Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 listopada 2005 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie metod przeprowadzania badań właściwości fizykochemicz

W skrócie

Niniejsze rozporządzenie zmienia istniejące przepisy dotyczące metod przeprowadzania badań właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów chemicznych. Wprowadza ono nowe metody badawcze oraz aktualizuje już istniejące.

Co reguluje

Metody badań właściwości fizykochemicznych substancji.
Metody oznaczania toksyczności i innych skutków zdrowotnych.
Metody przeprowadzania badań ekotoksyczności.
Szczegółowe procedury dla badania właściwości utleniających cieczy.

Kogo dotyczy

Podmioty przeprowadzające badania właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów chemicznych.
Minister Zdrowia, jako organ wydający rozporządzenie.

Kluczowe punkty

Wprowadzono nową pozycję "A.21. Właściwości utleniające (ciecze)" do spisu metod badań fizykochemicznych.
Dodano nowe metody w części B (toksyczność), takie jak "B.42. Uczulanie skóry: próba na miejscowym węźle chłonnym" i "B.43. Badanie neurotoksyczności na gryzoniach".
Rozszerzono część C (ekotoksyczność) o nowe metody dotyczące mikroorganizmów glebowych i przemian w glebie oraz osadach wodnych.
Badanie właściwości utleniających cieczy polega na mieszaniu badanej cieczy z włóknami celulozy w stosunku 1:1 (masowo) i obserwacji samozapalenia lub pomiarze czasu narastania ciśnienia w naczyniu ciśnieniowym.
W badaniu właściwości utleniających cieczy, jako substancję kontrolną stosuje się 65% (masowo) roztwór wodny kwasu azotowego.
Włókna celulozy używane jako materiał palny powinny mieć długość od 50 do 250 µm i średnicę 25 µm, oraz zawartość wody niższą niż 0,5% (masowo).
Rozporządzenie wchodzi w życie po upływie 14 dni od dnia ogłoszenia.

Tekst ustawy

DZIENNIK USTAW RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ Warszawa, dnia 22 grudnia 2005 r. Nr 251 TREÂå: Poz.: ROZPORZÑDZENIE 2119 — Ministra Zdrowia z dnia 21 listopada 2005 r. zmieniajàce rozporzàdzenie w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych . . . . . . . . . . . . 16357 2119 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ZDROWIA1) z dnia 21 listopada 2005 r. zmieniajàce rozporzàdzenie w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych2) Na podstawie art. 24 ust. 2 pkt 1 ustawy z dnia 11 stycznia 2001 r. o substancjach i preparatach chemicznych (Dz. U. Nr 11, poz. 84, z póên. zm.3)) zarzàdza si´, co nast´puje: § 1. W rozporzàdzeniu Ministra Zdrowia z dnia 28 lipca 2003 r. w sprawie metod przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych, toksycznoÊci i ekotoksycznoÊci substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 232, poz. 2343) wprowadza si´ nast´pujàce zmiany w za∏àczniku do rozporzàdzenia: 1) „Spis metod” otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 1 do niniejszego rozporzàdzenia; 2) w cz´Êci A po pozycji „A.20 Rozpuszczanie/ekstrakcja polimerów w wodzie” dodaje si´ pozycj´ ——————— 1) Minister Zdrowia kieruje dzia∏em administracji rzàdowej — zdrowie, na podstawie § 1 ust. 2 rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 31 paêdziernika 2005 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Zdrowia (Dz. U. Nr 220, poz. 1901). 2) Niniejsze rozporzàdzenie dokonuje w zakresie swojej regulacji wdro˝enia dyrektywy 2004/73/WE z dnia 29 kwietnia 2004 r. dostosowujàcej po raz 29 do post´pu technicznego dyrektyw´ 67/548/EWG w sprawie zbli˝enia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszàcych si´ do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych (Dz. Urz. WE L 152 z 30.04.2004 r.). 3) Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U. z 2001 r. Nr 100, poz. 1085, Nr 123, poz. 1350 i Nr 125, poz. 1367, z 2002 r. Nr 135, poz. 1145 i Nr 142, poz. 1187, z 2003 r. Nr 189, poz. 1852, z 2004 r. Nr 96, poz. 959 i Nr 121, poz. 1263 oraz z 2005 r. Nr 179, poz. 1485. „A.21. W∏aÊciwoÊci utleniajàce (ciecze)” w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 2 do niniejszego rozporzàdzenia; 3) w cz´Êci B:

