9.4. Plantele test se cresc în încăperi de carantină până la 4 săptămâni la temperatura de 25-30°C şi umiditate relativ mare, stropindu-le în mod corespunzător pentru a preveni o suprasaturare hidrică sau ofilirea din lipsă de apă. Pentru a se evita contaminarea, plantele control pozitiv şi negativ se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră ori cameră de cultivare sau, în cazul în care spaţiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci când plantele aparţinând unor probe diferite trebuie incubate în apropiere unele de celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de precauţie pentru a se evita o contaminare încrucişată. Este esenţial ca în serele şi camerele de cultivare să nu fie insecte, dat fiind faptul că acestea ar putea transmite bacteria de la o probă la alta.
\n
Se observă apariţia simptomelor de ofilire: epinastie, cloroză şi/sau pipernicire.
\n
9.5. Se izolează plantele infectate şi se identifică culturile purificate prezumtive (suspecte) de Ralstonia solanacearum (lit. B).
\n
9.6. În cazul în care nu se observă niciun simptom după 3 săptămâni, se efectuează un test IF/PCR/de izolare pe o probă formată din bucăţi de tulpină de 1 cm prelevate de la fiecare plantă-test chiar deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se efectuează însămânţarea pe mediu de cultură (pct. 4.1).
\n
9.7. Se identifică toate culturile purificate prezumtive de Ralstonia solanacearum (lit. B).
\n
Interpretarea rezultatelor testului biologic:
\n
Rezultatele testului biologic sunt valide atunci când plantele control pozitiv prezintă simptome tipice, bacteriile pot fi reizolate din aceste plante şi nu se observă niciun simptom la plantele control negativ.
\n
Testul biologic este negativ în cazul în care plantele-test inoculate cu extract de probă nu sunt infectate cu Ralstonia solanacearum şi cu condiţia ca Ralstonia solanacearum să fie detectată în plantele control pozitiv.
\n
Testul biologic este pozitiv dacă plantele-test sunt infectate cu Ralstonia solanacearum.
\n
B. TESTE DE IDENTIFICARE Culturile pure prezumtive de Ralstonia solanacearum se identifică prin cel puţin unul dintre următoarele teste bazate pe principii biologice diferite.
\n
Se includ, după caz, tulpini de referinţă cunoscute, pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).
\n
1.Teste de identificare enzimatice şi de nutriţie Se stabilesc următoarele caracteristici fenotipice prezente sau absente sistematic la Ralstonia solanacearum, în conformitate cu metodele descrise de Lelliott şi Stead (1987), Klement et al. (1990) şi Schaad (2001).
\n
2.Testul IF 2.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în tampon IF (apendice 4).
\n
2.2. Se prepară o serie de diluţii de 1/2 dintr-un antiser corespunzător (vezi website-ul http://forum.europa.eu.int/Public/ irc/sanco/Home/main).
\n
2.3. Se aplică procedura testului IF (lit. A pct. 5).
\n
2.4. Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obţinut pentru cultură trebuie să fie echivalent cu cel al controlului pozitiv.
\n
3.Testul ELISA NOTĂ: În cazul în care se efectuează numai două teste de identificare, nu se efectuează alte teste serologice pe lângă această metodă.
\n
3.1. Se prepară o suspensie de circa 10^8 celule/ml în PBS 1X (vezi apendicele 4).
\n
3.2. Se aplică procedura ELISA corespunzătoare cu un anticorp monoclonal specific de Ralstonia solanacearum.
\n
3.3. Un test ELISA este pozitiv atunci când densitatea optică a culturii este egală cel puţin cu 1/2 din densitatea optică obţinută pentru controlul pozitiv.
\n
4.Testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR) 4.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în apă sterilă ultrapură.
\n
4.2. Se pipetează 100 f2μl din suspensie în tuburi închise şi se pun într-un bloc de încălzire sau pe baie de apă la 100°C timp de 4 minute. Apoi probele pot fi păstrate la o temperatură situată între - 16 şi - 24°C până în momentul în care sunt utilizate în următoarele etape ale testului PCR.
\n
4.3. Se aplică protocoalele PCR corespunzătoare pentru amplificarea fragmentelor tipice de Ralstonia solanacearum vezi, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).
\n
4.4. O identificare pozitivă a bacteriei Ralstonia solanacearum se obţine atunci când fragmentele amplificate prin PCR au aceeaşi dimensiune şi aceleaşi polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restricţie cu cele ale tulpinii de control pozitiv.
\n
5.Testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH) 5.1. Se prepară o suspensie de circa 10^6 celule/ml în apă ultrapură.
\n
5.2. Se aplică procedura FISH (lit. A pct. 7) folosindu-se cel puţin două oligosonde specifice pentru Ralstonia solanacearum (apendice 7).
\n
5.3. Pentru ca un test FISH să fie pozitiv, cultura trebuie să prezinte aceleaşi reacţii ca şi controlul pozitiv.
\n
6.Profilul acizilor graşi (FAP) 6.1. Se realizează o cultură de 48 de ore (28°C) pe mediu tripticaz-soia-agar (Oxoid).
\n
6.2. Se aplică procedura FAP corespunzătoare (Janse, 1991; Stead, 1992).
\n
6.3. Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii prezumtive trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv. Prezenţa acizilor graşi caracteristici 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH şi 18:1 2OH şi absenţa16:0 3OH indică prezenţa Ralstonia sp.
\n
7.Metode de caracterizare a tulpinii Se recomandă o caracterizare a tulpinii prin una dintre următoarele metode pentru fiecare caz nou de izolare a bacteriei Ralstonia solanacearum.
\n
Se includ, după caz, tulpini de referinţă cunoscute pentru fiecare test efectuat (vezi apendicele 3).
\n
7.1. Determinarea biovarului Există diferite biovaruri de Ralstonia solanacearum în funcţie de capacitatea lor de a utiliza şi/sau oxida 3 zaharuri şi 3 hexoze alcoolice (Hayward, 1964 şi Hayward et al., 1990). Mediile de creştere pentru testul biovarului sunt descrise în apendicele 2. Testul poate fi realizat inoculând prin injectare profundă a mediilor cu culturi pure de izolat de Ralstonia solanacearum şi incubare la 28°C. În cazul în care mediile sunt repartizate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri sterile (200 f2μl/godeu), se poate observa o modificare a culorii, în 72 de ore, din verde-oliv în galben, ceea ce indică un rezultat pozitiv al testului.
\n
Teste suplimentare diferenţiază biovarul 2 în subfenotipuri:
\n
7.2. Amprentare genomică Diferenţierea moleculară a tulpinilor din complexul Ralstonia solanacearum se poate face prin:
\n
7.2.1. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricţie (RFLP) (Cook et al., 1989);
\n
7.2.2. PCR realizat pe secvenţe repetitive folosindu-se primeri REP, BOX şi ERIC (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995);
\n
7.2.3. analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricţie amplificate (Van der Wolf et al., 1998).
