CN)6]·3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml; 3.4. Lufa-Šorla reaģents: uzmanīgi maisot, citronskābes šķīdumu (3.4.2.) pievieno nātrija karbonāta šķīdumam (3.4.3.). Pievieno vara sulfāta šķīdumu (3.4.1.) un papildina ar ūdeni līdz 1 litram. Nostādina līdz nākamajai dienai un filtrē. Pārbauda iegūtā šķīduma normalitāti (Cu 0,1 n; Na2CO3 2n). Šķīduma pH vajadzētu būt apmēram 9,4: 3.4.1. vara sulfāta šķīdums: izšķīdina 25g no dzelzs attīrīta a.t. vara sulfāta CuSO4·5H2O 100 ml ūdens; 3.4.2. citronskābes šķīdums: izšķīdina 50g a.t. citronskābes (C6H8O7·H2O) 50 ml ūdens; 3.4.3. nātrija karbonāta šķīdums: izšķīdina 143,8g bezūdens a.t. nātrija karbonāta apmēram 300 ml silta ūdens, atdzesē; 3.5. Pumeka gabaliņi, kas izvārīti sālsskābē, mazgāti ūdenī un izžāvēti; 3.6. Nātrija jodīda 30 % (m/V) šķīdums; 3.7. Sērskābes 6n šķīdums; 3.8. Nātrija tiosulfāta 0,1n šķīdums; 3.9. Cietes šķīdums: 1 litram vāroša ūdens pievieno 5g šķīstošās cietes maisījuma 30 ml ūdens. Vāra trīs minūtes, atdzesē un, ja vajadzīgs, kā konservantu pievieno 10mg dzīvsudraba jodīda. 4. Aparatūra Termostatējama ūdens vanna, kas ieregulēta 38-40°C temperatūrā. 5. Darba gaita 5.1. Nosver 1g paraugu ar precizitāti līdz 1 mg un iesvaru pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbu. Pievieno 25 līdz 30 ml ūdens. Kolbu 30 minūtes silda verdoša ūdens vannā un pēc tam atdzesē līdz apmēram 35°C temperatūrai. Pievieno 5 ml rauga suspensijas (3.1.) un homogenizē. Kolbu uz divām stundām ievieto ūdens vannā 38 - 40°C temperatūrā. Atdzesē līdz apmēram 20°C. 5.2. Pievieno 2,5 ml Kareca I šķīduma (3.2.) un maisa 30 sekundes, pēc tam pievieno 2,5 ml Kareca II šķīduma (3.3.) un atkal maisa 30 sekundes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml, samaisa un filtrē. Ar pipeti ņem ne vairāk par 25 ml filtrāta, kurā vēlams, lai būtu 40 līdz 80 mg laktozes, un to pārnes uz 300 ml tilpuma Erlenmeijera kolbu. Ja vajadzīgs, papildina ar ūdeni līdz 25 ml tilpumam. 5.3. Tādā pašā veidā veic tukšā parauga analīzi ar 5 ml rauga suspensijas (3.1.). 5.4. Pēc Lufa-Šorla metodes nosaka laktozes saturu: pievieno precīzi 25 ml Lufa-Šorla reaģenta (3.4.) un divus pumeka (3.5.) gabaliņus. Uz vidēja augstuma vaļējas liesmas šķīdumu apmēram divās minūtēs uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai, maisa ar roku. Erlenmeijera kolbu nekavējoties novieto uz metāla sieta, kas pārklāts ar azbestu un kam ir apmēram 6 cm liels caurums, zem kura iedegta liesma. Liesmu noregulē tā, lai Erlenmeijera kolba tiktu sildīta tikai no apakšas. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces dzesinātāju. Vāra precīzi desmit minūtes. Nekavējoties atdzesē aukstā ūdenī un pēc apmēram piecām minūtēm titrē šādi - pievieno 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.6.) un tūlīt pievieno 25 ml sērskābes 6 n šķīduma (3.7.) (uzmanīgi, iespējama ievērojama putu veidošanās). Titrē ar 0,1 n nātrija tiosulfāta šķīdumu (3.8.), līdz parādās blāvi dzeltens krāsojums, pievieno cietes indikatoru (3.9.) un pabeidz titrēšanu. 5.5. Tādā pašā veidā (bez vārīšanas) titrē 25 ml precīzi iemērīta Lufa-Šorla reaģenta (3.4.) un 25 ml ūdens maisījumu, kam pievienoti 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.6.) un 25 ml sērskābes 6 n šķīduma (3.7.). 6. Rezultātu aprēķināšana 6.1. Pēc tabulas nosaka laktozes daudzumu mg, kas atbilst divu titrēšanas rezultātu starpībai, ko izsaka 0,1 n nātrija tiosulfāta mililitros. 6.2. Rezultātu izsaka kā bezūdens laktozes masas daļu procentos no parauga masas. 7. Piezīmes 7.1. Tādu produktu analīzēm, kuros ir vairāk par 40 % rūgstošu cukuru, ņem vairāk par 5 ml rauga suspensijas (3.1.). 7.2. 0,1 n Na2S2O3 šķīduma (
  5. ml)lielumu tabula 25 ml Lufa-Šorla reaģentam (sildīšana - divas minūtes, vārīšana - desmit minūtes) 0,1 n Na2S2O3 Glikoze, fruktoze, invertcukuri C6H12O6 Laktoze C12H22O11 Maltoze C12H22O11 0,1 n Na2S2O3 ml mg starpība mg starpība mg starpība ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 88,0 94,6 23 Zemkopības ministrs M.Roze 8.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Kālija noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka kālija saturu barībā. 2. Princips Paraugu pārpelno un izšķīdina sālsskābē. Kālija saturu šķīdumā nosaka ar liesmas fotometru cēzija hlorīda un alumīnija nitrāta klātbūtnē. Pievienojot šīs vielas, tiek ievērojami novērsta traucējošo elementu ietekme. 3. Reaģenti 3.1. Sālsskābe - a.t., d: 1,12; 3.2. Cēzija hlorīds - a.t.; 3.3. Alumīnija nitrāts Al (NO3)3·9H2O - reaģents vispārējai lietošanai; 3.4. Kālija hlorīds - a.t., bezūdens; 3.5. buferšķīdums: ūdenī izšķīdina 50g cēzija hlorīda (3.2.) un 250g alumīnija nitrāta (3.3.), papildina līdz 1 litram ar ūdeni un homogenizē. Uzglabā plastmasas pudelēs; 3.6. Kālija standartšķīdums: ūdenī izšķīdina 1,907g kālija hlorīda (3.4.) un pievieno 5 ml sālsskābes šķīduma (3.1.), uzpilda līdz 1 litram ar ūdeni un homogenizē. Uzglabā plastmasas pudelēs. Šā šķīduma 1 ml satur 1,00mg kālija. 4. Iekārtas 4.1. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi pārpelnošanai, kam vajadzības gadījumos uzliek vāciņu; 4.2. Elektriskā mufeļkrāsns ar termo­statu; 4.3. Liesmas fotometrs. 5. Darba gaita 5.1. paraugu analīze 5.1.1. Parasti ņem 10g iesvara ar precizitāti līdz 10mg, ko pārnes uz tīģeli, un trīs stundas pārpelno 450°C temperatūrā. Pēc atdzesēšanas pelnus ar 250 līdz 300 ml ūdens kvantitatīvi pārnes uz 500 ml tilpuma mērkolbu un pievieno 50 ml sālsskābes (3.1.). Kad beigusies oglekļa dioksīda izdalīšanās, šķīdumu uzkarsē un, laiku pa laikam samaisot, divas stundas silda apmēram 90°C temperatūrā. Atdzesē, papildina ar ūdeni līdz atzīmei, sakrata un filtrē. Filtrāta alikvoto daļu, kas satur apmēram 1,0 mg kālija, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbu, pievieno 10,0 ml buferšķīduma (3.5.), uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni un samaisa. Ja kālija koncentrācija ir augsta, analizējamo šķīdumu atšķaida pirms buferšķīduma pievienošanas. 5.1.2. Apmēram 10g lielam parauga iesvaram orientējošais atšķaidījums norādīts tabulā. Paredzamais nātrija saturs paraugā (% Na) Atšķaidījuma koeficients Analīzei izmantotais šķīduma tilpums (
  6. ml)līdz 0,1 - 50 0,1 līdz 0,5 - 10 0,5 līdz 1,0 - 5 1,0 līdz 5,0 1 : 10 10 5,0 līdz 10,0 1 : 10 5 10,0 līdz 20,0 1 : 20 5 5.1.3. Mērījumus izdara ar liesmas fotometru pie 768 nm. Rezultātus aprēķina pēc kalibrēšanas līknes. 5.2. Kalibrēšanas līkne - precīzi 10 ml standartšķīduma (3.6.) pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni un samaisa. Precīzi 5, 10, 15, 20 un 25 ml šā šķīduma, kam atbilstošais kālija daudzums ir attiecīgi 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mg, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbām. Šo šķīdumu sēriju papildina ar tukšo paraugu, kam standartšķīdumu nepievieno. Visās kolbās pievieno pa 10 ml buferšķīduma (3.5.), ar ūdeni papildina līdz atzīmei un samaisa. Mērījumus veic tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunktā. Kalibrēšanas līknes lineārā daļa parasti ir līdz kālija koncentrācijai 1mg /100 ml šķīduma. 6. Rezultātu aprēķināšana Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Piezīmes Traucējošo elementu ietekmes novēršanai ne vienmēr ir jāpievieno šķīdums (3.5.). Zemkopības ministrs M.Roze 9.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Nātrija noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka nātrija saturu barības līdzekļos. 2. Princips Paraugu pārpelno un pelnus izšķīdina sālsskābē. Nātrija saturu šķīdumā nosaka ar liesmas fotometru cēzija hlorīda un alumīnija nitrāta klātbūtnē. Pievienojot šīs vielas, tiek ievērojami novērsta traucējošo elementu ietekme. 3. Reaģenti 3.1. Sālsskābe - a.t., d: 1,12; 3.2. Cēzija hlorīds - a.t.; 3.3. Alumīnija nitrāts Al (NO3)3·9H2O - reaģents vispārējai lietošanai; 3.4. Nātrija hlorīds - a.t., bezūdens; 3.5. Buferšķīdums: ūdenī izšķīdina 50g cēzija hlorīda (3.2.) un 250g alumīnija nitrāta (3.3.), papildina līdz 1 litram ar ūdeni un samaisa. Uzglabā plastmasas pudelēs; 3.6. Nātrija standartšķīdums: ūdenī izšķīdina 2,542g nātrija hlorīda (3.4.) un pievieno 5 ml sālsskābes (3.1.), uzpilda līdz 1 litram ar ūdeni un samaisa. Uzglabā plastmasas pudelēs, šā šķīduma 1 ml satur 1,00mg nātrija. 4. Iekārtas 4.1. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi pārpelnošanai, kam vajadzības gadījumos uzliek vāciņu; 4.2. elektriskā mufeļkrāsns ar termostatu; 4.3. Liesmas fotometrs. 5. Darba gaita 5.1. Paraugu analīzes 5.1.1. Parasti ņem 10 g iesvara ar precizitāti līdz 10 mg, ko pārnes tīģelī un trīs stundas pārpelno 450°C temperatūrā. Jānovērš pārkarsēšana (degšana). Pēc atdzesēšanas pelnus kvantitatīvi ar 250 līdz 300 ml ūdens pārnes uz 500 ml tilpuma mērkolbu un pievieno 50 ml sālsskābes (3.1.). Kad beigusies oglekļa dioksīda izdalīšanās, šķīdumu uzkarsē un, laiku pa laikam samaisot, divas stundas silda apmēram 90°C temperatūrā. Atdzesē, papildina ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Filtrāta alikvoto daļu, kas satur ne vairāk par 1,0 mg nātrija, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbu, pievieno 10,0 ml buferšķīduma (3.5.), papildina līdz atzīmei ar ūdeni un samaisa. Ja nātrija koncentrācija ir augsta, analizējamo šķīdumu atšķaida pirms buferšķīduma pievienošanas. 5.1.2. Apmēram 10g lielam parauga iesvaram orientējošais atšķaidījums norādīts tabulā. Paredzamais nātrija saturs paraugā (% Na) Atšķaidījuma koeficients Analīzei izmantotais šķīduma tilpums (
  7. ml)līdz 0,1 - 50 0,1 līdz 0,5 - 10 0,5 līdz 1,0 - 5 1,0 līdz 5,0 1 : 10 10 5,0 līdz 10,0 1 : 10 5 10,0 līdz 20,0 1 : 20 5 5.1.3. Mērījumus izdara ar liesmas fotometru pie 589nm. Rezultātus aprēķina pēc kalibrēšanas līknes. 5.2. Kalibrēšanas līkne - precīzi 10 ml standartšķīduma (3.6.) pārnes uz 250 ml tilpuma mērkolbu, papildina līdz atzīmei ar ūdeni un samaisa. Precīzi 5, 10, 15, 20 un 25 ml šā šķīduma, kam atbilstošais nātrija daudzums ir attiecīgi 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mg, pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbām. Šo šķīdumu sēriju papildina ar tukšo paraugu, kam standartšķīdumu nepievieno. Visās kolbās pievieno pa 10 ml buferšķīduma (3.5.), ar ūdeni papildina līdz atzīmei un samaisa. Mērījumus veic tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunktā. Kalibrēšanas līknes lineārā daļa parasti ir līdz nātrija koncentrācijai 1mg /100 ml šķīduma. 6. Rezultātu aprēķināšana Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Piezīmes 7.1. Produktiem, kuros ir vairāk par 4 % nātrija, ieteicams veikt pārpelnošanu divas stundas tīģelī ar vāciņu. Pēc atdzesēšanas pievieno ūdeni, pelnus ar platīna stiepli suspendē, izžāvē un pārpelno vēl divas stundas tīģelī ar vāciņu 7.2. Ja parauga sastāvā ir tikai minerālvielas, to izšķīdina, iepriekš nepārpelnojot Zemkopības ministrs M.Roze 10.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Cukura noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka reducējošo cukuru saturu, un, izdarot inversiju, kopējo cukuru saturu, ko izsaka glikozē vai atbilstošos gadījumos saharozē, reizinot ar koeficientu 0,95. Metode izmantojama kombinētās barības analīzēm. Pārējo barības veidu analīzēm ir īpašas metodes. Vajadzības gadījumos laktozi nosaka atsevišķi un ņem vērā rezultātu aprēķinos. 2. Princips Cukurus ekstrahē ar atšķaidītu etanolu, šķīdumu dzidrina ar Kareca I un Kareca II šķīdumu. Pēc etanola atdalīšanas ar Lufa-Šorla metodi nosaka cukuru daudzumu pirms un pēc inversijas. 3. Reaģenti 3.1. Etilspirts - 40 % V/V, d: 0,948 20°C temperatūrā, neitralizēts pēc fenolftaleīna; 3.2. Kareca I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9g cinka acetāta (Zn (CH3COO)2·2H2O) un 3g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml; 3.3. Kareca II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6g kālija heksacianoferāta (K4[Fe(CN)6]·3H2O). Papildina ar ūdeni līdz 100 ml; 3.4. Metiloranžā 0,1 % (m/V) šķīdums; 3.5. Sālsskābes 4n šķīdums; 3.6. Sālsskābes 0,1n šķīdums; 3.7. Nātrija hidroksīda 0,1n šķīdums; 3.8. Lufa-Šorla reaģents: Citronskābes šķīdumu (3.8.2.), uzmanīgi maisot, pievieno nātrija karbonāta šķīdumam (3.8.3.). Pievieno vara sulfāta šķīdumu (3.8.1.) un papildina ar ūdeni līdz 1 litram. Nostādina līdz nākamajai dienai un filtrē. Pārbauda iegūtā šķīduma normalitāti (Cu 0,1n, Na2CO3 2n). Šķīduma pH vajadzētu būt apmēram 9,4. 3.8.1. Vara sulfāta šķīdums: 25g no dzelzs attīrīta a.t. vara sulfāta (CuSO4·5H2O) izšķīdina 100 ml ūdens; 3.8.2. Citronskābes šķīdums: 50g a.t. citronskābes (C6H8O7·H2O) izšķīdina 50 ml ūdens; 3.8.3. Nātrija karbonāta šķīdums: 143,8g bezūdens a.t. nātrija karbonāta izšķīdina apmēram 300 ml silta ūdens un atdzesē; 3.9. Nātrija tiosulfāta 0,1n šķīdums; 3.10. Cietes šķīdums: 1 litram vāroša ūdens pievieno 5g šķīstošās cietes maisījuma 30 ml ūdens. Vāra trīs minūtes, atdzesē un, ja vajadzīgs, kā konservantu pievieno 10mg dzīvsudraba jodīda; 3.11. Sērskābes 6n šķīdums; 3.12. Kālija jodīda 30 % (m/V) šķīdums; 3.13. Pumeka gabaliņi, kas izvārīti sālsskābē, mazgāti ūdenī un izžāvēti; 3.14. 