a)pozycja B.1.BIS. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 3 do niniejszego rozporzàdzenia,
b)pozycja B.1.TRIS. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 4 do niniejszego rozporzàdzenia,
c)pozycja B.4. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 5 do niniejszego rozporzàdzenia,
d)pozycja B.5. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 6 do niniejszego rozporzàdzenia,
e)pozycja B.31. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 7 do niniejszego rozporzàdzenia,
f)pozycja B.35. otrzymuje brzmienie okreÊlone w za∏àczniku nr 8 do niniejszego rozporzàdzenia,
g)po pozycji „B.41. FototoksycznoÊç in vitro — test wychwytu czerwieni oboj´tnej 3T3” dodaje si´ pozycje: — „B.42. Uczulanie skóry: próba na miejscowym w´êle ch∏onnym” w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 9 do niniejszego rozporzàdzenia, Dziennik Ustaw Nr 251 — 16358 — Poz. 2119 — „B.43 Badanie neurotoksycznoÊci na gryzoniach” w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 10 do niniejszego rozporzàdzenia;
c)„C.23. Przemiany tlenowe i beztlenowe w glebie” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 13 do niniejszego rozporzàdzenia, 4) w cz´Êci C po pozycji „C.20. Rozmna˝anie rozwielitki (Daphnia magna sp.)” dodaje si´ pozycje:
d)„C.24. Przemiany tlenowe i beztlenowe w osadach wodnych” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 14 do niniejszego rozporzàdzenia.
a)„C.21. Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian azotu” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 11 do niniejszego rozporzàdzenia,
b)„C.22. Mikroorganizmy glebowe: Badanie przemian w´gla” — w brzmieniu okreÊlonym w za∏àczniku nr 12 do niniejszego rozporzàdzenia, § 2. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie 14 dni od dnia og∏oszenia. Minister Zdrowia: Z. Religa Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Zdrowia z dnia 21 listopada 2005 r. (poz. 2119) Za∏àcznik nr 1 SPIS METOD Cz´Êç A. Metody przeprowadzania badaƒ w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych A.1. A.2. A.3. A.4. A.5. A.6. A.8. A.9. A.10. A.11. A.12. A.13. A.14. A.15. A.16. A.17. A.18. A.19. A.20. A.21. Temperatura topnienia/krzepni´cia Temperatura wrzenia G´stoÊç wzgl´dna Pr´˝noÊç par Napi´cie powierzchniowe RozpuszczalnoÊç w wodzie Wspó∏czynnik podzia∏u Temperatura zap∏onu PalnoÊç (substancje i preparaty chemiczne sta∏
e)PalnoÊç (gazy) PalnoÊç (w kontakcie z wodà) W∏aÊciwoÊci piroforyczne cia∏ sta∏ych i cieczy W∏aÊciwoÊci wybuchowe Temperatura samozap∏onu (ciecze i gazy) Wzgl´dna temperatura samozapalenia substancji/preparatów chemicznych sta∏ych W∏aÊciwoÊci utleniajàce (substancje/preparaty chemiczne sta∏
e)Liczbowo Êrednia masa czàsteczkowa i rozk∏ad masy czàsteczkowej polimerów ZawartoÊç polimerów o ma∏ej masie czàsteczkowej Rozpuszczanie/ekstrakcja polimerów w wodzie W∏aÊciwoÊci utleniajàce (ciecze) Cz´Êç B. Metody oznaczania toksycznoÊci i innych skutków zdrowotnych B.1.BIS. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà) — Metoda Ustalonej Dawki B.1.TRIS. ToksycznoÊç ostra (podanie drogà pokarmowà) — Metoda Klas ToksycznoÊci Ostrej B.2. ToksycznoÊç ostra (inhalacyjna) B.3. ToksycznoÊç ostra (nara˝enie przez skór´) B.4. ToksycznoÊç ostra: dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na skór´ B.5. ToksycznoÊç ostra: dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na oko B.6. ToksycznoÊç ostra (uczulenie skóry) B.7. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga pokarmowa) B.8. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, droga inhalacyjna) B.9. ToksycznoÊç dawki powtarzanej (28 dni, po podaniu na skór´) B.10. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych in vitro na komórkach ssaków) B.11. MutagennoÊç (test aberracji chromosomowych na komórkach szpiku kostnego ssaków) B.12. MutagennoÊç (test mikrojàdrowy na erytrocytach ssaków in vivo) B.13/14. MutagennoÊç (test rewersji mutacji na bakteriach) B.15. MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) B.16. MutagennoÊç (test rekombinacji mitotycznych na komórkach Saccharomyces cerevisiae) B.17. MutagennoÊç (test mutacji genowych na komórkach ssaków) Dziennik Ustaw Nr 251 B.18. B.19. B.20. B.21. B.22. B.23. B.24. B.25. B.26. B.27. B.28. B.29. B.30. B.31. B.32. B.33. B.34. B.35. B.36. B.37. B.38. B.39. B.40. B.41. B.42. B.43. — 16359 — Poz. 2119 Uszkodzenie i naprawa DNA — Nieplanowa synteza DNA — Badanie na komórkach ssaków in vitro Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro Recesywne mutacje letalne zwiàzane z p∏cià u Drosophila melanogaster Transformacja komórek ssaków in vitro Dominujàce mutacje letalne u gryzoni Aberracje chromosomowe spermatogoniów ssaków Test plamkowy u myszy Test dziedzicznych translokacji u myszy ToksycznoÊç podchroniczna (90-dniowe powtarzane nara˝enie gryzoni drogà pokarmowà) ToksycznoÊç podchroniczna (90-dniowe powtarzane nara˝enie drogà pokarmowà zwierzàt z gatunków innych ni˝ gryzonie) ToksycznoÊç podprzewlek∏a — nara˝enie przez skór´ (90-dniowe powtarzane nara˝enie na skór´ u gryzoni) ToksycznoÊç podprzewlek∏a — nara˝enie inhalacyjne (90-dniowe powtarzane nara˝enie inhalacyjne u gryzoni) ToksycznoÊç przewlek∏a Badanie toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym Dzia∏anie rakotwórcze ToksycznoÊç przewlek∏a/dzia∏anie rakotwórcze Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu jednopokoleniowego Dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego Toksykokinetyka Opóêniona neurotoksycznoÊç zwiàzków fosforoorganicznych po nara˝eniu ostrym Opóêniona neurotoksycznoÊç zwiàzków fosforoorganicznych po dawce powtarzanej — 28-dniowej Nieplanowana synteza DNA na komórkach wàtroby ssaków Dzia∏anie ˝ràce na skór´ FototoksycznoÊç in vitro — test wychwytu czerwieni oboj´tnej 3T3 Uczulanie skóry: próba na miejscowym w´êle ch∏onnym Badanie neurotoksycznoÊci na gryzoniach Cz´Êç C. Metody przeprowadzenia badaƒ ekotoksycznoÊci C.1. C.2. C.3. C.4. C.4.I. C.4.II. C.4.III. C.4.IV. C.4.V. C.4.VI. C.4.VII. C.5. C.6. C.7. C.8. C.9. C.10. C.11. C.12. C.13. C.14. C.15. C.16. C.17. C.18. C.19. C.20. C.21. C.22. C.23. C.24. ToksycznoÊç ostra (dla ryb) ToksycznoÊç ostra (dla rozwielitek — Daphnia sp.) Hamowanie wzrostu glonów PodatnoÊç na biodegradacj´ Uwagi ogólne Zanikanie RWO (Metoda C.4—A) Zmodyfikowane badanie przesiewowe wg OECD (Metoda C.4—B) Wydzielanie CO2 (Metoda C.4—C) Metoda respirometrii manometrycznej (Metoda C.4—D) Metoda naczynia zamkni´tego (Metoda C.4—E) Metoda M.I.T.I. (Metoda C.4—F) Degradacja — biochemiczne zapotrzebowanie na tlen Degradacja — chemiczne zapotrzebowanie na tlen Degradacja — abiotyczny rozk∏ad przez hydroliz´ w zale˝noÊci od pH ToksycznoÊç dla d˝d˝ownic. Badanie w sztucznej glebie Biodegradacja. Test Zahn-Wellensa Biodegradacja. Badania symulacyjne osadu czynnego Biodegradacja. Badania stopnia hamowania oddychania osadu czynnego Biodegradacja. Zmodyfikowany test SCAS Biokoncentracja. Badanie przep∏ywowe na rybach Badanie wzrostu narybku Krótkoterminowa toksycznoÊç na zarodkach ryb i stadiach narybku Badanie toksycznoÊci ostrej drogà pokarmowà na pszczo∏ach miodnych Badanie toksycznoÊci ostrej kontaktowej na pszczo∏ach miodnych Adsorpcja/desorpcja metodà wyznaczania stanu równowagi Wyznaczanie wspó∏czynnika adsorpcji (KOC) na glebie i osadzie Êciekowym za pomocà chromatografii cieczowej (HPLC) Rozmna˝anie rozwielitki (Daphnia magna sp.) Mikroorganizmy glebowe: badanie przemian azotu Mikroorganizmy glebowe: badanie przemian w´gla Przemiany tlenowe i beztlenowe w glebie Przemiany tlenowe i beztlenowe w osadach wodnych Dziennik Ustaw Nr 251 — 16360 — Poz. 2119 Za∏àcznik nr 2 A.21. W¸AÂCIWOÂCI UTLENIAJÑCE (CIECZE) 1. METODA 1.4. Zasada metody badawczej 1.1. Wst´p Badanà ciecz miesza si´ w stosunku 1:1 (masowo), z w∏óknami celulozy i umieszcza si´ w naczyniu ciÊnieniowym. Je˝eli podczas mieszania lub nape∏niania naczynia nastàpi samozapalenie, to dalsze prowadzenie badania nie jest konieczne. Niniejsza metoda badania jest przewidziana do pomiaru zdolnoÊci cieczy do zwi´kszenia szybkoÊci spalania lub intensywnoÊci spalania materia∏ów palnych lub do tworzenia mieszanin z materia∏ami palnymi, które ulegajà samozapaleniu, je˝eli takie dwa sk∏adniki zostanà dok∏adnie zmieszane. Opiera si´ ona na metodzie ONZ przewidzianej dla cieczy utleniajàcych (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa) i jest z nià równowa˝na. Jednak˝e, metoda ta jako A.21 przewidziana jest przede wszystkim do spe∏nienia wymagaƒ dyrektywy 67/548; wymagane jest porównanie tylko z jednà substancjà kontrolnà. Badanie i porównanie z dodatkowà substancjà kontrolnà mo˝e byç konieczne, je˝eli przewiduje si´ zastosowanie wyników badaƒ do innych celów1. Badania nie trzeba wykonywaç, je˝eli z budowy strukturalnej substancji mo˝na wnioskowaç o tym, ˝e substancja nie reaguje egzotermicznie z materia∏em palnym. Przed wykonaniem badania wskazane jest poznanie informacji o w∏aÊciwoÊciach wybuchowych substancji/preparatów chemicznych. Metody nie nale˝y stosowaç do badaƒ substancji/preparatów chemicznych sta∏ych, gazowych, wybuchowych, wysoce ∏atwopalnych oraz nadtlenków organicznych. Niniejsze badanie nie musi byç przeprowadzane, je˝eli dost´pne sà wyniki badania cieczy wed∏ug metody ONZ dla cieczy utleniajàcych (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). 1.2. Definicje i jednostki Âredni czas narastania ciÊnienia jest Êrednià ze zmierzonych czasów narastania ciÊnienia dla mieszanin podatnych w warunkach oznaczenia do powodowania wzrostu ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa powy˝ej ciÊnienia atmosferycznego. 1.3. Substancje kontrolne Alternatywnie, je˝eli badajàcy przewiduje, ˝e wyniki takiego badania mogà byç wykorzystane do innych celów1, to mo˝e uznaç za zasadne przeprowadzenie badania z dodatkowà substancjà kontrolnà3. ——————— 1 Np. w ramach przepisów transportowych ONZ. 2 Przed badaniem kwas powinien byç zmiareczkowany w ce- lu potwierdzenia st´˝enia. nadchlorowy i 40 % (w/
w)chloran sodu. 1.5. Kryteria wiarygodnoÊci badaƒ W serii pi´ciu prób dla jednej substancji nie powinno byç wyników ró˝niàcych si´ o wi´cej ni˝ 30 % od Êredniej arytmetycznej. Wyniki ró˝niàce si´ o wi´cej ni˝ 30 % od Êredniej arytmetycznej powinny byç odrzucone, a procedury mieszania i nape∏niania powinny zostaç skorygowane, a badanie powtórzone. 1.6. Opis metody badawczej 1.6.1. CzynnoÊci przygotowawcze 1.6.1.1. Materia∏ palny Jako materia∏ palny stosuje si´ wysuszone w∏ókna celulozy o d∏ugoÊci w∏ókna pomi´dzy 50 i 250 µm oraz przeci´tnej Êrednicy 25 µm4. Powinny byç one wysuszone do sta∏ej wagi w warstwie nie grubszej ni˝ 25 mm w 105 °C przez 4 godz. i przechowywane w eksykatorze, ze Êrodkiem suszàcym, a˝ do och∏odzenia i osiàgni´cia stanu wymaganego do stosowania. ZawartoÊç wody w wysuszonej celulozie powinna byç ni˝sza ni˝ 0,5 % (masowo) w przeliczeniu na suchà mas´5. Je˝eli to konieczne, czas suszenia powinien byç przed∏u˝ony a˝ do osiàgni´cia tej wartoÊci6. Ta sama partia celulozy powinna byç stosowana podczas ca∏ego badania. 1.6.1.2. Aparatura Jako substancj´2 kontrolnà stosuje si´ 65 % (masowo) roztwór wodny kwasu azotowego (czystoÊç analityczna). 3 Wed∏ug odsy∏acza1 stosowane sà np.: 50 Je˝eli samozapalenie nie nastàpi∏o, to powinno byç przeprowadzone pe∏ne badanie. Mieszanin´ ogrzewa si´ w naczyniu ciÊnieniowym i oznacza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa powy˝ej ciÊnienia atmosferycznego. Uzyskany czas porównuje si´ ze Êrednim czasem narastania ciÊnienia dla mieszaniny 1:1 (masowo) substancji kontrolnej(ych) i celulozy. % (w/
w)kwas 1.6.1.2.1. Naczynie ciÊnieniowe Wymagane jest naczynie ciÊnieniowe. Aparat sk∏ada si´ z cylindrycznego stalowego naczynia ciÊnieniowego o d∏ugoÊci 89 mm i Êrednicy zewn´trznej 60 mm ——————— 4 Np. Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalog nr 4021 050. np. za pomocà miareczkowania metodà Karl-Fisher’a. 6 Alternatywnie, wskazana zawartoÊç wody mo˝e byç równie˝ osiàgana np. przez ogrzewanie w 105 °C pod obni˝onym ciÊnieniem przez 24 h. 5 Potwierdzone Dziennik Ustaw Nr 251 — 16361 — (patrz rysunek A.21.1). Na przeciwnych stronach znajdujà si´ dwie p∏aszczyzny (zmniejszajàce przekrój naczynia do 50
mm)w celu u∏atwienia trzymania podczas zak∏adania g∏owiczki zapalajàcej i odpowietrznika. Naczynie, które ma wywiercony otwór o Êrednicy 20 mm, z jednego koƒca nagwintowany do g∏´bokoÊci 19 mm gwintem 1„zgodnie z normà British Standard Pipe (BSP) lub jego odpowiednikiem metrycznym. Odprowadzenie ciÊnienia, w postaci bocznego ramienia, jest wkr´cane w zakrzywionà powierzchni´ naczynia ciÊnieniowego 35 mm od jednego koƒca i pod kàtem 90° do powierzchni uchwytowych. Na koƒcu ramienia bocznego jest wywiercone gniazdo na g∏´bokoÊç 12 mm i nagwintowane gwintem 1/2”, zgodnie z BSP lub jego odpowiednikiem metrycznym. Je˝eli jest to konieczne, uszczelnienie wewn´trzne zawiera uszczelk´ gazoszczelnà. Rami´ boczne wchodzi 55 mm w g∏àb korpusu naczynia ciÊnieniowego i ma otwór o Êrednicy 6 mm. Koniec ramienia bocznego jest nagwintowany w celu unieruchomienia czujnika ciÊnienia. Do pomiaru ciÊnienia mo˝e byç u˝yte dowolne urzàdzenie, pod warunkiem ˝e nie jest wra˝liwe na goràce gazy lub produkty rozk∏adu i jest odpowiednie do odczytu szybkoÊci narastania ciÊnienia w przedziale 690—2070 kPa, w okresie nie d∏u˝szym ni˝ 5 ms. Najdalszy od ramienia bocznego koniec naczynia ciÊnieniowego jest zamykany g∏owiczkà zapalajàcà, wyposa˝onà w dwie elektrody, jedna odizolowana od korpusu, a druga uziemiajàca jest z nim po∏àczona. Drugi koniec naczynia ciÊnieniowego jest zamykany aluminiowà membranà rozrywajàcà o gruboÊci 0,2 mm (ciÊnienie rozrywajàce wynosi ok. 2200 kPa) zamocowanà w gnieêdzie za pomocà korka z otworem 20 mm. Je˝eli to konieczne, pod g∏owiczkà zapalajàcà stosuje si´ oboj´tne uszczelnienie w celu zapewnienia hermetycznoÊci. Urzàdzenie podtrzymujàce (rysunek A.21.2) umo˝liwia w∏aÊciwà pozycj´ zestawu podczas badania. Zwykle sk∏ada si´ ono z p∏ytki z mi´kkiej stali o wymiarach 235 mm x 184 mm x 6 mm z przymocowanym do niej wspornikiem o d∏ugoÊci 185 mm i wyprofilowanym kwadratowo zag∏´bieniem na naczynie ciÊnieniowe o wymiarach 70 mm x 70 mm x 4 mm. Âciany boczne wyprofilowanego kwadratowo wspornika sà naci´te na dwóch przeciwleg∏ych stronach na jednym koƒcu jego d∏ugoÊci tak, ˝e konstrukcja ma dwie p∏askie boczne nogi wznoszàce si´ na wysokoÊç 86 mm ponad nienaruszony przekrój wspornika. Drugie koƒce tych p∏askich Êcian sà obci´te pod kàtem 60° do poziomu i przyspawane do p∏ytki podstawy. Po jednej stronie górnej cz´Êci podstawy przekroju wspornika wykonana jest szczelina o wymiarach 22 mm szerokoÊci i 46 mm g∏´bokoÊci tak, ˝e gdy zestaw naczynia ciÊnieniowego jest opuszczany w g∏àb wspornika, najpierw podparty jest we wsporniku zacisk zapalajàcy, a boczne rami´ umieszczone jest w tej szczelinie. Podk∏adka stalowa o d∏ugoÊci 30 mm i gruboÊci 6 mm jest dospawana do dolnej wewn´trznej cz´Êci przedniej wspornika, która dzia∏a jako przek∏adka dystansowa. Dwie Êruby 7 mm z p∏askim ∏bem (lub motylkowe) wkr´cone w Êcian´ przeciwleg∏à s∏u˝à do mocowania naczynia ciÊnieniowego w miejscu. Dwie 12 mm szerokoÊci taÊmy stalowe o gruboÊci 6 mm, przyspawane do cz´Êci bocznych, stykajà si´ z podstawà wspornika, podpierajàc naczynie ciÊnieniowe od do∏u. Poz. 2119 1.6.1.2.2. Uk∏ad zapalajàcy Uk∏ad zapalajàcy zawiera drut Ni/Cr o d∏ugoÊci 25 cm, Êrednicy 0,6 mm i opornoÊci 3,85 ohm/m. Drut zwija si´, za pomocà pr´ta o Êrednicy 5 mm w spiral´ i przymocowuje si´ do elektrod g∏owiczki zapalajàcej. Spirala powinna mieç jednà z form pokazanych na rysunku A.21.3. Odleg∏oÊç pomi´dzy dnem naczynia a dolnà cz´Êcià spirali powinna wynosiç 20 mm. Je˝eli elektrody nie sà nastawialne, to koƒce drutu zapalajàcego pomi´dzy spiralà a dnem naczynia powinny byç odizolowane za pomocà ceramicznej gilzy. Drut rozgrzewa si´ wskutek przep∏ywu pràdu sta∏ego o nat´˝eniu co najmniej 10 A. 1.6.2. Wykonanie badania7 Urzàdzenie, zestawione razem z czujnikiem ciÊnienia i uk∏adem grzewczym, ale bez membrany rozrywajàcej umieszczonej na miejscu, jest podtrzymywane od do∏u przez g∏owiczk´ zapalajàcà. Badanà ciecz w iloÊci 2,5 g miesza si´ z 2,5 g wysuszonej celulozy w szklanej zlewce za pomocà szklanej bagietki8. Ze wzgl´dów bezpieczeƒstwa, mieszanie powinno byç przeprowadzone spoza os∏ony pomi´dzy wykonawcà a mieszaninà. Je˝eli mieszanina zapali si´ podczas mieszania lub nape∏niania, dalsze wykonywanie badania nie jest konieczne. Mieszanin´ dodaje si´, ma∏ymi porcjami przez zawór, do naczynia ciÊnieniowego w sposób gwarantujàcy, ˝e mieszanina zosta∏a u∏o˝ona wokó∏ spirali zapalajàcej i jest z nià w dobrym kontakcie. Wa˝ne jest, aby spirala nie zosta∏a zniekszta∏cona podczas operacji nape∏niania, co mo˝e mieç wp∏yw na uzyskanie b∏´dnych wyników9. Membran´ rozrywajàcà umieszcza si´ na miejscu i zabezpiecza si´ jà, wkr´cajàc korek w celu uszczelnienia. Za∏adowane naczynie z membranà rozrywajàcà umieszczonà do góry przenosi si´ na miejsce (podstaw´), w którym b´dzie wykonywany zap∏on, umieszczone w odpowiednim opancerzonym wyciàgu lub komorze do spalania. Koƒcówki zasilania powinny zostaç pod∏àczone do zewn´trznych koƒcówek g∏owiczki zapalajàcej i powinien zostaç w∏àczony pràd o nat´˝eniu 10 A. Czas pomi´dzy poczàtkiem mieszania i w∏àczeniem zasilania nie powinien przekraczaç 10 minut. Sygna∏ wytwarzany przez czujnik ciÊnienia rejestruje si´ przez odpowiedni uk∏ad, który umo˝liwia ocen´ i rejestrowanie sta∏ego zapisu czasu narastania ciÊnienia (np. przekaênik po∏àczony jest z rejestratorem). Mieszanin´ ogrzewa si´ a˝ do p´kni´cia membrany rozrywajàcej lub przez co najmniej 60 s. Je˝eli membrana rozrywajàca nie p´k∏a, to mieszanin´ nale——————— 7 Mieszaniny utleniacza z celulozà powinny byç traktowane jako potencjalnie wybuchowe i wszelkie czynnoÊci powinny byç wykonywane ostro˝nie. 8 W praktyce, mo˝e to byç uzyskiwane poprzez przygotowanie mieszaniny 1:1 (masowo) mieszaniny cieczy badanej i celulozy w iloÊci wi´kszej ni˝ potrzebna do próby i do przeniesienia 5 ± 0,1g do naczynia ciÊnieniowego. Do ka˝dej próby mieszanina powinna byç Êwie˝o przygotowana. 9 W szczególnoÊci nie nale˝y dopuÊciç do kontaktu pomi´dzy sàsiadujàcymi zwojami spirali. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16362 — ˝y pozostawiç do och∏odzenia przed ostro˝nym rozebraniem urzàdzenia, stosujàc zabezpieczenia przed dzia∏aniem nadciÊnienia, które mo˝e w nim wyst´powaç. Wykonuje si´ pi´ç prób z cieczà badanà i substancjà(ami) kontrolnà(ymi). Zapisuje si´ czas narastania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa powy˝ej ciÊnienia atmosferycznego. Potem oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia. W pewnych przypadkach ciecze mogà powodowaç wzrost ciÊnienia (zbyt wysoki lub zbyt niski), spowodowany przez reakcje chemiczne nieb´dàce charakterystycznymi dla w∏aÊciwoÊci utleniajàcych. W takich przypadkach mo˝e byç konieczne powtórzenie badania z materia∏em oboj´tnym, np. diatomitem (ziemià okrzemkowà), zast´pujàcym celuloz´ w celu wyjaÊnienia rodzaju reakcji. Poz. 2119 2. WYNIKI Czas narastania ciÊnienia zarówno dla substancji badanej i substancji kontrolnej(ych). Czas narastania ciÊnienia z badaƒ z materia∏em oboj´tnym, o ile zosta∏y przeprowadzone. 2.1. Opracowanie wyników Oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia dla cieczy badanej i substancji kontrolnej(ych). Oblicza si´ Êredni czas narastania ciÊnienia z badaƒ z materia∏em oboj´tnym (o ile zosta∏y przeprowadzone). Niektóre przyk∏ady wyników podano w tabeli A.21.1. Tabela A.21.1. Przyk∏ady wynikówd)
a)Ârednia wartoÊç z porównawczych prób mi´dzylaboratoryjnych.
b)Maksymalnego ciÊnienia 2070 kPa nie uzyskano.
c)Roztwory nasycone powinny byç przygotowywane w 20 °C.
d)Zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa dotyczàca klasyfikacji wed∏ug algorytmu ONZ dla transportu. 3. SPRAWOZDANIE 3.1. Sprawozdanie z badaƒ Sprawozdanie z badaƒ musi zawieraç nast´pujàce informacje: — identyfikacj´, sk∏ad, czystoÊç badanej substancji itp., — st´˝enie substancji badanej, — zastosowanà procedur´ suszenia celulozy, — obliczone Êrednie czasy narastania ciÊnienia, — odst´pstwa od niniejszej metody i ich przyczyny, — wszystkie informacje dodatkowe lub uwagi dotyczàce interpretacji wyników. 3.2. Interpretacja wyników10 Wyniki badaƒ ocenia si´ na podstawie: — obserwacji, czy mieszanina cieczy badanej i celulozy zapala si´ samorzutnie, oraz — zawartoÊç wody w wysuszonej celulozie, — wyniki badaƒ, — wyniki badaƒ z materia∏em oboj´tnym, je˝eli by∏y wykonywane, ——————— 10 Zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa; w celu interpretacji wy- ników na podstawie zaleceƒ ONZ dla transportu stosowanych dla ró˝nych substancji kontrolnych. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16363 — — porównania Êredniego czasu przyj´tego dla narastania ciÊnienia od 690 kPa do 2070 kPa z substancjà(ami) kontrolnà(ymi). Ciecz uwa˝a si´ za utleniajàcà, je˝eli: Poz. 2119 W celu unikni´cia fa∏szywie pozytywnych wyników, je˝eli to konieczne, powinny byç równie˝ uwzgl´dnione przy ich interpretacji wyniki uzyskane podczas badania cieczy z materia∏em oboj´tnym. — mieszanina 1:1 (masowo), cieczy i celulozy zapala si´ samorzutnie lub 4. PIÂMIENNICTWO — mieszanina 1:1 (masowo) cieczy i celulozy wykazuje Êredni czas narastania ciÊnienia mniejszy lub równy Êredniemu czasowi narastania ciÊnienia dla mieszaniny 1:1 masowo, 65 % (masowo) wodnego roztworu kwasu azotowego i celulozy. 1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids. Rysunek A.21.1. Naczynie ciÊnieniowe A Korpus naczynia ciÊnieniowego B Korek blokujàcy membran´ rozrywajàcà C G∏owiczka zapalajàca D Mi´kka podk∏adka o∏owiana E Membrana rozrywajàca F Rami´ boczne G G∏owica czujnika ciÊnienia H Podk∏adka J Elektroda zaizolowana K Elektroda uziemiona L Izolacja M Króciec stalowy N Wy˝∏obienie na odkszta∏cenie podk∏adki Dziennik Ustaw Nr 251 — 16364 — Rysunek A.21.2. Urzàdzenie podtrzymujàce Rysunek A.21.3. Uk∏ad zapalajàcy A Spirala zapalajàca B Izolacja C Elektrody D G∏owiczka zapalajàca Uwaga: mogà byç stosowane oba te ustawienia. Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16365 — Poz. 2119 Za∏àcznik nr 3 B.1.BIS. TOKSYCZNOÂå OSTRA (PODANIE DROGÑ POKARMOWÑ) — METODA USTALONEJ DAWKI 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD Nr 420

(2001). 1.1. Wst´p W tradycyjnych metodach szacowania ostrej toksycznoÊci poszukiwanym wskaênikiem si∏y dzia∏ania toksycznego jest padni´cie zwierzàt. W 1984 r. Brytyjskie Towarzystwo Toksykologiczne zaproponowa∏o nowe podejÊcie do badaƒ toksycznoÊci ostrej opierajàce si´ na kolejnym podawaniu dawek o ustalonej wielkoÊci (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). PodejÊcie to umo˝liwia unikni´cie traktowania padni´cia zwierzàt jako kryterium oceny, gdy˝ polega na obserwacji wyraênych cech dzia∏ania toksycznego ujawniajàcych si´ po kolejnym podaniu dawki o ustalonej wielkoÊci. Po brytyjskich (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa) i mi´dzynarodowych (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa) badaniach walidacyjnych przeprowadzonych in vivo procedura zosta∏a przyj´ta w 1992 r. jako metoda badawcza. Nast´pnie w kolejnych badaniach (zobacz pozycje 4, 5 i 6 piÊmiennictwa) oszacowano wiarygodnoÊç Metody Ustalonej Dawki przy zastosowaniu statystycznych modeli matematycznych. Badania in vivo oraz matematyczne modelowania wykaza∏y, ˝e procedura jest powtarzalna, w porównaniu z metodami tradycyjnymi umo˝liwia zmniejszenie liczby stosowanych zwierzàt oraz pozwala uszeregowaç substancje w sposób zbli˝ony do innych nietradycyjnych metod badania toksycznoÊci ostrej. Wytyczne co do wyboru najbardziej w∏aÊciwej metody badawczej do oceny toksycznoÊci ostrej podane sà w Wytycznych do Badaƒ ToksycznoÊci Ostrej po Podaniu Drogà Pokarmowà (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Dokument ten zawiera tak˝e dodatkowe informacje, dotyczàce przeprowadzenia badaƒ Metodà B.1.bis i ich interpretacji. Zasadà metody jest, aby w badaniu g∏ównym stosowane by∏y tylko Êrednio toksyczne dawki; unikaç nale˝y podawania dawek, które prawdopodobnie b´dà powodowaç padni´cie zwierzàt. Nie nale˝y podawaç równie˝ substancji w dawkach, co do których jest pewnoÊç, ˝e powodujà znaczny ból i cierpienie z powodu ich ostrego dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego. Zwierz´ta w agonii lub w widoczny sposób cierpiàce, bàdê te˝ wykazujàce oznaki silnego i trwa∏ego bólu, powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a w interpretacji wyników powinny zostaç traktowane tak samo, jak zwierz´ta, które pad∏y podczas badania. Kryteria podj´cia decyzji o uÊmierceniu zwierzàt w agonii lub cierpiàcych oraz wytyczne co do rozpoznawania przewidywanej lub nieuchronnej Êmierci sà przedmiotem osobnych Wytycznych (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Stosujàc t´ metod´, mo˝na uzyskaç informacje na temat niebezpiecznych w∏aÊciwoÊciach substancji oraz uszeregowaç je i sklasyfikowaç zgodnie z zasada- mi Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) dotyczàcymi klasyfikacji substancji chemicznych ze wzgl´du na toksycznoÊç ostrà (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). Przed przystàpieniem do badania wykonujàcy je powinien wziàç pod uwag´ wszystkie dost´pne informacje na temat badanej substancji. Do takich informacji zalicza si´ to˝samoÊç i budow´ chemicznà substancji, jej w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, wyniki innych badaƒ toksykologicznych in vitro lub in vivo, dane toksykologiczne dla substancji o podobnej budowie chemicznej oraz przewidywane zastosowanie(

