Rozcieƒczanie wina wykonuje si´ zgodnie z danymi w tabeli rozcieƒczeƒ:
\nSpodziewana iloÊç kwasu D-jab∏kowego/litr Pomiar wykonywany przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 340 lub 334 nm 365 nm < 0,3 g 0,3 — 3,0 g < 0,5 g 0,5 — 5,0 g 4. WYKONANIE OZNACZANIA Za pomocà spektrofotometru z d∏ugoÊcià fali ustawionà na 340 nm oznacza si´ absorbancj´ przy u˝yciu 1 cm kuwet i w stosunku do powietrza jako wzorca o zerowej absorbancji (próbka odniesienia), czyli bez kuwety w drodze optycznej.
\nDo kuwet odmierza si´:
\nKuweta Kuweta odniesienia z badanà próbkà (próba Êlepa) (ml) (ml) Roztwór 1 Roztwór 2 Woda redestylowana Roztwór badanej próbki — 1,00 — 0,10 — 1,80 — — 1,00 0,10 1,70 0,10 ZawartoÊç kuwet miesza si´ i odczytuje absorbancj´ próby Êlepej i próbki badanej (A1) po oko∏o 6 minutach. Nast´pnie dodaje si´ do kuwety odniesienia i kuwety z badanà próbkà 0,05 ml Roztworu 3. Po wymieszaniu pozostawia si´ do zakoƒczenia reakcji (oko∏o 20 minut) i odczytuje absorbancj´ próby Êlepej i próbki badanej (A2).
\nCzas niezb´dny do przeprowadzenia reakcji enzymatycznej mo˝e byç ró˝ny dla poszczególnych serii Roztwór wodny Roztwór czynnika F — 1+9 1 10 oznaczeƒ. Podany wy˝ej czas reakcji jest przyk∏adowy.
\nCzas reakcji okreÊla si´ dla ka˝dej serii oznaczeƒ.
\nKwas D-jab∏kowy reaguje bardzo gwa∏townie. Enzym przekszta∏ca równie˝ kwas L-winowy, ale o wiele wolniej. To t∏umaczy wyst´powanie „reakcji pe∏zajàcych”, które mogà byç korygowane w drodze ekstrapolacji.
\nZalecany sposób post´powania w przypadku „reakcji pe∏zajàcych” „Reakcje pe∏zajàce” sà spowodowane g∏ównie reakcjami ubocznymi enzymu, obecnoÊcià innych enzymów w matrycy próbki badanej lub interakcjà jednego sk∏adnika lub wi´cej sk∏adników matrycy z czynnikami towarzyszàcymi reakcji enzymatycznej.
\nGdy reakcja przebiega normalnie, absorbancja osiàga wartoÊç sta∏à po czasie zale˝nym od pr´dkoÊci okreÊlonej reakcji enzymatycznej, zazwyczaj po 10 do 20 minutach.
\nW przypadku gdy zachodzà reakcje uboczne, absorbancja nie osiàga sta∏ej wartoÊci, lecz stale roÊnie w czasie, co okreÊla si´ mianem „reakcji pe∏zajàcej”.
\nJe˝eli zjawisko to wyst´puje w czasie analizy, pomiar powinien byç wykonywany w regularnych odst´- Dziennik Ustaw Nr 126 — 8356 — Poz. 1173 pach (co 2 do 5 minut), po czasie wymaganym dla osiàgni´cia ostatecznej absorbancji roztworu standardowego. Przeprowadza si´ 5 lub 6 odczytów, jeÊli absorbancja roÊnie ze sta∏à pr´dkoÊcià, a nast´pnie ekstra- poluje graficznie lub matematycznie wartoÊç absorbancji, jakà mia∏by roztwór w momencie ostatniego dodania enzymu (T 0). Ró˝nic´ absorbancji (Af—Ai) wykorzystaç do obliczenia st´˝enia substratu.
\nZawartoÊç kwasu D-jab∏kowego (C) w mg/l oblicza si´ wed∏ug wzoru:
\nV × PM C =—————— × ∆A ε×d×v W przypadku oznaczania kwasu D-jab∏kowego powtarzalnoÊç (r) wynosi: gdzie: r = 11 mg/l.
\nV — oznacza obj´toÊç koƒcowà w ml (2,95 ml), v — oznacza obj´toÊç badanej próbki w ml (0,1 ml), PM — oznacza ci´˝ar czàsteczkowy oznaczanej substancji (dla kwasu D-jab∏kowego PM = 134,09), d — oznacza d∏ugoÊç drogi optycznej kuwety w cm ∆A = (A2 — A1)próbki — (A2 — A1)próby Êlepej ε — oznacza wspó∏czynnik absorbancji NADH, który przy:
\nJe˝eli próbka zosta∏a rozcieƒczona w trakcie przygotowywania, wynik nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
\nZawartoÊç kwasu D-jab∏kowego w mg/l z dok∏adnoÊcià do jednoÊci. podaje si´ 6. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna 7. ODTWARZALNOÂå METODY OdtwarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w ró˝nych laboratoriach, przez ró˝nych analityków, z u˝yciem ró˝nego sprz´tu.
\nW przypadku oznaczania kwasu D-jab∏kowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi:
\nR = 20 mg/l.
\nW celu unikni´cia mo˝liwoÊci zatrzymania aktywnoÊci enzymatycznej przez polifenole zawartoÊç próbki wina w kuwecie nie powinna przekraczaç 0,1 ml.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8357 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 21 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU JAB¸KOWEGO OGÓ¸EM Kwas jab∏kowy, rozdzielony metodà chromatografii anionowymiennej, jest oznaczany kolorymetrycznie w eluacie, przez pomiar barwy ˝ó∏tej, tworzàcej si´ w reakcji z kwasem chromotropowym w obecnoÊci st´˝onego kwasu siarkowego. Poprawka na obecnoÊç substancji przeszkadzajàcych jest dokonywana przez odj´cie absorbancji uzyskanej w reakcji prowadzonej z 86 % kwasem siarkowym i kwasem chromotropowym (kwas jab∏kowy nie reaguje przy takim st´˝eniu kwasu) od absorbancji uzyskanej przy u˝yciu kwasu siarkowego o st´˝eniu 96 %.
\nTak przygotowanà kolumn´ zalewa si´ kwasem octowym o st´˝eniu 30 % wagowych, który sàczy si´ do chwili, gdy górny poziom cieczy w kolumnie znajdzie si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy. Przemywanie kwasem octowym wykonuje si´ dwukrotnie. Przed u˝yciem kolumn´ pozostawia si´ na co najmniej 24 godziny. Do rozpocz´cia nast´pnej analizy pozostawia si´ kolumn´ zalanà kwasem octowym o st´˝eniu 30 % wagowych.
\nPrzygotowanie kolumny z ˝ywicà jonowymiennà 2. ODCZYNNIKI Na dnie kolumny (o Êrednicy 11 mm i wysokoÊci 300 mm), nad kranem, umieszcza si´ zatyczk´ z waty bawe∏nianej. Nast´pnie wlewa si´ zawiesin´ ˝ywicy jonowymiennej do wysokoÊci 10 cm. Po czym otwiera si´ kran i powoli spuszcza roztwór kwasu octowego do chwili, gdy górny poziom cieczy w kolumnie znajdzie si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy. Nast´pnie kolumn´ przemywa si´ 50 ml porcjami 0,5 % kwasu octowego.
\nRozdzia∏ kwasu DL-jab∏kowego
\nPrzed ka˝dym oznaczaniem przygotowuje si´ Êwie˝y roztwór przez rozpuszczenie 500 mg chromotropianu sodu (C10H6Na2O8 S2⋅2H20) w 10 ml wody destylowanej;
\nDo tej kolumny wlewa si´ zawiesin´ ˝ywicy jonowy- Do kolumny wlewa si´ 10 ml wina lub moszczu.
\nPróbk´ sàczy si´ przez kolumn´ z takà pr´dkoÊcià, aby z kolumny wyp∏ywa∏y pojedyncze krople (Êrednia pr´dkoÊç: kropla na sekund´), i zamyka kran w chwili, gdy górny poziom cieczy znajdzie si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy. Nast´pnie kolumn´ przemywa si´ za pomocà 50 ml 0,5 % kwasu octowego i 50 ml wody destylowanej, po czym ciecz sàczy si´ przez kolumn´ do chwili, gdy górny poziom cieczy znajdzie si´ 2 do 3 mm nad warstwà ˝ywicy.
\nKwasy zaabsorbowane przez ˝ywic´ jonowymiennà eluuje si´ roztworem siarczanu sodu. Eluat zbiera si´ w kolbie miarowej na 100 ml.
\nPo skoƒczonym rozdziale kolumn´ regeneruje si´.
\nOznaczanie kwasu jab∏kowego Dwie próbówki, z szyjkà szerokà, o pojemnoÊci 30 ml (i z doszlifowanym korkiem) oznacza si´ jako A i B. Do ka˝dej z nich wprowadza si´ 1 ml eluatu i 1 ml kwasu chromotropowego. Nast´pnie dodaje si´:
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8358 — Próbówki zamyka si´ korkiem i miesza przez wytrzàsanie, uwa˝ajàc, aby nie zamoczyç korka. Nast´pnie próbówki zanurza si´ we wrzàcej ∏aêni wodnej na 10 minut, po czym och∏adza si´ je w ciemnoÊci w temperaturze 20 °C przez 90 minut. Natychmiast mierzy si´ absorbancj´ badanej próbki w stosunku do próbki odniesienia przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 420 nm w kuwetach o d∏ugoÊci drogi optycznej wynoszàcej 1 cm.