3-metil-butān-1-ols. 4. Aparatūra Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min. 5. Darba gaita 5.1. Parauga ekstrakcija - 2,5g lielu parauga iesvaru ar precizitāti līdz 1 mg pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 200 ml etanola šķīduma (3.1.) un vienu stundu maisa maisītājā. Pievieno 5 ml Kareca I šķīduma (3.2.) un maisa vienu minūti. Pievieno 5 ml Kareca II šķīduma (3.3.) un maisa vēl vienu minūti. Uzpilda ar etilspirta šķīdumu (3.1.) līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Ņem 200 ml filtrāta un, lai atdalītu lielāko daļu etanola, ietvaicē apmēram uz pusi. Ietvaicēto šķīdumu ar siltu ūdeni kvantitatīvi pārnes 200 ml tilpuma mērkolbā, atdzesē, papildina ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē, ja nepieciešams. Šo šķīdumu izmantos reducējošo cukuru un (pēc inversijas) arī kopējo cukuru daudzuma noteikšanai. 5.2. Reducējošo cukuru noteikšana - ar pipeti ņem ne vairāk par 25 ml šķīduma, kurā, izsakot glikozē, ir ne vairāk kā 60mg reducējošo cukuru. Ja vajadzīgs, tilpumu papildina ar ūdeni līdz 25 ml un nosaka reducējošos cukurus pēc Lufa-Šorla metodes. Rezultātu izsaka kā glikozes masas daļu procentos no parauga masas. 5.3. Kopējā cukuru satura noteikšana pēc inversijas - ar pipeti ņem 50 ml šķīduma, ko pārnes 100 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno dažus pilienus metiloranžā šķīduma (3.4.) un pēc tam, nepārtraukti maisot, uzmanīgi pievieno 4n sālsskābes šķīdumu (3.5.), līdz šķidrums kļūst izteikti sarkans. Pievieno 15 ml 0,1n sālsskābes šķīdumu (3.6.) un kolbu uz trīsdesmit minūtēm strauji ievieto verdošā ūdens vannā. Ātri atdzesē līdz aptuveni 20°C temperatūrai un pievieno 15 ml 0,1n nātrija hidroksīda šķīduma (3.7.). Papildina ar ūdeni līdz 100 ml un samaisa. Ar pipeti ņem ne vairāk par 25 ml šķīduma, kurā, izsakot glikozē, ir ne vairāk par 60mg reducējošo cukuru. Ja vajadzīgs, tilpumu papildina ar ūdeni līdz 25 ml un nosaka reducējošos cukurus pēc Lufa-Šorla metodes. Rezultātu izsaka glikozes vai, ja vajadzīgs, saharozes procentos, reizinot ar koeficientu 0,95. 5.4. Titrēšana pēc Lufa-Šorla metodes 5.4.1. Ar pipeti ņem 25 ml Lufa-Šorla reaģenta (3.8.), ko pārnes 300 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā, pievieno precīzi 25 ml dzidrināta cukura šķīduma. Pievieno divus gabaliņus pumeka (3.13.) un, ar roku maisot, uz vidēja augstuma vaļējas liesmas šķīdumu apmēram divās minūtēs uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai. Erlemneijera kolbu nekavējoties novieto uz metāla sieta, kas pārklāts ar azbestu un kuram ir caurums apmēram 6 cm diametrā, zem kura iedegta liesma. Liesmu noregulē tā, lai Erlenmeijera kolba tiktu sildīta tikai no apakšas. Erlenmeijera kolbai pievieno atteces dzesinātāju. Vāra precīzi desmit minūtes. Nekavējoties atdzesē aukstā ūdenī un apmēram pēc piecām minūtēm titrē šādi. 5.4.2. Pievieno 10 ml kālija jodīda šķīdumu (3.12.) un tūlīt pēc tam pievieno 25 ml 6n sērskābes šķīdumu (3.11.) (uzmanīgi, iespējama ievērojama putu veidošanās). Titrē ar 0,1n nātrija tiosulfāta šķīdumu (3.9.), līdz parādās blāvi dzeltens krāsojums, pievieno cietes indikatoru (3.10.) un pabeidz titrēšanu. 5.4.3. Bez vārīšanas tādā pašā veidā titrē 25 ml precīzi mērīta Lufa-Šorla reaģenta (3.8.) un 25 ml ūdens maisījuma, kam pievienoti 10 ml kālija jodīda šķīduma (3.12.) un 25 ml 6n sērskābes šķīduma (3.11.). 6. Rezultātu aprēķināšana Pēc tabulas nosaka glikozes daudzumu mg, kas atbilst divu titrēšanas rezultātu starpībai, ko izsaka 0,1n nātrija tiosulfāta mililitros. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Īpašas procedūras 7.1. Ja analizē barību, kurā ir daudz melases, kā arī citu veidu barību, kas nav īpaši viendabīga, ņem 20g lielu iesvaru, ko ar 500 ml ūdens pārnes 1 l tilpuma mērkolbā. Vienu stundu maisa maisītājā. Dzidrina, izmantojot Kareca I (3.2.) un Kareca II (3.3.) šķīdumus pēc 5.1. apakšpunktā sniegtā apraksta, abus reaģentus ņemot četrreiz lielākā daudzumā. Uzpilda līdz atzīmei ar 80 % V/V etanolu. Samaisa un filtrē. Atdala etanolu pēc 5.1. apakšpunktā sniegtā apraksta. Ja paraugā nav dekstrīnā pārvērstas cietes, uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni. 7.2. Analizējot melasi un vienkāršo barību, kurā ir daudz cukuru un kas tikpat kā nesatur cieti (ceratonijas, žāvēti biešu graizījumi u.c.), ņem 5g iesvara un pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā, pievieno 200 ml ūdens un vienu stundu, bet, ja vajadzīgs, arī ilgāk, maisa maisītājā. Dzidrina ar Kareca I (3.2.) un Kareca II (3.3.) šķīdumiem pēc 5.1. apakšpunktā sniegtā apraksta. Uzpilda ar aukstu ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Lai noteiktu kopējo cukuru saturu, analīzi turpina pēc 5.3. apakšpunktā sniegtā apraksta. 8. Piezīmes 8.1. Pirms vārīšanas ar Lufa-Šorla reaģentu putošanās novēršanai ieteicams pievienot (neatkarīgi no tilpuma) apmēram 1 ml 3-metil-butān-1-ola (3.14.); 8.2. Pēc glikozē izteiktā kopējo cukuru daudzuma, ko nosaka pēc inversijas, un glikozē izteiktā reducējošo cukuru daudzuma starpības, ko reizina ar koeficientu 0,95, nosaka saharozes saturu; 8.3. Reducējošos cukurus, izņemot laktozi, var noteikt pēc divām metodēm: 8.3.1. aptuvenu aprēķinu - laktozes saturu reizina ar koeficientu 0,675, kas noteikts pēc citas metodes, un iegūto rezultātu atņem no reducējošo cukuru satura; 8.3.2. precīzu aprēķinu - nosakot reducējošo cukuru, izņemot laktozi, vienam paraugam veic divas analīzes. Vienai analīzei ņem daļu šķīduma, kas iegūts saskaņā ar 5.1. apakšpunktā sniegto aprakstu, bet otrai analīzei - daļu šķīduma, ko iegūst pēc laktozes noteikšanas metodes (pēc citu cukuru fermentācijas un dzidrināšanas). Abos gadījumos cukuru saturu nosaka pēc Lufa-Šorla metodes un aprēķina mg glikozes. No viena lieluma atņem otru un starpību izsaka procentos no parauga masas. Piemērs Divi abām analīzēm ņemto šķīdumu tilpumi atbilst 250mg paraugam. Pirmajā gadījumā patērēti 17 ml 0,1n nātrija tiosulfāta šķīduma, kas atbilst 44,2mg glikozes; otrajā - 11 ml, kas atbilst 27,6mg glikozes. Starpība ir 16,6mg glikozes. Tāpēc reducējošo cukuru (izņemot laktozi) saturs, pārrēķinot glikozē, ir: 4 x 16,6 = 6,64% ___________ 10 0,1n Na2S2O3 šķīduma (
  8. ml)lielumu tabula 25 ml Lufa-Šorla reaģentam (sildīšana - divas minūtes, vārīšana - desmit minūtes) 0,1n Na2S2O3 Glikoze, fruktoze, invertcukuri C6H12O6 Laktoze C12H22O11 Maltoze C12H22O11 0,1n Na2S2O3 ml mg starpība mg starpība mg starpība ml 1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1 2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2 3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3 4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4 5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5 6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6 7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7 8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8 9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9 10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10 11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11 12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12 13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13 14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14 15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15 16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16 17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17 18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18 19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19 20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20 21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21 22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22 23 62,2 88,0 94,6 23 Zemkopības ministrs M.Roze 11.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Urīnvielas noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka urīnvielas saturu barībā. 2. Princips Paraugu kopā ar dzidrināšanas reaģentu iejauc ūdenī. Suspensiju filtrē. Urīnvielas saturu filtrātā nosaka pēc 4-dimetilaminobenzaldehīda (4-DMAB) pievienošanas, ar spektrofotometru mērot optisko blīvumu pie 420 nm. 3. Reaģenti 3.1. 4-dimetilaminobenzaldehīda šķīdums: izšķīdina 1,6 g 4-DAMB 100 ml 96% etanola un pievieno 10 ml tīra analīzei (a.t.). sālsskābes (d: 1,19). Šo reaģentu var glabāt ne ilgāk par divām nedēļām; 3.2. Karreza I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9 g cinka acetāta Zn(CH3COO)2·2H2O un 3 g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 m;l 3.3. Karreza II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6 g kālija dzelzs cianīda K4[Fe(CN)6]·3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml; 3.4. aktīvā ogle - a.t., kas neabsorbē urīnvielu (jāpārbauda); 3.5. urīnvielas šķīdums a.t., 0,1 % masa/tilpums (m/v). 4. Iekārtas 4.1. rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.; 4.2. mēģenes: 160 × 16 mm ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem; 4.3. spektrofotometrs. 5. Darba gaita 5.1. Parauga analīze 5.1.1. Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz vienam miligramam un kopā ar 1 g aktīvās ogles (3.4.) pārnes uz 500 ml mērkolbu. Pievieno 400 ml ūdens un pa 5 ml Karreza I šķīduma (3.2.) un Karreza II šķīduma (3.3.). 30 minūtes maisa maisītājā. Uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. 5.1.2. Ņem 5 ml caurspīdīgā bezkrāsas filtrāta, pārnes uz mēģeni ar pieslīpēta stikla aizbāzni, pievieno 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.) un samaisa. Mēģeni ievieto ūdens vannā 20°C temperatūrā. Pēc piecpadsmit minūtēm ar spektrofotometru pie 420 nm mēra parauga šķīduma optisko blīvumu. Salīdzina ar "tukšā" parauga šķīdumu. 5.2. Kalibrēšanas līkne: 5.2.1. Ņem pa 1, 2, 4, 5 un 10 ml urīnvielas šķīduma (3.5.), pārnes uz 100 ml tilpuma mērkolbām un papildina ar ūdeni līdz atzīmei; 5.2.2. Ņem 5 ml no katra šķīduma, pievieno pa 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.), samaisa un iepriekš aprakstītajā veidā mēra optisko blīvumu pret kontrolšķīdumu, kas sastāv no 5 ml 4-DMAB un 5 ml ūdens, kurš nesatur urīnvielu. Konstruē kalibrēšanas līkni. 6. Rezultātu aprēķināšana Pēc kalibrēšanas līknes nosaka urīnvielas daudzumu paraugā. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Piezīmes 7.1. Ja urīnvielas saturs ir lielāks par 3 %, iesvaru samazina līdz 1 g vai sākotnēji pagatavoto šķīdumu atšķaida tā, lai 500 ml nebūtu vairāk par 50mg urīnvielas; 7.2. Ja urīnvielas saturs ir zems, parauga iesvara masu palielina, ievērojot nosacījumu, ka no tā iegūtais filtrāts ir caurspīdīgs un bezkrāsains; 7.3. Ja paraugs satur tādus vienkāršus slāpekļa savienojumus kā aminoskābes, optisko blīvumu mēra pie 435nm. Zemkopības ministrs M.Roze 12.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Ureāzes aktivitātes noteikšana sojas produktos 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka ureāzes aktivitāti sojas produktos un to, vai šie produkti ir pietiekami ilgi termiski apstrādāti. 2. Princips Ureāzes aktivitāti nosaka pēc amonjaka slāpekļa daudzuma, kas uz 1g produkta 30°C temperatūrā vienas minūtes laikā izdalās no urīnvielas šķīduma. 3. Reaģenti 3.1. 0,1n sālsskābes šķīdums; 3.2. 0,1n nātrija hidroksīda šķīdums; 3.3. Fosfātu 0,05 M buferšķīdums, kurā uz 1000 ml ir 4,45 g nātrija hidrogēnfosfāta (Na2HPO4·2H2O) un 3,40 g kālija dihidrogēnfosfāta (KH2PO4); 3.4. Svaigi pagatavots urīnvielas buferšķīdums, kurā uz 1000 ml buferšķīduma (3.3.) ir 30,0 g urīnvielas; pH 6,9-7,0 4. Aparatūra 4.1. Potenciometriskās titrēšanas iekārta vai augstas jutības pH-metrs (0,02 pH) ar magnētisko maisītāju; 4.2. Termostatējama ūdens vanna, kas ieregulēta 30°C temperatūrā; 4.3. Mēģenes (150 × 18
  9. mm)ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem. 5. Darba gaita 5.1. Sasmalcina apmēram 20 g parauga (piemēram, kafijas dzirnaviņās) tā, lai to var izsijāt caur 0,2 mm lielu acu sietu. Ņem 0,2 g sasmalcinātā parauga iesvara ar precizitāti līdz 1 mg, to pārnes uz mēģeni ar pieslīpēta stikla aizbāzni un pievieno 10 ml urīnvielas buferšķīduma (3.4.). Mēģeni nekavējoties noslēdz ar aizbāzni un enerģiski krata. Mēģeni precīzi uz 30 minūtēm ievieto ūdens vannā, kas noregulēta uz 30°C temperatūru. Nekavējoties pievieno 10 ml sālsskābes 0,1 n šķīduma (3.1.), strauji atdzesē līdz 20°C un mēģenes saturu, divreiz skalojot ar 5 ml ūdens, kvantitatīvi pārnes titrēšanas traukā. Ar stikla elektrodu (4.1.) elektrometriski ar 0,1 n nātrija hidroksīda šķīdumu (3.2.) nekavējoties un ātri titrē līdz pH 4,7. 5.2. Tukšo paraugu analizē šādi - ņem 0,2 g sasmalcinātā parauga iesvara ar precizitāti līdz mg, ko ātri pārnes uz mēģeni ar pieslīpēta stikla aizbāzni, pievieno 10 ml 0,1 n sālsskābes šķīduma (3.1.) un 10 ml urīnvielas buferšķīduma (3.4.). Mēģeni nekavējoties atdzesē ledus ūdenī, kur to tur 30 minūtes. Iepriekš norādītajos apstākļos mēģenes saturu pārnes traukā titrēšanai, lietojot 0,1 n nātrija hidroksīda šķīdumu (3.2.) līdz pH 4,7. 6. Aprēķins Ureāzes aktivitāti aprēķina pēc formulas: mgN 1 · 4(b -