a)tej substancji. Takie informacje sà konieczne w celu przekonania wszystkich zainteresowanych, ˝e badanie jest odpowiednie dla ochrony zdrowia ludzkiego i odpowiednie do w∏aÊciwego wyboru dawki poczàtkowej. 1.2. Definicje ToksycznoÊç ostra po podaniu drogà pokarmowà: oznacza wszystkie szkodliwe skutki, które wyst´pujà po podaniu substancji drogà pokarmowà w pojedynczej dawce lub w wielu dawkach, podanych w czasie 24 godzin. Padni´cie opóênione: oznacza, ˝e zwierz´ nie pada lub nie znajduje si´ w stanie agonii w czasie 48 godzin od podania badanej substancji, ale pada póêniej, w czasie 14-dniowego okresu obserwacji. Dawka: jest iloÊcià badanej substancji podanej zwierz´ciu. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ badanej substancji przypadajàcà na jednostk´ masy cia∏a zwierz´cia (np.: mg/kg). ToksycznoÊç widoczna: jest ogólnym poj´ciem opisujàcym wyraêne oznaki zatrucia wyst´pujàce po podaniu badanej substancji (zobacz pozycja 3 piÊmiennictwa) takie, ˝e w nast´pnej najwy˝szej ustalonej dawce mogà wystàpiç trwa∏e objawy ostrego bólu i cierpienia, stan agonii (kryteria podano w Humane Endpoints Guidance Document (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) lub prawdopodobne jest padni´cie wi´kszoÊci zwierzàt. GHS: Âwiatowy System Zharmonizowany. Wspólne przedsi´wzi´cie OECD (zdrowie i Êrodowisko), Komitetu Ekspertów ONZ ds. Transportu Towarów Niebezpiecznych (w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne), ILO (informacja o zagro˝eniach) i koordynowane przez Mi´dzyorganizacyjny Program Zarzàdzania Chemikaliami (IOMC). Nieuchronne padni´cie: oznacza spodziewany stan agonii lub padni´cie po przed∏u˝eniu czasu obserwacji. Do objawów mogàcych wskazywaç na taki stan u gryzoni zalicza si´ konwulsje, po∏o˝enie boczne, pozycj´ le˝àcà i drgawki (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Dziennik Ustaw Nr 251 — 16366 — LD50 (medialna dawka Êmiertelna): jest statystycznie obliczonà pojedynczà dawkà substancji, która spowoduje Êmierç 50 % zwierzàt po podaniu drogà pokarmowà. WartoÊç LD50 jest wyra˝ana w postaci masy badanej substancji przypadajàcej na jednostk´ masy badanego zwierz´cia (mg/kg). Dawka graniczna: odnosi si´ do górnego ograniczenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg). Prognozowane padni´cie: wyst´powanie objawów klinicznych Êwiadczàcych o padni´ciu w przewidywalnym okresie w przysz∏oÊci przed up∏ywem zakoƒczenia doÊwiadczenia, np. niezdolnoÊç do picia wody lub spo˝ywania paszy (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). 1.3. Zasada metody badawczej Grupy zwierzàt jednej p∏ci nara˝ane sà wed∏ug procedury etapowej przy zastosowaniu ustalonych dawek 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (wyjàtkowo mo˝e byç brana pod uwag´ dodatkowa dawka 5000 mg/kg, zobacz pkt 1.6.2). Poziom dawki poczàtkowej jest wybierany na podstawie badania wst´pnego i jest to dawka, która powinna powodowaç wystàpienie pewnych objawów toksycznoÊci, jednak bez wystàpienia jej ostrych skutków lub ÊmiertelnoÊci. Objawy kliniczne i warunki powiàzane z wystàpieniem bólu, cierpienia i nieuchronnego padni´cia sà szczegó∏owo opisane w oddzielnych Wytycznych OECD (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Nast´pne grupy zwierzàt mogà byç nara˝ane na badanà substancj´ podawanà w wy˝szych lub ni˝szych ustalonych dawkach, w zale˝noÊci od wyst´powania lub niewyst´powania objawów toksycznoÊci lub ÊmiertelnoÊci. Procedura ta jest kontynuowana a˝ do podania substancji w dawce powodujàcej widoczne objawy toksycznoÊci lub do momentu, gdy stwierdzi si´ nie wi´cej ni˝ jeden przypadek padni´cia lub gdy w najwy˝szej dawce nie notuje si´ ˝adnych skutków, bàdê te˝ padni´cie wyst´puje w dawce najni˝szej. 1.4. Opis metody badawczej 1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝ mogà byç równie˝ stosowane inne gatunki gryzoni. W badaniach zazwyczaj u˝ywa si´ samic (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Jest to uzasadnione opisanymi w literaturze wynikami konwencjonalnych badaƒ s∏u˝àcych do okreÊlenia wartoÊci LD50, które wykazujà, ˝e zazwyczaj istnieje niewielka ró˝nica we wra˝liwoÊci pomi´dzy samcami a samicami gryzoni; a w tych przypadkach, w których obserwowane sà ró˝nice, samice sà na ogó∏ nieco bardziej wra˝liwe (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). Je˝eli wiedza o toksykologicznych lub toksykokinetycznych w∏aÊciwoÊciach strukturalnie podobnych substancji wskazuje na wi´ksze prawdopodobieƒstwo, ˝e samce mogà byç bardziej wra˝liwe, wówczas do badaƒ powinny byç u˝yte szczury tej p∏ci. Gdy badanie prowadzi si´ na samcach, nale˝y podaç wyraêne uzasadnienie. Poz. 2119 Stosowane powinny byç m∏ode, dojrza∏e, zdrowe osobniki powszechnie u˝ywanych ras laboratoryjnych. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne. Ka˝de zwierz´ na poczàtku doÊwiadczenia powinno byç w wieku 8 do 12 tygodni, a jego masa powinna zawieraç si´ w przedziale ±20 % Êredniej masy uprzednio nara˝anych zwierzàt. 1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Zwierz´ta mogà byç pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej dawki, ale liczba zwierzàt przypadajàcych na klatk´ nie mo˝e zak∏ócaç dok∏adnych obserwacji ka˝dego zwierz´cia. 1.4.3. Przygotowanie zwierzàt Zwierz´ta sà wybierane losowo, znakowane dla umo˝liwienia identyfikacji ka˝dego osobnika i w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzymywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´ciem podawania substancji. 1.4.4. Przygotowanie okreÊlonych dawek substancji i ich podawanie Zasadniczo substancje badane, niezale˝nie od dawki, powinny byç podawane w sta∏ej obj´toÊci poprzez zró˝nicowanie st´˝enia podawanego preparatu. Gdy bada si´ produkt koƒcowy w postaci ciek∏ej lub mieszanin´, wówczas zastosowanie nierozcieƒczonej badanej substancji, tj. w sta∏ym st´˝eniu, mo˝e byç bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre urz´dy dla nast´pujàcej w dalszej kolejnoÊci oceny ryzyka tej substancji. W ka˝dym z tych przypadków nie nale˝y przekraczaç maksymalnej obj´toÊci podawanej dawki. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia. U gryzoni obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia∏a, jednak˝e w przypadku roztworów wodnych mo˝na wziàç pod uwag´ obj´toÊç 2 ml/100 g masy cia∏a. O ile jest to tylko mo˝liwe, to w przypadku ró˝nych postaci (formulacji) podawanego preparatu zaleca si´ w pierwszej kolejnoÊci u˝ycie wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w nast´pnej kolejnoÊci wskazane sà roztwory/zawiesiny/emulsje w oleju (np.: oleju kukurydzianym), a w ostatecznoÊci roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny byç znane w∏asnoÊci toksykologiczne noÊników innych ni˝ woda. Podawane roztwory muszà byç przygotowane na krótko przed ich podaniem, chyba ˝e stabilnoÊç preparatu w okresie d∏u˝szym od okresu, w jakim przeprowadzono badanie, jest znana i akceptowalna. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16367 — 1.5. Sposób post´powania 1.5.1. Podawanie substancji Badana substancja jest podawana jednorazowo w pojedynczej dawce za pomocà sondy do˝o∏àdkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku gdy jednorazowe podanie ca∏ej dawki jest niemo˝liwe, mo˝e byç ona podana w porcjach, przy czym czas podania ca∏ej dawki nie mo˝e przekroczyç 24 godzin. Zwierz´ta przed podaniem badanej substancji powinny byç g∏odzone (np. w przypadku szczurów pozostawia si´ wod´, ale paszy nie podaje si´ w nocy; w przypadku myszy pozostawia si´ wod´, a paszy nie podaje si´ w okresie 3—4 godzin przed doÊwiadczeniem). Po okresie g∏odzenia nale˝y zwierz´ta zwa˝yç i podaç im badanà substancj´. Po podaniu substancji, w przypadku szczurów, pasz´ podaje si´ po up∏ywie 3—4 godzin, a w przypadku myszy po up∏ywie 1—2 godzin. Je˝eli substancje podaje si´ w porcjach w ciàgu pewnego okresu, wówczas w zale˝noÊci od d∏ugoÊci trwania tego okresu mo˝e okazaç si´ konieczne dostarczenie zwierz´tom wody i paszy. 1.5.2. Badanie wst´pne Celem badania wst´pnego jest ustalenie w∏aÊciwej dawki poczàtkowej stosowanej w badaniu w∏aÊciwym. Badana substancja jest podawana pojedynczym zwierz´tom w sposób sekwencyjny wed∏ug schematów zamieszczonych w Schemacie 1. Badanie wst´pne koƒczy si´, gdy mo˝na podjàç decyzj´ co do wyboru dawki poczàtkowej stosowanej w badaniu w∏aÊciwym lub gdy w najni˝szej ustalonej dawce obserwuje si´ padni´cie badanych zwierzàt. Dawka poczàtkowa do badania wst´pnego jest wybierana z ustalonych poziomów 5, 50, 300 i 2000 mg/kg jako dawka majàca spowodowaç widocznà toksycznoÊç, jeÊli mo˝na to przewidzieç na podstawie wyników badaƒ in vivo i in vitro tej samej substancji lub substancji podobnej strukturalnie. W przypadku braku takich informacji dawkà poczàtkowà b´dzie 300 mg/kg. Pomi´dzy nara˝aniem kolejnych zwierzàt powinien byç zachowany odst´p wynoszàcy przynajmniej 24 godziny. Wszystkie zwierz´ta powinny byç obserwowane przez przynajmniej 14 dni. W wyjàtkowych sytuacjach, usprawiedliwionych tylko szczególnymi wymaganiami prawnymi, mo˝na rozwa˝aç zastosowanie dodatkowej, wy˝szej dawki 5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). W celu zapobie˝enia nadmiernym cierpieniom zwierzàt nie jest zalecane badanie w zakresach Kategorii 5 wg GHS (dawki 2000 do 5000 mg/kg). Powinno byç ono brane pod uwag´ tylko wtedy, gdy istnieje du˝e prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takiego badania b´dà mia∏y istotne znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt. W przypadkach gdy badane zwierz´ nara˝one w badaniu wst´pnym na substancj´ w najni˝szej ustalonej dawce (5 mg/
kg)padnie, wskazanà procedurà Poz. 2119 jest zakoƒczenie badaƒ i przypisanie substancji do Kategorii 1 wg GHS (jak przedstawiono w Schemacie 1). Je˝eli wymagane jest dalsze potwierdzenie tej klasyfikacji, mo˝na przeprowadziç dodatkowà procedur´, nara˝ajàc drugie zwierz´ w dawce 5 mg/kg. Je˝eli i to zwierz´ padnie, wówczas potwierdza si´ zaklasyfikowanie substancji do Kategorii 1 wg GHS i natychmiast koƒczy badanie. Je˝eli drugie zwierz´ prze˝yje, wówczas nara˝ane sà maksymalnie trzy dodatkowe zwierz´ta w dawce 5 mg/kg. Ze wzgl´du na wysokie ryzyko ÊmiertelnoÊci, w celu zapobie˝enia zb´dnym cierpieniom, zwierz´ta powinny byç nara˝ane jedno po drugim. Odst´p czasowy pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach powinien byç wystarczajàcy do ustalenia, czy poprzednie zwierz´ mo˝e prze˝yç. Je˝eli padnie drugie zwierz´, natychmiast wstrzymuje si´ podawanie substancji w kolejnych dawkach, a badanie si´ koƒczy. Wystàpienie przypadku drugiego padni´cia (bez wzgl´du na liczb´ zwierzàt pozosta∏ych przy ˝yciu w momencie zakoƒczenia badania) powoduje zaklasyfikowanie substancji do wyniku A (2 lub wi´cej padni´ç), przestrzegana jest zasada klasyfikacji wg Schematu 2 w ustalonej dawce 5 mg/kg (Kategoria 1 — je˝eli wystàpi∏y 2 lub wi´cej przypadki padni´ç lub Kategoria 2 — je˝eli nie wystàpi∏ wi´cej ni˝ 1 przypadek padni´cia). Ponadto Schemat 3 przedstawia wytyczne co do klasyfikacji wed∏ug systemu UE obowiàzujàcego do czasu wdro˝enia systemu GHS. 1.5.3. Badanie w∏aÊciwe 1.5.3.1. Liczba zwierzàt i poziomy dawek Dzia∏ania, które nale˝y podjàç po badaniu wst´pnym, podane sà w Schemacie 2. Konieczne b´dzie dokonanie wyboru jednej z trzech mo˝liwoÊci: zaprzestanie badaƒ i przypisanie substancji do odpowiedniej klasy zagro˝enia, badanie w wy˝szej ustalonej dawce lub badanie w ni˝szej ustalonej dawce. Jednak˝e w celu oszcz´dzenia cierpieƒ zwierz´tom dawka powodujàca padni´cia w badaniu wst´pnym nie mo˝e byç powtarzana w badaniu w∏aÊciwym (zobacz Schemat 2). DoÊwiadczenie wykazuje, ˝e najbardziej prawdopodobnym wynikiem badania substancji w dawce poczàtkowej b´dzie mo˝liwoÊç sklasyfikowania jej i dalsze doÊwiadczenia nie b´dà konieczne. Dla ka˝dej badanej dawki nale˝y u˝yç pi´ciu zwierzàt jednej p∏ci. WÊród tych pi´ciu zwierzàt powinno znajdowaç si´ jedno zwierz´, któremu podawana by∏a substancja w odpowiednio ustalonej dawce w trakcie badania wst´pnego, oraz cztery dodatkowe zwierz´ta (z wyjàtkiem sytuacji, gdy dawka stosowana w badaniu g∏ównym nie by∏a stosowana w badaniu wst´pnym). Odst´p czasowy pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach jest okreÊlony przez pojawienie si´, czas trwania i nasilenie objawów toksycznoÊci. Badanie zwierzàt poprzez nara˝anie na substancj´ w kolejnej dawce powinno byç wstrzymane do czasu uzyskania pewnoÊci co do prze˝ycia uprzednio nara˝onych zwierzàt. Zalecany jest okres przerwy trwajàcy 3 do 4 dni pomi´dzy podawaniem substancji w kolej- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16368 — nych dawkach, aby umo˝liwiç zaobserwowanie objawów opóênionej toksycznoÊci. Odst´p czasowy powinien byç w∏aÊciwie dostosowany np. w przypadku niedajàcych si´ wyjaÊniç reakcji. Gdy pod uwag´ bierze si´ zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawki 5000 mg/kg, to powinna byç stosowana procedura podana w Kryteriach Klasyfikacji (zobacz tak˝e pkt 1.6.2.). 1.5.3.2. Badanie dawki granicznej Badanie dawek granicznych wykonywane jest w sytuacjach, gdy osoba przeprowadzajàca doÊwiadczenie posiada informacje, ˝e badany materia∏ jest prawdopodobnie nietoksyczny, tj. gdy przejawia on objawy toksycznoÊci w dawkach powy˝ej górnych, wymaganych przez prawo poziomów. Informacje o toksycznoÊci badanego materia∏u mogà pochodziç z badaƒ podobnych zwiàzków lub podobnych zarówno pod wzgl´dem to˝samoÊci sk∏adników, jak i sk∏adu procentowego produktów. W przypadku braku informacji o toksycznoÊci bàdê te˝ przypuszczeƒ, ˝e badany materia∏ jest toksyczny, nale˝y przeprowadziç badanie w∏aÊciwe. Stosujàc typowà procedur´ do badania wst´pnego z zastosowaniem dawki poczàtkowej 2000 mg/kg (lub wyjàtkowo 5000 mg/
kg)i nast´pnie badanie z wykorzystaniem czterech zwierzàt nara˝anych na substancj´ w dawce na tym samym poziomie, spe∏nia si´ wymagania badania dawki granicznej zgodne z opisanà procedurà. 1.6. Obserwacje Obserwacje nale˝y prowadziç dla ka˝dego pojedynczego zwierz´cia, przynajmniej raz podczas pierwszych 30 minut po podaniu badanej substancji i okresowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem szczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Obserwacj´ zwierzàt nale˝y przeprowadziç codziennie przez 14 dni, z wyjàtkiem przypadków, gdy muszà byç one usuwane z badania i w sposób humanitarny uÊmiercane lub gdy sà martwe. Okres obserwacji nie powinien byç jednak ustalony sztywno. Powinien byç okreÊlony przez objawy toksyczne, czas ich rozpocz´cia i d∏ugoÊç okresu powrotu do stanu normalnego i dlatego, gdy uzna si´ to za konieczne, mo˝e byç odpowiednio wyd∏u˝ony. Okresy pojawiania si´ i znikania objawów toksycznoÊci sà wa˝ne, szczególnie w przypadku istnienia tendencji do wystàpienia opóênienia objawów toksycznoÊci (zobacz pozycja 11 piÊmiennictwa). Wszystkie obserwacje nale˝y systematycznie zapisywaç, prowadzàc dla ka˝dego zwierz´cia osobne zapisy. Dodatkowe obserwacje b´dà konieczne, gdy zwierz´ta nadal przejawiajà objawy toksycznoÊci. Nale˝y obserwowaç zmiany na skórze i sierÊci, oczach i b∏onach Êluzowych, a tak˝e w uk∏adzie oddechowym, uk∏adzie krà˝enia, oÊrodkowym i autonomicznym uk∏adzie nerwowym oraz w aktywnoÊci somatomotorycznej i zachowaniu. Uwag´ nale˝y zwróciç na pojawienie si´ drgawek, konwulsji, Êlinotoku, biegunki, le- Poz. 2119 targu, snu i Êpiàczki. Pod uwag´ nale˝y braç zasady i kryteria podane w Humane Endpoints Guidance Document (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Zwierz´ta w agonii i wykazujàce objawy silnego cierpienia lub bólu powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercone. Dla zwierzàt uÊmiercanych lub martwych nale˝y mo˝liwie dok∏adnie zanotowaç czas padni´cia. 1.6.1. Masa cia∏a Masy cia∏a poszczególnych osobników powinny byç okreÊlone na krótko przed rozpocz´ciem podawania badanej substancji i nast´pnie powinny byç okreÊlone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy cia∏a powinny byç obliczone i zapisywane. Pod koniec badania zwierz´ta, które prze˝y∏y, nale˝y ponownie zwa˝yç i nast´pnie w sposób humanitarny je uÊmierciç. 1.6.2. Badania patologiczne Wszystkie zwierz´ta powinny byç poddane badaniom makroskopowym podczas sekcji (tak˝e te, które padnà podczas badania lub sà uÊmiercane z powodów humanitarnych). Nale˝y zanotowaç wszystkie zmiany patologiczne, które wystàpi∏y u ka˝dego zwierz´cia. Nale˝y wziàç pod uwag´ badania mikroskopowe narzàdów wykazujàcych zmiany patologiczne u zwierzàt prze˝ywajàcych 24 lub wi´cej godzin od poczàtku podawania badanej substancji, poniewa˝ mogà one dostarczyç u˝ytecznych informacji. 2. WYNIKI Nale˝y dostarczyç dane pochodzàce od ka˝dego zwierz´cia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane powinny byç zebrane w formie tabeli przedstawiajàcej dla ka˝dej badanej grupy: liczb´ u˝ytych zwierzàt, liczb´ zwierzàt przejawiajàcych objawy toksycznoÊci, liczb´ zwierzàt martwych i uÊmierconych podczas badania, czas padniecia poszczególnych zwierzàt, opis i czas wystàpienia objawów toksycznoÊci i odwracalnoÊci reakcji oraz wyniki sekcji. 3. SPRAWOZDANIE Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje: Badana substancja: — stan skupienia, czystoÊç, gdy ma to znaczenie, tak˝e w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomeryzacja), — dane identyfikacyjne, w tym numer CAS. NoÊnik (jeÊli jego u˝ycie by∏o konieczne): — uzasadnienie wyboru noÊnika, jeÊli nie by∏a nim woda. Badane zwierz´ta: — gatunek/szczep, Dziennik Ustaw Nr 251 — 16369 — — stan mikrobiologiczny zwierzàt, jeÊli jest znany, — liczba, wiek i p∏eç zwierzàt (w tym tak˝e uzasadnienie zastosowania samców zamiast samic), — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasza itp. Warunki doÊwiadczenia: — szczegó∏owe dane dotyczàce postaci (formulacji) badanej substancji, w tym stan skupienia podanego materia∏u, — szczegó∏owe dane dotyczàce sposobu podawania badanej substancji, w tym podawane obj´toÊci i czas podawania, — szczegó∏owe dane dotyczàce paszy i jakoÊci wody, w tym typ i êród∏o paszy, êród∏o wody, — podstawy wyboru dawki poczàtkowej. Wyniki: — uj´te w tabeli dane dla ka˝dego zwierz´cia i poziomu dawki (tj. zwierz´ta wykazujàce objawy toksycznoÊci ∏àcznie ze ÊmiertelnoÊcià, nasilenie i czas trwania objawów), — uj´te w tabeli dane dotyczàce masy cia∏a i jej zmian, — masa cia∏a poszczególnych zwierzàt w dniu podawania badanej substancji i nast´pnie w odst´pach tygodniowych oraz w dniu padni´cia bàdê uÊmiercenia, — data i czas padni´cia, — czas pojawienia si´ objawów toksycznoÊci i informacje, czy by∏y one odwracalne dla ka˝dego zwierz´cia, — jeÊli sà dost´pne, wyniki sekcji i wyniki badaƒ histopatologicznych ka˝dego zwierz´cia. Dyskusja i interpretacja wyników. Wnioski. 4. PIÂMIENNICTWO 1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity

(1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85—92. Poz. 2119 2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O.

(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279—291. 3) Van den Heuvel M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P.

(1990). The international validation of the fixed — dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol., 28, 469—482. 4) Whithead and Curnow, R.N.

(1992). Statistical evaluation of the fixed — dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313—324. 5) Stallard and Whitehead, A.

(1995). Reducing the numbers in the fixed — dose procedure. Human Exptl. Toxicol., 14, 315—323. 6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P.

(2000). Statistical evaluation of modifications to the fixed — dose procedure (manuscript in preparation). 7) OECD

(2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 8) OECD

(2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. 9) OECD

(1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ pages/home/displaygeneral/0,3380,ENdocuments-521-14-no-24-no-0,FF.html]. 10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L.,Springer, J.A. and Myers, R.C.

(1995). Comparison of the Up—and—Down, Conventional LD50, and Fixed—Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231. 11) Chan P.K and A.W. Hayes

(1994)Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA. SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WST¢PNEGO Dziennik Ustaw Nr 251 — 16370 — Poz. 2119 SCHEMAT 1: SCHEMAT BADANIA WST¢PNEGO Dziennik Ustaw Nr 251 — 16371 — Poz. 2119 SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA W¸AÂCIWEGO Dziennik Ustaw Nr 251 — 16372 — Poz. 2119 SCHEMAT 2: SCHEMAT BADANIA W¸AÂCIWEGO Dziennik Ustaw Nr 251 — 16373 — Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16374 — Poz. 2119 KRYTERIA KLASYFIKACJI KRYTERIA KLASYFIKACJI BADANYCH SUBSTANCJI ZE SPODZIEWANYMI WARTOÂCIAMI LD50 PRZEKRACZAJÑCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA Kryteria zagro˝enia Kategorii 5 sà przeznaczone dla identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej toksycznoÊci ostrej, które w pewnych okolicznoÊciach mogà stanowiç zagro˝enie dla wra˝liwej populacji. Przewiduje si´, ˝e substancje te wykazujà wartoÊç LD50 po podaniu do˝o∏àdkowym lub naskórnym w zakresie 2000 do 5000 mg/kg lub równowa˝ne dawki poprzez inne drogi nara˝enia. Substancje badane mogà byç zaklasyfikowane do klasy zagro˝enia wed∏ug klasyfikacji zdefiniowanej przez: 2000 mg/kg<LD50<5000 mg/kg (Kategoria 5 w GHS) w nast´pujàcych przypadkach:

a)je˝eli skierowane do tej kategorii przez schemat badawczy (Schemat 2) w oparciu o wyst´powanie ÊmiertelnoÊci,
b)je˝eli istniejà wiarygodne dowody, które wykazujà ˝e wartoÊç LD50 b´dzie mieÊci∏a si´ w zakresie Kategorii 5; lub inne badania na zwierz´tach lub skutki toksyczne u ludzi wskazujà ostre dzia∏anie na zdrowie ludzkie,
c)przez ekstrapolacj´, oszacowanie lub pomiar danych, je˝eli przypisanie do bardziej niebezpiecznej klasy nie jest gwarantowane i: — dost´pne sà wiarygodne informacje wskazujàce na znaczàce skutki toksyczne u ludzi lub — nie obserwuje si´ ÊmiertelnoÊci podczas badania a˝ do wartoÊci Kategorii 4 po podaniu drogà pokarmowà, lub — gdy opinia ekspertów potwierdza znaczàce objawy kliniczne toksycznoÊci, podczas badania a˝ do wartoÊci Kategorii 4, z wyjàtkiem biegunki, nastroszenia sierÊci lub nietypowego wyglàdu zewn´trznego, lub — gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne informacje wskazujàce potencja∏ znaczàcych ostrych objawów w innych badaniach na zwierz´tach. BADANIE W DAWKACH POWY˚EJ 2000 mg/kg W wyjàtkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko przez szczególne wymagania prawne, pod uwag´ brane mo˝e byç zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierzàt badanie dawki 5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno byç stosowane tylko wtedy, gdy istnieje du˝e prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takich badaƒ b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). Badanie wst´pne Zasady rzàdzàce procedurà etapowà podane w Schemacie 1 sà rozszerzone do poziomu dawki 5000 mg/kg. Stàd, jeÊli w badaniu wst´pnym stosuje si´ dawk´ poczàtkowà 5000 mg/l, to wynik A (padni´cie) b´dzie wymaga∏ drugiego zwierz´cia do badaƒ w dawce 2000 mg/kg, wyniki B i C (widoczne objawy toksycznoÊci lub brak objawów toksycznoÊci) pozwoli na wybór dawki 5000 mg/kg do badania w∏aÊciwego. Podobnie, jeÊli stosuje si´ innà dawk´ poczàtkowà ni˝ 5000 mg/kg, to wtedy badanie podà˝y do 5000 mg/kg w przypadku wyników B lub C w 2000 mg/kg; wynik A b´dzie dyktowa∏ dawk´ 2000 mg/kg do badania w∏aÊciwego, a wyniki B i C dawk´ 5000 mg/kg jako poczàtkowà do badania w∏aÊciwego. Badania w∏aÊciwe Zasady rzàdzàce procedurà etapowà podane w Schemacie 2 sà rozszerzone do poziomu dawki 5000 mg/kg. Stàd, jeÊli w badaniu wst´pnym stosuje si´ dawk´ poczàtkowà 5000 mg/kg, to wynik A (≥ 2 padni´cia) b´dzie wymaga∏ drugiej grupy do badaƒ w dawce 2000 mg/kg; wynik B (toksycznoÊç widoczna i/lub ≤ 1 padni´cie) lub C (brak objawów dzia∏ania toksycznego) spowoduje brak klasyfikacji substancji wed∏ug GHS. Podobnie, jeÊli stosuje si´ dawk´ poczàtkowà innà ni˝ 5000 mg/kg, to badanie podà˝y do 5000 mg/kg w przypadku wyniku C w 2000 mg/kg; nast´pnie wynik A 5000 mg/kg spowoduje przypisanie substancji do Kategorii 5 GHS, a wyniki B lub C spowodujà brak klasyfikacji substancji. METODA BADAWCZA B.1.bis — Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug schematu UE na okres przejÊciowy do pe∏nego wdro˝enia Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) SCHEMAT 3: Dziennik Ustaw Nr 251 — 16375 — Poz. 2119 METODA BADAWCZA B.1.bis — Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug schematu UE na okres przejÊciowy do pe∏nego wdro˝enia Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) SCHEMAT 3: Dziennik Ustaw Nr 251 — 16376 — Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16377 — Poz. 2119 Za∏àcznik nr 4 B.1.TRIS. TOKSYCZNOÂå OSTRA (PODANIE DROGÑ POKARMOWÑ) — METODA KLAS TOKSYCZNOÂCI OSTREJ 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 423

(2001). 1.