\n
7.3. metodele PCR.
\n
Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al., 2002; vezi apendice 6) pentru a diferenţia tulpinile aparţinând diviziunii 1 (biovari 3, 4 şi 5) şi diviziunii 2 (biovari 1, 2A şi 2T) ale Ralstonia solanacearum, definite iniţial de analiza RFLP (Cook et al., 1989) şi analiza secvenţei 16S a ADNr (Taghavi et al., 1996).
\n
C. TEST DE CONFIRMARE Testul de patogenitate trebuie efectuat pentru confirmarea finală a diagnosticului şi pentru evaluarea virulenţei culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum.
\n
(1)Se prepară un inoculum de circa 10^6 celule/ml dintr-o cultură de 24-48 de ore dintr-o tulpină corespunzătoare de control pozitiv de Ralstonia solanacearum (de exemplu, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; vezi apendicele 3). ...
\n
(2)Se inoculează 5-10 plantule de tomate sau vinete sensibile, în stadiul celei de a treia frunze adevărate (vezi lit. A pct. 9). ...
\n
(3)Se incubează până la două săptămâni la 25-28°C şi umiditate relativă crescută, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile ar trebui să intervină ofilirea. În absenţa simptomelor la sfârşitul acestei perioade, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Ralstonia solanacearum. ...
\n
(4)Se observă apariţia simptomelor de ofilire şi/sau epinastie, cloroză şi de pipernicire. ...
\n
(5)Se izolează plantele simptomatice îndepărtând o secţiune de ţesut din tulpină la 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunţeşte şi se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau tampon fosfat de 50 mM (apendice 4). Se însămânţează suspensia pe un mediu adecvat, de preferinţă mediu selectiv (apendice 2), se incubează timp de 48-72 de ore la 28°C şi se observă formarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum. ...
\n
Apendicele 1 Laboratoarele care efectuează optimizarea şi validarea protocoalelor Apendicele 2 Medii pentru izolarea şi cultivarea bacteriei Ralstonia solanacearum
\n
a)Medii de creştere în general ...
\n
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Se răceşte la 50°C şi se adaugă o soluţie apoasă sterilizată prin filtrare de clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obţinerea unei concentraţii finale de 50 mg la litru.
\n
b)Medii de creştere selective validate ...
\n
Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Se răceşte la 50°C şi se adaugă soluţii apoase concentrate, sterilizate prin filtrare, conţinând următoarele ingrediente pentru obţinerea concentraţiilor finale specificate:
\n
Observaţii:
\n
1.Utilizarea altor reactivi decât cei menţionaţi anterior poate afecta creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum.
\n
2.Agarul de tip oxoid nr. 1 poate fi înlocuit de Bacto-agar (Difco). În acest caz, creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum va fi mai lentă, dar şi creşterea bacteriilor saprofite concurente ar putea fi, de asemenea, redusă. Dezvoltarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum poate dura o zi sau două în plus, iar coloraţia roşie poate fi mai puţin pronunţată decât pe mediu de Bacto-agar.
\n
3.O creştere a concentraţiei de bacitracină la 2.500 de unităţi la litru poate reduce populaţiile de bacterii concurente fără a perturba creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum.
\n
Mediile şi soluţiile concentrate de antibiotice se păstrează la 4°C la întuneric şi timp de maximum o lună.
\n
Trebuie asigurată absenţa condensului pe suprafaţa plăcilor înainte de utilizare.
\n
A se evita uscarea excesivă a plăcilor.
\n
După prepararea fiecărui lot nou de mediu de cultură trebuie efectuat un control de calitate prin însămânţarea unei suspensii dintr-o cultură de referinţă de Ralstonia solanacearum (vezi apendicele 3) şi se observă formarea de colonii tipice după incubarea la 28°C timp de 2-5 zile.
\n
c)Medii de îmbogăţire validate ...
\n
Mediu nutritiv SMSA (Elphinstone et al., 1996) Se prepară ca şi pentru mediul selectiv SMSA, dar se elimină Bacto-agar şi clorura de 2-3-5-tetrazoliu.
\n
Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute şi se răceşte la 50°C.
\n
Se adaugă soluţii concentrate de antibiotice ca şi pentru mediul nutritiv SMSA.
\n
Apendicele 3 A. Material de control standardizat disponibil în comerţ
\n
a)Tulpini bacteriene ...
\n
Următoarele tulpini bacteriene se recomandă spre utilizare în calitate de material standard de referinţă sau control pozitiv (tabelul 1) sau pe parcursul optimizării testelor pentru a evita reacţiile încrucişate (tabelul 2). Toate tulpinile sunt disponibile în comerţ la următoarele adrese:
\n
1.Naţional Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK;
\n
2.Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Ţările de Jos;
\n
3.Collection francaise de bacteries phytopathogenes (CFBP), INRA - Station de phytobacteriologie, Angers, Franţa.
\n
Tabelul 1. Tulpini de referinţă SMT de Ralstonia solanacearum _______ Notă ... *) A se utiliza ca tulpină de referinţă standard biovarul 2 rasa 3 de Ralstonia solanacearum.
\n
NOTĂ: Autenticitatea tulpinilor menţionate anterior poate fi garantată numai în cazul în care acestea sunt obţinute dintr-o colecţie de culturi autentice.
\n
Tabelul 2. Tulpini de referinţă SMT corelate serologic sau genetic în vederea utilizării pentru optimizarea testelor de detecţie _________
\n
1)Tulpină care poate determina în testele serologice (IF şi/sau ELISA) o reacţie încrucişată cu antiserurile policlonale.
\n
2)Tulpină din care poate fi amplificat produsul PCR în anumite laboratoare, având dimensiuni asemănătoare celor preconizate la utilizarea primerilor specifici OLI-1 şi Y-2 (vezi apendicele 6).
\n
3)Poate determina o reacţie încrucişată în majoritatea testelor, dar cunoscut ca fiind prezent numai pe banan în Indonezia.
\n
b)Material de control standardizat disponibil în comerţ ...
\n
Următorul material de control standardizat este disponibil în colecţia de culturi NCPPB:
\n
-granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartof sănătoşi în calitate de control negativ pentru ansamblul testelor;
\n
-granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartofi sănătoşi conţinând 10^3-10^4 şi 10^4-10^6 celule de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) în calitate de control pozitiv pentru testele serologice şi testul PCR. Întrucât liofilizarea afectează viabilitatea celulelor, acestea nu pot fi folosite drept control standard pentru testele de izolare sau testele biologice;
\n
-suspensii fixate cu formalină de Ralstonia solanacearum biovar 2 (tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de concentraţie 10^6 celule/ml în calitate de control pozitiv pentru testele serologice.