  10. a)----- pie 30°C = --------, g min 30 · E kur a = parauga titrēšanai patērētais 0,1 n nātrija hidroksīda šķīduma tilpums mililitros b = tukšajam paraugam patērētais 0,1 n nātrija hidroksīda šķīduma tilpums mililitros E = parauga masa gramos 7. Piezīmes 7.1. Šī metode piemērota ureāzes aktivitātes noteikšanai līdz 1 mgN/g*min. 30°C temperatūrā. Produktiem ar augstāku ureāzes aktivitāti parauga iesvaru var samazināt līdz 50 mg 7.2. Produkti, kas satur vairāk par 10% tauku, vispirms aukstumā jāattauko Zemkopības ministrs M.Roze 13.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Mitruma noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra 1.1. Ar šo metodi nosaka mitruma saturu barībā. 1.2. Eiropas Padomes Regulā Nr. 136/66/EEK definēto eļļas sēklu un eļļas augļu analīzes neveic ar šo metodi. Ar šo metodi neizmeklē arī piena produktus, minerālvielas un minerālbarību. 1.3. Eļļas sēklu un eļļas augu mitruma satura noteikšana ir aprakstīta Eiropas Komisijas Regulas Nr. 1470/682 III pielikumā. 2. Princips Paraugu žāvē atkarībā no barības sastāva. Masas zudumus nosaka sverot. Ja analizē cietu barību, kurai ir augsts mitruma saturs, tad veic sākotnējo žāvēšanu. 3. Iekārtas 3.1. Malšanai izmanto dzirnavas no materiāla, kas neabsorbē mitrumu un ir viegli tīrāms, veic ātru, vienmērīgu sasmalcināšanu, neradot būtisku parauga sakaršanu. Dzirnavām ,kas novērš saskari ar apkārtējo gaisu un atbilst 4.1.1., 4.1.2. apakšpunktā minētajām prasībām (piemēram, āmurveida dzirnavas vai dzirnavas ar ūdens dzesēšanu, konusveida dzirnavas, dzirnavas ar palēninātu zobratu apgriezienu skaitu); 3.2. Analītiskie svari ar precizitāti līdz 0,5 mg; 3.3. Sausi nerūsējoša metāla vai stikla trauki (konteineri) ar vākiem, kas nodrošina to hermētisku noslēgšanu. Trauku žāvēšanas virsmai jānodrošina analizējamā parauga biezums aptuveni 0,3 g/cm² slānī; 3.4. Žāvēšanas skapis (± 1°C) ar pienācīgu ventilāciju un ātru temperatūras regulēšanu
(3); 3.5. Regulējama elektriskā vakuumkrāsns, kas aprīkota ar eļļas sūkni un mehānismu karsta, sausa gaisa vai žāvējoša aģenta (piemēram, kalcija oksīds) ievadīšanai; 3.6. Eksikators, kas nodrošina efektīvu mitruma uzsūkšanu. 4. Darba gaita Piezīme. Šajā sadaļā aprakstītās darbības ir jāveic tūlīt pēc paraugu iepakojuma atvēršanas. Analīzes jāatkārto vismaz divas reizes. 4.1. Parauga sagatavošana: 4.1.1. neattiecas uz to barību, kas minēta 4.1.2. un 4.1.3.apakšpunktā. Ņem vismaz 50 g parauga. Pēc vajadzības sasmalcina vai sadala tā, lai izvairītos no mitruma satura izmaiņām (skatīt 6. punktu); 4.1.2. graudi un putraimi; 4.1.2.1. Ņem vismaz 50 g parauga. To samaļ tā, ka vismaz 50% no maluma izsijājas caur 0,5 mm sietu un atlikums 1 mm sietā nepārsniedz 10%. 4.1.2.2. Graudu, miltu, putraimu un rupja maluma miltus žāvē krāsnī, kuras siltumspēja ir tāda, lai pēc tam, kad to noregulē uz 131°C un vienlaicīgai žāvēšanai ievieto maksimālo analizējamo paraugu skaitu, norādītā temperatūra tiek sasniegta 45 minūtēs. Žāvēšanas krāsns ventilācijai jābūt tādai, lai atšķirība starp rezultātiem, kas iegūti, žāvējot kviešu paraugus pie pilna krāsns noslogojuma divas stundas, un rezultātiem, kas iegūti pēc četru stundu žāvēšanas, būtu mazāka par 0,15 %. 4.1.3. šķidra vai pastveida formas barība un barība, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem. Ņem aptuveni 25 g parauga, nosver ar precizitāti līdz 10 mg, pievieno atbilstošu daudzumu sausas smilts, kas nosvērta ar precizitāti līdz 10 mg un samaisa, kamēr iegūst viendabīgu produktu. 4.2. Žāvēšana 4.2.1. barības līdzekļi, izņemot 4.2.2. un 4.2.3.apakšpunktā minētos; Nosver trauku (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā traukā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Trauku ar atvērtu vāku ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 103°C. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, trauku tajā ievieto pēc iespējas ātrāk. Paraugu žāvē četras stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 103°C. Traukam uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Barību, kuras sastāvā galvenokārt ir eļļas un tauki, žāvē krāsnī vēl papildu 30 minūtes 130°C temperatūrā. Mitruma saturs paraugā starp diviem mērījumiem nedrīkst pārsniegt 0,1%. 4.2.2. graudaugi, milti, putraimi un rupja maluma milti; Nosver trauku (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā traukā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g samalta parauga un izlīdzina. Trauku ar atvērtu vāku ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 130°C. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, trauku tajā ievieto pēc iespējas ātrāk. Paraugu žāvē divas stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra sasniedz 130°C. Traukam uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6. punkts) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. 4.2.3. barības līdzekļi, kas satur vairāk kā 4% saharozes vai laktozes (piemēram, augļi, hidrolizēti graudaugu produkti, iesala asni, kaltēti biešu graizījumi, zivju buljons un cukuru sīrupi), barība, kas satur vairāk kā 25% minerālsāļu, ieskaitot kristalizācijas ūdeni. 4.2.3.1. Nosver trauku (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā traukā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Trauku ar atvērtu vāku ieliek vakuuma krāsnī (3.5.), kas iepriekš sakarsēta līdz 80°C - 85°C. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, trauku tajā ievieto pēc iespējas ātrāk. 4.2.3.2. Žāvējamā krāsnī palielina spiedienu līdz 0,13 atmosfērām (100 tor) un pie šāda spiediena paraugu žāvē četras stundas - vai nu karsta, sausa gaisa plūsmā vai, izmantojot vielu, kas uzsūc mitrumu (aptuveni 300 g uz 20 paraugiem). Izmantojot otro metodi, pēc paredzētā spiediena sasniegšanas vakuuma sūkni atvieno. Žāvēšanas laiku skaita no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 80°C līdz 85°C. Krāsnī uzmanīgi atjauno atmosfēras spiedienu. Krāsni atver, traukam nekavējoties uzliek vāku, izņem trauku no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Tad turpina parauga žāvēšanu 30 minūtes vakuuma krāsnī pie 80°C līdz 85°C un vēlreiz nosver. Mitruma saturs paraugā starp abiem svērumiem nedrīkst pārsniegt 0,1 %. 4.3. Sākotnējā žāvēšana: 4.3.1. barības līdzekļi, izņemot tos, kas minēti 4.3.2.apakšpunktā; Sākotnēji žāvē barības līdzekļus ar augstu mitruma saturu, kurus grūti samalt: 50 g nesasmalcināta parauga (ja nepieciešams, presētu vai aglomerētu barību var nedaudz sasmalcināt) ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā traukā (piemēram, 20 × 12 cm alumīnija trauks ar 0,5 cm apmali). Žāvē krāsnī pie 60°C līdz 70°C temperatūrā, kamēr mitruma saturs ir samazinājies līdz 8% - 12%. Trauku izņem no krāsns, atdzesē vienu stundu laboratorijā, noņemot vāku, un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.1. apakšpunktā, un žāvē kā norādīts 4.2.1. vai 4.2.3. apakšpunktā atkarībā no barības sastāva. 4.3.2. graudaugi; Graudus, kuru mitruma saturs pārsniedz 17%, sākotnēji žāvē šādi: 50 g nemaltu graudu ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā traukā (piemēram, 20 x 12 cm alumīnija trauks ar 0,5 cm apmali). Žāvē krāsnī 5 līdz 7 minūtes pie 130°C. Izņem no krāsns, atdzesē laboratorijā divas stundas, noņemot vāku, un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.2. apakšpunktā, un žāvē, kā norādīts 4.2.2. apakšpunktā. 5. Rezultātu aprēķināšana Mitruma saturu paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu: 5.1. Žāvēšana bez sākotnējās žāvēšanas: 100 (E -
  1. m)· ----, E kur E = analizējamā parauga sākotnējā masa gramos m = izžāvētā analizējamā parauga masa gramos 5.2. Žāvēšana ar sākotnēju žāvēšanu: kur E = analizējamā parauga sākotnējā masa gramos M = analizējamā parauga masa gramos pēc sākotnējās kaltēšanas M' = analizējamā parauga masa gramos pēc sasmalcināšanas vai samalšanas m = izkaltētā analizējamā parauga masa gramos Rezultātus izsaka procentos. 5.3. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 0,2% mitruma. 6. Piezīmes Ja ir vajadzīga parauga malšana un ja tās rezultātā mainās produkta mitruma saturs, barības sastāvdaļu analīzes rezultāti ir jākoriģē, pamatojoties uz parauga mitruma saturu tā sākotnējā stāvoklī. Zemkopības ministrs M.Roze 14.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Gaistošo slāpekļa bāzu noteikšana 1. Mikrodifūzijas metode 1.1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka gaistošo slāpekļa bāžu saturu barībā. Rezultātu izsaka kā amonjaku. 1.2. Princips Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala mikrodifūzijas ceļā, izmantojot kālija karbonāta šķīdumu, kas tiek uztverts borskābes šķīdumā un titrēts ar sērskābi. 1.3. Reaģenti 1.3.1. 20% trihloretiķskābes šķīdums - masa/tilpums,(m/v); 1.3.2. Indikators: 33mg bromkrezolzaļā un 65mg metilsarkanā izšķīdina 100 ml 95 % -96 % (v/
  2. v)etanola; 1.3.3. Borskābes šķīdums: 1 litra mērkolbā ielej 200 ml 95 % -96 % etanola, 700 ml ūdens un izšķīdina 10g borskābes- analītiski tīrs (a.t.). Pievieno 10 ml indikatora (1.3.2.). Sajauc un pēc vajadzības koriģē šķīduma krāsu līdz gaiši sarkanai, pievienojot nātrija hidroksīdu. 1 ml šā šķīduma nofiksēs līdz 300 mg amonjaka (NH3); 1.3.4. Piesātināts kālija karbonāta šķīdums: 10.0g kālija karbonāta (a.t.) izšķīdina 100 ml vāroša ūdens. Atdzesē un filtrē; 1.3.5. Sērskābe 0,02n. 1.4. Iekārtas 1.4.1. Mikseris (maisītājs) - aptuveni 35 līdz 40 apgr /min.; 1.4.2. Stikla vai plastmasas Konveja trauks; 1.4.3. Mikrobiretes - graduējums 1/100 ml. 1.5. Darba gaita 1.5.1. Nosver 10g parauga ar precizitāti līdz 1mg un kopā ar 100 ml ūdens pārnes uz 200 ml mērkolbu. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (1.3.1.), papildina līdz atzīmei ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru. 1.5.2. Ar pipeti Konveja trauka centrā iepilina 1 ml borskābes šķīduma (1.3.3.) un 1 ml parauga filtrāta trauka ārējā lokā. Trauku daļēji nosedz ar ieziestu vāku. 1 ml piesātināta kālija karbonāta šķīduma (1.3.4.) ātri iepilina ārējā lokā un aizver vāku, hermētiski noslēdzot trauku. Trauku uzmanīgi griež, lai tas rotētu horizontālā plaknē un abi reaģenti sajauktos. Inkubācija turpinās vismaz četras stundas istabas temperatūrā vai vienu stundu 40°C temperatūrā. 1.5.3. Izmantojot mikrobireti (1.4.3.), gaistošās bāzes titrē borskābes šķīdumā ar 0,02n sērskābes (1.3.5.). 1.5.4. Veic "tukšo" analīzi, izmantojot to pašu procedūru bez analizējamā parauga. 1.6. Rezultātu aprēķināšana 1 ml 0,02n H2SO4 atbilst 0,34mg amonjaka. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 1.7. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt: 10% no relatīvā lieluma, ja amonjaka saturs ir mazāks par 1,0% 0,1 % no absolūtā lieluma, ja amonjaka saturs ir lielāks par 1,0% 1.8. Piezīmes Sākotnējo filtrātu atšķaida, ja amonjaka saturs paraugā pārsniedz 0,6 %. 2. Destilēšana 2.1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka gaistošo slāpekļa bāzu saturu zivju miltos, kas praktiski nesatur urīnvielu, izteiktu kā amonjaku. To piemēro tikai tad, ja amonjaka saturs paraugā ir mazāks par 0,25 %. 2.2. Princips Paraugu ekstrahē ar ūdeni, šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala viršanas temperatūrā, pievienojot magnija oksīdu, savāc konkrētā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu. 2.3. Reaģenti 2.3.1. 20% (m/
  3. v)trihloretiķskābes šķīdums; 2.3.2. Magnija oksīds (a.t.); 2.3.3. Putu dzēšanas emulsija (piemēram, silikons); 2.3.4. Sērskābe 0,1 n; 2.3.5. Nātrija hidroksīda šķīdums 0,1 n; 2.3.6. 0,3 % (m/
  4. v)metilsarkanā šķīduma 95 % -96 % (v/
  5. v)etanolā. 2.4. Iekārtas 2.4.1. Mikseris (maisītājs): aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.; 2.4.2. Kjeldāla tipa destilēšanas iekārta. 2.5. Darba gaita 2.5.1. Nosver 10 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 100 ml ūdens ielej 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (2.3.1.), papildina līdz atzīmei ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru. 2.5.2. Ņem tīra filtrāta daudzumu, kāds ir piemērots prognozētajam gaistošo slāpekļa bāzu saturam (parasti der 100 ml). Atšķaida līdz 200 ml, pievieno 2 g magnija oksīda (2.3.2.) un dažus putu dzēšanas emulsijas pilienus (2.3.3.). Izmantojot lakmusa papīru, nosaka šķīduma reakciju. Tai jāuzrāda sārmaina reakcija, pretējā gadījumā vēl pievieno magnija oksīdu (2.3.2.). Aptuveni 150 ml šķīduma destilē Kjeldāla iekārtā un destilātu savāc Erlenmeijera kolbā, kurā ir precīzi nomērīts 0,1 n sērskābes (2.3.4.) daudzums (25 - 50 ml). Destilējot raugās, lai trauka sienas nepārkarstu. Sērskābes šķīdumu vāra divas minūtes, atdzesē un sērskābes pārpalikumu attitrē ar 0,1 n nātrija hidroksīda šķīdumu (2.3.5.) metilsarkanā indikatora (2.3.6.) klātbūtnē. 2.5.3. Veic "tukšo" analīzi, izmantojot to pašu procedūru bez analizējamā parauga. 2.6. Rezultātu aprēķināšana 1 ml 0,1 n H2SO4 atbilst 1,7 mg amonjaka. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 2.7. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% no amonjaka relatīvās vērtības. Zemkopības ministrs M.Roze 15.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Kopējā fosfora daudzuma noteikšana ar fotometrisko metodi 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka kopējo fosfora saturu barībā. Metode ir piemērota tādu produktu analīzei, kuros ir zems fosfora daudzums. Dažos gadījumos (ja produktā ir daudz fosfora) var izmantot gravimetrisko metodi. 2. Princips Paraugu mineralizē, izmantojot sauso dedzināšanu (organiskās barības gadījumā) vai skābes hidrolīzi (kombinēto minerālu un šķidrās barības gadījumā), un veic skābes izvilkumu. Šķīdumu apstrādā ar molibdovanadāta reaģentu. Šādi iegūtā dzeltenā šķīduma optisko blīvumu mēra ar spektrofotometru pie 430 nm. 3. Reaģenti 3.1. Kalcija karbonāts - a.t.; 3.2. Sālsskābe - a.t., d 1,1 (aptuveni 6 n); 3.3. Slāpekļskābe - a.t., d 1,045; 3.4. Slāpekļskābe - a.t., d 1,38 līdz 1,42; 3.5. Sērskābe - a.t., d 1,84; 3.6. Molibdovanadāta reaģents 200 ml amonija heptomolibdāta šķīduma (3.6.1.), 200 ml amonija monovanadāta šķīduma (3.6.2.) un 134 ml slāpekļskābes (3.4.) sajauc 1 litra mērkolbā. Uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei. 3.6.1. Amonija heptomolibdāta šķīdums: karstā ūdenī izšķīdina 100 g amonija heptomolibdāta (NH4) 6Mo7024 4 H2O. Pievieno 10 ml amonjaka (d: 0,91) un uzpilda ar ūdeni līdz 1 litram 3.6.2. Amonija monovanadāta šķīdums: 400 ml karsta ūdens izšķīdina 2,35 g amonija monovanadāta (t.