\nSporzàdzanie roboczych roztworów wzorcowych Do czterech kolb miarowych o pojemnoÊci 50 ml odmierza si´ pipetà odpowiednio 5; 10; 15 i 20 ml roztworu kwasu jab∏kowego. Kolby uzupe∏nia si´ do 50 ml roztworem siarczanu sodowego. Uzyskane robocze roztwory wzorcowe odpowiadajà eluatom otrzymanym z wina zawierajàcego odpowiednio 0,5; 1,0; 1,5 i 2,0 g/l kwasu jab∏kowego.
\nWykreÊlanie krzywej wzorcowej Do próbówek, z szyjkà szerokà i z doszlifowanym korkiem, o pojemnoÊci 30 ml, wprowadza si´ po 1 ml roboczego roztworu wzorcowego i 1 ml kwasu chromotropowego. Nast´pnie dodaje si´ 10 ml kwasu siarkowego (96 %). Próbówki zamyka si´ korkiem i miesza przez wytrzàsanie, uwa˝ajàc, aby nie zamoczyç korka.
\nNast´pnie próbówki zanurza si´ we wrzàcej ∏aêni wodnej na 10 minut, po czym och∏adza si´ je w ciemnoÊci w temperaturze 20 °C przez 90 minut. Natychmiast mierzy si´ absorbancj´ badanej próbki w stosunku do próbki odniesienia (1 ml eluatu, 1 ml kwasu chromotropowego i 10 ml kwasu siarkowego 86 %) przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 420 nm w kuwetach o d∏ugoÊci drogi optycznej wynoszàcej 1 cm.
\nNast´pnie sporzàdza si´ krzywà wzorcowà w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza wartoÊç absorbancji, c — oznacza st´˝enie kwasu jab∏kowego w roboczych roztworach wzorcowych w g/l. Wykres absorbancji ma Poz. 1173 postaç linii prostej przechodzàcej przez poczàtek uk∏adu wspó∏rz´dnych.
\nW przypadku oznaczania kwasu jab∏kowego powtarzalnoÊç (r) wynosi:
\nW przypadku oznaczania kwasu jab∏kowego odtwarzalnoÊç (R) wynosi:
\nR = 0,3 g/l.
\nZa∏àcznik nr 22 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU SORBOWEGO Metoda spektrofotometrii absorpcyjnej w nadfiolecie 1. ODCZYNNIKI Kwas sorbowy (kwas trans, trans, 2,4-heksadienowy), wydzielony metodà destylacji z parà wodnà, oznacza si´ w destylacie wina metodà spektrofotometrii w nadfiolecie. Substancje, które zak∏ócajà pomiar w nadfiolecie, usuwa si´ przez odparowanie do sucha z zastosowaniem lekko alkalicznego wodorotlenku wapnia. Przy stwierdzeniu w badanej próbce zawartoÊci kwasu sorbowego w iloÊci poni˝ej 20 mg/l przeprowadza si´ dla potwierdzenia wyniku chromatografi´ cienkowarstwowà.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8359 — 2. APARATURA I SPRZ¢T
\nPoz. 1173 bowego w roztworze, wyra˝onà w mg na litr, którego u˝yto do pomiaru spektrofotometrycznego.
\nPrzygotowanie krzywej wzorcowej Wzorcowy roztwór kwasu sorbowego rozcieƒcza si´, uzyskujàc w ten sposób cztery robocze roztwory wzorcowe, zawierajàce odpowiednio 0,5 mg, 1,0 mg, 2,5 mg i 5,0 mg kwasu sorbowego w litrze. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ roztworów za pomocà spektrofotometru przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 256 nm. Pierwszy pomiar nale˝y przeprowadziç na próbie Êlepej sporzàdzonej z wody destylowanej. Po dokonaniu pomiaru wykreÊla si´ krzywà wzorcowà dla roboczych roztworów wzorcowych w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza st´˝enie kwasu sorbowego w roboczych roztworach wzorcowych w mg/l. Wykres jest zale˝noÊcià liniowà.
\nOznaczanie W parownicy o Êrednicy 55 mm umieszcza si´ 5 ml destylatu i dodaje si´ 1 ml roztworu wodorotlenku wapnia Ca(OH)2, a zawartoÊç parownicy odparowuje si´ do sucha na ∏aêni wodnej.
\nPozosta∏oÊç z odparowania rozpuszcza si´ w kilku ml wody destylowanej i przenosi si´ bez strat do kolby miarowej o pojemnoÊci 20 ml, nast´pnie uzupe∏nia si´ do 20 ml wodà u˝ywanà do przep∏ukiwania.
\nAbsorbancj´ mierzy si´ przy d∏ugoÊci fali 256 nm za pomocà spektrofotometru, jako próby Êlepej u˝ywa si´ roztworu, który otrzymuje si´ przez rozcieƒczenie 1 ml roztworu wodorotlenku wapnia Ca(OH)2 wodà do obj´toÊci 20 ml.
\nDla zmierzonej wartoÊci absorbancji odczytuje si´ na krzywej wzorcowej zawartoÊç (C) kwasu sorbowego w roztworze.
\nObliczanie wyniku oznaczania ZawartoÊç kwasu sorbowego w winie, w mg na litr, wynosi 100 x C, gdzie C oznacza zawartoÊç kwasu sor- 1. ODCZYNNIKI
\nMo˝liwe jest u˝ycie kolumn innego rodzaju, a szczególnie kolumny kapilarnej.
\nPo zmieszaniu roztworów, przez kilkakrotne odwracanie próbówki dnem do góry, dodaje si´ 10 ml eteru etylowego (C2H5)2O. Kwas sorbowy ekstrahuje si´ do Dziennik Ustaw Nr 126 — 8360 — fazy organicznej, wstrzàsajàc próbówkà przez 5 minut, nast´pnie próbk´ odstawia si´ do rozdzielenia faz.
\nPrzygotowanie roztworu wzorcowego Do przygotowania roztworu wzorcowego wybiera si´ wino, którego chromatogram ekstraktu eterowego nie wykazuje piku odpowiadajàcego kwasowi sorbowemu. Do wina dodaje si´ kwas sorbowy w iloÊci 100 mg na litr, nast´pnie 20 ml. Tak przygotowane próbki poddaje si´ obróbce.
\nRozdzia∏ chromatograficzny 3. WYKONANIE OZNACZANIA Do chromatografu przy u˝yciu mikrostrzykawki wprowadza si´ kolejno 2 µl fazy eterowej.
\nPrzygotowanie próbki do analizy Rejestrujàc odpowiednie chromatogramy, sprawdza si´ zgodnoÊç czasów retencji kwasu sorbowego i wzorca wewn´trznego. Nast´pnie mierzy si´ wysokoÊç lub powierzchni´ ka˝dego zarejestrowanego piku.
\nObliczanie wyniku oznaczania ZawartoÊç kwasu sorbowego (C) w analizowanym winie, wyra˝onà w mg na litr, oblicza si´ wed∏ug wzoru:
\nC = 100 × (h : H) × (I : i), Poz. 1173 Do szklanej próbówki o pojemnoÊci oko∏o 25 ml, z doszlifowanym korkiem szklanym, odmierza si´ 10 ml wina. Dodaje si´ 1 ml rozcieƒczonego kwasu siarkowego oraz 5 ml eteru etylowego, nast´pnie zawartoÊç próbówki miesza si´ przez kilkakrotne odwracanie próbówki dnem do góry i pozostawia do rozdzielenia faz.
\nPrzygotowanie rozcieƒczonego roztworu wzorcowego Z wzorcowego roztworu kwasu sorbowego przygotowuje si´ 5 rozcieƒczonych roztworów wzorcowych zawierajàcych odpowiednio 2, 4, 6, 8 i 10 mg kwasu sorbowego w litrze. gdzie:
\nH — oznacza wysokoÊç piku kwasu sorbowego w roztworze wzorcowym, h — oznacza wysokoÊç piku kwasu sorbowego w analizowanej próbce, I — oznacza wysokoÊç piku wzorca wewn´trznego w roztworze wzorcowym.
\nZawartoÊç kwasu sorbowego jest mo˝liwa do obliczenia w analogiczny sposób przez okreÊlenie wielkoÊci powierzchni pików.
\nWykrywanie Êladowych iloÊci kwasu sorbowego metodà chromatografii cienkowarstwowej Kwas sorbowy, wyekstrahowany octanem etylu, rozdziela si´ metodà chromatografii cienkowarstwowej, a jego zawartoÊç oznacza si´ pó∏iloÊciowo.
\nRozdzia∏ chromatograficzny Za pomocà mikropipety lub mikrostrzykawki nanosi si´ 5 µl przygotowanej fazy eterowej i 5 µl ka˝dego z rozcieƒczonych roztworów wzorcowych w punktach oddalonych o 2 cm od dolnej kraw´dzi p∏ytki i 2 cm od siebie nawzajem.
\nDo komory chromatograficznej wlewa si´ faz´ ruchomà odpowiednio do wysokoÊci oko∏o 0,5 cm i pozostawia si´ do nasycenia komory parami rozpuszczalnika. Nast´pnie p∏ytk´ umieszcza si´ w komorze. Chromatogram rozwija si´ na drodze od 12 cm do 15 cm (czas rozwijania oko∏o 30 minut). Nast´pnie p∏ytk´ osusza si´ w strumieniu ch∏odnego powietrza, a chromatogram oglàda si´ pod promiennikiem nadfioletu przy 254 nm.
\nInterpretacja oznaczania
\nPó∏iloÊciowe oznaczenie kwasu sorbowego w st´˝eniu od 2 do 10 mg na litr ustala si´ przez porównanie nat´˝enia barwy plam uzyskanych w wyniku rozdzia∏u próbki z intensywnoÊcià plam roztworów wzorcowych.
\nSt´˝enie 1 mg na litr oznacza si´, nanoszàc na p∏ytk´ 10 µl roztworu badanej próbki.