Wst´p Metoda klas toksycznoÊci ostrej (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa) jest etapowà procedurà, w której wykorzystuje si´ na ka˝dym etapie 3 zwierz´ta jednej p∏ci. W zale˝noÊci od ÊmiertelnoÊci i/lub stanu agonii zwierzàt konieczne mogà byç Êrednio 2—4 etapy dla ustalenia ostrej toksycznoÊci badanej substancji. Procedura ta jest odtwarzalna, wykorzystuje si´ ma∏à iloÊç zwierzàt. Umo˝liwia ona uszeregowanie substancji w sposób podobny, jak inne metody badania toksycznoÊci ostrej. Metoda klasy toksycznoÊci ostrej opiera si´ na szacunkach biometrycznych (zobacz pozycje 2, 3, 4 i 5 piÊmiennictwa) w ustalonych, odpowiednio rozdzielonych dawkach tak, aby umo˝liwiç zaszeregowanie substancji do odpowiedniej klasy i oceniç zagro˝enia. Metoda przyj´ta w 1996 r. poddana zosta∏a procesom walidacji in vivo w stosunku do danych wartoÊci LD50 uzyskanych z piÊmiennictwa krajowego (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa) i mi´dzynarodowego (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Wytyczne, co do wyboru najbardziej w∏aÊciwej metody badawczej s∏u˝àcej temu celowi, podane sà w Wytycznych ToksycznoÊci Ostrej po Podaniu Drogà Pokarmowà (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Dokument ten zawiera tak˝e dodatkowe informacje, dotyczàce przeprowadzenia badaƒ i ich interpretacji Metodà B.1.tris. Zasadà metody jest, aby nie podawaç substancji w dawkach, w stosunku do których jest pewnoÊç, ˝e powodujà znaczny ból i cierpienie z powodu ich ostrego dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego. Zwierz´ta w agonii lub w widoczny sposób cierpiàce bàdê te˝ wykazujàce oznaki silnego i trwa∏ego bólu powinny byç w humanitarny sposób uÊmiercone, a w interpretacji wyników powinny zostaç traktowane tak samo jak zwierz´ta, które pad∏y podczas badania. Kryteria podj´cia decyzji o uÊmierceniu zwierzàt w agonii lub cierpiàcych oraz wytyczne co do rozpoznawania przewidywanej lub nieuchronnej Êmierci sà przedmiotem osobnych Wytycznych (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). Metoda opiera si´ na zastosowaniu wczeÊniej ustalonych dawek oraz pozwala na uszeregowanie i sklasyfikowanie substancji zgodnie z zasadami Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) w zakresie klasyfikacji substancji chemicznych powodujàcych zatrucie ostre (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). W zasadzie metoda ta nie ma na celu wyznaczania dok∏adnych wartoÊci LD50, ale pozwala na okreÊlenie zdefiniowanych zakresów dawek, w których spodziewany jest Êmiertelny skutek z uwagi na fakt, ˝e padni´- cie cz´Êci zwierzàt wcià˝ jest podstawowym kryterium oceny tego badania. Metoda pozwala na wyznaczenie wartoÊci LD50 tylko wtedy, gdy przynajmniej dwie dawki powodujà ÊmiertelnoÊç wy˝szà ni˝ 0 % i ni˝szà ni˝ 100 %. Zastosowanie wczeÊniej ustalonych dawek, bez wzgl´du na badanà substancj´, z klasyfikacjà zwiàzanà wy∏àcznie z liczbà zwierzàt znajdujàcych si´ w ró˝nych stanach polepsza zgodnoÊç wyników uzyskanych w ró˝nych laboratoriach oraz ich powtarzalnoÊç. Przed przystàpieniem do badania wykonujàcy je powinien wziàç pod uwag´ wszystkie dost´pne informacje na temat badanej substancji. Do takich informacji zalicza si´ to˝samoÊç i budow´ chemicznà substancji, jej w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, wyniki innych badaƒ toksykologicznych in vitro lub in vivo, dane toksykologiczne dla substancji o podobnej budowie chemicznej oraz przewidywane zastosowanie(a) tej substancji. Takie informacje sà konieczne w celu przekonania wszystkich zainteresowanych, ˝e badanie jest odpowiednie dla ochrony zdrowia ludzkiego i odpowiednie do w∏aÊciwego wyboru dawki poczàtkowej. 1.
Definicje ToksycznoÊç ostra po podaniu drogà pokarmowà: oznacza wszystkie szkodliwe skutki, które wyst´pujà po podaniu substancji drogà pokarmowà w pojedynczej dawce lub w wielu dawkach, podanych w czasie 24 godzin. Zgon opóêniony: oznacza, ˝e zwierz´ nie pada lub nie znajduje si´ w stanie agonii w czasie 48 godzin od podania badanej substancji, ale pada póêniej w czasie 14-dniowego okresu obserwacji. Dawka: jest iloÊcià badanej substancji podanej zwierz´ciu. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ badanej substancji przypadajàcà na jednostk´ masy cia∏a zwierz´cia (np. mg/kg). GHS: Âwiatowy System Zharmonizowany. Wspólne przedsi´wzi´cie OECD (zdrowie i Êrodowisko), Komitetu Ekspertów ONZ ds. Transportu Towarów Niebezpiecznych (w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne), ILO (informacja o zagro˝eniach) i koordynowane przez Mi´dzyorganizacyjny Program Zarzàdzania Chemikaliami (IOMC). Nieuchronny zgon: oznacza spodziewany stan agonii lub zgon po przed∏u˝eniu czasu obserwacji. Do objawów mogàcych wskazywaç na taki stan u gryzoni zalicza si´ konwulsje, po∏o˝enie boczne, pozycj´ le˝àcà i drgawki (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Human Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). LD50 (medialna dawka Êmiertelna): jest statystycznie obliczonà pojedynczà dawkà substancji, która spo- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16378 — woduje zgon 50 % zwierzàt po podaniu drogà pokarmowà. WartoÊç LD50 jest wyra˝ana w postaci masy badanej substancji przypadajàcej na jednostk´ masy badanego zwierz´cia (mg/kg). Dawka graniczna: odnosi si´ do górnego ograniczenia dawki w badaniu (2000 lub 5000 mg/kg). Stan agonii: stan umierania lub niezdolnoÊci do prze˝ycia pomimo prowadzenia post´powania leczniczego (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 9 pismiennictwa). Prognozowany zgon: wyst´powanie objawów klinicznych Êwiadczàcych o zgonie w przewidywalnym okresie w przysz∏oÊci przed up∏ywem zakoƒczenia doÊwiadczenia, np. niezdolnoÊç do picia wody lub spo˝ywania paszy (bardziej szczegó∏owy opis mo˝na znaleêç w Humane Endpoints Guidance Document, zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). 1.
Zasada metody badawczej Zasadà badania zaplanowanego jako etapowe i w którym stosuje si´ minimalnà liczb´ zwierzat w poszczególnym etapach jest otrzymanie wystarczajàcej informacji o toksycznoÊci ostrej badanej substancji, która umo˝liwia klasyfikacj´ tej substancji. Substancj´, w iloÊci równej jednej z wybranych dawek, podaje si´ drogà pokarmowà grupie zwierzàt doÊwiadczalnych. Substancj´ bada si´ stopniowo, przy czym na ka˝dym poziomie doÊwiadczenia stosuje si´ 3 zwierz´ta tej samej p∏ci (zazwyczaj samice). Wystàpienie na którymkolwiek etapie zwiàzanym z nara˝eniem na danà substancj´ skutku Êmiertelnego lub jego brak warunkuje podj´cie dalszych badaƒ, np.: — nie ma potrzeby wykonywania dalszych badaƒ, — nale˝y podaç t´ samà dawk´ substancji trzem dodatkowym zwierz´tom, — nale˝y podaç nast´pnà wy˝szà lub poprzedzajàcà ni˝szà dawk´ substancji trzem dodatkowym zwierz´tom. Szczegó∏y procedury opisane sà w Schemacie
Metoda pozwala na zaklasyfikowanie badanej substancji do jednej z klas toksycznoÊci okreÊlonych przez ustalone wartoÊci graniczne LD
1.
Opis metody badawczej 1.4.
Wybór gatunku zwierzàt Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝ mogà byç równie˝ stosowane inne gatunki gryzoni. W badaniach zazwyczaj u˝ywa si´ samic (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa). Jest to uzasadnione opisanymi w literaturze wynikami konwencjonalnych badaƒ s∏u˝àcych do okreÊlenia wartoÊci LD50, które wykazujà, ˝e zazwyczaj istnieje niewielka ró˝nica we wra˝liwoÊci pomi´dzy samcami a samicami gryzoni; a w tych przypadkach, w których obserwowane sà ró˝nice, samice Poz. 2119 sà na ogó∏ nieco bardziej wra˝liwe (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). Je˝eli wiedza o toksykologicznych lub toksykokinetycznych w∏aÊciwoÊciach strukturalnie podobnych substancji wskazuje na wi´ksze prawdopodobieƒstwo, ˝e samce mogà byç bardziej wra˝liwe, wówczas do badaƒ powinny byç u˝yte szczury tej p∏ci. Gdy badanie prowadzi si´ na samcach, nale˝y podaç wyraêne uzasadnienie. Stosowane powinny byç m∏ode, dojrza∏e, zdrowe osobniki powszechnie u˝ywanych ras laboratoryjnych. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne. Ka˝de zwierz´ na poczàtku doÊwiadczenia powinno byç w wieku 8 do 12 tygodni, a jego masa powinna zawieraç si´ w przedziale ±20 % Êredniej masy uprzednio nara˝anych zwierzàt. 1.4.
Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powina byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Zwierz´ta mogà byç pogrupowane w klatkach wg otrzymywanej dawki, ale liczba zwierzàt przypadajàcych na klatk´ nie mo˝e zak∏ócaç dok∏adnych obserwacji ka˝dego zwierz´cia. 1.4.
Przygotowanie zwierzàt Zwierz´ta sà wybierane losowo, znakowane dla umo˝liwienia identyfikacji ka˝dego osobnika i w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych przetrzymywane w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´ciem podawania substancji. 1.4.
Przygotowanie okreÊlonych dawek substancji i ich podawanie Zasadniczo substancje badane, niezale˝nie od dawki, powinny byç podawane w sta∏ej obj´toÊci poprzez zró˝nicowanie st´˝enia podawanego preparatu. Gdy bada si´ produkt koƒcowy w postaci ciek∏ej lub mieszanin´, wówczas zastosowanie nierozcieƒczonej badanej substancji, tj. w sta∏ym st´˝eniu, mo˝e byç bardziej odpowiednie i wymagane przez niektóre urz´dy dla nast´pujàcej w dalszej kolejnoÊci oceny ryzyka tej substancji. W ka˝dym z tych przypadków nie nale˝y przekraczaç maksymalnej obj´toÊci podawanej dawki. Maksymalna obj´toÊç cieczy, która mo˝e byç podana jednorazowo, zale˝y od rozmiarów zwierz´cia. U gryzoni obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia∏a, jednak˝e w przypadku roztworów wodnych mo˝na wziàç pod uwag´ obj´toÊç 2 ml/100 g masy cia∏a. O ile jest to tylko mo˝liwe, to w przypadku ró˝nych postaci (formulacji) podawanego preparatu zaleca si´ w pierwszej kolejnoÊci u˝ycie wodnych roztworów/zawiesin/emulsji, a w nast´pnej kolejnoÊci wskazane sà roztwory/zawiesiny/emulsje w oleju (np. oleju kukurydzianym), a w ostatecznoÊci Dziennik Ustaw Nr 251 — 16379 — Poz. 2119 roztwory w innych rozpuszczalnikach. Powinny byç znane w∏asnoÊci toksykologiczne noÊników innych ni˝ woda. Podawane roztwory muszà byç przygotowane na krótko przed ich podaniem, chyba ˝e stabilnoÊç preparatu w okresie d∏u˝szym od okresu, w jakim przeprowadzono badanie, jest znana i akceptowalna. Klasyfikacji). Dla dobra zwierzàt odradza si´ badanie w zakresie Kategorii 5 wg GHS (2000 do 5000 mg/kg). Powinno byç ono brane pod uwag´ tylko wówczas, gdy istnieje wysokie prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takiego badania b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt. 1.
Sposób post´powania 1.5.
Badanie dawki granicznej 1.5.
Podawanie substancji Badanie dawek granicznych wykonywane jest w sytuacjach, gdy osoba przeprowadzajàca doÊwiadczenie posiada informacje, ˝e badany materia∏ jest prawdopodobnie nietoksyczny, tj. gdy przejawia on objawy toksycznoÊci w dawkach powy˝ej górnych, wymaganych przez prawo poziomów. Informacje o toksycznoÊci badanego materia∏u mogà pochodziç z badaƒ podobnych zwiàzków lub podobnych zarówno pod wzgl´dem sk∏adu jakoÊciowego i iloÊciowego produktów. W przypadku braku informacji o toksycznoÊci bàdê te˝ przypuszczeƒ, ˝e badany materia∏ jest toksyczny, nale˝y przeprowadziç badanie w∏aÊciwe. Badana substancja jest podawana jednorazowo w pojedynczej dawce za pomocà sondy do˝o∏àdkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W przypadku gdy jednorazowe podanie ca∏ej dawki jest niemo˝liwe mo˝e byç ona podana w porcjach, przy czym czas podania ca∏ej dawki nie mo˝e przekroczyç 24 godzin. Zwierz´ta przed podaniem badanej substancji powinny byç g∏odzone (np.: w przypadku szczurów nale˝y g∏odziç je na noc przed badaniem, a w przypadku myszy nale˝y g∏odziç je na 3—4 godziny przed badaniem). Nie nale˝y wstrzymywaç podawania wody. Po okresie g∏odzenia zwierz´ta powinny byç zwa˝one, a nast´pnie nale˝y podaç im badanà substancj´. Po jej podaniu paszy nie powinno si´ podawaç zwierz´tom przez 3—4 godziny w przypadku szczurów, a 1—2 godziny w przypadku myszy. Gdy badana substancja jest podawana w kilku porcjach, mo˝e ze wzgl´du na d∏ugoÊç okresu nara˝ania okazaç si´ konieczne dostarczenie zwierz´tom paszy i wody w trakcie nara˝ania. Badanie dawek granicznych mo˝e byç wykonane na szeÊciu zwierz´tach (trzy zwierz´ta w ka˝dym etapie) przy zastosowaniu jednej dawki 2000 mg/kg masy cia∏a. W sytuacjach wyjàtkowych badanie graniczne mo˝e byç wykonane na trzech zwierz´tach przy u˝yciu substancji w dawce 5000 mg/kg (Kryteria Klasyfikacji). Je˝eli nara˝enie na badanà substancj´ spowoduje wystàpienie ÊmiertelnoÊci, to mo˝e okazaç si´ konieczne wykonanie dalszego badania dla kolejnej, ni˝szej dawki. 1.5.
Liczba zwierzàt i poziomy dawek 1.
Obserwacje W ka˝dym etapie badania stosuje si´ trzy zwierz´ta. Dawka, która ma byç podana jako poczàtkowa, jest wybierana z czterech ustalonych poziomów: 5, 50, 300 i 2000 mg/kg masy cia∏a. Dawkà poczàtkowà powinna byç ta, która w sposób najbardziej prawdopodobny spowoduje ÊmiertelnoÊç u niektórych nara˝anych zwierzàt. Schemat 1 przedstawia sposób post´powania dla ka˝dej dawki poczàtkowej. Ponadto Schemat 4 przedstawia wytyczne co do klasyfikacji wed∏ug systemu UE obowiàzujàcego do czasu wdro˝enia systemu GHS. Obserwacje nale˝y prowadziç dla ka˝dego pojedynczego zwierz´cia, przynajmniej raz podczas pierwszych 30 minut po podaniu badanej substancji i okresowo podczas pierwszych 24 godzin, ze zwróceniem szczególnej uwagi podczas pierwszych 4 godzin. Obserwacj´ zwierzàt nale˝y przeprowadziç codziennie przez 14 dni, z wyjàtkiem przypadków, gdy muszà byç one usuwane z badania i w sposób humanitarny uÊmiercane lub gdy sà martwe. Okres obserwacji nie powinien byç jednak ustalony sztywno. Powinien byç okreÊlony przez reakcje toksyczne, czas ich rozpocz´cia i d∏ugoÊç okresu powrotu do stanu normalnego i dlatego, gdy uzna si´ to za konieczne, mo˝e byç odpowiednio wyd∏u˝ony. Okresy pojawiania si´ i znikania objawów toksycznoÊci sà wa˝ne, szczególnie w przypadku istnienia tendencji do wystàpienia opóênionych objawów toksycznoÊci (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa). Wszystkie obserwacje nale˝y systematycznie zapisywaç, prowadzàc dla ka˝dego zwierz´cia osobne zapisy. Gdy dost´pne dane sugerujà, ˝e ÊmiertelnoÊç prawdopodobnie nie wystàpi w najwy˝szej z dawek poczàtkowych (2000 mg/kg masy cia∏a), wówczas powinno byç wykonane badanie dla dawek granicznych. Gdy dla badanej substancji brak jest jakichkolwiek informacji, to dla dobra zwierzàt zaleca si´ stosowanie dawki 300 mg/kg masy cia∏a jako dawki poczàtkowej. Odst´py czasowe pomi´dzy podawaniem substancji w kolejnych dawkach sà okreÊlone przez pojawienie si´, czas trwania i nasilenie objawów toksycznoÊci. Badanie zwierzàt przez nara˝anie na substancj´ w kolejnej dawce powinno byç wstrzymane do czasu uzyskania pewnoÊci co do prze˝ycia uprzednio nara˝onych zwierzàt. Wyjàtkowo i tylko w przypadkach uzasadnionych wymaganiami prawnymi mo˝e byç brane pod uwag´ zastosowanie dawki 5000 mg/kg masy cia∏a (Kryteria Dodatkowe obserwacje b´dà konieczne, gdy zwierz´ta nadal przejawiajà objawy toksycznoÊci. Nale˝y obserwowaç zmiany na skórze i sierÊci, oczach i b∏onach Êluzowych, a tak˝e w uk∏adzie oddechowym, uk∏adzie krà˝enia, oÊrodkowym i autonomicznym uk∏adzie nerwowym oraz w aktywnoÊci somatomotorycznej i zachowaniu. Uwag´ nale˝y zwróciç na pojawienie si´ drgawek, konwulsji, Êlinotoku, biegunki, letargu, snu i Êpiàczki. Pod uwag´ nale˝y braç zasady i kryteria podane w Humane Endpoints Guidance Do- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16380 — cument (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). Zwierz´ta w agonii i wykazujàce objawy silnego cierpienia lub bólu powinny byç w sposób humanitarny uÊmiercone. Dla zwierzàt uÊmiercanych lub martwych nale˝y mo˝liwie dok∏adnie zanotowaç czas padni´cia. 1.6.
Masa cia∏a Masy cia∏a poszczególnych osobników powinny byç okreÊlone na krótko przed rozpocz´ciem podawania badanej substancji i nast´pnie powinny byç okreÊlone przynajmniej raz w tygodniu. Zmiany masy cia∏a powinny byç obliczone i zapisywane. Pod koniec badania zwierz´ta, które prze˝y∏y, nale˝y ponownie zwa˝yç i nast´pnie w sposób humanitarny uÊmierciç. 1.6.
Badania patologiczne Wszystkie zwierz´ta powinny byç poddane badaniom makroskopowym podczas sekcji (tak˝e te, które padnà podczas badania lub sà uÊmiercane z powodów humanitarnych). Nale˝y zanotowaç wszystkie zmiany patologiczne, które wystàpi∏y u ka˝dego zwierz´cia. Nale˝y wziàç pod uwag´ badania mikroskopowe narzàdów wykazujàcych zmiany patologiczne u zwierzàt prze˝ywajàcych 24 lub wi´cej godzin od poczàtku podawania badanej substancji, poniewa˝ mogà one dostarczyç u˝ytecznych informacji.
WYNIKI Nale˝y dostarczyç dane pochodzàce od ka˝dego zwierz´cia indywidualnie. Dodatkowo wszystkie dane powinny byç zebrane w formie tabeli przedstawiajàcej dla ka˝dej badanej grupy: liczb´ u˝ytych zwierzàt, liczb´ zwierzàt przejawiajàcych objawy toksycznoÊci, liczb´ zwierzàt martwych i uÊmierconych podczas badania, czas zgonu poszczególnych zwierzàt, opis i czas wystàpienia objawów toksycznoÊci i odwracalnoÊci reakcji oraz wyniki sekcji.
SPRAWOZDANIE Sprawozdanie powinno zawieraç nast´pujàce informacje: Badana substancja: — stan skupienia, czystoÊç, gdy ma to znaczenie, tak˝e w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (w tym izomeryzacja), — dane identyfikacyjne, w tym numer CAS. NoÊnik (jeÊli jego u˝ycie by∏o konieczne): — uzasadnienie wyboru noÊnika, jeÊli nie by∏a nim woda. Badane zwierz´ta: — gatunek/szczep, — stan mikrobiologiczny zwierzàt, jeÊli jest znany, — liczba, wiek i p∏eç zwierzàt (w tym tak˝e uzasadnienie zastosowania samców zamiast samic), — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasza itp. Poz. 2119 Warunki doÊwiadczenia: — szczegó∏owe dane dotyczàce postaci (formulacji) badanej substancji, w tym stan skupienia podanego materia∏u, — szczegó∏owe dane dotyczàce sposobu podawania badanej substancji, w tym podawane obj´toÊci i czas podawania, — szczegó∏owe dane dotyczàce paszy i jakoÊci wody (w tym typ i êród∏o paszy, êród∏o wody), — podstawy wyboru dawki poczàtkowej. Wyniki: — uj´te w tabeli dane dla ka˝dego zwierz´cia i poziomu dawki (tj. zwierz´ta wykazujàce objawy toksycznoÊci ∏àcznie z ÊmiertelnoÊcià, nasilenie i czas trwania skutków), — uj´te w tabeli dane dotyczàce masy cia∏a i jej zmian, — masa cia∏a poszczególnych zwierzàt w dniu podawania badanej substancji i nast´pnie w odst´pach tygodniowych oraz w dniu padni´cia bàdê uÊmiercenia, — data i czas padni´cia, — czas pojawienia si´ objawów toksycznoÊci i informacje, czy by∏y one odwracalne dla ka˝dego zwierz´cia, — jeÊli sà dost´pne, wyniki sekcji i wyniki badaƒ histopatologicznych ka˝dego zwierz´cia. Dyskusja i interpretacja wyników. Wnioski.
PIÂMIENNICTWO 1) Roll et al.

(1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett. Suppl., 31, 86. 2) Roll et al.

(1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxicitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt, 32, 336—341. 3) Diener et al.

(1994). The biometric Evaluation of the Acute Toxic Class Method (Orla). Arch. Toxicol., 68, 559—610. 4) Diener et al.

(1995). The biometric evaluation of the OECD modified version of the acute toxic class method (oral). Arch. Toxicol. 69, 729—734. 5) Diener et al.

(1999). Acute toxicity class methods: alterations to LD/LC50 tests. ALTEX 16, 129—134. 6) Schlede et al.

(1992). A national validation study of the acute toxicity class method — an alternative to the LD50 test. Arch. Toxicol. 66, 455—470. 7) Schlede et al.

(1994). The international validation study of the acute toxicity class method (oral). Arch. Toxicol. 69, 659—670. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16381 — 8) OECD

(2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series in Testing and Assessment No 24. Paris. SCHEMAT 1 9) OECD

(2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as human endpoints for experimental animals used in safety evaluations. Environmental Health and Safety Monograph Series in Testing and Assessment No 19. UWAGI OGÓLNE 10) OECD

(1998). Harmonized integrated hazard classification for human health and environmental effects of chemical substances. 11) Lipnick et al.