  6. a)NH4VO3. Pastāvīgi maisot, lēnām pievieno 20 ml atšķaidītas slāpekļskābes (7 ml HNO3 (3.4) + 13 ml H2O) un papildina līdz 1 litram ar ūdeni; 3.7. 1 mg/ ml fosfora standarta šķīdums: ūdenī izšķīdina 4,387 g kālija dihidrogēna fosfāta (a.t.) KH2PO4. Uzpilda ar ūdeni līdz 1 litram. 4. Iekārtas 4.1. Kvarca vai porcelāna tīģeļi; 4.2. Elektriskā mufeļkrāsns - 550°C; 4.3. 250 ml Kjeldāla kolba; 4.4. Mērkolbas un graduētas pipetes; 4.5. Spektrofotometrs; 4.6. Mēģenes vai kolbas ar 16 mm diametru un aizbāžņiem 14,5 mm diametrā, ar 25 līdz 30 ml tilpumu. 5. Darba gaita 5.1. Šķīduma sagatavošana: Atkarībā no parauga sastāva sagatavo šķīdumu, kā norādīts 5.1.1. vai 5.1.2. apakšpunktā 5.1.1. 1g parauga vai vairāk nosver ar precizitāti līdz 1mg. Analizējamo paraugu ieliek Kjeldāla kolbā, pievieno 20 ml sērskābes (3.5.), sakrata, lai vielu pilnībā piesūcinātu ar skābi un neļautu tai pielipt pie kolbas sienām, uzkarsē un uztur viršanas temperatūru 10 minūtes. Nedaudz atdzesē, pievieno 2 ml slāpekļskābes (3.4.), lēnām uzkarsē, nedaudz atdzesē, pievieno vēl nedaudz slāpekļskābes (3.4.) un atjauno viršanas temperatūru. Procedūru atkārto, kamēr iegūst bezkrāsainu šķīdumu. Atdzesē, pievieno mazliet ūdens, šķīdumu pārnes uz 500 ml mērkolbu, izskalojot Kjeldāla kolbu ar karstu ūdeni. Atdzesē, uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē; 5.1.2. Paraugi, kas satur organiskās vielas un kuros nav kalcija un magnija dihidrogēnfosfātu. Pārpelnošanas tīģelī iesver aptuveni 2,5g parauga ar precizitāti līdz 1mg. Analizējamo paraugu sajauc ar 1g kalcija karbonāta (3.1.). Karsē krāsnī pie 550°C ± 5°C, kamēr iegūst baltus vai pelēkus pelnus (nelielam oglekļa daudzumam nav nozīmes). Pelnus pārnes uz 250 ml vārglāzi. Pievieno 20 ml ūdens un sālsskābi (3.2.), kamēr beidzas putošana. Pievieno vēl 10 ml sālsskābes (3.2.). Vārglāzi tvaicē smilšu vanniņā, kamēr sausa, lai padarītu silīcija dioksīdu nešķīstošu. Atlikumu atkārtoti šķīdina 10 ml slāpekļskābes (3.3.) un 5 minūtes vāra smilšu vanniņā, netvaicējot sausu. Šķidrumu pārnes uz 500 ml mērkolbu, izskalojot vārglāzi vairākas reizes ar karstu ūdeni. Atdzesē, uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. 5.2. Optiskā blīvuma mērīšana Saskaņā ar 5.1.1. vai 5.1.2. apakšpunkta aprakstu iegūto filtrātu atšķaida, lai dabūtu fosfora koncentrāciju, kas nepārsniedz 40 μg/ml. 10 ml iegūtā šķīduma ielej mēģenē vai kolbā (4.6.) un pievieno 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.). Samaisa un atstāj 20°C temperatūrā vismaz 10 minūtes. Spektrofotometrā pie 430nm izmēra optisko blīvumu pret šķīdumu, ko iegūst, pievienojot 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.) un 10 ml ūdens. 5.3. Kalibrācijas līkne 5.3.1. No standarta šķīduma (3.7.) sagatavo šķīdumus, kas satur attiecīgi 5, 10, 20, 30 un 40μg fosfora/1 ml. Ņem 10 ml katra šķīduma un pievieno 10 ml molibdovanadāta reaģenta (3.6.). Samaisa un atstāj 20°C temperatūrā vismaz 10 minūtes. Optisko blīvumu izmēra tā, kā aprakstīts 5.2. apakš­punktā. 5.3.2. Veido kalibrācijas līkni, atzīmējot optisko blīvumu un tam atbilstošo fosfora daudzumu. Ja fosfora koncentrācija ir robežās no 0 līdz 40μg/ml, līkne būs lineāra. 6. Rezultātu aprēķināšana Nosaka fosfora daudzumu analizējamajā paraugā, izmantojot kalibrācijas līkni. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt: 7.1. 3 % no relatīvā lieluma, ja fosfora saturs ir mazāks par 5% 7.2. 0,15 % no absolūtā lieluma, ja fosfora saturs ir 5% vai lielāks. Zemkopības ministrs M.Roze 16.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Koptauku un eļļu noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra 1.1. Ar šo metodi nosaka koptauku un eļļu saturu barībā. Eiropas Padomes Regulā Nr. 136/66/EEK definēto eļļas sēklu un eļļas augļu analīzes neveic ar šo metodi. 1.2. Atkarībā no barība rakstura un sastāva var izmantot vienu no metodēm: 1.2.1. A metode (ekstrahēšana ar dietilēteri): piemēro visiem augu valsts barības veidiem, izņemot tos, kas minēti 1.2.2.apakš­punktā; 1.2.2. B metode: piemēro dzīvnieku valsts izcelsmes barībai un visiem kombinētās barības līdzekļiem. Tā ir jāizmanto barības līdzekļiem, no kuriem eļļas un taukus nevar pilnībā ekstrahēt bez iepriek­šējas hidrolīzes (glutēniem, raugam, kartupeļu proteīnam un produktiem, kas ir pakļauti tādiem procesiem kā ekstrūzija, placināšana, žāvēšana un sildīšana). 1.3. Rezultātu skaidrošana - visos gadījumos, kad, izmantojot B metodi, tiek iegūts lielāks rezultāts nekā izmantojot A metodi, B metodes rādītājs ir uzskatāms par pareizu. 2. Princips 2.1. A metode: Paraugu ekstrahē ar dietlēteri, frakcija 40 - 60. Pēc šķīdinātāja atdestilēšanas atlikumu izžāvē un nosver. 2.2. B metode: Karsējot, paraugu apstrādā ar sālsskābi. Šķīdumu atdzesē un filtrē. Atlikumu mazgā un žāvē, veic mērījumus saskaņā ar A metodi. 3. Reaģenti 3.1. Dietilēteris - 40 - 60°C. Broma vērtībai ir jābūt mazākai par 1 un pārpalikumam pēc iztvaicēšanas mazākam par 2 mg/100 ml; 3.2. Bezūdens nātrija sulfāts; 3.3. Sālsskābe - c=3 mol HCl/l; 3.4. Filtrēšanas materiāls (piemēram, kizelgurs vai Hyflo-supercel). 4. Iekārtas 4.1. Ekstraktori - ja tie ir aprīkoti ar sifonu (Soksleta iekārta), šķīdinātāja caurplūdei stundas laikā jāveic 10 cikli, vai ja nav aprīkoti ar sifonu, tad šķīdinātāja caurplūdei ir jābūt 10 ml/min.; 4.2. Ekstrakcijas trauki - dietilēterī nešķīstoši materiāli ar porainību, kas atbilst 4.1. punktā minētajām prasībām; 4.3. Vakuuma žāvēšanas krāsns, kas noregulēta uz 75°C ± 3°C vai krāsns žāvēšanai ar gaisu, kas noregulēta uz 100°C ± 3°C. 5. Darba gaita 5.1. A metode: skatīt 8.1.apakšpunktu 5.1.1. Nosver 5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg, ievieto ekstrakcijas traukā (4.2.) un pārklāj ar attaukotu vates gabalu. 5.1.2. Trauku ievieto ekstraktorā (4.1.) un sešas stundas ekstrahē ar ēteri (3.1.). Ētera ekstraktu savāc sausā nosvērtā kolbā, kurā ir pumeka gabaliņi
(1). 5.1.
  1. Šķīdumu atdestilē un tvaicēšanas atlikumu pusotru stundu žāvē krāsnī (4.3.). To atdzesē eksikatorā un nosver. Žāvē vēl 30 minūtes, lai pārliecinātos, ka eļļas un tauku svars nemainās (svara zudumi divās secīgās svēršanās nedrīkst pārsniegt 1 mg). 5.
  2. B metode 5.2.1.Nosver 2,5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg (skatīt 8.
  3. apakšpunktu) un pārnes uz 400 ml vārglāzi vai 300 ml Erlenmeijera kolbu. Pievieno 100 ml sālsskābes (3.3.) un pumeka gabaliņus. Vārglāzi nosedz ar pulksteņstiklu vai Erlenmeijera kolbu aprīko ar atteces dzesinātāju. Maisījumu uz mazas liesmas vai karstas virsmas lēnām uzvāra un tur vienu stundu. Neļauj produktam pielipt pie trauka sienām. 5.2.
  4. Atdzesē un pievieno pietiekamu daudzumu filtrējošā materiāla (3.4.), lai novērstu eļļas un tauku zudumu filtrēšanas laikā. Filtrē caur mitru beztauku dubulto filtrpapīru. Atlikumu mazgā ar aukstu ūdeni līdz ir sasniegts neitrāls filtrāts. Pārbauda, vai filtrātā nav eļļa vai tauki. To esamība norāda, ka paraugs pirms hidrolīzes ir jāekstrahē ar ēteri, izmantojot A metodi. 5.2.
  5. Dubulto filtrpapīru ar atlikumu novieto uz pulksteņstikla un pusotru stundu žāvē žāvējamā krāsnī 100°C ± 3°C temperatūrā. 5.2.
  6. Ievieto dubulto filtrpapīru un sauso atlikumu ekstraktora traukā (4.2.) un pārklāj ar attaukotu vates gabalu. Novieto to ekstraktorā (4.1.) un rīkojas tā, kā norādīts 5.
  8. un 5.1.3.apakšpunktā. 5.2.
  9. Ja ar eļļām un taukiem ir jāveic vēl kādas analīzes, tad pumeka gabaliņus aizstāj ar stikla gabaliņiem.
  10. Rezultātu aprēķināšana Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.
  11. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt: 7.
  12. 0,2 % absolūtās vērtības, ja kopējo eļļu un tauku saturs zemāks par 5 - 4,0 % , 7.
  13. 0,4% absolūtās vērtības, ja kopējo eļļu un tauku saturs ir lielāks par 10%.
  14. Piezīmes Produkus ar augstu eļļas un tauku saturu vai kurus ir grūti sasmalcināt, vai arī no kuriem nevar sagatavot viendabīgu analizējamo paraugu, sagatavo šādi: 8.
  15. nosver 20 g parauga ar precizitāti līdz 1mg un to sajauc ar 10 g vai vairāk bezūdens nātrija sulfāta (3.2.). Ekstrahē ar ēteri (3.1.) tā, kā aprakstīts 5.