\n
B. Pregătirea controalelor pozitive şi negative pentru testele rapide de detecţie PCR/ F şi FISH efectuate pe conuri de cartof Se realizează o cultură de 48 de ore dintr-o tulpină virulentă de Ralstonia solanacearum biovar 2 rasa 3 (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pe mediu general SMSA şi se face o suspensie în tampon fosfat 10 mM pentru a obţine o densitate celulară de circa 2 x 10^8 ufc/ml. În general, aceasta se obţine printr-o suspensie uşor tulbure echivalentă cu o densitate optică de 0,15-600 nm.
\n
Se extrag conurile de la 200 de tuberculi de cartof, varietate cu coaja albă cunoscută ca fiind neinfectată cu Ralstonia solanacearum.
\n
Conurile se tratează după metoda obişnuită şi se resuspendă sedimentul în 10 ml.
\n
Se pregătesc 10 microfiole sterile de 1,5 ml cu 900 f2μl de sediment resuspendat.
\n
Se transferă 100 f2μl din suspensia de Ralstonia solanacearum în prima microfiolă şi se omogenizează prin vortexare.
\n
Se realizează diluţii zecimale în următoarele 5 microfiole.
\n
Cele 6 microfiole contaminate vor fi utilizate drept control pozitiv. Cele 4 microfiole necontaminate se vor folosi în calitate de control negativ. Se etichetează microfiolele în mod corespunzător.
\n
Se prepară alicote de 100 f2μl în microfiole sterile de 1,5 ml pentru a obţine 9 replici din fiecare control. Se conservă la - 16 şi - 24°C până la utilizare.
\n
Prezenţa şi concentraţia de celule de Ralstonia solanacearum în control trebuie confirmate în primul rând prin IF.
\n
Pentru testul PCR, se efectuează o extracţie de ADN din controale pozitive şi negative pentru fiecare serie de probe de testare.
\n
Pentru testele IF şi FISH, se efectuează teste asupra controalelor pozitive şi negative pentru fiecare serie de probe de testare.
\n
Pentru testele IF şi FISH, nivelul de detecţie al celulelor de Ralstonia solanacearum trebuie să fie de cel puţin 10^6 şi 10^4 celule/ml în controlul pozitiv, iar în controlul negativ să nu fie detectate.
\n
Apendicele 4 Tampoane pentru procedura de testare Generalităţi: tampoanele sterilizate nedeschise pot fi păstrate până la un an.
\n
1.Soluţii-tampon pentru procedura de extracţie 1.1. Tampon de extracţie (50 mM tampon fosfat, pH 7,0) Acest tampon este utilizat pentru extracţia bacteriei din ţesuturile plantei prin omogenizare sau agitare.
\n
Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Utilizarea următorilor compuşi suplimentari poate fi utilă: _________ (*) A se utiliza cu metoda de extracţie prin omogenizare.
\n
1.2. Tampon de extract concentrat (10 mM tampon fosfat, pH 7,2) Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea şi diluţia extractelor de conuri de tuberculi de cartof ca urmare a concentrării prin centrifugare.
\n
Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
2.Soluţii-tampon pentru testul de imunofluorescenţă 2.1. Tampon IF: 10 mM PBS, pH 7,2 Acest tampon este utilizat pentru diluţia anticorpilor.
\n
Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
2.2. Tampon IF-Tween Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor.
\n
Se adaugă 0,1 % Tween 20 la tamponul IF.
\n
2.3. Tampon glicerol fosfat, pH 7,6 Acest tampon este utilizat pentru montarea lamei IF pentru mărirea fluorescenţei.
\n
În comerţ sunt disponibile soluţii-suport antidecolorare, de exemplu, Vectashield(R) (Vector Laboratories) sau Citifluor(R) (Leica).
\n
3.Soluţii tampon pentru testul ELISA indirect 3.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6 Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Poate fi adăugat sulfit de sodiu (0,2 %) ca antioxidant pentru a împiedica constituirea de compuşi aromatici oxidaţi.
\n
3.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,4 3.3. PBS-Tween 3.4. Tampon de blocare (anticorpi) (trebuie preparat proaspăt) 3.5. Soluţie de substrat de fosfatază alcalină, pH 9,8 Se amestecă şi se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.
\n
Se adaugă apă distilată până la 1 litru.
\n
Se adaugă 0,2 g MgCl(2).
\n
Se dizolvă două tablete de 5 mg de substrat de fosfatază (Sigma) la 15 ml de soluţie.
\n
4.Tampoane pentru testul DASI ELISA 4.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6 Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul.
\n
4.2. 10 x tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,2-7,4 4.3. PBS-Tween 4.4. Tampon de substrat, pH 9,8 Se amestecă şi se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.
\n
Apendicele 5 Stabilirea gradului de contaminare în testele IF şi FISH 1. Se calculează numărul mediu de celule fluorescente tipice pe câmp (c).
\n
2.Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe godeul lamei de microscop (C).
\n
3.Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe ml de sediment resuspendat (N).
\n
N = C x 1.000/y x F, unde: y = volumul de extract concentrat resuspendat şi per godeu, F = factorul de diluţie al sedimentului resuspendat Apendicele 6 Protocoale PCR şi reactivi validaţi NOTĂ: Testele preliminare trebuie să permită detecţia reproductibilă a 10^3-10^4 celule de Ralstonia solanacearum pe ml de extract de probă De asemenea, testele preliminare nu trebuie să indice rezultate fals pozitive cu o gamă de tulpini bacteriene selecţionate (vezi apendicele 3).
\n
1.Protocolul PCR Seal et al. (1993) 1.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor Dimensiunea prevăzută a ampliconului de ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum = 288 bp 1.2. Amestecul reactiv pentru PCR _______
\n
1)Metoda a fost validată cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.
\n
1.3. Condiţiile reacţiei PCR Se urmează procedura:
\n
NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.
\n
1.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconului Fragmentele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 37°C cu enzima Ava II.
\n
2.Protocolul PCR Pastrik & Maiss (2000) 2.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ului-ţintă de Ralstonia solanacearum = 553 bp.
\n
2.2. Amestecul reactiv pentru PCR ________
\n
1)Metodele au fost validate cu Taq polimerază de PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.
\n
NOTĂ: Optimizată iniţial pentru termociclorul MJ Research PTC 200 cu polimerază Taq Gibco.
\n
AmpliTaq de PerkinElmer şi tamponul pot fi utilizate, de asemenea, la aceleaşi concentraţii.
\n
2.3. Condiţiile reacţiei PCR Se urmează procedura:
\n
NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.