(1995). Comparison of the up — and — down, conventional LD50 and fixed — dose acute toxicity procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223—231. 12) Chan et al.

(1994). Chapter 16, Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology, 3rd ed. A.Hayes editor, Raven Press, Ltd. New York, USA. Poz. 2119 PROCEDURA POST¢POWANIA W PRZYPADKU KA˚DEJ Z DAWEK POCZÑTKOWYCH Dla ka˝dej dawki poczàtkowej podj´te powinny byç nast´pujàce post´powania, wed∏ug niniejszego Schematu, odpowiednio: — Schemat 1a: dawkà poczàtkowà jest 5 mg/kg masy cia∏a, — Schemat 1b: dawkà poczàtkowà jest 50 mg/kg masy cia∏a, — Schemat 1c: dawkà poczàtkowà jest 300 mg/kg masy cia∏a, — Schemat 1d: dawkà poczàtkowà jest 2000 mg/kg masy cia∏a. W zale˝noÊci od liczby zwierzàt uÊmierconych w sposób humanitarny lub zwierzàt martwych, kolejny etap post´powania wskazujà strza∏ki. SCHEMAT 1A: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 5 MG/KG MASY CIA¸A Dziennik Ustaw Nr 251 — 16382 — SCHEMAT 1B: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 50 MG/KG MASY CIA¸A Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16383 — SCHEMAT 1C: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 300 MG/KG MASY CIA¸A Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16384 — SCHEMAT 1D: SPOSÓB POST¢POWANIA PRZY DAWCE POCZÑTKOWEJ 2000 MG/KG MASY CIA¸A Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16385 — Poz. 2119 KRYTERIA KLASYFIKACJI KRYTERIA KLASYFIKACJI BADANYCH SUBSTANCJI ZE SPODZIEWANYMI WARTOÂCIAMI LD50 PRZEKRACZAJÑCYMI 2000 mg/kg BEZ POTRZEBY BADANIA Kryteria zagro˝enia Kategorii 5 sà przeznaczone dla identyfikacji substancji o stosunkowo niskiej toksycznoÊci ostrej, ale w pewnych okolicznoÊciach mogà one stanowiç zagro˝enie dla wra˝liwej populacji. Przewiduje si´, ˝e substancje te majà doustne lub skórne LD50 w zakresie 2000 do 5000 mg/kg lub równowa˝ne dawki poprzez inne drogi nara˝enia. Substancje badane mogà byç zaklasyfikowane do klasy zagro˝enia wed∏ug klasyfikacji zdefiniowanej przez: 2000 mg/kg<LD50<5000 mg/kg (Kategoria 5 w GHS) w nast´pujàcych przypadkach:

a)je˝eli skierowane do tej kategorii przez schemat badawczy (Schematy 1a—1d) w oparciu o wyst´powanie ÊmiertelnoÊci,
b)je˝eli istniejà wiarygodne dowody, które wykazujà, ˝e LD50 b´dzie w zakresie Kategorii 5; lub inne badania na zwierz´tach lub skutki toksyczne u ludzi wskazujà ostre dzia∏anie na zdrowie ludzkie,
c)przez ekstrapolacj´, oszacowanie lub pomiar danych, je˝eli przypisanie do bardziej niebezpiecznej klasy nie jest gwarantowane i: — dost´pne sà wiarygodne informacje wskazujàce na znaczàce objawy toksycznoÊci u ludzi lub — nie obserwuje si´ ÊmiertelnoÊci podczas badania a˝ do wartoÊci Kategorii 4 po podaniu drogà pokarmowà, lub — gdy opinia ekspertów potwierdza znaczàce objawy kliniczne toksycznoÊci, podczas badania a˝ do wartoÊci Kategorii 4, z wyjàtkiem biegunki, nastroszenia sierÊci lub niedobrego wyglàdu zewn´trznego, lub — gdy opinia ekspertów potwierdza wiarygodne informacje wskazujàce potencja∏ znaczàcych ostrych objawów w innych badaniach na zwierz´tach. BADANIE W DAWKACH POWY˚EJ 2000 mg/kg W wyjàtkowych sytuacjach, uzasadnionych tylko przez szczególne wymagania prawne, pod uwag´ mo˝e byç brane zastosowanie najwy˝szej ustalonej dawki 5000 mg/kg. Dla dobra zwierzàt badanie dawki 5000 mg/kg nie jest zalecane i powinno byç stosowane tylko gdy istnieje silne prawdopodobieƒstwo, ˝e wyniki takich badaƒ b´dà mia∏y bezpoÊrednie znaczenie dla ochrony zdrowia ludzi i zwierzàt (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). Gdy wymagane jest badanie dawki 5000 mg/kg, prowadzi si´ tylko jeden etap (tj. trzy zwierz´ta b´dà stosowane). Je˝eli pierwsze zadawkowane zwierz´ padnie, dalsze dawkowanie nast´puje w 2000 mg/kg zgodnie z procedurà wed∏ug Schematu 1. Je˝eli pierwsze zwierz´ prze˝yje, to dawkowane sà dwa dalsze zwierz´ta. Je˝eli tylko jedno z trzech zwierzàt padnie, to LD50 prawdopodobnie przekracza 5000 mg/kg. Je˝eli zginà dwa osobniki, to dawkowanie przechodzi do poziomu 2000 mg/kg. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16386 — Poz. 2119 SCHEMAT 2: METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) Dziennik Ustaw Nr 251 — 16387 — Poz. 2119 SCHEMAT 2 (kontynuowany): METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) Dziennik Ustaw Nr 251 — 16388 — Poz. 2119 SCHEMAT 2 (kontynuowany): METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) Dziennik Ustaw Nr 251 — 16389 — Poz. 2119 SCHEMAT 2 (kontynuowany): METODA BADAWCZA B.1.tris: Przewodnik do klasyfikacji wed∏ug systemu UE na okres przejÊciowy przed pe∏nym wdro˝eniem Âwiatowego Systemu Zharmonizowanego (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa) Dziennik Ustaw Nr 251 — 16390 — Poz. 2119 Za∏àcznik nr 5 B.4. TOKSYCZNOÂå OSTRA: DZIA¸ANIE DRA˚NIÑCE/˚RÑCE NA SKÓR¢ 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 404

(2002). 1.

Wst´p Podczas opracowywania niniejszej metody szczególnà uwag´ zwrócono na mo˝liwoÊç jej ulepszenia, bioràc pod uwag´ dobro zwierzàt i oszacowanie wszystkich istniejàcych informacji dotyczàcych badanej substancji w celu unikni´cia zb´dnych badaƒ na zwierz´tach laboratoryjnych. W metodzie tej przed podj´ciem badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego badanej substancji na skór´ in vivo zaleca si´ wykonanie oceny wagi dowodów istniejàcych danych. Je˝eli sà dost´pne niepe∏ne dane, to mogà byç one uzupe∏nione przez zastosowanie badania sekwencyjnego (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Strategia badawcza zawiera wykonanie zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro, a przedstawiona jest ona w Schemacie za∏àczonym do niniejszej metody. Ponadto zaleca si´, je˝eli to w∏aÊciwe, sekwencyjne a nie jednoczesne stosowanie trzech pól do przeprowadzenia testów p∏atkowych na zwierz´ciu we wst´pnym badaniu in vivo. Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe jak i dobro zwierzàt, nie nale˝y wykonywaç badaƒ in vivo, przed przeprowadzeniem analizy wagi dowodów wszystkich dost´pnych danych istotnych dla identyfikacji potencjalnego dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji na skór´. Dane takie powinny zawieraç dowody otrzymane w badaniach wykonanych u ludzi i na zwierz´tach laboratoryjnych, dowody o dzia∏aniu ˝ràcym/dra˝niàcym jednej lub wi´cej podobnych strukturalnie substancji lub mieszanin takich substancji, dane wskazujàce na silnà kwasowoÊç lub zasadowoÊc substancji (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa), a tak˝e wyniki zwalidowanych i akceptowanych badaƒ wykonanych w warunkach in vitro lub ex vivo (zobacz pozycje 4, 5 i 6 piÊmiennictwa). Taka analiza powinna ograniczyç potrzeby wykonywania w warunkach in vivo oceny dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w przypadku substancji, dla których ju˝ zebrano wystarczajàce dowody z innych badaƒ tych dwóch kierunków dzia∏ania toksycznego. Zalecana strategia badania etapowego, obejmujàca przeprowadzenie badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego za pomocà zwalidowanych i akceptowanych metod in vitro lub ex vivo, jest do∏àczona w formie Schematu stanowiàcego dodatek do niniejszej metody. Strategia ta zosta∏a opracowana i jednomyÊlnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa) oraz przyj´ta jako zalecana strategia badawcza w Âwiatowym Systemie Zharmonizowanym (GHS) (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Zaleca si´, by ww. strategia badawcza by∏a podj´ta przed wykonaniem badania in vivo. W celu uzyskania danych o przes∏ankach naukowych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego dla nowych substancji zale- ca si´ sposób badania etapowego. Dla substancji istniejàcych o niewystarczajàcych danych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ strategi´ t´ nale˝y stosowaç dla uzupe∏nienia brakujàcych danych. Zastosowanie innej strategii badawczej lub sposobu post´powania bàdê te˝ podj´cie decyzji o niestosowaniu etapowego sposobu badania musi byç uzasadnione. Je˝eli za pomocà analizy wagi dowodów nie mo˝na ustaliç, czy dana substancja posiada w∏aÊciwoÊci dra˝niàce lub ˝ràce, to wówczas, zgodnie ze strategià etapowego badania, nale˝y podjàç decyzj´ o przeprowadzeniu badania in vivo (zobacz Schemat). 1.
Definicje Dzia∏anie dra˝niàce na skór´: jest to wywo∏anie odwracalnego uszkodzenia skóry w czasie do 4 godzin po na∏o˝eniu badanej substancji. Dzia∏anie ˝ràce na skór´: jest to wywo∏anie nieodwracalnych uszkodzeƒ skóry; w postaci widocznej martwicy naskórka i skóry w czasie do 4 godzin po na∏o˝eniu badanej substancji. Dzia∏anie ˝ràce charakteryzuje si´ wrzodami, krwawieniem, krwawymi strupami i na koƒcu 14-dniowego okresu obserwacji odbarwieniem powodowanym ∏uszczeniem si´ skóry, ca∏kowitym miejscowym wy∏ysieniem oraz bliznami. Dla oceny wàtpliwych uszkodzeƒ nale˝y uwzgl´dniç badania histopatologiczne. 1.
Zasada metody badawczej Badanà substancj´ nanosi si´ w pojedynczej dawce na skór´ zwierz´cia doÊwiadczalnego; nienara˝ane pola skóry zwierz´cia doÊwiadczalnego s∏u˝à jako kontrola. W celu uzyskania ca∏kowitej oceny skutków stopieƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego jest odczytywany i punktowany w ustalonych odst´pach czasu, a nast´pnie opisywany. Czas trwania badania powinien byç wystarczajàcy dla oceny odwracalnoÊci lub nieodwracalnoÊci obserwowanych skutków. Zwierz´ta wykazujàce ciàg∏e oznaki ci´˝kiego wstrzàsu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badaƒ muszà byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a dzia∏anie substancji odpowiednio oszacowane. Kryteria podj´cia decyzji o humanitarnym uÊmierceniu zwierzàt w stanie agonii lub silnie cierpiàcych mo˝na znaleêç w piÊmiennictwie (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). 1.
Opis metody badawczej 1.4.
Przygotowanie do badania in vivo 1.4.1.
Wybór gatunku badanego Zalecanym gatunkiem jest królik albinotyczny; stosowaç nale˝y zdrowe, m∏ode dojrza∏e króliki. W przypadku stosowania innych gatunków nale˝y podaç uzasadnienie. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16391 — 1.4.1.
Przygotowanie zwierzàt Oko∏o 24 godziny przed na∏o˝eniem substancji nale˝y usunàç sierÊç przez krótkie strzy˝enie cz´Êci grzbietowej tu∏owia zwierzàt. Nale˝y zwróciç uwag´, by nie uszkodziç skóry; w badaniu mogà byç stosowane jedynie zwierz´ta ze zdrowà, nienaruszonà skórà. Niektóre odmiany królików posiadajà pola g´stej sierÊci, które uwidaczniajà si´ bardziej w niektórych porach roku. Takich pól z g´stà sierÊcià nie nale˝y wybieraç jako miejsca do przeprowadzenia badania. 1.4.1.
Warunki przebywania i karmienia zwierzàt Zwierz´ta powinny byç przetrzymywane pojedynczo. Temperatura w pomieszczeniu doÊwiadczalnym dla królików powinna wynosiç 20±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. 1.4.
Sposób post´powania 1.4.2.
Nanoszenie badanej substancji Badana substancja powinna byç nanoszona na ma∏à powierzchni´ (oko∏o 6 cm2) skóry i przykryta p∏atkiem gazy, umocowanym niedra˝niàcà taÊmà. W przypadku gdy nie mo˝na nanosiç substancji bezpoÊrednio (np. ciecz lub niektóre pasty), nale˝y nanieÊç badanà substancj´ najpierw na p∏atek gazy i nast´pnie na∏o˝yç go na skór´. P∏atek w czasie nara˝ania powinien byç w swobodnym kontakcie ze skórà za pomocà odpowiedniego pó∏przepuszczalnego banda˝a. Gdy badanà substancj´ nanosi si´ na p∏atek, nale˝y go przenieÊç na skór´ w taki sposób, by zapewniç dobry kontakt ze skórà i równomierne rozprowadzenie substancji na skórze. Nale˝y zapobiec, by zwierz´ nie mia∏o dost´pu do p∏atka i nie spo˝y∏o go lub nie wdycha∏o badanej substancji. Poz. 2119 1.4.2.
Badanie wst´pne (badanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´, na jednym zwierz´ciu) Stanowczo zaleca si´, by badanie in vivo przeprowadziç wst´pnie na jednym zwierz´ciu, szczególnie, gdy przewiduje si´, ˝e substancja posiada w∏aÊciwoÊci ˝ràce. Jest to zgodne ze strategià badania etapowego (zobacz Schemat). Je˝eli na podstawie analizy wagi dowodów oceniono, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco, nie ma potrzeby przeprowadzenia dalszych badaƒ na zwierz´tach. Dla wi´kszoÊci substancji podejrzanych o dzia∏anie ˝ràce dalsze badania in vivo na ogó∏ nie sà potrzebne. W przypadkach gdy dodatkowe dane by∏yby konieczne, ze wzgl´du na brak dostatecznych dowodów, mo˝na wykonaç ograniczone badania na zwierz´tach, stosujàc nast´pujàcy sposób post´powania: nanosi si´ kolejno do trzech p∏atków na zwierz´. Pierwszy p∏atek usuwa si´ po trzech minutach. Gdy nie obserwuje si´ powa˝nych reakcji na skórze, nanosi si´ drugi p∏atek i usuwa po godzinie. Je˝eli obserwacje na tym etapie wskazujà, ˝e nara˝enie mo˝e byç w sposób humanitarny przed∏u˝one do czterech godzin, nak∏ada si´ trzeci p∏atek i usuwa go po czterech godzinach, a nast´pnie ocenia si´ wynik badania. Je˝eli obserwuje si´ dzia∏anie ˝ràce po którymÊ z tych trzech etapów nara˝enia, doÊwiadczenie nale˝y natychmiast zakoƒczyç. Je˝eli nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego po usuni´ciu ostatniego p∏atka, zwierz´ obserwuje si´ przez 14 dni, chyba ˝e dzia∏anie ˝ràce wystàpi wczeÊniej. W przypadkach gdy nie przewiduje si´ dzia∏ania ˝ràcego badanej substancji, lecz dzia∏anie dra˝niàce, nak∏ada si´ jeden p∏atek na jedno zwierz´ na cztery godziny. 1.4.2.
Badanie potwierdzajàce (badanie dzia∏ania dra˝niàcego skór´ in vivo na dodatkowych zwierz´tach) Po up∏ywie okresu nara˝enia, w warunkach typowych po 4 godzinach nale˝y usunàç pozosta∏oÊci badanej substancji, najlepiej u˝ywajàc wody lub odpowiedniego rozpuszczalnika niezmieniajàcego istniejàcej reakcji lub integralnoÊci naskórka. Gdy w badaniu wst´pnym nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub brak takiego dzia∏ania nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc do dwóch dodatkowych zwierzàt, nak∏adajàc im po jednym p∏atku na cztery godziny. Gdy w badaniu wst´pnym obserwowano dzia∏anie dra˝niàce, badanie potwierdzajàce powinno si´ przeprowadziç w sposób etapowy lub nara˝aç dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. W wyjàtkowym przypadku, gdy nie prowadzi si´ badania wst´pnego, na dwa lub trzy zwierz´ta nak∏ada si´ po jednym p∏atku, które usuwa si´ po czterech godzinach. Gdy u˝ywa si´ dwóch zwierzàt i oba wykazujà takà samà reakcj´, nie potrzeba dalszych badaƒ. W innym przypadku nale˝y badaç równie˝ trzecie zwierz´. Dla oceny dwuznacznych reakcji potrzebne b´dzie u˝ycie dodatkowych zwierzàt. 1.4.2.
Poziom dawkowania 1.4.2.
Okres obserwacji Na badane miejsce nak∏ada si´ 0,5 ml cieczy wzgl´dnie 0,5 g substancji sta∏ej lub pasty. Czas trwania obserwacji musi byç wystarczajàcy do pe∏nej oceny odwracalnoÊci obserwowanych skut- Ciek∏e substancje stosuje si´ z zasady jako nierozcieƒczone. Gdy bada si´ substancje sta∏e (które mogà byç w razie potrzeby sproszkowane), nale˝y je zwil˝yç najmniejszà iloÊcià wody (lub w razie potrzeby innym odpowiednim noÊnikiem) wystarczajàcà do zapewnienia dobrego kontaktu ze skórà. O ile stosuje si´ noÊnik inny ni˝ woda, to jego mo˝liwy wp∏yw na dra˝nienie skóry przez badanà substancj´ powinien byç minimalny, a najlepiej gdyby to dzia∏anie nie wystàpi∏o. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16392 — Poz. 2119 ków. DoÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w momencie, gdy zwierz´ta wykazujà ciàg∏e oznaki silnego bólu lub ci´˝ki stan. Dla ustalenia odwracalnoÊci skutków zwierz´ta nale˝y obserwowaç do 14 dni po usuni´ciu p∏atków. Gdy odwracalnoÊç widoczna jest przed 14 dniami doÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w tym czasie. akcje jak ∏ysienie (na ograniczonej powierzchni), nadmierne rogowacenie, przerosty i z∏uszczenie utrzymujà si´ do koƒca 14-dniowego okresu obserwacji, to badanà substancj´ nale˝y uznaç za dra˝niàcà. 1.4.2.
Obserwacje kliniczne i stopniowanie oddzia∏ywania na skór´ 3.
Sprawozdanie z badaƒ Wszystkie zwierz´ta nale˝y badaç, zwracajàc uwag´ na oznaki rumienia oraz obrz´ku, a nast´pnie nale˝y oceniç reakcj´ wg skali punktowej po 60 minutach, a póêniej po 24, 48 i 72 godzinach po usuni´ciu p∏atka. W badaniu wst´pnym na jednym zwierz´ciu nale˝y sprawdziç miejsce na∏o˝enia bezpoÊrednio po usuni´ciu p∏atka. Reakcje skórne nale˝y oceniç wg skali punktowej i odnotowaç zgodnie z tabelà B.4.
Je˝eli po 72 godzinach uszkodzenie skóry nie mo˝e byç okreÊlone jako dzia∏anie dra˝niàce lub ˝ràce, to dla ustalenia odwracalnoÊci skutków obserwacje nale˝y prowadziç do 14 dnia. W uzupe∏nieniu obserwacji dzia∏ania dra˝niàcego nale˝y odnotowaç i dok∏adnie opisaç wszystkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak odt∏uszczenie skóry oraz jakiekolwiek szkodliwe skutki dzia∏ania ogólnego (np. kliniczne objawy toksyczne i wp∏yw na mas´ cia∏a). W celu wyjaÊnienia dwuznacznych reakcji nale˝y rozwa˝yç przeprowadzenie badaƒ histopatologicznych. Ocena reakcji skóry wg skali punktowej jest z koniecznoÊci subiektywna. W celu ujednolicenia oceny reakcji skóry wg skali punktowej i wsparcia laboratoriów przeprowadzajàcych doÊwiadczenia w przeprowadzeniu i interpretacji obserwacji, personel przeprowadzajàcy je nale˝y odpowiednio przeszkoliç w zakresie stosownego systemu punktowania (zobacz tabela poni˝ej). Dla stopniowania dzia∏ania dra˝niàcego na skór´ lub innych uszkodzeƒ pomocne mogà byç wszelkie ilustrowane przewodniki (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).
WYNIKI 2.
Przedstawienie wyników
SPRAWOZDANIE Sprawozdanie z badaƒ musi zawieraç nast´pujàce informacje: Racjonalne uzasadnienie do przeprowadzenia badania in vivo; analiz´ istniejàcych wyników badaƒ, ∏àcznie z wynikami strategii dzia∏ania etapowego: — opis istotnych wyników dost´pnych z wczeÊniejszych badaƒ, — wyniki uzyskane na ka˝dym etapie wynikajàce ze strategii badania, — opis przeprowadzonych doÊwiadczeƒ in vitro, ∏àcznie ze szczegó∏ami post´powania, wyniki uzyskane dla badanej substancji kontrolnej, — analiz´ przeprowadzenia badania in vivo. Badana substancja: — dane identyfikacyjne (np. numer CAS; êród∏o otrzymania; znane zanieczyszczenia; numer serii), — stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np. wartoÊç pH, lotnoÊç, rozpuszczalnoÊç, trwa∏oÊç), — w przypadku mieszanin, sk∏ad i udzia∏ procentowy sk∏adników. NoÊnik: — identyfikacja, st´˝enie (je˝eli dotyczy), stosowana obj´toÊç, — uzasadnienie wyboru noÊnika. DoÊwiadczalne zwierz´ta: — stosowany gatunek/szczep, uzasadnienie w przypadku stosowania innych zwierzàt ni˝ króliki albinotyczne, — liczba zwierzàt ka˝dej p∏ci, W sprawozdaniu koƒcowym z badania wyniki nale˝y zestawiç w formie tabel i powinny one zawieraç wszystkie pozycje wymienione w pkt 3.
— masa ka˝dego zwierz´cia na poczàtku doÊwiadczenia, po zakoƒczeniu doÊwiadczenia, 2.
Ocena wyników — êród∏o pozyskania, warunki przebywania, pasza itp. Ocen´ dzia∏ania dra˝niàcego na skór´ nale˝y oceniaç w powiàzaniu z charakterem i nasileniem uszkodzeƒ, ich odwracalnoÊcià lub brakiem odwracalnoÊci. Indywidualna punktacja nie prezentuje bezwzgl´dnego standardu w∏aÊciwoÊci dra˝niàcych substancji, poniewa˝ inne skutki wywo∏ane przez badany materia∏ sà równie˝ brane pod uwag´. Natomiast indywidualna punktacja powinna byç rozpatrywana jako wartoÊç odniesienia, którà nale˝y oceniaç w po∏àczeniu z wszystkimi innymi obserwacjami z tego badania. W ocenie dzia∏ania dra˝niàcego nale˝y braç pod uwag´ odwracalnoÊç uszkodzeƒ skóry. Je˝eli takie re- — wiek na poczàtku doÊwiadczenia, Warunki prowadzenia doÊwiadczenia: — technika przygotowania miejsca nak∏adania, — szczegó∏y dotyczàce materia∏u stosowanego na p∏atki i technika nak∏adania, — szczegó∏y przygotowania substancji do badaƒ, nak∏adanie i usuwanie. Wyniki: — zestawienie w tabelach wyników dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego, indywidualnie dla ka˝dego zwierz´cia, dla wszystkich okresów obserwacji, Dziennik Ustaw Nr 251 — 16393 — — opis wszystkich obserwowanych uszkodzeƒ, — s∏owny opis rodzaju i stopnia obserwowanego dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego, jak i wyniki badaƒ histopatologicznych, — opis jakichkolwiek innych skutków miejscowych (np. odt∏uszczenie skóry) i skutków ogólnoustrojowych towarzyszàcych dzia∏aniu dra˝niàcemu lub ˝ràcemu. Dyskusja wyników.
PIÂMIENNICTWO 1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.j., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P.

