Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 12 maja 2003 r. w sprawie metod analiz wyrobów winiarskich do celów urzędowej kontroli pod wzgl

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8306 — Poz. 1172 i 1173 34. Namibia 35. Norwegia 36. Republika Po∏udniowej Afryki 37. Republika Ârodkowoafrykaƒska 38. Rzeczpospolita Polska 39. Federacja Rosyjska 40. Sierra Leone 41. S∏owenia 42. Sri Lanka 43. Stany Zjednoczone Ameryki 44. Suazi 45. Szwajcaria 46. Tajlandia 47. Tanzania 48. Togo 49. Tunezja 50. Turcja 51. Ukraina 52. kraje cz∏onkowskie Unii Europejskiej 53. Wenezuela 54. W´gry 55. Wietnam 56. Wybrze˝e KoÊci S∏oniowej 57. Zimbabwe 58. Zjednoczone Emiraty Arabskie 9. Chiƒska Republika Ludowa 10. Cypr 11. Republika Czeska 12. Filipiny 13. Gabon 14. Ghana 15. Gujana 16. Gwinea 17. Indie 18. Izrael 19. Japonia 20. Kamerun 21. Kanada 22. Demokratyczna Republika Konga 23. Republika Konga 24. Koreaƒska Republika Ludowo-Demokratyczna 25. Republika Korei 26. Laos 27. Lesotho 28. Liban 29. Malezja 30. Mali 31. Malta 32. Mauritius 33. Meksyk 1173 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1) z dnia 12 maja 2003 r. w sprawie metod analiz wyrobów winiarskich do celów urz´dowej kontroli pod wzgl´dem jakoÊci handlowej Na podstawie art. 29 pkt 2 ustawy z dnia 25 lipca 2001 r. o wyrobie i rozlewie wyrobów winiarskich oraz obrocie tymi wyrobami (Dz. U. Nr 128, poz. 1401) zarzàdza si´, co nast´puje: § 1. Analiz´ aromatyzowanych napojów winiarskich i wyrobów winiarskich gronowych pod wzgl´dem jakoÊci handlowej przeprowadza si´, stosujàc nie mniej ni˝ jednà z nast´pujàcych metod do: 1) oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C — okreÊlonà w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia; 2) refraktometrycznego oznaczania zawartoÊci cukrów w moszczach gronowych i zag´szczonych moszczach gronowych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 2 do rozporzàdzenia; ——————— 1) Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje dzia∏em admini- stracji rzàdowej — rynki rolne, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 3 rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca 2002 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305). 3) oznaczania zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia; 4) oznaczania zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego (suchej masy ogó∏em) — okreÊlonà w za∏àczniku nr 4 do rozporzàdzenia; 5) oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 5 do rozporzàdzenia; 6) oznaczania zawartoÊci sacharozy — okreÊlonà w za∏àczniku nr 6 do rozporzàdzenia; 7) oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy — okreÊlonà w za∏àczniku nr 7 do rozporzàdzenia; 8) wykrywania wzbogacania moszczy gronowych, zag´szczonych moszczy gronowych i win metodà magnetycznego rezonansu jàdrowego deuteru (SNIF-NMR/RMN-FINS) — okreÊlonà w za∏àczniku nr 8 do rozporzàdzenia; 9) oznaczania zawartoÊci popio∏u — okreÊlonà w za∏àczniku nr 9 do rozporzàdzenia; Dziennik Ustaw Nr 126 — 8307 — Poz. 1173 10) oznaczania alkalicznoÊci popio∏u — okreÊlonà w za∏àczniku nr 10 do rozporzàdzenia; 37) oznaczania zawartoÊci dwutlenku w´gla — okreÊlonà w za∏àczniku nr 37 do rozporzàdzenia; 11) oznaczania zawartoÊci chlorków — okreÊlonà w za∏àczniku nr 11 do rozporzàdzenia; 38) oznaczania zawartoÊci pochodnych cyjankowych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 38 do rozporzàdzenia; 12) oznaczania zawartoÊci siarczanów — okreÊlonà w za∏àczniku nr 12 do rozporzàdzenia; 39) wykrywania obecnoÊci izotiocyjanianu allilowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 39 do rozporzàdzenia; 13) oznaczania kwasowoÊci ogólnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 13 do rozporzàdzenia; 40) oznaczania wskaênika Folin-Ciocalteu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 40 do rozporzàdzenia; 14) oznaczania kwasowoÊci lotnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 14 do rozporzàdzenia; 41) oznaczania stosunku izotopów tlenu o masie atomowej 18 i 16 (18O/16O) w wodzie zawartej w winie — okreÊlonà w za∏àczniku nr 41 do rozporzàdzenia. 15) oznaczania kwasowoÊci zwiàzanej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 15 do rozporzàdzenia; 16) oznaczania zawartoÊci kwasu winowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 16 do rozporzàdzenia; 17) oznaczania zawartoÊci kwasu cytrynowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 17 do rozporzàdzenia; 18) oznaczania zawartoÊci kwasu mlekowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 18 do rozporzàdzenia; 19) oznaczania zawartoÊci kwasu L-jab∏kowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 19 do rozporzàdzenia; 20) oznaczania zawartoÊci kwasu D-jab∏kowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 20 do rozporzàdzenia; § 2. Analiz´ fermentowanych napojów winiarskich pod wzgl´dem jakoÊci handlowej przeprowadza si´, stosujàc co najmniej jednà z nast´pujàcych metod: 1) oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C — okreÊlonà w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia; 2) oznaczania zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 3 do rozporzàdzenia; 21) oznaczania zawartoÊci kwasu jab∏kowego ogó∏em — okreÊlonà w za∏àczniku nr 21 do rozporzàdzenia; 3) oznaczania zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego (suchej masy ogó∏em) — okreÊlonà w za∏àczniku nr 4 do rozporzàdzenia; 22) oznaczania zawartoÊci kwasu sorbowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 22 do rozporzàdzenia; 4) oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych — okreÊlonà w za∏àczniku nr 5 do rozporzàdzenia; 23) oznaczania zawartoÊci kwasu L-askorbinowego — okreÊlonà w za∏àczniku nr 23 do rozporzàdzenia; 5) oznaczania zawartoÊci popio∏u — okreÊlonà w za∏àczniku nr 9 do rozporzàdzenia; 24) oznaczania wartoÊci pH — okreÊlonà w za∏àczniku nr 24 do rozporzàdzenia; 6) oznaczania alkalicznoÊci popio∏u — okreÊlonà w za∏àczniku nr 10 do rozporzàdzenia; 25) oznaczania zawartoÊci dwutlenku siarki — okreÊlonà w za∏àczniku nr 25 do rozporzàdzenia; 7) oznaczania zawartoÊci chlorków — okreÊlonà w za∏àczniku nr 11 do rozporzàdzenia; 26) oznaczania zawartoÊci sodu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 26 do rozporzàdzenia; 8) oznaczania zawartoÊci siarczanów — okreÊlonà w za∏àczniku nr 12 do rozporzàdzenia; 27) oznaczania zawartoÊci potasu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 27 do rozporzàdzenia; 9) oznaczania kwasowoÊci ogólnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 13 do rozporzàdzenia; 28) oznaczania zawartoÊci magnezu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 28 do rozporzàdzenia; 10) oznaczania kwasowoÊci lotnej — okreÊlonà w za∏àczniku nr 14 do rozporzàdzenia. 29) oznaczania zawartoÊci wapnia — okreÊlonà w za∏àczniku nr 29 do rozporzàdzenia; 30) oznaczania zawartoÊci ˝elaza — okreÊlonà w za∏àczniku nr 30 do rozporzàdzenia; 31) oznaczania zawartoÊci miedzi — okreÊlonà w za∏àczniku nr 31 do rozporzàdzenia; 32) oznaczania zawartoÊci kadmu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 32 do rozporzàdzenia; 33) oznaczania zawartoÊci srebra — okreÊlonà w za∏àczniku nr 33 do rozporzàdzenia; 34) oznaczania zawartoÊci cynku — okreÊlonà w za∏àczniku nr 34 do rozporzàdzenia; 35) oznaczania zawartoÊci o∏owiu — okreÊlonà w za∏àczniku nr 35 do rozporzàdzenia; 36) oznaczania zawartoÊci fluorków — okreÊlonà w za∏àczniku nr 36 do rozporzàdzenia; § 3. Analiz´ wyrobów winiarskich pod wzgl´dem jakoÊci handlowej mo˝na przeprowadzaç metodami innymi ni˝ okreÊlone w rozporzàdzeniu, je˝eli stosowanie innych metod zapewnia porównywalnà powtarzalnoÊç i odtwarzalnoÊç wyników, z tym ˝e uznaje si´ za ostateczny wynik analizy przeprowadzonej metodà okreÊlonà w rozporzàdzeniu. § 4. Przepisy § 1 tracà moc z dniem uzyskania przez Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii Europejskiej. § 5. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie 14 dni od dnia og∏oszenia. Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: A. Taƒski Dziennik Ustaw Nr 126 — 8308 — Poz. 1173 Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 12 maja 2003 r. (poz. 1173) Za∏àcznik nr 1 OZNACZANIE G¢STOÂCI I CI¢˚ARU W¸AÂCIWEGO W TEMPERATURZE 20 °C G´stoÊç jest stosunkiem masy okreÊlonej obj´toÊci wina lub moszczu w temperaturze 20 °C do tej obj´toÊci, wyra˝anym w g/ml, oznaczanym symbolem ρ 20. Ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C (lub g´stoÊç wzgl´dna) jest stosunkiem, wyra˝onym liczbà dziesi´tnà, g´stoÊci wina lub moszczu w temperaturze 20 °C do g´stoÊci wody w tej samej temperaturze, oznaczanym symbolem d2020. Do analiz stosuje si´ piknometr, który posiada bocznà rurk´ o d∏ugoÊci 25 mm o Êrednicy nieprzekraczajàcej 1 mm, zakoƒczonà sto˝kowym szlifem lub zamkni´tà korkiem zbiornikowym, który sk∏ada si´ z rurki ze sto˝kowym szlifem, wyd∏u˝onej cz´Êci na koƒcu i komory w Êrodkowej cz´Êci. 3. KALIBRACJA PIKNOMETRU Kalibracja piknometru polega na oznaczeniu: G´stoÊç i ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C w badanej próbce oznaczane sà metodà piknometrycznà. 1) tary pustego piknometru; 1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY 3) masy piknometru po nape∏nieniu go wodà o temperaturze 20 °C. JeÊli próbka zawiera znaczne iloÊci dwutlenku w´gla, usuwa si´ nadmiar tego dwutlenku w´gla przez mieszanie 250 ml wina w litrowej kolbie lub przez wykonanie filtracji pod zmniejszonym ciÊnieniem. 2. APARATURA I SPRZ¢T Do oznaczenia g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C stosuje si´ typowy sprz´t laboratoryjny, w szczególnoÊci: 1) piknometr przedstawiony na schemacie, wykonany ze szk∏a typu Pyrex, o pojemnoÊci oko∏o 100 ml, z wyjmowanym skalibrowanym termometrem, z doszlifowanym korkiem, o skali o dzia∏ce elementarnej 1/10 stopnia w zakresie od 10 do 30 °C; 2) butelk´ tarowà przedstawionà na schemacie, o obj´toÊci takiej jak piknometr, z dopuszczalnà tolerancjà do 1 ml, o masie równej masie piknometru nape∏nionego cieczà o g´stoÊci w∏aÊciwej 1,01, np. 2,0 % m/v roztworem chlorku sodowego; 3) termicznie izolowanà os∏on´ (pojemnik) o kszta∏cie dok∏adnie dopasowanym do kszta∏tu piknometru; 4) wag´ dwuszalkowà o noÊnoÊci nie mniejszej ni˝ 300 g oraz czu∏oÊci 0,1 mg albo wag´ jednoszalkowà o noÊnoÊci nie mniejszej ni˝ 200 g oraz czu∏oÊci 0,1 mg. Schemat piknometru i butelki tarowej 2) obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C; Metoda oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C z zastosowaniem wagi dwuszalkowej Butelk´ tarowà stawia si´ na lewej szalce wagi, natomiast czysty i suchy piknometr, zamkni´ty „korkiem zbiornikowym”, stawia si´ na prawej szalce wagi. Na szalce z piknometrem umieszcza si´ odwa˝niki w liczbie potrzebnej do uzyskania równowagi. Nast´pnie zapisuje si´ ∏àcznà mas´ odwa˝ników w gramach, oznaczanà dalej literà „ρ”. Piknometr nape∏nia si´ wodà destylowanà o temperaturze pokojowej, wk∏ada si´ do niego termometr. Ostro˝nie wyciera si´ piknometr, a nast´pnie umieszcza go w termicznie izolowanym pojemniku. Pojemnik z piknometrem odwraca si´ parokrotnie w celu wyrównania temperatury. Po osiàgni´ciu wyrównanej sta∏ej temperatury uzupe∏nia si´ poziom wody w piknometrze do poziomu górnej kraw´dzi bocznej rurki. Wyciera si´ do sucha Êcianki rurki, wk∏ada „korek zbiornikowy” i dok∏adnie odczytuje wskazanie temperatury t °C. Nape∏niony wodà piknometr umieszcza si´ na prawej szalce wagi, a butelk´ tarowà na lewej. Na szalk´ z piknometrem nape∏nionym wodà dok∏ada si´ odwa˝niki w liczbie potrzebnej do uzyskania równowagi, nast´pnie zapisuje si´ ich ∏àcznà mas´ ρ’ w gramach. Obliczanie wyniku oznaczania: 1) tara pustego piknometru = ρ + m, gdzie m oznacza mas´ powietrza wype∏niajàcego piknometr, m = 0,0012 (ρ — ρ’); 2) obj´toÊç piknometru (V20) w temperaturze 20 °C ustala si´ z dok∏adnoÊcià ± 0,001 ml wed∏ug wzoru: V20 = (ρ + m — ρ’) x F, butelka tarowa piknometr gdzie F jest wspó∏czynnikiem odczytanym z tabeli nr I za∏àcznika, dla temperatury t °C; Dziennik Ustaw Nr 126 — 8309 — 3) masa wody (M20) w temperaturze 20 °C: Poz. 1173 gdzie liczba 0,998203 jest g´stoÊcià wody w temperaturze 20 °C. w dalszej cz´Êci dokumentu, zgodnie z rodzajem badanej cieczy: wino o zawartoÊci cukrów mniejszej ni˝ 33 g/l (tabela nr II), naturalny lub zag´szczony moszcz (tabela nr III), wino o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l (tabela nr IV); Metoda oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C z zastosowaniem wagi jednoszalkowej 4) ci´˝ar w∏aÊciwy d2020 badanego wina oblicza si´ przez podzielenie jego g´stoÊci w temperaturze 20 °C przez g´stoÊç wody w temperaturze 20 °C, która wynosi 0,998203. M20 = 0,998203 V20, W metodzie z zastosowaniem wagi jednoszalkowej oznacza si´: 1) tar´ pustego piknometru, oznaczanà symbolem P; 2) mas´ piknometru nape∏nionego wodà o temperaturze t °C, oznaczanà symbolem P1; 3) mas´ butelki tarowej, oznaczanà symbolem T0. W metodzie z wykorzystaniem wagi jednoszalkowej oznacza si´: 1) tar´ pustego piknometru, oznaczanà symbolem P; 2) mas´ piknometru nape∏nionego badanà próbkà o temperaturze t °C, oznaczanà symbolem P2; 3) mas´ butelki tarowej oznaczanej symbolem Tt. Obliczanie wyniku oznaczania: 1) tara pustego piknometru = P — m, Obliczanie wyniku oznaczania gdzie m oznacza mas´ powietrza wype∏niajàcego piknometr, m = 0,0012 (P1— P); 2) obj´toÊç piknometru (V20) w 20 °C oblicza si´ wed∏ug wzoru: Metoda z wykorzystaniem wagi jednoszalkowej temperaturze V20 = [P — (P — m)] x F, gdzie F = wspó∏czynnik odczytany z tabeli nr I za∏àcznika dla temperatury t °C. Obj´toÊç piknometru podaje si´ z dok∏adnoÊcià do ±0,001 ml; 3) mas´ wody (M20) w temperaturze 20 °C oblicza si´ wed∏ug wzoru: M20 = 0,998203 V20, gdzie 0,998203 jest g´stoÊcià wody w temperaturze 20 °C. 1) masa pustego piknometru w czasie pomiaru = P — m + dT, gdzie dT = Tt — T0; 2) masa próbki zawartej w piknometrze w temperaturze t °C = P2 — (P — m + dT); 3) g´stoÊç pozornà (ρ t) w temperaturze t °C oblicza si´ wed∏ug wzoru: P2 — (P — m + dT) ρt = —————————— ; V20 4) g´stoÊç w temperaturze 20 °C oblicza si´, wykorzystujàc jednà z tabel poprawek zamieszczonych w dalszej cz´Êci dokumentu, zgodnie z rodzajem badanej cieczy: wino o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l i wino pozbawione alkoholu (tabela nr II), naturalny lub zag´szczony moszcz (tabela nr III), wino o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l (tabela nr IV); Metoda z wykorzystaniem wagi dwuszalkowej 5) ci´˝ar w∏aÊciwy d2020 wina jest obliczany przez podzielenie jego g´stoÊci w temperaturze 20 °C przez g´stoÊç wody w temperaturze 20 °C równà 0,998203. Piknometr nape∏nia si´ przygotowanà próbkà i przeprowadza post´powanie analogicznie jak w przypadku nape∏nienia wodà destylowanà. Dla uzyskania bardzo dok∏adnych oznaczeƒ wynik pomiaru g´stoÊci koryguje si´, uwzgl´dniajàc wp∏yw dwutlenku siarki, zgodnie z wzorem: 4. WYKONANIE OZNACZANIA Obliczanie wyniku oznaczenia: 1) masa próbki zawartej w piknometrze = ρ + m — ρ”, gdzie ρ” oznacza mas´ odwa˝ników w gramach potrzebnà do uzyskania równowagi podczas wa˝enia pomi´dzy butelkà tarowà znajdujàcà si´ na lewej szalce i piknometrem nape∏nionym badanà próbkà znajdujàcym si´ na prawej szalce wagi; 2) pozornà g´stoÊç (ρt) w temperaturze t °C oblicza si´ wed∏ug wzoru: ρ + m — ρ„ ρt = —————— ; V20 3) g´stoÊç w temperaturze 20 °C oblicza si´, wykorzystujàc jednà z tabel poprawek zamieszczonych ρ20 = ρ‘20 — 0,0006 x S, gdzie ρ20 — oznacza g´stoÊç skorygowanà, ρ’20 — oznacza g´stoÊç zmierzonà, S — oznacza ca∏kowità zawartoÊç dwutlenku siarki w g/l. 5. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8310 — W przypadku oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C powtarzalnoÊç (r) wynosi: 1) dla win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l: r = 0,00010; Poz. 1173 ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu. 2) dla win o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l: r = 0,00018. W przypadku oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C odtwarzalnoÊç (R) wynosi: 6. ODTWARZALNOÂå METODY 1) dla win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l: R = 0,00037; OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna 2) dla win o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l: R = 0,00045. TABELA nr I WartoÊci wspó∏czynnika F do obliczenia obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie: Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika F pomno˝one przez mas´ wody o temperaturze t °C zawartej w piknometrze ze szk∏a typu Pyrex stosuje si´ do obliczenia obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8311 — Poz. 1173 TABELA nr II WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l, pozbawionych alkoholu, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie: Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” stosuje si´ do obliczania g´stoÊci win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l, pozbawionych alkoholu, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C wed∏ug nast´pujàcego wzoru: c ρ20 = ρt ± ——— 1000 — je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C + je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C WartoÊci podane w tabeli majà tak˝e zastosowanie do przeliczania ci´˝aru w∏aÊciwego d t20 na ci´˝ar w∏aÊciwy d 2020. TABELA nr III WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci naturalnych i zag´szczonych moszczy, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie: WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” podane w tabeli stosuje si´ obliczania g´stoÊci naturalnych i zag´szczonych moszczy, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C wed∏ug nast´pujàcego wzoru: c ρ20 = ρt ± ——— 1000 — je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C + je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C WartoÊci podane w tabeli majà tak˝e zastosowanie do przeliczania ci´˝aru w∏aÊciwego d t20 na ci´˝ar w∏aÊciwy d 2020. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8312 — Poz. 1173 TABELA nr IV WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci win o st´˝eniu alkoholu nie mniejszym ni˝ 13 % obj., zawierajàcych pozosta∏oÊci cukrów, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie: Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” stosuje si´ do obliczania g´stoÊci win o st´˝eniu alkoholu nie mniejszym ni˝ 13 % obj., zawierajàcych pozosta∏oÊci cukrów, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C, wed∏ug nast´pujàcego wzoru: c ρ20 = ρt ± ——— 1000 — je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C + je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C Dziennik Ustaw Nr 126 — 8313 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 2 REFRAKTOMETRYCZNE OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CUKRÓW W MOSZCZACH GRONOWYCH I ZAG¢SZCZONYCH MOSZCZACH GRONOWYCH Oznaczanie zawartoÊci cukrów w moszczach gronowych, zag´szczonych moszczach gronowych polega na obliczeniu ich zawartoÊci w g/l lub w g/kg na podstawie: 1) wspó∏czynnika refrakcji wyra˝onego w wartoÊciach bezwzgl´dnych i zawartego w tabelach lub z dok∏adnoÊcià do 0,1 %, a wspó∏czynnik refrakcji z dok∏adnoÊcià do czwartego miejsca po przecinku. Dodatkowo ustala si´ wartoÊç temperatury t °C. Oznaczanie wykonuje si´ w dwóch powtórzeniach. 2) zawartoÊci sacharozy wyra˝onej w % wagowych. 4. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA 1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Poprawka uwzgl´dniajàca wp∏yw temperatury jest stosowana w przypadku u˝ycia refraktometru wyskalowanego w % wagowych sacharozy. Do odczytania wartoÊci poprawki korzysta si´ z tabeli nr I za∏àcznika. Przygotowanie moszczu lub moszczu zag´szczonego wykonuje si´, przesàczajàc go przez suchà gaz´ z∏o˝onà czterokrotnie, przy czym pierwsze krople przesàczu odrzuca si´. 2. APARATURA I SPRZ¢T Refraktometr Abbego ze skalà podajàcà: 1) % wagowe sacharozy z dok∏adnoÊcià do 0,1 % lub 2) wspó∏czynnik refrakcji do czwartego miejsca po przecinku. Do oznaczania zawartoÊci cukrów stosuje si´ refraktometr wyposa˝ony w termometr ze skalà o zakresie co najmniej od +15 °C do +25 °C oraz w urzàdzenie do cyrkulacji wody umo˝liwiajàce dokonywanie pomiarów w temperaturze 20±5 °C. 3. WYKONANIE OZNACZANIA Próbk´ doprowadza si´ do temperatury bliskiej 20 °C. Nast´pnie niewielkà iloÊç tej próbki umieszcza si´ na dolnym pryzmacie refraktometru tak, aby próbka równomiernie pokrywa∏a szklanà powierzchni´. ZawartoÊç sacharozy odczytuje si´ w % wagowych W przypadku zastosowania refraktometru wyskalowanego w wartoÊciach wspó∏czynnika refrakcji do odczytania odpowiedniej wartoÊci zawartoÊci sacharozy w % wagowych w temperaturze t °C w tabeli nr II za∏àcznika odczytuje si´ zawartoÊç sacharozy odpowiadajàcà zmierzonej wartoÊci wspó∏czynnika refrakcji. Ustalanà w ten sposób zawartoÊç sacharozy koryguje si´ za pomocà danych podanych w tabeli nr I za∏àcznika. ZawartoÊç sacharozy w moszczach i moszczach zag´szczonych w % wagowych w temperaturze 20 °C odnajduje si´ w tabeli nr II za∏àcznika i odczytuje odpowiednià zawartoÊç sacharozy w g/l i g/kg. ZawartoÊç cukrów jest wyra˝ana w przeliczeniu na cukier inwertowany z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Przy ustalaniu wspó∏czynnika refrakcji moszczu lub moszczu zag´szczonego zawartoÊç sacharozy w temperaturze 20 °C odnajduje si´ w tabeli nr II i odczytuje odpowiednià wartoÊç wspó∏czynnika refrakcji w temperaturze 20 °C. Wspó∏czynnik ten podany jest z dok∏adnoÊcià do czwartego miejsca po przecinku. TABELA nr I WartoÊci poprawek majàce zastosowanie, gdy oznaczanie zawartoÊci sacharozy w procentach masowych zosta∏o wykonane w temperaturze ró˝nej od 20 °C ObjaÊnienie: Podane w tabeli poprawki majà zastosowanie w przypadku dokonania oznaczania zawartoÊci sacharozy w procentach masowych przy temperaturze ró˝nej od 20 °C. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8314 — Poz. 1173 TABELA nr II ZawartoÊç cukrów w moszczu gronowym i zag´szczonym moszczu gronowym w g/l i g/kg, oznaczona za pomocà refraktometru wyskalowanego w % wag. sacharozy w temperaturze 20 °C lub w wartoÊci wspó∏czynnika refrakcji w temperaturze 20 °C, przeliczona na cukier inwertowany Dziennik Ustaw Nr 126 — 8315 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8316 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8317 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8318 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8319 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8320 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8321 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8322 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8323 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8324 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8325 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8326 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8327 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 3 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI ALKOHOLU W PROCENTACH OBJ¢TOÂCIOWYCH 1. APARATURA I SPRZ¢T Destylat zbiera si´ w tej samej 200 ml kolbie miarowej u˝ywanej do odmierzania wina. Destylat zbiera si´ w iloÊci oko∏o 3/4 wyjÊciowej obj´toÊci wina w przypadku destylacji bez pary wodnej i 198 do 199 ml destylatu w przypadku destylacji z parà wodnà. Nast´pnie destylat uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do 200 ml, przy czym temperatura destylatu nie mo˝e odbiegaç od temperatury poczàtkowej o wi´cej ni˝ ±2 °C. Do oznaczania zawartoÊci alkoholu stosuje si´ sprz´t laboratoryjny, w szczególnoÊci: Bardzo ostro˝nie miesza si´ destylat w kolbie kolistymi ruchami. 1) zestaw do destylacji sk∏adajàcy si´ z litrowej kolby okràg∏odennej ze szlifem, kolumny rektyfikacyjnej o wysokoÊci oko∏o 20 cm lub innego urzàdzenia zapobiegajàcego rozpryskiwaniu cieczy, êród∏a ciep∏a, ch∏odnicy zakoƒczonej przed∏u˝aczem doprowadzajàcym destylat na dno kolby miarowej lub Dla win zawierajàcych szczególnie du˝e iloÊci jonów amonowych destylat poddaje si´ powtórnej destylacji, zast´pujàc zawiesin´ wodorotlenku wapnia 1-molowym roztworem kwasu siarkowego, rozcieƒczonego w stosunku 10:100 (v/v). Oznaczanie zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych (% obj.) polega na wykonaniu destylacji wina, uprzednio zalkalizowanego za pomocà zawiesiny wodorotlenku wapnia, i piknometrycznym oznaczeniu g´stoÊci destylatu. ZawartoÊci alkoholu odczytuje si´ z tabel alkoholometrycznych. 2) zestaw do destylacji z parà wodnà, sk∏adajàcy si´ z wytwornicy pary, przewodu pary, kolumny rektyfikacyjnej i ch∏odnicy; 3) piknometr. Dopuszcza si´ u˝ycie dowolnego typu aparatu do destylacji bez pary wodnej lub z parà wodnà, o ile spe∏ni wymagania testu, w którym przeprowadza si´ pi´ç kolejnych destylacji mieszaniny alkoholowo-wodnej o zawartoÊci alkoholu 10 % obj., przy czym zawartoÊç alkoholu w destylacie po pi´ciu destylacjach powinna wynosiç co najmniej 9,9 % obj., a straty alkoholu w ka˝dej destylacji nie mogà przekraczaç 0,02 % obj. 2. ODCZYNNIKI Dwumolowa zawiesina wodorotlenku wapnia, otrzymana przez stopniowe dodawanie do 120 g wapna niegaszonego (CaO) litra wody o temperaturze od 60 do 70 °C. 3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Z wina usuwa si´ wi´kszoÊç dwutlenku w´gla przez mieszanie próbki wina o obj´toÊci 250 do 300 ml w kolbie o pojemnoÊci 500 ml. Nast´pnie za pomocà kolby miarowej odmierza si´ 200 ml wina, które przenosi si´ nast´pnie do kolby destylacyjnej. Kolb´ miarowà przemywa si´ czterokrotnie 5 ml porcjami wody, zlewajàc jà do kolby destylacyjnej lub do przewodu pary. Do kolby destylacyjnej wprowadza si´ przewód pary zestawu do destylacji z parà wodnà. Nast´pnie dodaje si´ 10 ml zawiesiny wodorotlenku wapnia i kilka od∏amków oboj´tnego materia∏u porowatego takiego jak pumeks. 4. WYKONANIE OZNACZANIA G´stoÊç (ρt) destylatu w temperaturze t °C oznacza si´ w sposób okreÊlony w za∏àczniku nr 1 do rozporzàdzenia. 5. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA ZawartoÊç alkoholu w temperaturze 20 °C odczytuje si´ przy u˝yciu tabel alkoholometrycznych. 6. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu. W przypadku oznaczania zawartoÊci alkoholu powtarzalnoÊç (r) wynosi: r = 0,10 % obj. 7. ODTWARZALNOÂå METODY OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu. W przypadku oznaczania zawartoÊci alkoholu odtwarzalnoÊç (R) wynosi: R = 0,19 % obj. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8328 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 4 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI EKSTRAKTU CA¸KOWITEGO (suchej masy ogó∏em) Ekstrakt ca∏kowity (sucha masa ogó∏em) jest to zawartoÊç wszystkich substancji nielotnych. Ekstrakt bezcukrowy jest to ró˝nica pomi´dzy ekstraktem ca∏kowitym a zawartoÊcià cukrów ogó∏em. 2. OBLICZANIE WYNIKU Ci´˝ar w∏aÊciwy (d1) wina pozbawionego alkoholu oblicza si´ wed∏ug wzoru: gdzie: Ekstrakt zredukowany jest to ró˝nica mi´dzy ekstraktem ca∏kowitym a zawartoÊcià cukrów ogó∏em w iloÊci powy˝ej 1 g/l, zawartoÊcià siarczanu potasowego w iloÊci powy˝ej 1 g/l, zawartoÊcià mannitolu i zawartoÊcià innych substancji chemicznych, które mogà byç dodawane do wina. Ekstrakt resztkowy jest to ekstrakt bezcukrowy pomniejszony o kwasowoÊç zwiàzanà w przeliczeniu na kwas winowy. ZawartoÊç ekstraktu wyra˝a si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do ±0,5 g. 1. WYKONANIE OZNACZANIA ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego oblicza si´ poÊrednio na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego moszczu, a dla wina na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego wina pozbawionego alkoholu. ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego wyra˝ana jest przez iloÊç sacharozy, która rozpuszczona w wodzie i sprowadzona do obj´toÊci 1 litra da roztwór o ci´˝arze w∏aÊciwym takim jak moszcz lub wino pozbawione alkoholu. IloÊci te sà podane w tabeli za∏àcznika. dv d1 = dv – da + 1,000, — oznacza ci´˝ar w∏aÊciwy wina w temperaturze 20 °C (z poprawkà na kwasowoÊç lotnà), dv = d2020 — 0,0000086 kwasowoÊci lotnej wyra˝onej w miligramorównowa˝nikach na litr, da — oznacza ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C mieszaniny wodno-alkoholowej o tej samej zawartoÊci alkoholu co wino. dv obliczaç mo˝na równie˝ na podstawie g´stoÊci w temperaturze 20 °C wina (ρv) i mieszaniny wodno-alkoholowej (ρa) o tej samej zawartoÊci alkoholu wed∏ug wzoru: dv = 1,0018 (ρv – ρa) + 1,000, gdzie wspó∏czynnik 1,0018 zaokràgla si´ do jednoÊci, gdy wartoÊç ρv jest mniejsza od 1,05, co ma miejsce w wi´kszoÊci przypadków. Do obliczenia zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego w g/l na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego d1 wina pozbawionego alkoholu lub na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego d2020 moszczu stosuje si´ wartoÊci z tabeli za∏àcznika. ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego ustala si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8329 — TABELA Obliczanie zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego w g/l Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8330 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 5 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CUKRÓW REDUKUJÑCYCH Cukry redukujàce sà to wszystkie cukry zawierajàce wolne grupy karbonylowe, które mogà redukowaç sole miedziowe w roztworach alkalicznych. Metoda oznaczania cukrów redukujàcych polega na przesàczeniu zoboj´tnionego oraz pozbawionego alkoholu wina lub moszczu przez kolumn´ jonowymiennà, w której aniony analizowanej próbki sà wymieniane na jony octanowe. Przesàczonà próbk´ klaruje si´ oboj´tnym octanem o∏owiawym i tak sklarowane wino lub moszcz reaguje z okreÊlonà iloÊcià zasadowego roztworu soli miedziowej, a pozosta∏e w roztworze jony miedziowe sà oznaczane jodometrycznie. 