\n
2.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconului Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricţie obţinute din fragmentul specific de ADN de Ralstonia solanacearum au o lungime de 457 bp şi de 96 bp.
\n
3.Protocolul multiplex PCR şi cu control intern al PCR (Pastrik et al., 2002) 3.1. Secvenţa de primer de oligonucleotide Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum = 718 bp (în prezenţa setului de primeri Rs) Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului intern al PCR de 18S ARNr = 310 bp (în prezenţa setului de primeri Ns) 3.2. Amestecul reactiv pentru PCR _________
\n
1)Metodele au fost validate cu polimerază Taq de PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.
\n
2)Concentraţiile primerilor Ns-5-F şi Ns-6-R au fost optimizate pentru extracţia conurilor de cartof, utilizându-se metoda de omogenizare şi pentru metoda de izolare a ADN Pastrik (2000) (vezi secţiunea VI. A.6.1.a). Va fi nevoie de o nouă optimizare a concentraţiilor de reactivi în cazul în care se aplică extracţia prin agitare şi se folosesc alte metode de izolare de ADN.
\n
3.3. Condiţiile reacţiei PCR Se urmează procedura:
\n
NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.
\n
3.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconului Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzimă izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute.
\n
4.Protocolul PCR biovar specific de Ralstonia solanacearum (Pastrik et al., 2001) 4.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum: cu Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp cu Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.
\n
4.2. Amestecul reactiv pentru PCR
\n
a)PCR specific biovarului 1/2 ... ________
\n
1)Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.
\n
b)PCR specific biovarului 3/4/5 ... _________
\n
1)Metodele au fost validate cu polimerază Taq PerkinElmer (AmpliTaq) şi Gibco BRL.
\n
4.3. Condiţiile reacţiei PCR Se urmează procedura descrisă în continuare pentru reacţiile specifice biovarului 1/2 şi biovarului 3/4/5:
\n
NOTĂ: Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor (îi), (iii) şi (iv) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.
\n
4.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimerului Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F şi Rs-1-R produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzima izoschizomeră (de exemplu, Mva 1269 I) timp de 30 de minute. Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizând primerii Rs-1-F şi Rs-3-R nu au puncte de restricţie.
\n
5.Prepararea tamponului de încărcare 5.1. Albastru de bromfenol (soluţie concentrată de 10%) 5.2. Tampon de încărcare 6. Tampon tris-acetat EDTA (TAE) 10 x, pH 8,0 Înainte de utilizare se diluează până la 1 x.
\n
De asemenea, acest tampon este disponibil în comerţ (de exemplu, Invitrogen sau echivalent).
\n
Apendicele 7 Reactivi validaţi pentru testul FISH 1. Oligosonde Sondă OLI-1-CY3 specifică Ralstonia solanacearum: 5'-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3' Sondă eubacteriană EUB-338-FITC nespecifică: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3' 2. Soluţia de fixare Atenţie! Soluţia de fixare conţine paraformaldehidă, care este toxică, se manipulează cu mănuşi şi nu se inhalează. Se recomandă să se lucreze într-o hotă chimică. (i) Se încălzesc 9 ml de apă pentru biologie moleculară (de exemplu, apă ultrapură) la circa 60°C şi se adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehida se dizolvă după adăugarea a 5 picături de NaOH 1N şi amestecarea pe un agitator magnetic. (îi) Se ajustează pH-ul la 7,0 prin adăugarea a 1 ml de tampon fosfat 0,1 M (PB; pH 7,0) şi 5 picături de HCl 1 N. Se verifică pH-ul cu benzi indicatoare şi se ajustează, atunci când este necesar, cu HCl sau NaOH.
\n
Atenţie! Nu se foloseşte pH-metrul în soluţii care conţin paraformaldehidă. (iii) Se filtrează soluţia printr-un filtru cu membrană de 0,22 f2μm şi se păstrează la 4°C până la utilizare ferită de praf.
\n
3.Hibmix 3 x Se diluează până la 1 x, după cum este prevăzut.
\n
4.Soluţie de hibridizare Hibmix 1 x Se prepară cantităţile de soluţie de hibridizare în conformitate cu reţeta din tabelul 1. Pentru fiecare lamă (conţinând două probe diferite duplicate) este nevoie de 90 f2μl de soluţie de hibridizare.
\n
Important: Formamida este foarte toxică. Prin urmare, se poartă mănuşi şi se iau măsurile de siguranţă necesare!
\n
Tabelul 1. Cantităţi recomandate pentru prepararea amestecului de hibridizare NOTĂ: Toate soluţiile care conţin oligosonde sensibile la lumină se păstrează la întuneric, la - 20°C.
\n
Se protejează de lumina directă a soarelui sau de lumina electrică directă în timpul utilizării.
\n
5.Tampon fosfat 0,1 M, pH 7,0 Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.
\n
Apendicele 8 Condiţii de cultură pentru vinete şi tomate Se însămânţează seminţe de tomate (Lycopersicon esculentum) şi de vinete (Solanum melongena) în pământ de seră pasteurizat. Se transplantează plantulele în pământ pentru flori pasteurizat atunci când cotiledoanele sunt dezvoltate în totalitate (10-14 zile).
\n
Vinetele sau tomatele trebuie cultivate în seră, înainte de inoculare, în următoarele condiţii de mediu:
\n
Durata zilei: 14 ore sau durata naturală a zilei atunci când este mai mare REFERINŢE 1. Amann, R.I., L Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative. Phylogenetic and environmental studies în microbiology. Ţ. Bacteriol. 1 72: 762-770.
\n
2.Anon. 1998. Council Directive 98/5 7/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.
\n
3.Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. l.abarre and B. (ouan. 1999. Design of division specific primers of (Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 10^5; 373-380.
\n
4.Caruso, P., Gorris, M.T.. Cambra, M.. Palomo, Ţ.L. Collar, Ţ and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody lor sensitive Detection of Ralstonia solanacearum în Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68. 3634-3638.
\n
5.Cook, D., Barlow, E. and Sequeira. L. 1989. Genetic diversity ol Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive respon. se. Molecular PlantMicrobe Interactions 1:113-121.
\n
6.Elphinstone. J.G., Hcnnessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanaceamm în potato tuber extracts. FPPO Buletin 26: 663-678.
\n
7.Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. În: A.C. Hayward (ecL) Bacterial Wilt Newsletter 10. 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research. Canberra, Australia.
\n
8.Hayward, A.C. 1964. Characteristics ol Pseudomonas solanacearum. Journal ol Applied Bacteriology 27: 265-277.
\n
9.Hayward, A.C., El-Nashaar. H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation în nitrate metabolism în biovars of Pseudomonas solanacearm. Journal of Applied Bacteriology 69: 269-280.
\n
10.Ito, S.. Y. Ushijima. T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-lwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum în soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.
