konieczne. Zwierz´ta objawiajàce ciàg∏y silny ból lub ci´˝ki stan powinny byç bezzw∏ocznie w sposób humanitarny uÊmiercone, a substancja odpowiednio oceniona. Zwierz´ta nale˝y w sposób humanitarny uÊmierciç, je˝eli po wprowadzeniu badanej substancji do oka wystàpià nast´pujàce rodzaje jego uszko- Poz. 2119 Punktowà ocen´ dzia∏ania dra˝niàcego na oczy nale˝y oceniaç w powiàzaniu z charakterem i nasileniem uszkodzeƒ, ich odwracalnoÊcià lub brakiem odwracalnoÊci. Indywidualna punktacja nie prezentuje bezwzgl´dnego standardu w∏aÊciwoÊci dra˝niàcych substancji. Nale˝y równie˝ oceniç inne skutki wywo∏ane przez badany materia∏. Natomiast indywidualnà punktacj´ nale˝y uwa˝aç jako wartoÊç odniesienia i ma ona tylko wtedy znaczenie, gdy jest poparta pe∏nym opisem i ocenà wszystkich obserwacji.
\nRacjonalne uzasadnienie do przeprowadzenia badania in vivo; analiz´ istniejàcych wyników badaƒ, ∏àcznie z wynikami strategii dzia∏ania etapowego:
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16401 — Poz. 2119 — opis istotnych wyników dost´pnych z wczeÊniejszych badaƒ, — s∏owny opis rodzaju i stopnia obserwowanego dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego, — wyniki uzyskane na ka˝dym etapie wynikajàce ze strategii badania, — opis jakichkolwiek innych uszkodzeƒ obserwowanych w oku (np. unaczynienie, tworzenie si´ ∏uszczki, zrosty, zabarwienia), — opis przeprowadzonych doÊwiadczeƒ in vitro, ∏àcznie z szczegó∏ami post´powania, wyniki uzyskane dla badanej substancji/referencyjnej, — opis przeprowadzonego badania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ ∏àcznie z otrzymanymi wynikami, — analiza wagi dowodów dla przeprowadzonego doÊwiadczenia in vivo.
\nBadana substancja: — dane identyfikacyjne (np. numer CAS; êród∏o otrzymania; znane zanieczyszczenia; numer serii), — stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np. wartoÊç pH, lotnoÊç, rozpuszczalnoÊç, trwa∏oÊç), — w przypadku mieszanin sk∏ad i udzia∏ procentowy sk∏adników, — je˝eli stosowano miejscowe znieczulenie, to˝samoÊç Êrodka, zanieczyszczenia, typ, dawka i potencjalne wspó∏dzia∏anie z badanà substancjà.
\nNoÊnik: — identyfikacja, st´˝enie (o ile dotyczy), stosowana obj´toÊç, — uzasadnienie wyboru noÊnika.
\nZwierz´ta doÊwiadczalne: — stosowany gatunek/szczep, uzasadnienie w przypadku stosowania innych zwierzàt ni˝ króliki albinotyczne, — wiek ka˝dego zwierz´cia na poczàtku doÊwiadczenia, — liczba zwierzàt ka˝dej p∏ci w grupach nara˝anych i kontrolnych (o ile potrzebne), — masa ka˝dego zwierz´cia na poczàtku i po zakoƒczeniu doÊwiadczenia, — êród∏o pozyskania zwierzàt, warunki przebywania, pasza itp.
\nWyniki: — opis metody stosowanej do oceny dzia∏ania dra˝niàcego w ka˝dym czasie obserwacji (np. u˝ycie r´cznej lampy szczelinowej, biomikroskopu, fluoresceiny), — zestawienie w tabelach wyników dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego dla ka˝dego zwierz´cia z ka˝dego czasu obserwacji, a˝ do usuni´cia zwierz´cia z doÊwiadczenia, — opis miejscowych i uk∏adowych skutków szkodliwych innych ni˝ zwiàzane z okiem i zmian histopatologicznych, o ile wystàpi∏y.
\nDyskusja wyników.
\n3.2. Interpretacja wyników Ekstrapolacja wyników z badania dzia∏ania dra˝niàcego na oczy u zwierzàt laboratoryjnych na cz∏owieka jest mo˝liwa tylko w ograniczonym stopniu.
\nW wielu przypadkach królik albinotyczny jest bardziej wra˝liwy na dzia∏anie dra˝niàce/˝ràce na oczy od cz∏owieka.
\nPodczas interpretacji wyników nale˝y zwróciç uwag´, by wykluczyç wyniki dzia∏ania dra˝niàcego spowodowanego wtórnà infekcjà.
\nStatistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159—164.
\nATLA 27, 161—177.
\nIn Vitro, 2, 19—26.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16402 —
\nFinal Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
\nTABELA B.5.1: STOPNIOWANIE USZKODZENIA OKA Rogówka Zm´tnienie: stopieƒ g´stoÊci (odczytuje si´ na obszarze najwi´kszego nasilenia)*) Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 * Nale˝y zapisaç wielkoÊç pola zm´tnienia rogówki.
\nT´czówka Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 2 Spojówka Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 3 Obrz´k spojówki Obrz´k (odnosi si´ do powieki i/lub b∏on mru˝nych) Maksymalna mo˝liwa liczba punktów: 4 Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16403 — Poz. 2119 SCHEMAT Strategia etapowego badania dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego na oczy przypadkach (zobacz pozycje 3 i 4 piÊmiennictwa).
\nOPIS ETAPOWEJ STRATEGII BADAWCZEJ ROZWA˚ANIA OGÓLNE Przed rozpocz´ciem doÊwiadczeƒ jako cz´Êci strategii badania etapowego (Rysunek B.5.1) nale˝y oceniç wszystkie dost´pne informacje, dla okreÊlenia potrzeby badania oka in vivo. Chocia˝ istotne informacje mo˝na uzyskaç z oceny pojedynczych parametrów (np. skrajne wartoÊci pH), nale˝y oceniç ca∏oÊç istniejàcych informacji. Nale˝y oceniç na podstawie analizy wagi dowodów wszystkie znaczàce dane o skutkach dzia∏ania substancji lub jej analogów strukturalnych i przedstawiç uzasadnienie decyzji. G∏ówny nacisk nale˝y po∏o˝yç na istniejàce dane o substancji uzyskane dla ludzi i zwierzàt, a nast´pnie wyniki z badaƒ in vitro lub ex vivo. Nale˝y unikaç w miar´ mo˝liwoÊci badaƒ dzia∏ania ˝ràcego substancji in vivo. Czynniki brane pod uwag´ w strategii badania obejmujà:
\nUwzgl´dniajàc zarówno przes∏anki naukowe, jak i dobro zwierzàt, wa˝ne jest, by unikaç niepotrzebnego stosowania zwierzàt i zmniejszaç liczb´ badaƒ, które mog∏yby wywo∏aç silne reakcje u zwierzàt. Przed badaniem in vivo nale˝y oceniç wszystkie istotne informacje o substancji dotyczàce jej w∏aÊciwoÊci ˝ràcych i dra˝niàcych na oczy. Byç mo˝e istniejà ju˝ wystarczajàce dowody do klasyfikacji badanej substancji pod kàtem jej mo˝liwego dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego na oczy, bez potrzeby prowadzenia doÊwiadczeƒ na zwierz´tach laboratoryjnych. Dlatego stosowanie analizy wagi dowodów i strategii badania etapowego zminimalizuje potrzeb´ badania in vivo, szczególnie gdy substancja prawdopodobnie spowoduje silnà reakcj´.
\nW celu zdecydowania o potrzebie przeprowadzenia dodatkowego badania innego ni˝ badania oczu in vivo, by móc scharakteryzowaç takie dzia∏ania, zaleca si´ stosowanie analizy wagi dowodów na podstawie istniejàcych informacji dotyczàcych dzia∏ania dra˝niàcego i ˝ràcego substancji na oczy. Gdy sà potrzebne dalsze badania, zaleca si´ stosowanie strategii badania etapowego dla uzyskania istotnych wyników doÊwiadczalnych. Dla substancji, które nie by∏y dotàd badane, nale˝y stosowaç strategi´ etapowego badania dla uzyskania zestawu wyników potrzebnych do oceny si∏y dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oko. Strategi´ badania opisanà w niniejszym Schemacie wypracowano na warsztatach OECD (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). By∏a ona póêniej zatwierdzona i rozwini´ta w Zharmonizowanym Integralnym Systemie Klasyfikacji Ryzyka Skutków Zdrowotnych dla ludzi i dla Êrodowiska wywo∏anego przez substancje chemiczne, zaaprobowanego na 28 Wspólnym Posiedzeniu Komitetu Substancji Chemicznych i Grupy Roboczej d/s Substancji Chemicznych w listopadzie 1998 r. (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa).
\nMimo ˝e strategia badania etapowego nie stanowi integralnej cz´Êci metody badawczej B.5, to wyra˝a zalecany sposób ustalania dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy. To podejÊcie przedstawia zarówno najlepszà praktyk´, jak i etyczny wyznacznik dla badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy in vivo. Metoda badawcza dostarcza wskazówek, jak prowadziç doÊwiadczenie in vivo i podsumowuje czynniki, które powinny byç wykorzystane przed rozpocz´ciem takiego badania. Strategia badania etapowego dostarcza na podstawie wagi dowodów sposób na ocen´ istniejàcych danych o w∏aÊciwoÊciach dra˝niàcych/˝ràcych badanej substancji na oczy i zró˝nicowany sposób uzyskiwania znaczàcych danych o substancjach, dla których potrzebne sà dodatkowe badania lub dla których nie przeprowadzono badaƒ. Strategia obejmuje przeprowadzenie najpierw sprawdzonymi i przyj´tymi metodami in vitro lub ex vivo badaƒ dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego, a nast´pnie metodà badawczà B.4 dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´ w okreÊlonych Ocena istniejàcych danych dotyczàcych dzia∏ania substancji na ludzi i zwierz´ta (Etap 1). W pierwszej kolejnoÊci nale˝y braç po uwag´ istniejàce dane dla ludzi, np. badania kliniczne lub zawodowe i sprawozdania z wypadków i/lub dane z badaƒ przeprowadzonych na zwierz´tach, gdy˝ dostarczajà one bezpoÊrednich informacji o oddzia∏ywaniu na oczy. Nast´pnie nale˝y oceniç dost´pne dane z badaƒ na ludziach i/lub zwierz´tach dotyczàce dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na skór´. Substancje o znanym silnym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym na oczy, jak równie˝ substancje wykazujàce dzia∏anie ˝ràce lub silnie dra˝niàce na skór´ nie powinny byç wkraplane do oka zwierz´cia; takie substancje nale˝y uznaç za ˝ràce lub dra˝niàce równie˝ na oczy. Nie nale˝y badaç w teÊcie in vivo substancji o znanym dzia∏aniu dra˝niàcym lub ˝ràcym i substancji, co do których istniejà bezsporne dowody o braku ich dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego.
\nAnaliza zale˝noÊci aktywnoÊci od struktury substancji (SAR)(Etap 2). Je˝eli dost´pne sà wyniki badaƒ substancji o podobnej strukturze, to nale˝y je wziàç pod uwag´. Je˝eli dost´pna jest dostateczna liczba wyników dotyczàcych substancji o podobnej budowie lub mieszanin takich substancji wskazujàcych na ich mo˝liwoÊci dzia∏ania ˝ràcego/dra˝niàcego na oczy dotyczàcych dzia∏ania na ludzi i/lub zwierz´ta, to mo˝na za∏o˝yç, ˝e oceniana substancja b´dzie wywo∏ywa∏a te same reakcje. W takich przypadkach nie ma potrzeby badania substancji. Wyniki negatywne z badaƒ substancji o podobnej budowie lub mieszanin takich substancji nie stanowià wystarczajàcych dowodów na brak dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego substancji w strategii etapowego badania. Sprawdzone i przyj´te sposoby z zastosowaniem analizy SAR mogà byç stosowane do identyfikacji potencja∏u zarówno dzia∏ania ˝ràcego jak i dra˝niàcego na oczy.
\nW∏aÊciwoÊci fizykochemiczne i reaktywnoÊç chemiczna (Etap 3). Substancje wykazujàce skrajne wartoÊci pH, takie jak ≤2,0 i ≥11,5, mogà wykazywaç silne dzia∏anie miejscowe. Je˝eli skrajne wartoÊci pH sà podstawà do zaklasyfikowania substancji jako ˝ràcej Dziennik Ustaw Nr 251 — 16404 — Poz. 2119 w stosunku do skóry, to nale˝y braç równie˝ pod uwag´ jej rezerw´ kwasowà/zasadowà (pojemnoÊç buforowà) (zobacz pozycje 5 i 6 piÊmiennictwa). Je˝eli z pojemnoÊci buforowej wynika, ˝e substancja nie powinna dzia∏aç ˝ràco na oczy, to nale˝y podjàç dalsze badania dla potwierdzenia tego, najlepiej przy u˝yciu sprawdzonej i przyj´tej metody in vitro lub ex vivo (zobacz etapy: 5 i 6).
\nBadanie in vivo na królikach (Etap 8 i 9). Badanie oka in vivo nale˝y rozpoczàç od badania wst´pnego, u˝ywajàc jednego królika. O ile wyniki tego badania wska˝à, ˝e substancja dzia∏a silnie dra˝niàco lub ˝ràco na oczy, nie nale˝y przeprowadziç dalszego badania.
\nJe˝eli w badaniu tym nie wystàpià skutki dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego, nale˝y przeprowadziç badanie sprawdzajàce na dwóch dalszych zwierz´tach.
\nUwzgl´dnianie innych istniejàcych informacji (Etap
\nPIÂMIENNICTWO Wyniki z badaƒ in vitro lub ex vivo (Etap 5 i 6).
\nSubstancje, które wykaza∏y w badaniu przeprowadzonym metodà in vitro lub ex vivo (zobacz pozycje 7 i 8 piÊmiennictwa), która by∏a sprawdzona i przyj´ta do szacowania szczególnie dzia∏ania dra˝niàcego/˝ràcego na oczy lub skór´, dzia∏ania silnie dra˝niàce lub ˝ràce nie muszà byç badana na zwierz´tach. Mo˝na przypuszczaç, ˝e substancje takie b´dà wywo∏ywa∏y podobnie silne skutki w badaniu in vivo. Gdy sprawdzone i przyj´te metody in vitro/ex vivo sà niedost´pne, nale˝y ominàç etapy 5 i 6 oraz przejÊç wprost do etapu 7.
\nOszacowanie in vivo dzia∏ania dra˝niàcego lub ˝ràcego substancji na skór´ (Etap 7). Gdy istniejàce dowody nie stanowià wystarczajàcej podstawy do przeprowadzenia rozstrzygajàcej analizy wagi dowodów o potencjalnym dzia∏aniu ˝ràcym/dra˝niàcym na oczy przez danà substancj´ na bazie danych z badaƒ wyszczególnionych powy˝ej, nale˝y najpierw oceniç potencjalne dzia∏anie ˝ràce/dra˝niàce po naniesieniu na skór´ in vivo, stosujàc metod´ badawczà B.4 (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa) i za∏àczony do niej Schemat (zobacz pozycja 9 piÊmiennictwa). O ile substancja wyka˝e dzia∏anie ˝ràce lub silnie dra˝niàce na skór´, nale˝y przyjàç, ˝e dzia∏a ˝ràco na oczy, chyba ˝e inne informacje sk∏onià do innego wniosku. Tak wi´c nie ma potrzeby przeprowadzenia badania oka in vivo.
\nO ile substancja nie wykazuje dzia∏ania ˝ràcego lub silnie dra˝niàcego na skór´ nale˝y przeprowadziç badanie oka in vivo.
\nFinal Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22—24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
\nATLA 27, 161—177.
\nToxic In Vitro, 2 (1) pp. 19—26.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16405 — Rysunek B.5.1.
\nSTRATEGIA BADANIA I OCENY DZIA¸ANIA DRA˚NIÑCEGO/˚RÑCEGO NA OCZY Poz. 2119 Dziennik Ustaw Nr 251 — 16406 — Poz. 2119 Za∏àcznik nr 7 B.31. BADANIE TOKSYCZNOÂCI W ROZWOJU PRZEDPORODOWYM 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 414 (2001).