1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY — KLAROWANIE Przy oznaczaniu cukrów redukujàcych próbk´ rozcieƒcza si´ tak, aby zawartoÊç cukrów w badanym roztworze mieÊci∏a si´ w granicach od 0,5 do 5 g/l. Win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l nie rozcieƒcza si´ w trakcie klarowania, natomiast wina s∏odkie rozcieƒcza si´ w trakcie klarowania tak, aby zawartoÊç cukrów mieÊci∏a si´ w nast´pujàcych granicach: Próbka ZawartoÊç cukrów (g/l) G´stoÊç Rozcieƒczenie (%) Moszcze i mistele Wina s∏odkie o zawartoÊci cukrów znacznie powy˝ej 33 g/l, wzmocnione lub niewzmocnione Wina o zawartoÊci cukrów nieco powy˝ej 33 g/l Wina o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l >125 >1,038 1 25 do 125 1,005 do 1,038 4 5 do 25 0,997 do 1,005 20 <5 <0,997 nierozcieƒczane Odczynniki: 1) jednomolowy roztwór kwasu solnego (HCl); 2) jednomolowy roztwór wodorotlenku sodowego (NaOH); 3) czteromolowy (CH3COOH); roztwór kwasu octowego 4) dwumolowy roztwór wodorotlenku sodowego (NaOH); 5) ˝ywica anionowymienna (Dowex 3 20—50 mesh) lub inna ˝ywica o podobnych w∏asnoÊciach; 6) oboj´tny roztwór octanu o∏owiawego, sporzàdzony z 250 g oboj´tnego octanu o∏owiawego [Pb(CH3COOH)2 • 3 H2O)] rozpuszczonego w goràcej wodzie, w takiej iloÊci, aby mo˝na by∏o uzyskaç 500 ml gotowego roztworu; 7) w´glan wapniowy (CaCO3). Klarowanie win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l Do zlewki o Êrednicy od 10 do 12 cm wlewa si´ 50 ml wina, a nast´pnie dodaje si´ 1/2 (n – 0,5) ml roztworu wodorotlenku sodowego (gdzie n oznacza obj´toÊç roztworu wodorotlenku sodowego zu˝ytego do oznaczania kwasowoÊci ogólnej w 10 ml wina). Próbk´ odparowywuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej w strumieniu goràcego powietrza do otrzymania obj´toÊci oko∏o 20 ml. Nast´pnie próbk´ przesàcza si´ przez kolumn´ z ˝ywicà anionowymiennà w formie octanowej, z szybkoÊcià 3 ml na dwie minuty. Eluat zbiera si´ w kolbie miarowej na 100 ml. Naczynie i kolumn´ przemywa si´ szeÊciokrotnie porcjami wody o obj´toÊci 10 ml ka˝da. Nast´pnie, mieszajàc ca∏y czas, do eluatu dodaje si´ 2,5 ml nasyconego roztworu octanu o∏owianego oraz 0,5 g w´glanu wapniowego. Ca∏oÊç cieczy wstrzàsa si´ kilkakrotnie i pozostawia na co najmniej 15 minut. Nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà i przesàcza si´. 1 ml przesàczu odpowiada 0,5 ml wina. Klarowanie moszczy, misteli, win s∏odkich i pó∏s∏odkich: 1) dla moszczy i misteli — przygotowuje si´ 10 % roztwór badanej próbki, a do analizy bierze si´ 10 ml rozcieƒczonej próbki; 2) dla win s∏odkich o g´stoÊci w temperaturze 20 °C pomi´dzy 1,005 i 1,038 — przygotowuje si´ 20 % roztwór badanej próbki, a do analizy bierze si´ 20 ml rozcieƒczonej próbki; 3) dla win pó∏s∏odkich o g´stoÊci w temperaturze 20 °C pomi´dzy 0,997 i 1,005 — do analizy pobiera si´ 20 ml nierozcieƒczonego wina. Próbki przesàcza si´ przez kolumn´ anionowymiennà w formie octanowej z szybkoÊcià 3 ml na dwie minuty. Eluat zbiera si´ w kolbie miarowej na 100 ml. Nast´pnie kolumn´ przemywa si´ wodà a˝ do uzyskania oko∏o 90 ml eluatu. Do eluatu dodaje si´ 0,5 g w´glanu wapniowego i 1 ml nasyconego roztworu octanu o∏owiawego. Ca∏oÊç miesza si´ i pozostawia na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, po czym uzupe∏nia wodà do 100 ml i przesàcza. 2. WYKONANIE OZNACZANIA Odczynniki: 1) zasadowy roztwór soli miedziowej — 25 g siarczanu miedziowego (CuSO4 • 5 H2O) rozpuszcza si´ w 100 ml wody, 50 g kwasu cytrynowego (C6H8O7 • H2O) rozpuszcza si´ w 300 ml wody, 388 g krystalicznego w´glanu sodu (Na2CO3 • 10 H2O) rozpuszcza si´ w 300 ÷ 400 ml goràcej wody, nast´pnie miesza si´ Dziennik Ustaw Nr 126 — 8331 — roztwory kwasu cytrynowego i w´glanu sodu, dodaje roztwór siarczanu miedzi i dope∏nia wodà do 1 litra; 2) 30 % roztwór jodku potasowego; 3) 25 % kwas siarkowy; 4) roztwór skrobi o st´˝eniu 5 g/l: wod´ w iloÊci oko∏o 500 ml z dodatkiem 5 g skrobi doprowadza si´ do wrzenia, stale mieszajàc, a nast´pnie gotuje przez 10 minut, po czym dodaje si´ 200 g chlorku sodu, ch∏odzi i uzupe∏nia wodà do 1 litra; 5) 0,1-molowy roztwór tiosiarczanu(VI)sodu; 6) roztwór cukru inwertowanego o st´˝eniu 5 g/l: roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób: w kolbie miarowej o pojemnoÊci 200 ml umieszcza si´ 4,75 g czystej i suchej sacharozy, dodaje 100 ml wody oraz 5 ml st´˝onego kwasu solnego (o g´stoÊci ρ20 = 1,16—1,19 g/ml); kolb´ ogrzewa si´ w ∏aêni wodnej o temperaturze 60 °C do uzyskania temperatury roztworu 50 °C. Temperatur´ t´ utrzymuje si´ przez oko∏o 15 minut, a nast´pnie kolb´ pozostawia si´ do ostygni´cia na oko∏o 30 minut; roztwór z kolby przenosi si´ do kolby miarowej o pojemnoÊci 1 litra i dope∏nia wodà do 1 litra. Tak sporzàdzony roztwór mo˝e byç stosowany nie d∏u˝ej ni˝ miesiàc od dnia sporzàdzenia. Przed u˝yciem roztwór zoboj´tnia si´ roztworem wodorotlenku sodu. Poz. 1173 3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA IloÊç cukrów zawarta w próbce w przeliczeniu na cukier inwertowany podana w tabeli jest funkcjà iloÊci (n’ — n) ml zu˝ytego tiosiarczanu sodu, gdzie n — oznacza iloÊç ml zu˝ytego tiosiarczanu sodu, n’ — oznacza iloÊç ml tiosiarczanu sodu zu˝ytego w próbie Êlepej. ZawartoÊç cukrów w winie, w przeliczeniu na cukier inwertowany, podaje si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Uwzgl´dnia si´ rozcieƒczenie próbki powsta∏e w trakcie klarowania oraz obj´toÊç badanej próbki. 4. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu. W przypadku oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych powtarzalnoÊç (r) wynosi: r = 0,015 xi, gdzie xi oznacza zawartoÊç w g/l próbki. cukru inwertowanego Oznaczanie 5. ODTWARZALNOÂå METODY W kolbie sto˝kowej o pojemnoÊci 300 ml sporzàdza si´ mieszanin´ 25 ml zasadowego roztworu siarczanu OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejmiedzi z 15 ml wody i 10 ml sklarowanego roztworu ba- sza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna danej próbki. Do tej mieszaniny wrzuca si´ kilka ma∏ych ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami baod∏amków pumeksu. Nast´pnie na kolb´ zak∏ada si´ daƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, ch∏odnic´ zwrotnà. Roztwór podgrzewa si´ i doprowa- dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez dza do wrzenia w ciàgu 2 minut. Roztwór gotuje si´ przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu. 10 minut, po czym kolb´ szybko och∏adza si´ w strumieW przypadku oznaczania zawartoÊci cukrów reduniu zimnej wody. Do och∏odzonego roztworu dodaje si´ 10 ml roztworu jodku potasu, 25 ml kwasu siarkowego kujàcych odtwarzalnoÊç (R) wynosi: oraz 2 ml roztworu skrobi. Roztwór ten miareczkuje si´ R = 0,058 xi, roztworem tiosiarczanu(VI)sodu. Dla porównania wykonuje si´ prób´ Êlepà, w której 10 ml roztworu cukru za- gdzie xi oznacza zawartoÊç cukru inwertowanego st´puje si´ 10 ml wody destylowanej. w g/l próbki. TABELA Zale˝noÊç mi´dzy obj´toÊcià 0,1-molowego roztworu tiosiarczanu sodu (n’ — n) a iloÊcià cukrów redukujàcych w mg Na2S2O3 (ml) Cukry redukujàce (mg) Ró˝nica Na2S2O3 (ml) Cukry redukujàce (mg) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,2 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 Ró˝nica 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8332 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 6 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SACHAROZY Oznaczanie zawartoÊci sacharozy wykonuje si´ metodà chromatografii cienkowarstwowej, chromatografii cieczowej lub chromatografii gazowej. ko fazà zwiàzanà oraz z detekcjà refraktometrycznà. Oznaczanie iloÊciowe jest wykonywane z u˝yciem wzorca zewn´trznego analizowanego w identycznych warunkach. METODA CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ W chromatografii cienkowarstwowej sacharoz´ oddziela si´ od innych cukrów na p∏ytce pokrytej celulozà. Wywo∏ywanie