\nKwas sorbowy o st´˝eniu powy˝ej 10 mg na litr oznacza si´, nanoszàc na p∏ytk´ mniej ni˝ 5 µl roztworu badanej próbki odmierzonego mikrostrzykawkà.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8361 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 23 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KWASU L-ASKORBINOWEGO Metoda umo˝liwia oznaczanie kwasu L-askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego obecnego w winie lub moszczu.
\nKwas L-askorbinowy jest utleniany na w´glu aktywnym do kwasu dehydroaskorbinowego. Ten ostatni daje zwiàzek fluorescencyjny w reakcji z ortofenylenodiaminà (OPDA). Próba kontrolna w obecnoÊci kwasu borowego umo˝liwia oznaczanie fluorescencji zak∏ócanej przez wytworzenie kompleksu kwasu borowego z kwasem dehydroaskorbinowym i odj´cie wyniku uzyskanego w tej próbie od wyniku oznaczania.
\nPrzygotowanie próbki Pobranà próbk´ wina albo moszczu rozcieƒcza si´ 56 % roztworem kwasu octowego w kolbie miarowej o pojemnoÊci 100 ml, w celu uzyskania roztworu o zawartoÊci kwasu L-askorbinowego od 0 do 60 mg/l, nast´pnie dok∏adnie miesza si´ zawartoÊç kolby i dodaje si´ 2 g w´gla aktywnego. Tak przygotowanà próbk´ odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, nast´pnie zawartoÊç próbki przesàcza si´ przez zwyk∏à bibu∏´ filtracyjnà, odrzucajàc kilka pierwszych mililitrów przesàczu.
\nPróbka Êlepa Do kolby miarowej o pojemnoÊci 100 ml wprowadza si´ po 5 ml przesàczu, nast´pnie dodaje si´ 5 ml roztworu mieszaniny kwasu borowego i octanu sodu.
\nPróbka badana Do kolby miarowej o pojemnoÊci 100 ml wprowadza si´ po 5 ml przesàczu, nast´pnie dodaje si´ 5 ml roztworu octanu sodu.
\nTak przygotowane próbki odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do 100 ml.
\nZ ka˝dej kolby pobiera si´ po 2 ml roztworu, nast´pnie dodaje si´ 5 ml roztworu dwuchlorowodorku ortofenylenodiaminy i dok∏adnie miesza si´. Reakcj´ prowadzi si´ przez oko∏o 30 minut. Po up∏ywie 30 minut, gdy barwa roztworu pociemnieje, przeprowadza si´ pomiar fluorometryczny.
\nPrzygotowanie krzywej wzorcowej Do trzech kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml odmierza si´ odpowiednio 2 ml, 4 ml i 6 ml wzorcowego roztworu kwasu L-askorbinowego, nast´pnie uzupe∏nia si´ do 100 ml roztworem kwasu octowego i dok∏adnie miesza si´. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà 2, 4 i 6 mg kwasu L-askorbinowego w 100 ml.
\nDo ka˝dej kolby dodaje si´ 2 g w´gla aktywnego i odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu. Tak przygotowane roztwory wzorcowe sàczy si´ przez zwyk∏à bibu∏´ filtracyjnà, odrzucajàc kilka pierwszych mililitrów przesàczu.
\nNast´pnie odmierza si´ 5 ml ka˝dego przesàczu do trzech kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml (pierwsza seria) — próbka Êlepa. CzynnoÊç t´ nale˝y powtórzyç drugi raz w celu otrzymania drugiej serii wyników dla trzech kolb miarowych.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8362 — Do ka˝dej z kolb pierwszej serii, które odpowiadajà próbie Êlepej, dodaje si´ 5 ml roztworu kwasu borowego i kwasu octowego, natomiast do ka˝dej z kolb stanowiàcych drugà seri´ dodaje si´ 5 ml roztworu octanu sodu.
\nKolby z dwóch serii odstawia si´ na 15 minut, mieszajàc od czasu do czasu, nast´pnie uzupe∏nia si´ wodà destylowanà do 100 ml.
\nZ ka˝dej kolby pobiera si´ 2 ml roztworu oraz dodaje si´ 5 ml roztworu dwuchlorowodorku ortofenylenodiaminy, miesza si´ i prowadzi reakcj´ przez oko∏o 30 minut do pociemnienia barwy roztworu, nast´pnie przeprowadza si´ pomiar fluorometryczny.
\nPoz. 1173 wiednià próbk´ wzorcowà. Nast´pnie mierzy si´ nat´˝enie fluorescencji ka˝dego roztworu wzorcowego i badanej próbki.
\nPo dokonaniu pomiaru wykreÊla si´ krzywà wzorcowà w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza nat´˝enie fluorescencji, c — oznacza st´˝enie kwasu L-askorbinowego. Wykres ma postaç linii prostej przechodzàcej przez poczàtek uk∏adu wspó∏rz´dnych.
\nDla wartoÊci fluorescencji badanej próbki z krzywej wzorcowej odczytuje si´ zawartoÊç (C) kwasu L-askorbinowego + kwasu dehydroaskorbinowego w badanym roztworze.
\nObliczanie wyniku oznaczania Wykonanie pomiaru fluorometrycznego Dla roztworu, którego u˝ywa si´ do przygotowania krzywej wzorcowej, oraz dla roztworu badanego ustawia si´ zero na skali pomiarowej, wykorzystujàc odpo- ZawartoÊç kwasu L-askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego w winie w mg na litr oblicza si´, mno˝àc uzyskanà z pomiaru fluorometrycznego wartoÊç (C) przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
\nZa∏àcznik nr 24 OZNACZANIE WARTOÂCI pH Metoda oznaczania pH polega na pomiarze ró˝nicy potencja∏u mi´dzy dwoma elektrodami zanurzonymi w badanej cieczy. Jedna elektroda wykazuje potencja∏, który jest funkcjà wartoÊci pH cieczy, natomiast druga elektroda b´dàca elektrodà odniesienia wykazuje sta∏y i znany potencja∏. ranu(V)dipotasu (K2HPO4) rozpuszcza si´ w wodzie i uzupe∏nia si´ wodà do 1000 ml. Tak sporzàdzony roztwór przechowuje si´ nie d∏u˝ej ni˝ dwa miesiàce, o pH: — 6,90 w temperaturze 15 °C, — 6,88 w temperaturze 20 °C, 1. ODCZYNNIKI — 6,86 w temperaturze 25 °C, Roztwory buforowe: — 6,85 w temperaturze 30 °C.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8363 — Zerowanie aparatu Aparat zeruje si´ przed ka˝dym pomiarem.
\nPoz. 1173 najmniej odbiegaç od 20 °C. Nast´pnie odczytuje si´ wartoÊç pH na skali pehametru.
\nKalibracja pehametru Wykonuje si´ co najmniej dwa równoleg∏e oznaczania badanej próbki.
\nPehametr skaluje si´ w temperaturze 20 °C, stosujàc roztwory buforowe o pH = 6,88 i pH = 3,57 o temperaturze 20 °C. Do sprawdzenia kalibracji skali u˝ywa si´ roztworu buforowego o pH = 4,00 o temperaturze 20 °C.
\nWynik koƒcowy oblicza si´ jako Êrednià arytmetycznà z dwóch oznaczaƒ.
\nWykonanie oznaczania Obliczanie wyniku oznaczania Elektrod´ zanurza si´ w badanej próbce, której temperatura wynosi od 20 °C do 25 °C, temperatura ma jak WartoÊç pH moszczu lub wina podaje si´ z dok∏adnoÊcià do dwóch miejsc po przecinku.
\nZa∏àcznik nr 25 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI DWUTLENKU SIARKI Wolny dwutlenek siarki jest to dwutlenek siarki obecny w moszczu lub winie w formie kwasu siarkawego (H2SO3) lub powstajàcej z jego rozpadu czàsteczki HSO3. Równowaga mi´dzy tymi dwoma postaciami jest funkcjà pH i temperatury:
\nH2SO3 <=> H+ + HSO3 H2SO3 jest czàsteczkowym dwutlenkiem siarki.
\nDwutlenek siarki ogó∏em sà to wszystkie formy dwutlenku siarki obecne w winie, zarówno w stanie wolnym, jak i zwiàzane ze sk∏adnikami wina.
\nOznaczanie wolnego dwutlenku siarki Przed wykonaniem oznaczania wino przechowuje si´ w ca∏kowicie nape∏nionej butelce w temperaturze 20 °C przez dwa dni.
\nDo barbotera odmierza si´ 2 ml do 3 ml roztworu nadtlenku wodoru i dwie krople wskaênika, po czym zoboj´tnia si´ roztwór nadtlenku wodoru 0,01-molowym roztworem wodorotlenku sodu, nast´pnie barboter przy∏àcza si´ do aparatu.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8364 — Do kolby wprowadza si´ 50 ml próbki i 15 ml kwasu fosforowego, nast´pnie kolb´ przy∏àcza si´ do aparatu.
\nPrzez 15 minut przez aparat przepuszcza si´ powietrze lub azot. Wolny dwutlenek siarki wydzielajàcy si´ z próbki utlenia si´ do kwasu siarkowego. Nast´pnie barboter od∏àcza si´ od aparatu, a powsta∏y kwas siarkowy miareczkuje si´ 0,01-molowym roztworem wodorotlenku sodu.
\nObliczanie wyniku oznaczania IloÊç uwolnionego dwutlenku siarki podaje si´ w mg/l, zaokràglajàc wynik do liczby ca∏kowitej.
\nZawartoÊç wolnego dwutlenku siarki w miligramach na litr wynosi 6,4 n, gdzie n oznacza iloÊç ml 0,01-molowego roztworu wodorotlenku sodu zu˝ytego do miareczkowania.
\nOznaczanie dwutlenku siarki ogó∏em Je˝eli oczekiwana zawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em w próbce nie jest wi´ksza ni˝ 50 mg na litr, do kolby odmierza si´ 50 ml próbki i 15 ml 85 % kwasu fosforowego, nast´pnie kolb´ przy∏àcza si´ do aparatu.
