Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 12 maja 2003 r. w sprawie metod analiz wyrobów winiarskich do celów urzędowej kontroli pod względem jakości handlowej

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8306 — Poz. 1172 i 1173 34. Namibia 35. Norwegia 36. Republika Po∏udniowej Afryki 37. Republika Ârodkowoafrykaƒska 38. Rzeczpospolita Polska 39. Federacja Rosyjska 40. Sierra Leone 41. S∏owenia 42. Sri Lanka 43. Stany Zjednoczone Ameryki 44. Suazi 45. Szwajcaria 46. Tajlandia 47. Tanzania 48. Togo 49. Tunezja 50. Turcja 51. Ukraina 52. kraje cz∏onkowskie Unii Europejskiej 53. Wenezuela 54. W´gry 55. Wietnam 56. Wybrze˝e KoÊci S∏oniowej 57. Zimbabwe 58. Zjednoczone Emiraty Arabskie 9. Chiƒska Republika Ludowa 10. Cypr 11. Republika Czeska 12. Filipiny 13. Gabon 14. Ghana 15. Gujana 16. Gwinea 17. Indie 18. Izrael 19. Japonia 20. Kamerun 21. Kanada 22. Demokratyczna Republika Konga 23. Republika Konga 24. Koreaƒska Republika Ludowo-Demokratyczna 25. Republika Korei 26. Laos 27. Lesotho 28. Liban 29. Malezja 30. Mali 31. Malta 32. Mauritius 33. Meksyk 1173 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1) z dnia 12 maja 2003 r. w sprawie metod analiz wyrobów winiarskich do celów urz´dowej kontroli pod wzgl´dem jakoÊci handlowej Na podstawie art. 29 pkt 2 ustawy z dnia 25 lipca 2001 r. o wyrobie i rozlewie wyrobów winiarskich oraz obrocie tymi wyrobami (Dz. U. Nr 128, poz. 1401) zarzàdza si´, co nast´puje:

§ 1Analiz´ aromatyzowanych napojów winiarskich i wyrobów winiarskich gronowych pod wzgl´dem jakoÊci handlowej przeprowadza si´, stosujàc nie

mniej ni˝ jednà z nast´pujàcych metod do:

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8307 — Poz. 1173

§ 2Analiz´ fermentowanych napojów winiarskich

pod wzgl´dem jakoÊci handlowej przeprowadza si´, stosujàc co najmniej jednà z nast´pujàcych metod:

§ 3Analiz´ wyrobów winiarskich pod wzgl´dem

jakoÊci handlowej mo˝na przeprowadzaç metodami innymi ni˝ okreÊlone w rozporzàdzeniu, je˝eli stosowanie innych metod zapewnia porównywalnà powtarzalnoÊç i odtwarzalnoÊç wyników, z tym ˝e uznaje si´ za ostateczny wynik analizy przeprowadzonej metodà okreÊlonà w rozporzàdzeniu.

§ 4Przepisy § 1 tracà moc z dniem uzyskania przez

Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii Europejskiej.

§ 5Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie po up∏ywie

14 dni od dnia og∏oszenia.

Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: A. Taƒski Dziennik Ustaw Nr 126 — 8308 — Poz. 1173 Za∏àczniki do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 12 maja 2003 r. (poz. 1173) Za∏àcznik nr 1 OZNACZANIE G¢STOÂCI I CI¢˚ARU W¸AÂCIWEGO W TEMPERATURZE 20 °C G´stoÊç jest stosunkiem masy okreÊlonej obj´toÊci wina lub moszczu w temperaturze 20 °C do tej obj´toÊci, wyra˝anym w g/ml, oznaczanym symbolem ρ 20.

Ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C (lub g´stoÊç wzgl´dna) jest stosunkiem, wyra˝onym liczbà dziesi´tnà, g´stoÊci wina lub moszczu w temperaturze 20 °C do g´stoÊci wody w tej samej temperaturze, oznaczanym symbolem d2020.

Do analiz stosuje si´ piknometr, który posiada bocznà rurk´ o d∏ugoÊci 25 mm o Êrednicy nieprzekraczajàcej 1 mm, zakoƒczonà sto˝kowym szlifem lub zamkni´tà korkiem zbiornikowym, który sk∏ada si´ z rurki ze sto˝kowym szlifem, wyd∏u˝onej cz´Êci na koƒcu i komory w Êrodkowej cz´Êci.

G´stoÊç i ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C w badanej próbce oznaczane sà metodà piknometrycznà.

JeÊli próbka zawiera znaczne iloÊci dwutlenku w´gla, usuwa si´ nadmiar tego dwutlenku w´gla przez mieszanie 250 ml wina w litrowej kolbie lub przez wykonanie filtracji pod zmniejszonym ciÊnieniem.

Schemat piknometru i butelki tarowej

Metoda oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C z zastosowaniem wagi dwuszalkowej Butelk´ tarowà stawia si´ na lewej szalce wagi, natomiast czysty i suchy piknometr, zamkni´ty „korkiem zbiornikowym”, stawia si´ na prawej szalce wagi. Na szalce z piknometrem umieszcza si´ odwa˝niki w liczbie potrzebnej do uzyskania równowagi. Nast´pnie zapisuje si´ ∏àcznà mas´ odwa˝ników w gramach, oznaczanà dalej literà „ρ”.

Piknometr nape∏nia si´ wodà destylowanà o temperaturze pokojowej, wk∏ada si´ do niego termometr.

Ostro˝nie wyciera si´ piknometr, a nast´pnie umieszcza go w termicznie izolowanym pojemniku. Pojemnik z piknometrem odwraca si´ parokrotnie w celu wyrównania temperatury. Po osiàgni´ciu wyrównanej sta∏ej temperatury uzupe∏nia si´ poziom wody w piknometrze do poziomu górnej kraw´dzi bocznej rurki.

Wyciera si´ do sucha Êcianki rurki, wk∏ada „korek zbiornikowy” i dok∏adnie odczytuje wskazanie temperatury t °C.

Nape∏niony wodà piknometr umieszcza si´ na prawej szalce wagi, a butelk´ tarowà na lewej. Na szalk´ z piknometrem nape∏nionym wodà dok∏ada si´ odwa˝niki w liczbie potrzebnej do uzyskania równowagi, nast´pnie zapisuje si´ ich ∏àcznà mas´ ρ’ w gramach.

Obliczanie wyniku oznaczania:

V20 = (ρ + m — ρ’) x F, butelka tarowa piknometr gdzie F jest wspó∏czynnikiem odczytanym z tabeli nr I za∏àcznika, dla temperatury t °C;

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8309 —

Poz. 1173 gdzie liczba 0,998203 jest g´stoÊcià wody w temperaturze 20 °C. w dalszej cz´Êci dokumentu, zgodnie z rodzajem badanej cieczy: wino o zawartoÊci cukrów mniejszej ni˝ 33 g/l (tabela nr II), naturalny lub zag´szczony moszcz (tabela nr III), wino o zawartoÊci cukrów powy˝ej 33 g/l (tabela nr IV);

Metoda oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C z zastosowaniem wagi jednoszalkowej

M20 = 0,998203 V20, W metodzie z zastosowaniem wagi jednoszalkowej oznacza si´:

W metodzie z wykorzystaniem wagi jednoszalkowej oznacza si´:

Obliczanie wyniku oznaczania:

Metoda z wykorzystaniem wagi jednoszalkowej temperaturze V20 = [P — (P — m)] x F, gdzie F = wspó∏czynnik odczytany z tabeli nr I za∏àcznika dla temperatury t °C.

Obj´toÊç piknometru podaje si´ z dok∏adnoÊcià do ±0,001 ml;

M20 = 0,998203 V20, gdzie 0,998203 jest g´stoÊcià wody w temperaturze 20 °C.

P2 — (P — m + dT) ρt = —————————— ;

V20

Metoda z wykorzystaniem wagi dwuszalkowej

Piknometr nape∏nia si´ przygotowanà próbkà i przeprowadza post´powanie analogicznie jak w przypadku nape∏nienia wodà destylowanà.

Dla uzyskania bardzo dok∏adnych oznaczeƒ wynik pomiaru g´stoÊci koryguje si´, uwzgl´dniajàc wp∏yw dwutlenku siarki, zgodnie z wzorem:

V20

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8310 — W przypadku oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C powtarzalnoÊç (r) wynosi:

Poz. 1173 ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.

W przypadku oznaczania g´stoÊci i ci´˝aru w∏aÊciwego w temperaturze 20 °C odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

R = 0,00037;

OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna

R = 0,00045.

TABELA nr I WartoÊci wspó∏czynnika F do obliczenia obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie:

Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika F pomno˝one przez mas´ wody o temperaturze t °C zawartej w piknometrze ze szk∏a typu Pyrex stosuje si´ do obliczenia obj´toÊci piknometru w temperaturze 20 °C.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8311 — Poz. 1173 TABELA nr II WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l, pozbawionych alkoholu, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie:

Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” stosuje si´ do obliczania g´stoÊci win o zawartoÊci cukrów ni˝szej od 33 g/l, pozbawionych alkoholu, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C wed∏ug nast´pujàcego wzoru: c ρ20 = ρt ± ——— 1000 — je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C + je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C WartoÊci podane w tabeli majà tak˝e zastosowanie do przeliczania ci´˝aru w∏aÊciwego d t20 na ci´˝ar w∏aÊciwy d 2020.