\n1.1. Wst´p Niniejsza metoda — badania toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym zosta∏a opracowana w celu dostarczania ogólnych informacji dotyczàcych skutków nara˝enia w okresie przedporodowym na badane ci´˝arne zwierz´ i p∏ód rozwijajàcy si´ w macicy. Mogà one zawieraç ocen´ skutków nara˝enia na matk´, a tak˝e padni´cie, nieprawid∏owoÊci strukturalne lub zaburzenia rozwoju p∏odu. Zaburzenia czynnoÊciowe, chocia˝ sà wa˝nà cz´Êcià rozwoju, nie sà brane pod uwag´ w niniejszej metodzie. Mo˝na je oceniaç w oddzielnych lub równolegle przeprowadzonych badaniach wed∏ug metody dotyczàcej neurotoksycznoÊci w okresie rozwojowym. Informacji dotyczàcych badania zaburzeƒ czynnoÊciowych i innych skutków poporodowych nale˝y poszukiwaç za pomocà metody badania toksycznoÊci reprodukcyjnej w teÊcie dwupokoleniowym oraz metody badania neurotoksycznoÊci rozwojowej.
\nW niniejszej metodzie badawczej mogà byç konieczne, w szczególnych przypadkach, modyfikacje w oparciu o okreÊlonà wiedz´, np. dotyczàcà w∏aÊciwoÊci fizykochemicznych lub toksykologicznych badanej substancji. Takie modyfikacje sà dopuszczalne, gdy przekonujàce dowody naukowe sugerujà, ˝e modyfikacja b´dzie prowadziç do dostarczenia wi´kszej iloÊci danych wynikajàcych z badania. W takim przypadku te naukowe dowody powinny byç dok∏adnie przedstawione w sprawozdaniu koƒcowym z badania. podczas rozwoju przedporodowego lub w okresie poporodowym do czasu osiàgni´cia dojrza∏oÊci p∏ciowej. Do g∏ównych objawów toksycznoÊci rozwojowej zalicza si´: 1) zgon, 2) nieprawid∏owoÊci budowy,
\nToksykologia rozwoju by∏a uprzednio cz´sto nazywana teratologià.
\nSzkodliwe skutki: jakiekolwiek zmiany zwiàzane z nara˝eniem powodujàce obni˝enie zdolnoÊci organizmu do prze˝ywania, rozmna˝ania lub przystosowania si´ do Êrodowiska. Bioràc pod uwag´ toksykologi´ rozwoju rozumianà w najszerszym jej uj´ciu, zalicza si´ tutaj ka˝dy skutek, który zak∏óca normalny rozwój zarodka zarówno przed, jak i po narodzinach.
\nZmieniony wzrost: zmiana masy lub wielkoÊci narzàdu lub cia∏a potomstwa.
\nZmiany (nieprawid∏owoÊci): zmiany strukturalne w rozwoju, do których zalicza si´ zniekszta∏cenia i zmiennoÊç (zobacz pozycja 28 piÊmiennictwa):
\nZniekszta∏cenie/nieprawid∏owoÊç wi´ksza: zmiana strukturalna uwa˝ana za szkodliwà dla zwierz´cia (mo˝e byç tak˝e Êmiertelna) i jest zazwyczaj rzadka.
\nZmiennoÊç/nieprawid∏owoÊç mniejsza: zmiana strukturalna uwa˝ana za majàcà ma∏y lub niemajàcà ˝adnego szkodliwego wp∏ywu na zwierz´; mo˝e byç przejÊciowa bàdê stosunkowo cz´sto wyst´powaç w populacji kontrolnej.
\n1.2. DEFINICJE Zarodek: sumaryczne okreÊlenie wszystkich form pochodzàcych od zap∏odnionego jaja w jakiejkolwiek fazie rozwoju od zap∏odnienia a˝ do porodu, w tym b∏ony zarodkowe, a tak˝e zarodek lub p∏ód.
\nToksykologia rozwoju: badania skutków dzia∏ania szkodliwego na rozwijajàcy si´ organizm, które mogà byç nast´pstwem nara˝enia przed zap∏odnieniem, Implantacja (zagnie˝d˝enie): przy∏àczenie blastocysty do nab∏onka macicy, w tym jej penetracj´ przez ten nab∏onek i jej osadzenie w endometrium.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16407 — Poz. 2119 Zarodek: wczesna faza rozwojowa organizmu, w szczególnoÊci rozwijajàcy si´ produkt zap∏odnienia jaja po pojawieniu si´ osi pod∏u˝nej, a˝ do pojawienia si´ wszystkich g∏ównych struktur. woju przedporodowym. Zalecanym gatunkiem wÊród gryzoni jest szczur, a z pozosta∏ych zwierzàt królik.
\nW przypadku, u˝ycia innego gatunku zwierz´cia nale˝y podaç uzasadnienie.
\nEmbriotoksycznoÊç: szkodliwe dzia∏anie dla normalnej struktury, rozwoju, wzrostu i/lub ˝ywotnoÊci zarodka.
\n1.5.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt P∏ód: nienarodzone potomstwo w okresie pozarodkowym.
\nToksycznoÊç p∏odowa: szkodliwe dzia∏anie dla normalnej struktury, rozwoju, wzrostu i/lub ˝ywotnoÊci p∏odu.
\nPoronienie: przedwczesne wydalenie z macicy produktu zap∏odnienia: zarodka lub p∏odu niezdolnego do ˝ycia.
\nResorpcja: zarodek, który po zagnie˝d˝eniu w macicy obumar∏ i jest lub zosta∏ wch∏oni´ty:
\nResorpcja wczesna: dowód zagnie˝d˝enia bez rozpoznawalnego zarodka/p∏odu.
\nResorpcja póêna: martwy zarodek lub p∏ód z zewn´trznymi zmianami zwyrodnieniowymi.
\nNOAEL: skrót dla poziomu dawkowania bez obserwowanego szkodliwego skutku, jest to najwy˝szy poziom dawki, przy którym nie obserwuje si´ szkodliwych skutków zwiàzanych z nara˝eniem.
\n1.3. Substancja kontrolna Brak.
\n1.4. Zasada metody badawczej Badana substancja podawana jest zwierz´tom b´dàcym w cià˝y przynajmniej od momentu zagnie˝d˝enia do jednego dnia przed planowanym uÊmierceniem, które powinno nastàpiç, w miar´ mo˝liwoÊci, jak najbli˝ej dnia normalnego porodu, bez ryzykowania utraty danych wynikajàcych z porodu przedwczesnego. Niniejsza metoda badawcza nie jest przeznaczona, w celu badania jedynie okresu organogenezy (np.: 5—15 dzieƒ u gryzoni i 6—18 dzieƒ u królika), ale tak˝e w przypadku gdy to w∏aÊciwe, równie˝ skutków nara˝enia z okresu przed zagnie˝d˝eniem przez ca∏y okres cià˝y, a˝ do dnia przed ci´ciem cesarskim. Tu˝ przed cesarskim ci´ciem samice sà uÊmiercane, zawartoÊç macicy przebadana, a p∏ody ocenione pod wzgl´dem widocznych zmian zewn´trznych, szkieletowych oraz w tkankach mi´kkich.
\n1.5. Opis metody badawczej 1.5.1. Wybór gatunku zwierzàt Zaleca si´, by badanie by∏o wykonane na najbardziej odpowiednim gatunku, a stosowane powinny byç gatunki i rasy zwierzàt laboratoryjnych u˝ywanych powszechnie w badaniach toksycznoÊci w roz- Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C dla gryzoni i 18±3 °C dla królików. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci.
\nDo karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody.
\nKojarzenie w pary powinno byç przeprowadzone w klatkach odpowiednich do tych celów. Preferowane jest przetrzymywanie pojedynczych osobników, ale dopuszczalne jest tak˝e przetrzymywanie osobników w ma∏ych grupach.
\n1.5.3. Przygotowanie zwierzàt Powinny byç stosowane zdrowe zwierz´ta, aklimatyzowane przynajmniej przez 5 dni do warunków laboratoryjnych i nieu˝ywane wczeÊniej w innych doÊwiadczeniach. Powinny byç znane: rasa, êród∏a pochodzenia, p∏eç, waga i/lub wiek zwierzàt. Zwierz´ta wszystkich grup badanych powinny byç, na ile to mo˝liwe, w tym samym wieku i mieç takà samà mas´ cia∏a. Na ka˝dym poziomie dawkowania stosuje si´ m∏ode doros∏e dziewicze samice. Samice powinny byç kojarzone z samcami tego samego gatunku i rasy, nale˝y unikaç kojarzenia osobników spokrewnionych.
\nW przypadku gryzoni zerowym dniem cià˝y jest ten, w którym zaobserwuje si´ czop pochwowy i/lub nasienie; w przypadku królików dniem zerowym jest zazwyczaj dzieƒ pokrycia lub sztucznej inseminacji, je˝eli taka technika jest stosowana. Klatki nale˝y ustawiç w taki sposób, by zminimalizowaç mo˝liwy wp∏yw ich ustawienia na wyniki badania. Ka˝demu zwierz´ciu nale˝y przypisaç jego w∏asny numer identyfikacyjny.
\nSamice powinny byç przypisane do grupy kontrolnej i grup nara˝anych w sposób losowy. Je˝eli samice by∏y kojarzone grupowo, to zwierz´ta z ka˝dej partii powinny zostaç równomiernie rozdzielone pomi´dzy grupy. Podobnie samice inseminowane przez tego samego samca powinny byç równomiernie rozdzielone pomi´dzy grupy.
\n1.6. Sposób post´powania 1.6.1. Liczba i p∏eç zwierzàt Ka˝da grupa kontrolna i badana powinna zawieraç wystarczajàcà liczb´ samic, by uzyskaç w przybli˝eniu 20 samic z miejscami zagnie˝d˝enia podczas autopsji.
\nGrupy z mniej ni˝ 16 zwierz´tami z miejscami zagnie˝d˝enia mogà byç nieodpowiednie. Wyst´pujàca ÊmiertelnoÊç osobników rodzicielskich nie musi byç przyczynà uniewa˝nienia badania, pod warunkiem ˝e nie przekracza 10 %.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16408 — 1.6.2. Przygotowanie dawek Je˝eli stosowany jest noÊnik lub inny dodatkowy zwiàzek umo˝liwiajàcy podawanie substancji, to nale˝y braç pod uwag´ jego nast´pujàce charakterystyczne cechy: wp∏yw na absorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm i retencj´ lub wydalanie badanej substancji; wp∏yw na w∏aÊciwoÊci chemiczne badanej substancji, które mogà zmieniç jej charakterystyk´ toksykologicznà; wp∏yw na spo˝ywanie pokarmu i pobieranie wody przez zwierz´ta. NoÊnik nie powinien byç ani toksyczny dla rozwoju, ani nie mo˝e mieç wp∏ywu na rozrodczoÊç.
\nPoz. 2119 zmu i toksykokinetyki badanej substancji lub substancji podobnych strukturalnie. Informacje te pomogà w doborze w∏aÊciwego sposobu dawkowania.
\nRównolegle nale˝y stosowaç grup´ kontrolnà. Tej grupie podaje si´ placebo lub noÊnik, je˝eli taki jest stosowany podczas podawania substancji. Wszystkie grupy powinny otrzymywaç takà samà obj´toÊç badanej substancji lub noÊnika. Ze zwierz´tami w grupach kontrolnych nale˝y obchodziç si´ w taki sam sposób, jak ze zwierz´tami nara˝anymi. Grupy kontrolne z noÊnikiem powinny otrzymywaç noÊnik w najwy˝szej zastosowanej iloÊci (jak w grupie o najni˝szej stosowanej dawce).
\n1.6.3. Podawanie substancji 1.6.4. Badanie dawki granicznej W zasadzie badana substancja powinna byç podawana codziennie od zagnie˝d˝enia (np. 5 dnia po skojarzeniu) do dnia przed planowanym porodem za pomocà cesarskiego ci´cia. W przypadku gdy dost´pne sà wyniki badania wst´pnego, które nie wskazujà na wysoki potencja∏ strat przed zagnie˝d˝eniem, to podawanie substancji mo˝e byç przed∏u˝one na ca∏y okres cià˝y, od dnia skojarzenia do dnia przed planowanym uÊmierceniem. Ogólnie wiadomo jest, ˝e niew∏aÊciwe obchodzenie si´ ze zwierz´tami lub stres podczas cià˝y mo˝e powodowaç poronienia. Aby zapobiec poronieniom spowodowanym przez czynniki niezwiàzane z podawanà substancjà, nale˝y unikaç niepotrzebnego zak∏ócania spokoju ci´˝arnych samic, a tak˝e stresu spowodowanego przez czynniki zewn´trzne takie jak ha∏as.
\nNale˝y stosowaç przynajmniej trzy poziomy dawek i równoleg∏à grup´ kontrol´. Zdrowe zwierz´ta powinny zostaç przypisane do grup nara˝anych i kontrolnych w sposób losowy. Poziomy dawkowania powinny zostaç ustalone tak, by spowodowaç stopniowanie skutków toksycznych. Najwy˝sza dawka powinna zostaç dobrana w taki sposób, by indukowaç toksycznoÊç rozwojowà i/lub objawy toksyczne u samic (objawy kliniczne lub spadek masy cia∏a), ale nie ich zgon bàdê powa˝ne cierpienie, chyba ˝e jest to ograniczone w∏aÊciwoÊciami fizykochemicznymi lub w∏aÊciwoÊciami biologicznymi badanej substancji. Przynajmniej jedna dawka poÊrednia powinna powodowaç minimalne skutki toksyczne mo˝liwe do zaobserwowania. Najni˝sza dawka nie powinna powodowaç jakiejkolwiek toksycznoÊci rozwojowej lub toksycznoÊci dla osobników rodzicielskich. Sekwencja malejàcych dawek powinna zostaç dobrana tak, by mo˝na by∏o wykazaç odpowiedê typu dawka–skutek i wyznaczyç poziom bez obserwowanego szkodliwego skutku (NOAEL). Optymalne dla ustalenia sekwencji malejàcych dawek sà wspó∏czynniki o wartoÊci 2—4, a cz´sto dodanie czwartej badanej grupy jest lepsze ni˝ stosowanie bardzo du˝ych wspó∏czynników pomi´dzy dawkami (np. wi´kszych ni˝ 10). Chocia˝ celem jest ustalenie wartoÊci NOAEL dla matek, to badania, w których nie ustalono takiego poziomu, równie˝ sà mo˝liwe do zaakceptowania (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa).
\nPoziomy dawek powinny zostaç ustalone z uwzgl´dnieniem istniejàce danych o toksycznoÊci, a tak˝e informacji dodatkowych na temat metaboli- Je˝eli badanie w jednej dawce na poziomie przynajmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ po podaniu do˝o∏àdkowym i przy zastosowaniu procedur opisanych w niniejszej metodzie nie powoduje powstawania mo˝liwych do zaobserwowania skutków toksycznych i je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç takich skutków na podstawie istniejàcych danych (np. w przypadku zwiàzków strukturalnie i/lub metabolicznie podobnych) to wtedy pe∏ne badanie z trzema poziomami dawek mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne. Spodziewane nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na potrzeb´ zastosowania wy˝szej dawki stosowanej do˝o∏àdkowo w badaniu st´˝eƒ granicznych. W przypadku innych sposobów podawania, takich jak inhalacyjne bàdê skórne, w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne badanej substancji cz´sto mogà wskazywaç na maksymalny mo˝liwy do uzyskania poziom nara˝enia (np. zastosowanie po naniesieniu na skór´ nie powinno powodowaç ostrej toksycznoÊci miejscowej).
\n1.6.5. Podawanie substancji Badana substancja lub noÊnik sà zazwyczaj podawane do˝o∏àdkowo za pomocà sondy do˝o∏àdkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Je˝eli stosowany jest inny sposób podawania, to nale˝y podaç jego uzasadnienie; konieczne mogà byç wtedy pewne modyfikacje (zobacz pozycje 2, 3 i 4 piÊmiennictwa). Badana substancja powinna byç podawana codziennie, w przybli˝eniu o tej samej porze dnia.
\nDawka dla ka˝dego zwierz´cia powinna opieraç si´ na najbardziej aktualnych pomiarach masy cia∏a osobnika. Nale˝y byç jednak˝e ostro˝nym w dostosowywaniu dawki w ostatnim trymestrze cià˝y. Do wyboru dawki stosowane powinny byç istniejàce dane, by zapobiec nadmiernej toksycznoÊci dla osobnika macierzystego. Je˝eli jednak takie objawy toksycznoÊci pojawià si´, to zwierz´ta te powinny zostaç w sposób humanitarny uÊmiercone. Je˝eli objawy takie pojawià si´ u kilku ci´˝arnych samic z nara˝anej grupy, to nale˝y wziàç pod uwag´ zakoƒczenie doÊwiadczenia z tà grupà. Gdy substancja podawana jest przez zg∏´bnik, to powinna byç podawana w pojedynczej dawce przy pomocy sondy do˝o∏àdkowej lub kaniuli intubacyjnej.