(1995). The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report

ATLA 23, 410—
2) Young J.R., How M.J., Walker A.P. and Worth W.M.H.

(1988). Classification as corrosive or irritant to skin of preparations containing acidic or alkaline substances without testing on animals. Toxicology In Vitro, 2, 19—26. 3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdail, D.J., Liebsch, M.

(1998). Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709—720. 4) ECETOC

(1990)Monograph No. 15, „Skin Irritation”, European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. Poz. 2119 5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M.

(1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity.

Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483—
6) Testing Method B. 40 Skin Corrosion. 7) OECD

(1996). OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). 8) OECD

(1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substancecs, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs /Class /HCL6.htm). 9) OECD

(2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/ monos.htm). 10) EPA

(1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. TABELA B.4.1: STOPNIOWANIE REAKCJI SKÓRY Rumieƒ i tworzenie si´ strupów Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 Tworzenie si´ obrz´ku Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 W celu wyjaÊnienia wàtpliwych reakcji mo˝na przeprowadziç badania histopatologiczne. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16394 — Poz. 2119 SCHEMAT Strategia etapowego badania dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego na skór´ ROZWA˚ANIA OGÓLNE Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak i dobro zwierzàt, wa˝ne jest, aby unikaç niepotrzebnego stosowania zwierzàt i zmniejszaç liczb´ badaƒ, które mog∏yby wywo∏aç silne reakcje u zwierzàt. Przed badaniem in vivo nale˝y oceniç wszystkie istotne informacje o substancji dotyczàce jej w∏aÊciwoÊci ˝ràcych i dra˝niàcych na skór´. Byç mo˝e istniejà ju˝ wystarczajàce dowody do klasyfikacji badanej substancji pod kàtem jej mo˝liwego dzia∏ania ˝ràcego i dra˝niàcego na skór´, bez potrzeby prowadzenia doÊwiadczeƒ na zwierz´tach laboratoryjnych. Dlatego stosowanie analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego zminimalizuje potrzeb´ badania in vivo szczególnie gdy substancja prawdopodobnie spowoduje silnà reakcj´. W celu zdecydowania, o potrzebie przeprowadzenia dodatkowego badania, innego ni˝ badania skórne in vivo, by móc scharakteryzowaç takie mo˝liwoÊci, zaleca si´ stosowanie analizy wagi dowodów na podstawie istniejàcych informacji dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego substancji na skór´. Gdy sà potrzebne dalsze badania, zaleca si´ stosowanie strategii etapowego badania dla uzyskania istotnych wyników doÊwiadczalnych. Dla substancji, które nie by∏y dotàd badane, nale˝y stosowaç strategi´ etapowego badania dla uzyskania wyników potrzebnych do oceny si∏y dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Strategi´ badania, opisanà w tym Schemacie, wypracowano na warsztatach OECD (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa) oraz zatwierdzono i rozwini´to w Zharmonizowanym Integralnym Systemie Klasyfikacji Ryzyka Skutków Zdrowotnych dla Ludzi i Ârodowiska, zaaprobowanym na 28 Wspólnym Posiedzeniu Komitetu Substancji Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Substancji Chemicznych w listopadzie 1998 r. (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa). Mimo ˝e strategia etapowego badania nie stanowi integralnej cz´Êci metody badawczej B.4, to wyra˝a zalecany sposób ustalania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. To podejÊcie przedstawia zarówno najlepszà praktyk´, jak i etyczny wyznacznik dla badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ in vivo. Metoda badawcza dostarcza wskazówek, jak prowadziç doÊwiadczenie in vivo, i podsumowuje czynniki, które powinny byç wykorzystane przed rozpocz´ciem takiego badania. Strategia dostarcza sposób oceny istniejàcych danych o w∏aÊciwoÊciach dra˝niàcych/˝ràcych badanej substancji na skór´ i zró˝nicowany sposób uzyskiwania znaczàcych danych o substancjach, dla których potrzebne sà dodatkowe badania lub dla których nie przeprowadzono badaƒ. Zaleca si´ równie˝ przeprowadzenie, sprawdzonymi i przyj´tymi metodami in vitro lub ex vivo, badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w okreÊlonych przypadkach. OPIS STRATEGII BADAWCZEJ I OSZACOWANIA Przed rozpocz´ciem doÊwiadczenia jako cz´Êci strategii badania etapowego (RYSUNEK) nale˝y oceniç wszystkie dost´pne informacje, dla okreÊlenia potrzeby badania skóry in vivo. Chocia˝ istotne informacje mo˝na uzyskaç z oceny pojedynczych parametrów (np. skrajne wartoÊci pH), to nale˝y wziàç pod uwag´ ca∏oÊç istniejàcych informacji. Nale˝y oceniç na podstawie analizy wagi dowodów wszystkie znaczàce dane o skutkach dzia∏ania substancji lub jej analogów i przedstawiç racjonalnoÊç decyzji. G∏ówny nacisk nale˝y po∏o˝yç na istniejàce dane dotyczàce dzia∏ania substancji na ludzi i zwierz´ta, a nast´pnie wyniki z badaƒ in vitro lub ex vivo. Nale˝y unikaç w miar´ mo˝liwoÊci badaƒ dzia∏ania ˝ràcego substancji in vivo. Czynniki brane pod uwag´ w strategii badania obejmujà: Ocena istniejàcych danych dotyczàcych dzia∏ania substancji na ludzi i zwierz´ta (Etap 1). W pierwszej kolejnoÊci nale˝y braç po uwag´ istniejàce dane dla ludzi, np. badania kliniczne lub zawodowe i sprawozdania z wypadków i/lub dane z badaƒ przeprowadzonych na zwierz´tach, np. badaƒ toksykologicznych przy jednokrotnym lub powtarzanym nara˝aniu, gdy˝ dostarczajà one bezpoÊrednich informacji o oddzia∏ywaniu na skór´. Nie nale˝y badaç w teÊcie in vivo substancji o znanym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym i substancji, co, do których istniejà bezsporne dowody o braku ich dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego. Analiza zale˝noÊci aktywnoÊci od budowy substancji (SAR) (Etap 2). Je˝eli dost´pne sà wyniki badaƒ substancji podobnych strukturalnie, to nale˝y je wziàç pod uwag´. Je˝eli dost´pna jest dostateczna liczba wyników dotyczàcych substancji o podobnej budowie lub mieszanin takich substancji wskazujàcych na ich mo˝liwoÊci dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ dotyczàcych dzia∏ania na ludzi i/lub zwierz´ta, to mo˝na za∏o˝yç, ˝e oceniana substancja b´dzie wywo∏ywa∏a te same reakcje. W takich przypadkach nie ma potrzeby badania substancji. Wyniki negatywne z badaƒ substancji o podobnej budowie lub mieszaniny takich substancji nie stanowià wystarczajàcych dowodów na brak dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w strategii etapowego badania. Sprawdzone i przyj´te sposoby z zastosowaniem analizy SAR mogà byç stosowane do identyfikacji potencja∏u zarówno dzia∏ania dra˝niàcego, jak i ˝ràcego na skór´. W∏aÊciwoÊci fizykochemiczne i reaktywnoÊç chemiczna (Etap 3). Substancje wykazujàce skrajne wartoÊci pH, takie jak ≤2,0 i ≥11,5, mogà wykazywaç silne dzia∏anie miejscowe. Je˝eli skrajne wartoÊci pH sà podstawà do zaklasyfikowania substancji jako ˝ràcej w stosunku do skóry, to nale˝y braç równie˝ pod uwag´ jej rezerw´ kwasowà/zasadowà (pojemnoÊç buforowà) (zobacz pozycje 3 i 4 piÊmiennictwa). Je˝eli z pojemnoÊci buforowej wynika, ˝e substancja nie powinna dzia∏aç ˝ràco na skór´, to nale˝y podjàç dalsze badania dla potwierdzenia tego, najlepiej przy u˝yciu Dziennik Ustaw Nr 251 — 16395 — sprawdzonej i przyj´tej metody in vitro lub ex vivo (zobacz etapy: 5 i 6). ToksycznoÊç skórna (Etap 4). Gdy sprawdzono, ˝e substancja chemiczna wykazuje dzia∏anie bardzo toksyczne w kontakcie ze skórà, to badanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego mo˝e byç niewykonalne, gdy˝ nak∏adana iloÊç badanej substancji mo˝e przekroczyç najwy˝szà dawk´ toksycznà i wywo∏aç w konsekwencji zgon lub silny ból u zwierzàt. Poza tym, gdy badanie toksycznoÊci ostrej skórnej na królikach albinotycznych prowadzone by∏o z granicznà dawkà toksycznà, wynoszàcà 2000 mg/kg m.c. lub wi´cej, i nie obserwowano podra˝nienia skóry lub dzia∏ania ˝ràcego, to nie ma potrzeby dodatkowego badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Oceniajàc wczeÊniej przeprowadzone badanie toksycznoÊci ostrej po naniesieniu na skór´, nale˝y mieç na uwadze szereg okolicznoÊci. Mogà byç na przyk∏ad podane w sprawozdaniu niekompletne informacje o uszkodzeniu skóry. DoÊwiadczenia i obserwacje mog∏y byç przeprowadzone na innym gatunku zwierzàt ni˝ króliki, którego wra˝liwoÊç na reakcje mog∏a si´ znacznie ró˝niç. Mo˝e równie˝ forma badanej substancji, nanoszonej na skór´ zwierz´cia, nie by∏a odpowiednia dla oszacowania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ (np. rozcieƒczanie substancji w badaniu toksycznoÊci skórnej) (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa). Jednak w takich przypadkach, gdy dobrze zaplanowane i przeprowadzone badania toksycznoÊci skórnej przeprowadzono na królikach, to negatywne wyniki mogà byç przyj´te jako wystarczajàcy dowód, ˝e substancja nie dzia∏a ˝ràco lub dra˝niàco. Poz. 2119 nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub jego brak nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc do dwóch dodatkowych zwierzàt, nara˝ajàc je przez cztery godziny. Gdy w badaniu wst´pnym obserwuje si´ dzia∏anie dra˝niàce, to badanie potwierdzajàce prowadzi si´ etapowo lub nara˝ajàc dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. PIÂMIENNICTWO 1) OECD

(1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1. oecd.org/ehs/test/background.htm). 2) OECD

(1998). Harmonized Intergrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). 3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdail, D.J., Liebsch, M.

(1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709—720. 4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H.

(1998). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2

(1)pp. 19—26. Wyniki z badaƒ in vitro i ex vivo (Etap 5 i 6). Substancje, które wykaza∏y w∏aÊciwoÊci ˝ràce lub silnie dra˝niàce w badaniu przeprowadzonym sprawdzonà i przyj´tà metodà in vitro i ex vivo (zobacz pozycje 6 i 7 piÊmiennictwa) przeznaczonà do oszacowania tych specyficznych skutków, nie muszà byç badane na zwierz´tach. Mo˝na przypuszczaç, ˝e substancje takie b´dà wywo∏ywa∏y podobnie silne skutki w badaniu in vivo. 5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I.