TABELA nr III WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci naturalnych i zag´szczonych moszczy, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie:

WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” podane w tabeli stosuje si´ obliczania g´stoÊci naturalnych i zag´szczonych moszczy, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C wed∏ug nast´pujàcego wzoru: c ρ20 = ρt ± ——— 1000 — je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C + je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C WartoÊci podane w tabeli majà tak˝e zastosowanie do przeliczania ci´˝aru w∏aÊciwego d t20 na ci´˝ar w∏aÊciwy d 2020.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8312 — Poz. 1173 TABELA nr IV WartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” majàce zastosowanie do obliczania g´stoÊci win o st´˝eniu alkoholu nie mniejszym ni˝ 13 % obj., zawierajàcych pozosta∏oÊci cukrów, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu wyra˝enia wyniku w temperaturze 20 °C ObjaÊnienie:

Podane w tabeli wartoÊci wspó∏czynnika korekcji temperatury „C” stosuje si´ do obliczania g´stoÊci win o st´˝eniu alkoholu nie mniejszym ni˝ 13 % obj., zawierajàcych pozosta∏oÊci cukrów, mierzonej przy u˝yciu piknometru ze szk∏a typu Pyrex w temperaturze t °C w celu sprowadzenia wyniku do temperatury 20 °C, wed∏ug nast´pujàcego wzoru: c ρ20 = ρt ± ——— 1000 — je˝eli temperatura t °C jest ni˝sza od 20 °C + je˝eli temperatura t °C jest wy˝sza od 20 °C Dziennik Ustaw Nr 126 — 8313 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 2 REFRAKTOMETRYCZNE OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CUKRÓW W MOSZCZACH GRONOWYCH I ZAG¢SZCZONYCH MOSZCZACH GRONOWYCH Oznaczanie zawartoÊci cukrów w moszczach gronowych, zag´szczonych moszczach gronowych polega na obliczeniu ich zawartoÊci w g/l lub w g/kg na podstawie:

Dodatkowo ustala si´ wartoÊç temperatury t °C.

Oznaczanie wykonuje si´ w dwóch powtórzeniach.

Przygotowanie moszczu lub moszczu zag´szczonego wykonuje si´, przesàczajàc go przez suchà gaz´ z∏o˝onà czterokrotnie, przy czym pierwsze krople przesàczu odrzuca si´.

Do oznaczania zawartoÊci cukrów stosuje si´ refraktometr wyposa˝ony w termometr ze skalà o zakresie co najmniej od +15 °C do +25 °C oraz w urzàdzenie do cyrkulacji wody umo˝liwiajàce dokonywanie pomiarów w temperaturze 20±5 °C.

ZawartoÊç sacharozy odczytuje si´ w % wagowych W przypadku zastosowania refraktometru wyskalowanego w wartoÊciach wspó∏czynnika refrakcji do odczytania odpowiedniej wartoÊci zawartoÊci sacharozy w % wagowych w temperaturze t °C w tabeli nr II za∏àcznika odczytuje si´ zawartoÊç sacharozy odpowiadajàcà zmierzonej wartoÊci wspó∏czynnika refrakcji. Ustalanà w ten sposób zawartoÊç sacharozy koryguje si´ za pomocà danych podanych w tabeli nr I za∏àcznika.

ZawartoÊç sacharozy w moszczach i moszczach zag´szczonych w % wagowych w temperaturze 20 °C odnajduje si´ w tabeli nr II za∏àcznika i odczytuje odpowiednià zawartoÊç sacharozy w g/l i g/kg. ZawartoÊç cukrów jest wyra˝ana w przeliczeniu na cukier inwertowany z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.

Przy ustalaniu wspó∏czynnika refrakcji moszczu lub moszczu zag´szczonego zawartoÊç sacharozy w temperaturze 20 °C odnajduje si´ w tabeli nr II i odczytuje odpowiednià wartoÊç wspó∏czynnika refrakcji w temperaturze 20 °C. Wspó∏czynnik ten podany jest z dok∏adnoÊcià do czwartego miejsca po przecinku.

TABELA nr I WartoÊci poprawek majàce zastosowanie, gdy oznaczanie zawartoÊci sacharozy w procentach masowych zosta∏o wykonane w temperaturze ró˝nej od 20 °C ObjaÊnienie:

Podane w tabeli poprawki majà zastosowanie w przypadku dokonania oznaczania zawartoÊci sacharozy w procentach masowych przy temperaturze ró˝nej od 20 °C.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8314 — Poz. 1173 TABELA nr II ZawartoÊç cukrów w moszczu gronowym i zag´szczonym moszczu gronowym w g/l i g/kg, oznaczona za pomocà refraktometru wyskalowanego w % wag. sacharozy w temperaturze 20 °C lub w wartoÊci wspó∏czynnika refrakcji w temperaturze 20 °C, przeliczona na cukier inwertowany Dziennik Ustaw Nr 126 — 8315 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8316 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8317 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8318 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8319 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8320 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8321 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8322 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8323 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8324 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8325 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8326 — Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8327 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 3 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI ALKOHOLU W PROCENTACH OBJ¢TOÂCIOWYCH 1. APARATURA I SPRZ¢T Destylat zbiera si´ w tej samej 200 ml kolbie miarowej u˝ywanej do odmierzania wina. Destylat zbiera si´ w iloÊci oko∏o 3/4 wyjÊciowej obj´toÊci wina w przypadku destylacji bez pary wodnej i 198 do 199 ml destylatu w przypadku destylacji z parà wodnà. Nast´pnie destylat uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do 200 ml, przy czym temperatura destylatu nie mo˝e odbiegaç od temperatury poczàtkowej o wi´cej ni˝ ±2 °C.

Do oznaczania zawartoÊci alkoholu stosuje si´ sprz´t laboratoryjny, w szczególnoÊci:

Bardzo ostro˝nie miesza si´ destylat w kolbie kolistymi ruchami.

Oznaczanie zawartoÊci alkoholu w procentach obj´toÊciowych (% obj.) polega na wykonaniu destylacji wina, uprzednio zalkalizowanego za pomocà zawiesiny wodorotlenku wapnia, i piknometrycznym oznaczeniu g´stoÊci destylatu. ZawartoÊci alkoholu odczytuje si´ z tabel alkoholometrycznych.

Dopuszcza si´ u˝ycie dowolnego typu aparatu do destylacji bez pary wodnej lub z parà wodnà, o ile spe∏ni wymagania testu, w którym przeprowadza si´ pi´ç kolejnych destylacji mieszaniny alkoholowo-wodnej o zawartoÊci alkoholu 10 % obj., przy czym zawartoÊç alkoholu w destylacie po pi´ciu destylacjach powinna wynosiç co najmniej 9,9 % obj., a straty alkoholu w ka˝dej destylacji nie mogà przekraczaç 0,02 % obj.

Nast´pnie za pomocà kolby miarowej odmierza si´ 200 ml wina, które przenosi si´ nast´pnie do kolby destylacyjnej. Kolb´ miarowà przemywa si´ czterokrotnie 5 ml porcjami wody, zlewajàc jà do kolby destylacyjnej lub do przewodu pary. Do kolby destylacyjnej wprowadza si´ przewód pary zestawu do destylacji z parà wodnà. Nast´pnie dodaje si´ 10 ml zawiesiny wodorotlenku wapnia i kilka od∏amków oboj´tnego materia∏u porowatego takiego jak pumeks.

W przypadku oznaczania zawartoÊci alkoholu powtarzalnoÊç (r) wynosi: r = 0,10 % obj.

W przypadku oznaczania zawartoÊci alkoholu odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

R = 0,19 % obj.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8328 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 4 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI EKSTRAKTU CA¸KOWITEGO (suchej masy ogó∏em) Ekstrakt ca∏kowity (sucha masa ogó∏em) jest to zawartoÊç wszystkich substancji nielotnych.

Ekstrakt bezcukrowy jest to ró˝nica pomi´dzy ekstraktem ca∏kowitym a zawartoÊcià cukrów ogó∏em.

Ekstrakt zredukowany jest to ró˝nica mi´dzy ekstraktem ca∏kowitym a zawartoÊcià cukrów ogó∏em w iloÊci powy˝ej 1 g/l, zawartoÊcià siarczanu potasowego w iloÊci powy˝ej 1 g/l, zawartoÊcià mannitolu i zawartoÊcià innych substancji chemicznych, które mogà byç dodawane do wina.

Ekstrakt resztkowy jest to ekstrakt bezcukrowy pomniejszony o kwasowoÊç zwiàzanà w przeliczeniu na kwas winowy.

ZawartoÊç ekstraktu wyra˝a si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do ±0,5 g.

ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego wyra˝ana jest przez iloÊç sacharozy, która rozpuszczona w wodzie i sprowadzona do obj´toÊci 1 litra da roztwór o ci´˝arze w∏aÊciwym takim jak moszcz lub wino pozbawione alkoholu. IloÊci te sà podane w tabeli za∏àcznika. dv d1 = dv – da + 1,000, — oznacza ci´˝ar w∏aÊciwy wina w temperaturze 20 °C (z poprawkà na kwasowoÊç lotnà), dv = d2020 — 0,0000086 kwasowoÊci lotnej wyra˝onej w miligramorównowa˝nikach na litr, da — oznacza ci´˝ar w∏aÊciwy w temperaturze 20 °C mieszaniny wodno-alkoholowej o tej samej zawartoÊci alkoholu co wino. dv obliczaç mo˝na równie˝ na podstawie g´stoÊci w temperaturze 20 °C wina (ρv) i mieszaniny wodno-alkoholowej (ρa) o tej samej zawartoÊci alkoholu wed∏ug wzoru: dv = 1,0018 (ρv – ρa) + 1,000, gdzie wspó∏czynnik 1,0018 zaokràgla si´ do jednoÊci, gdy wartoÊç ρv jest mniejsza od 1,05, co ma miejsce w wi´kszoÊci przypadków.

Do obliczenia zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego w g/l na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego d1 wina pozbawionego alkoholu lub na podstawie ci´˝aru w∏aÊciwego d2020 moszczu stosuje si´ wartoÊci z tabeli za∏àcznika.

ZawartoÊç ekstraktu ca∏kowitego ustala si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8329 — TABELA Obliczanie zawartoÊci ekstraktu ca∏kowitego w g/l Poz. 1173 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8330 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 5 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CUKRÓW REDUKUJÑCYCH Cukry redukujàce sà to wszystkie cukry zawierajàce wolne grupy karbonylowe, które mogà redukowaç sole miedziowe w roztworach alkalicznych.