\nMaksymalna obj´toÊç, jaka mo˝e zostaç podana jednorazowo zwierz´ciu, zale˝y od jego rozmiarów. Obj´toÊç ta nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16409 — ∏a, z wyjàtkiem przypadku roztworów wodnych gdzie stosowane mo˝e byç 2 ml/100 g masy cia∏a. Je˝eli jako noÊnik stosuje si´ olej kukurydziany, to obj´toÊç nie powinna przekraczaç 0,4 ml/100 g masy cia∏a. ZmiennoÊç obj´toÊci powinna byç zminimalizowana przez dostosowanie st´˝enia tak, aby zapewniç sta∏à obj´toÊç na wszystkich poziomach dawek.
\n1.6.6. Obserwacje samic ci´˝arnych Obserwacje kliniczne powinny byç dokonywane, a wyniki zapisywane przynajmniej raz dziennie, najlepiej o tej samej porze dnia, bioràc pod uwag´ szczytowy okres przewidywanych skutków po podawaniu substancji. Kondycja zwierzàt powinna byç opisywana z uwzgl´dnieniem ÊmiertelnoÊci, stanów agonalnych, sta∏ych zmian w zachowaniu i wszystkich innych objawów wyraênej toksycznoÊci.
\n1.6.7. Masa cia∏a i spo˝ycie pokarmu Zwierz´ta powinny byç wa˝one w dniu zerowym lub nie póêniej ni˝ w trzecim dniu (zwierz´ta po skojarzeniu dostarczone przez dostawc´ zewn´trznego), nast´pnie pierwszego dnia nara˝enia i przynajmniej co trzy dni podczas okresu podawania substancji oraz w dniu przewidywanego uÊmiercenia.
\nSpo˝ycie pokarmu powinno byç zapisywane w odst´pach trzydniowych i zbiegaç si´ w czasie z pomiarami masy cia∏a.
\n1.6.8. Badanie sekcyjne Samice powinny zostaç uÊmiercone na dzieƒ przed przewidywanym porodem. Samice wykazujàce objawy poronienia lub przedwczesnego porodu przed zaplanowanym uÊmierceniem powinny zostaç uÊmiercone i poddane dok∏adnym ogl´dzinom makroskopowym.
\nW czasie zakoƒczenia doÊwiadczenia lub zgonu podczas doÊwiadczenia samice powinny zostaç przebadane makroskopowo pod kàtem nieprawid∏owoÊci w budowie i zmian patologicznych. W celu unikni´cia zasugerowania wyniku, badania samic podczas ci´cia cesarskiego oraz p∏odów powinny byç wykonane bez wiedzy o tym, z jakiej grupy one pochodzi∏y.
\n1.6.9. Badanie zawartoÊci macicy Natychmiast po zakoƒczeniu porodu lub tu˝ po Êmierci macice powinny byç usuni´te, a stopieƒ zaawansowania cià˝y okreÊlony. Macice, których wyglàd nie wskazuje na cià˝´, powinny zostaç poddane dalszym badaniom (np. barwienie siarczkiem amonu u gryzoni i barwienie Salewskiego lub innà odpowiednià metodà dla królików), by potwierdziç brak cià˝y (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa).
\nNale˝y zwa˝yç macice samic ci´˝arnych wraz z szyjkà macicy. Nie nale˝y zapisywaç masy macic samic ci´˝arnych uzyskanych od zwierzàt, które pad∏y podczas doÊwiadczenia.
\nPoz. 2119 U zwierzàt ci´˝arnych nale˝y okreÊliç liczb´ cia∏ek ˝ó∏tych.
\nZawartoÊç macicy powinna zostaç przebadana pod kàtem liczby martwych zarodków lub p∏odów oraz p∏odów ˝ywych. W celu oszacowania wzgl´dnego czasu Êmierci zarodka nale˝y opisaç stopieƒ resorpcji (zobacz pkt 1.2).
\n1.6.10. Badanie p∏odów Nale˝y okreÊliç p∏eç i mas´ cia∏a ka˝dego p∏odu.
\nU ka˝dego p∏odu powinny zostaç przebadane zmiany zewn´trzne (zobacz pozycja 6 piÊmiennictwa).
\nNale˝y przebadaç p∏ody pod kàtem zmian w szkielecie i tkankach mi´kkich (np. zmiany, zniekszta∏cenia i nieprawid∏owoÊci) (zobacz pozycje 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 i 24 piÊmiennictwa). Po˝àdana, ale niewymagana jest kategoryzacja zmian p∏odowych. Je˝eli jednak jest ona wykonywana, to nale˝y wyraênie podaç kryteria definicji ka˝dej kategorii. Szczególnà uwag´ nale˝y zwróciç na uk∏ad rozrodczy, który powinien zostaç przebadany pod kàtem zmian w rozwoju.
\nW przypadku gryzoni oko∏o po∏owa miotów powinna byç przebadana pod kàtem zmian szkieletowych. Pozosta∏a cz´Êç powinna byç przebadana pod wzgl´dem zmian w tkankach mi´kkich przy zastosowaniu uznanych w∏aÊciwych metod serii przekrojów lub techniki przekrojów ca∏oÊciowych.
\nW przypadku zwierzàt innych ni˝ gryzonie, np.: króliki, wszystkie p∏ody powinny zostaç przebadane pod wzgl´dem zmian w szkielecie jak i tkankach mi´kkich. Cia∏a tych p∏odów powinny byç ocenione przez sekcj´ pod kàtem zmian w tkankach mi´kkich, do czego zalicza si´ równie˝ procedury do dalszego szacowania wewn´trznej struktury serca (zobacz pozycja 25 piÊmiennictwa). G∏owy po∏owy p∏odów przebadanych w ten sposób powinny zostaç oddzielone i poddane badaniom pod wzgl´dem zmian w tkankach mi´kkich (oczy, mózg, komory nosowe i j´zyk) przy zastosowaniu standardowych metod serii przekrojów (zobacz pozycja 26 piÊmiennictwa) lub innych równie czu∏ych metod. Cia∏a tych p∏odów i pozosta∏e nienaruszone p∏ody powinny zostaç przebadane pod wzgl´dem zmian w szkielecie przy zastosowaniu tych samych metod, jak opisane dla gryzoni.
\nDane liczbowe powinny byç oszacowane w∏aÊciwà metodà statystycznà. Ka˝dy p∏ód nale˝y traktowaç w analizie danych jako jednostk´. Stosowane powinny byç ogólnie uznane metody statystyczne; wybrane jako cz´Êç sk∏adowa uk∏adu doÊwiadczenia, a ich wybór powinien byç uzasadniony. Dane zwierzàt, które nie prze˝y∏y do planowanego uÊmiercenia, tak˝e powinny byç podane. Mogà one równie˝ byç uwzgl´dnione w obliczonych wartoÊciach Êrednich z ka˝dej grupy. Znaczenie takich wyników oraz ich uwzgl´dnienie bàdê te˝ nieuwzgl´dnienie w Êrednich dla grup(y) w ka˝dym przypadku powinno byç oszacowane i uzasadnione.
\n2.2. Ocena wyników Obserwacje poczynione w przeprowadzonym badaniu toksycznoÊci rozwoju przedporodowego powinny byç ocenione pod wzgl´dem zaobserwowanych skutków. Ocena ta powinna zawieraç nast´pujàce informacje: — wyniki badania zarodków/p∏odów i samic w tym ocena powiàzaƒ lub ich brak pomi´dzy nara˝eniem zwierzàt badanych na badanà substancj´ oraz wyst´powaniem i nasileniem wszystkich obserwacji, — kryteria stosowane w kategoryzacji zmian zewn´trznych, tkanek mi´kkich i szkieletu p∏odów, je˝eli dokonano takiej kategoryzacji, — w celu wspomo˝enia interpretacji danych z doÊwiadczenia, dane z wczeÊniej przeprowadzonych badaƒ jako dane kontrolne, je˝eli jest to w∏aÊciwe, — dane liczbowe stosowane w obliczaniu wszystkich wartoÊci procentowych i odpowiednich wspó∏czynników, — odpowiednià analiz´ statystycznà uzyskanych wyników, w tym wystarczajàce informacje na temat metody analizy tak, aby niezale˝ny recenzent/statystyk móg∏ ponownie dokonaç obliczeƒ i odtworzyç analiz´.
\nW badaniach, które wykazujà brak objawów dzia∏ania toksycznego, pod uwag´ nale˝y braç dalsze badania dotyczàce absorpcji i biodost´pnoÊci badanej substancji.
\n2.3. Interpretacja wyników Badanie toksycznoÊci w rozwoju przedporodowym dostarcza informacji na temat skutków dzia∏ania toksycznego na samice i wewnàtrzmaciczny rozwój ich potomstwa powtarzanego podawania drogà pokarmowà substancji w czasie cià˝y. Wyniki badaƒ powinny byç interpretowane w po∏àczeniu z wynikami z badaƒ podprzewlek∏ych, rozmna˝ania, toksykokinetycznych i innych. Poniewa˝ nacisk po∏o˝ony jest zarówno na toksycznoÊç ogólnà, jak i rozwojowà, to wy- Poz. 2119 niki badania pozwalajà na rozró˝nienie pomi´dzy skutkami rozwojowymi nast´pujàcymi przy niewystàpieniu toksycznoÊci ogólnej i tymi, które wyst´pujà tylko w warunkach nara˝enia na dawki toksyczne dla zwierzàt rodzicielskich.
\nBadana substancja: — stan fizyczny i gdy to ma znaczenie równie˝ w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, — identyfikacja, w tym numer CAS, je˝eli jest znany/ustalony, — czystoÊç.
\nNoÊnik (je˝eli by∏ stosowany): — uzasadnienie wyboru noÊnika, je˝eli zosta∏ zastosowany inny noÊnik ni˝ woda.
\nBadane zwierz´ta: — gatunek/szczep, — liczba i wiek zwierzàt, — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasza itp., — masy poszczególnych zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia.
\nWarunki badania: — uzasadnienie wybranych dawek, — szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substancji, w tym przygotowania pokarmu, osiàgni´te st´˝enie, trwa∏oÊç i jednorodnoÊç preparatu, — szczegó∏y dotyczàce podawania badanej substancji, — przeliczenie st´˝enia (ppm) badanej substancji z zawartoÊci w paszy/wodzie pitnej na dawk´ rzeczywistà (mg/kg masy cia∏a/dzieƒ), je˝eli istnieje taka koniecznoÊç, — warunki Êrodowiskowe, — szczegó∏y dotyczàce paszy i wody pitnej.
\nWyniki:
\nDane o toksycznoÊci dla samic wed∏ug dawki powinny zawieraç, ale nie ograniczaç si´ do: — liczby zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia, liczby zwierzàt prze˝ywajàcych badanie, liczby zwierzàt ci´˝arnych, liczby poronieƒ i przedwczesnych porodów, Dziennik Ustaw Nr 251 — 16411 — — dni padni´ç podczas badania i liczby zwierzàt, które prze˝y∏y do koƒca badania, — danych zwierzàt, które nie prze˝y∏y do koƒca badania, powinny byç podane, ale nie nale˝y ich uwzgl´dniaç w statystycznych porównaniach pomi´dzy grupami, — dnia zaobserwowania ka˝dego nietypowego objawu klinicznego i jego nast´pstw, — masy cia∏a, zmiany masy cia∏a i masy macicy samicy ci´˝arnej, w tym opcjonalnie zmiany masy cia∏a skorygowanej o mas´ macicy samicy ci´˝arnej, — spo˝ycia paszy i, je˝eli mierzone, spo˝ycie wody, — wyników z sekcji, w tym masy macicy, — wartoÊci NOAEL dla skutków dzia∏ania na osobniki pokolenia rodzicielskiego i dla skutków dzia∏ania na rozwój.
\nRozwojowe wartoÊci koƒcowe wed∏ug dawki dla samic z zagnie˝d˝eniami: — liczba cia∏ek ˝ó∏tych, — liczba zagnie˝d˝eƒ, liczba i procent martwych i ˝ywych p∏odów i resorpcji, — liczba i procent poronieƒ przed i po zagnie˝d˝eniu.
\nRozwojowe wartoÊci koƒcowe wed∏ug dawki dla samic z ˝ywymi p∏odami: — liczba i wartoÊci procentowe dla ˝ywego potomstwa, — stosunek p∏ci, — masa cia∏a p∏odów najlepiej zebrana wed∏ug p∏ci, — zniekszta∏cenia zewn´trzne, tkanki mi´kkiej i szkieletu oraz inne wa˝ne zmiany, — kryteria kategoryzacji, je˝eli zosta∏a ona zastosowana, — ca∏kowita liczba i wartoÊci procentowe dla p∏odów i matek z jakimikolwiek zmianami zewn´trznymi, zmianami tkanki mi´kkiej i szkieletu, a tak˝e rodzaje i wyst´powanie poszczególnych nieprawid∏owoÊci i inne wa˝ne zmiany.
\nOmówienie wyników.
\nWnioski.
\nPoz. 2119
\nFundam. Appl. Toxicol. 14, 386—398.
\nD.H.M. Woolam (ed.), Vol. 3. Academic Press, NY.
\nJ. Morphol. 127, 291—306.
\nRisk Anal. 16, 399—400.
\nSupplement to Teratology Workshop Manual, pp. 163—173.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16412 —
\nPoz. 2119
\nKwasigroch). Universoity of Chicago, Chicago, IL, pp. 126—144.
\nZa∏àcznik nr 8 B.35. DZIA¸ANIE TOKSYCZNE NA ROZRODCZOÂå W WARUNKACH TESTU DWUPOKOLENIOWEGO 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 416 (2001). toksycznoÊci rozwojowej, bàdê te˝ mogà byç one cz´Êcià osobnych badaƒ z u˝yciem odpowiednich metod badawczych.
\n1.2. Zasada metody badawczej 1.1. Wst´p Niniejsza metoda — dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego — zosta∏a opracowana w celu dostarczenia ogólnych informacji dotyczàcych wp∏ywu badanej substancji na nienaruszalnoÊç i wydajnoÊç uk∏adów rozrodczych samca i samicy, w tym na funkcjonowanie gonad, cykl rujowy, zachowanie w czasie kojarzenia, zap∏odnienie, cià˝´, poród, laktacj´ i odsadzanie oraz rozwój i wzrost potomstwa. Badania mogà tak˝e dostarczyç informacji o wp∏ywie badanej substancji na zachorowalnoÊç noworodków, ÊmiertelnoÊç w okresie neonatalnym, wst´pnych danych o przedporodowym i poporodowym dzia∏aniu toksycznym. Wyniki uzyskane w przedstawionym badaniu mogà s∏u˝yç jako wskazówki dla nast´pnych badaƒ. Oprócz badania wzrostu i rozwoju pokolenia F1 dzi´ki niniejszej metodzie mo˝na tak˝e oceniç integralnoÊç i wydajnoÊç uk∏adów rozrodczych samców i samic, a tak˝e wzrost i rozwój pokolenia F2.
\nDalsze informacje o dzia∏aniu toksycznym na rozwój p∏odu i zaburzeniach czynnoÊciowych mogà byç uzyskane w badaniach dodatkowych do badania zaprezentowanego w niniejszej metodyce przy zastosowaniu metody dla toksycznoÊci rozwojowej i/lub neuro- Badana substancja podawana jest w stopniowanych dawkach kilku grupom samców i samic. W celu wywo∏ania jakichkolwiek szkodliwych skutków dla spermatogenezy samce pokolenia P powinny otrzymywaç badanà substancj´ w okresie wzrostu i przynajmniej przez jeden pe∏ny cykl spermatogenetyczny (w przybli˝eniu 56 dni u myszy i 70 dni u szczura). Dzia∏anie na nasienie jest oceniane z wykorzystaniem kilku parametrów (np. morfologia nasienia i jego ruchliwoÊç) oraz w badaniach histopatologicznych. Je˝eli dost´pne sà archiwalne dane o spermatogenezie pochodzàce z poprzednio przeprowadzonych badaƒ o wystarczajàcym okresie powtarzanego nara˝enia, np. badanie 90-dniowe, to samce pokolenia P nie muszà byç uwzgl´dniane w szacowaniu. Zaleca si´ jednak˝e, aby próbki lub zapisy cyfrowe dotyczàce nasienia pokolenia P by∏y zachowane tak, by umo˝liwiç ich póêniejsze oszacowanie. Samice pokolenia P powinny otrzymywaç badanà substancj´ w okresie wzrostu i przez kilka pe∏nych cyklów rujowych tak, aby wykryç jakikolwiek szkodliwy wp∏yw tej substancji na cykl rujowy. Badanà substancj´ podaje si´ zwierz´tom rodzicielskim (P) podczas ich kojarzenia, podczas cià˝y i do odsadzenia potomstwa F1. Po odsadzeniu podawanie Dziennik Ustaw Nr 251 — 16413 — substancji pokoleniu F1 kontynuuje si´ w okresie ich wzrostu, a˝ do osiàgni´cia dojrza∏oÊci, w okresie kojarzenia i do uzyskania potomstwa — pokolenia F2 a nast´pnie a˝ do usamodzielnienia pokolenia F2.