  16. apakšpunktā. Iegūto ekstraktu ar ēteri papildina līdz 500 ml un samaisa. 50 ml šķīduma pārnes uz nelielu, sausu, nosvērtu kolbu, kurā ir pumeka gabaliņi
(1). Šķīdinātāju atdala destilējot. Atlikumu žāvē un rīkojas tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunkta pēdējā rindkopā. 8.2. atdala šķīdinātāju no ekstrakcijas traukā palikušā atlikuma un atlikumu sasmalcina līdz 1 mm lielām daļiņām. To ievieto atpakaļ ekstrakcijas traukā (nātrija sulfātu nepievieno) un rīkojas tā, kā aprakstīts 5.1. apakšpunkta otrajā un trešajā rindkopā. 8.3. Rezultātus aprēķina kā procentus no parauga, izmantojot šādu formulu: (10 a +
  1. b)x 5, kur a = atlikuma masa gramos pēc pirmās ekstrakcijas (ekstrakta daļa, kas ņemta analīzei) b = atlikuma masa gramos pēc otrās ekstrakcijas 8.4. Produktiem ar zemu eļļu un tauku saturu analizējamo paraugu var palielināt līdz 5 g. 8.5. Mājdzīvnieku barība, kurā ir augsts ūdens saturs, pirms hidrolīzes un ekstrakcijas ir jāsajauc ar bezūdens nātrija sulfātu saskaņā ar B metodi. 8.6. 5.2. apakšpunktā filtrēšanas atlikuma mazgāšanai auksta ūdens vietā daudz efektīvāk ir izmantot karstu ūdeni. 8.7. Atsevišķām barībām pusotru stundu ilgo parauga žāvēšanas laiku var pagarināt. Tomēr ir jāizvairās no pārāk ilgas žāvēšanas, jo tās rezultātā var iegūt zemus analīžu rezultātus. Var izmantot mikroviļņu krāsni. 8.8. Ja kopējais eļļas un tauku saturs paraugā ir lielāks par 15%, ir ieteicams A metodē pirms hidrolīzes veikt sākotnējo ekstrahēšanu un B metodē veikt atkārtoto ekstrahēšanu. Tas ir atkarīgs no barības līdzekļa sastāva un no eļļas un tauku rakstura barībā. 1 Ja ar eļļām un taukiem ir jāveic vēl kādas analīzes, aizstājiet pumeka gabaliņus ar stikla gabaliņiem. Zemkopības ministrs M.Roze 17.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Kopproteīna noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka kopproteīna saturu barībā, pamatojoties uz slāpekļa saturu, kuru savukārt nosaka ar Kjeldāla metodi. 2. Princips Paraugu mineralizē ar sērskābi katalizatora klātbūtnē. Skābo šķīdumu pasārmina ar nātrija hidroksīda šķīdumu. Destilējot atdala amonjaku un savāc izmērītā sērskābes daudzumā, kuras pārākumu attitrē ar nātrija hidroksīda standartšķīdumu. 3. Reaģenti 3.1. Kālija sulfāts 3.2. Katalizators: vara (II) oksīds CuO vai vara (II) sulfāta pentahidrāts CuSO4·5H2O 3.3. Cinka granulas 3.4. Sērskābe - d = 1,84 g/ml 3.5. Sērskābe - c (H2SO4) = 0,5 mol/l 3.6. Sērskābe - c (H2SO4) = 0,1 mol/l 3.7. Metilsarkanais indicators - 300 mg metilsarkanā izšķīdina 100 ml 95 līdz 96% (V/V) etilspirtā 3.8. Nātrija hidroksīda 40% (m/V) šķīdums (var lietot tehniskas kvalitātes) 3.9. Nātrija hidroksīda šķīdums - c (NaOH) = 0,25 mol/l 3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums - c (NaOH) = 0,1 mol/l 3.11. Granulēts pumeks - mazgāts sālsskābē un izdedzināts 3.12. Acetanilīds (k.t. = 1140C, N = 10,36 %) 3.13. Saharoze, kas nesatur slāpekli 4. Aparatūra Aparāts mineralizācijai, destilācijai un titrēšanai pēc Kjeldāla metodes. 5. Darba gaita 5.1. Mineralizācija Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz 0,001 mg un ievieto mineralizācijas aparāta kolbā. Pievieno 15 g kālija sulfāta (3.1.) un atbilstīgu katalizatora (3.2.) daudzumu (0,3 līdz 0,4 g vara (II) oksīda vai 0,9 līdz 1,2 g vara sulfāta, 25 ml sērskābes (3.4.) un dažas pumeka (3.11.) granulas, samaisa. Kolbu sākumā silda lēni, šad tad pakratot, līdz masa ir pārogļojusies un pazudušas putas. Pēc tam silda straujāk, līdz šķidrums nepārtraukti vārās. Karsēšana ir adekvāta, ja virstošā skābe kondensējas uz kolbas sienām. Jāizvairās pārāk stipri sakarsēt kolbas sānus, lai tiem nepieliptu organisko vielu daļiņas. Kad šķidrums kļūst dzidrs un gaiši zaļš, turpina vārīt vēl divas stundas, pēc tam atstāj atdzist. 5.2. Destilācija 5.2.1. uzmanīgi pievieno pietiekamu daudzumu ūdens, lai sulfāti pilnīgi izšķīstu. Atstāj atdzist. Pievieno dažas cinka granulas (3.3.). 5.2.2. destilācijas aparāta uztvērējkolbā ielej precīzi nomērītu daudzumu - 25 ml sērskābes (3.5.) vai (3.6.) atkarībā no paredzamā slāpekļa satura un pievieno dažus pilienus metilsarkanā indikatora šķīduma (3.7.). 5.2.3. pievieno mineralizācijas kolbu destilācijas aparāta dzesinātājam un iegremdē dzesinātāja galu uztvērējkolbā esošajā šķidrumā vismaz 1 cm dziļumā (skatīt piezīmi 8.3.apakšpunktā). Bez amonjaka zudumiem mineralizācijas kolbā lēni ielej 100 ml 40 % nātrija hidroksīda šķīduma (3.8.). 5.2.4. kolbu silda, līdz viss amonjaks ir pārdestilēts. 5.3. Attitrēšana Uztvērējkolbā sērskābes pārākumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.9.) vai (3.10.) atkarībā no izmantotās sērskābes koncentrācijas - līdz ekvivalences punktam. 5.4. Tukšais mēģinājums Lai noteiktu, vai reaģenti nesatur slāpekli, izdara tukšo mēģinājumu (mineralizāciju, destilēšanu un titrēšanu) parauga vietā ņemot 1 g slāpekli nesaturošas saharozes (3.13.). 6. Rezultātu aprēķināšana Kopproteīna saturu paraugā aprēķina pēc formulas: (V1 - V0) · c · 0,014 · 100 · 6,25 -------------------------, m kur V0 - NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) tilpums, kas izlietots tukšā mēģinājuma titrēšanai ml V1 - NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) tilpums, kas izlietots analizējamā parauga titrēšanai ml c - NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) koncentrācija mol/l m - analizējamā parauga masa g 7. Metodes pārbaude 7.1. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt: 7.1.1. 0,2 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš mazāks par 20% 7.1.2. 1,0 % pēc relatīvā lieluma kopproteīna saturam, kurš nav mazāks par 20% un lielāks par 40% 7.1.3. 0,4 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš lielāks par 40 % 7.2. Precizitāte Veic analīzi (mineralizāciju, destilēšanu un titrēšanu) ar 1,5 - 2,0 g acetanilīda (3.12.) 1 g saharozes (3.13.) klātbūtnē. 1 g acetanilīda patērē 14,80 ml sērskābes (3.5.). Atgūstamībai jābūt vismz 99 %. 8. Piezīmes 8.1. Var izmantot manuālos, pusautomātiskos vai automātiskos aparātus. Ja izmanto aparātus, kuros ir vajadzīga pārliešana starp mineralizāciju un destilāciju, pārliešana jāizdara uzmanīgi, bez zudumiem. Ja destilācijas aparāta kolba nav aprīkota ar pilināmo piltuvi, nātrija hidroksīdu pievieno tieši pirms kolbas savienošanas ar dzesinātāju, ielejot šķidrumu lēni gar sieniņām. 8.2. Ja mineralizācijas maisījums sacietē, noteikšanai ieteicams izmantot lielāku sērskābes (3.6.) tilpumu nekā teikts iepriekš tekstā. 8.3. Produktiem ar zemu slāpekļa saturu uztvērēj kolbā ievietojamo sērskābes šķīduma (3.6.) daudzumu vajadzības gadījumā var samazināt līdz 10 ml vai 15 ml un uzpildīt līdz 25 ml ar ūdeni. Zemkopības ministrs M.Roze 18.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Ar pepsīnu un sālsskābi izšķīdinātā kopproteīna noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka kopproteīna daļu, kas noteiktos apstākļos izšķīdināta ar pepsīnu un sālsskābi. Tā ir piemērojama visu veidu barībai. 2. Princips Paraugu 48 stundas silda pie 40oC pepsīna hidrohlorīda šķīdumā. Suspensiju izfiltrē un slāpekļa saturu filtrātā nosaka saskaņā ar kopproteīna noteikšanas metodi. 3. Reaģenti 3.1. Sālsskābe - d = 1,125 3.2. Sālsskābe 0,075 N 3.3. 2,0 vien. /mg pepsīns. Pepsīna aktivitāte ir definēta pepsīna aktivitātes noteikšanas metodē un to nosaka saskaņā ar minēto metodi. 3.4. Aptuveni 0,2 % (m/V) svaigi pagatavota pepsīna šķīduma sālsskābē (3.2.). Aktivitāte: 400 vien. /l 3.5. Pretputošanas emulsija (piemēram, silikona emulsija) 3.6. Visi reaģenti, kas uzskaitīti kopproteīna noteikšanas metodes 3. punktā 4. Aparatūra 4.1. Ūdens vanna vai inkubators - noregulēts pie 40 ± 1 oC 4.2. Kjeldāla mineralizācijas un destilācijas aparāts 5. Darba gaita 5.1. Šķīduma sagatavošana (sk. 7.2. piezīmi). Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg un ievieto 500 ml mērkolbā. Pievieno 450 ml pepsīna hidrohlorīda šķīduma (3.4.), kas iepriekš uzsildīts līdz 40oC, un krata, lai novērstu aglomerātu veidošanos. Pārliecinās, ka suspensijas pH ir mazāks par 1,7. Ieliek kolbu ūdens vannā vai inkubatorā (4.1.) un atstāj uz 48 stundām. Sakrata pēc 8, 24 un 32 stundām. Pēc 48 stundām pievieno 15 ml sālsskābes (3.1.), atdzesē līdz 20oC, uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni un izfiltrē. 5.2. Mineralizācija 5.2.1. 250 ml filtrāta ielej destilācijas aparāta kolbā (4.2.). Pievieno šķelšanai vajadzīgos reaģentus, kas norādīti kopproteīna noteikšanas metodes 5.1. punkta otrajā teikumā. Homogenizē un uzkarsē līdz viršanai. Ja veidojas putas, pievieno dažus pilienus pretputošanas emulsijas (3.5.). Turpina enerģiski vārīt, līdz ūdens ir gandrīz pilnīgi iztvaicēts. Samazina sildīšanu un uzmanīgi aizvada pēdējās ūdens pēdas. 5.2.2. Kad šķidrums kļūst dzidrs un bezkrāsains (vai gaiši zaļš, ja ir lietots varu saturošs katalizators), turpina vārīt vēl vienu stundu. Atstāj atdzist. 5.3. Destilēšana un titrēšana Rīkojas tā, kā aprakstīts kopproteīna noteikšanas metodes 5.2. un 5.3. apakšpunktā. 5.4. Tukšais mēģinājums Izdara tukšo mēģinājumu, izmantojot to pašu darba gaitu, bet bez analizējamā parauga. 6. Rezultātu aprēķināšana 6.1. Atņem tukšajā mēģinājumā patērētās sērskābes daudzumu no analizējamā parauga patērētā sērskābes daudzuma. 1 ml 0,1 N sērskābes atbilst 1,4 mg slāpekļa. 6.2. Slāpekļa daudzumu reizina ar koeficientu 6,25. Rezultātu izsaka kā procentus no parauga svara. 7. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt: 7.1. 0,4 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš mazāks par 20 % 7.2. 2,0 % relatīvo lielumu kopproteīna saturam, kurš nav mazāks par 20 % un nav lielāks par 40 % 7.3. 0,8 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, kurš lielāks par 40 % 8. Piezīmes 8.1. Ar šo metodi iegūtajiem lielumiem nav tiešas saistības ar šķelšanu in vivo. 8.2. Produkti ar eļļas vai tauku saturu, kas pārsniedz 10 %, vispirms ir jāatbrīvo no taukiem, ekstrahējot ar petrolēteri (v.p. 40 līdz 60oC). Zemkopības ministrs M.Roze 19.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Pepsīna aktivitātes noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka aktivitāti pepsīnam, ko izmanto ar pepsīnu un sālsskābi izšķīdināta kopproteīna noteikšanai. 2. Princips 2.1. hemoglobīnu apstrādā ar pepsīnu sālsskābes vidē noteiktos apstākļos. Pēc tam proteīnu nehidrolizēto daļu izgulsnē trihloretiķskābē. Filtrātam pievieno nātrija hidroksīdu un Folina-Čikalteu (Folin-Ciocalteu) reaģentu. Pie 750 nm izmēra šā šķīduma optisko blīvumu un atbilstīgo tirozīna daudzumu nolasa no kalibrācijas līknes. 2.2. definīcija: pepsīna vienību definē kā šā fermenta daudzumu, kas metodes pielietošanas apstākļos minūtē atbrīvo hidroksiarilgrupu daudzumu, kuram, iekrāsotam ar Folina-Čikalteu reaģentu, ir optiskais blīvums, kas atbilst vienam mikromolam tirozīna, kurš iekrāsots tādā pašā veidā. 3. Reaģenti 3.1. Sālsskābe 0,2 N 3.2. Sālsskābe 0,06 N 3.3. Sālsskābe 0,025 N 3.4. Trihloretiķskābes 5 % (masa/tilpums) šķīdums 3.5. Nātrija hidroksīda 0,5 N šķīdums 3.6. Folina-Čikalteu reaģents - ievieto 2 litru apaļkolbā ar pieslīpēta stikla standartkaklu 100 g nātrija volframāta (Na2WO4,·2H2O), 25 g nātrija molibdāta (Na2MoO4, 2H2O) un 700 ml ūdens. Pievieno 50 ml fosforskābes (d = 1,71) un 100 ml koncentrētas sālsskābes (d = 1.19). Pievieno kolbai atteces dzesinātāju, uzkarsē līdz viršanai un šķīdumu lēni vāra 10 stundas. Atstāj atdzist, atvieno atteces dzesinātāju, pievieno 175 g litija sulfāta (Li2SO4, ·2H2O), 50 ml ūdens un 1 ml broma. Vāra 15 minūtes, lai aizvadītu pārpalikušo bromu. Atstāj atdzist, pārnes šķīdumu uz 1 l mērkolbu, uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, homogenizē un filtrē. Nedrīkst rasties zaļgans krāsojums. Atšķaida vienu tilpumu reaģenta ar diviem tilpumiem ūdens pirms lietošanas. 