Metoda oznaczania cukrów redukujàcych polega na przesàczeniu zoboj´tnionego oraz pozbawionego alkoholu wina lub moszczu przez kolumn´ jonowymiennà, w której aniony analizowanej próbki sà wymieniane na jony octanowe. Przesàczonà próbk´ klaruje si´ oboj´tnym octanem o∏owiawym i tak sklarowane wino lub moszcz reaguje z okreÊlonà iloÊcià zasadowego roztworu soli miedziowej, a pozosta∏e w roztworze jony miedziowe sà oznaczane jodometrycznie.

Win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l nie rozcieƒcza si´ w trakcie klarowania, natomiast wina s∏odkie rozcieƒcza si´ w trakcie klarowania tak, aby zawartoÊç cukrów mieÊci∏a si´ w nast´pujàcych granicach:

Próbka ZawartoÊç cukrów (g/l) G´stoÊç Rozcieƒczenie (%) Moszcze i mistele Wina s∏odkie o zawartoÊci cukrów znacznie powy˝ej 33 g/l, wzmocnione lub niewzmocnione Wina o zawartoÊci cukrów nieco powy˝ej 33 g/l Wina o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l >125 >1,038 1 25 do 125 1,005 do 1,038 4 5 do 25 0,997 do 1,005 20 <5 <0,997 nierozcieƒczane Odczynniki:

Klarowanie win o zawartoÊci cukrów poni˝ej 33 g/l Do zlewki o Êrednicy od 10 do 12 cm wlewa si´ 50 ml wina, a nast´pnie dodaje si´ 1/2 (n – 0,5) ml roztworu wodorotlenku sodowego (gdzie n oznacza obj´toÊç roztworu wodorotlenku sodowego zu˝ytego do oznaczania kwasowoÊci ogólnej w 10 ml wina). Próbk´ odparowywuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej w strumieniu goràcego powietrza do otrzymania obj´toÊci oko∏o 20 ml. Nast´pnie próbk´ przesàcza si´ przez kolumn´ z ˝ywicà anionowymiennà w formie octanowej, z szybkoÊcià 3 ml na dwie minuty. Eluat zbiera si´ w kolbie miarowej na 100 ml. Naczynie i kolumn´ przemywa si´ szeÊciokrotnie porcjami wody o obj´toÊci 10 ml ka˝da.

Nast´pnie, mieszajàc ca∏y czas, do eluatu dodaje si´ 2,5 ml nasyconego roztworu octanu o∏owianego oraz 0,5 g w´glanu wapniowego. Ca∏oÊç cieczy wstrzàsa si´ kilkakrotnie i pozostawia na co najmniej 15 minut. Nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà i przesàcza si´. 1 ml przesàczu odpowiada 0,5 ml wina.

Klarowanie moszczy, misteli, win s∏odkich i pó∏s∏odkich:

Próbki przesàcza si´ przez kolumn´ anionowymiennà w formie octanowej z szybkoÊcià 3 ml na dwie minuty. Eluat zbiera si´ w kolbie miarowej na 100 ml.

Nast´pnie kolumn´ przemywa si´ wodà a˝ do uzyskania oko∏o 90 ml eluatu. Do eluatu dodaje si´ 0,5 g w´glanu wapniowego i 1 ml nasyconego roztworu octanu o∏owiawego. Ca∏oÊç miesza si´ i pozostawia na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, po czym uzupe∏nia wodà do 100 ml i przesàcza.

Tak sporzàdzony roztwór mo˝e byç stosowany nie d∏u˝ej ni˝ miesiàc od dnia sporzàdzenia. Przed u˝yciem roztwór zoboj´tnia si´ roztworem wodorotlenku sodu.

Poz. 1173 3. OBLICZANIE WYNIKU OZNACZANIA IloÊç cukrów zawarta w próbce w przeliczeniu na cukier inwertowany podana w tabeli jest funkcjà iloÊci (n’ — n) ml zu˝ytego tiosiarczanu sodu, gdzie n — oznacza iloÊç ml zu˝ytego tiosiarczanu sodu, n’ — oznacza iloÊç ml tiosiarczanu sodu zu˝ytego w próbie Êlepej.

ZawartoÊç cukrów w winie, w przeliczeniu na cukier inwertowany, podaje si´ w g/l z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku. Uwzgl´dnia si´ rozcieƒczenie próbki powsta∏e w trakcie klarowania oraz obj´toÊç badanej próbki.

W przypadku oznaczania zawartoÊci cukrów redukujàcych powtarzalnoÊç (r) wynosi: r = 0,015 xi, gdzie xi oznacza zawartoÊç w g/l próbki. cukru inwertowanego Oznaczanie 5. ODTWARZALNOÂå METODY W kolbie sto˝kowej o pojemnoÊci 300 ml sporzàdza si´ mieszanin´ 25 ml zasadowego roztworu siarczanu OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejmiedzi z 15 ml wody i 10 ml sklarowanego roztworu ba- sza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna danej próbki. Do tej mieszaniny wrzuca si´ kilka ma∏ych ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami baod∏amków pumeksu. Nast´pnie na kolb´ zak∏ada si´ daƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, ch∏odnic´ zwrotnà. Roztwór podgrzewa si´ i doprowa- dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez dza do wrzenia w ciàgu 2 minut. Roztwór gotuje si´ przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.

10 minut, po czym kolb´ szybko och∏adza si´ w strumieW przypadku oznaczania zawartoÊci cukrów reduniu zimnej wody. Do och∏odzonego roztworu dodaje si´ 10 ml roztworu jodku potasu, 25 ml kwasu siarkowego kujàcych odtwarzalnoÊç (R) wynosi: oraz 2 ml roztworu skrobi. Roztwór ten miareczkuje si´ R = 0,058 xi, roztworem tiosiarczanu(VI)sodu. Dla porównania wykonuje si´ prób´ Êlepà, w której 10 ml roztworu cukru za- gdzie xi oznacza zawartoÊç cukru inwertowanego st´puje si´ 10 ml wody destylowanej. w g/l próbki.

TABELA Zale˝noÊç mi´dzy obj´toÊcià 0,1-molowego roztworu tiosiarczanu sodu (n’ — n) a iloÊcià cukrów redukujàcych w mg Na2S2O3 (ml) Cukry redukujàce (mg) Ró˝nica Na2S2O3 (ml) Cukry redukujàce (mg) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,2 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 Ró˝nica 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8332 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 6 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SACHAROZY Oznaczanie zawartoÊci sacharozy wykonuje si´ metodà chromatografii cienkowarstwowej, chromatografii cieczowej lub chromatografii gazowej. ko fazà zwiàzanà oraz z detekcjà refraktometrycznà.

Oznaczanie iloÊciowe jest wykonywane z u˝yciem wzorca zewn´trznego analizowanego w identycznych warunkach.

METODA CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ W chromatografii cienkowarstwowej sacharoz´ oddziela si´ od innych cukrów na p∏ytce pokrytej celulozà. Wywo∏ywanie chromatogramu wykonuje si´ z zastosowaniem mieszaniny mocznika i kwasu solnego, w temperaturze 105 °C.

Aparatura i sprz´t:

Odczynniki:

Przygotowanie próbki do analizy Silnie zabarwiony moszcz lub wino przed wykonaniem oznaczania odbarwia si´ za pomocà w´gla aktywnego.

Otrzymywanie chromatogramu Na linii równoleg∏ej do dolnej kraw´dzi p∏ytki i oddalonej od niej o 2,5 cm nanosi si´:

P∏ytk´ umieszcza si´ w komorze uprzednio nasyconej parami fazy ruchomej. Chromatogram rozwija si´ do momentu, gdy faza ruchoma znajdzie si´ 1 cm od górnej kraw´dzi p∏ytki. P∏ytk´ wyjmuje si´ i suszy w strumieniu ciep∏ego powietrza. Rozwijanie chromatogramu powtarza si´ dwukrotnie. Po rozwini´ciu chromatogramu p∏ytk´ spryskuje si´ równomiernie 15 ml odczynnika barwiàcego i umieszcza w suszarce o temperaturze 105 °C na oko∏o 5 minut.

Aparatura i sprz´t:

Odczynniki:

Wykonanie oznaczania W celu przygotowania próbki wina i moszcze przesàcza si´ przez filtr membranowy 0,45 µm.

Oznaczanie chromatograficzne wykonuje si´, nastrzykujàc na kolumn´ chromatografu kolejno 10 µl roztworu wzorcowego i 10 µl próbki. Zabieg ten powtarza si´ i rejestruje si´ chromatogram. Czas retencji sacharozy wynosi oko∏o 10 minut.

Obliczanie wyniku oznaczania Sacharoza i fruktoza sà widoczne w postaci ciemnoniebieskiej plamy na bia∏ym tle, a glukoza — w postaci plamy zielonej o mniej intensywnym zabarwieniu.

Do obliczeƒ stosuje si´ Êrednià obliczonà z dwóch oznaczeƒ wykonanych dla roztworu wzorcowego i dla próbki. W przypadku win i moszczy wynik oznaczania jest zarazem zawartoÊcià sacharozy.

METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Wyra˝anie wyniku Sacharoz´ rozdziela si´ w kolumnie z zastosowaniem wype∏nienia na bazie krzemionki z alkiloaminà ja- ZawartoÊç sacharozy w winach, moszczach podaje si´ w g/l wina lub moszczu z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8333 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 7 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI GLUKOZY I FRUKTOZY Glukoza i fruktoza sà oznaczane indywidualnie metodà enzymatycznà, jedynie w celu obliczenia stosunku glukozy do fruktozy.

Oznaczanie to polega na poddaniu tych cukrów fosforylacji za pomocà adenozynotrójfosforanu (ATP) w wyniku reakcji enzymatycznej katalizowanej przez heksokinaz´ (HK), podczas której powstajà glukozo-6-fosforan (G6P) i fruktozo-6-fosforan (F6P).

HK glukoza + ATP <————> G6P + ADP HK fruktoza + ATP <————> F6P + ADP Glukozo-6-fosforan jest poczàtkowo utleniany do 6-fosforanu glukonianu za pomocà fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego w obecnoÊci enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (G6PDH).