\nObserwacje kliniczne i badania patologiczne prowadzi si´ u wszystkich zwierzàt pod kàtem objawów dzia∏ania toksycznego ze zwróceniem szczególnej uwagi na skutki wskazujàce na zaburzenia budowy i czynnoÊci uk∏adów rozrodczych samic i samców oraz na wzrost i rozwój potomstwa.
\n1.3. Opis metody badawczej 1.3.1. Wybór gatunku zwierzàt Zalecanym gatunkiem jest szczur. Je˝eli stosowany jest inny gatunek zwierz´cia, to nale˝y to uzasadniç. W takiej sytuacji konieczne wówczas b´dà pewne modyfikacje badania. W badaniu nie powinny byç stosowane rasy charakteryzujàce si´ niskà p∏odnoÊcià lub dobrze znanà wysokà cz´stotliwoÊcià wyst´powania wad rozwojowych. Na poczàtku badania ró˝nica w masie cia∏a badanych zwierzàt powinna byç jak najmniejsza i nie powinna przekraczaç 20 % Êredniej masy cia∏a ka˝dej z p∏ci.
\n1.3.2. Warunki przetrzymywania i karmienie Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Wybór paszy mo˝e zale˝eç od koniecznoÊci zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji, je˝eli jest ona podawana tà metodà.
\nZwierz´ta mogà byç przetrzymywane pojedynczo lub w ma∏ych grupach tej samej p∏ci. Kojarzenie powinno odbywaç si´ w klatkach przystosowanych do tych celów. Po kopulacji skojarzone samice powinny byç przetrzymywane pojedynczo w klatkach przystosowanych do porodu i macierzyƒstwa. Skojarzone szczury mogà tak˝e byç trzymane w ma∏ych grupach i rozdzielone na jeden lub dwa dni przed porodem.
\nSkojarzonym zwierz´tom nale˝y dostarczyç odpowiedni materia∏ do budowy gniazda, gdy okres porodu jest bliski.
\n1.3.3. Przygotowanie zwierzàt Stosowane powinny byç zdrowe zwierz´ta aklimatyzowane przynajmniej przez 5 dni do warunków laboratoryjnych i nieu˝ywane wczeÊniej w innych doÊwiadczeniach. Powinny byç znane: gatunek, szczep, êród∏o pochodzenia, p∏eç, masa cia∏a i/lub wiek. Pokrewieƒstwa pomi´dzy zwierz´tami powinny byç znane tak, by uniknàç krzy˝owania zwierzàt spokrewnionych. Zwierz´ta przypisuje si´ losowo do grupy kontrolnej i grupy nara˝anej (zalecany jest dobór wed∏ug masy cia∏a).
\nPoz. 2119 Klatki nale˝y ustawiç w taki sposób, by zminimalizowaç mo˝liwy wp∏yw ich ustawienia na wyniki badania.
\nKa˝demu zwierz´ciu nale˝y przypisaç jego w∏asny numer identyfikacyjny. Dla pokolenia P nale˝y to uczyniç przed rozpocz´ciem podawania substancji. W przypadku pokolenia F1 nale˝y to uczyniç przy odsadzaniu zwierzàt, które zosta∏y wybrane do kojarzenia. Zapisy wskazujàce na pochodzenie miotu powinny byç zachowane dla wszystkich wybranych zwierzàt pokolenia F1.
\nPonadto tak szybko, jak to jest mo˝liwe, po porodzie w przypadku, gdy bierze si´ pod uwag´ badania czynnoÊciowe lub wa˝enie poszczególnych osobników, zaleca si´ identyfikacj´ osobników m∏odych.
\nZwierz´ta rodzicielskie (P) w momencie rozpocz´cia podawania badanej substancji powinny byç w wieku 5 do 9 tygodni. Zwierz´ta ze wszystkich grup badanych powinny, na tyle, na ile to mo˝liwe, byç w tym samym wieku i mieç takà samà mas´ cia∏a.
\n1.4. Sposób post´powania 1.4.1. Liczba i p∏eç zwierzàt Ka˝da grupa nara˝ana i kontrolna powinna sk∏adaç si´ z odpowiedniej liczby zwierzàt, tj. powinna liczyç nie mniej ni˝ 20 samic ci´˝arnych lub bliskich porodu. W przypadku substancji powodujàcych niektóre niepo˝àdane skutki zwiàzane z nara˝eniem (np. sterylnoÊç lub nadmierna toksycznoÊç w przypadku stosowania wysokich dawek) spe∏nienie tego warunku mo˝e byç niemo˝liwe. Celem jest uzyskanie takiej iloÊci ci´˝arnych samic, by zapewniç odpowiednie oszacowanie potencja∏u substancji w zakresie wp∏ywu na p∏odnoÊç, cià˝´, zachowanie osobników rodzicielskich i osesków oraz wzrost i rozwój potomstwa F1 od zap∏odnienia do osiàgni´cia dojrza∏oÊci oraz rozwój ich potomstwa (F2) do momentu odsadzenia. Dlatego te˝ brak po˝àdanej iloÊci samic w cià˝y (tj. 20) nie zawsze oznacza uniewa˝nienie badania, a ka˝dy przypadek powinien byç oceniany indywidualnie.
\n1.4.2. Przygotowanie substancji w okreÊlonych dawkach Zaleca si´, by substancj´ podawaç drogà pokarmowà (z pokarmem, wodà pitnà lub za pomocà sondy), chyba ˝e inna droga podawania wydaje si´ bardziej w∏aÊciwa.
\nJe˝eli jest to konieczne, to badana substancja powinna byç rozpuszczana lub zawieszana w odpowiednim noÊniku. Zaleca si´, o ile jest to mo˝liwe, stosowanie w pierwszej kolejnoÊci roztworów/zawiesin wodnych, a w nast´pnej kolejnoÊci roztworów/emulsji olejowych (w oleju kukurydzianym) i w koƒcu innych noÊników. W przypadku stosowania noÊników innych ni˝ woda powinny byç znane ich w∏aÊciwoÊci toksykologiczne. Nale˝y okreÊliç trwa∏oÊç badanej substancji w noÊniku.
\n1.4.3. Dawkowanie Nale˝y stosowaç przynajmniej trzy poziomy dawek i równoleg∏à kontrol´. Najwy˝sza dawka powinna Dziennik Ustaw Nr 251 — 16414 — byç dobrana w taki sposób, by wywo∏aç dzia∏anie toksyczne, ale nie powodowaç Êmierci lub cierpienia zwierzàt, chyba ˝e jest to ograniczone w∏aÊciwoÊciami fizykochemicznymi lub skutkami biologicznymi badanej substancji. W przypadku niespodziewanej ÊmiertelnoÊci wynoszàcej w przybli˝eniu mniej ni˝ 10 % w pokoleniu zwierzàt rodzicielskich (P) badanie w dalszym ciàgu mo˝liwe jest do zaakceptowania. Sekwencja malejàcych dawek powinna zostaç dobrana tak, by mo˝na by∏o wykazaç odpowiedê typu dawka-skutek i wyznaczyç poziom bez obserwowanego skutku szkodliwego (NOAEL). Optymalne dla ustalenia sekwencji malejàcych dawek sà wspó∏czynniki o wartoÊci od 2—4, a cz´sto dodanie czwartej badanej grupy jest lepsze ni˝ stosowanie bardzo du˝ych wspó∏czynników pomi´dzy dawkami (np. wi´kszych ni˝ 10). W przypadku badaƒ drogà pokarmowà odst´p pomi´dzy dawkami nie powinien byç wi´kszy ni˝ 3. Poziomy dawek powinny zostaç ustalone z uwzgl´dnieniem istniejàcych danych o toksycznoÊci, a tak˝e informacji dodatkowych na temat metabolizmu i toksykokinetyki badanej substancji lub substancji o podobnej strukturze. Informacje te pomogà w doborze w∏aÊciwego sposobu dawkowania.
\nRównolegle nale˝y stosowaç grup´ kontrolnà. Tej grupie podaje si´ placebo lub noÊnik, je˝eli taki jest stosowany podczas podawania substancji. Wszystkie grupy powinny otrzymywaç takà samà obj´toÊç badanej substancji lub noÊnika. Ze zwierz´tami w grupach kontrolnych nale˝y obchodziç si´ w taki sam sposób, jak ze zwierz´tami nara˝anymi. Grupy kontrolne z noÊnikiem powinny otrzymywaç ten noÊnik w najwy˝szej z zastosowanych obj´toÊci. Je˝eli badana substancja podawana w paszy powoduje zmniejszenie pobierania lub wykorzystania paszy, to pod uwag´ mo˝e byç brana koniecznoÊç zastosowania pary grup kontrolnych.
\nZamiast pary grup kontrolnych mo˝na wykorzystaç dane z kontrolowanych badaƒ szacujàcych skutki obni˝onego spo˝ycia pokarmu na parametry rozmna˝ania.
\nNale˝y braç pod uwag´ nast´pujàce cechy charakterystyczne noÊnika i innych dodatków: wp∏ywy na absorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm lub retencj´ badanej substancji; wp∏ywy na w∏asnoÊci chemiczne badanej substancji, które mogà zmieniç jej w∏aÊciwoÊci toksykologiczne; wp∏ywy na spo˝ywanie pokarmu lub wody i wp∏yw na stan fizjologiczny zwierz´cia.
\n1.4.4. Badanie dawki granicznej Pe∏ne badanie z u˝yciem substancji podawanej w ró˝nych dawkach mo˝e byç uwa˝ane za niepotrzebne w przypadku, gdy: — badanie prowadzone drogà pokarmowà przy zastosowaniu jednej dawki na poziomie przynajmniej 1000 mg/kg masy cia∏a/dzieƒ albo podania w paszy lub w wodzie substancji w iloÊci stanowiàcej odpowiedni ekwiwalent procentowy badanej substancji i przy zastosowaniu procedur opisanych w niniejszej metodzie nie powoduje powstawania mo˝liwych do zaobserwowania objawów dzia∏ania toksycznego zarówno u zwierzàt rodzicielskich, jak i u ich potomstwa, Poz. 2119 — je˝eli nie nale˝a∏o si´ spodziewaç takich skutków na podstawie istniejàcych danych (np. w przypadku zwiàzków strukturalnie i/lub metabolicznie podobnych).
\nSpodziewane nara˝enie ludzi mo˝e wskazywaç na potrzeb´ zastosowania wy˝szej dawki podawanej drogà pokarmowà ni˝ w badaniu dawki granicznej.
\nW przypadku innych sposobów podawania, takich jak inhalacyjne bàdê skórne, w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne badanej substancji, takie jak jej rozpuszczalnoÊç cz´sto mogà wskazywaç na maksymalny mo˝liwy do uzyskania poziom nara˝enia.
\n1.4.5. Podawanie substancji Badana substancja powinna byç podawana zwierz´tom 7 dni w tygodniu. Preferowane jest podawanie substancji drogà pokarmowà (w paszy, w wodzie lub za pomocà sondy do˝o∏àdkowej). Je˝eli stosowany jest inny sposób podawania, to nale˝y podaç jego uzasadnienie; konieczne mogà byç wtedy pewne modyfikacje. Badana substancja powinna byç podawana wszystkim zwierz´tom tà samà metodà podczas w∏aÊciwego okresu doÊwiadczenia. Je˝eli substancj´ podaje si´ do˝o∏àdkowo, to powinno stosowaç si´ sond´ do˝o∏àdkowà. Obj´toÊç podawanej cieczy jednorazowo nie powinna przekraczaç 1 ml/100 g masy cia∏a (0,4 ml/100 g masy cia∏a w przypadku oleju kukurydzianego), z wyjàtkiem roztworów wodnych, gdy stosowaç mo˝na 2 ml/100 g masy cia∏a. Z wyjàtkiem substancji dra˝niàcych lub ˝ràcych, które zwi´kszajà skutki swego dzia∏ania ze wzrostem st´˝enia, zmiennoÊç obj´toÊci powinna byç minimalizowana przez dostosowanie st´˝enia tak, by zapewniç sta∏à obj´toÊç we wszystkich dawkach. W badaniach z zastosowaniem sondy m∏ode b´dà otrzymywaç badanà substancj´ poÊrednio z mlekiem, dopóki nie rozpocznie si´ po odsadzeniu podawanie substancji w typowy dla nich sposób. W badaniach z paszà lub wodà pitnà m∏ode b´dà dodatkowo otrzymywaç badanà substancj´ bezpoÊrednio, gdy rozpocznà samodzielnie spo˝ywaç pokarm podczas ostatniego tygodnia okresu laktacji.
\nW przypadku substancji podawanych w pokarmie lub w wodzie pitnej wa˝ne jest upewnienie si´, ˝e dodane iloÊci badanej substancji nie zak∏ócajà normalnej równowagi pokarmowej i wodnej. Je˝eli badana substancja podawana jest w pokarmie, to jej iloÊç mo˝e byç wyra˝ona w postaci sta∏ego st´˝enia w pokarmie (ppm) lub w postaci sta∏ej dawki wzgl´dem masy cia∏a zwierz´cia; ka˝dy inny sposób wyra˝enia dawki musi byç opisany. W przypadku podawania sondà substancja podawana powinna byç o ustalonych porach dnia i dostosowywana przynajmniej raz w tygodniu tak, aby utrzymaç sta∏y jej poziom wzgl´dem masy cia∏a zwierz´cia. Pod uwag´ powinno si´ braç informacje o przenikaniu przez barier´ ∏o˝yska, dostosowujàc dawk´ substancji podawanej sondà wzgl´dem masy.
\n1.4.6. Uk∏ady doÊwiadczalne Codzienne podawanie substancji w okreÊlonych dawkach samcom i samicom rodzicielskim (P) powinno rozpoczàç si´ wtedy, gdy sà one w wieku 5 do 9 ty- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16415 — godni. Codzienne podawanie substancji samcom i samicom pokolenia F1 powinno rozpoczàç si´ przy odsadzeniu; nale˝y pami´taç, ˝e w przypadku podawania badanej substancji z paszà lub wodà pitnà bezpoÊrednie nara˝enie m∏odych F1 na badanà substancj´ mo˝e wystàpiç ju˝ w okresie laktacji. Dla obu p∏ci (P i F1) podawanie substancji powinno byç kontynuowane przez przynajmniej 10 tygodni przed okresem kojarzenia. Podawanie substancji powinno byç kontynuowane u obu p∏ci podczas 2 tygodni okresu kojarzenia. Samce nale˝y w sposób humanitarny uÊmierciç i przebadaç, je˝eli nie sà niezb´dne do oceny skutków reprodukcyjnych. W przypadku samic rodzicielskich (P) podawanie substancji powinno byç kontynuowane przez okres cià˝y, a˝ do odsadzenia pokolenia F1. Pod uwag´ powinno si´ braç modyfikacje schematu podawania substancji w zale˝noÊci od dost´pnych informacji dotyczàcych badanej substancji; nale˝y uwzgl´dniç istniejàce dane o jej toksycznoÊci, indukcji metabolicznej lub bioakumulacji. Dawka stosowana dla ka˝dego zwierz´cia powinna byç wyznaczona przy uwzgl´dnieniu najnowszych pomiarów masy jego cia∏a. Nale˝y byç ostro˝nym podczas dostosowywania dawki w ostatnim trymestrze cià˝y.
\nNara˝anie samców i samic P i F1 powinno trwaç a˝ do zakoƒczenia doÊwiadczenia. Wszystkie doros∏e samce i samice P i F1 powinny zostaç w sposób humanitarny uÊmiercone, je˝eli nie sà potrzebne do dalszych ocen skutków. Potomstwo F1 niewybrane do kojarzenia i potomstwo F2 powinno byç w sposób humanitarny uÊmiercone po odsadzeniu.
\nPoz. 2119 Pary, które nie majà potomstwa, powinny byç zbadane w celu stwierdzenia przyczyny niep∏odnoÊci.
\nKonieczne mogà byç takie procedury, jak dopuszczenie do ponownego kojarzenia z innymi samcami lub samicami, mikroskopowe badanie organów rozrodczych oraz badanie cyklu rujowego lub spermatogenezy.
\n1.4.7.3. Drugie kojarzenie W pewnych przypadkach, takich jak zmiany liczebnoÊci miotów spowodowane nara˝eniem na badanà substancj´ lub obserwacja podobnych skutków w pierwszym kojarzeniu zaleca si´ ponowne skojarzenie doros∏ych P lub F1 w celu uzyskania drugiego miotu. Zaleca si´ ponowne kojarzenie samic lub samców, które nie wyda∏y miotu ze sprawdzonymi osobnikami przeciwnej p∏ci. Je˝eli wytworzenie drugiego miotu jest uznane za konieczne w którymkolwiek pokoleniu to zwierz´ta powinny byç ponownie kojarzone mniej wi´cej tydzieƒ po odsadzeniu ostatniego miotu.