\nJe˝eli szacunkowa zawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em w próbce jest wi´ksza ni˝ 50 mg na litr, do kolby odmierza si´ 20 ml próbki i 5 ml 85 % kwasu fosforowego, nast´pnie kolb´ przy∏àcza si´ do aparatu.
\nDo barbotera odmierza si´ 2 ml do 3 ml roztworu nadtlenku wodoru, zoboj´tnionego w opisany sposób, nast´pnie wino w kolbie doprowadza si´ do wrzenia za pomocà p∏omienia o wysokoÊci 4 cm do 5 cm dotykajàcego dna kolby. Nie nale˝y umieszczaç kolby na p∏ytce metalowej, lecz na krà˝ku z otworem o Êrednicy oko∏o 30 mm, co zapobiega przegrzaniu substancji wydzielanych z wina, które osadzajà si´ na Êciankach kolby.
\nPróbk´ utrzymuje si´ w stanie wrzenia, przepuszczajàc przez nià strumieƒ powietrza lub azotu. W czasie 15 minut wydziela si´ i utlenia z próbki ca∏oÊç dwutlenku siarki wolnego i zwiàzanego. IloÊç wytworzonego kwasu siarkowego oblicza si´, miareczkujàc 0,01-molowym roztworem wodorotlenku sodu.
\nObliczanie wyniku oznaczania ZawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em wyra˝a si´ w mg/l.
\nZawartoÊç dwutlenku siarki ogó∏em w miligramach na litr wynosi: — 6,4 n dla próbki o niskiej zawartoÊci dwutlenku siarki w przypadku, gdy obj´toÊç badanej próbki wynosi 50 ml, — 16 n dla pozosta∏ych próbek w przypadku, gdy obj´toÊç badanej próbki wynosi 20 ml, gdzie n oznacza iloÊç ml roztworu wodorotlenku sodu zu˝ytego do miareczkowania.
\nPoz. 1173 4. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
\nW przypadku powy˝szego oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi:
\nW przypadku powy˝szego oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi:
\nCzàsteczkowy dwutlenek siarki Procentowy udzia∏ czàsteczkowego dwutlenku siarki H2SO3 w wolnym dwutlenku siarki oblicza si´ jako funkcj´ pH, zawartoÊci alkoholu i temperatury.
\nDla danej temperatury i zawartoÊci alkoholu:
\nH2SO3 <=> H+ + HSO3– L [H2SO3] = —————— (1) 10’ pH pKM+ I gdzie: — A√ Ι pKM = pK T – ———— — I + B√ Ι L = [H2SO3] + [HSO3–], gdzie:
\nI — oznacza si∏´ jonowà, A — oznacza wspó∏czynnik zale˝ny od temperatury, B — oznacza wspó∏czynnik zale˝ny od zawartoÊci alkoholu, KT — oznacza termodynamicznà sta∏à dysocjacji — wartoÊci KT dla ró˝nej temperatury i ró˝nej mocy alkoholowej sà podane w tabeli 1, KM — oznacza mieszanà sta∏à dysocjacji.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8365 — Dla Êredniej wartoÊci si∏y jonowej I = 0,038 w tabeli 2 jest podana wartoÊç pKM dla ró˝nej temperatury i zawartoÊci alkoholu. ZawartoÊç czàsteczkowego dwutlenku siarki obliczona na podstawie wzoru (1) jest podana w tabeli 3 dla ró˝nej wartoÊci pH, temperatury i zawartoÊci alkoholu.
\nPoz. 1173 ry T °C obliczona na podstawie znanej wartoÊci pH wina i zawartoÊci alkoholu.
\nZawartoÊç czàsteczkowego w mg/l wynosi: dwutlenku siarki X × C, Obliczanie wyniku oznaczania W tabeli 3 jest podana procentowa zawartoÊç czàsteczkowego dwutlenku siarki (X) dla temperatu- gdzie C — oznacza zawartoÊç wolnego dwutlenku siarki w mg/l.
\nTABELA 1 WartoÊci termodynamicznej sta∏ej dysocjacji pKT TABELA 2 WartoÊci mieszanej sta∏ej dysocjacji pKM (I = 0,038) Dziennik Ustaw Nr 126 — 8366 — Poz. 1173 TABELA 3 Procentowa zawartoÊç czàsteczkowego dwutlenku siarki w stosunku do wolnego dwutlenku siarki Dziennik Ustaw Nr 126 — 8367 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 26 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SODU ZawartoÊç sodu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej po dodaniu chlorku cezu (CsCl) w celu przeciwdzia∏ania jonizacji sodu.
\nPomiary si´ powtarza.
\nObliczanie wyniku oznaczania Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç sodu w roztworach wzorcowych w mg/l.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) sodu w miligramach na litr.
\nOznaczanie ZawartoÊç sodu w miligramach na litr wina wynosi 20 X C i jest wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej. do
\nW przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi:
\nPipetà przenosi si´ 2,5 ml wina do kolby miarowej o pojemnoÊci 50 ml, nast´pnie dodaje si´ 1 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia si´ do 50 ml wodà destylowanà. xi — oznacza zawartoÊç sodu w próbce w mg/l.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml przenosi si´ 5,0 ml roztworu matrycy i dodaje si´ odpowiednio 0 ml; 2,5 ml; 5,0 ml; 7,5 ml i 10,0 ml roztworu sodu o st´˝eniu 1 g/l, rozcieƒczonego uprzednio w stosunku 1:100. Nast´pnie do ka˝dej kolby dodaje si´ 2 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia si´ do 100 ml wodà destylowanà.
\nPrzygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio 0 mg; 0,25 mg; 0,50 mg;
\n0,75 mg i 1,00 mg sodu na litr i 1 g cezu w litrze. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
\nW przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi:
\nR = 2,5 + 0,05 xi (mg/l), gdzie: xi — oznacza zawartoÊç sodu w próbce w mg/l.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8368 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 27 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI POTASU ZawartoÊç potasu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej, dodajàc chlorku cezu (CsCl) w celu przeciwdzia∏ania jonizacji potasu.
\nOznaczanie D∏ugoÊç fali ustawia si´ na 769,9 nm, nast´pnie ustawia si´ zero na skali absorbancji, stosujàc roztwór wzorcowy zawierajàcy 1 g cezu w litrze, bez zawartoÊci sodu. Do palnika spektrofotometru absorbcji atomowej wprowadza si´ próbk´ bezpoÊrednio rozcieƒczonego wina, a nast´pnie roztwory wzorcowe. Oznaczanie koƒczy si´ odczytaniem absorbancji. Wszystkie pomiary powtarza si´ dwa razy.
\nObliczanie wyniku oznaczania Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç potasu w roztworach wzorcowych w mg/l.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) potasu w miligramach na litr.
\nZawartoÊç potasu w miligramach na litr wina, wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej, wynosi F × C, gdzie F jest wspó∏czynnikiem rozcieƒczenia (w tym przypadku 200).
\nMo˝liwe jest wyra˝enie wyniku w: — miligramorównowa˝nikach na litr: 0,0256 × F × C albo — miligramach wodorowinianu 4,813 x F x C. potasu na litr:
\nPrzygotowanie próbki Do kolby miarowej o pojemnoÊci 50 ml przenosi si´ pipetà 2,5 ml wina (rozcieƒczonego uprzednio wodà w stosunku 1:10), nast´pnie dodaje si´ 1 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia wodà destylowanà do 50 ml.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml przenosi si´ 5,0 ml roztworu modelowego (matryca) i dodaje si´ odpowiednio 0 ml; 2,0; 4,0 ml; 6,0 ml i 8,0 ml roztworu potasu o st´˝eniu 1 g/l (rozcieƒczonego uprzednio w stosunku 1:10). Nast´pnie do ka˝dej kolby dodaje si´ 2 ml roztworu chlorku cezu i uzupe∏nia wodà destylowanà do 100 ml.
\nPrzygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio 1 g cezu w litrze oraz 2 mg, 4 mg, 6 mg i 8 mg potasu na litr, a piàty roztwór wzorcowy nie zawiera potasu. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
\nW przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi: 35 mg/l.
\nW przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi: 66 mg/l.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8369 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 28 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI MAGNEZU ZawartoÊç magnezu oznacza si´ bezpoÊrednio w odpowiednio rozcieƒczonym winie metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej.
\nNast´pnie odczytuje si´ absorbancj´ i powtarza wszystkie pomiary dwa razy.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) magnezu w miligramach na litr.
\nZawartoÊç magnezu w miligramach na litr wina jest wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej i wynosi 100 × C.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Do ka˝dej z czterech kolb miarowych o pojemnoÊci 100 ml przenosi si´ odpowiednio 5 ml, 10 ml, 15 ml i 20 ml rozcieƒczonego wzorcowego roztworu magnezu i uzupe∏nia do 100 ml wodà destylowanà. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio 0,25 mg; 0,50 mg; 0,75 mg i 1,0 mg magnezu na litr. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
\nOznaczanie D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 285 nm. Zero ustawia si´ na skali absorbancji, stosujàc wod´ destylowanà. Do palnika spektrofotometru absorpcji atomo- PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
\nW przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi 3 mg/l.
\nW przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi 8 mg/l.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8370 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 29 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI WAPNIA ZawartoÊç wapnia oznacza si´ metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej bezpoÊrednio w odpowiednio rozcieƒczonym winie, dodajàc czynnik zmniejszajàcy jonizacj´.
\nOznaczanie D∏ugoÊç fali ustawia si´ na 422,7 nm. Zero na skali absorbancji ustawia si´, stosujàc roztwór zawierajàcy 5 g lantanu na litr (przygotowanie roztworów wzorcowych). Do palnika spektrofotometru absorpcji atomowej wprowadza si´ bezpoÊrednio rozcieƒczone wino, a nast´pnie kolejno pi´ç roztworów wzorcowych sporzàdzonych w podany sposób. Odczytuje si´ absorbancj´ i powtarza wszystkie pomiary dwa razy.
\nSporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç sodu w roztworach wzorcowych w mg/l.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) wapnia w miligramach na litr.
\nW przypadku win s∏odkich st´˝enie 5 g lantanu w litrze jest wystarczajàce, o ile w wyniku rozcieƒczania zawartoÊç cukrów nie spadnie poni˝ej 2,5 g na litr.
\nW przypadku win o wi´kszym st´˝eniu cukrów zwi´ksza si´ st´˝enie lantanu do 10 g na litr.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Do ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych na 100 ml przenosi si´ odpowiednio 0 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml i 20 ml rozcieƒczonego wzorcowego roztworu wapnia, dodaje si´ 10 ml roztworu lantanu i uzupe∏nia do 100 ml wodà destylowanà. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio 0; 0,25; 5,0; 7,5;
\n10 mg wapnia na litr, ka˝dy roztwór zawiera 5 g lantanu na litr. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
\nZawartoÊç wapnia w miligramach na litr wina wynosi 20 x C i jest wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej.
\nW przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi:
\nW przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi 0,114 xi — 0,5, gdzie: xi — oznacza zawartoÊç wapnia w próbce w mg/l.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8371 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 30 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI ˚ELAZA Po odpowiednim rozcieƒczeniu wina i usuni´ciu alkoholu zawartoÊç ˝elaza oznacza si´ bezpoÊrednio metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej.
\nJe˝eli potrzeba, próbk´ rozcieƒcza si´ przed oznaczaniem, podajàc wspó∏czynnik rozcieƒczenia (F).
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych 1. ODCZYNNIKI
\nDo ka˝dej z pi´ciu kolb miarowych na 100 ml przenosi si´ odpowiednio 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml i 5 ml roztworu ˝elaza o st´˝eniu 100 mg na litr i uzupe∏nia do 100 ml wodà destylowanà. Przygotowane w ten sposób roztwory wzorcowe zawierajà odpowiednio 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg i 5 mg ˝elaza w litrze. Roztwory przechowuje si´ w butelkach z polietylenu.
\nOznaczanie D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 248,3 nm. Zero na skali absorbancji spektrofotometru ustawia si´ w stosunku do wody destylowanej. Do palnika spektrofotometru wprowadza si´ bezpoÊrednio rozcieƒczonà próbk´, a nast´pnie kolejno pi´ç roztworów wzorcowych. Odczytuje si´ absorbancj´ i powtarza wszystkie pomiary.
\nObliczanie wyniku oznaczania
\nSporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç ˝elaza w roztworach wzorcowych w mg/l. Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) ˝elaza w miligramach na litr. ZawartoÊç ˝elaza w miligramach na litr wina, wyra˝ana w zaokràgleniu do liczby ca∏kowitej, wynosi F x C, gdzie F — jest wspó∏czynnikiem rozcieƒczenia.
\nZa∏àcznik nr 31 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI MIEDZI Metoda opiera si´ na zastosowaniu spektrofotometrii absorpcji atomowej.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8372 —
\nPoz. 1173 Dla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) miedzi w miligramach na litr.
\nJe˝eli F jest wspó∏czynnikiem rozcieƒczenia, zawartoÊç miedzi, podawana w miligramach na litr z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków po przecinku, wynosi F x C.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Do trzech kolb miarowych na 100 ml przenosi si´ odpowiednio 0,5 ml, 1 ml i 2 ml roztworu miedzi (100 mg miedzi w litrze) i uzupe∏nia wodà redestylowanà; przygotowane w ten sposób roztwory zawierajà odpowiednio 0,5 mg, 1 mg i 2 mg miedzi w litrze.
\nPomiary absorbancji wykonuje si´ przy 324,8 nm.
\nNa skali spektrofotometru absorbancji atomowej ustawia si´ zero dla wody redestylowanej. Wykonuje si´ kolejno bezpoÊrednie pomiary absorbancji roztworów wzorcowych przygotowanych w opisany sposób, nast´pnie wykonuje si´ dwa równoleg∏e oznaczania.
\nSt´˝enia roztworów do wyznaczania krzywej wzorcowej i rozcieƒczenie próbki dobiera si´ w∏aÊciwie do czu∏oÊci u˝ywanego spektrofotometru absorbancji atomowej oraz do zawartoÊci miedzi w badanej próbce.
\nJe˝eli w badanej próbce oczekiwana zawartoÊç miedzi jest bardzo ma∏a, post´puje si´ nast´pujàco: w naczynku platynowym umieszcza si´ 100 ml próbki i odparowuje na ∏aêni wodnej o temperaturze 100 °C do konsystencji syropu. Nast´pnie dodaje si´ po kropli 2,5 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 %, ca∏kowicie pokrywajàc cieczà dno naczynka. Ostro˝nie spopiela si´ pozosta∏oÊç na elektrycznej p∏ytce grzejnej lub w niskim p∏omieniu palnika, a nast´pnie wk∏ada naczynko do pieca muflowego o temperaturze 500±25 °C i pozostawia na oko∏o jednà godzin´. Po wystudzeniu popió∏ zwil˝a si´ 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 %, rozkruszajàc próbk´ szklanà bagietkà, pozostawia mieszanin´ do odparowania i spopiela jak uprzednio. Ponownie umieszcza si´ naczynko w piecu muflowym na 15 minut. Obróbk´ kwasem azotowym powtarza si´ co najmniej trzykrotnie. Popió∏ rozpuszcza si´, dodajàc do naczynka 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 % oraz 2 ml wody redestylowanej, i przenosi do kolby na 10 ml. Naczynko przemywa si´ trzykrotnie, za ka˝dym razem u˝ywajàc 2 ml wody redestylowanej. Nast´pnie dodaje si´ wody redestylowanej do 10 ml.
\nZa∏àcznik nr 32 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI KADMU ZawartoÊç kadmu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà bezp∏omieniowej spektrofotometrii absorpcji atomowej.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8373 —
\nPoz. 1173
\nW celu oczyszczenia pieca temperatur´ podnosi si´ do 2700 °C.
\nPrzygotowanie próbki 4. WYRA˚ANIE WYNIKU Wino rozcieƒcza si´ w stosunku 1:2 obj., u˝ywajàc roztworu kwasu fosforowego.
\nObliczanie wyniku oznaczania
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Wykorzystujàc wzorcowy roztwór kadmu, przygotowuje si´ seri´ roztworów o st´˝eniach odpowiednio 2,5; 5; 10 i 15 µg kadmu w litrze.
\nTemperatur´ pieca programuje si´ w nast´pujàcy sposób:
\nPomiary metodà absorpcji atomowej Sporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç kadmu w roztworach wzorcowych w mg/l.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) kadmu w miligramach na litr.
\nZawartoÊç kadmu w mikrogramach na litr wina wynosi: 2 x C.
\nZa∏àcznik nr 33 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI SREBRA Metoda oparta jest na zastosowaniu spektrofotometrii absorpcji atomowej po spopieleniu próbki.
\n10 ml roztworu zawierajàcego 1 g srebra sporzàdzonego w opisany sposób rozcieƒcza si´ do 1000 ml rozcieƒczonym roztworem kwasu azotowego.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8374 — 3. WYKONANIE OZNACZANIA Przygotowanie próbki 20 ml próbki umieszcza si´ w naczynku platynowym i odparowuje do sucha na wrzàcej ∏aêni wodnej. Nast´pnie spopiela si´ próbk´ w piecu w temperaturze 500 do 525 °C. Bia∏y popió∏ zwil˝a si´ za pomocà 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 %. Próbk´ odparowuje si´ na wrzàcej ∏aêni wodnej, powtórnie dodaje 1 ml kwasu azotowego o st´˝eniu 65 % i odparowuje po raz drugi. Nast´pnie dodaje si´ 5 ml rozcieƒczonego kwasu azotowego w stosunku 1:10 obj. i lekko ogrzewa do rozpuszczenia.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Do szeÊciu kolb miarowych na 100 ml odmierza si´ pipetà odpowiednio 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml oraz 20 ml roztworu zawierajàcego 10 mg srebra w litrze i uzupe∏nia do 100 ml rozcieƒczonym kwasem azotowym w stosunku 1:10 obj. Przygotowane w ten sposób roztwory zawierajà odpowiednio 0,20 mg, 0,40 mg, 0,60 mg, 0,80 mg, 1,0 mg i 2,0 mg srebra w litrze.
\nPoz. 1173 D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 328,1 nm. Zero ustawia si´ na skali spektrofotometru absorbancji atomowej w stosunku do wody redestylowanej. Wykonuje si´ kolejno bezpoÊrednie pomiary absorbancji roztworów wzorcowych. Wykonuje si´ dwa równoleg∏e oznaczania.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) srebra w miligramach na litr.
\nZawartoÊç srebra w winie w miligramach na litr wynosi 0,25 x C. WartoÊç ta jest podawana z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków po przecinku.
\nZa∏àcznik nr 34 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI CYNKU Po usuni´ciu alkoholu zawartoÊç cynku jest oznaczana bezpoÊrednio w winie metodà spektrofotometrii absorpcji atomowej. j´toÊç próbki do po∏owy. Nast´pnie uzupe∏nia si´ do pierwotnej obj´toÊci 100 ml za pomocà wody redestylowanej.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych 1. ODCZYNNIKI Stosuje si´ wod´ redestylowanà w aparacie ze szk∏a borokrzemowego. Jest mo˝liwe u˝ycie wody o podobnym wskaêniku czystoÊci.