IloÊç powstajàcego zredukowanego fosforanu dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) odpowiada iloÊci glukozo-6-fosforanu, a przez to iloÊci glukozy.

G6PDH G6P + NADP+ <————> glukozo-6-fosforan + + NADPH + H+ Zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego jest oznaczany przez pomiar absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm.

Na koniec reakcji fruktozo-6-fosforan przeprowadzany jest w glukozo-6-fosforan za pomocà izomerazy glukofosforanowej (PGI):

PGI F6P <————> G6P Glukozo-6-fosforan reaguje z kolei z fosforanem dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego, dajàc 6-fosforan glukonianu i zredukowany fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego; ten ostatni zwiàzek jest oznaczany iloÊciowo.

Roztwory przed przystàpieniem do wykonania oznaczania sprowadza si´ do temperatury 20 °C.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8334 — Poz. 1173 3. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO ANALIZY Zale˝nie od spodziewanej ∏àcznej iloÊci glukozy i fruktozy w 1 litrze próbk´ rozcieƒcza si´, stosujàc:

Pomiar przy 340 lub 334 nm Pomiar przy 365 nm Rozcieƒczanie wodà Wspó∏czynnik rozcieƒczenia F do 0,4 g/l 0,8 g/l — — do 4,0 g/l 8,0 g/l 1+ 9 10 do 10,0 g/l 20,0 g/l 1 + 24 25 do 20,0 g/l 40,0 g/l 1 + 49 50 do 40,0 g/l 80,0 g/l 1 + 99 100 Powy˝ej 40,0 g/l 80,0 g/l 1 + 999 1000 4. WYKONANIE OZNACZANIA

D∏ugoÊç fali w spektrofotometrze ustawia si´ na 340 nm i przeprowadza pomiar w stosunku do powietrza (bez kuwety na drodze optycznej) lub w stosunku do wody jako odnoÊnika.

Pomiaru dokonuje si´ w temperaturze od 20 do 25 °C.

Do kuwet o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm nalewa si´:

Kuweta Kuweta odniesienia z próbkà Roztwór 1 2,50 ml 2,50 ml Roztwór 2 0,10 ml 0,10 ml Roztwór 3 0,10 ml 0,10 ml Badana próbka 0,20 ml Woda redestylowana 0,20 ml Przygotowuje si´ tak˝e:

Roztwór 4 Roztwór 5 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml 0,02 ml Roztwory 1, 2 i 3 miesza si´. Po oko∏o 3 minutach odczytuje ich absorbancj´ (A1) i zapoczàtkowuje si´ reakcj´ enzymatycznà przez dodanie Roztworu 4. Ca∏oÊç miesza si´, a nast´pnie po up∏ywie 15 minut odczytuje si´ absorbancj´ (A2). Po nast´pnych 2 minutach sprawdza si´, czy reakcja ju˝ ca∏kowicie usta∏a. Wówczas dodaje si´ Roztwór 5. Ponownie ca∏oÊç miesza si´ i po up∏ywie 10 minut odczytuje si´ absorbancj´ (A3). Po kolejnych 2 minutach sprawdza si´, czy reakcja usta∏a.

Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej mo˝e byç ró˝ny dla poszczególnych serii oznaczeƒ, podany czas nale˝y traktowaç jako czas przyk∏adowy trwania reakcji dla ka˝dej z serii.

Obliczanie zawartoÊci glukozy i fruktozy (C) wykonuje si´ wed∏ug wzoru:

V·M C (g/l) = ——————— ∆A, ε · d · v · 1000 gdzie:

V — oznacza obj´toÊç roztworu wzorcowego (ml), v — oznacza obj´toÊç badanej próbki (ml), M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji, d — oznacza gruboÊç warstwy kuwety o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm, ε — jest wspó∏czynnikiem absorbancji NADPH (przy 340 nm = 6,3 mmol–1 x 1 cm–1).

Dla oznaczania glukozy V = 2,92, a dla oznaczania fruktozy V = 2,94 v = 0,20 ml M = 180 d=1 Wykorzystujàc dane, otrzymuje si´ dla:

Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.

Po zakoƒczeniu analizy oblicza si´ ró˝nice absorbancji dla kuwet z próbkà odniesienia i próbkà badanà:

Oblicza si´ ró˝nic´ absorbancji dla kuwety z próbkà odniesienia (∆AR) i kuwety z badanà próbkà (∆AS), otrzymujàc wartoÊci dla: dla glukozy — C(g/l) = 0,425 ∆ΑG, dla fruktozy — C(g/l) = 0,428 ∆AF;

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8335 — Poz. 1173 6. POWTARZALNOÂå METODY 7. ODTWARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.

OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.

W przypadku oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy powtarzalnoÊç (r) wynosi:

W przypadku oznaczania zawartoÊci glukozy i fruktozy odtwarzalnoÊç (R) wynosi: r = 0,056 xi, R = 0,12 + 0,076 xi, gdzie xi = zawartoÊç glukozy lub fruktozy w g/l. gdzie xi = zawartoÊç glukozy lub fruktozy w g/l.

Za∏àcznik nr 8 WYKRYWANIE WZBOGACANIA MOSZCZY GRONOWYCH, ZAG¢SZCZONYCH MOSZCZY GRONOWYCH I WIN METODÑ MAGNETYCZNEGO REZONANSU JÑDROWEGO DEUTERU (SNIF-NMR/RMN-FINS) Deuter wyst´pujàcy w cukrach i w wodzie moszczy gronowych po fermentacji znajduje si´ w winie w czàsteczkach zwiàzków oznaczonych jako zwiàzki chemiczne:

I. CH2D CH2OH II. CH3 CHD OH III. CH3 CH2 OD IV. HOD Dodatek egzogennego cukru podczas dos∏adzania na sucho przed fermentacjà moszczu wp∏ywa na rozk∏ad deuteru w czàsteczkach tych zwiàzków. gdzie:

D H R (D/H)I R = 2(D/H)II/(D/H)I wyra˝a wzgl´dny rozk∏ad deuteru w czàsteczkach zwiàzku chemicznego I i II i jest bezpoÊrednio mierzony na podstawie nat´˝enia (h) sygna∏u, stàd R wynosi 3hII/hI. — oznacza deuter, — oznacza wodór, — oznacza wzgl´dny rozk∏ad deuteru, — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach zwiàzku chemicznego I, (D/H)II — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach zwiàzku chemicznego II, o (D/H) w — oznacza stosunek izotopów w czàsteczkach wody w winie.

W porównaniu z wartoÊcià parametrów dla naturalnego wina kontrolnego z tego samego regionu wzbogacanie egzogennym cukrem b´dzie powodowa∏o nast´pujàce zmiany:

Parametr (D/H)I charakteryzuje g∏ównie roÊliny, które syntetyzujà cukier, w mniejszym stopniu po∏o˝enie geograficzne miejsca uprawy (rodzaj wody wykorzystywanej w fotosyntezie).

Parametr (D/H)II charakteryzuje warunki klimatyczne miejsca uprawy winogron (rodzaj wody deszczowej Dziennik Ustaw Nr 126 — 8336 — i warunki pogodowe) oraz, w mniejszym stopniu, zawartoÊç cukru w wyjÊciowym moszczu.

Parametr (D/H)ow charakteryzuje warunki klimatyczne miejsca uprawy i zawartoÊç cukru w moszczu.

Poz. 1173 Odczynniki Stosuje si´ odczynniki do oznaczania zawartoÊci wody metodà Karla-Fischera.

Wykonanie oznaczania Zdefiniowane parametry [R, (D/H)I oraz (D/H)II] sà oznaczane metodà magnetycznego rezonansu jàdrowego deuteru w etanolu wydzielonym z wina lub z produktów fermentacji moszczu, moszczu zag´szczonego uzyskanego w okreÊlonych warunkach; parametry te mogà byç uzupe∏nione przez oznaczanie stosunku izotopów w wodzie wydzielonej z wina, (D/H)ow oraz przez oznaczanie stosunku izotopów 13C/12C w etanolu.

Aparatura i sprz´t Aparat destylacyjny do wydzielania etanolu, przedstawiony na schemacie, sk∏ada si´ z:

W badanej próbce wina oznacza si´ zawartoÊç etanolu (p) z dok∏adnoÊcià co najmniej 0,05 % obj. zgodnie z metodà opisanà w za∏àczniku nr 3.

Nast´pnie 500 ml jednorodnej próbki wina o zawartoÊci alkoholu (p) wprowadza si´ do kolby aparatu destylacyjnego o sta∏ej wartoÊci stopnia deflegmacji równej 0,9. Jako odbieralnik destylatu umieszcza si´ kolb´ sto˝kowà na 125 ml. Destylat zbiera si´ w iloÊci oko∏o 40 do 60 ml, przy temperaturze wrzenia mi´dzy 78,0 a 78,2 °C. Je˝eli temperatura przekroczy 78,5 °C przerywa si´ zbieranie destylatu na 5 minut.

Gdy temperatura ponownie osiàgnie 78 °C, zbiera si´ ponownie destylat do osiàgni´cia temperatury 78,5 °C. CzynnoÊç t´ powtarza si´ do chwili, gdy temperatura, po przerywaniu destylacji i pracy w obiegu zamkni´tym, utrzyma si´ na sta∏ym poziomie. Ca∏kowita destylacja trwa oko∏o 5 godzin. Metoda ta pozwala na odzyskanie w destylacie od 98 do 98,5 % ca∏oÊci zawartego w winie alkoholu, przy czym zawartoÊç alkoholu w destylacie wynosi od 92 do 93 % wagowo (95 % obj.) i jest to st´˝enie, dla którego ustalono warunki NMR.

Nast´pnie wa˝y si´ zebrany destylat, po czym 60 ml jednorodnej próbki pozosta∏oÊci po destylacji, odpowiadajàcej wodzie zawartej w winie, przenosi si´ do kolby na 60 ml.

W próbce tej mo˝na oznaczyç stosunek izotopów.

Je˝eli do oznaczania stosuje si´ spektrometr wyposa˝ony w próbnik o Êrednicy 10 mm, do oznaczenia wystarczy jednorodna próbka wina o obj´toÊci 300 ml.