\n1.4.7.4. WielkoÊç miotu Zwierz´tom nale˝y pozwoliç na normalne wydanie miotu i wychowywanie potomstwa, a˝ do jego odsadzenia. Standaryzacja rozmiarów miotu jest post´powaniem opcjonalnym. Je˝eli stosuje si´ standaryzacj´ miotów, to zastosowana metoda powinna byç szczegó∏owo opisana.
\n1.5. Obserwacje 1.4.7. Sposób kojarzenia 1.5.1. Obserwacje kliniczne 1.4.7.1. Kojarzenie rodziców (P) Ogólne obserwacje kliniczne powinny byç dokonywane codziennie, a w przypadku podawania sondà czas przeprowadzenia obserwacji powinien uwzgl´dniaç przewidywany szczytowy okres nasilenia skutków po nara˝eniu. Zmiany w zachowaniu, objawy trudnej lub przed∏u˝onej cià˝y i wszystkie objawy cià˝y powinny byç zapisane. Ponadto bardziej szczegó∏owe badanie ka˝dego zwierz´cia powinno byç przeprowadzone przynajmniej raz w tygodniu; najdogodniej uczyniç to podczas jego wa˝enia. Dwa razy dziennie, a podczas weekendu raz dziennie wszystkie zwierz´ta obserwuje si´, poszukujàc zwierzàt w stanie agonalnym oraz pad∏ych.
\nDla ka˝dego kojarzenia, ka˝da samica powinna byç umieszczona z jednym samcem z tej samej grupy nara˝anej (kojarzenie 1:1) a˝ do kopulacji lub do zakoƒczenia dwutygodniowego okresu. Ka˝dego dnia samice powinny byç badane na obecnoÊç nasienia lub czopa pochwowego. Dzieƒ zerowy cià˝y okreÊla si´ jako dzieƒ odkrycia nasienia lub czopa pochwowego.
\nW przypadku niepowodzenia kojarzenia pod uwag´ mo˝na wziàç ponowne kojarzenie z samcami tej samej grupy. Kojarzone pary nale˝y wyraênie okreÊliç w danych. Nale˝y unikaç kojarzenia rodzeƒstwa.
\n1.4.7.2. Kojarzenie pokolenia F1 Do kojarzenia potomstwa F1 przynajmniej jeden samiec i jedna samica powinny byç wybrane przy odsadzaniu z ka˝dego miotu do kojarzenia z innymi m∏odymi tej samej grupy nara˝anej, ale innego miotu, aby daç pokolenie F2. Wybór m∏odych z ka˝dego miotu powinien mieç charakter losowy, je˝eli nie obserwuje si´ znaczàcych ró˝nic w masie cia∏a lub wyglàdzie w obr´bie miotu. W przypadku zaobserwowania takich ró˝nic wybrani powinni byç najlepsi przedstawiciele z ka˝dego miotu. Najlepiej opieraç si´ w tym przypadku na zapisach masy cia∏a, ale w∏aÊciwszym mo˝e byç wybór w oparciu o wyglàd. Potomstwo F1 nie powinno byç kojarzone, a˝ do osiàgni´cia pe∏nej dojrza∏oÊci p∏ciowej.
\n1.5.2. Masa cia∏a i spo˝ycie paszy/wody osobników rodzicielskich Samice rodzicielskie (P i F1) powinny byç zwa˝one pierwszego dnia nara˝enia, a nast´pnie przynajmniej raz na tydzieƒ. Samice rodzicielskie (P i F1) powinny byç zwa˝one przynajmniej w 0, 7, 14 i 20 lub 21 dniu cià˝y, a podczas laktacji w tych samych dniach, w których odbywa si´ wa˝enie m∏odych, oraz w dniu uÊmiercenia zwierzàt. Obserwacje te powinny byç zapisywane dla ka˝dego doros∏ego zwierz´cia oddzielnie. W okresie przed kojarzeniem i podczas cià˝y mierzone powinno byç spo˝ycie paszy przynajmniej w odst´pach tygodniowych. Je˝eli badana substancja podawana jest w wodzie, to spo˝ycie wody powinno byç mierzone przynajmniej w odst´pach tygodniowych.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16416 — 1.5.3. Cykl rujowy D∏ugoÊç cyklu rujowego i jego normalnoÊç ocenia si´ u samic P i F1 przez rozmazy pochwowe wykonywane przed kojarzeniem i opcjonalnie podczas kojarzenia, dopóki nie nastàpi skojarzenie. Podczas pobierania komórek pochwowych/szyjki macicy nale˝y byç ostro˝nym, by nie podra˝niç b∏ony Êluzowej i w nast´pstwie nie sprowokowaç cià˝y urojonej (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa).
\n1.5.4. Parametry nasienia W czasie zakoƒczenia doÊwiadczenia u wszystkich samców P oraz F1 nale˝y zapisaç mas´ jàder i najàdrzy. Do badaƒ histopatologicznych nale˝y zachowaç po jednym z tych organów (zobacz pkt 1.5.7 i pkt 1.5.8.1). Pozosta∏e jàdra i najàdrza uzyskane z przynajmniej 10 zwierzàt z ka˝dej grupy samców P i F1 powinny byç u˝yte odpowiednio do policzenia spermatyd odpornych na homogenizacj´ i zapasów nasienia z ogona najàdrza. Od tych samych samców powinno pobraç si´ nasienie z ogona najàdrza lub nasieniowodów w celu oszacowania jego ruchliwoÊci i morfologii. Je˝eli obserwuje si´ skutki zwiàzane z nara˝aniem lub gdy istniejà dowody z innych badaƒ takich wp∏ywów na spermatogenez´, to ocena nasienia powinna zostaç dokonana u wszystkich samców w ka˝dej grupie nara˝anej; w pozosta∏ych przypadkach liczenie mo˝e ograniczaç si´ do grupy kontrolnej i grupy samców P i F1 otrzymujàcych substancj´ w najwy˝szej dawce.
\nPoliczona powinna zostaç ca∏kowita liczba spermatyd jàdrowych odpornych na homogenizacj´ oraz liczba nasienia ogona najàdrza (zobacz pozycje 2 i 3 piÊmiennictwa). Zapasy nasienia ogona najàdrza mogà byç oszacowane na podstawie st´˝enia i obj´toÊci nasienia w zawiesinie stosowanej w oszacowaniach jakoÊciowych, a tak˝e iloÊci nasienia odzyskanego w czasie homogenizacji pozosta∏ej tkanki ogona najàdrza. Liczenie powinno byç wykonane na wybranej grupie samców ze wszystkich grup nara˝anych natychmiast po uÊmierceniu zwierzàt, chyba ˝e dokonywane sà zapisy video lub zapisy cyfrowe lub okazy sà zamra˝ane, a analizy sà wykonywane póêniej. W tych przypadkach grupy kontrole i grupy otrzymujàce substancj´ w najwy˝szej dawce powinny byç oceniane w pierwszej kolejnoÊci. Je˝eli nie obserwuje si´ ˝adnych skutków zwiàzanych z nara˝eniem (np. wp∏yw na liczb´ nasienia, jego ruchliwoÊç i morfologi´), to inne grupy nara˝ane nie muszà byç analizowane. Gdy takie skutki zostanà jednak zauwa˝one w grupie otrzymujàcej substancj´ w najwy˝szej dawce, to wtedy zwierz´ta otrzymujàce substancj´ w ni˝szych dawkach tak˝e muszà byç przeanalizowane.
\nRuchliwoÊç nasienia najàdrza (lub nasieniowodu) powinno si´ oszacowaç lub filmowaç natychmiast po uÊmierceniu zwierzàt. Nasienie pobiera si´, minimalizujàc uszkodzenia i rozcieƒczajàc do analizy ruchliwoÊci przy zastosowaniu uznanych metod (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa). WielkoÊç procentowa ruchliwego nasienia powinna zostaç okreÊlona subiektywnie lub obiektywnie. Je˝eli stosowana jest komputerowa Poz. 2119 analiza ruchliwoÊci (zobacz pozycje 5, 6, 7, 8, 9 i 10 piÊmiennictwa), to wyliczenie ruchliwoÊci zale˝y od progów Êredniej pr´dkoÊci wyznaczonych przez operatora oraz prostoliniowoÊci lub indeksu liniowoÊci. Je˝eli próbki sà filmowane (zobacz pozycja 11 piÊmiennictwa), lub obrazy zapisywane sà w inny sposób w czasie sekcji to ocenia si´ jedynie grup´ kontrolnà i grup´ samców P i F1 otrzymujàcych substancje w najwy˝szej dawce, je˝eli nie obserwuje si´ skutków zwiàzanych z nara˝aniem; je˝eli takie skutki istniejà, to zwierz´ta otrzymujàce substancje w ni˝szych dawkach tak˝e muszà byç analizowane. W przypadku braku filmowania lub zapisu cyfrowego podczas sekcji powinny byç analizowane wszystkie próbki wszystkich grup.
\nNale˝y wykonaç morfologicznà analiz´ próbki nasienia najàdrza (lub nasieniowodu). Nasienie (przynajmniej 200 na próbk´) powinno si´ badaç w postaci utrwalonych mokrych preparatów (zobacz pozycja 12 piÊmiennictwa) i klasyfikowaç jako normalne lub nienormalne. Przyk∏adem morfologicznych nieprawid∏owoÊci nasienia jest fuzja, oddzielone g∏ówki, zniekszta∏cone g∏ówki i/lub ogony. Szacowanie powinno byç dokonane na wybranej podgrupie samców wszystkich grup nara˝anych natychmiast po uÊmierceniu zwierzàt lub z wykorzystaniem zapisu cyfrowego lub filmowego w póêniejszym czasie. Rozmazy po utrwaleniu tak˝e mogà byç analizowane w póêniejszym terminie. W tych przypadkach w pierwszej kolejnoÊci analizuje si´ grup´ kontrolnà i grup´ zwierzàt otrzymujàcych substancje w najwy˝szej dawce. Je˝eli nie obserwuje si´ skutków zwiàzanych z nara˝aniem (np. zmiany w morfologii), to zwierz´ta z grup otrzymujàcych substancje w innych dawkach nie muszà byç analizowane. Gdy takie skutki jednak wyst´pujà to analizuje si´ wszystkie zwierz´ta otrzymujàce substancje we wszystkich dawkach.
\nJe˝eli jakikolwiek z powy˝szych parametrów nasienia by∏ analizowany jako cz´Êç badaƒ toksycznoÊci przynajmniej w badaniach 90-dniowych, to niekoniecznie musi byç on ponownie powtarzany w badaniu dwupokoleniowym. Zaleca si´ jednak zachowanie próbek lub zapisów cyfrowych nasienia pokolenia P w przypadku koniecznoÊci póêniejszej analizy.
\n1.5.5. Potomstwo Ka˝dy miot powinno si´ zbadaç jak najszybciej po porodzie (dzieƒ 0 laktacji) w celu ustalenia liczby i p∏ci m∏odych, martwych i ˝ywych oraz wystepowania nieprawid∏owoÊci. M∏ode martwe w dniu zerowym, je˝eli nie uleg∏y maceracji, powinny zostaç przebadane pod kàtem mo˝liwych wad i przyczyn Êmierci oraz powinny byç zachowane (utrwalone). ˚ywe m∏ode powinno si´ policzyç i zwa˝yç pojedynczo tu˝ po urodzeniu (dzieƒ zerowy laktacji) lub w dniu 1 i w nast´pnych dniach, np. w dniu 4, 7, 14 i 21 laktacji. Nieprawid∏owoÊci fizyczne lub behawioralne zaobserwowane u samic lub potomstwa powinny byç zanotowane.
\nFizyczny rozwój potomstwa powinien byç zapisywany g∏ównie na podstawie przyrostu masy cia∏a. Inne parametry fizyczne (np. rozwarcie szpary powiekowej i zewn´trznego przewodu s∏uchowego, wyr˝ni´cie si´ Dziennik Ustaw Nr 251 — 16417 — z´bów, wzrost w∏osów) mogà dostarczyç dodatkowych informacji, ale dane te powinny byç szacowane w kontekÊcie dojrzewania p∏ciowego (np.: wiek i masa cia∏a przy rozwarciu zewn´trznego ujÊcia pochwy i rozwoju gruczo∏u napletkowego) (zobacz pozycja 13 piÊmiennictwa). Badania czynnoÊciowe (aktywnoÊç motoryczna, czynnoÊç sensoryczna, odruchy) pokolenia F1 przed i po odsadzeniu, w szczególnoÊci te zwiàzane z dojrzewaniem p∏ciowym, sà zalecane, je˝eli nie sà cz´Êcià osobnych badaƒ. Przy rozwarciu zewn´trznego ujÊcia pochwy i rozwoju gruczo∏u napletkowego powinny byç okreÊlone dla odsadzonych m∏odych F1 wybranych do kojarzenia. Odleg∏oÊç anogenitalna powinna zostaç zmierzona w dniu zerowym po urodzeniu u m∏odych F2, je˝eli spowodowane sà przez zmiany w stosunku p∏ci F1 lub zmiany czasu dojrzewania p∏ciowego.
\nObserwacje czynnoÊciowe mogà byç pomini´te w grupach, które przejawiajà wyraêne objawy szkodliwych skutków (np.: znaczàcy spadek przyrostu masy).
\nJe˝eli badania czynnoÊciowe sà wykonywane, to nie powinny byç one robione na m∏odych wybranych do kojarzenia.
\n1.5.6. Ogólne badania sekcyjne Wszystkie zwierz´ta rodzicielskie (P i F1) po zakoƒczeniu badania i zwierz´ta pad∏e podczas badania lub wszystkie m∏ode, u których stwierdzono zewn´trzne nieprawid∏owoÊci lub nietypowe objawy kliniczne, a tak˝e przynajmniej jedno losowo wybrane m∏ode/p∏eç/miot zarówno z pokolenia F1, jak i F2 powinno badaç si´ makroskopowo na wyst´powanie wad rozwojowych lub zmian patologicznych. Szczególnà uwag´ nale˝y zwracaç na narzàdy uk∏adu rozrodczego.
\nM∏ode uÊmiercone w sposób humanitarny lub b´dàce w agonii i m∏ode martwe, je˝eli nie podleg∏y maceracji, powinny byç przebadane pod wzgl´dem mo˝liwych wad i/lub przyczyn Êmierci oraz powinny byç zachowane (utrwalone).
\nMacice wszystkich samic pierworódek powinny byç zbadane w sposób, który nie wyklucza badaƒ histopatologicznych, pod wzgl´dem obecnoÊci i liczby miejsc zagnie˝d˝eƒ.
\n1.5.7. Masa narzàdów Po zakoƒczeniu badania powinno si´ okreÊliç mas´ cia∏a wszystkich zwierzàt oraz mas´ nast´pujàcych narzàdów wszystkich zwierzàt rodzicielskich P i F1 (narzàdy wyst´pujàce parami powinny byç wa˝one pojedynczo): — macica, jajniki, — jàdra, najàdrza (ca∏e i ogon), — prostata, — p´cherzyki nasienne z gruczo∏ami koagulujàcymi i ich p∏yny oraz prostatà (razem), — mózg, wàtroba, nerki, Êledziona, przysadka, gruczo∏y tarczycowy i nadnercza oraz znane narzàdy krytyczne.
\nPoz. 2119 Koƒcowe masy cia∏a powinny byç okreÊlone dla m∏odych pokolenia F1 i F2, które zosta∏y wybrane do sekcji. Nast´pujàce narzàdy z jednego losowo wybranego m∏odego/p∏eç/miot (zobacz pkt 1.5.6) powinny byç zwa˝one: mózg, Êledziona i grasica.
\nWyniki sekcji i masy narzàdów powinny byç oszacowane w kontekÊcie obserwacji poczynionych w innych badaniach, je˝eli by∏y one prowadzone.
\n1.5.8. Badania histopatologiczne 1.5.8.1. Zwierz´ta rodzicielskie Nast´pujàce narzàdy i tkanki zwierzàt rodzicielskich (P i F1), bàdê ich reprezentatywne próbki, powinny byç utrwalone i przechowywane w odpowiednim medium do badaƒ histopatologicznych: — pochwa, macica z szyjkà i jajniki (zachowane w odpowiednim utrwalaczu), — jedno jàdro (zachowane w utrwalaczu Bouina lub porównywalnym), jedno najàdrze, p´cherzyki nasienne, prostata i gruczo∏ koagulujàcy, — uprzednio okreÊlone narzàd(y) krytyczne wszystkich zwierzàt P i F1 wybranych do kojarzenia.