(1996). Animal, Human and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31, 411—436. Badanie in vivo na królikach (Etap 7 i 8). Gdy na podstawie wagi dowodów podejmuje si´ decyzj´ o przeprowadzeniu doÊwiadczenia in vivo, to nale˝y rozpoczàç od badania wst´pnego, u˝ywajàc jednego zwierz´cia. Gdy wynik tego doÊwiadczenia wskazuje, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco na skór´, to nie nale˝y prowadziç dalszego badania. Gdy w badaniu wst´pnym 7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M.

(1998). The ECVAM international validation study on in vitro test for skin corrosivity.

Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483—
6) Testing Method B.40 Skin Corrosion. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16396 — RYSUNEK B.4.
STRATEGIA BADANIA I OCENY DZIA¸ANIA DRA˚NIÑCEGO/˚RÑCEGO NA SKÓR¢ Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16397 — Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16398 — Poz. 2119 Za∏àcznik nr 6 B.
TOKSYCZNOÂå OSTRA: DZIA¸ANIE DRA˚NIÑCE/˚RÑCE NA OKO
METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 405

(2002). 1.

Wst´p Podczas opracowywania niniejszej metody szczególnà uwag´ zwrócono na mo˝liwoÊç jej ulepszenia, bioràc pod uwag´ dobro zwierzàt i oszacowanie wszystkich istniejàcych informacji dotyczàcych badanej substancji w celu unikni´cia zb´dnych badaƒ na zwierz´tach laboratoryjnych. W metodzie tej zaleca si´ przed podj´ciem badania in vivo dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego badanej substancji na oczy wykonanie oceny wagi dowodów istniejàcych danych (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Je˝eli sà dost´pne niepe∏ne dane, to mogà byç one uzupe∏nione przez zastosowanie badania sekwencyjnego (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa). Strategia badawcza zawiera wykonanie zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro, a przedstawiona jest ona w Schemacie za∏àczonym do niniejszej metody. Ponadto, w celu przewidzenia dzia∏ania ˝ràcego na oczy, przed podj´ciem badania in vivo na oku zaleca si´ wziàç pod uwag´ wyniki badaƒ in vivo toksycznoÊci ostrej skórnej, dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Uwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak i dobro zwierzàt nie nale˝y wykonywaç badaƒ in vivo, a˝ do momentu oceny, w wyniku analizy wagi dowodów, wszystkich dost´pnych, istotnych danych dotyczàcych potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji na oczy. Dane takie powinny zawieraç dowody pochodzàce z istniejàcych badaƒ u ludzi i/lub przeprowadzonych na zwierz´tach laboratoryjnych, dowody na dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce jednej lub kilku substancji o podobnej strukturze lub mieszanin takich substancji, informacje o silnie kwaÊnym lub zasadowym odczynie tej substancji (zobacz pozycje 4 i 5 piÊmiennictwa) i wyniki zwalidowanych i akceptowanych badaƒ in vitro lub ex vivo dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego na skór´ (zobacz pozycje 6 i 7 piÊmiennictwa). Analiza ta powinna ograniczyç potrzeb´ badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w teÊcie in vivo, dla których istniejà ju˝ wystarczajàce dowody z innych badaƒ dla tych dwóch typów uszkodzeƒ. Badania te powinny byç prowadzone przed, lub jako wynik, analizy wagi dowodów. Dla pewnych substancji taka analiza mo˝e wskazywaç na potrzeb´ przeprowadzenia badaƒ in vivo potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji na oczy. We wszystkich takich przypadkach przed podj´ciem decyzji o przeprowadzeniu takiego badania preferowane jest wykonanie badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ (in vivo) oraz ocena wyników badania zgodnie z metodà badawczà B.4 (zobacz pozycja 8 piÊmiennictwa). Zastosowanie analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego powinno zmniej- szyç potrzeb´ przeprowadzania badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy (in vivo) dla substancji, dla której istniejà ju˝ wystarczajàce dowody z innych badaƒ, ˝e posiada takie w∏aÊciwoÊci. W przypadku gdy nie mo˝na okreÊliç potencja∏u dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego na oczy za pomocà strategii badania etapowego, pomimo przeprowadzonego badania dzia∏ania ˝ràcego i dra˝niàcego na skór´ (in vivo), mo˝na przeprowadziç badanie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy (in vivo). Zalecana strategia badania etapowego, obejmujàca przeprowadzenie badaƒ dzia∏ania ˝ràcego/dra˝nienia za pomocà zwalidowanych i akceptowanych metod in vitro lub ex vivo jest do∏àczona w formie Schematu stanowiàcego dodatek do niniejszej metody. Strategia ta zosta∏a opracowana i jednomyÊlnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa) oraz przyj´ta jako zalecana strategia badawcza w Âwiatowym Systemie Zharmonizowanym (GHS) (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa). Zaleca si´, by ww. strategia badawcza by∏a podj´ta przed wykonaniem badania in vivo. W celu uzyskania danych o przes∏ankach naukowych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji dla nowych substancji zaleca si´ sposób badania etapowego. Dla substancji istniejàcych o niewystarczajàcych danych dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ strategi´ t´ nale˝y stosowaç dla uzupe∏nienia brakujàcych danych. Zastosowanie innej strategii badawczej lub sposobu post´powania bàdê te˝ podj´cie decyzji o niestosowaniu etapowego sposobu badania musi byç uzasadnione. 1.
Definicje Dzia∏anie dra˝niàce na oczy: jest to wywo∏ywanie zmian w oku po podaniu badanej substancji na przednià powierzchni´ oka, które sà w pe∏ni odwracalne w ciàgu 21 dni od podania. Dzia∏anie ˝ràce na oczy: jest to wywo∏ywanie uszkodzenia tkanek oka lub powa˝nej fizycznej utraty zdolnoÊci widzenia, po podaniu badanej substancji na przednià powierzchni´ oka, które nie sà w pe∏ni odwracalne w ciàgu 21 dni od podania. 1.
Zasada metody badawczej Badanà substancj´ wprowadza si´ w pojedynczej dawce do jednego oka zwierz´cia doÊwiadczalnego; drugie oko s∏u˝y jako kontrolne. Stopieƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy jest oceniany w skali punktowej na podstawie uszkodzeƒ rogówki, t´czówki i spojówki w ustalonych odst´pach czasu. Dla uzyskania ca∏kowitej oceny skutków nale˝y równie˝ opisaç inne skutki w oku i negatywne skutki ogólnoustrojowe. Czas trwania badania powinien byç wystarczajàcy dla oceny odwracalnoÊci lub nieodwracalnoÊci obserwowanych skutków. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16399 — Poz. 2119 Zwierz´ta wykazujàce ciàg∏e oznaki ci´˝kiego wstrzàsu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badaƒ muszà byç w sposób humanitarny uÊmiercone, a dzia∏anie substancji odpowiednio oszacowane. Kryteria s∏u˝àce do podj´cia decyzji o humanitarnym zabiciu zwierzàt umierajàcych lub silnie cierpiàcych mo˝na odnaleêç w pozycji piÊmiennictwa
dodatkowa grupa, nale˝y u˝yç dwóch królików. Nale˝y starannie udokumentowaç warunki przemywania, np. moment przemywania, sk∏ad i temperatura cieczy do przemywania, czas trwania przemywania, obj´toÊç stosowanej cieczy i szybkoÊç przemywania. 1.
Opis metody badawczej 1.4.2.3.
Badanie cieczy 1.4.
Przygotowanie do badania in vivo W przypadku badania cieczy stosuje si´ jà w iloÊci 0,1 ml. Badanej substancji nie nale˝y bezpoÊrednio wprowadzaç do oka za pomocà pulweryzatora. Nale˝y jà najpierw przenieÊç do naczynia, a nast´pnie wkropliç do oka w iloÊci 0,1 ml. 1.4.1.
Wybór gatunku zwierzàt Zalecanym gatunkiem jest królik albinotyczny; stosowaç nale˝y zdrowe, m∏ode dojrza∏e króliki. W przypadku stosowania innych gatunków nale˝y podaç uzasadnienie. 1.4.1.
Przygotowanie zwierzàt Oczy ka˝dego zwierz´cia wybranego wst´pnie do badania nale˝y sprawdziç 24 godziny przed rozpocz´ciem doÊwiadczenia. Nie nale˝y u˝ywaç zwierzàt, u których stwierdza si´ objawy podra˝nienia oczu, wady oczu lub istniejàce wczeÊniej uszkodzenie rogówki. 1.4.1.
Warunki przetrzymywania i karmienia zwie-rzàt Zwierz´ta powinny byç przetrzymywane pojedynczo. Temperatura w pomieszczeniu doÊwiadczalnym dla królików powinna wynosiç 20±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. 1.4.
Sposób post´powania 1.4.2.
Podawanie badanej substancji Badanà substancj´ nale˝y umieÊciç w worku spojówkowym jednego oka ka˝dego zwierz´cia po ∏agodnym odsuni´ciu dolnej powieki od ga∏ki ocznej. Nast´pnie powieki nale˝y ∏agodnie przytrzymaç razem przez oko∏o jednà sekund´, by zapobiec stratom materia∏u. Drugie oko, które pozostaje nienara˝one, s∏u˝y jako kontrolne. 1.4.2.
Przep∏ukiwanie Oczu zwierzàt doÊwiadczalnych nie nale˝y przemywaç przez 24 godziny po wprowadzeniu badanej substancji, z wyjàtkiem substancji sta∏ych (patrz pkt 1.4.2.3.2) i w przypadku bezpoÊredniego dzia∏ania ˝ràcego lub dra˝niàcego. Po 24 godzinach mo˝na stosowaç przemycie, jeÊli jest to potrzebne. Nie zaleca si´ stosowania dodatkowej grupy zwierzàt celem zbadania wp∏ywu przemywania, dopóki nie jest to naukowo umotywowane. Gdy potrzebna jest 1.4.2.
Poziom dawkowania 1.4.2.3.
Badanie substancji sta∏ych W badaniu substancji w stanie sta∏ym, past i substancji sypkich stosowana iloÊç powinna mieç obj´toÊç 0,1 ml lub mas´ nie wi´kszà ni˝ 100 mg. Substancj´ nale˝y rozetrzeç na drobny py∏. Obj´toÊç substancji sta∏ej nale˝y mierzyç po delikatnym jej zag´szczeniu, np. przez stukanie pojemnikiem. O ile badana substancja w postaci sta∏ej nie zostanie wydalona z oka zwierz´cia za pomocà odruchu fizjologicznego do pierwszego punktu odczytu, tj. jednej godziny po podaniu, oko nale˝y przep∏ukaç fizjologicznym roztworem soli lub wodà destylowanà. 1.4.2.3.
Badanie aerozoli Zaleca si´, aby substancje z pojemników zaopatrzonych w pulweryzatory oraz z aerozoli zebraç przed wprowadzeniem do oka. Jedyny wyjàtek stanowià substancje znajdujàce si´ w ciÊnieniowych pojemnikach aerozolowych, które nie mogà byç zbierane ze wzgl´du na odparowanie. W takich przypadkach oko nale˝y trzymaç otwarte i badanà substancj´ wprowadziç na przednià cz´Êç oka z odleg∏oÊci 10 cm pojedynczym strzykni´ciem trwajàcym oko∏o jednej sekundy. Odleg∏oÊç ta mo˝e ulec zmianie w zale˝noÊci od ciÊnienia w pojemniku i jego zawartoÊci. Nale˝y zwracaç uwag´, by nie uszkodziç oka p∏ynem z rozpylacza. W stosownych przypadkach mo˝e zajÊç koniecznoÊç oceny mo˝liwoÊci „mechanicznego” uszkodzenia oka spowodowanego silnym dzia∏aniem strumienia. Dawk´ aerozolu mo˝na ustaliç, symulujàc doÊwiadczenie w nast´pujàcy sposób: substancj´ rozpyla si´ na zwa˝ony papier wielkoÊci oka królika. Przyrost masy papieru odpowiada w przybli˝eniu iloÊci, która zosta∏a wprowadzona do oka. Dla substancji lotnych dawk´ mo˝na ustaliç na podstawie masy pojemnika przed i po u˝yciu. 1.4.2.
Badanie wst´pne (badanie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy in vivo na jednym zwierz´ciu) Jak przedstawiono w strategii badania sekwencyjnego (zobacz Schemat 1) stanowczo zaleca si´, by badanie in vivo przeprowadziç wst´pnie na jednym zwierz´ciu. Dziennik Ustaw Nr 251 — 16400 — O ile wyniki tego badania po zastosowaniu opisanej procedury wskazujà, ˝e substancja dzia∏a ˝ràco lub silnie dra˝niàco na oczy, to nie nale˝y przeprowadzaç dalszych badaƒ dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego na oczy. 1.4.2.
Miejscowe znieczulenie Miejscowe znieczulenie nale˝y stosowaç w okreÊlonych przypadkach. Je˝eli analiza wagi dowodów wskazuje, ˝e substancja mo˝e wywo∏aç ból, lub wst´pne badanie pokazuje, ˝e nast´puje reakcja bólowa, to nale˝y przed wprowadzeniem badanej substancji zastosowaç miejscowe znieczulenie. Nale˝y starannie dobraç rodzaj, st´˝enie i dawk´ substancji znieczulajàcej tak, aby zapewniç, ˝e jej zastosowanie nie wywo∏a znaczàcych ró˝nic w reakcji badanej substancji. W ten sam sposób nale˝y znieczuliç oko kontrolne. 1.4.2.
Badanie potwierdzajàce (badanie dzia∏ania dra˝niàcego na oczy in vivo na dodatkowych zwierz´tach) Gdy w badaniu wst´pnym nie obserwuje si´ dzia∏ania ˝ràcego, to dzia∏anie dra˝niàce lub brak takiego dzia∏ania nale˝y potwierdziç, u˝ywajàc w dalszych badaniach do dwóch dodatkowych zwierzàt. Gdy w badaniu wst´pnym obserwowano silne dzia∏anie dra˝niàce, wskazujàce na mo˝liwy silny (nieodwracalny) skutek w badaniu potwierdzajàcym, zaleca si´, by badanie potwierdzajàce prowadziç w sposób etapowy, ka˝dorazowo raczej na jednym zwierz´ciu, ni˝ nara˝aç dwa dodatkowe zwierz´ta równoczeÊnie. W przypadku gdy u drugiego zwierz´cia wyst´pujà skutki dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego, to doÊwiadczenia nie nale˝y kontynuowaç. W celu potwierdzenia s∏abych lub umiarkowanych objawów dzia∏ania dra˝niàcego potrzebne b´dà dodatkowe zwierz´ta. dzenia: perforacja rogówki lub znaczàce owrzodzenie rogówki ∏àcznie z garbiakiem rogówki, krew w przedniej komorze oka, 4 stopieƒ nieprzezroczystoÊci rogówki utrzymujàcej si´ przez 48 godzin, brak reakcji na Êwiat∏o (2 stopieƒ reakcji t´czówki), utrzymujàce si´ przez 72 godziny, owrzodzenie b∏on spojówkowych, martwica b∏on spojówkowych lub mru˝nych lub linienie. Tego typu uszkodzenia sà zazwyczaj nieodwracalne. Zwierz´ta niewykazujàce uszkodzeƒ oka nale˝y zabijaç nie wczeÊniej ni˝ przed up∏ywem 3 dni po wprowadzeniu substancji. Zwierz´ta wykazujàce ∏agodne lub umiarkowane uszkodzenia nale˝y obserwowaç, dopóki zmiany si´ nie ustabilizujà lub przez 21 dni, a po tym czasie zakoƒczyç doÊwiadczenie. Obserwacje nale˝y przeprowadzaç w 7, 14 i 21 dniu celem ustalenia stanu uszkodzeƒ i ich odwracalnoÊci lub braku odwracalnoÊci. Stopnie uszkodzenia oka (rogówki, t´czówki i spojówki) nale˝y zapisywaç podczas ka˝dego badania (Tabela B.5.1). Nale˝y równie˝ zapisywaç wszystkie inne uszkodzenia oka (np. ∏uszczka, zabarwienie) lub szkodliwe skutki ogólnoustrojowe. Badanie reakcji mo˝na u∏atwiç, u˝ywajàc lupy binokularowej, r´cznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub innych odpowiednich przyrzàdów. Po zapisaniu obserwacji po 24 godzinach oczy mo˝na dalej badaç przy pomocy fluoresceiny. Ocena reakcji oczu wg skali punktowej jest z koniecznoÊci subiektywna. W celu ujednolicenia oceny reakcji oczu wg skali punktowej i wsparcia laboratoriów przeprowadzajàcych doÊwiadczenia w przeprowadzeniu i interpretacji obserwacji, personel je przeprowadzajàcy nale˝y odpowiednio przeszkoliç w zakresie odpowiedniego systemu punktowania. 1.4.2.
Okres obserwacji
WYNIKI Czas trwania obserwacji musi byç wystarczajàcy do pe∏nej oceny wielkoÊci i odwracalnoÊci obserwowanych skutków. DoÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w ka˝dym momencie, gdy zwierz´ta wykazujà oznaki silnego bólu lub ci´˝ki stan 9). Dla ustalenia odwracalnoÊci skutków zwierz´ta nale˝y obserwowaç do 21 dni od podania substancji. Gdy odwracalnoÊç widoczna jest przed up∏ywem 21 dnia, doÊwiadczenie nale˝y zakoƒczyç w tym czasie. 2.
Ocena wyników 1.4.2.7.
Obserwacje kliniczne i stopniowanie oddzia∏ywania na oko Oczy powinny zostaç zbadane po up∏ywie 1, 24, 48 i 72 godzin po podaniu substancji. Zaraz po uzyskaniu rozstrzygajàcej informacji uczestnictwo zwierzàt w badaniu powinno trwaç nie d∏u˝ej ni˝ jest to konieczne. Zwierz´ta objawiajà

Wyjaśnienie AI na podstawie urzędowego tekstu ustawy. Orientacyjne, nie zastępuje porady prawnej.