ZawartoÊç wody (p’) w gramach oznacza si´ metodà Karla-Fischera.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8337 — Poz. 1173 Schemat aparatu destylacyjnego do wydzielania etanolu ZawartoÊç alkoholu (tDm) w % wagowych oblicza si´ wed∏ug wzoru: p—p’ tDm = ——— x 100. p Fermentacja moszczy i moszczy zag´szczonych Odczynniki:

Aparatura Naczynie fermentacyjne o pojemnoÊci 1,5 l wyposa˝one w urzàdzenie zapewniajàce hermetyczne zamkni´cie i skraplanie par alkoholu, poniewa˝ w trakcie Dziennik Ustaw Nr 126 — 8338 — Poz. 1173 fermentacji nie mogà wystàpiç ˝adne straty etanolu.

WydajnoÊç przemiany cukrów fermentujàcych w etanol powinna wynosiç ponad 98 %.

Wykonanie oznaczania:

Zale˝nie od rodzaju spektrometru i próbnika dodaje si´ odpowiednie iloÊci heksafluorobenzenu jako substancji stabilizujàcej cz´stotliwoÊç pola zgodnie z zamieszczonà tabelà:

Przygotowanie próbki alkoholu do oznaczania metodà NMR Odczynniki:

Wykonanie oznaczania:

Spektrometr Próbnik 10 mm Próbnik 15 mm 7,05 T 9,4 T 150 µl 35 µl 200 µl 50 µl Przygotowanie próbki wody do pomiarów metodà NMR, w celu ewentualnego oznaczania w niej stosunku izotopów Odczynniki N,N-czterometylomocznik (TMU) Wykonanie oznaczania 3 ml wody uzyskanej podczas wydzielania etanolu i wody z wina lub podczas fermentacji moszczy umieszcza si´ w wytarowanej kolbie i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 mg (m’E). Nast´pnie wprowadza si´ 4 ml wzorca wewn´trznego (TMU) i wa˝y z dok∏adnoÊcià do 0,1 m (m’ST), po czym ca∏oÊç miesza si´ dok∏adnie przez wstrzàsanie.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8339 — Kalibracja i sprawdzanie prawid∏owoÊci kalibracji spektrofotometru

U˝ywa si´ wzorcowych etanoli, oznaczonych literami C, V i B, o ró˝nym st´˝eniu izotopów, ale dok∏adnie standaryzowanych, gdzie:

C — oznacza alkohol uzyskany z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej, V — oznacza alkohol uzyskany z winogron, B — oznacza alkohol uzyskany z buraków.

Post´pujàc zgodnie z metodà opisanà dalej, oznacza si´ stosunek izotopów w alkoholu uzyskanym z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej (Cmeas), alkoholu uzyskanym z winogron (Vmeas) i alkoholu uzyskanym z buraków (Bmeas).

WartoÊci uzyskane z oznaczania porównuje si´ z wartoÊciami podanymi dla odpowiednich wzorców — alkoholu uzyskanego z cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej (CST), alkoholu uzyskanego z winogron (VST) i alkoholu uzyskanego z buraków (BST).

Poz. 1173 Dla ka˝dego widma prowadzi si´ pewnà liczb´ akumulacji NS, wystarczajàcà do uzyskania stosunku sygna∏u do szumu. Powtarza si´ te akumulacje NE = 10 razy.

WartoÊci NS zale˝à od rodzaju spektrometru i u˝ywanego próbnika.

3hII wysokoÊç sygna∏u II (CH3CHD OH)

Przygotowanà próbk´ alkoholu lub próbk´ wody umieszcza si´ w próbówce szklanej o Êrednicy 15 lub 10 mm i wprowadza do próbnika.

Warunki uzyskiwania widm NMR sà nast´pujàce:

Wykorzystujàc do obliczeƒ wysokoÊç piku uzyskanego na chromatogramie, zamiast jego powierzchni, co jest metodà mniej dok∏adnà, zak∏ada si´, ˝e szerokoÊç piku w po∏owie jego wysokoÊci jest identyczna i pozwala uzyskaç mo˝liwe do przyj´cia przybli˝enie.

Woda Je˝eli stosunek izotopów w wodzie jest oznaczany metodà NMR w mieszaninie woda — TMU, wykorzystuje si´ nast´pujàcy wzór:

Dobre odsprz´ganie osiàga si´, gdy 02 znajduje si´ w Êrodku przedzia∏u cz´stotliwoÊci wyst´pujàcego mi´dzy grupami CH3– i CH2. Stosuje si´ szerokie pasmo odsprz´gania. m’st (D/H)ow = 0,9306 x TIV x ——— x (D/H)st m’E przy czym: powierzchnia sygna∏u (HOD) wody wydzielonej z wina

Dla ka˝dego z parametrów izotopów oblicza si´ Êrednià z 10 oznaczeƒ oraz przedzia∏ ufnoÊci.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8340 — 4. INTERPRETACJA WYNIKU Poz. 1173 nuje si´ te wartoÊci z alkoholem wydzielonym z produktu fermentacji moszczy.

Porównuje si´ wartoÊci wzgl´dnego rozk∏adu deuteru w badanej próbce (RX) z wartoÊcià wzgl´dnego rozk∏adu deuteru we wzorcu (RTI) lub (RTII). Je˝eli RX ró˝ni si´ od Êredniej wartoÊci RTI lub RTII uzyskanej dla wina kontrolnego o wi´cej ni˝ dwukrotnà wartoÊç odchylenia standardowego, mo˝na przypuszczaç, ˝e próbka zosta∏a zafa∏szowana.

Wykrywanie dodatku cukru buraczanego, cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej

WielkoÊç wzbogacenia E w % obj. wyra˝a obj´toÊç alkoholu dodanego do fermentowanego produktu.

Znajàc rozcieƒczenia, które mog∏y byç dokonane przed fermentacjà (w przypadku moszczy zag´szczonych), i zak∏adajàc, ˝e z 16,83 g cukru otrzymuje si´ 1 % obj. alkoholu, nale˝y obliczyç iloÊç (mas´) cukru dodanego na litr moszczu, moszczu zag´szczonego.

Wykrywanie dodatku mieszaniny cukru buraczanego, cukru trzcinowego lub glukozy kukurydzianej Stosunek izotopów (D/H)I i R zmienia si´ w mniejszym stopniu w przypadku dodania mieszaniny cukrów ni˝ w przypadku dodania tylko jednego rodzaju cukru.

WartoÊç (D/H)II jest wi´ksza, jak równie˝ wartoÊç (D/H)wo.

Oznacza si´ wartoÊci parametrów izotopów w alkoholu wydzielonym z fermentowanego produktu otrzymanego podczas fermentacji moszczu lub moszczu zag´szczonego, post´pujàc zgodnie z instrukcjà, i porów- Dodanie mieszaniny cukrów mo˝na potwierdziç przez wyznaczenie stosunku 13C/12C w etanolu metodà spektrometrii masowej, gdy˝ w przypadku zafa∏szowania stosunek ten jest wy˝szy.

Za∏àcznik nr 9 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI POPIO¸U Popió∏ stanowià wszystkie substancje pozostajàce po spaleniu pozosta∏oÊci po odparowaniu wina. Spalanie przeprowadza si´ w taki sposób, aby wszystkie kationy (z wyjàtkiem kationów amonowych) przesz∏y w form´ w´glanów lub innych bezwodnych soli nieorganicznych. si´ tygiel w elektrycznym piecu muflowym o temperaturze 525 ± 25 °C. Po 15 minutach zw´glania tygiel wyjmuje si´ z pieca, dodaje 5 ml wody destylowanej i odparowuje wod´ na ∏aêni wodnej lub w promienniku w podczerwieni, a nast´pnie ponownie ogrzewa w temperaturze 525 °C przez 10 minut.

Pozosta∏oÊç po odparowaniu wina jest spalana w temperaturze od 500 do 550 °C a˝ do ca∏kowitego spalenia (utlenienia) substancji organicznych.

W sytuacji gdy nie nastàpi∏o ca∏kowite spalenie zw´glonych czàsteczek, powtarza si´ przemywanie, odparowywanie wody i pra˝enie.

Po zakoƒczeniu spalania próbki przenosi si´ do eksykatora. Po och∏odzeniu w eksykatorze wa˝y si´ tygiel.

ZawartoÊç popio∏u (P) w badanej próbce, w g/l, oblicza si´ wed∏ug wzoru:

P = 50 x (P1 – P0), 2. WYKONANIE OZNACZANIA Po uprzednim zwa˝eniu tygla z platyny odmierza si´ 20 ml wina. Próbk´ odparowuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej, a nast´pnie ogrzewa pozosta∏oÊç na p∏ycie grzejnej o temperaturze 200 °C lub w promienniku w podczerwieni a˝ do rozpocz´cia zw´glania próbki.

Gdy z próbki przestanie wydzielaç si´ dym, umieszcza gdzie:

P0 — oznacza mas´ pustego tygla, P1 — oznacza mas´ tygla ze spopielonà próbkà (popio∏em), 50 — oznacza przelicznik 20 ml na litr.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8341 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 10 OZNACZANIE ALKALICZNOÂCI POPIO¸U AlkalicznoÊç popio∏u stanowi suma kationów, innych ni˝ kationy amonowe, zwiàzanych z kwasami organicznymi w winie.

Metoda oznaczania alkalicznoÊci popio∏u polega na rozpuszczeniu popio∏u w goràcym roztworze kwasu, a nast´pnie dokonaniu oznaczania nadmiaru kwasu metodà miareczkowà z u˝yciem oran˝u metylowego jako wskaênika.

AlkalicznoÊç popio∏u (A) w miligramorównowa˝nikach na litr, z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku, oblicza si´ wed∏ug wzoru:

A = 5 (10 – n),

Za∏àcznik nr 11 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CHLORKÓW ZawartoÊç chlorków oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà potencjometrycznà z zastosowaniem elektrody Ag/AgCl.