\n
11.Janse, j.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum în symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Buletin OEPP/EPPO Buletin 18. 343-351.
\n
12.Janse. J.D. 1991. Infra- and inlra-spccilic classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatly-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.
\n
13.Kelman, A. 1954. The relationship ol pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.
\n
14.Klemenl Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods în Phytobacteriology. Akadcmiai Kiado, Budapest, 568 pp.
\n
15.Lelliott. R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd.. Oxford. 216 pp.
\n
16.Lopez. M.M.. Corns, M.T., Hop, P., Cubero. J., Vicedo, B.. Cambra, M., 1 997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. În: H.W. Dehne ft al., (eds). Klewer Academic Publishers, pp. 117-121.
\n
17.Louws, F.J., Fulbright, D.W.. Stephens. C.T. and Dc Bruijn, F.J.. 1994. Specific genomic fingerprints of phytopalhogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.
\n
18.Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, FJ. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85: 528-5 36.
\n
19.Opina, N., F. Tavner. G. Holloway, Ţ.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5: 19-33.
\n
20.Pastrik, K.H. and Maiss. E. 2000. Detection of Ralstonia solanacearum în potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.
\n
21.Pastrik. K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 1 6S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.
\n
22.Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearm, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7. 67-79.
\n
23.Schaad, W. 2001. Laboratory guide fur identification of plant pathogenic bacteria. Schaad fHrsg. ş.-3. cd.: Şi. Paul, Minnesota: 373 pp.
\n
24.Seal, S.E., LA. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum. Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by parţial 16S rRNA sequencing: construction of oligonuclc-oiide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1 594.
\n
25.Smith)., Offord. I..C, Holderness, M. and Snaddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solamcearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 în Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61: 4262-4268.
\n
26.Stead. D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42: 281-295.
\n
27.Taghavi. M., Hayward, A.C.O, Sly, L.I, Fcgan, M. 1996. Analysis of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46: 10-15.
\n
28.Van Der Wolf, J.M.. Bonants. P.J.M.. Smith, J.J., Hagcnaar, M., Nijhuis. E., Van Bcckhoven. J.R.C.. Saddler, G.S.. Trigalet. A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 în Western Europe as determined by AFLP. RC-PFGE and rep-PCR. În: Prior. P., Alien, C. and Elphinstonc. J. (eds.) Bacterial will disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.
\n
29.Weller, S.A.. Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead. D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.
\n
30.Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanaceanun, which causes brown rot of potato, by fluorescent în situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.
\n
Anexa III 1. Pentru fiecare apariţie suspectată pentru care a fost identificat un rezultat pozitiv la testul sau testele de detecţie, în conformitate cu metodele prevăzute în anexa nr. II pentru materialul de plantare şi în toate celelalte cazuri, pentru care este aşteptată confirmarea sau infirmarea, trebuie să se păstreze şi să se conserve în mod corespunzător:
\n
-toţi tuberculii prelevaţi şi, în măsura în care este posibil, toate plantele prelevate;
\n
-orice extract rămas şi material preparat suplimentar pentru testul sau testele de detecţie, de exemplu, lamele de imunofluorescenţă; şi
\n
-toată documentaţia relevantă, până la finalizarea metodei menţionate.
\n
Păstrarea tuberculilor permite testarea soiului, efectuată atunci când este cazul.
\n
2.În cazul confirmării organismului, trebuie să se păstreze şi să se conserve în condiţii corespunzătoare:
\n
-materialul specificat la pct. 1;
\n
-o probă de tomate sau vinete infectate prin inoculare cu extract din tuberculi sau plante, după caz; şi
\n
-cultura izolată a organismului, timp de cel puţin o lună după procedura de notificare prevăzută la art. 9 din ordin.
\n
Anexa IV Elementele din investigaţia prevăzută la art. 8 alin. (2) lit. a) din ordin includ, acolo unde este cazul: (i) locurile de producţie:
\n
-în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi care sunt înrudiţi prin clonare cu cartofii depistaţi ca fiind infectaţi cu acest organism;
\n
-în care se cultivă sau au fost cultivate tomate care sunt din aceeaşi sursă cu tomatele depistate ca fiind infectate cu acest organism;
\n
-în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi ori tomate care au fost plasaţi sub control oficial datorită apariţiei suspectate a organismului;
\n
-în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi care sunt înrudiţi prin clonare cu cartofii care au fost cultivaţi în locurile de producţie depistate ca fiind infestate cu acest organism;
\n
-în care se cultivă cartofi sau tomate şi care sunt situate în vecinătatea unor locuri de producţie infestate, incluzând acele locuri de producţie care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;
\n
-care utilizează pentru irigare sau stropire apa de suprafaţă din orice sursă confirmată ori suspectată a fi contaminată cu acest organism;
\n
-care utilizează pentru irigare sau stropire apa de suprafaţă dintr-o sursă folosită în comun cu locurile de producţie confirmate sau suspectate a fi infestate cu acest organism;
\n
-care sunt sau au fost inundate cu apa de suprafaţă confirmată ori suspectată a fi contaminată cu acest organism; şi (îi) apă de suprafaţă utilizată la irigare sau stropire sau care a inundat unul sau mai multe câmpuri sau locuri de producţie confirmate a fi infestate cu acest organism.
\n
Anexa V 1. Elementele care trebuie luate în considerare la determinarea extinderii contaminării probabile în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. e) şi alin. (4) lit. c) din ordin includ:
\n
-materialul de plantare cultivat într-un loc de producţie desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin;
\n
-locurile de producţie care au legătură cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, inclusiv cele care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;
\n
-materialul de plantare produs în locul sau locurile de producţie prevăzute la liniuţa anterioară sau care se află în aceste locuri de producţie în timpul perioadei în care materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin a fost prezent la locul de producţie prevăzut la prima liniuţă;
\n
-spaţiile în care se manipulează materialul de plantare provenit din locurile de producţie menţionate la liniuţele anterioare;
\n
-orice utilaj, vehicul, container, depozit sau unităţi ale acestora şi orice alt obiect, inclusiv ambalajul, care au venit în contact cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin;
\n
-orice material de plantare depozitat în sau în contact cu oricare dintre structurile sau obiectele menţionate la liniuţa anterioară, înainte de curăţarea şi dezinfectarea acestora;
\n
-ca rezultat al investigaţiei şi testării în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. a) din ordin, în cazul cartofilor, acei tuberculi sau plante cu o înrudire clonală colaterală ori parentală şi, în cazul tomatelor, acele plante cu aceeaşi sursă ca materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin şi pentru care apare probabilă contaminarea printr-o legătură clonală, deşi rezultatele testării privind prezenţa organismului pot fi negative. Testarea soiului poate fi efectuată pentru a se verifica identitatea tuberculilor sau a plantelor contaminate şi legătura clonală;
\n
-locul sau locurile de producţie a materialului de plantare menţionat la liniuţa anterioară;
\n
-locul sau locurile de producţie a materialului de plantare care utilizează pentru irigare ori stropire apă care a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 8 alin. (4) lit. b) din ordin;
\n
-materialul de plantare produs în câmpurile inundate cu apă de suprafaţă confirmată ca fiind contaminată.