3.7. Hemoglobīna šķīdums Nosver hemoglobīna daudzumu (aptuveni 2 g proteīnu substrāta, kas noteikts saskaņā ar Ansona metodi) un atbilst 354 mg slāpekļa1, un ievieto 200 ml kolbā ar šlifa standartkaklu. Pievieno dažus ml sālsskābes (3.2.), savieno kolbu ar vakuumsūkni un krata, līdz hemoglobīns ir pilnīgi izšķīdis. Atvieno vakuumu un kratot pievieno sālsskābi (3.2.), lai uzpildītu līdz 100 ml. Sagatavo tieši pirms lietošanas. 3.8. Standarta tirozīna šķīdums - izšķīdina sālsskābē (3.1.) 181,2 mg tirozīna un uzpilda līdz 1 l ar to pašu skābi (izejas šķīdums). Ņem 20 ml un atšķaida ar sālsskābi (3.1.) līdz 100 ml. Šā šķīduma 1 ml satur 0,2 mikromolus tirozīna. 4. Aparatūra 4.1. Ūdens vanna - noregulēta uz 25 ± 0,1 oC ar ultratermostatu 4.2. Spektrofotometrs 4.3. Hronometrs ar precizitāti 1 sekunde 4.4. pH metrs 5. Darba gaita 5.1. Šķīduma sagatavošana (skatīt piezīmi 7.1.apakšpunktā) Izšķīdina 150 mg pepsīna 100 ml sālsskābes (3.2.). Ar pipeti pārnes 2 ml šķīduma uz 50 ml mērkolbu un uzpilda līdz atzīmei ar sālsskābi (3.3.). Ar pH metru izmērītajam šķīduma pH jābūt 1,6 ± 0,1. Kolbu iegremdē ūdens vannā (4.1.). 5.2. Hidrolīze Mēģenē ar pipeti pārnes 5,0 ml hemoglobīna šķīduma (3.7.), uzsilda ūdens vannā (4.1.) līdz 25 oC, pievieno 1,0 ml pepsīna šķīduma, kas iegūts atbilstīgi 5.1.apakšpunktam, un samaisa ar vienā galā paresninātu stikla spieķīti (apmēram ar 10 kustībām uz priekšu un atpakaļ). Atstāj mēģeni ūdens vannā pie 25oC precīzi 10 minūtes, skaitot no pepsīna šķīduma pievienošanas (ilgums un temperatūra ir stingri jāievēro). Pēc tam pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš uzsildīts līdz 25oC, homogenizē un nofiltrē caur sausu filtru. 5.3. Krāsojuma attīstīšana un optiskā blīvuma mērīšana 50 ml koniskajā kolbā ar pipeti pārnes 5,0 ml filtrāta, pievieno 10,0 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.5.) un, visu laiku kratot, pievieno 3,0 ml atšķaidīta Folina-Čikalteu reaģenta (3.6.). Pēc 5 līdz 10 minūtēm ar spektrofotometru pie 750 nm nosaka šķīduma optisko blīvumu 1 cm kivetē pret ūdeni. 5.4. Tukšais mēģinājums Katrai noteikšanai izdara tukšo mēģinājumu šādi - mēģenē ar pipeti pārnes 5,0 ml hemoglobīna šķīduma (3.7.), uzsilda ūdens vannā (4.1.) līdz 25oC, pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš sasildīts līdz 25 oC, homogenizē, pēc tam pievieno 1,0 ml pepsīna šķīduma, kas iegūts saskaņā ar 5.1.apakšpunktu. Ar stikla spieķīti samaisa un atstāj mēģeni ūdens vannā (4.1.) 250C temperatūrā precīzi 10 minūtes. Homogenizē un filtrē caur sausu filtru. Rīkojas, kā norādīts 5.3.apakšpunktā. 5.5. Kalibrēšanas līkne Ievieto 50 ml koniskajās kolbās 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 un 5,0 ml alikvotās daļas tirozīna šķīduma (3.8.), kas attiecīgi atbilst 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mikromolam tirozīna. Sēriju beidz ar salīdzināšanas šķīdumu, kurā nav tirozīna. Tilpumus uzpilda līdz 5,0 ml ar sālsskābi (3.1.). Pievieno 10,0 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.5.) un, visu laiku kratot, pievieno 3,0 ml atšķaidīta Folina-Čikalteu reaģenta (3.6.). Izmēra optisko blīvumu, kā norādīts 5.3.apakšpunkta pēdējā teikumā. Uzzīmē kalibrācijas līkni, atzīmējot optiskos blīvumus pret tirozīna daudzumiem. 6. Rezultātu aprēķināšana 6.1. no kalibrēšanas līknes nolasa tirozīna daudzumu mikromolos, kas atbilst krāsainā šķīduma optiskajam blīvumam, koriģētam pret tukšo mēģinājumu. 6.2. pepsīna aktivitāti tirozīna mikromolos uz mg minūtē pie 25oC aprēķina, izmantojot šādu formulu: vienības uz mg (vien./
  2. mg)= , 0,32a ___________ p kur a - tirozīna daudzums mikromolos, nolasīts no kalibrēšanas līknes p - pepsīna daudzums miligramos, kas pievienots saskaņā ar 5.2. punktu 7. Piezīmes 7.1. Izšķīdināmā pepsīna daudzumam jābūt tādam, lai galīgajos fotometrijas mērījumos iegūtu optisko blīvumu 0,35 ± 0,035 7.2. Ar šo metodi iegūtas divas vienības uz mg atbilst 3,64 Ansona milivienībām uz mg (mikromoli tirozīna/mg. min. pie 35,5oC) vai 36 400 komercvienības/g (mikromoli tirozīna/g 10 minūtēs pie 35,5oC) 1 Nosaka slāpekļa saturu ar pusmikro Kjeldāla metodi (teorētiskais slāpekļa saturs - 17,7 %). Zemkopības ministrs M.Roze 20.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Brīvā un kopējā gosipola noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka brīvo gosipolu, kopējo gosipolu un ķīmiski radniecīgu vielu līmeņus kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos, kā arī kombinētajā barībā, kas satur šīs vielas, ja to ir vairāk par 20ppm. 2. Princips Gosipolu ekstrahē 3-amino-1-propanola klātbūtnē ar 2-propanola un heksāna maisījumu brīvā gosipola noteikšanai vai ar dimetilformamīdu kopējā gosipola noteikšanai. Gosipolu ar anilīnu pārvērš gosipoldianilīnā, kura optisko blīvumu mēra pie 440 nm. 3. Reaģenti 3.1. 2-propanola-heksāna maisījums. Samaisa 60 tilpuma daļas analītiski kvalitatīva 2-propanola ar 40 tilpuma daļām heksāna 3.2. Šķīdinātājs A: 1 litra mērkolbā ielej aptuveni 500 ml 2-propanola-heksāna maisījuma (3.1.), 2 ml 3-amino-1-propanola, 8 ml ledus etiķskābes un 50 ml ūdens. Uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šis reaģents ir stabils vienu nedēļu 3.3. Šķīdinātājs B: ar pipeti pārnes 2 ml 3-amino-1-propanola un 10 ml ledus etiķskābes 100 ml mērkolbā. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un uzpilda līdz zīmei ar N,N-dimetilformamīdu. Šis reaģents ir stabils vienu nedēļu 3.4. Anilīns, analīzes kvalitātes. Ja tukšajā mēģinājumā optiskais blīvums ir lielāks par 0,022, anilīnu pārdestilē virs cinka putekļiem, izmetot destilāta pirmos un pēdējos 10 % frakciju. Turot ledusskapī brūnā, noslēgtā traukā, šis reaģents ir glabājams vairākus mēnešus 3.5. Gosipola standartšķīdums A: Ievieto 250 ml mērkolbā 27,9mg gosipola acetāta. Izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju A (3.2.). Ar pipeti pārnes 50 ml šā šķīduma 250 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju A. Šā gosipola šķīduma koncentrācija ir 0,02mg mililitrā. Pirms lietošanas atstāj uz vienu stundu istabas temperatūrā 3.6. Gosipola standartšķīdums B: Ievieto 50 mērkolbā 27,9mg gosipola acetāta. Izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju B (3.3.). Šā gosipola šķīduma koncentrācija ir 0,5mg mililitrā Gosipola standartšķīdumi A un B ir stabili 24 stundas, ja tos aizsargā no gaismas. 4. Aparatūra 4.1. Maisītājs: Aptuveni 35apgr./min. 4.2. Spektrofotometrs 5. Darba gaita 5.1. Analizējamais paraugs Analizējamā parauga lielums ir atkarīgs no gaidāmā gosipola satura paraugā. Ir ieteicams strādāt ar mazu analizējamo paraugu un relatīvi lielu filtrāta alikvoto daļu, lai ar iegūto gosipola daudzumu būtu iespējami precīzi fotometrijas mērījumi. Brīva gosipola noteikšanai kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos analizējamam paraugam nebūtu jāpārsniedz 1g. Kombinētās barības paraugs var būt līdz 5g. Vairumā gadījumu piemērota ir 10 ml filtrāta alikvotā daļa. Tai būtu jāsatur 50 līdz 100µg gosipola. Kopējā gosipola noteikšanai analizējamam paraugam jābūt starp 0,5g un 5g tā, lai 2 ml filtrāta alikvotā daļa saturētu 40µg līdz 200µg gosipola. Analīze jāizdara istabas temperatūrā - aptuveni 20°C. 5.2. Brīvā gosipola noteikšana. 5.2.1. analizējamo paraugu ievieto 250 ml kolbā ar pieslīpētu kaklu, kuras dibens ir klāts ar stikla lauskām. Ar pipeti pievieno 50 ml šķīdinātāja A (3.2.), aiztaisa kolbu un maisa maisītājā vienu stundu. Nofiltrē caur sausu filtru un savāc filtrātu mazā kolbā ar pieslīpētu kaklu. Filtrēšanas laikā piltuvi apklāj ar pulksteņstiklu. Ar pipeti pārnes identiskas filtrāta alikvotās daļas, kas satur 50µg līdz 100µg gosipola, katrā no divām 25 ml mērkolbām (A un B). Vajadzības gadījumā tilpumu uzpilda līdz 10 ml ar šķīdinātāju A (3.2.). Pēc tam A kolbas saturu uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šo šķīdumu izmanto kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra parauga šķīdumu. 5.2.2. ar pipeti pārnes 10 ml šķīdinātāja A (3.2.) katrā no divām citām 25 ml mērkolbām (C un D). C kolbas saturu uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šo šķīdumu izmanto kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra tukšā mēģinājuma šķīdumu. 5.2.3. pievieno 2 ml anilīna (3.4.) katrā no kolbām (D) un (B). Silda 30 minūtes vāroša ūdens vannā, lai attīstītu krāsu. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj nostāvēties vienu stundu. 5.2.4. ar spektrofotometru pie 440 nm nosaka optisko blīvumu tukšā mēģinājuma šķīdumam (D) pret salīdzināšanas šķīdumu (C) un optisko blīvumu parauga šķīdumam (B) pret salīdzināšanas šķīdumu (A), izmantojot 1 cm stikla kivetes. 5.2.5. atņem tukšā mēģinājuma šķīduma optisko blīvumu no parauga šķīduma optiskā blīvuma (= koriģētais optiskais blīvums). No šā lieluma aprēķina brīvā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā. 5.3. Kopējā gosipola noteikšana. 5.3.1. analizējamo paraugu, kas satur 1mg līdz 5mg gosipola, ievieto 50 ml mērkolbā un pievieno 10 ml šķīdinātāja B (3.3.). Vienlaikus sagatavo tukšo mēģinājumu, ievietojot 10 ml šķīdinātāja B (3.3.) citā 50 ml mērkolbā. Abas kolbas silda 30 minūtes vāroša ūdens vannā. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un abu kolbu saturu uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Homogenizē un atstāj nostādināšanai 10 - 15 minūtes, pēc tam filtrē un savāc filtrātus kolbās ar pieslīpētiem kakliem. 5.3.2. ar pipeti pārnes katrā no divām 25 ml mērkolbām 2 ml parauga filtrāta un katrā no divām citām 25 ml mērkolbām - 2 ml tukšā mēģinājuma filtrāta. Pēc tam katras sērijas vienas kolbas saturu uzpilda līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šos šķīdumus izmanto kā salīdzināšanas šķīdumus. 5.3.3. pievieno 2 ml anilīna (3.4.) katrā no divām pārējām kolbām. Silda 30 minūtes vāroša ūdens vannā, lai attīstītu krāsu. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj nostāvēties vienu stundu. 5.3.4. nosaka optisko blīvumu, kā norādīts 5.2. punktā, attiecībā uz brīvo gosipolu. No šā lieluma aprēķina kopējā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā. 6. Rezultātu aprēķināšana Rezultātus var aprēķināt vai nu no īpatnējā optiskā blīvuma (6.1.), vai no kalibrācijas līknes (6.2.). 6.1. No īpatnējā optiskā blīvuma Aprakstītajos apstākļos īpatnējie optiskie blīvumi ir šādi: brīvam gosipolam: E1%1cm = 625 kopējam gosipolam: E1%1cm = 600 Brīvā vai kopējā gosipola saturu parau­gā aprēķina pēc formulas: E · 1250 gosipola % = ---------, E1%1cm · p · a kur E - koriģētais optiskais blīvums noteikts saskaņā ar 5.2. punktu p - parauga iesvars g a - filtrāta alikvotā daļa ml 6.2. Aprēķināšana no kalibrēšanas līknes: 6.2.1. Brīvs gosipols; 6.2.1.2. sagatavo divas sērijas 25 ml mērkolbu pa piecām mērkolbām katrā. Katras sērijas mērkolbās ar pipeti ievada attiecīgi 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 un 10,0 ml gosipola standartšķīduma A (3.5.). Ar šķīdinātāju A (3.2.) uzpilda šķīdumus līdz 10 ml. Katru sēriju pabeidz ar tukšo paraugu, kas 25 ml mērkolbā satur tikai 10 ml šķīdinātāja A (3.2.). 6.2.1.2. pirmās sērijas kolbas, ieskaitot tukšo mēģinājumu, uzpilda ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.) līdz zīmei (salīdzināšanas rinda). 6.2.1.3. otrās sērijas kolbās, ieskaitot tukšo mēģinājumu, katrā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Pēc tam krāsas attīstīšanai 30 minūtes silda vāroša ūdens vannā, atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), sakrata un atstāj nostāvēties 1 stundu (standarta rinda). 6.2.1.4. izmēra standartrindas šķīdumu optisko blīvumu atbilstīgi 5.2. punkta nosacījumiem, salīdzinot ar atbilstīgiem salīdzināšanas rindas šķīdumiem. Uzzīmē kalibrācijas līkni, kurā atliek optiskā blīvuma lielumus pret gosipola daudzumiem µg. 6.2.2. Kopējais gosipols. 