Do cylindrycznego naczynia na 150 ml odmierza si´ 5 ml wzorcowego roztworu chlorku, dodaje si´ 95 ml Dziennik Ustaw Nr 126 — 8342 — wody destylowanej i 1 ml kwasu azotowego i zanurza elektrod´. Nast´pnie miareczkuje si´ roztworem azotanu srebra dozowanym z mikrobiurety, ciàgle mieszajàc, do uzyskania potencja∏u punktu równowa˝nikowego. Oznaczenie powtarza si´ do uzyskania zbli˝onych wyników. Test ten nale˝y przeprowadziç przed ka˝dà serià oznaczeƒ chlorków w próbkach win.

Do cylindrycznego naczynia na 150 ml odmierza si´ 50 ml wina, nast´pnie dodaje si´ 50 ml wody destylowanej i 1 ml kwasu azotowego i miareczkuje roztworem azotanu srebra dozowanym z mikrobiurety, ciàgle mieszajàc, do uzyskania potencja∏u punktu równowa˝nikowego.

Dla dok∏adnego oznaczania:

20 x V — wynik wyra˝ony w mg/l w przeliczeniu na chlor (Cl), 0,5633 x V — wynik wyra˝ony w miligramorównowa˝nikach na litr, 32,9 x V — wynik wyra˝ony w mg/l w przeliczeniu na chlorek sodu (NaCl), gdzie V — oznacza iloÊç ml azotanu srebra zu˝ytego w oznaczaniu.

Punkt koƒcowy miareczkowania oraz dok∏adnà obj´toÊç zu˝ytego roztworu azotanu srebra okreÊla si´:

V — oznacza iloÊç ml zu˝ytego roztworu azotanu srebra do uzyskania punktu równowa˝nikowego, V’ — oznacza iloÊç ml zu˝ytego roztworu azotanu srebra przed najwi´kszym skokiem potencja∏u, ∆V1 — oznacza sta∏à obj´toÊç, w jakiej wprowadzano roztwór azotanu srebra, równà 0,2 ml, ∆∆E1 — oznacza drugà ró˝nic´ potencja∏u przed najwi´kszym skokiem potencja∏u, ∆∆E2 — oznacza drugà ró˝nic´ potencja∏u po najwi´kszym skoku potencja∏u.

W przypadku oznaczania zawartoÊci chlorków powtarzalnoÊç (r) wynosi:

W przypadku oznaczania zawartoÊci chlorków odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8343 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 12 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SIARCZANÓW Metoda oznaczania zawartoÊci siarczanów polega na wytràceniu jonów siarczanowych za pomocà chlorku baru. RównoczeÊnie wytràcajàcy si´ fosforan baru jest usuwany przez przemywanie osadu kwasem chlorowodorowym. Uzyskany osad po spopieleniu wa˝y si´. W przypadku moszczy i win bogatych w dwutlenek siarki przed oznaczaniem zalecana jest desulfitacja przez gotowanie w szczelnie zamkni´tym naczyniu.

Uzyskany osad siarczanu baru przemywa si´ 10 ml kwasu solnego, nast´pnie wytwarza si´ zawiesin´ i wiruje przez 5 minut, po czym ostro˝nie zlewa si´ ciecz znad osadu. Przemywanie wykonuje si´ dwukrotnie w tych samych warunkach, za ka˝dym razem u˝ywajàc 15 ml wody destylowanej. Po zakoƒczeniu przemywania osad przenosi si´ do zwa˝onego naczynka platynowego, wyp∏ukujàc osad wodà destylowanà. Naczynko wraz z osadem umieszcza si´ w ∏aêni wodnej o temperaturze 100 °C a˝ do ca∏kowitego odparowania. Suchy osad pra˝y si´ kilkakrotnie w p∏omieniu do uzyskania bia∏ej pozosta∏oÊci, nast´pnie och∏adza w eksykatorze i wa˝y.

Ogólny sposób wykonania oznaczania Do próbówki do wirowania o pojemnoÊci 50 ml odmierza si´ 40 ml badanej próbki i dodaje 2 ml kwasu solnego i 2 ml roztworu chlorku baru. Ca∏oÊç miesza si´ mieszad∏em szklanym, nast´pnie mieszad∏o przemywa si´ niewielkà iloÊcià wody destylowanej i odstawia na 5 minut, po czym wiruje 5 minut. Po zakoƒczeniu wirowania ostro˝nie zlewa si´ ciecz znad osadu.

Uzyskany osad siarczanu baru przemywa si´ 10 ml kwasu solnego, nast´pnie wytwarza si´ zawiesin´ i wiruje przez 5 minut, po czym ostro˝nie zlewa si´ ciecz znad osadu. Przemywanie wykonuje si´ dwukrotnie w tych samych warunkach, za ka˝dym razem u˝ywajàc 15 ml wody destylowanej. Po zakoƒczeniu przemywania osad przenosi si´ do zwa˝onego naczynka platynowego, wyp∏ukujàc osad wodà destylowanà. Naczynko wraz z osadem umieszcza si´ w ∏aêni wodnej o temperaturze 100 °C a˝ do ca∏kowitego odparowania. Suchy osad pra˝y si´ kilkakrotnie w p∏omieniu do uzyskania bia∏ej pozosta∏oÊci, nast´pnie och∏adza w eksykatorze i wa˝y.

ZawartoÊç siarczanów w moszczach i winie oznacza si´ w mg chlorku potasu/litr, z dok∏adnoÊcià do 1 mg.

W przypadku oznaczania zawartoÊci siarczanów powtarzalnoÊç (r) wynosi:

Specjalny sposób wykonania oznaczania

Specjalny sposób wykonania oznaczania dotyczy moszczy i win o wysokiej zawartoÊci dwutlenku siarki.

Do kolby sto˝kowej na 500 ml wyposa˝onej we wkraplacz i rurk´ odprowadzajàcà odmierza si´ 25 ml wody i 1 ml czystego kwasu solnego o g´stoÊci (ρ20) wynoszàcej od 1,15 do 1,18 g/ml. Roztwór zagotowuje si´ w celu odpowietrzenia. Nast´pnie przez lejek wprowadza si´ 100 ml wina. Próbk´ gotuje si´ dalej a˝ do momentu, gdy obj´toÊç cieczy w kolbie zmniejszy si´ do oko∏o 75 ml. Po och∏odzeniu roztwór przenosi si´ iloÊciowo do kolby miarowej na 100 ml i uzupe∏nia wodà do 100 ml. Uzyskuje si´ w ten sposób próbk´ do badaƒ.

W przypadku oznaczania zawartoÊci siarczanów odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8344 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 13 OZNACZANIE KWASOWOÂCI OGÓLNEJ KwasowoÊç ogólna jest sumà kwasowoÊci miareczkowych próbki, gdy miareczkowanie odbywa si´ do pH 7 przy u˝yciu mianowanego roztworu zasady.

Dwutlenek w´gla nie wchodzi w sk∏ad kwasowoÊci ogólnej.

Metoda oznaczania kwasowoÊci ogólnej polega na miareczkowaniu potencjometrycznym lub miareczkowaniu z b∏´kitem bromotymolowym jako wskaênikiem i porównaniu z wzorcem o barwie odpowiadajàcej punktowi koƒcowemu miareczkowania.

Do cylindra miarowego wprowadza si´ przygotowanà próbk´ o obj´toÊci 10 ml. Nast´pnie dodaje si´ oko∏o 10 ml wody destylowanej i roztwór wodorotlenku sodu w iloÊci potrzebnej do uzyskania pH 7 w temperaturze 20 °C. Wodorotlenek sodu dodaje si´ powoli, stale mieszajàc.

Miareczkowanie ze wskaênikiem (b∏´kit bromotymolowy)

A = 10 x n, gdzie n — oznacza obj´toÊç zu˝ytego roztworu wodorotlenku sodu.

WartoÊç t´ podaje si´ z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;

Elektrod´ szklanà przechowuje si´ w wodzie destylowanej. Elektrod´ kalomelowà nasyconà chlorkiem potasu przechowuje si´ w nasyconym roztworze chlorku potasu. Najcz´Êciej jest u˝ywana elektroda kombinowana, która powinna byç przechowywana w wodzie destylowanej.

WartoÊç t´ podaje si´ z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.

Do kolby pró˝niowej odmierza si´ oko∏o 50 ml wina. Nast´pnie kolb´ pod∏àcza si´ do pompki wodnej na jednà do dwóch minut, stale wstrzàsajàc.

W przypadku oznaczania kwasowoÊci ogólnej powtarzalnoÊç (r) wynosi:

Miareczkowanie potencjometryczne 7. ODTWARZALNOÂå METODY Przed przystàpieniem do miareczkowania wzorcuje si´ pehametr za pomocà buforu o pH 7.

OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bez-

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8345 — wzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.

W przypadku oznaczania kwasowoÊci ogólnej odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

Poz. 1173

Za∏àcznik nr 14 OZNACZANIE KWASOWOÂCI LOTNEJ KwasowoÊç lotna jest sumà kwasów lotnych w stanie wolnym lub zwiàzanym, wyra˝onà liczbà gramów kwasu octowego na litr. ZawartoÊci kwasu w´glowego i kwasu siarkowego nie zalicza si´ do kwasowoÊci lotnej wina.

Metoda oznaczania kwasowoÊci lotnej polega na zmiareczkowaniu oddestylowanych kwasów lotnych mianowanym roztworem wodorotlenku sodu. Z wina usuwa si´ uprzednio dwutlenek w´gla, natomiast kwasowoÊç tworzonà przez wolny i zwiàzany dwutlenek siarki odejmuje si´ od kwasowoÊci destylatu. Odejmuje si´ równie˝ kwasowoÊç tworzonà przez kwas sorbowy, który móg∏ byç dodany do wina.

W destylacie jest obecna cz´Êç kwasu salicylowego, który w niektórych krajach jest stosowany do utrwalania wina. ZawartoÊç kwasu salicylowego równie˝ odejmuje si´ od kwasowoÊci lotnej.