\n
2.Elementele care trebuie luate în considerare la determinarea unei posibile răspândiri în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) din ordin includ: (i) în cazurile prevăzute la art. 8 alin. (2) lit. f) din ordin:
\n
-vecinătatea altor locuri de producţie care cultivă materialul de plantare;
\n
-producţia şi utilizarea în comun a stocurilor de cartofi de sămânţă;
\n
-locurile de producţie care utilizează apă de suprafaţă pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare, în cazurile în care există sau a existat riscul de scurgere ori de inundare cu apă de suprafaţă din unul sau mai multe locuri de producţie desemnate ca fiind contaminate în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin; (îi) în cazurile în care apa de suprafaţă a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu art. 8 alin. (4) lit. b) din ordin:
\n
-locul sau locurile de producţie învecinate care produc materialul de plantare sau care sunt în pericol de a fi inundate cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată;
\n
-orice bazin de irigare îngropat, care are legătură cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată;
\n
-întinderile de apă în legătură cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată, ţinându-se seama de:
\n
-direcţia şi nivelul debitului apei desemnate ca fiind contaminată;
\n
-prezenţa plantelor-gazdă sălbatice solanacee.
\n
3.Notificarea prevăzută la art. 9 din ordin include:
\n
-imediat după confirmarea prezenţei organismului prin teste de laborator, efectuate conform metodelor prevăzute în anexa nr. II, cel puţin:
\n
-pentru cartofi:
\n
a)denumirea soiului lotului; ...
\n
b)tipul (consum, sămânţă etc.) şi, dacă este cazul, categoria de cartofi de sămânţă; ...
\n
-pentru plantele de tomate, denumirea soiului lotului şi, dacă este cazul, categoria;
\n
-fără a prejudicia cerinţele de notificare a unei apariţii suspectate conform art. 7 alin. (2) din ordin, statul membru în care a fost confirmată apariţia, în cazul în care există riscul de contaminare a materialului de plantare provenit din unul sau mai multe state membre, comunică de îndată statului membru sau statelor membre în cauză informaţiile necesare conform art. 10 din ordin, cum ar fi:
\n
a)denumirea soiului lotului de cartofi sau tomate; ...
\n
b)numele şi adresa expeditorului şi destinatarului; ...
\n
c)data livrării lotului de cartofi sau tomate; ...
\n
d)mărimea lotului de cartofi sau tomate livrat; ...
\n
e)atunci când este cazul, o copie a paşaportului fitosanitar sau cel puţin numărul paşaportului fitosanitar sau numărul de înregistrare al producătorului sau al comerciantului şi o copie a bonului de livrare. ...
\n
Comisiei i se notifică imediat aceste informaţii.
\n
4.Detaliile notificării suplimentare prevăzute la art. 9 alin. (2) din ordin includ, după finalizarea tuturor investigaţiilor, pentru fiecare caz:
\n
a)data la care s-a confirmat contaminarea; ...
\n
b)o scurtă descriere a investigaţiilor realizate pentru identificarea sursei şi posibilei răspândiri a contaminării, precizându-se intensitatea prelevării; ...
\n
c)informaţii privind sursa/sursele identificate sau presupuse ale contaminării; ...
\n
d)detalii ale întinderii contaminării desemnate, inclusiv numărul de locuri de producţie, şi pentru cartofi, numărul de loturi, cu indicarea soiului şi, în cazul cartofului de sămânţă, a categoriei; ...
\n
e)detalii ale zonei delimitate, inclusiv numărul de locuri de producţie nedesemnate ca fiind contaminate, dar incluse în zonă; ...
\n
f)detalii ale apei desemnate ca fiind contaminată, inclusiv numele şi amplasarea apei şi întinderea desemnării/interdicţia de irigare; ...
\n
g)pentru orice transport sau lot de plante de tomate desemnat ca fiind contaminat, certificatele fitosanitare prevăzute la art. 11 alin. (2) lit. d) şi alin. (3), (4) şi (5) din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 şi numărul paşaportului, în conformitate cu anexa nr. V partea A secţiunea 1 pct. 2.2 din Hotărârea Guvernului nr. 563/2007; ...
\n
h)toate celelalte informaţii pe care Comisia le solicită, referitoare la focarul sau focarele confirmate. ...
\n
Anexa VI 1. Prevederile art. 11 din ordin se referă la:
\n
-utilizarea în hrana animalelor după tratamentul termic, astfel încât să nu existe niciun risc de supravieţuire a organismului; sau
\n
-eliminarea deşeurilor într-un loc autorizat de distrugere, în mod oficial, în care nu există niciun risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu, prin infiltrare în terenuri agricole sau prin contact cu surse de apă care pot fi utilizate pentru irigarea terenurilor agricole; sau
\n
-incinerare; sau
\n
-transformarea industrială prin livrare directă şi imediată la o fabrică de procesare care dispune de instalaţii de eliminare a deşeurilor, autorizate oficial, despre care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi că dispune de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau
\n
-alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului; aceste măsuri şi justificarea lor trebuie să fie notificate Comisiei şi celorlalte state membre.
\n
Toate deşeurile asociate şi care rezultă din operaţiile menţionate anterior sunt eliminate prin metode aprobate oficial în conformitate cu anexa nr. VII.
\n
2.Utilizarea sau eliminarea corespunzătoare a materialului de plantare prevăzut la art. 12 din ordin, sub controlul organismelor oficiale responsabile ale statului membru sau ale statelor membre în cauză, prin comunicări corespunzătoare între organismele oficiale responsabile pentru a asigura controlul permanent şi aprobarea de către organismele oficiale responsabile ale statului membru în care cartofii urmează să fie ambalaţi sau procesaţi, cu privire la instalaţiile de eliminare a deşeurilor menţionate la prima şi a doua liniuţă, include: (i) pentru tuberculii de cartofi:
\n
-utilizarea acestora drept cartofi destinaţi consumului gata ambalaţi pentru livrare şi utilizarea directă, fără reambalare, într-un loc care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor. Cartofii destinaţi plantării pot fi manipulaţi în acelaşi loc, numai dacă sunt manipulaţi separat sau după curăţarea şi dezinfectarea acestuia; sau
\n
-utilizarea acestora drept cartofi de consum destinaţi procesării industriale după livrare directă şi imediată la o fabrică de prelucrare care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor, precum şi de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau
\n
-un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi supus aprobării de către organismele oficiale responsabile; (îi) pentru alte părţi de plantă, inclusiv resturi de tulpini şi frunze:
\n
-distrugerea; sau
\n
-un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului şi supus aprobării de către organismele oficiale responsabile.