\nOznaczanie D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 213,9 nm. Zero ustawia si´ na skali absorbancji w stosunku do wody redestylowanej. Do palnika spektrofotometru absorpcji atomowej wprowadza si´ bezpoÊrednio wino, a nast´pnie kolejno cztery roztwory wzorcowe. Nast´pnie odczytuje si´ absorbancj´. Wykonuje si´ dwa równoleg∏e oznaczania.
\nDla wartoÊci absorbancji uzyskanej dla próbki rozcieƒczonego wina odczytuje si´ z wykresu zawartoÊç (C) cynku w miligramach na litr.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8375 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 35 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI O¸OWIU ZawartoÊç o∏owiu oznacza si´ bezpoÊrednio w winie metodà bezp∏omieniowej spektrofotometrii absorpcji atomowej.
\nStosuje si´ wod´ redestylowanà w aparacie ze szk∏a borokrzemowego, dopuszcza si´ u˝ycie wody o podobnej czystoÊci. Wszystkie odczynniki sà czystoÊci analitycznej i nie zawierajà o∏owiu.
\nProgramowanie temperatury pieca przeprowadza si´ w nast´pujàcy sposób:
\nW celu oczyszczenia pieca temperatur´ podnosi si´ do 2700 °C.
\nPomiary D∏ugoÊç fali Êwietlnej ustawia si´ na 217 nm, zero ustawia si´ na skali absorbancji w stosunku do wody redestylowanej. Za pomocà mikropipety wprowadza si´ do pieca, o zaprogramowanej temperaturze, trzy 5 µl porcje ka˝dego z roztworów do kalibracji i roztworu badanej próbki. Odczytuje si´ wartoÊci absorbancji, nast´pnie oblicza si´ Êrednià wartoÊç absorbancji na podstawie wyników pomiaru trzech porcji.
\nSporzàdza si´ wykres w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´, c — oznacza zawartoÊç o∏owiu w roztworach wzorcowych w mg/l.
\nPrzygotowanie próbki Wino rozcieƒcza si´ w stosunku 1:2 lub 1:3 roztworem kwasu fosforowego, zale˝nie od oczekiwanej zawartoÊci o∏owiu okreÊlajàc wspó∏czynnik rozcieƒczenia (F).
\nObliczanie wyniku oznaczania ZawartoÊç o∏owiu w winie w miligramach na litr wynosi:
\nC x F, gdzie F — oznacza wspó∏czynnik rozcieƒczenia.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8376 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 36 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI FLUORKÓW ZawartoÊç fluorków w winie, wprowadzonych do roztworu buforowego, jest oznaczana za pomocà elektrody selektywnej z membranà sta∏à. Zmierzony za pomocà elektrody potencja∏ jest proporcjonalny do logarytmu aktywnoÊci jonów fluorkowych w badanym Êrodowisku, zgodnie z równaniem:
\nE = E0 ± S log aF, gdzie:
\nE — oznacza potencja∏ elektrody jonoselektywnej mierzony w stosunku do elektrody odniesienia w badanym Êrodowisku,
\nE0 — oznacza standardowy potencja∏ czujnika pomiarowego,
\nS — oznacza nachylenie elektrody jonoselektywnej (wspó∏czynnik Nernsta). W temperaturze 25 °C teoretyczne nachylenie wynosi 59,2 mV, 3. WYKONANIE OZNACZANIA aF — oznacza aktywnoÊç jonów fluorkowych w badanym roztworze.
\nWszystkie roztwory w trakcie oznaczania majà temperatur´ 25 °C (±1 °C). Odchylenie o wi´cej ni˝ 1 °C powoduje zmian´ mierzonego potencja∏u o oko∏o 0,2 mV.
\nDo zlewki z tworzywa sztucznego przenosi si´ odmierzonà iloÊç wina i takà samà obj´toÊç roztworu buforowego.
\nRoztwór miesza si´ w sposób równomierny i ∏agodny. Gdy wskazówka miliwoltomierza ustabilizuje si´ (stabilnoÊç jest osiàgana, gdy wahania potencja∏u nie przekraczajà 0,2 do 0,3 mV w ciàgu trzech minut), odczytuje si´ wartoÊç potencja∏u w mV.
\nMetoda dodawania znanych iloÊci fluorku Do badanej próbki dodaje si´ za pomocà mikropipety, przy ciàg∏ym mieszaniu, znanà obj´toÊç wzorcowego roztworu fluorku. Gdy wskazówka miliwoltomierza ustabilizuje si´, odczytuje si´ wartoÊç potencja∏u w mV.
\nSt´˝enie dodawanego roztworu wzorcowego ustala si´ w nast´pujàcy sposób:
\nPrzybli˝one st´˝enie roztworu badanej próbki odczytuje si´ z krzywej wzorcowej wykreÊlonej na skali pó∏logarytmicznej za pomocà roztworów wzorcowych o st´˝eniu 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 i 2,0 mg/l.
\nJe˝eli przybli˝one st´˝enie roztworu badanej próbki znajduje si´ poza zakresem st´˝eƒ roztworów wzorcowych, próbk´ nale˝y rozcieƒczyç.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8377 — Obliczanie wyniku oznaczania ZawartoÊç fluorków (CF) w roztworze badanej próbki w mg/l oblicza si´ wed∏ug wzoru:
\nVa × Ca 1 CF = ————— × —————————— , (antylog ∆E/S) — 1 Vo Poz. 1173 Va — oznacza obj´toÊç roztworu badanej próbki po dodaniu roztworu fluorku (ml), ∆E — oznacza ró˝nic´ potencja∏ów otrzymanà w metodzie bezpoÊredniej i w metodzie dodawania znanych iloÊci fluorku (mV), S — oznacza nachylenie elektrody w badanym roztworze.
\nJe˝eli Va jest bardzo zbli˝one do Vo, stosuje si´ wzór: gdzie:
\nCF — oznacza zawartoÊç fluorków w roztworze badanej próbki (mg/l), Ca — oznacza zawartoÊç fluorków w roztworze dodanym (mg/l) do roztworu badanej próbki (Va), Vo — oznacza poczàtkowà obj´toÊç roztworu badanej próbki przed dodaniem roztworu fluorku (ml), 1 CF = Ca × ——————————— . (antylog ∆E/S) — 1 Uzyskanà wartoÊç nale˝y pomno˝yç przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia, wynikajàcy z dodania do próbki roztworu buforowego.
\nZa∏àcznik nr 37 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI DWUTLENKU W¢GLA Wina inne ni˝ wina musujàce i gazowane (nadciÊnienie wywo∏ywane przez CO2 < 0,5 x 105 Pa) Przygotowanie próbki Odmierzona obj´toÊç wina jest sch∏adzana do temperatury oko∏o 0 °C i mieszana z wodorotlenkiem sodu w iloÊci wystarczajàcej do sprowadzenia pH do wartoÊci 10—11. Miareczkowanie wykonuje si´ za pomocà roztworu kwasu w obecnoÊci anhydrazy w´glowej (dehydrataza w´glanowa). ZawartoÊç dwutlenku w´gla oblicza si´ na podstawie obj´toÊci kwasu potrzebnego do zmiany pH z 8,6 (forma wodorow´glanowa) na 4,0 (kwas w´glowy). W celu uwzgl´dnienia iloÊci wodorotlenku sodowego zwiàzanego przez kwasy obecne w winie przeprowadza si´ prób´ Êlepà, miareczkujàc w tych samych warunkach wino pozbawione dwutlenku w´gla.
\nDo zlewki na 100 ml odmierza si´ 25 ml 0,1-molowego roztworu wodorotlenku sodu, dodaje dwie krople wodnego roztworu anhydrazy w´glowej o st´˝eniu g/l, a nast´pnie za pomocà pipety sch∏odzonej do temperatury 0 °C wprowadza si´ 10 ml wina.
\nZlewk´ umieszcza si´ na mieszadle magnetycznym, wk∏ada elektrod´ pehametru i miesza z umiarkowanà pr´dkoÊcià.
\nGdy roztwór osiàgnie temperatur´ pokojowà, miareczkuje si´ powoli roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci pH 8,6. IloÊç u˝ytego kwasu zapisuje si´.
\nKontynuuje si´ miareczkowanie 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci pH 4,0. IloÊç ml kwasu zu˝ytego na zmian´ pH z 8,6 do 4,0 — oznacza si´ symbolem n. Z próbki wina o obj´toÊci oko∏o 50 ml usuwa si´ CO2 przez wstrzàsanie pod pró˝nià przez 3 minuty, ogrzewajàc kolb´ w ∏aêni wodnej do temperatury 25 °C.
\nCzynnoÊci powtarza si´, u˝ywajàc 10 ml wina pozbawionego dwutlenku w´gla. IloÊç ml kwasu zu˝ytego w próbie Êlepej oznacza si´ symbolem n’.
\n1 ml odmiareczkowanego 0,1-molowego wodorotlenku sodowego odpowiada 4,4 mg CO2.
\n0,44 x (n — n’).
\nWino razem z pipetà na 10 ml u˝ywanà do pobierania próbek sch∏adza si´ do temperatury oko∏o 0 °C.
\nWartoÊç t´ podaje si´ z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków po przecinku.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8378 — Je˝eli wino zawiera poni˝ej 1 g/l CO2, nie jest konieczne dodawanie anhydrazy w´glowej w celu katalizowania reakcji hydratacji CO2.
\nPoz. 1173 10 ml zalkalizowanego wina. Zlewk´ umieszcza si´ na mieszadle magnetycznym, wk∏ada elektrod´ oraz mieszade∏ko magnetyczne i miesza si´ z umiarkowanà pr´dkoÊcià.