chromatogramu wykonuje si´ z zastosowaniem mieszaniny mocznika i kwasu solnego, w temperaturze 105 °C. Aparatura i sprz´t: 1) p∏ytki chromatograficzne pokryte warstwà celulozy o odpowiedniej gruboÊci (20 x 20); 2) komora chromatograficzna; 3) mikrostrzykawka lub mikropipeta; 4) suszarka umo˝liwiajàca uzyskanie temperatury 105 °C, z dok∏adnoÊcià do 2 °C. Odczynniki: 1) w´giel aktywowany do odbarwiania; 2) faza ruchoma: dwuchlorometan : kwas octowy 100 % (lodowaty o g´stoÊci ρ20 = 1,05 g/ml) : etanol : metanol : woda, w nast´pujàcych proporcjach 50:25:9:6:10; 3) roztwór wywo∏ujàcy sporzàdzony z: 5 g mocznika, 20 ml dwumolowego kwasu solnego i 100 ml etanolu; 4) roztwór wzorcowy zawierajàcy: 35 g glukozy, 35 g fruktozy i 0,5 g sacharozy w 1000 ml wody. Przygotowanie próbki do analizy Silnie zabarwiony moszcz lub wino przed wykonaniem oznaczania odbarwia si´ za pomocà w´gla aktywnego. Otrzymywanie chromatogramu Na linii równoleg∏ej do dolnej kraw´dzi p∏ytki i oddalonej od niej o 2,5 cm nanosi si´: 1) 10 µl próbki; 2) 10 µl roztworu wzorcowego. P∏ytk´ umieszcza si´ w komorze uprzednio nasyconej parami fazy ruchomej. Chromatogram rozwija si´ do momentu, gdy faza ruchoma znajdzie si´ 1 cm od górnej kraw´dzi p∏ytki. P∏ytk´ wyjmuje si´ i suszy w strumieniu ciep∏ego powietrza. Rozwijanie chromatogramu powtarza si´ dwukrotnie. Po rozwini´ciu chromatogramu p∏ytk´ spryskuje si´ równomiernie 15 ml odczynnika barwiàcego i umieszcza w suszarce o temperaturze 105 °C na oko∏o 5 minut. Aparatura i sprz´t: 1) wysokosprawny chromatograf cieczowy wyposa˝ony w: a) injektor typu zaworu z 10 µl loop injector, b) detektor, refraktometr ró˝nicowy lub refraktometr interferometryczny, c) kolumn´ z wype∏nieniem na bazie krzemionki z alkiloaminà jako fazà zwiàzanà (d∏ugoÊç 25 cm, Êrednica wewn´trzna 4 mm), d) kolumn´ wst´pnà wype∏nionà tà samà fazà, e) izolacj´ prekolumny i kolumny analitycznej, umo˝liwiajàcà utrzymanie ich w odpowiedniej temperaturze (30 °C), f) regulacj´ przep∏ywu fazy ruchomej na 1 ml/minut´, g) rejestrator oraz ewentualnie integrator; 2) urzàdzenie do filtracji membranowej (0,45 µm). Odczynniki: 1) woda redestylowana; 2) acetonitryl (CH3CN) do HPLC; 3) faza ruchoma: acetonitryl : woda w proporcji 80:20, poddane uprzednio filtracji membranowej (filtr 0,45 µm). Faz´ ruchomà odgazowuje si´ przed u˝yciem; 4) roztwór wzorcowy: wodny roztwór sacharozy o st´˝eniu 1,2 g/l, przesàczony przez filtr membranowy 0,45 µm. Wykonanie oznaczania W celu przygotowania próbki wina i moszcze przesàcza si´ przez filtr membranowy 0,45 µm. Oznaczanie chromatograficzne wykonuje si´, nastrzykujàc na kolumn´ chromatografu kolejno 10 µl roztworu wzorcowego i 10 µl próbki. Zabieg ten powtarza si´ i rejestruje si´ chromatogram. Czas retencji sacharozy wynosi oko∏o 10 minut. Obliczanie wyniku oznaczania Sacharoza i fruktoza sà widoczne w postaci ciemnoniebieskiej plamy na bia∏ym tle, a glukoza — w postaci plamy zielonej o mniej intensywnym zabarwieniu. Do obliczeƒ stosuje si´ Êrednià obliczonà z dwóch oznaczeƒ wykonanych dla roztworu wzorcowego i dla próbki. W przypadku win i moszczy wynik oznaczania jest zarazem zawartoÊcià sacharozy. METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Wyra˝anie wyniku Sacharoz´ rozdziela si´ w kolumnie z zastosowaniem wype∏nienia na bazie krzemionki z alkiloaminà ja- ZawartoÊç sacharozy w winach, moszczach podaje si´ w g/l wina lub moszczu z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8333 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 7 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI GLUKOZY I FRUKTOZY Glukoza i fruktoza sà oznaczane indywidualnie metodà enzymatycznà, jedynie w celu obliczenia stosunku glukozy do fruktozy. Oznaczanie to polega na poddaniu tych cukrów fosforylacji za pomocà adenozynotrójfosforanu (ATP) w wyniku reakcji enzymatycznej katalizowanej przez heksokinaz´ (HK), podczas której powstajà glukozo-6-fosforan (G6P) i fruktozo-6-fosforan (F6P). HK glukoza + ATP <————> G6P + ADP HK fruktoza + ATP <————> F6P + ADP Glukozo-6-fosforan jest poczàtkowo utleniany do 6-fosforanu glukonianu za pomocà fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w obecnoÊci enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (G6PDH). IloÊç powstajàcego zredukowanego fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) odpowiada iloÊci glukozo-6-fosforanu, a przez to iloÊci glukozy. G6PDH G6P + NADP+ <————> glukozo-6-fosforan + + NADPH + H+ Zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego jest oznaczany przez pomiar absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm. Na koniec reakcji fruktozo-6-fosforan przeprowadzany jest w glukozo-6-fosforan za pomocà izomerazy glukofosforanowej (PGI): PGI F6P <————> G6P Glukozo-6-fosforan reaguje z kolei z fosforanem dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego, dajàc 6-fosforan glukonianu i zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego; ten ostatni zwiàzek jest oznaczany iloÊciowo. 1. APARATURA I SPRZ¢T Do oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy stosuje si´ nast´pujàcy sprz´t laboratoryjny: 1) spektrofotometr umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 340 nm. Je˝eli opisany aparat nie jest dost´pny, mo˝na równie˝ wykorzystaç spektrofotometr ze êród∏em Êwiat∏a o nieciàg∏ym widmie, umo˝liwiajàcy pomiar przy d∏ugoÊci fali 334 lub 365 nm; 2) kuwety szklane o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm lub kuwety jednorazowego u˝ytku; 3) pipety do odmierzania roztworów do testów enzymatycznych o pojemnoÊci 0,02; 0,05; 0,1 i 0,2 ml. 2. ODCZYNNIKI 1) Roztwór 1: roztwór buforowy (0,3-molowa trójetanoloamina, pH 7,6, 4 x 10-3 M w Mg2+), który otrzymuje si´ przez rozpuszczenie 11,2 g chlorowodorku trójetanoloaminy [(C2H5)3N • HCl] i 0,2 g siarczanu magnezu MgSO4 • 7H2O w 150 ml wody redestylowanej i dodanie oko∏o 4 ml 5-molowego roztworu wodorotlenku sodu (NaOH) do uzyskania wartoÊci pH 7,6 oraz uzupe∏nienie wodà do 200 ml. Roztwór buforowy mo˝na przechowywaç w temperaturze 4 °C przez cztery tygodnie; 2) Roztwór 2: roztwór fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (oko∏o 11,5 x 10-3 M), który uzyskuje si´ przez rozpuszczenie 50 mg fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w 5 ml wody redestylowanej. Roztwór ten mo˝e byç przechowywany w temperaturze 4 °C przez cztery tygodnie; 3) Roztwór 3: trójfosforanu dwusodowego adenozyny (oko∏o 81 x 10-3 M), który uzyskuje si´ przez rozpuszczenie 250 mg 5’-trójfosforanu dwusodowego adenozyny i 250 mg wodorow´glanu sodu (NaHCO3) w 5 ml wody redestylowanej. Roztwór ten mo˝e byç przechowywany w temperaturze 4 °C przez cztery tygodnie; 4) Roztwór 4: heksokinaza/dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu, który uzyskuje si´ przez zmieszanie 0,5 ml roztworu heksokinazy (2 mg bia∏ka/ml lub 280 U/ml) z 0,5 ml roztworu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (1 mg bia∏ka/ml). Roztwór ten mo˝e byç przechowywany w temperaturze oko∏o +4 °C przez rok; 5) Roztwór 5: izomeraza fosforoglukozowa (2 mg bia∏ka/ml lub 700 U/ml), który stosuje si´ bez rozcieƒczania. Roztwór ten mo˝e byç przechowywany w temperaturze oko∏o 4 °C przez rok. Roztwory przed przystàpieniem do wykonania oznaczania sprowadza si´ do temperatury 20 °C. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8334 — Poz. 1173 3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY Zale˝nie od spodziewanej ∏àcznej iloÊci glukozy i fruktozy w 1 litrze próbk´ rozcieƒcza si´, stosujàc: Pomiar przy 340 lub 334 nm Pomiar przy 365 nm Rozcieƒczanie wodà Wspó∏czynnik rozcieƒczenia F do 0,4 g/l 0,8 g/l — — do 4,0 g/l 8,0 g/l 1+ 9 10 do 10,0 g/l 20,0 g/l 1 + 24 25 do 20,0 g/l 40,0 g/l 1 + 49 50 do 40,0 g/l 80,0 g/l 1 + 99 100 Powy˝ej 40,0 g/l 80,0 g/l 1 + 999 1000 4. WYKONANIE OZNACZANIA 1) glukozy: ∆AG = (A2 — A1)S – (A3 — A2)R; D∏ugoÊç fali w spektrofotometrze ustawia si´ na 340 nm i przeprowadza pomiar w stosunku do powietrza (bez kuwety na drodze optycznej) lub w stosunku do wody jako odnoÊnika. 2) fruktozy: ∆AF = (A2 — A1)S – (A3 — A2)R. Pomiaru dokonuje si´ w temperaturze od 20 do 25 °C. Do kuwet o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm nalewa si´: Kuweta Kuweta odniesienia z próbkà Roztwór 1 2,50 ml 2,50 ml Roztwór 2 0,10 ml 0,10 ml Roztwór 3 0,10 ml 0,10 ml Badana próbka 0,20 ml Woda redestylowana 0,20 ml Przygotowuje si´ tak˝e: Roztwór 4 Roztwór 5 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml Roztwory 1, 2 i 3 miesza si´. Po oko∏o 3 minutach odczytuje ich absorbancj´ (A1) i zapoczàtkowuje si´ reakcj´ enzymatycznà przez dodanie Roztworu 4. Ca∏oÊç miesza si´, a nast´pnie po up∏ywie 15 minut odczytuje si´ absorbancj´ (A2). Po nast´pnych 2 minutach sprawdza si´, czy reakcja ju˝ ca∏kowicie usta∏a. Wówczas dodaje si´ Roztwór 5. Ponownie ca∏oÊç miesza si´ i po up∏ywie 10 minut odczytuje si´ absorbancj´ (A3). Po kolejnych 2 minutach sprawdza si´, czy reakcja usta∏a. Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej mo˝e byç ró˝ny dla poszczególnych serii oznaczeƒ, podany czas nale˝y traktowaç jako czas przyk∏adowy trwania reakcji dla ka˝dej z serii. Obliczanie zawartoÊci glukozy i fruktozy (C) wykonuje si´ wed∏ug wzoru: V·M C (g/l) = ——————— ∆A, ε · d · v · 1000 gdzie: V — oznacza obj´toÊç roztworu wzorcowego (ml), v — oznacza obj´toÊç badanej próbki (ml), M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji, d — oznacza gruboÊç warstwy kuwety o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm, ε — jest wspó∏czynnikiem absorbancji NADPH (przy 340 nm = 6,3 mmol–1 x 1 cm–1). Dla oznaczania glukozy V = 2,92, a dla oznaczania fruktozy V = 2,94 v = 0,20 ml M = 180 d=1 Wykorzystujàc dane, otrzymuje si´ dla: 1) glukozy C(g/l) = 0,417 ∆AG; 2) fruktozy C(g/l) = 0,420 ∆AF. Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia. 5. OBLICZANIE WYNIKÓW OZNACZANIA Je˝eli pomiar by∏ wykonywany przy d∏ugoÊci fali 334 lub 365 nm, uzyskuje si´ nast´pujàce pomiary: Po zakoƒczeniu analizy oblicza si´ ró˝nice absorbancji dla kuwet z próbkà odniesienia i próbkà badanà: 1) przy d∏ugoÊci fali 334 nm ε = 6,2 (mmola–1 x 1 cm–1) 1) odpowiadajàcà zawartoÊci glukozy A2 — A1; 2) odpowiadajàcà zawartoÊci fruktozy A3 — A2. Oblicza si´ ró˝nic´ absorbancji dla kuwety z próbkà odniesienia (∆AR) i kuwety z badanà próbkà (∆AS), otrzymujàc wartoÊci dla: dla glukozy — C(g/l) = 0,425 ∆ΑG, dla fruktozy — C(g/l) = 0,428 ∆AF; 2) przy d∏ugoÊci fali 365 nm ε = 3,4 (mmola–1 x 1 cm–1) dla glukozy — C(g/l) = 0,773 ∆AG, dla fruktozy — C(g/l) = 0,778 ∆AF. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8335 — Poz. 1173 6. POWTARZALNOÂå METODY 7. ODTWARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu. OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu. W przypadku oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy powtarzalnoÊç (r) wynosi: W przypadku oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy odtwarzalnoÊç (R) wynosi: r = 0,056 xi, R = 0,12 + 0,076 xi, gdzie xi = zawartoÊç glukozy lub fruktozy w g/l. gdzie xi = zawartoÊç glukozy lub fruktozy w g/l. Za∏àcznik nr 8 WYKRYWANIE WZBOGACANIA MOSZCZY GRONOWYCH, ZAG¢SZCZONYCH MOSZCZY GRONOWYCH I WIN METODÑ MAGNETYCZNEGO REZONANSU JÑDROWEGO DEUTERU (SNIF-NMR/RMN-FINS) Deuter wyst´pujàcy w cukrach i w wodzie moszczy gronowych po fermentacji znajduje si´ w winie w czàsteczkach zwiàzków oznaczonych jako zwiàzki chemiczne: I. CH2D CH2OH II. CH3 CHD OH III. CH3 CH2 OD IV. HOD Dodatek egzogennego cukru podczas dos∏adzania na sucho przed fermentacjà moszczu wp∏ywa na rozk∏ad deuteru w czàsteczkach tych zwiàzków. gdzie: D H R (D/H)I R = 2(D/H)II/(D/H)I wyra˝a wzgl´dny rozk∏ad deuteru w czàsteczkach zwiàzku chemicznego I i II i jest bezpoÊrednio mierzony na podstawie nat´˝enia (h) sygna∏u, stàd R wynosi 3hII/hI. — oznacza deuter, — oznacza wodór, — oznacza wzgl´dny rozk∏ad deuteru, — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach zwiàzku chemicznego I, (D/H)II — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach zwiàzku chemicznego II, o (D/H) w — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach wody w winie. W porównaniu z wartoÊcià parametrów dla naturalnego wina kontrolnego z tego samego regionu wzbogacanie egzogennym cukrem b´dzie powodowa∏o nast´pujàce zmiany: Parametr (D/H)I charakteryzuje g∏ównie roÊliny, które syntetyzujà cukier, w mniejszym stopniu po∏o˝enie geograficzne miejsca uprawy (rodzaj wody wykorzystywanej w fotosyntezie). Parametr (D/H)II charakteryzuje warunki klimatyczne miejsca uprawy winogron (rodzaj wody deszczowej Dziennik Ustaw Nr 126 — 8336 — i warunki pogodowe) oraz, w mniejszym stopniu, zawartoÊç cukru w wyjÊciowym moszczu. Parametr (D/H)ow charakteryzuje warunki klimatyczne miejsca uprawy i zawartoÊç cukru w moszczu. Poz. 1173 Odczynniki Stosuje si´ odczynniki do oznaczania zawartoÊci wody metodà Karla-Fischera. Wykonanie oznaczania Zdefiniowane parametry [R, (D/H)I oraz (D/H)II] sà oznaczane metodà magnetycznego rezonansu jàdrowego deuteru w etanolu wydzielonym z wina lub z produktów fermentacji moszczu, moszczu zag´szczonego uzyskanego w okreÊlonych warunkach; parametry te mogà byç uzupe∏nione przez oznaczanie stosunku izotopów w wodzie wydzielonej z wina, (D/H)ow oraz przez oznaczanie stosunku izotopów 13C/12C w etanolu. 1. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY Wydzielanie etanolu i wody z wina Do wydzielania etanolu i wody z wina dopuszcza si´ zastosowanie dowolnej metody wydzielania etanolu, pod warunkiem ˝e metoda taka zapewnia w destylacie, zawierajàcym 92 do 93 % % wagowo etanolu (95 % obj.), uzyskanie odzysku od 98 do 98,5 % ca∏kowitej zawartoÊci etanolu w winie. Aparatura i sprz´t Aparat destylacyjny do wydzielania etanolu, przedstawiony na schemacie, sk∏ada si´ z: 1) elektrycznego p∏aszcza grzejnego z transformatorem; 2) kolby okràg∏odennej o pojemnoÊci 1 litra, ze szlifem; 3) kolumny Cadiota z obracajàcym si´ pierÊcieniem (cz´Êci ruchome wykonane z teflonu); W badanej próbce wina oznacza si´ zawartoÊç etanolu (p) z dok∏adnoÊcià co najmniej 0,05 % obj. zgodnie z metodà opisanà w za∏àczniku nr 3. Nast´pnie 500 ml jednorodnej próbki wina o zawartoÊci alkoholu (p) wprowadza si´ do kolby aparatu destylacyjnego o sta∏ej wartoÊci stopnia deflegmacji równej 0,9. Jako odbieralnik destylatu umieszcza si´ kolb´ sto˝kowà na 125 ml. Destylat zbiera si´ w iloÊci oko∏o 40 do 60 ml, przy temperaturze wrzenia mi´dzy 78,0 a 78,2 °C. Je˝eli temperatura przekroczy 78,5 °C przerywa si´ zbieranie destylatu na 5 minut. Gdy temperatura ponownie osiàgnie 78 °C, zbiera si´ ponownie destylat do osiàgni´cia temperatury 78,5 °C. CzynnoÊç t´ powtarza si´ do chwili, gdy temperatura, po przerywaniu destylacji i pracy w obiegu zamkni´tym, utrzyma si´ na sta∏ym poziomie. Ca∏kowita destylacja trwa oko∏o 5 godzin. Metoda ta pozwala na odzyskanie w destylacie od 98 do 98,5 % ca∏oÊci zawartego w winie alkoholu, przy czym zawartoÊç alkoholu w destylacie wynosi od 92 do 93 % wagowo (95 % obj.) i jest to st´˝enie, dla którego ustalono warunki NMR. Nast´pnie wa˝y si´ zebrany destylat, po czym 60 ml jednorodnej próbki pozosta∏oÊci po destylacji, odpowiadajàcej wodzie zawartej w winie, przenosi si´ do kolby na 60 ml. W próbce tej mo˝na oznaczyç stosunek izotopów. 