\n
3.Metodele corespunzătoare de decontaminare a obiectelor prevăzute la art. 13 din ordin sunt curăţarea şi, dacă este cazul, dezinfectarea, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil de răspândire a organismului. Aceste metode sunt aplicate sub control oficial.
\n
4.Măsurile care trebuie puse în aplicare în zona (zonele) demarcată(e), stabilită(e) conform art. 8 alin. (2) lit. f) şi alin. (4) lit. c) din ordin şi menţionate la art. 14 din ordin includ:
\n
4.1. atunci când locurile de producţie au fost desemnate ca fiind contaminate conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin:
\n
a)într-un câmp sau într-o unitate de producţie de cultură protejată desemnată ca fiind contaminată conform cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin; ... (i) în cursul a cel puţin 4 ani de cultură care urmează contaminării desemnate:
\n
-sunt luate măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartof şi tomate, precum şi a altor plante-gazdă ale organismului, inclusiv a buruienilor solanacee; şi
\n
-nu se plantează următoarele:
\n
-tuberculi, plante sau seminţe de cartof;
\n
-plante şi seminţe de tomate;
\n
-ţinându-se seama de biologia organismului;
\n
-alte plante-gazdă;
\n
-plante din specia Brassica pentru care există un risc identificat de supravieţuire a organismului;
\n
-culturi pentru care există un risc identificat de răspândire a organismului;
\n
-în primul sezon de cultură a cartofilor sau tomatelor care urmează după perioada specificată la liniuţa anterioară şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă, inclusiv buruieni solanacee, în timpul inspecţiilor oficiale pentru cel puţin 2 ani consecutivi de cultură înainte de plantare;
\n
-în cazul cartofilor, se va autoriza numai producţia de cartofi pentru consum;
\n
-în cazul cartofilor şi tomatelor, tuberculii de cartof sau plantele de tomate recoltate vor fi testate, după caz, în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr. II;
\n
-în sezonul de cultură a cartofilor sau tomatelor care urmează celui prevăzut la liniuţa anterioară şi după un ciclu adecvat de rotaţie, care trebuie să fie de minimum 2 ani, se autorizează plantarea cartofilor de sămânţă şi se efectuează inspecţii oficiale conform art. 2; sau (îi) pe parcursul a 5 ani de cultură care urmează anului contaminării desemnate:
\n
-se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi tomate, precum şi a altor plante-gazdă ale organismului prezente în mod spontan, inclusiv a buruienilor solanacee; şi
\n
-terenul trebuie menţinut, în cursul primilor 3 ani, înţelenit sau cultivat cu cereale în conformitate cu riscul identificat sau ca păşune permanentă şi în acest caz este frecvent cosit scurt sau păşunat intensiv sau cultivat cu iarbă pentru producţia de seminţe, urmată de plantarea în următorii 2 ani cu plante care nu sunt gazdă organismului pentru care nu există un risc identificat de supravieţuire sau răspândire a organismului;
\n
-în primul sezon de cultivare a cartofilor sau tomatelor care urmează după perioadă specificată la liniuţa anterioară şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă, inclusiv buruieni solanacee, în timpul inspecţiilor oficiale timp de cel puţin 2 ani consecutivi înainte de plantare:
\n
-în cazul cartofilor, se autorizează producţia de cartofi de sămânţă sau de consum;
\n
-tuberculii de cartof sau plantele de tomate recoltate se testează, după caz, în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr. II;
\n
b)în toate celelalte terenuri din locul de producţie contaminat şi cu condiţia ca organismele oficiale să aibă certitudinea că riscul reprezentat de plantele spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă ale organismului, inclusiv buruienile solanacee prezente în mod spontan, a fost eliminat: ...
\n
-în anul de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:
\n
-fie nu se plantează niciun tubercul, plantă, sămânţă de cartof sau altă plantă-gazdă a organismului; sau
\n
-în cazul tuberculilor de cartof, cartofii de sămânţă certificaţi pot fi plantaţi numai pentru producţia destinată consumului;
\n
-în cazul plantelor de tomate, răsadul de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 poate fi plantat numai pentru producţia de fructe;
\n
-în al doilea an de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:
\n
-în cazul cartofilor, se plantează numai cartofi de sămânţă certificaţi sau cartofi de sămânţă testaţi oficial pentru detecţia prezenţei veştejirii bacteriene şi cultivaţi sub control oficial în locuri de producţie, altele decât cele prevăzute la pct. 4.1 pentru producţia de cartofi de sămânţă sau consum;
\n
-în cazul tomatelor, numai răsadul de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau, în cazul înmulţirii vegetative din plante de tomate obţinute din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial în locuri de producţie, altele decât cele menţionate la pct. 4.1, poate fi plantat fie pentru producţia de material de înmulţire, fie pentru producţia de fructe;
\n
-în cel de-al treilea an de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:
\n
-în cazul cartofilor, se plantează numai cartofi de sămânţă certificaţi sau cultivaţi sub control oficial proveniţi din cartofi de sămânţă certificaţi pentru producţia de cartofi de sămânţă sau de consum;
\n
-în cazul tomatelor, se plantează numai răsad de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau plante de tomate obţinute sub control oficial din astfel de plante, fie pentru producţia de material de înmulţire, fie pentru producţia de fructe;
\n
-în fiecare dintre anii de cultivare prevăzuţi la liniuţele anterioare, se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi a altor plante-gazdă ale organismului şi se desfăşoară inspecţii oficiale ale culturii în perioade adecvate şi, pe fiecare câmp de cartofi, cartofii recoltaţi sunt testaţi oficial în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr. II;
\n
c)imediat după desemnarea contaminării în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin şi după primul an de cultivare care urmează: ...
\n
-toate utilajele şi instalaţiile de depozitare de la locul de producţie şi implicate în producţia cartofilor sau tomatelor sunt curăţate şi, după caz, dezinfectate, utilizându-se metodele corespunzătoare prevăzute la pct. 3;
\n
-sunt introduse controale oficiale ale programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a acestora, pentru a preveni răspândirea organismului atunci când este cazul;
\n
d)într-o unitate de producţie de cultură protejată, desemnată ca fiind contaminată conform art. 8 alin. (2) lit. b), c) şi d) din ordin, unde este posibilă înlocuirea completă a mediului de creştere: ...