20 ml wina pozbawionego dwutlenku w´gla odmierza si´ do kolby zestawu destylacyjnego, dodaje oko∏o 0,5 g kwasu winowego i przeprowadza destylacj´. Zbiera si´ co najmniej 250 ml destylatu.

Miareczkowanie Destylat miareczkuje si´ roztworem wodorotlenku sodu, wobec dwóch kropli fenoloftaleiny jako wskaênika. Miareczkowanie koƒczy si´ w chwili pojawienia si´ ró˝owej barwy roztworu niezanikajàcej w ciàgu 30 sekund.

Wprowadzenie poprawki na dwutlenek siarki Destylat bezpoÊrednio po zmiareczkowaniu zakwasza si´ czterema kroplami kwasu solnego. Nast´pnie dodaje si´ 2 ml roztworu skrobi i kilka kryszta∏ów jodku potasu. Roztwór miareczkuje si´ za pomocà roztworu jodu do niebieskiego zabarwienia. Zu˝yta iloÊç jodu odpowiada zawartoÊci wolnego dwutlenku siarki w destylacie. Nast´pnie dodaje si´ nasycony roztwór heptaoksotetraboranu sodu do uzyskania barwy ró˝owej i miareczkuje zwiàzany dwutlenek siarki za pomocà roztworu jodu.

Poz. 1173 7. ODTWARZALNOÂå METODY OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy pomi´dzy dwoma wynikami pojedynczego oznaczania, uzyskanymi na tej samej próbce, w ró˝nych warunkach — ró˝ne osoby wykonujàce, ró˝ne aparaty lub ró˝ne laboratoria, lub w ró˝nym czasie.

W przypadku oznaczania kwasowoÊci lotnej odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

Oznaczanie kwasu salicylowego przechodzàcego do destylatu wraz z kwasami lotnymi wykonuje si´ w drugim destylacie, przy czym u˝ywa si´ tej samej obj´toÊci destylatu, jakà wykorzystano do oznaczania kwasowoÊci lotnej. Kwas salicylowy oznacza si´ kolorymetrycznà metodà porównawczà. Oznaczonà zawartoÊç kwasu salicylowego odejmuje si´ od kwasowoÊci lotnej oznaczonej w destylacie uzyskanym w wyniku pierwszej destylacji. n — oznacza obj´toÊç zu˝ytego wodorotlenku sodu, Odczynniki: n’ — oznacza obj´toÊç jodu zu˝ytego do miareczkowania wolnego dwutlenku siarki,

JeÊli wino zawiera kwas sorbowy, kwasowoÊç pochodzàcà z kwasu sorbowego odejmuje si´ od oznaczonej kwasowoÊci lotnej, przy za∏o˝eniu, ˝e 100 mg kwasu sorbowego odpowiada kwasowoÊci 0,89 milirównowa˝nika/l lub 0,053 g/l kwasu octowego oraz gdy jest znana zawartoÊç kwasu sorbowego w mg/ml.

Wykonanie oznaczania:

W przypadku oznaczania kwasowoÊci lotnej powtarzalnoÊç (r) wynosi:

Za∏àcznik nr 15 OZNACZANIE KWASOWOÂCI ZWIÑZANEJ KwasowoÊç zwiàzanà oblicza si´ z ró˝nicy mi´dzy kwasowoÊcià ca∏kowità a kwasowoÊcià lotnà.

KwasowoÊç zwiàzanà wyra˝a si´ w miligramorównowa˝nikach na litr lub w g kwasu winowego na litr.

Za∏àcznik nr 16 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU WINOWEGO Kwas winowy wytràcany w postaci (±)winianu wapnia oznacza si´ grawimetrycznie. Dopuszczalne jest uzupe∏nienie tego oznaczania przy u˝yciu dodatkowo metody miareczkowej. Podczas wytràcania nale˝y zapewniç, aby takie warunki, jak: pH, ca∏kowita obj´toÊç roztworu zu˝ytego do wytràcania, st´˝enie jonów wytràcajàcych by∏y takie same i aby nastàpi∏o ca∏kowite wytràcenie (±)winianu wapnia oraz pozostanie w roztworze D(-)winianu wapnia. Je˝eli do wina dodano kwas mezowinowy, który powoduje nieca∏kowite wytràcanie (±)winianu wapnia, przed oznaczaniem przeprowadza si´ hydroliz´ kwasu.

Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób: do zlewki na 400 ml odmierza si´ 20 ml roztworu kwasu L(+)winowego (5 g/l), dodaje si´ 20 ml roztworu D(–)winianu amonu (6,126 g/l) i 6 ml roztworu octanu wapnia zawierajàcego 10 g wapnia w litrze. Ca∏oÊç pozostawia si´ na dwie godziny w celu wytràcenia winianu wapnia. Osad zbiera si´ na tyglu ze spiekiem szklanym nr 4 i przemywa trzy razy oko∏o 30 ml wody destylowanej. Nast´pnie osad suszy si´ do sta∏ej masy w suszarce w temperaturze 70 °C. U˝ywajàc wy˝ej wskazanych iloÊci odczynników, uzyskuje si´ oko∏o 340 mg krystalicznego (±)winianu wapnia. Tak przygotowany winian wapnia przechowuje si´ w zakorkowanej butelce;

Wykonanie oznaczania:

Uzyskany osad suszy si´ do sta∏ej masy w suszarce w temperaturze 70 °C i nast´pnie wa˝y;

Obliczonà zawartoÊç kwasu mezowinowego uwzgl´dnia si´ w koƒcowym wyniku oznaczenia jako kwas winowy.

Obliczanie wyniku oznaczania:

Jedna czàsteczka (±)winianu wapnia odpowiada po∏owie czàsteczki kwasu L(+)-winowego w winie.

WartoÊç ta podawana jest z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;

WartoÊç ta podawana jest z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;

WartoÊç ta podawana jest z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.

Poz. 1173

Wykonanie oznaczania:

Uprzednio zwa˝ony tygiel ze spiekiem szklanym zawierajàcy osad (±)winianu wapnia umieszcza si´ na kolbie pró˝niowej. Osad rozpuszcza si´ w 10 ml rozcieƒczonego kwasu solnego. Nast´pnie tygiel przemywa si´ 50 ml wody destylowanej. Po przemyciu osadu dodaje si´ do tygla 5 ml roztworu wodorotlenku sodu i oko∏o 30 mg wskaênika. Ca∏oÊç miareczkuje si´ roztworem EDTA.

Obliczanie wyniku oznaczania:

WartoÊç ta jest podawana z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku;

WartoÊç ta jest podawana z dok∏adnoÊcià do jednego miejsca po przecinku.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8349 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 17 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU CYTRYNOWEGO Metoda jest oparta na enzymatycznej przemianie kwasu cytrynowego (cytrynianu) w oksalooctan i octan w reakcji katalizowanej przez liaz´ cytrynianowà (CL) CL cytrynian <——> szczawiooctan + octan Oksalooctan ulega samorzutnej dekarboksylacji do pirogronianu.

W obecnoÊci dehydrogenazy jab∏czanowej (MDH) i dehydrogenazy mleczanowej (LDH) szczawiooctan i pirogronian sà redukowane do L-jab∏czanu i L-mleczanu przez zredukowany dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NADH).

MDH szczawiooctan + NADH + H+ <———> L-jab∏czan + NAD+ LDH pirogronian + NADH + H+ <———> L-mleczan + NAD+ IloÊç NADH utlenionego do NAD+ w powy˝szej reakcji jest proporcjonalna do iloÊci cytrynianu w próbce. IloÊç utlenionego NADH jest oznaczana przez pomiar spadku absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm.

Roztwór ten jest trwa∏y w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzieƒ i przez co najmniej cztery tygodnie w stanie zamro˝enia od dnia sporzàdzenia.

Przed wykonaniem oznaczania sprawdza si´ aktywnoÊç enzymów;

Kuweta odniesienia (próba Êlepa) (ml) Roztwór 1 — 1,00 Roztwór 2 — 0,10 Badana próbka — — Woda redestylowana — 2,00 Roztwór 3 — 0,02 Kuweta z badanà próbkà (ml) 1,00 0,10 0,20 1,80 0,02 Dziennik Ustaw Nr 126 — 8350 — Poz. 1173 Ca∏oÊç miesza si´ i po oko∏o 5 minutach odczytuje absorbancj´ roztworu odniesienia i roztworu badanej próbki (A1).

Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia:

Po odczytaniu absorbancji dodaje si´ Roztworu 4 w iloÊci 0,02 ml do kuwety odniesienia oraz 0,02 ml do kuwety z badanà próbkà.

Nast´pnie miesza si´, pozostawia do zakoƒczenia reakcji (oko∏o 5 minut) i odczytuje absorbancj´ roztworu odniesienia i roztworu badanej próbki (A2).

Z uwagi na to, ˝e czas niezb´dny do ca∏kowitego przebiegu reakcji enzymatycznej mo˝e byç ró˝ny dla kolejnych serii oznaczeƒ, podany czas nale˝y traktowaç jedynie jako orientacyjny czas trwania reakcji. W zwiàzku z tym oznacza si´ czas dla ka˝dej z serii.

V×M C = ————— × ∆A, ε×d×v gdzie:

V — oznacza obj´toÊç badanego roztworu w ml, v — oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml, M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji, d — oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm, ε — oznacza wspó∏czynnik absorbancji NADH (przy 340 nm ε = 6,3–1 x 1 × cm–1), ∆A — oznacza ró˝nic´ (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej Wykorzystujàc powy˝sze dane, otrzymuje si´:

C = 479 x ∆A.

W przypadku oznaczania kwasu cytrynowego powtarzalnoÊç (r) wynosi:

W przypadku oznaczania kwasu cytrynowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8351 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 18 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU MLEKOWEGO Ca∏a iloÊç kwasu mlekowego (L-mleczan i D-mleczan) jest utleniana przez dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) do pirogronianu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz´ L-mleczanowà (L-LDH) i dehydrogenaz´ D-mleczanowà (D-LDH).