\nPe∏ne wyniki badaƒ histopatologicznych zachowanych narzàdów i tkanek podanych powy˝ej powinny zostaç wykonane u wszystkich zwierzàt P i F1 otrzymujàcych substancj´ w najwy˝szej dawce i u zwierzàt z grupy kontrolnej wybranych do kojarzenia. Badanie jajników zwierzàt P jest badaniem opcjonalnym. Narzàdy wykazujàce zmiany zwiàzane z nara˝eniem powinny byç tak˝e zbadane u zwierzàt otrzymujàcych substancj´ w ni˝szych dawkach tak, aby wspomóc oszacowanie NOAEL. Ponadto narzàdy rozrodcze zwierzàt otrzymujàcych ni˝sze dawki, u których mo˝na podejrzewaç zmniejszonà p∏odnoÊç, np. takich, u których nie dochodzi∏o do kojarzenia lub nie dochodzi∏o do zap∏odnienia, lub nie da∏y zdrowego potomstwa bàdê te˝ u których zmieniona by∏a cyklicznoÊç rujowa, liczba nasienia, jego ruchliwoÊç lub morfologia, powinny byç poddane badaniom histopatologicznym.
\nWszystkie zwierz´ta, u których stwierdzono wi´ksze uszkodzenia, takie jak atrofia lub guzy, powinny byç tak˝e zbadane.
\nSzczegó∏owe badania histopatologiczne jàder (np.: z zastosowaniem utrwalacza Bouina, techniki parafinowej i wykonaniem przekrojów poprzecznych o gruboÊci 4—5 µm) powinny byç przeprowadzone w celu okreÊlenia skutków zwiàzanych z nara˝eniem, takich jak wstrzymane spermatydy, brakujàce komórki nab∏onka lub ich rodzaje, wielojàdrowe komórki ogromne lub odpadanie tkanki komórek spermatogenetycznych w Êwiat∏o przewodu (zobacz pozycja 14 piÊmiennictwa). Badanie nienaruszonego najàdrza powinno sk∏adaç si´ z badania jego g∏owy, trzonu i ogona, co mo˝e byç osiàgni´te w badaniu przekroju pod∏u˝nego. Najàdrze powinno byç przebadane pod wzgl´dem infiltracji leukocytów, zmian wyst´pujàcych w typach komórek, rodzajów komórek niew∏aÊciwych oraz fago- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16418 — cytozy nasienia. Barwienie PAS i hematoksylinà mo˝e byç stosowane w badaniu narzàdów rozrodczych samców.
\nJajnik po okresie laktacji powinien zawieraç pierwotne i wzrastajàce p´cherzyki, a tak˝e du˝e cia∏ka ˝ó∏te laktacji. Badanie histopatologiczne powinno wykryç jakoÊciowe niedobory populacji p´cherzyków pierwotnych. IloÊciowe oszacowanie p´cherzyków pierwotnych powinno byç przeprowadzone dla samic F1; liczba zwierzàt, wybór przekrojów jajnika oraz rozmiar próbki powinny byç statystycznie odpowiednie do zastosowanej procedury oszacowania. Dla porównania jajników nara˝onych i kontrolnych badanie powinno zawieraç policzenie p´cherzyków pierwotnych, które mogà byç liczone wspólnie z ma∏ymi p´cherzykami wzrastajàcymi (zobacz pozycje 15, 16, 17, 18 i 19 piÊmiennictwa).
\nPoz. 2119 nale˝y powiàzanie, lub jego brak, pomi´dzy dawkà badanej substancji i obecnoÊcià lub nieobecnoÊcià, wyst´powaniem i nasileniem nieprawid∏owoÊci, w tym powa˝nych uszkodzeƒ zidentyfikowanych organów krytycznych, zmienionà p∏odnoÊç, nieprawid∏owoÊci kliniczne, zmienionà wydajnoÊç reprodukcyjnà i liczb´ miotów, zmiany masy cia∏a, wp∏ywy na ÊmiertelnoÊç i inne skutki dzia∏ania toksycznego. Podczas oszacowania wyników powinno wziàç si´ pod uwag´ w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne badanej substancji oraz, je˝eli dost´pne, to tak˝e dane o toksykokinetyce.
\nW∏aÊciwie przeprowadzone badanie toksycznoÊci reprodukcyjnej powinno umo˝liwiç przeprowadzenie w zadowalajàcy sposób oszacowania poziomu bez widocznych skutków oraz umo˝liwiç zrozumienie szkodliwych wp∏ywów na rozmna˝anie, cià˝´, laktacj´, rozwój poporodowy, w tym wzrost i rozwój p∏ciowy.
\n1.5.8.2. M∏ode odsadzone 2.3. Interpretacja wyników Nietypowo wyglàdajàce tkanki i narzàdy krytyczne wszystkich m∏odych, u których wystàpi∏y nieprawid∏owoÊci zewn´trzne lub nietypowe objawy kliniczne, a tak˝e przynajmniej od jednego losowo wybranego m∏odego/p∏eç/miot z pokolenia F1 i F2, które nie zosta∏o wybrane do kojarzenia, powinny byç utrwalone i zachowane w odpowiednim medium do badaƒ histopatologicznych. Pe∏na charakterystyka histopatologiczna zachowanej tkanki powinna byç wykonana ze szczególnym naciskiem po∏o˝onym na narzàdy uk∏adu rozrodczego.
\nBadanie toksycznoÊci w teÊcie dwupokoleniowym ma dostarczyç informacji na temat wp∏ywów powtarzanego nara˝enia na substancj´ podczas wszystkich faz cyklu reprodukcyjnego. W szczególnoÊci badanie to dostarcza informacji o parametrach reprodukcji, rozwoju, wzrostu i prze˝ywalnoÊci potomstwa. Wyniki badania powinny byç interpretowane w po∏àczeniu z wynikami badaƒ podprzewlek∏ych, przedporodowych rozwojowych, toksykokinetycznych i innych dost´pnych. Wyniki niniejszego badania mogà byç stosowane w szacowaniu potrzeby dalszych badaƒ substancji chemicznej. Ekstrapolacja uzyskanych wyników na cz∏owieka jest wiarygodna tylko w ograniczonym stopniu. Najlepiej stosowaç je do dostarczania informacji o dopuszczalnym nara˝eniu cz∏owieka i o poziomie bez widocznych skutków (zobacz pozycje 20, 21, 22 i 23 piÊmiennictwa).
\nDane liczbowe powinny byç oszacowane w∏aÊciwà ogólnie uznanà metodà statystycznà; metody statystyczne powinny byç wybrane jako cz´Êç sk∏adowa uk∏adu doÊwiadczalnego. Do analizowania danych stosowane mogà byç modele statystyczne typu dawka-odpowiedê. Sprawozdanie powinno zawieraç szczegó∏owe informacje o metodzie analizy i zastosowanym programie komputerowym, tak by niezale˝ny recenzent/statystyk móg∏ odtworzyç przebieg analizy i ponownie jà oszacowaç.
\nBadana substancja: — stan fizyczny i gdy to ma znaczenie równie˝ w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne, — dane identyfikacyjne, — czystoÊç.
\nNoÊnik (je˝eli by∏ stosowany): — uzasadnienie wyboru noÊnika, je˝eli by∏ inny ni˝ woda.
\nBadane zwierz´ta:
\n2.2. Oszacowanie wyników — gatunek/szczep, Wyniki badania dzia∏anie toksyczne na rozrodczoÊç w warunkach testu dwupokoleniowego powinny byç ocenione pod wzgl´dem zaobserwowanych skutków, w tym wyniki sekcji i dane mikroskopowe. Oszacowaç — liczba, p∏eç i wiek zwierzàt, — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasza, materia∏ u˝ywany na gniazdo itp., Dziennik Ustaw Nr 251 — 16419 — — masy cia∏a poszczególnych zwierzàt na poczàtku doÊwiadczenia.
\nWarunki badania: — uzasadnienie wybranych dawek, — szczegó∏y dotyczàce formulacji badanej substancji/przygotowania pokarmu, osiàgni´te st´˝enie, Poz. 2119 — czas trwania cià˝y, — liczba zagnie˝d˝eƒ, cia∏ek ˝ó∏tych i rozmiar miotu, — liczba zwierzàt ˝ywo narodzonych i strat po zagnie˝d˝eniu, — liczba m∏odych z widocznymi nieprawid∏owoÊciami, je˝eli okreÊlona liczba skar∏owacia∏ych to nale˝y podaç, — trwa∏oÊç i jednorodnoÊç u˝ywanego preparatu, — dane o rozwoju poporodowym m∏odych, — szczegó∏y dotyczàce podawania badanej substancji, — przeliczenie st´˝enia (ppm) badanej substancji z pokarmu/wody pitnej na dawk´ rzeczywistà (mg/kg masy cia∏a/dzieƒ), je˝eli istnieje taka koniecznoÊç, — szczegó∏y dotyczàce paszy i wody pitnej. — dane o obserwacjach czynnoÊciowych u m∏odych i doros∏ych, — statystyczna analiza wyników.
\nOmówienie wyników.
\nWnioski, w tym wartoÊci NOAEL dla skutów dzia∏ania na potomstwo i na osobniki doros∏e.
\nWyniki: — spo˝ycie paszy i, je˝eli dost´pne, to spo˝ycie wody, wykorzystanie paszy (przyrost masy cia∏a na gram spo˝ytej paszy) i spo˝ycie materia∏u badanego dla zwierzàt P i F1 z wyjàtkiem okresu kojarzenia i przynajmniej ostatniej jednej trzeciej okresu laktacji, — dane o absorpcji (je˝eli dost´pne), — dane dotyczàce masy cia∏a zwierzàt P i F1 wybranych do kojarzenia, — masa cia∏a m∏odych i liczebnoÊç miotów, — masa cia∏a przy uÊmierceniu oraz wzgl´dne i bezwzgl´dne masy narzàdów zwierzàt rodzicielskich, — istota, nasilenie i czas trwania obserwacji klinicznych (odwracalne czy nie), 4. PIÂMIENNICTWO
\nReproduction In Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.
\nFundamental and Applied Toxicology 12: 92—108.
\nMethodologic Considerations. Reproductive Toxicology 5: 449—458.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16420 —
\nJournal of Andrology 8: 330—337.
\n298—303.
\nFemale Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
\nPoz. 2119
\nPergamon, New York.
\nZa∏àcznik nr 9 B.42. UCZULANIE SKÓRY: PRÓBA NA MIEJSCOWYM W¢èLE CH¸ONNYM 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 429 (2002). natywna, gdy wyniki pozytywne i negatywne nie wymagajà z regu∏y dalszego potwierdzenia.
\nPróba na Miejscowym W´êle Ch∏onnym (PMWCh) zosta∏a wystarczajàco uwierzytelniona i zaakceptowana, tak aby przyjàç jà jako nowà metod´ badawczà (zobacz pozycje 1, 2 i 3 piÊmiennictwa). Jest to druga metoda s∏u˝àca ocenie potencja∏u dzia∏ania uczulajàcego substancji chemicznych na skór´ zwierzàt. Inna metoda opiera si´ na badaniu na Êwinkach morskich, a dok∏adniej jest to test maksymalizacji (B.6) i test Buehlera (zobacz pozycja 4 piÊmiennictwa).
\nPMWCh ma pewne zalety zarówno z punktu widzenia post´pu naukowego, jak i dobrostanu zwierzàt.
\nW metodzie tej bada si´ faz´ indukcji uczulania skóry i uzyskuje iloÊciowe dane przydatne w szacowaniu zale˝noÊci dawka-odpowiedê. Szczegó∏y walidacji PMWCh i przeglàd towarzyszàcych prac opublikowano w piÊmiennictwie (zobacz pozycje 5, 6, 7 i 8 piÊmiennictwa). Ponadto nale˝y odnotowaç, ˝e substancje dzia∏ajàce ∏agodnie/umiarkowanie uczulajàco, które sà zalecane jako odpowiednie do kontroli pozytywnej w metodach badaƒ na Êwinkach morskich, równie˝ sà odpowiednie w PMWCh (zobacz pozycje 6, 8 i 9 piÊmiennictwa).
\nPMWCh jest metodà alternatywnà dla wykrywania substancji chemicznych dzia∏ajàcych uczulajàco na skór´ lub dla potwierdzenia, ˝e substancje chemiczne nie posiadajà znaczàcego potencja∏u wywo∏ujàcego uczulanie skóry. Nie oznacza to, ˝e w ka˝dym przypadku mo˝na stosowaç PMWCh zamiast badaƒ przeprowadzanych na Êwinkach morskich, ale raczej, ˝e próba ta ma równà wartoÊç i mo˝e byç stosowana jako alter- PMWCh jest metodà in vivo i w konsekwencji nie eliminuje stosowania zwierzàt w ocenie kontaktowej aktywnoÊci uczulajàcej. Potencjalnie mo˝e jednak zmniejszyç liczb´ zwierzàt potrzebnych do osiàgni´cia tego celu. Ponadto PMWCh stwarza znacznie ∏agodniejsze warunki, w jakich zwierz´ta sà stosowane w kontaktowym badaniu uczulenia. PMWCh opiera si´ na immunologicznych zjawiskach stymulowanych 1.1. Wst´p Dziennik Ustaw Nr 251 — 16421 — przez substancje chemiczne w fazie indukcyjnej uczulania. W przeciwieƒstwie do badaƒ na Êwinkach morskich PMWCh nie wymaga wywo∏ywania reakcji nadwra˝liwoÊci skórnej. Ponadto PMWCh nie wymaga stosowania adjuwanta, tak jak w metodzie maksymalizacji na Êwinkach morskich. Dlatego PMWCh zmniejsza obcià˝enie zwierzàt. Pomimo zalet PMWCh w porównaniu do tradycyjnej metody na Êwinkach morskich, istniejà jednak pewne ograniczenia zmuszajàce do zastosowania tradycyjnej metody z Êwinkami morskimi (np. fa∏szywie negatywne wyniki dla niektórych metali w PMWCh, fa∏szywie pozytywne wyniki z niektórymi substancjami dra˝niàcymi skór´) (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).
\nZobacz tak˝e Wprowadzenie cz´Êç B.
\n1.2. Zasada metody badawczej Zasadà le˝àcà u podstaw PMWCh jest to, ˝e substancje uczulajàce pobudzajà pierwotne namna˝anie si´ limfocytów w w´êle ch∏onnym poddanemu miejscowemu dzia∏aniu substancji chemicznej. Namna˝anie to jest proporcjonalne do podanej dawki (i do potencja∏u alergenu) i daje prosty sposób otrzymania obiektywnego, iloÊciowego pomiaru uczulenia.
\nW PMWCh namna˝anie to wycenia si´ jako zale˝noÊç dawka-odpowiedê, a namna˝anie w grupach nara˝anych porównuje si´ z namna˝aniem w grupie kontrolnej z noÊnikiem. Oznaczany jest stosunek namna˝ania w grupach nara˝anych i grupie kontrolnej, który nazywany jest Wskaênikiem Stymulacji (WS). Aby badana substancja mog∏a byç oceniona jako potencjalnie uczulajàca skór´, musi on wynosiç przynajmniej trzy.
\nW opisanej metodzie do pomiarów namna˝ania si´ komórek stosuje si´ substancje znaczone radioaktywnie. Mo˝na jednak stosowaç inne sposoby do szacowania namna˝ania si´ komórek, pod warunkiem ˝e jest to umotywowane i znajduje odpowiednie poparcie naukowe, zawierajàce pe∏ne cytowania i opis metodologii.
\n1.3. Opis metody badawczej 1.3.1. Przygotowania 1.3.1.1. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt Temperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody.
\n1.3.1.2. Przygotowanie zwierzàt Zwierz´ta nale˝y dobieraç losowo, znakowaç dla umo˝liwienia indywidualnej identyfikacji (lecz nie za pomocà jakiegokolwiek znakowania uszu), przetrzymywaç w klatkach przynajmniej 5 dni przed rozpocz´- Poz. 2119 ciem podawania substancji w celu aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych. Przed rozpocz´ciem doÊwiadczenia nale˝y sprawdziç wszystkie zwierz´ta, dla upewnienia si´, czy nie posiadajà widocznych uszkodzeƒ skóry.
\n1.3.2. Warunki badania 1.3.2.1. Zwierz´ta doÊwiadczalne W tym badaniu gatunkiem z wyboru jest mysz. Nale˝y u˝yç do badaƒ samice myszy szczepu CBA/Ca lub CBA/J, które sà dziewicze i nieci´˝arne. Przy rozpocz´ciu badania zwierz´ta powinny byç w wieku 8—12 tygodni, a ró˝nica w masie cia∏a zwierzàt powinna byç jak najmniejsza i nie przekraczaç 20 % Êredniej masy.