6.2.2.1. sagatavo sešas 50 ml mērkolbas. Pirmajā kolbā ar pipeti pārnes 10 ml šķīdinātāja B (3.3.) un pārējās 2,0, 4,0 6,0 8,0 un 10,0 ml gosipola standartšķīduma B (3.6.). Katras kolbas saturu ar šķīdinātāju B papildina līdz 10 ml, 30 minūtes silda vāroša ūdens vannā, atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.) un sakrata. 6.2.2.2. šos šķīdumus ar pipeti pārnes pa 2 ml divās rindās pa sešām 25 ml mērkolbām. 6.2.2.3. pirmās rindas kolbas uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.) (salīdzināšanas rinda). 6.2.2.4. otrās rindas kolbās katrā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Pēc tam 30 minūtes karsē vāroša ūdens vannā, atdzesē līdz istabas temperatūrai, ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.) uzpilda līdz zīmei, sakrata un atstāj nostāvēties 1 stundu (standartrinda). 6.2.2.5. izmēra standartrindas šķīdumu optisko blīvumu atbilstīgi 5.2. punkta nosacījumiem, salīdzinot ar atbilstīgiem salīdzināšanas rindas šķīdumiem. Uzzīmē kalibrācijas līkni, kurā atliek optiskā blīvuma lielumus pret gosipola daudzumiem µg. 6.3. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt: 6.3.1. ja gosipola saturs ir mazāks par 500 ppm - 15 relatīvos procentus, 6.3.2. ja gosipola saturs ir 500 līdz 750 ppm - absolūto lielumu - 75 ppm, 6.3.3. ja gosipola saturs ir 750 ppm un vairāk - 10 relatīvos procentus. Zemkopības ministrs M.Roze 21.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Tetraciklīna grupas antibiotiku noteikšana 1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka un identificē tetraciklīna grupas antibiotikas barībā, kas satur vismaz 1 ppm antibiotiku koncentrātos un premiksos. 2. Princips Paraugu ekstrahē ar metilspirta un sālsskābes maisījumu. Ekstraktu un salīdzināšanas šķīdumus salīdzināšanai pakļauj augšup ejošai papīra hromatogrāfijai. Antibiotikas konstatē un identificē, salīdzinot to Rf lielumus ar standartvielu Rf lielumiem pēc fluorescences UV gaismā (ja ir liels antibiotiku saturs) vai pēc bioautogrāfijas uz agara barotnes, kurai uzsēts B. cereus. 3. Reaģenti un barotne 3.1. Buferšķīdums pH 3,5: 10,256 g citronskābes monohidrāts - analītiski kvalitatīvs; 7,45 g nātrija hidrogēnfosfāts Na2HPO4·2H2O - analītiski kvalitatīvs; 300 ml acetones - analītiski kvalitatīvs; destilēts ūdens līdz 1000 ml. 3.2. Fosfāta buferšķīdums pH 5,5: 130,86 g kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4 - analītiski kvalitatīvs; 6,947 g nātrija hidrogēnfosfāts Na2HPO4·2H2O - analītiski kvalitatīvs; destilēts ūdens līdz 1000 ml. 3.3. Eluents I: tīra nitrometāna, tīra hloroforma un 1,3-dihlor-2-propanola maisījums -20:10:1,5 tilpuma daļas - jāsagatavo tieši pirms lietošanas 3.4. Eluents II: tīra nitrometāna, tīra hloroforma un 2-pikolīna maisījums - 20:10:3 tilpuma daļas - jāsagatavo tieši pirms lietošanas; 3.5.Tīra metilspirta un sālsskābes (d = 1.19) maisījums - 98:2 tilpuma daļas; 3.6. 0,1 N sālsskābe ; 3.7. Amonija hidroksīds - d = 0,91; 3.8. Standartvielas: hlortetraciklīns, oksitetraciklīns, tetraciklīns, kuru aktivitāte ir izteikta, rēķinot uz hidrohlorīdiem; 3.9. Mikroorganisms: B. cereus ATCC nr. 11.778; Kultūras uzturēšana, sporu suspensijas pagatavošana un barotnes uzsēšana: rīkojas, kā aprakstīts hlortetraciklīna, oksitetraciklīna un tetraciklīna satura noteikšanas metodes (ar difūziju agarā) 3.1. un 3.2. apakšpunktā. Metodes apraksts ir šajā pielikumā. 3.10.Barotne 1: 1 g glikozes; 10 g triptiskā peptona; 1,5 g gaļas ekstrakta; 3 g rauga ekstrakta; 20g agara; destilēts ūdens līdz 1000 ml Tieši pirms lietošanas noregulē pH līdz 5,8; 3.11. 0,1 % (masa/tilp.) 2,3,5-trifeniltetrazolija hlorīda šķīdums un 5 % (masa/tilp.) glikozes šķīdums. 4. Aparatūra 4.1. Augšupejošās papīra hromatogrāfijas aparāts (papīra augstums 25
  3. cm)- Schleicher&Schuell papīrs ( 2040B vai 2043B ) vai līdzvērtīgs; 4.2. Centrifūga; 4.3. Inkubators - ieregulēts uz 30 oC; 4.4. UV lampa fluorescences konstatēšanai; 4.5. Stikla plāksnes - aptuveni 20 x 30 cm bioautogrāfijai. 5. Standartšķīdumi 5.1. Izejas šķīdumi Izmantojot sālsskābi (3.6.), no standartvielām (3.8.) pagatavo šķīdumus ar koncentrācijām, kas atbilst 500 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda, oksitetraciklīna hidrohlorīda un tetraciklīna hidrohlorīda 5.2. Salīdzināšanas šķīdums konstatēšanai UV gaismā Atšķaida šķīdumus (5.1.) ar fosfāta buferšķīdumu (3.2.), lai iegūtu šķīdumus ar koncentrācijām, kas atbilst 100 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda, oksitetraciklīna hidrohlorīda un tetraciklīna hidrohlorīda 5.3. Salīdzināšanas šķīdums konstatēšanai ar bioautogrāfiju Atšķaida šķīdumus (5.1.) ar fosfāta buferšķīdumu (3.2.), lai iegūtu šķīdumus ar koncentrācijām, kas atbilst 5 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda, oksitetraciklīna hidrohlorīda un tetraciklīna hidrohlorīda 6. Ekstrahēšana 6.1. ja paredzamais antibiotiku saturs ir mazāks par 10 ppm, tad var izmantot homogenizētu paraugu vai, sijājot atdalīto smalkāko frakciju, jo antibiotikas atrodas galvenokārt šajā frakcijā. 6.2. paraugu suspendē maisījumā (3.5.) un centrifugē. Centrifugātu savāc un izmanto tieši vai vajadzības gadījumā atšķaida ar maisījumu (3.5.), lai iegūtu antibiotiku koncentrācijas aptuveni 100 µg/ml (6.1.) un 5 µg/ml (6.2.). 7. Noteikšana un identificēšana 7.1. Hromatogrāfija 7.1.1. iegremdē papīru buferšķīdumā ar pH 3,5 (3.1.). Aizvada lieko šķidrumu, nospiežot papīru starp sausa filtrpapīra loksnēm. Pēc tam uz papīra uzpilina 0,01 ml salīdzināšanas šķīdumu (5.2. un 5.3.) un ekstraktu (6.1. un 6.2.). Lai panāktu labu sadalīšanu, jābūt pareizam papīra mitrumam, vajadzības gadījumā to atstāj nedaudz pažāvēties. 7.1.2. hromatografē ar augšupejošās hromatogrāfijas metodi. Noteikšanai ar bioautogrāfiju izmanto eluentu I (3.3.) un konstatēšanai UV gaismā izmanto eluentu II (3.4.). Kad šķīdinātāja fronte ir pacēlusies par 15 līdz 20 cm (aptuveni 1 stunda 30 minūtes), hromatografēšanu pārtrauc un papīru izžāvē. 7.2. Konstatēšana UV gaismā Ja antibiotiku līmenis ir lielāks par 1 µg/cm2, tad pēc hromatogrammas apstrādes ar amonjaka tvaikiem (3.7.) UV spuldzes (4.4.) starojumā ir redzami zeltdzelteni fluorescējoši plankumi. 7.3. Noteikšana ar bioautogrāfiju 7.3.1. izlej barotni (3.10.), kurā iepriekš iesēts B. cereus (3.9.), stikla platēs (4.5.) un uzliek papīru uz barotnes. Pēc 5 minūšu saskares papīru noņem un uzliek to citam plankumam barotnē, kur papīrs paliek inkubācijas perioda laikā. Inkubē vienu nakti 30oC temperatūrā. Ja ir klāt tetraciklīna grupas antibiotika, duļķainajā barotnē parādās gaišas inhibīcijas zonas. 7.3.2. pēc inkubācijas iztvaicē šķīdumu (3.11.), lai hromatogrammu fiksētu uz papīra. 7.4. Identifikācija 7.4.1. tetraciklīnu grupas antibiotiku relatīvie Rf lielumi ir doti turpmāk. Šie lielumi var nedaudz mainīties atkarībā no papīra kvalitātes un tā mitruma satura: 7.4.1.1. Hlortetraciklīns (CTC) 0,60 7.4.1.2. Tetraciklīns (TC) 0,40 7.4.1.3. Oksitetraciklīns (OTC) 0,20 7.4.1.4. 4-Epi-CTC 0.15 7.4.1.5. 4-Epi-TC 0,13 7.4.1.6. 4-Epi-OTC 0,10 7.4.2. Epi-savienojumu antibiotiskā aktivitāte ir mazāka par parasto savienojumu antibiotisko aktivitāti. Zemkopības ministrs M.Roze 22.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Hlortetraciklīna, oksitetraciklīna un tetraciklīna noteikšana 1. Ar difūzijas metodi agara barotnē 1.1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka hlortetraciklīna (CTC), oksitetracilīna (OTC) un tetraciklīna (TC) līmeni barībā, koncentrātos un premiksos, ja koncentrācijas ir lielākas par 5 ppm. Saturu, kas mazāks par 5 ppm, var noteikt ar grafisko interpolāciju. 1.2. Princips 1.2.1. ja saturs ir 50 ppm vai mazāks, paraugu ekstrahē ar atšķaidītu formamīdu. Ja saturs ir lielāks par 50 ppm, to CTC noteikšanai ekstrahē ar acetona, ūdens un sālsskābes maisījumu. OTC un TC noteikšanai ekstrahē ar metilspirta un sālsskābes maisījumu. 1.2.2. pēc tam ekstraktus atšķaida un to antibiotisko aktivitāti nosaka, izmērot CTC, OTC vai TC difūziju agara barotnē, kurā iesēts B. cereus. Par difūziju liecina inhibīcijas zonu veidošanās mikroorganisma klātbūtnē. Šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam. 1.3. Mikroorganisms: B. cereus, ATCC nr. 11.778. 1.3.1. Kultūras uzturēšana Mēģeni ar slīpagaru, kurā iesēts B. cereus, kas ņemts no barotnes (1.4.1.) bez metilēnzilā un borskābes, inkubē vienu nakti aptuveni 30oC temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī un slīpagaru pārsēj reizi 14 dienās. 1.3.2. Sporu suspensijas pagatavošana 1.3.2.1. ar 2 - 3 ml fizioloģiskā šķīduma (1.4.5.) noskalo kultūras augumu no slīpagara (1.3.1.) virsmas. Šo suspensiju iesēj Rū (Roux) kolbā, kas satur 300 ml barotnes (1.4.1.) (bez metilēnzilā un borskābes) ar agara koncentrāciju 2 - 4 %. Inkubē 3 - 5 dienas 28 - 30oC temperatūrā, sporu veidošanos novēro mikroskopā, pēc tam savāc sporas 15 mililitros etilspirta (1.4.6.) un homogenizē. Suspensija ir glabājama ledusskapī 5 mēnešus un ilgāk. 1.3.2.2. priekšmēģinājumos uz platēm ar noteikšanas pamatbarotni (1.4.1.) nosaka uzsējamā materiāla daudzumu, kas dažādām izmantojamo antibiotiku koncentrācijām veido iespējami lielākās inhibēšanas zonas, kas vēl ir skaidri izteiktas. Šis daudzums parasti ir starp 0,2 un 0,3 ml uz 1000 ml. Inokulēšanu barotnē veic temperatūrā starp 50 un 60oC. 1.4. Barotne un reaģenti 1.4.1. Pamatbarotne noteikšanai 1: 1 g glikoze; 10 g triptiskais peptons; 1,5 g gaļas ekstrakts; 3 g rauga ekstrakts; 10 - 20 g agars, atkarībā no kvalitātes; 1 ml "Tween 80"; 10 ml fosfāta buferšķīdums pH 5,5 (4.2.); 15 ml 5 % (m/V) borskābes šķīdums; 4 ml 0,5 % metilēnzilā šķīdums etilspirtā; destilēts ūdens līdz 1000 ml. Pirms lietošanas noregulē pH 5,8; 1.4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 5,5: 130,86 g kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4 - analītiski kvalitatīvs; 6,947 g nātrija hidrogēnfosfāts Na2HPO4·2H2O - analītiski kvalitatīvs; destilēts ūdens līdz 1000 ml; 1.4.3.Fosfāta buferšķīdums pH 5,5 atšķaidīts attiecībā 1/10; 1.4.4. Fosfāta buferšķīdums, pH 8: 1,407 g kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4 - analītiski kvalitatīvs; 57,539 g dinātrija hidrogenfosfāts Na2HPO4 ·2H2O - analītiski kvalitatīvs; destilēts ūdens līdz 1000 ml; 1.4.5. Sterils fizioloģiskais šķīdums; 1.4.6. 20 % (V/V) etilspirts; 1.4.7. 0,1 N sālsskābe; 1.4.8. 70 % (V/V) formamīds: pagatavo svaigu pirms lietošanas un noregulē pH 4,5 ar aptuveni 2 N sērskābi; 1.4.9.Tīra acetona, ūdens un sālsskābes (d = 1,19) maisījums - 65:33:2 tilpuma daļas; 1.4.10. Tīra metilspirta un sālsskābes (d = 1,19) maisījums - 98:2 tilpuma daļas; 1.4.11. Standartvielas: hlortetraciklīns, oksitetraciklīns, tetraciklīns, kuru aktivitāte ir izteikta, rēķinot uz hidrohlorīdiem. 1.5. Standartšķīdumi 1.5.1. Hlortetraciklīns 1.5.1.1. izmantojot sālsskābi (1.4.7.), no standartvielas (1.4.11.) pagatavo izejas šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 500 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda. Šis šķīdums ir glabājams ledusskapī vienu nedēļu. 1.5.1.2. no šā izejas šķīduma pagatavo darba standartšķīdumu S8 ar koncentrāciju, kas atbilst 0,2 µg/ml hlortetraciklīna hidrohlorīda. Atšķaidīšanu izdara ar fosfāta buferšķīdumu pH 5,5, kas ir atšķaidīts attiecībā 1:10 (1.4.3.) un kam ir pievienots 0,01 % amīdmelnā 2. 1.5.1.3. pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot buferšķīdumu (1.4.3.), pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,1 µg/ml, S2 0,05 µg/ml un S1 0,025µg/ml. 1.5.2. Oksitetraciklīns Rīkojoties, kā norādīts 1.5.1.apakšpunktā, no izejas šķīduma ar koncentrāciju, kas atbilst 400 µg/ml oksitetraciklīna hidrohlorīda, pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 1,6 µg/ml oksitetraciklīna hidrohlorīda, un pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,8 µg/ml, S2 0,4 µg/ml un S1 0,2 µg/ml. 1.5.3. Tetraciklīns Rīkojoties, kā norādīts 1.5.1.apakšpunktā, no izejas šķīduma ar koncentrāciju, kas atbilst 500 µg/ml tetraciklīna hidrohlorīda, pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 1,0 µg/ml tetraciklīna hidrohlorīda, un pagatavo šādas koncentrācijas: S4 0,5 µg/ml, S2 0,25 µg/ml un S1 0,125 µg/ml. 1.6. Ekstrahēšana 1.6.1. Saturs 50 ppm vai mazāk 1.6.1.1. analizējamam paraugam pievieno formamīdu (1.4.8.) turpmāk dotajā tabulā norādītajos daudzumos. Ar kratītāju krata 30 minūtes. Tūlīt pēc tam atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (1.4.3.) saskaņā ar zemāk tabulā dotajiem norādījumiem, lai iegūtu koncentrāciju U8. Šā šķīduma formamīda koncentrācija nedrīkst pārsniegt 40 %. 1.6.1.2. centrifugē vai dekantē, lai iegūtu dzidru šķīdumu. Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 +1), izmantojot fosfāta buferšķīdumu (1.4.3.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1. Antibiotika CTC OTC TC Paredzamais saturs ppm 10 50 10 50 10 50 Parauga iesvars g 10 10 24 9,6 20 10 Formamīds ml (4.8.) 100 100 80 100 80 100 Fosfāta buferšķīdums (4.3.) Atšķ.1: 5 (