Równowaga tej reakcji jest zwykle przesuni´ta w stron´ mleczanu. Usuwanie pirogronianu z miesza- niny reakcyjnej przesuwa równowag´ reakcji w stron´ tworzenia pirogronianu.

W obecnoÊci L-glutominianu pirogronian przechodzi w L-alanin´ w reakcji katalizowanej przez transaminaz´ glutaminowo-pirogronianowà (GPT). Nast´puje to wed∏ug reakcji:

L-LDH

IloÊç powstajàcego NADH, mierzona przez wzrost absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm, jest proporcjonalna do iloÊci mleczanu obecnego w próbce.

Mo˝liwe jest wykonanie oznaczania kwasu L-mlekowego niezale˝nie przy wykorzystaniu reakcji (1) i (3), a kwasu D-mlekowego analogicznie za pomocà reakcji (2) i (3).

Roztwór ten jest trwa∏y przez co najmniej 12 miesi´cy w temperaturze 4 °C;

Roztwór sporzàdza si´ w nast´pujàcy sposób — 900 mg NAD rozpuszcza si´ w 30 ml wody redestylowanej. Roztwór ten jest trwa∏y przez co najmniej 4 tygodnie w temperaturze 4 °C;

Zaleca si´ sprawdzenie aktywnoÊci enzymów przed wykonaniem oznaczania.

Z uwagi na mo˝liwoÊç wprowadzenia kwasu L-mlekowego, którego obecnoÊç spowoduje uzyskanie b∏´dnego wyniku, jest zabronione dotykanie palcami jakiejkolwiek z tych cz´Êci u˝ywanego szk∏a, które mogà mieç kontakt z mieszaninà reakcyjnà.

Dziennik Ustaw Nr 126 W kuwetach umieszcza si´:

Kuweta odniesienia (próba Êlepa) (ml) — 8352 — Kuweta z badanà próbkà Roztwór 1 — 1,00 Roztwór 2 — 0,20 Woda redestylowana — 1,00 Roztwór 3 — 0,02 Badana próbka — — (ml) 1,00 0,20 0,80 0,02 0,20 ZawartoÊç kuwet miesza si´ mieszad∏em szklanym lub pr´tem z materia∏u syntetycznego ze sp∏aszczonym koƒcem. Nast´pnie po oko∏o 5 minutach mierzy si´ absorbancj´ roztworów w kuwecie z próbkà odniesienia oraz w kuwecie z badanà próbkà (A1).

Po zmierzeniu absorbancji do kuwety odniesienia oraz kuwety z badanà próbkà dodaje si´ 0,02 ml Roztworu 4 oraz 0,05 ml Roztworu 5. Nast´pnie dok∏adnie miesza si´, pozostawia do zakoƒczenia reakcji (na oko∏o 30 minut) i mierzy absorbancj´ roztworów w kuwetach z próbkà odniesienia i z badanà próbkà (A2).

Oznaczanie kwasu L-mlekowego i D-mlekowego Mo˝liwe jest niezale˝ne prowadzenie oznaczania kwasu L-mlekowego i D-mlekowego przy zastosowaniu metody oznaczania kwasu mlekowego ogó∏em do momentu wyznaczenia wartoÊci A1. Przy czym po zmierzeniu absorbancji A1 dodaje si´ po 0,02 ml Roztworu 4, nast´pnie dok∏adnie miesza si´ i pozostawia substancje do zakoƒczenia reakcji. Czas ten wynosi oko∏o 20 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ w kuwetach zawierajàcych próbk´ odniesienia i próbk´ badanà (A2). Po dokonaniu pomiaru absorbancji A2 dodaje si´ 0,02 ml Roztworu 5, dok∏adnie miesza si´, ponownie pozostawia si´ substancj´ do zakoƒczenia reakcji. Czas ten wynosi oko∏o 30 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ w kuwetach zawierajàcych próbk´ odniesienia i próbk´ badanà (A3).

Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej mo˝e ró˝niç si´ dla kolejnych serii oznaczaƒ, podane czasy trwania reakcji sà przyk∏adowe. Zaleca si´ oznaczanie faktycznego czasu dla ka˝dej z serii. Przy oznaczaniu wy∏àcznie kwasu L-mlekowego czas inkubacji mo˝na skróciç do 10 minut.

VxM C = ———————— x ∆A, ε x d x v x 1000 gdzie:

V — oznacza obj´toÊç badanego roztworu w ml (V = 2,24 ml dla kwasu L-mlekowego, V = 2,29 dla kwasu D-mlekowego i kwasu mlekowego ogó∏em), v — oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml, M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji, d — oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm, Poz. 1173 ε — oznacza wspó∏czynnik absorpcji NADH (w 340 nm, ε = 6,3 mmol–1 x cm–1), ∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej w przypadku kwasu mlekowego ogó∏em, ∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej w przypadku kwasu L-mlekowego, ∆A = (A3 — A2)próbki — (A3 — A2)próby Êlepej w przypadku kwasu D-mlekowego.

ZawartoÊç kwasu mlekowego ogó∏em i kwasu D-mlekowego oblicza si´ wed∏ug wzoru:

C = 0,164 x ∆A Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowania do oznaczania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.

Pomiar w 334 nm: C = 0,167 x ∆A (ε = 6,2 mmol–1 x 1 x cm–1) Pomiar w 365 nm: C = 0,303 x ∆A (ε = 3,4 mmol–1 x 1 x cm–1) ZawartoÊç kwasu mlekowego i kwasu L-mlekowego oblicza si´ wed∏ug wzoru:

C = 0,160 x ∆A Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowania do oznaczania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.

Pomiar w 334 nm: C = 0,163 x ∆A (ε = 6,2 mmol–1 x 1 x cm–1) Pomiar w 365 nm: C = 0,297 x ∆A (ε = 3,4 mmol–1 x 1 x cm–1) 6. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.

W przypadku oznaczania kwasu mlekowego powtarzalnoÊç (r) wynosi: r = 0,02 + 0,07 xi g/l xi — oznacza zawartoÊç kwasu mlekowego w próbce w g/l.

W przypadku oznaczania kwasu mlekowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

R = 0,05 + 0,125 xi g/l xi — oznacza zawartoÊç kwasu mlekowego w próbce w g/l.

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8353 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 19 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU L-JAB¸KOWEGO Kwas L-jab∏kowy (L-jab∏czan) jest utleniany przez dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) do szczawiooctanu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz´ L-jab∏czanowà (L-DH). Równowaga tej reakcji jest zwykle wyraênie przesuni´ta w stron´ jab∏czanu.

Usuwanie szczawiooctanu z mieszaniny reakcyjnej przesuwa równowag´ reakcji w stron´ tworzenia szczawiooctanu. W obecnoÊci L-glutaminianu szczawiooctan przechodzi w L-asparaginian w reakcji katalizowanej przez transaminaz´ glutaminianowo-szczawiooctanowà (GOT):

L–MDH

GPT IloÊç powstajàcego NADH, mierzona przez wzrost absorbancji przy d∏ugoÊci fali 340 nm, jest proporcjonalna do iloÊci L-jab∏czanu obecnego w próbce.

Roztwór ten jest trwa∏y przez co najmniej 4 tygodnie w temperaturze 4 °C;

W kuwetach o d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm umieszcza si´:

Kuweta odniesienia (próba Êlepa) (ml) Roztwór 1 — 1,00 Roztwór 2 — 0,10 Woda redestylowana — 1,00 Roztwór 3 — 0,01 Badana próbka — — Kuweta z badanà próbkà (ml) 1,00 0,10 0,90 0,01 0,20

ZawartoÊç kuwet miesza si´, pozostawia na oko∏o 3 minuty, odczytuje absorbancj´ roztworów w kuwecie z próbkà odniesienia i w kuwecie z badanà próbkà (A1).

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8354 — Z uwagi na to, ˝e czas trwania reakcji enzymatycznej mo˝e ró˝niç si´ dla kolejnych serii oznaczeƒ, podane powy˝ej czasy trwania reakcji sà przyk∏adowe. Zaleca si´ oznaczanie faktycznego czasu dla ka˝dej z serii.

ZawartoÊç kwasu cytrynowego (C) oblicza si´ wed∏ug wzoru:

V×M C = ————————— × ∆A, ε × d × v × 1000 Poz. 1173 6. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.

W przypadku oznaczania kwasu L-jab∏kowego powtarzalnoÊç (r) wynosi: r = 0,03 + 0,034 xi xi — oznacza st´˝enie kwasu jab∏kowego w próbce w g/l. gdzie:

V — oznacza obj´toÊç badanego roztworu w ml, v — oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml, M — oznacza mas´ czàsteczkowà oznaczanej substancji (dla kwasu L-jab∏kowego M = 134,09), 7. ODTWARZALNOÂå METODY d — oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm, OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu. ε — oznacza wspó∏czynnik absorbancji NADH (przy 340 nm ε = 6,3 mmola–1 x 1 x cm–1), ∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej Wykorzystujàc powy˝sze dane, otrzymuje si´:

C = 0,473 × ∆A g/l.

Je˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia:

W przypadku oznaczania kwasu L-jab∏kowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi:

R = 0,05 + 0,071 xi xi — oznacza st´˝enie kwasu jab∏kowego w próbce w g/l.

Za∏àcznik nr 20 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU D-JAB¸KOWEGO Kwas D-jab∏kowy (D-jab∏czan) jest utleniany przez dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) do szczawiooctanu w obecnoÊci dehydrogenazy D-jab∏- czanowej (D-MDH). Powstajàcy szczawiooctan ulega rozpadowi do pirogronianu i dwutlenku w´gla.

D-MDH D-jab∏czan + NAD+ <————> pirogronian + CO2 + NADH + H+ IloÊç powstajàcego NADH jest proporcjonalna do iloÊci kwasu D-jab∏kowego i jest mierzona przy d∏ugoÊci fali 334, 340 lub 365 nm.

Zestaw testowy na oko∏o 30 oznaczeƒ sk∏adajàcy si´ z:

Przygotowanie roztworów:

Dziennik Ustaw Nr 126 — 8355 —

Trwa∏oÊç roztworów:

Poz. 1173