\nMo˝na u˝ywaç innych szczepów i samców, gdy sà wystarczajàce dane dla wykazania, ˝e nie istniejà istotne specyficzne ró˝nice w odpowiedzi w PMWCh zale˝ne od szczepu i/lub p∏ci.
\n1.3.2.2. Sprawdzenie wiarygodnoÊci Do wykazania w∏aÊciwego przeprowadzenia próby i kompetencji laboratorium do prawid∏owego wykonania doÊwiadczenia stosuje si´ kontrol´ pozytywnà.
\nKontrola pozytywna powinna daç w PMWCh pozytywnà odpowiedê na poziomie nara˝enia, dla którego przewiduje si´ wzrost wskaênika stymulacji (WS) >3 w stosunku do kontroli negatywnej. Dawk´ w kontroli pozytywnej nale˝y dobraç tak, by indukcja by∏a wyraêna, lecz nie nadmierna. Zalecanymi substancjami sà aldehyd heksylocynamonowy (No CAS 101-86-1, No EINECS 202-983-3) i merkaptobenzotiazol (No CAS 149-30-4, No EINECS 205-736-8). W okreÊlonych warunkach, po odpowiednim uzasadnieniu, mo˝na u˝yç innych substancji kontrolnych spe∏niajàcych powy˝sze kryteria. Kontrola pozytywna wymagana jest zazwyczaj w ka˝dym doÊwiadczeniu, lecz mogà byç sytuacje, gdy laboratoria badawcze posiadajà dane archiwalne dotyczàce kontroli pozytywnej, wskazujàce na sta∏oÊç zadowalajàcych reakcji przez okres szeÊciu miesi´cy lub d∏u˝szy. W takich sytuacjach rzadsze sprawdzanie za pomocà kontroli pozytywnej jest w∏aÊciwe, lecz w odst´pach nie d∏u˝szych ni˝ 6 miesi´cy.
\nChocia˝ pozytywnà kontrol´ substancji nale˝y sprawdzaç w noÊniku, o którym wiadomo, ˝e wywo∏uje sta∏à odpowiedê (np. aceton: oliwa z oliwek), to mogà wystàpiç szczególne okolicznoÊci okreÊlone w odr´bnych przepisach, w których b´dzie równie˝ konieczne przebadanie w niestandardowym noÊniku (odpowiednia formulacja o znaczeniu klinicznym/chemicznym).
\nW takich sytuacjach nale˝y przebadaç mo˝liwà interakcj´ pozytywnej kontroli z niekonwencjonalnym noÊnikiem.
\n1.3.2.3. Liczba zwierzàt, poziom dawkowania i wybór noÊnika Nale˝y stosowaç minimum po cztery zwierz´ta w grupach nara˝anych i co najmniej trzy st´˝enia badanej substancji, grup´ kontroli negatywnej otrzymujàcej jedynie noÊnik badanej substancji i grup´ kontroli pozytywnej, o ile stosowne. W przypadkach, w których wycenia si´ dane indywidualnych zwierzàt, nale- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16422 — ˝y stosowaç minimum pi´ç zwierzàt w grupie. Zwierz´ta z grup kontrolnych nale˝y traktowaç w ten sam sposób jak z grup nara˝onych, z wyjàtkiem podawania badanej substancji.
\nDobór dawek i noÊnika nale˝y opieraç o zalecenia z publikacji (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Dawki nale˝y dobraç z serii st´˝eƒ 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Gdy sà dost´pne wyniki ostrej toksycznoÊci skórnej i dra˝nienia skóry, nale˝y je braç pod uwag´ przy doborze tych trzech kolejnych st´˝eƒ tak, by przy nara˝eniu na najwy˝sze st´˝enie uniknàç toksycznoÊci ogólnoustrojowej i nadmiernego miejscowego podra˝nienia skóry (zobacz pozycje 2 i 11 piÊmiennictwa).
\nNoÊnik nale˝y dobieraç, uwzgl´dniajàc maksymalne st´˝enia substancji stosowanej w badaniu i maksymalnà rozpuszczalnoÊç, by mo˝na uzyskaç roztwory/zawiesiny odpowiednie dla podawania badanej substancji. Zaleca si´ noÊniki w nast´pujàcej kolejnoÊci: aceton/oliwa z oliwek (4:1 v/v), dimetyloformamid, keton metyloetylowy, propylenoglikol i dimetylosulfotlenek (zobacz pozycje 2 i 10 piÊmiennictwa), ale mogà byç równie˝ stosowane inne noÊniki, o ile dysponuje si´ o nich odpowiednià wiedzà naukowà. W niektórych przypadkach konieczne mo˝e byç u˝ywanie, jako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika stosowanego jako materia∏ do formulacji handlowej badanej substancji lub rozpuszczalnika wa˝nego z klinicznego punktu widzenia. W szczególnoÊci nale˝y zapewniç, aby materia∏y hydrofilne by∏y podawane z zastosowaniem noÊnika, który zwil˝a skór´ i nie sp∏ywa natychmiast. Dlatego nale˝y unikaç stosowania jedynie wodnych noÊników.
\n1.3.3. Sposób post´powania 1.3.3.1. Plan doÊwiadczenia Plan doÊwiadczenia jest nast´pujàcy: — Dzieƒ 1:
\nUstalanie i zapisywanie indywidualnej masy cia∏a dla ka˝dego zwierz´cia. Nanoszenie 25 µl odpowiedniego roztworu badanej substancji, samego noÊnika lub kontroli pozytywnej (je˝eli sà stosowane) na grzbietowà stron´ ka˝dego ucha zwierz´cia. — Dzieƒ 2 i 3:
\nPowtórzyç procedur´ nanoszenia jak w dniu 1. — Dzieƒ 4 i 5:
\nBrak nara˝enia. — Dzieƒ 6:
\nZapisaç mas´ cia∏a ka˝dego zwierz´cia. Ka˝dej myszy, której podawano substancj´, i myszy z grupy kontrolnej wstrzyknàç do ˝y∏y ogonowej po 250 µl roztworu buforu fosforanowego (PBS) zawierajàcego 20 µCi (7,4e+8 Bq) 3H-metylotymidyny. Alternatywnie wstrzyknàç 250 (l roztworu PBS zawierajàcego 2 µCi (7,4e+7 Bq) 125I-jododeoksy- Poz. 2119 urydyny i 10–5 M fluorodeoksyurydyny wszystkim myszom do ˝y∏y ogonowej.
\nPo pi´ciu godzinach zwierz´ta nale˝y uÊmierciç.
\nZwierz´tom nara˝onym na substancj´ nale˝y z ka˝dego ucha wyciàç przyuszne w´z∏y ch∏onne i zanurzyç w PBS. Z ka˝dej badanej grupy (badanie w sposób grupowy) alternatywnie nale˝y wyciàç pary w´z∏ów ch∏onnych od ka˝dego zwierz´cia i zanurzyç w PBS osobno dla ka˝dego zwierz´cia (sposób indywidualny). Szczegó∏y i wykresy identyfikacji w´z∏ów i analizy mo˝na znaleêç w za∏àczniku I do pozycji piÊmiennictwa (zobacz pozycja 10 piÊmiennictwa).
\n1.3.3.2. Przygotowanie zawiesiny komórek Zawiesiny komórek w´z∏a ch∏onnego otrzymane ze zwierzàt, badanych zarówno grupowo lub jak i od pojedynczych zwierzàt, przygotowuje si´ poprzez ∏agodne mechaniczne rozdrobnienie na nierdzewnej siatce stalowej o oczkach 200 µm. Komórki w´z∏a ch∏onnego przemywa si´ dwukrotnie PBS dodanym w nadmiarze i wytràca 5 % kwasem trichlorooctowym (TCA) w temp. 4 °C przez 18 godzin (zobacz pozycja 2 piÊmiennictwa). Granulki nale˝y ponownie zawiesiç w 1 ml kwasu trichlorooctowego i przenieÊç do fiolki scyntylacyjnej zawierajàcej 10 ml p∏ynu scyntylacyjnego dla zliczenia 3H, lub przenieÊç bezpoÊrednio do probówki pomiarów gamma dla zliczenia 125I.
\n1.3.3.3. Oznaczanie namna˝ania si´ komórek (radioaktywnoÊç zwiàzana) Zwiàzanie 3H-metylotymidyny mierzy si´ za pomocà licznika β-scyntylacyjnego jako liczb´ rozpadów na minut´. Zwiàzanie 125 I-jododeoksyurydyny mierzy si´ za pomocà licznika 125I scyntylacyjnego i wyra˝a si´ równie˝ w postaci liczby rozpadów na minut´. W zale˝noÊci od stosowanego sposobu badania wiàzania wyra˝a si´ w postaci liczby rozpadów na minut´/nara˝ana grupa (sposób grupowy) lub rozpad na minut´/zwierz´ (sposób indywidualny).
\n1.3.3.4. Obserwacje 1.3.3.4.1. Obserwacje kliniczne Zwierz´ta nale˝y obserwowaç starannie raz w ciàgu dnia pod kàtem objawów klinicznych albo miejscowego dra˝nienia w miejscach podania lub toksycznoÊci ogólnoustrojowej. Wszystkie obserwacje ∏àcznie z zapisami dla pojedynczych zwierzàt nale˝y systematycznie zapisywaç.
\n1.3.3.4.2. Masa cia∏a Jak podano w pkt 1.3.3.1, masy cia∏a pojedynczych zwierzàt nale˝y ustalaç na poczàtku doÊwiadczenia i przed planowym uÊmierceniem zwierzàt.
\n1.3.4. Obliczanie wyników Wyniki nale˝y wyraziç w formie Wskaênika Stymulacji (WS). Gdy stosuje si´ sposób grupowy, WS otrzy- Dziennik Ustaw Nr 251 — 16423 — muje si´ dzielàc, zwiàzanà radioaktywnoÊç dla ka˝dej nara˝anej grupy przez przy∏àczonà radioaktywnoÊç grupy kontrolnej z noÊnikiem; to daje Êredni WS. Gdy stosuje si´ sposób indywidualny, WS oblicza si´, dzielàc Êredni rozpad na minut´/mysz w ramach ka˝dej nara˝anej grupy i grup´ pozytywnej kontroli przez Êredni rozpad na minut´/mysz dla grupy kontrolnej rozpuszczalnik/noÊnik. Âredni WS dla grup kontrolnych z noÊnikiem wynosi wtedy 1.
\nZastosowanie sposobu indywidualnego do wyliczenia WS umo˝liwia przeprowadzenie statystycznej analizy wyników. Przy wyborze odpowiedniej metody analizy statystycznej badacz musi byç Êwiadomy mo˝liwych nierównoÊci wariancji i innych zwiàzanych z tym problemów, co mo˝e wymagaç przetworzenia danych lub zastosowania nieparametrycznej analizy statystycznej. Za pomocà odpowiedniego sposobu interpretacji nale˝y oceniç wszystkie indywidualne dane nara˝anych i kontrolnych zwierzàt i dopasowaç na tej podstawie stosownà krzywà zale˝noÊci dawka-odpowiedê, bioràc pod uwag´ przedzia∏y ufnoÊci (zobacz pozycje 8, 12 i 13 piÊmiennictwa). Jednak badacz musi uwa˝aç na mo˝liwe skrajne reakcje indywidualnych zwierzàt wewnàtrz grup, co mo˝e wymagaç stosowania alternatywnych miar reakcji (np. raczej mediany, a nie Êredniej) lub eliminowania skrajnych danych.
\nProces podejmowania decyzji odnoÊnie pozytywnej reakcji obejmuje WS ≥3, ∏àcznie z rozwa˝eniem reakcji dawka-odpowiedê, i, o ile stosowne, istotnoÊci statystycznej (zobacz pozycje 3, 6, 8, 12 i 14 piÊmiennictwa).
\nJe˝eli zachodzi potrzeba objaÊnienia otrzymanych wyników, nale˝y zwróciç uwag´ na ró˝ne w∏aÊciwoÊci badanej substancji, w tym strukturalne podobieƒstwo do znanych substancji uczulajàcych skór´, czy zdolnoÊç powodowania silnego dra˝nienia skóry i rodzaj reakcji dawka-odpowiedê. Te i inne okolicznoÊci dyskutowane sà szczegó∏owo w innym miejscu (zobacz pozycja 7 piÊmiennictwa).
\nBadana substancja: — dane identyfikacyjne (np. numer CAS (je˝eli jest dost´pny); êród∏o pochodzenia; stopieƒ czystoÊci; znane zanieczyszczenia; numer serii), — stan skupienia i w∏aÊciwoÊci fizykochemiczne (np. lotnoÊç, trwa∏oÊç, rozpuszczalnoÊç), — w przypadku mieszanin sk∏ad i zawartoÊç sk∏adników.
\nPoz. 2119 NoÊnik: — dane identyfikacyjne (stopieƒ czystoÊci; st´˝enie, o ile dotyczy; stosowana obj´toÊç), — uzasadnienie wyboru noÊnika.
\nZwierz´ta doÊwiadczalne: — szczep stosowanych myszy, — stan mikrobiologiczny zwierzàt, je˝eli jest znany, — liczba, wiek i p∏eç zwierzàt, — êród∏o pochodzenia, warunki przetrzymywania, pasze itd.
\nWarunki przeprowadzania badania: — szczegó∏y przygotowania badanej substancji i jej podawanie, — uzasadnienie wyboru dawek (∏àcznie z wynikami testu poszukiwania zakresu dawek, je˝eli prowadzono); stosowane st´˝enia badanej substancji i noÊnika i ogólna iloÊç podawanej substancji, — szczegó∏y jakoÊci paszy i wody (∏àcznie z typem paszy i êród∏em dostawy, êród∏o wody).
\nSprawdzenie wiarygodnoÊci: — podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodnoÊci, ∏àcznie z informacjami o substancji, st´˝eniu i stosowanym noÊniku, — równolegle uzyskane i/lub archiwalne pozytywne i negatywne dane kontrolne dla badajàcego laboratorium.
\nWyniki: — indywidualne masy cia∏a zwierzàt na poczàtku nara˝enia i przy planowanym ich uÊmiercaniu; — tabela z podaniem wartoÊci Êredniej/mediany (sposób grupowy) lub indywidualnych (sposób indywidualny) rozpadu na minut´, jak równie˝ zakres wartoÊci dla obu sposobów i wskaêników stymulacji dla ka˝dej badanej grupy (∏àcznie z kontrolà noÊnika), — analiza statystyczna, gdy by∏a stosowana, — czas wystàpienia i objawy toksyczne, w∏àcznie z podra˝nieniem skóry w miejscu na∏o˝enia, gdy wystàpi∏o, dla ka˝dego zwierz´cia.
\nDyskusja wyników: — krótki komentarz do wyników, do analizy zale˝noÊci dawka-odpowiedê i analizy statystycznej, gdy by∏y stosowane, z wnioskiem czy badana substancja mo˝e byç uznana za uczulajàcà skór´.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16424 — 4. PIÂMIENNICTWO
\nAssessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563—79 (1998).
\nPoz. 2119 method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49—59.
\nA test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99—4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov.).
\nZa∏àcznik nr 10 B.43. BADANIE NEUROTOKSYCZNOÂCI NA GRYZONIACH 1. METODA Niniejsza metoda jest równowa˝na metodzie opisanej w Wytycznej OECD nr 424 (1997).
\nBadanie przeprowadzone zgodnie z niniejszà metodà badawczà ma na celu dostarczenie informacji koniecznych dla potwierdzenia lub dalszego scharakteryzowania potencjalnej neurotoksycznoÊci substancji chemicznych u doros∏ych zwierzàt. Mo˝e ona byç ∏àczona z innymi metodami badawczymi przy powtarzanym podawaniu dawki bàdê te˝ mo˝e byç wykonywana jako oddzielne badanie. W projektowaniu badaƒ opartych o niniejszà metod´ badawczà zaleca si´ korzystanie z Dokumentu Przewodniego OECD dotyczàcego strategii i metod badawczych neurotoksycznoÊci (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Jest to szczególnie wa˝ne, gdy dokonuje si´ modyfikacji obserwacji i procedur badawczych zalecanych przy rutynowym stosowaniu niniejszej metody. Dokument Przewodni zosta∏ przygotowany dla u∏atwienia wyboru innych procedur badawczych stosowanych w szczególnych okolicznoÊciach.