  4. a)Atšķ. 1: 25 (
  5. b)70 200 120 atšķ.1:5 (
  6. a)Koncentrācija U8 μg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0 (
  7. a)Ņem 20 ml ekstrakta un 100 ml mērkolbā uzpilda ar fosfāta buferšķīdumu līdz zīmei. (
  8. b)Ņem 4 ml ekstrakta un 100 ml mērkolbā uzpilda ar fosfāta buferšķīdumu līdz zīmei. 1.6.2. Saturs lielāks par 50 ppm 1.6.2.1. Hlortetraciklīns Atkarībā no paredzamā antibiotiku satura paraugā vai tā izgatavotāja garantijām 2-10 g analizējamā parauga pievieno 20 reižu lielāku tilpumu maisījuma (1.4.9.). Ar kratītāju krata 30 minūtes. Ekstrahēšanas laikā pH ir jāpaliek mazākam par 3. Vajadzības gadījumā pH vēlreiz noregulē uz 3 (neorganiskiem maisījumiem izmanto 10 % etiķskābi). Ņem ekstrakta alikvotu daļu un, izmantojot fosfāta buferšķīdumu ar pH 8 1.4.4.), noregulē pH uz 5,5 bromkrezola zaļā klātbūtnē (krāsa mainās no dzeltenas uz zilu). Atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu pH 5,5, kas ir atšķaidīts attiecībā 1:10 (1.4.3.), lai iegūtu koncentrāciju U8 (sk. 1.6.1.). Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 + 1), izmantojot fosfāta buferšķīdumu (1.4.3.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1. 1.6.2.2. Oksitetraciklīns un tetraciklīns Rīkojas, kā norādīts 1.6.2.1.apakšpunktā, izmantojot maisījuma (1.4.9.) vietā maisījumu (1.4.10.). 1.7. Noteikšanas metode 1.7.1. Inokulācija barotnē Noteikšanai sporu suspensiju (1.3.2.) iesēj pamatbarotnē (1.4.1.) 50 - 60oC temperatūrā 1.7.2. Paplāšu sagatavošana 1.7.2.1. difūziju agarā izdara platēs, izmantojot 4 standartšķīduma koncentrācijas (S8, S4, S2, S1) un 4 ekstrakta koncentrācijas (U8, U4, U2, U1). Četras ekstrakta un standartšķīduma koncentrācijas ir jāievieto katrā platē. 1.7.2.2. tādēļ izvēlas plates, kas ir pietiekami lielas, lai tajās agara barotnē varētu izveidot vismaz 8 dobumus ar 10 - 13 mm diametru. Aprēķina apsētās barotnes (1.7.1.) daudzumu, kas vajadzīgs, lai nodrošinātu viendabīgu aptuveni 2 mm biezu pārklājumu. Analīzi vēlams izdarīt uz platēm, kas sastāv no plakana stikla plāksnēm, kuras aprīkotas ar pilnīgi horizontālu alumīnija vai plastmasas gredzenu ar 200 mm diametru un 20 mm augstumu. 1.7.2.3. dobumos ar pipeti iepilina antibiotiku šķīduma precīzi nomērītus daudzumus starp 0,10 un 0,15 ml atkarībā no dobumu diametra. 1.7.2.4. katram paraugam difūziju atkārto vismaz 4 reizes ar katru koncentrāciju, lai katra noteikšana ietvertu 32 inhibēšanas zonu novērtējumu. 1.7.3. Inkubācija Plates inkubē aptuveni 18 stundas 28 - 30 oC temperatūrā. 1.8. Novērtēšana 1.8.1. izmēra inhibēšanas zonu diametru, vēlams ar projicēšanu. Reģistrē mērījumus uz puslogaritmiskā papīra, atliekot koncentrācijas logaritmu pret kavēšanas zonu diametru. Uzzīmē standartšķīduma un ekstrakta līniju. Abas līnijas ir paralēlas pie nosacījuma, ka nepastāv traucējumi. 1.8.2. relatīvās aktivitātes logaritmu aprēķina, izmantojot šādu formulu: (U1 + U2 + U4 + U8 - S1 - S2 - S4 - S8) · 0,602 ---------------------------------------- U4 + U8 + S4 + S8 - U1 - U2 - S1 - S2 Faktiskā aktivitāte = paredzamā aktivitāte x relatīvā aktivitāte. 1.9. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10 % pēc relatīvā lieluma. 2. Ar tubidimetriju 2.1. Mērķis un darbības sfēra Ar šo metodi nosaka hlortetraciklīna (CTC), oksitetraciklīna (OTC) un tetraciklīna (TC) līmeņus, ja koncentrācijas ir lielākas par 1 g/kg ar nosacījumu, ka nepastāv citu vielu traucējošā iedarbība, kas duļķo ekstraktus. Šī metode ir ātrāka nekā difūzija agarā. 2.2. Princips 2.2.1. CTC noteikšanai paraugu ekstrahē ar acetona, ūdens un sālsskābes maisījumu, bet OTC un TC noteikšanai to ekstrahē ar metilspirta un sālsskābes maisījumu. 2.2.2. Ekstraktus pēc tam atšķaida un to antibiotisko ietekmi nosaka, mērot gaismas caurlaidību barotnei, kurā iesēts Sta­phylococcus aureus un kurā pievienota antibiotika. Gaismas caurlaidība ir atkarīga no antibiotiku koncentrācijas. 2.3. Mikroorganisms: Staphylococcus aureus K 141 3 2.3.1. Kultūras uzturēšana S. aureus iesēj mēģenē ar slīpagaru, kas ņemts no barotnes (2.4.1.), kurai pievienots 1,5 - 3 % agara (atkarībā no kvalitātes), inkubē vienu nakti 37oC temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī un slīpagaru no jauna pārsēj reizi 4 nedēļās. Vienlaikus sagatavo darba kultūras lietošanai laboratorijā. 2.3.2. Uzsējuma sagatavošana 24 stundas pirms lietošanas uz slīpagara uzsēj darba kultūru un inkubē vienu nakti 37oC temperatūrā. Visu mēģenē uz agara esošo kultūras augumu suspendē aptuveni 2 ml pamatbarotnes (2.4.1.), pēc tam sterilos apstākļos suspensiju pārnes aptuveni 100 ml tās pašas pamatbarotnes (2.4.1.). Inkubē ūdens vannā 37oC temperatūrā, līdz klona augšana ieiet logaritmiskā fāzē (1 stunda 30 minūtes līdz 2 stundām). 2.4. Barotne un reaģenti 2.4.1. Pamatbarotne noteikšanai 1: 5 g peptons; 1,5 g rauga ekstrakts; 1,5 g gaļas ekstrakts; 3,5 g nātrija hlorīds; 1,0 g glikoze; 1.32 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 - analītiski kvalitatīvs; 3.68 g kālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 - analītiski kvalitatīvs; destilēts ūdens līdz 1000 ml. pH pēc sterilizācijas 6,8 līdz 7,0; 2.4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 4,5: 13,6 g kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 - analītiski kvalitatīvs; destilēts ūdens līdz 1000 ml; 2.4.3. 0,1 N sālsskābe; 2.4.4. Tīra acetona, ūdens un sālsskābes (d = 1,19) maisījums - 65:33:2 tilpuma daļas; 2.4.5. Tīra metilspirta un sālsskābes (d = 1,19) maisījums - 98:2 tilpuma daļas; 2.4.6. Aptuveni 10 % (m/V) formaldehīda šķīdums; 2.4.7. Standartvielas: hlortetraciklīns, oksitetraciklīns, tetraciklīns, kuru aktivitāte ir izteikta, rēķinot uz hidrohlorīdiem. 2.5. Standartšķīdums Izmantojot sālsskābi (2.4.3.), no standartšķīduma (2.4.7.) pagatavo izejas šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 500 µg/ml CTC-HCl, OTC-HCl vai TC-HCl. Šis šķīdums ir glabājams ledusskapī vienu nedēļu. 2.6. Ekstrahēšana 2.6.1. Hlortetraciklīns 200 vai 250 ml mērkolbā ievieto 1 līdz 2 g analizējamā parauga. Pievieno aptuveni 100 ml maisījuma (2.4.4.) un ar kratītāju krata 30 minūtes. Ar fosfāta buferšķīdumu pH 4,5 (2.4.2.) uzpilda līdz atzīmei. Homogenizē un atstāj nostāties. 2.6.2. Oksitetraciklīns un tetraciklīns 200 vai 250 ml mērkolbā ievieto 1 līdz 2 g analizējamā parauga. Pievieno aptuveni 100 ml maisījuma (4.5.) un ar kratītāju krata 30 minūtes. Ar fosfāta buferšķīdumu pH 4,5 (2.4.2.) uzpilda līdz atzīmei. Homogenizē un atstāj nostāvēties. 2.7. Noteikšanas metode 2.7.1. Ekstrakta un standartsērijas pagatavošana Ar fosfāta buferšķīdumu pH 4,5 (2.4.2.) atšķaida standartšķīdumu (2.5.) un ekstraktu (2.6.), lai iegūtu koncentrāciju sēriju. Katrai noteikšanai no attiecīgās koncentrācijas uzzīmē kalibrēšanas līkni, lai varētu interpolēt vismaz divus lielumus, kas attiecas uz ekstraktu. Atšķaidījumus būtu jāizvēlas saskaņā ar klona audzēšanas apstākļiem, kas dažādās laboratorijās var būt atšķirīgi. Darba gaita parasti ir šāda: 2.7.1.1. Hlortetraciklīns Standartšķīdumu (2.5.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu standarta darba šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 0,2 µg/ml CTC·HCl. Pēc tam ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.) mēģenēs, kā turpmāk norādīts, pagatavo 6 atšķaidījumus, katru atšķaidījumu divos eksemplāros. Darba standartšķīdums, ml Fosfāta buferšķīdums (4.2.), ml CTC·HCl koncentrācija (µg/
  9. ml)0,7 0,6 0,55 0,45 0,4 0,3 0,3 0,4 0,45 0,55 0,6 0,7 0,14 0,12 0,11 0,09 0,08 0,06 Ekstraktu (2.6.1.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu paredzamo CTC·HCl koncentrāciju 0,12 µg/ml. Šā šķīduma 1 ml ievieto katrā no 2 mēģenēm un katrā no 2 citām mēģenēm ievieto 0,75 ml (=0,09µg). Uzpilda abu pēdējo mēģeņu tilpumu līdz 1 ml ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.). 2.7.1.2. Oksitetraciklīns un tetraciklīns 2.7.1.2.1. Standartšķīdumu (5.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu standarta darba šķīdumu ar koncentrāciju, kas atbilst 0,6 µg/ml OTC·HCl vai TC·HCl. Pēc tam ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.) mēģenēs, kā turpmāk norādīts, pagatavo 7 atšķaidījumus, katru atšķaidījumu divos eksemplāros. Darba standartšķīdums, ml Fosfāta buferšķīdums (4.2.), ml OTC·HCl vai TC·HCl koncentrācija (µg/
  10. ml)0,9 0,8 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 0,1 0,2 0,3 0,4 0,6 0,7 0,8 0,54 0,48 0,42 0,36 0,24 0,18 0,12 2.7.1.2.2. ekstraktu (2.6.2.) atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.), lai iegūtu paredzamo OTC·HCl vai TC·HCl koncentrāciju 0,48 µg/ml. Šā šķīduma 1 ml ievieto katrā no divām mēģenēm un katrā no divām citām mēģenēm ievieto 0,5 ml (=0,24 µg). Uzpilda abu pēdējo mēģeņu tilpumu līdz 1 ml ar fosfāta buferšķīdumu (2.4.2.). 2.7.2. Inokulēšana barotnē Inokulē noteikšanas pamatbarotni (2.4.1.) ar uzsējumu (2.3.2.), lai ar fotometru pie 590 nm iegūtu gaismas caurlaidību 85 % 5 cm kivetē vai 92 % caurlaidību 2 cm kivetē, ja aparāts ir noregulēts tā, lai 100 % caurlaidība būtu neinokulētā pamatbarotnē (2.4.1.). 2.7.3. Inokulēšana Katrā mēģenē (2.7.1.1. vai 2.7.1.2.) ievieto 9 ml inokulētas barotnes (2.7.2.). Mēģenes ir jāpilda tīros, bet ne obligāti sterilos apstākļos. 2.7.4. Inkubācija Jāinkubē ūdens vannā, kurā maisot uztur nemainīgu 37 ± 0,1oC temperatūru. Izraudzītajam inkubācijas periodam (parasti 2 stundas 30 minūtes līdz 3 stundas) jābūt tādam, lai būtu iespējams caurlaidības līknes uzzīmēt ar slīpumiem, kas ir pietiekami precīziem mērījumiem. Pēc tam augšanu pārtrauc, katrā mēģenē strauji iesmidzinot 1 ml formaldehīda šķīduma (2.4.6.). 2.7.5. Augšanas mērījumi Ar fotometru pie 590 nm izmēra caurlaidību, noregulējot aparātu uz 100% caurlaidību dzidrākajam standartšķīdumam (kas atbilst lielākajam antibiotikas saturam). Tā kā dažādu mēģeņu uzrādītās duļķainības atšķirības ir nelielas, būtu jāizmanto vismaz 2 cm kivetes, bet vēlams 5cm kivetes. 2.8. Rezultātu aprēķināšana Uz milimetru papīra uzzīmē kalibrācijas līkni, atliekot fotometrisko caurlaidību pret antibiotiku koncentrācijām. Interpolē ekstrakta caurlaidības lielumus uz līknes. Aprēķina parauga antibiotikas saturu. 2.9. Atkārtojamība Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10% pēc relatīvā lieluma. Zemkopības ministrs M.Roze 23.pielikums Zemkopības ministrijas 2005.gada 22.marta instrukcijai Nr.9 Oleandomicīna noteikšana ar di

MI skaidrojums pēc oficiālā likuma teksta. Orientējošs, neaizstāj juridisku konsultāciju.