\nWina musujàce i pó∏musujàce Przygotowanie próbki Próbk´ wina do analizy sch∏adza si´ w temperaturze bliskiej temperaturze zamarzania. Po pobraniu pewnej iloÊci wina do wykonania próby Êlepej po usuni´ciu dwutlenku w´gla wino pozosta∏e w butelce alkalizuje si´ w celu zwiàzania ca∏ego dwutlenku w´gla w formie Na2CO3. Miareczkowanie wykonuje si´ za pomocà roztworu kwasu w obecnoÊci anhydrazy w´glowej. ZawartoÊç dwutlenku w´gla oblicza si´ na podstawie obj´toÊci kwasu potrzebnej do zmiany pH z 8,6 (forma wodorow´glanowa) na 4,0 (kwas w´glowy).
\nW celu uwzgl´dnienia iloÊci wodorotlenku sodowego zwiàzanego przez kwasy obecne w winie prób´ Êlepà wykonuje si´, miareczkujàc w tych samych warunkach wino pozbawione dwutlenku w´gla.
\nMiareczkuje si´ powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do osiàgni´cia pH 8,6. Zapisuje si´ iloÊç zu˝ytego roztworu kwasu.
\nMiareczkuje si´ dalej powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci pH 4,0.
\nZ próbki wina o obj´toÊci v ml, pozostawionego do wykonania próby Êlepej, usuwa si´ CO2 przez wstrzàsanie pod pró˝nià przez 3 minuty, ogrzewajàc kolb´ w ∏aêni wodnej do temperatury 25 °C. Pobiera si´ 10 ml wina pozbawionego dwutlenku w´gla i dodaje 30 ml przegotowanej wody destylowanej, nast´pnie dodaje si´ dwie do trzech kropli roztworu wodorotlenku sodu (50 % obj.), aby sprowadziç pH do wartoÊci 10—11.
\nZlewk´ umieszcza si´ na mieszadle magnetycznym, wk∏ada elektrod´ oraz mieszade∏ko magnetyczne i miesza si´ z umiarkowanà pr´dkoÊcià. Miareczkuje si´ powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do osiàgni´cia pH 8,6. Zapisuje si´ iloÊç zu˝ytego roztworu kwasu.
\nMiareczkuje si´ dalej powoli 0,05-molowym roztworem kwasu siarkowego do uzyskania wartoÊci pH 4,0.
\n1 ml 0,05-molowego roztworu kwasu siarkowego odpowiada 4,4 mg CO2.
\nNatychmiast po pobraniu wina do próby Êlepej do butelki o pojemnoÊci 750 ml dodaje si´ 20 ml roztworu wodorotlenku sodu (50 % obj.).
\nWino pozostawia si´, a˝ osiàgnie temperatur´ pokojowà.
\nDo zlewki na 100 ml odmierza si´ 30 ml przegotowanej wody destylowanej i dodaje dwie krople roztworu anhydrazy w´glowej (1 g/l), a nast´pnie dodaje si´ Opró˝nia si´ butelk´ wina, które zosta∏o zalkalizowane, i oznacza poczàtkowà obj´toÊç wina (V) z dok∏adnoÊcià do 1 ml przez nape∏nienie butelki wodà do zaznaczonej wysokoÊci.
\nZawartoÊç CO2 (G) w gramach na litr wina oblicza si´ wed∏ug wzoru: (V — v + 20) G = 0,44 (n — n’) × —————— , V—v gdzie: n’ — oznacza iloÊç ml zu˝ytego 0,5-molowego roztworu kwasu siarkowego, n — oznacza iloÊç ml kwasu zu˝ytego na zmian´ pH z 8,6 na 4,0, V — oznacza zmierzonà poczàtkowà obj´toÊç wina w ml, v — oznacza zmierzonà koƒcowà obj´toÊç wina w ml.
\nWynik podaje si´ z dok∏adnoÊcià do dwóch znaków po przecinku.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8379 — Poz. 1173 NadciÊnienie w temperaturze 20 °C (Paph20) wyra˝ane w paskalach oblicza si´ wed∏ug wzoru:
\nQ Paph20 = —————————————————————— — Patm , –5 1,951 x 10 x (0,86 x 0,01 A) x (1 — 0,00144 S) gdzie:
\nQ A — oznacza zawartoÊç CO2 w g/l wina, — oznacza zawartoÊç alkoholu w winie w temperaturze 20 °C, S — oznacza zawartoÊç cukrów w winie w g/l, Patm — oznacza ciÊnienie atmosferyczne, wyra˝one w paskalach.
\nZa∏àcznik nr 38 OZNACZANIE ZAWARTOÂCI POCHODNYCH CYJANKOWYCH Wolny kwas cyjanowodorowy jest uwalniany w wyniku hydrolizy kwasowej i wydzielany metodà destylacji. Utworzony po reakcji z chloraminà-T i pirydynà dialdehyd glutakonowy jest oznaczany kolorymetrycznie na podstawie niebieskiego zabarwienia, jakie daje z kwasem 1,3-dimetylo-barbiturowym.
\nDo kolby miarowej zbiera si´ 30 do 35 ml destylatu (lub oko∏o 45 ml p∏ynu w sumie).
\nSto˝kowà rurk´ ch∏odnicy przep∏ukuje si´ kilkoma mililitrami wody destylowanej, destylat doprowadza si´ do temperatury 20 °C i uzupe∏nia si´ kolb´ wodà destylowanà do 50 ml.
\nWykonanie pomiaru Odmierza si´ 25 ml destylatu do kolby sto˝kowej na 50 ml z zakoƒczeniem na szlif, dodaje 1 ml 3 % roztworu chloraminy-T, a nast´pnie kolb´ zamyka si´ korkiem. Po dok∏adnie 60 s dodaje si´ 3 ml roztworu kwasu 1,3-dimetylo-barbiturowego, kolb´ zamyka si´ i pozostawia na 10 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ próbki i próby Êlepej (25 ml wody destylowanej zamiast 25 ml destylatu) przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 590 nm w kuwecie o d∏ugoÊci drogi optycznej równej 20 mm.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8380 — Przy za∏o˝eniu, ˝e 1 ml 0,1-molowego roztworu azotanu srebra iloÊciowo odpowiada 13,2 mg cyjanku potasu, wylicza si´ zawartoÊç cyjanku potasu w próbce.
\nPrzygotowanie roztworów wzorcowych Majàc ustalonà zawartoÊç cyjanku potasu, przygotowuje si´ roztwór wzorcowy zawierajàcy 30 mg/l kwasu cyjanowodorowego (30 mg HCN = 72,3 KCN). Rozcieƒcza si´ w stosunku 1 do 10.
\nPoz. 1173 5. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
\nDo kolb miarowych na 100 ml odmierza si´ po 1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml i 5,0 ml rozcieƒczonej próbki i uzupe∏nia wodà destylowanà. Przygotowane roztwory zawierajà odpowiednio po 30 µg; 60 µg; 90 µg;
\n120 µg i 150 µg kwasu cyjanowodorowego w litrze.
\nW przypadku oznaczania powtarzalnoÊç (r) wynosi dla:
\nWykreÊlanie krzywej wzorcowej gdzie:
\nDo kolb sto˝kowych na 50 ml, z zakoƒczeniem na szlif, pobiera si´ po 25 ml roztworów wzorcowych. Nast´pnie dodaje si´ po 1 ml 3 % roztworu chloraminy-T, po czym kolb´ zamyka si´ korkiem. Po dok∏adnie 60 s dodaje si´ 3 ml roztworu kwasu 1,3-dimetylo-barbiturowego, kolb´ zamyka si´ i pozostawia na 10 minut. Nast´pnie mierzy si´ absorbancj´ przy d∏ugoÊci fali Êwietlnej 590 nm w kuwecie o d∏ugoÊci drogi optycznej równej 20 mm. Z uzyskanych wartoÊci absorbancji wykreÊla si´ krzywà wzorcowà w uk∏adzie A = f (c), gdzie A — oznacza absorbancj´ roztworów wzorcowych, c — oznacza st´˝enie kwasu cyjanowodorowego w roztworach wzorcowych w µg/l. Krzywa wzorcowa ma postaç linii prostej przechodzàcej przez poczàtek uk∏adu wspó∏rz´dnych. xi — oznacza Êrednià zawartoÊç HCN w winie, Obliczanie wyniku oznaczania
\nW przypadku oznaczania odtwarzalnoÊç (R) wynosi dla:
\nZawartoÊç kwasu cyjanowodorowego jest wyra˝ana w mikrogramach na litr (µg/l) z dok∏adnoÊcià do jednoÊci.
\nOdczytuje si´ zawartoÊç kwasu cyjanowodorowego z krzywej wzorcowej. JeÊli próbka by∏a rozcieƒczona, uzyskany wynik mno˝y si´ przez wspó∏czynnik rozcieƒczenia. xi — oznacza Êrednià zawartoÊç HCN w winie, xi — dla wina bia∏ego wynosi 48,4 µg/l, xi — dla wina czerwonego wynosi 80,5 µg/l.
\nZa∏àcznik nr 39 WYKRYWANIE OBECNOÂCI IZOTIOCYJANIANU ALLILOWEGO Izotiocyjanian allilowy obecny w winie oddestylowuje si´ i identyfikuje metodà chromatografii gazowej.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8381 —
\nOch∏adza si´ obie próbówki od zewnàtrz mieszaninà zamra˝ajàcà. ¸àczy si´ kolb´ z próbówkami odbierajàcymi i rozpoczyna przep∏ukiwanie aparatu azotem z pr´dkoÊcià 3 litrów na minut´. Wino podgrzewa si´ do temperatury 80 °C za pomocà p∏aszcza grzejnego Poz. 1173 i destyluje, zbierajàc 45 do 50 ml destylatu. Nast´pnie chromatograf stabilizuje si´. Zaleca si´ przestrzegaç nast´pujàcych warunków:
\nZa pomocà mikrostrzykawki wprowadza si´ takà obj´toÊç roztworu wzorcowego, aby pik odpowiadajàcy izotiocyjanianowi allilowemu móg∏ byç ∏atwo zidentyfikowany na uzyskanym chromatogramie.