\nOszacowanie neurotoksycznoÊci rozwojowej nie jest przedmiotem niniejszej metody.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16425 — 1.1. Wst´p W szacowaniu i ocenie toksycznego charakteru substancji chemicznych wa˝ne jest, aby wziàç pod uwag´ potencjalne wystàpienie skutków neurotoksycznych. Ju˝ metoda badawcza przy powtarzanym podawaniu dawki uwzgl´dnia obserwacje pod kàtem potencjalnej neurotoksycznoÊci. Niniejsza metoda badawcza mo˝e byç stosowana w planowaniu badania majàcego na celu uzyskanie dalszych informacji, bàdê ich potwierdzeniu, co do skutków neurotoksycznych obserwowanych w badaniach toksycznoÊci przy powtarzanym nara˝eniu. Uwzgl´dnienie jednak mo˝liwej neurotoksycznoÊci pewnych klas substancji chemicznych mo˝e sugerowaç, ˝e jest ona bardziej w∏aÊciwie oszacowana przez niniejszà metod´ bez wczeÊniejszych ustaleƒ mo˝liwej neurotoksycznoÊci w badaniach przy powtarzanym dawkowaniu. Takie rozwa˝ania zawierajà na przyk∏ad: — obserwacje objawów neurologicznych lub zmian neuropatologicznych w badaniach toksycznoÊci innych ni˝ te z powtarzanym dawkowaniem lub — strukturalne pokrewieƒstwo lub inne informacje ∏àczàce je ze znanymi substancjami o dzia∏aniu neurotoksycznym.
\nPonadto mogà wystàpiç inne przypadki, gdy zastosowanie niniejszej metody badawczej jest w∏aÊciwe; dalsze szczegó∏y mo˝na znaleêç w piÊmiennictwie (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa).
\nNiniejszà metod´ opracowano w taki sposób, aby mog∏a byç przystosowana do spe∏nienia szczególnych potrzeb, potwierdziç specyficznà neurotoksycznoÊç histopatologicznà lub behawioralnà substancji chemicznej, a tak˝e dostarczyç charakterystyk´ i ocen´ iloÊciowà reakcji neurotoksycznych.
\nPoz. 2119 sycznych zalicza si´ procedury histopatologiczne i behawioralne, które mogà byç dalej uzupe∏nione przez badania elektrofizjologiczne i/lub biochemiczne (zobacz pozycje 1, 2, 3 i 4 piÊmiennictwa).
\nSubstancje neurotoksyczne mogà dzia∏aç na wiele miejsc w obr´bie uk∏adu nerwowego za pomocà wielu mechanizmów. ˚aden pojedynczy zestaw testów nie jest w stanie w pe∏ni oszacowaç potencja∏u neurotoksycznego wszystkich substancji chemicznych, dlatego konieczne mo˝e byç zastosowanie innych badaƒ in vivo lub in vitro specyficznych dla rodzaju obserwowanej lub przewidywanej neurotoksycznoÊci.
\nNiniejsza metoda badawcza mo˝e byç tak˝e stosowana w po∏àczeniu z wytycznymi zawartymi w Dokumencie Przewodnim OECD na temat strategii i metod badawczych neurotoksycznoÊci (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa), do planowania badaƒ zamierzajàcych dalej charakteryzowaç lub zwi´kszaç czu∏oÊç oceny iloÊciowej typu dawka-odpowiedê lub lepiej oszacowaç poziom bez obserwowanego szkodliwego dzia∏ania lub uzasadniç znane lub spodziewane zagro˝enia powodowane przez substancj´. Na przyk∏ad mo˝na zaplanowaç badanie majàce na celu identyfikacj´ i oszacowanie mechanizmów neurotoksycznych lub uzupe∏niç dane ju˝ istniejàce z podstawowych obserwacji neurobehawioralnych i neuropatologicznych.
\nTakie badania nie muszà powtarzaç danych, które by∏yby wygenerowane z zastosowania standardowych procedur niniejszej metody, je˝eli takie dane ju˝ istniejà i nie sà uwa˝ane za niezb´dne do interpretacji wyników badania.
\nBadanie neurotoksycznoÊci, wykonywane osobno lub w po∏àczeniu, dostarcza informacji, które mogà: — stwierdzaç, czy badana substancja dzia∏a na uk∏ad nerwowy w sposób odwracalny lub nieodwracalny, W przesz∏oÊci neurotoksycznoÊç przyrównywano do neuropatii obejmujàcej zmiany neuropatologiczne lub zaburzenia neurologiczne, takie jak napad padaczkowy, parali˝ lub dr˝enie. Chocia˝ neuropatia jest wa˝nym objawem neurotoksycznoÊci to obecnie oczywistym jest, ˝e istnieje wiele innych objawów toksycznoÊci w uk∏adzie nerwowym (np.: utrata koordynacji motorycznej, os∏abienie czucia, zaburzenia w uczeniu i zapami´tywaniu), które nie majà odbicia w neuropatii lub innych rodzajach badaƒ. — przyczyniç si´ do charakterystyki zmian w uk∏adzie nerwowym towarzyszàcym nara˝eniu na badanà substancj´ i do zrozumienia mechanizmów le˝àcych u podstaw tych zmian, Niniejsza metoda badawcza dotyczàca neurotoksycznoÊci przeznaczona jest do wykrywania g∏ównych skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych u doros∏ych gryzoni. Podczas gdy skutki behawioralne, nawet pod nieobecnoÊç zmian morfologicznych, mogà odzwierciedlaç szkodliwy wp∏yw na organizm, to nie wszystkie zmiany behawioralne sà specyficzne dla uk∏adu nerwowego. Dlatego ka˝da obserwowana zmiana powinna byç oszacowana w po∏àczeniu z danymi histopatologicznymi, hematologicznymi lub biochemicznymi, jak równie˝ wynikami innego rodzaju badaƒ toksycznoÊci uk∏adowej. Do badaƒ uj´tych w niniejszej metodzie majàcych na celu dostarczenie charakterystyki i oceny iloÊciowej reakcji neurotok- Niniejsza metoda badawcza opiera si´ na podawaniu badanej substancji drogà pokarmowà. Inne drogi podawania (np.: przez skór´ lub drogà inhalacyjnà) mogà byç bardziej w∏aÊciwe, ale mogà wtedy wymagaç modyfikacji zalecanych procedur. Wybór drogi podawania zale˝y od sposobu nara˝enia cz∏owieka i dost´pnych informacji toksykologicznych lub kinetycznych. — okreÊliç zale˝noÊci mi´dzy wielkoÊcià dawki a czasem wystàpienia odpowiedzi (reakcji) celem oszacowania poziomu bez obserwowanego dzia∏ania szkodliwego (stosowanego do okreÊlenia kryteriów bezpieczeƒstwa substancji chemicznej).
\n1.2. Definicje Szkodliwy skutek: jest ka˝dà zmianà w stosunku do wyjÊciowej zale˝nà od nara˝enia, która zmniejsza zdolnoÊç organizmu do prze˝ycia, rozmna˝ania si´ lub przystosowania do Êrodowiska.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16426 — Dawka: jest iloÊcià podanej substancji. Dawk´ wyra˝a si´ jako mas´ (np. mg) lub jako mas´ badanej substancji na jednostk´ masy zwierz´cia doÊwiadczalnego (np. mg/kg), lub jako sta∏e st´˝enie w paszy.
\nDawkowanie: jest poj´ciem ogólnym obejmujàcym dawk´, jej cz´stotliwoÊç i czas trwania jej podawania.
\nNeurotoksycznoÊç: jest szkodliwà zmianà w strukturze lub funkcjonowaniu uk∏adu nerwowego, która wynika z nara˝enia na czynnik biologiczny, chemiczny lub fizyczny.
\nCzynnik neurotoksyczny: to ka˝dy czynnik biologiczny, chemiczny lub fizyczny posiadajàcy mo˝liwoÊç spowodowania neurotoksycznoÊci.
\nNOAEL: skrót dla poziomu dawkowania bez obserwowanego szkodliwego skutku, jest to najwy˝szy poziom dawki, przy którym nie obserwuje si´ szkodliwych skutków zwiàzanych z nara˝eniem.
\nPoz. 2119 1.4. Opis metody badawczej 1.4.1. Wybór gatunku zwierzàt Zalecanym gatunkiem gryzoni jest szczur, chocia˝ inne gatunki gryzoni równie˝ mogà byç stosowane po odpowiednim uzasadnieniu. Stosowaç nale˝y powszechnie u˝ywane szczepy laboratoryjne m∏odych, zdrowych zwierzàt. Samice powinny byç dziewicze i nieci´˝arne. Dawkowanie powinno rozpoczàç si´ jak najszybciej po odstawieniu nie póêniej ni˝ w wieku 6 tygodni, a w ˝adnym przypadku w wieku ponad 9 tygodni. Je˝eli jednak niniejsze badanie jest ∏àczone z innymi, to wymagania co do wieku zwierzàt mogà ulec pewnym modyfikacjom. Na poczàtku doÊwiadczenia ró˝nica masy cia∏a nie powinna przekraczaç ±20 % Êredniej masy cia∏a ka˝dej p∏ci. Je˝eli doÊwiadczenie krótkoterminowe z powtarzanym dawkowaniem prowadzone jest jako wst´p do badania d∏ugoterminowego, to w obydwu doÊwiadczeniach nale˝y stosowaç takie same szczepy zwierzàt.
\n1.4.2. Warunki przetrzymywania i karmienia zwierzàt 1.3. Zasada metody badawczej Badana substancja podawana jest drogà pokarmowà w szeregu dawek kilku grupom gryzoni laboratoryjnych. Wymagane jest powtarzane podawanie dawek, a czas dawkowania powinien byç 28-dniowy, podprzewlek∏y (90 dni) lub przewlek∏y (1 rok lub d∏u˝ej). Procedury przedstawione w niniejszej metodzie badawczej mogà byç tak˝e wykorzystane do badania ostrej neurotoksycznoÊci. Zwierz´ta sà badane celem wykrycia lub scharakteryzowania nieprawid∏owoÊci behawioralnych i/lub neurologicznych. Rozpi´toÊç zmian behawioralnych, które mogà byç spowodowane przez substancj´ neurotoksycznà, jest okreÊlana w ka˝dym okresie obserwacji. Pod koniec badania cz´Êç zwierzàt ka˝dej p∏ci z ka˝dej grupy poddaje si´ perfuzji in situ i wykonuje sekcj´ mózgu, rdzenia kr´gowego i nerwów obwodowych.
\nGdy doÊwiadczenie jest prowadzone jako samodzielne badanie s∏u˝àce stwierdzeniu neurotoksycznoÊci lub charakterystyce skutków neurotoksycznych, to zwierz´ta w ka˝dej grupie nieu˝yte do perfuzji i badaƒ histopatologicznych (zobacz tabela B.43.1) mogà byç u˝yte do specyficznych badaƒ neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, które uzupe∏nià dane otrzymane w standardowych badaniach wymaganych przez niniejszà metod´ (zobacz pozycja 1 piÊmiennictwa). Te dodatkowe procedury mogà byç szczególnie u˝yteczne, gdy obserwacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazujà na specyficzny rodzaj lub cel neurotoksycznoÊci substancji chemicznej. Pozosta∏e zwierz´ta mogà byç tak˝e stosowane alternatywnie do oszacowaƒ, takich jak te podane w metodach badawczych przy powtarzanym dawkowaniu na gryzoniach.
\nGdy post´powanie wed∏ug niniejszej metody jest ∏àczone z post´powaniem wymaganym przez te inne metody, to wtedy potrzebna jest wystarczajàca liczba zwierzàt, by zapewniç obserwacje w obydwu badaniach.
\nTemperatura w pomieszczeniach doÊwiadczalnych powinna wynosiç 22±3 °C. WilgotnoÊç wzgl´dna powinna wynosiç 50—60 %, przy dopuszczalnych odchyleniach mi´dzy 30 % a 70 % (wy˝sza wartoÊç jedynie podczas czyszczenia pomieszczeƒ). Nale˝y stosowaç sztuczne oÊwietlenie: 12 godzin Êwiat∏a i 12 godzin ciemnoÊci. Nat´˝enie ha∏asu nale˝y ograniczyç do minimum. Do karmienia zwierzàt powinna byç stosowana typowa pasza laboratoryjna, nale˝y zapewniç nieograniczony dost´p do wody. Na wybór pokarmu mo˝e wp∏ywaç koniecznoÊç zapewnienia odpowiedniego zmieszania badanej substancji, gdy taki jest jej sposób podawania. Zwierz´ta mo˝na przetrzymywaç indywidualnie lub w ma∏ych grupach tej samej p∏ci.
\n1.4.3. Przygotowanie zwierzàt Zdrowe, m∏ode zwierz´ta sà w sposób losowy przypisywane do grup nara˝anych i kontrolnej. Klatki powinny byç umiejscowione w taki sposób, aby zminimalizowaç ewentualne skutki wynikajàce z ich usytuowania. Zwierz´ta sà jednoznacznie znakowane i trzymane w klatkach przez przynajmniej 5 dni przed rozpocz´ciem badania celem aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych (zobacz pozycja 5 piÊmiennictwa).
\n1.4.4. Sposób podawania i przygotowanie dawek Niniejsza metoda badawcza przeznaczona jest do podawania badanej substancji drogà pokarmowà. Podawanie drogà pokarmowà mo˝e byç wykonywane za pomocà sondy, w paszy, wodzie pitnej lub kapsu∏kach.
\nInne sposoby podawania (np. przez skór´ lub drogà inhalacyjnà) mogà byç stosowane, ale mogà wymagaç modyfikacji stosowanych procedur. Wybór drogi nara˝ania zale˝y od profilu nara˝enia ludzi i dost´pnych informacji toksykologicznych i kinetycznych. Nale˝y podaç uzasadnienie wyboru drogi nara˝enia i wynikajàce stàd modyfikacje procedur metody badawczej.
\nDziennik Ustaw Nr 251 — 16427 — Je˝eli to konieczne, to badana substancja mo˝e byç rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednim noÊniku. W pierwszej kolejnoÊci zaleca si´ stosowanie roztworów/zawiesin wodnych, a w dalszej kolejnoÊci roztworów/zawiesin olejowych (np. w oleju kukurydzianym) i w koƒcu roztworów/zawiesiny w innych noÊnikach. Charakterystyka toksykologiczna noÊnika powinna byç znana. Ponadto nale˝y uwzgl´dniç nast´pujàce w∏aÊciwoÊci noÊnika: wp∏ywy noÊnika na absorpcj´, rozmieszczenie, metabolizm i retencj´ badanej substancji, które mogà zmieniç jej charakterystyk´ toksykologicznà, wp∏ywy na konsumpcj´ paszy i spo˝ycie wody lub stan od˝ywienia zwierzàt.
\n1.5. Sposoby post´powania 1.5.1. Liczba i p∏eç zwierzàt Je˝eli badanie wykonywane jest jako oddzielne, to wtedy nale˝y stosowaç przynajmniej 20 zwierzàt (10 samic i 10 samców) w ka˝dej grupie nara˝anej i kontroli celem dokonania szczegó∏owych obserwacji klinicznych i czynnoÊciowych. Przynajmniej pi´ç samic i pi´ç samców z tych dziesi´ciu samców i dziesi´ciu samic powinno byç poddane perfuzji in situ i u˝ytych do szczegó∏owych badaƒ neurohistopatologicznych pod koniec doÊwiadczenia. W przypadkach gdy tylko ograniczona liczba zwierzàt w danej grupie dawkowej przejawia oznaki skutków neurotoksycznych, nale˝y uwzgl´dniç te zwierz´ta wÊród tych przeznaczonych do perfuzji. Je˝eli badanie jest wykonywane w po∏àczeniu z innym przy powtarzanym dawkowaniu, to nale˝y stosowaç odpowiednie liczby zwierzàt tak, by spe∏niç wymagania obydwu metod. Minimalne liczby zwierzàt na grup´ w ró˝nych kombinacjach badaƒ podano w tabeli B.43.1. Je˝eli planuje si´ likwidacj´ zwierzàt w trakcie doÊwiadczenia bàdê te˝ dodatkowe grupy celem obserwacji odwracalnoÊci, trwa∏oÊci lub opóênionego wystàpienia skutków toksycznych po nara˝eniu lub gdy planuje si´ dodatkowe obserwacje, to wtedy liczba zwierzàt powinna byç zwi´kszona tak, by zapewniç zwierz´ta potrzebne do obserwacji i badaƒ histopatologicznych.
\nPoz. 2119 konania badania i czu∏oÊç stosowanych sposobów post´powania. Takie dane powinny dostarczaç dowodów na zdolnoÊç do wykrywania i iloÊciowej oceny, o ile dotyczy, zmian w ró˝nych parametrach zalecanych do obserwacji, takich jak objawy autonomiczne, reakcje na bodêce, si∏a uchwytu i aktywnoÊç ruchowa. Informacje o substancjach, które powodujà ró˝ne rodzaje reakcji neurotoksycznych i mogà byç stosowane jako kontrola pozytywna, mo˝na znaleêç