4) kolby sto˝kowej na 125 ml, ze szlifem; Je˝eli do oznaczania stosuje si´ spektrometr wyposa˝ony w próbnik o Êrednicy 10 mm, do oznaczenia wystarczy jednorodna próbka wina o obj´toÊci 300 ml. 5) butelek o pojemnoÊci 125 i 60 ml, z korkami z tworzywa sztucznego. ZawartoÊç wody (p’) w gramach oznacza si´ metodà Karla-Fischera. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8337 — Poz. 1173 Schemat aparatu destylacyjnego do wydzielania etanolu ZawartoÊç alkoholu (tDm) w % wagowych oblicza si´ wed∏ug wzoru: p—p’ tDm = ——— x 100. p Fermentacja moszczy i moszczy zag´szczonych Odczynniki: 1) kwas winowy; 2) DIFCO — dro˝d˝e bez aminokwasów (Bacto Yeast Nitrogen Base); 3) aktywne suszone dro˝d˝e (Saccharomyces cerevisiae), przy czym je˝eli znany jest stosunek izotopów w moszczu, dro˝d˝e suszone przed u˝yciem mogà byç uaktywniane przez 15 minut w minimalnej iloÊci letniej niedestylowanej wody, aby stosunek izotopów by∏ podobny do stosunku izotopów w moszczu. Je˝eli stosunek izotopów w moszczu nie jest znany, lepiej u˝yç Êwie˝ych dro˝d˝y. Aparatura Naczynie fermentacyjne o pojemnoÊci 1,5 l wyposa˝one w urzàdzenie zapewniajàce hermetyczne zamkni´cie i skraplanie par alkoholu, poniewa˝ w trakcie Dziennik Ustaw Nr 126 — 8338 — Poz. 1173 fermentacji nie mogà wystàpiç ˝adne straty etanolu. WydajnoÊç przemiany cukrów fermentujàcych w etanol powinna wynosiç ponad 98 %. 2) w przypadku zastosowania próbnika do NMR o Êrednicy 10 mm pobiera si´ 3,2 ml alkoholu i 1,3 ml TMU. Wykonanie oznaczania: Zale˝nie od rodzaju spektrometru i próbnika dodaje si´ odpowiednie iloÊci heksafluorobenzenu jako substancji stabilizujàcej cz´stotliwoÊç pola zgodnie z zamieszczonà tabelà: 1) moszcze Êwie˝e, w których uprzednio oznaczono zawartoÊç cukrów fermentujàcych — 1 litr moszczu umieszcza si´ w naczyniu fermentacyjnym. Do naczynia dodaje si´ jeden gram suchych, wczeÊniej uaktywnionych dro˝d˝y, po czym zamyka si´ szczelnie naczynie. Fermentacj´ prowadzi si´ w temperaturze oko∏o 20 °C do czasu zu˝ycia cukrów. Po oznaczeniu mocy alkoholowej w produkcie fermentacji i obliczeniu wydajnoÊci przemiany cukrów w etanol odwirowuje si´ przefermentowanà ciecz i oddestylowuje etanol; 2) moszcze z fermentacjà zatrzymanà przez dodanie dwutlenku siarki; wykonuje si´ desulfitacj´ oko∏o 1,2 litra tego moszczu przez przepuszczenie azotu przez moszcz umieszczony w ∏aêni wodnej o temperaturze 70 do 80 °C pod ch∏odnicà zwrotnà, do uzyskania zawartoÊci dwutlenku siarki mniej ni˝ 200 mg/l. Zwraca si´ uwag´, aby moszcz nie uleg∏ zag´szczeniu w wyniku odparowania wody; w tym celu stosuje si´ wydajne ch∏odzenie. Nast´pnie 1 litr desulfitowanego moszczu umieszcza si´ w naczyniu fermentacyjnym i post´puje dalej tak jak w przypadku moszczu Êwie˝ego. Je˝eli do sulfitacji moszczu u˝yto pirosiarczynu sodowego, przed desulfitacjà do moszczu dodaje si´ 0,25 ml kwasu siarkowego (o g´stoÊci ρ20 = 1,84 g/ml) na 1 g pirosiarczynu dodanego na 1 litr moszczu; 3) moszcze zag´szczone o znanej zawartoÊci cukrów w iloÊci odpowiadajàcej masie oko∏o 170 g umieszcza si´ w naczyniu fermentacyjnym. Nast´pnie uzupe∏nia si´ do 1 litra wodà o tym samym stosunku izotopów co próbki naturalnego moszczu, dodaje 1 g suchych dro˝d˝y i 3 g DIFCO, po czym dok∏adnie miesza si´ i post´puje dalej tak jak w przypadku moszczu Êwie˝ego. Przygotowanie próbki alkoholu do oznaczania metodà NMR Odczynniki: 1) N,N-czterometylomocznik (TMU) — u˝ywa si´ próbki wzorcowego TMU o podanym, kontrolowanym stosunku izotopów D/H; 2) heksafluorobenzen. Wykonanie oznaczania: 1) w przypadku zastosowania próbnika do NMR o Êrednicy 15 mm post´puje si´ w nast´pujàcy sposób — do uprzednio zwa˝onej butelki szklanej zbiera si´ 7 ml alkoholu uzyskanego podczas wydzielania etanolu z wina i wa˝y ca∏oÊç z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (mA); nast´pnie bierze si´ 3 ml próbk´ wzorca wewn´trznego (TMU) i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (mst). Ca∏oÊç miesza si´, dok∏adnie wstrzàsajàc; Spektrometr Próbnik 10 mm Próbnik 15 mm 7,05 T 9,4 T 150 µl 35 µl 200 µl 50 µl Przygotowanie próbki wody do pomiarów metodà NMR, w celu ewentualnego oznaczania w niej stosunku izotopów Odczynniki N,N-czterometylomocznik (TMU) Wykonanie oznaczania 3 ml wody uzyskanej podczas wydzielania etanolu i wody z wina lub podczas fermentacji moszczy umieszcza si´ w wytarowanej kolbie i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (m’E). Nast´pnie wprowadza si´ 4 ml wzorca wewn´trznego (TMU) i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 m (m’ST), po czym ca∏oÊç miesza si´ dok∏adnie przez wstrzàsanie. 2. WYKONANIE OZNACZANIA — REJESTROWANIE WIDM 2HNMR ALKOHOLU I WODY Oznaczanie parametrów izotopowych Aparatura i sprz´t 1) spektrometr NMR wyposa˝ony w specyficzny próbnik deuterowy dostrojony do charakterystycznej cz´stotliwoÊci V0 pola B0, posiadajàcy kana∏ odsprz´gania protonów (B2) i kana∏ stabilizacji cz´stotliwoÊci pola na cz´stotliwoÊci fluorowej. RozdzielczoÊç mierzona w widmie, transformowana bez mno˝enia wyk∏adniczego (to jest LB = 0) i wyra˝ana przez szerokoÊç po∏ówkowà sygna∏u metylowego i metylenowego etanolu oraz sygna∏u metylowego TMU, mo˝e byç wi´ksza lub równa 0,5 Hz. Czu∏oÊç mierzona ze wspó∏czynnikiem mno˝enia wyk∏adniczego LB = 2 nie mo˝e byç mniejsza od 150 dla sygna∏u metylowego etanolu w roztworze o mocy alkoholowej 95 % obj./(93,5 % wagowo). W tych warunkach przedzia∏ ufnoÊci dla pomiaru wysokoÊci sygna∏u, obliczany z prawdopodobieƒstwem 97,5 % (test jednostronny) i dla 10 powtórzeƒ widm, wynosi 0,35 %; 2) urzàdzenie do automatycznej zmiany próbek; 3) komputerowy program do obróbki danych; 4) próbówki na próbki o Êrednicy 15 lub 10 mm, zale˝ne od konstrukcji spektrometru. Dziennik Ustaw Nr 126 — 8339 — Kalibracja i sprawdzanie prawid∏owoÊci kalibracji spektrofotometru 1) przeprowadza si´ zwyk∏à kalibracj´ odnoÊnie do jednorodnoÊci i czu∏oÊci zgodnie z zaleceniami producenta; 2) sprawdza si´ prawid∏owoÊç kalibracji. U˝ywa si´ wzorcowych etanoli, oznaczonych literami C, V i B, o ró˝nym st´˝eniu izotopów, ale dok∏adnie standaryzowanych, gdzie: C — oznacza alkohol uzyskany z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej, V — oznacza alkohol uzyskany z winogron, B — oznacza alkohol uzyskany z buraków. Post´pujàc zgodnie z metodà opisanà dalej, oznacza si´ stosunek izotopów w alkoholu uzyskanym z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej (Cmeas), alkoholu uzyskanym z winogron (Vmeas) i alkoholu uzyskanym z buraków (Bmeas). WartoÊci uzyskane z oznaczania porównuje si´ z wartoÊciami podanymi dla odpowiednich wzorców — alkoholu uzyskanego z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej (CST), alkoholu uzyskanego z winogron (VST) i alkoholu uzyskanego z buraków (BST). Poz. 1173 Dla ka˝dego widma prowadzi si´ pewnà liczb´ akumulacji NS, wystarczajàcà do uzyskania stosunku sygna∏u do szumu. Powtarza si´ te akumulacje NE = 10 razy. WartoÊci NS zale˝à od rodzaju spektrometru i u˝ywanego próbnika. 3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA Etanol Dla ka˝dego z 10 uzyskanych widm wyznacza si´: 3hII wysokoÊç sygna∏u II (CH3CHD OH) 1) R = —— = 3 x —————————————————; hI wysokoÊç sygna∏u I (CH2D CH2OH) mst (D/H)st 2) (D/H)I = 1,5866 x TI x —— x ———— ; mA tDm mst (D/H)st 3) (D/H)II = 2,3799 x TII —— x ———— mA t Dm przy czym: wysokoÊç sygna∏u I (CH2DCH2OH) a) TI = —————————————————————— , wysokoÊç sygna∏u wzorca wewn´trznego (TM …