\nW podobny sposób wprowadza si´ do chromatografu próbk´ destylatu. Sprawdza si´, czy czas retencji uzyskanego piku odpowiada czasowi retencji piku izotiocyjanianu allilowego.
\nW wy˝ej podanych warunkach sk∏adniki wyst´pujàce naturalnie w winie nie b´dà dawa∏y zak∏ócajàcych pików na chromatogramie badanej próbki.
\nSchemat aparatu do destylacji w strumieniu azotu Dziennik Ustaw Nr 126 — 8382 — Poz. 1173 Za∏àcznik nr 40 OZNACZANIE WSKAèNIKA FOLIN-CIOCALTEU Wskaênik Folin-Ciocalteu jest to wynik oznaczania uzyskany wed∏ug nast´pujàcej metody: wszystkie zwiàzki fenolowe wyst´pujàce w winie sà utleniane przez odczynnik Folin-Ciocalteu. Odczynnik ten stanowi mieszanina kwasu fosfowolframowego (H3PW12O40) i kwasu fosfomolibdenowego (H3PMo12O40), które po utlenieniu fenoli ulegajà redukcji do mieszaniny niebieskich tlenków wolframu (W8O23) i molibdenu (Mo8O23).
\nPowsta∏a barwa niebieska wykazuje maksimum absorbcji w pobli˝u 750 nm, a jej nat´˝enie jest proporcjonalne do ca∏kowitej iloÊci zwiàzków fenolowych obecnych w winie.
\nZawartoÊç próbki miesza si´ dok∏adnie i pozostawia na 30 minut do ustabilizowania si´ reakcji. Absorbancj´ oznacza si´ przy 750 nm i d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm w stosunku do próby Êlepej, w której zamiast wina u˝ywa si´ wody.
\nJe˝eli absorbancja jest wi´ksza od wartoÊci 0,3, próbk´ si´ rozcieƒcza.
\nWina bia∏e Do kolby miarowej o pojemnoÊci 100 ml odmierza si´ odpowiednio 1 ml nierozcieƒczonego wina bia∏ego, 50 ml wody destylowanej, 5 ml odczynnika Folin-Ciocalteu, 20 ml roztworu w´glanu sodu i uzupe∏nia wodà do 100 ml.
\nZawartoÊç próbki miesza si´ dok∏adnie i pozostawia na 30 minut do ustabilizowania si´ reakcji. Absorbancj´ oznacza si´ przy 750 nm i d∏ugoÊci drogi optycznej 1 cm w stosunku do próby Êlepej, w której zamiast wina u˝ywa si´ wody.
\nJe˝eli absorbancja jest wi´ksza od wartoÊci 0,3, próbk´ si´ rozcieƒcza.
\nRó˝nica pomi´dzy dwoma wynikami dwóch oznaczaƒ wykonanych równolegle lub zaraz po sobie, przez t´ samà osob´, nie mo˝e byç wi´ksza od jednoÊci.
\nZa∏àcznik nr 41 OZNACZANIE STOSUNKU IZOTOPÓW TLENU O MASIE ATOMOWEJ 18 I 16 (18O/16O) W WODZIE ZAWARTEJ W WINIE Metodà tà mierzy si´ stosunek izotopów tlenu 18O/16O w wodzie. Wyra˝a si´ go w odchyleniu (δ ‰) w stosunku do wartoÊci stosunku izotopów mi´dzynarodowego wzorca V.SMOW, przy zastosowaniu nast´pujàcego wzoru: [ ] R δ ‰ = ———— – 1 x 1000, RSMOW gdzie:
\nR — oznacza stosunek izotopów 18O/16O w badanej próbce, RSMOW — oznacza stosunek 18O/16O we wzorcu. izotopów tlenu tlenu Stosunek izotopów tlenu 18O/16O jest okreÊlany za pomocà spektrometrii masowej stosunków izotopo- Dziennik Ustaw Nr 126 — 8383 — wych (MSIR) dla strumieni jonowych 12C16O18O (m/z 46) oraz 12C16O (m/z 44) produkowa2 nych przez dwutlenek w´gla uzyskany po wymianie z wodà w winie zgodnie z reakcjà:
\n12C16O + H 18O ↔ C16O18O + H 16O 2 2 2 1. ODCZYNNIKI oznaczania proporcji izotopów rów. Nast´pnie zamyka si´ zawory i pozwala, aby wszystko si´ ponownie podgrza∏o. Cykl odgazowywania jest powtarzany do momentu, gdy przestanà wyst´powaç wahania lub zmiany ciÊnienia.
\nWyrównywanie wody i CO2 W analizie jest wykorzystywany dwutlenek w´gla w fazie gazowej.
\nDo Poz. 1173 tlenu 18O/16O stosuje si´ nast´pujàce odczynniki:
\nNast´pnie dooko∏a szyjki kolby okràg∏odennej nak∏ada si´ smar silikonowy i przy∏àcza si´ kolb´ do zaworu, sprawdzajàc, czy jest dok∏adnie zamkni´ty.
\nCzynnoÊç powtarza si´ dla ka˝dej kolby na rampie roboczej, przy czym do jednej z nich wprowadza si´ referencyjnà wod´ laboratoryjnà.
\nOdgazowywanie rampy Dwie rampy ch∏odzone p∏ynnym azotem odpowietrza si´ do ciÊnienia 0,1 mm Hg przez otworzenie zawo- Rampy robocze sch∏adza si´ do –70 °C (mieszankà p∏ynnego azotu i alkoholu) w celu zamro˝enia wody, a nast´pnie umieszcza w pró˝ni. Po ustabilizowaniu pró˝ni odizolowuje si´ ramp´ przez zamkni´cie zaworów oraz odgazowanie systemu wprowadzajàcego CO2. Pod∏àcza si´ dop∏yw gazowego CO2 do rampy roboczej i po odizolowaniu jej od reszty systemu umieszcza si´ ramp´ w ∏aêni z termostatem w temperaturze 25 °C (± 0,5 °C) na 12 godzin.
\nTransfer wymienionego CO2 do cel pomiarowych spektrometru masowego Stosuje si´ stojak na próbki, który pozwala wstawiç tyle celek pomiarowych, ile jest kolb okràg∏odennych zawierajàcych wymieniony CO2, które sà przystosowane do pustej linii za rampà roboczà. Puste celki sà ostro˝nie odgazowywane i wymieniony gaz zawarty w kolbach jest przenoszony do próbówek uprzednio sch∏odzonych p∏ynnym azotem. Nast´pnie próbówki pozostawia si´ do ogrzania do temperatury pokojowej.
\nMetoda automatyczna W celu osiàgni´cia równowagi próbówki nape∏nia si´ 2 ml wina oraz 2 ml wody (referencyjna do prac laboratoryjnych) i sch∏adza si´ do temperatury –18 °C.
\nProwadnice zawierajàce zamro˝one produkty sà przystosowywane do systemu wyrównywania i po osiàgni´ciu pró˝ni w systemie jest wprowadzany dwutlenek w´gla pod ciÊnieniem 800 hPa. Równowaga jest osiàgana przy temperaturze 22 ± 0,5 °C po minimalnym okresie pi´ciu godzin przy umiarkowanym mieszaniu. Poniewa˝ czas osiàgni´cia równowagi zale˝y od kszta∏tu fiolki, najpierw okreÊla si´ optymalny czas potrzebny do uzyskania równowagi dla danego systemu.
\nDwutlenek w´gla zawarty w fiolkach jest nast´pnie przenoszony do komory nastrzykowej spektrometru masowego przez rurk´ kapilarnà. Pomiar jest przeprowadzany zgodnie z procedurà pomiaru na danym instrumencie.
\nI46/I44 próbki — oznacza stosunek nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 w próbce, I46/I44 wzorca — oznacza stosunek nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 we wzorcu.
\nDziennik Ustaw Nr 126 — 8384 — ZawartoÊç 18O w próbce (δ’18O) w porównaniu ze wzorcem V.SMOW na skali V.SMOW/SLAP jest uzyskiwana za pomocà nast´pujàcego równania: δ’ próbki – δ’ SMOW δ’18O = —————————— × 55,5, δ’ SMOW – δ’ SLAP [ ] gdzie: δ’ próbki — oznacza wzgl´dnà ró˝nic´ stosunków nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 w próbce, δ’ SMOW — oznacza wzgl´dnà ró˝nic´ stosunków nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 we wzorcu SMOW, δ’ SLAP — oznacza wzgl´dnà ró˝nic´ stosunków nat´˝enia jonów m/z 46 i 44 we wzorcu SLAP.
\nWartoÊç akceptowana dla SLAP jest równa 55,5 ‰ w porównaniu z V.SMOW. Proporcja izotopów we wzorcu jest okreÊlana po ka˝dej serii 10 pomiarów nieznanych próbek.
\nPoz. 1173 5. POWTARZALNOÂå METODY PowtarzalnoÊç jest to wartoÊç, od której jest mniejsza, z prawdopodobieƒstwem, wartoÊç bezwzgl´dna ró˝nicy mi´dzy dwoma pojedynczymi wynikami badaƒ, uzyskanymi z zastosowaniem tej samej metody, dla tej samej próbki, w tym samym laboratorium, przez tego samego analityka, z u˝yciem tego samego sprz´tu, w krótkim odst´pie czasu.
\nPowtarzalnoÊç metody (r) jest równa 0,24 ‰.
\nOdtwarzalnoÊç metody (R) jest równa 0,50 ‰.
\nEgzemplarze bie˝àce oraz archiwalne mo˝na nabywaç:
\nT∏oczono z polecenia Prezesa Rady Ministrów w Zak∏adzie Wydawnictw i Poligrafii Centrum Obs∏ugi Kancelarii Prezesa Rady Ministrów, ul. Powsiƒska 69/71, 02-903 Warszawa Zam. 425/W/C/2003 ISSN 0867-3411 Cena 9,80 z∏ (w tym 7% VAT)