\n
-nu se plantează niciun tubercul, nicio plantă sau sămânţă de cartof ori alte plante-gazdă ale organismului, inclusiv plante şi seminţe de tomate, cu excepţia cazului în care unitatea de producţie respectivă a fost supusă măsurilor oficiale de control pentru eliminarea organismului şi pentru îndepărtarea întregului material vegetal gazdă, inclusiv o schimbare completă a mediului de cultură, curăţarea şi, după caz, dezinfectarea unităţii respective, a întregului echipament şi în care a fost acordată ulterior aprobarea pentru producţia de cartofi sau tomate din partea organismelor oficiale responsabile; şi
\n
-pentru producţia de cartofi, această producţie trebuie să provină din cartofi de sămânţă certificaţi sau din minituberculi ori microplante provenite din surse testate;
\n
-pentru producţia de tomate, această producţie trebuie să provină din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau, în cazul înmulţirii vegetative, din răsad de tomate provenit din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial;
\n
-sunt introduse controale oficiale asupra programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a acestora, pentru prevenirea răspândirii organismului, atunci când este cazul.
\n
4.2. Fără a prejudicia măsurile descrise la pct. 4.1, organismele oficiale responsabile în cadrul zonei demarcate:
\n
a)imediat după contaminarea desemnată, se asigură că toate echipamentele şi instalaţiile de depozitare din astfel de locuri şi implicate în producţia de cartofi sau de tomate sunt curăţate şi dezinfectate corespunzător, în conformitate cu metodele descrise la pct. 3; ...
\n
b)imediat după desemnarea contaminării şi timp de cel puţin 3 ani de cultivare: ... (ba) în cazurile în care zona demarcată a fost determinată conform art. 8 alin. (2) lit. f) din ordin:
\n
-se asigură supravegherea de către organismele oficiale a locurilor de cultivare, depozitare sau de manipulare a tuberculilor de cartofi sau a tomatelor, împreună cu locurile în care funcţionează utilajele pentru prelucrarea cartofilor sau a tomatelor;
\n
-se solicită plantarea doar a seminţelor certificate sau a seminţelor cultivate sub control oficial pentru toate culturile de cartofi din zona respectivă şi testarea după recoltare a cartofilor de sămânţă cultivaţi în locurile de producţie desemnate ca fiind probabil contaminate în conformitate cu art. 8 alin. (2) lit. e) din ordin;
\n
-se solicită manipularea separată a stocurilor de cartofi de sămânţă recoltaţi faţă de cele destinate consumului în toate locurile din zona respectivă sau punerea în aplicare a unui sistem de curăţare şi, după caz, de dezinfecţie între procedurile de manipulare a stocurilor de cartofi de sămânţă şi a celor destinaţi consumului;
\n
-se solicită plantarea numai a plantelor de tomate provenite din seminţe care îndeplinesc cerinţele prevăzute de Hotărârea Guvernului nr. 563/2007 sau, în cazul înmulţirii vegetative, din răsad provenit din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial, pentru toate culturile de tomate din zona respectivă;
\n
-se desfăşoară inspecţii oficiale în conformitate cu art. 2 din ordin; (bb) în cazurile în care apa de suprafaţă a fost declarată contaminată în conformitate cu art. 8 alin. (4) lit. b) din ordin sau inclusă printre elementele de răspândire posibilă a organismului în conformitate cu anexa nr. V pct. 2:
\n
-se desfăşoară inspecţii anuale în perioade adecvate, inclusiv prelevarea de probe de apă de suprafaţă şi, după caz, a plantelor-gazdă solanacee din sursele relevante de apă, precum şi testarea în conformitate cu metodele stabilite în anexa nr. II pentru materialul de plantare şi pentru celelalte cazuri;
\n
-se introduc controale oficiale asupra programelor de irigare şi stropire, inclusiv o interzicere a utilizării apei desemnate ca fiind contaminată pentru irigarea şi stropirea materialului de plantare şi, după caz, a altor plante-gazdă, pentru a preveni răspândirea organismului. Această interdicţie poate fi revizuită în baza rezultatelor obţinute din inspecţiile anuale şi desemnările de contaminare pot fi retrase atunci când organismele oficiale responsabile sunt sigure că apele de suprafaţă nu mai sunt contaminate. Utilizarea apei supuse interdicţiei poate fi autorizată sub control oficial, pentru irigarea şi stropirea plantelor-gazdă în cazul în care tehnicile aplicate, autorizate oficial, elimină organismul şi împiedică răspândirea acestuia;
\n
-în cazurile în care deşeurile lichide deversate sunt contaminate, se introduc controale oficiale pentru eliminarea deşeurilor solide ori lichide din fabricile de procesare industrială sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de plantare;
\n
c)se stabileşte un program, după caz, de înlocuire a tuturor stocurilor de cartofi de sămânţă într-o perioadă de timp corespunzătoare. ...
\n
Anexa VII Metodele de eliminare a deşeurilor aprobate oficial, prevăzute la pct. (1) din anexa nr. VI, trebuie să fie în conformitate cu următoarele prevederi, astfel încât să se evite orice risc identificabil de răspândire a organismului: (i) deşeurile de cartofi şi tomate (inclusiv cartofii respinşi, cojile şi tomatele), precum şi orice alt deşeu solid asociat cartofilor şi tomatelor (inclusiv solul, pietrele şi alte resturi) sunt eliminate, fie:
\n
-într-un loc autorizat de eliminare a deşeurilor aprobat oficial în care nu există niciun risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu, prin infiltrare în terenurile agricole sau în contact cu surse de apă care pot fi utilizate pentru irigarea terenurilor agricole. Deşeurile sunt transportate direct în locurile respective în condiţii de izolare, astfel încât să nu existe riscul răspândirii acestora; sau
\n
-prin incinerare; sau
\n
-prin alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există niciun risc identificabil de răspândire a organismului. Aceste măsuri trebuie notificate Comisiei şi celorlalte state membre; (îi) deşeurile lichide: înainte de eliminare, deşeurile lichide care conţin particule solide în suspensie trebuie să fie supuse unui procedeu de filtrare sau de sedimentare pentru a le îndepărta. Aceste particule solide vor fi eliminate conform pct. (i).
\n
Apoi deşeurile lichide sunt ulterior:
\n
-complet încălzite la o temperatură de 60°C timp de cel puţin 30 de minute înainte de a fi eliminate; sau
\n
-eliminate într-un alt mod, aprobat oficial şi sub control oficial, astfel încât să nu existe niciun risc identificabil ca deşeurile să între în contact cu terenurile agricole sau cu surse de apă care ar putea fi folosite pentru irigarea terenurilor agricole. Detaliile cu privire la aceasta sunt notificate celorlalte state membre şi Comisiei.
\n
Procedurile descrise în prezenta anexă se aplică, de asemenea, şi deşeurilor rezultate de la manipularea, eliminarea şi prelucrarea loturilor contaminate. _________