← Danmark

sø- & handelsrettens dombog

- mah udskrift af sø- & handelsrettens dombog ____________ kendelse afsagt den

  1. november 2017 a-22-17 millennium pharmaceuticals inc. (advokat sture rygaard) mod teva denmark a/s (advokat klaus ewald madsen) og a-33-17 millennium pharmaceuticals inc. (advokat sture rygaard) mod teva b.v. (advokat klaus ewald madsen) -2- sagernes baggrund og parternes påstande disse to sager om midlertidigt forbud og påbud i henhold til retsplejelovens kapitel 40 hand- ler om, hvorvidt henholdsvis teva denmark a/s og teva b.v. ved fremstilling, udbud, salg og anvendelse af det generiske lægemiddel ”bortezomib teva” krænker millennium phar- maceuticals inc.’s rettigheder i henhold til det supplerende beskyttelsescertifikat nr. cr 2004 00012, der er udstedt med basis i patent nr. dk/ep 0788
  2. sagernes tvist angår gyldigheden af både ovennævnte patent og af beskyttelsescertifikatet (spc´et). det er ubestridt, at ”bortezomib teva”-produktet udgør en krænkelse, såfremt pa- tentet og beskyttelsescertifikatet er gyldige. millennium pharmaceuticals inc. har i sag a-22-17 nedlagt følgende endelige påstande: principalt: det forbydes sagsøgte, teva denmark a/s, i danmark at fremstille, udbyde, brin- ge i omsætning eller anvende lægemidler, der indeholder bortezomib eller farmaceutisk ac- ceptable estere heraf, eventuelt i form af farmaceutisk acceptable salte heraf, herunder borte- zomib mannitolborester som aktivstof, til en hvilken som helst anvendelse som lægemiddel, der er givet tilladelse til inden udløbet af certifikatet, eller importere eller besidde dem med et sådant formål, eller tilskynde tredjeparter til at foretage disse handlinger, så længe supple- rende beskyttelsescertifikat nr. cr 2004 00012, jf. dansk patent nr. dk/ep 0 788 360, er i kraft. subsidiært: det forbydes sagsøgte, teva denmark a/s, i danmark at fremstille, udbyde, bringe i omsætning eller anvende lægemidlet "bortezomib teva", jf. dansk specialitetsnum- mer 30074, eller importere eller besidde disse produkter med et sådant formål, eller tilskynde tredjeparter til at foretage disse handlinger, så længe supplerende beskyttelsescertifikat nr. cr 2004 00012, jf. dansk patent nr. dk/ep 0 788 360, er i kraft. -3- det påbydes sagsøgte, teva denmark a/s, at tilbagekalde allerede skete leverancer af læge- midlet "bortezomib teva" fra alle erhvervsmæssige kunder, herunder distributører og hospi- talsapoteker, hvortil levering er foretaget af teva denmark a/s. det påbydes sagsøgte, teva denmark a/s, straks at afregistrere dets pris for "bortezomib teva" i det danske prisregister (www.medicinpriser.dk). forbuddet påstås principalt nedlagt uden sikkerhedsstillelse, subsidiært mod en af retten fastsat sikkerhed. teva denmark a/s har nedlagt påstand om, at sagen nægtes fremme, subsidiært at sagen fremmes mod en af sø- og handelsretten fastsat sikkerhed. millennium pharmaceuticals inc. har i sag a-33-17 nedlagt følgende endelige påstande: principalt: det forbydes sagsøgte, teva b.v., i danmark at fremstille, udbyde, bringe i om- sætning eller anvende lægemidler, der indeholder bortezomib eller farmaceutisk acceptable estere heraf, eventuelt i form af farmaceutisk acceptable salte heraf, herunder bortezomib mannitolborester som aktivstof, til en hvilken som helst anvendelse som lægemiddel, der er givet tilladelse til inden udløbet af certifikatet, eller importere eller besidde dem med et så- dant formål, eller medvirke eller tilskynde tredjeparter til at foretage disse handlinger, så længe supplerende beskyttelsescertifikat nr. cr 2004 00012, jf. dansk patent nr. dk/ep 0 788 360, er i kraft. subsidiært: det forbydes sagsøgte, teva b.v., i danmark at fremstille, udbyde, bringe i om- sætning eller anvende lægemidlet ”bortezomib teva”, jf. dansk specialitetsnummer 30074, eller importere eller besidde disse produkter med et sådant formål, eller medvirke eller til- skynde tredjeparter til at foretage disse handlinger, så længe supplerende beskyttelsescertifi- kat nr. cr 2004 00012, jf. dansk patent nr. dk/ep 0 788 360, er i kraft. -4- det påbydes sagsøgte, teva b.v., at tilbagekalde allerede skete leverancer af lægemidlet "bortezomib teva" fra alle erhvervsmæssige kunder, herunder distributører og hospitalsapo- teker, hvortil levering er foretaget af teva b.v. det påbydes sagsøgte, teva b.v., straks at afregistrere dets pris for "bortezomib teva" i det danske prisregister (www.medicinpriser.dk). forbuddet påstås principalt nedlagt uden sikkerhedsstillelse, subsidiært mod en af retten fastsat sikkerhed. teva b.v. har nedlagt påstand om, at sagen nægtes fremme, subsidiært at sagen fremmes mod en af sø- og handelsretten fastsat sikkerhed. oplysninger i sagen sagens parter millennium pharmaceuticals inc. (herefter milennium) er en lægemiddelvirksomhed med hovedsæde i massachusetts, usa, der satser på produktion og udvikling af nye inovative lægemidler, og som er aktiv inden for onkologiområdet. teva denmark a/s og teva b.v. (herefter tilsammen benævnt teva) er begge dele af den in- ternationale teva-koncern, der er verdens største producent af generiske lægemidler. millenniums grundpatent ep 0788 360 (herefter ep 360) blev udstedt den
  3. maj 2003 og valideret i danmark den
  4. september 2003 som dk/ep 0788 360 (herefter dk/ep 360). den relevante prioritetsdato er den
  5. maj 1995 på baggrund af patentansøgning us 442581 på hvilken baggrund, der blev udstedt patent i pct wo 96/
  6. følgende fremgår bl.a. af dk/ep 360: -5- -6- -7- -8- … … … -9- - 10 - … … … … … - 11 - … … … … … … - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - - 18 - - 19 - - 20 - - 21 - - 22 - - 23 - - 24 - … - 25 - … - 26 - … - 27 - det bemærkes vedrørende krav 22 og krav 23, at de – efter det oplyste på grund af en over- sættelsesfejl - ikke indeholdt ”eller boronatester deraf” i den oprindelige oversættelse. dette blev rettet, hvorefter ”eller boronatester deraf” fremgik af dk/ep 360 fra
  7. november 2008 til
  8. december 2012, hvorefter der skete en ny rettelse af oversættelsen, hvor ”eller bo- ronatester deraf” på ny udgik. det er af millennium oplyst, at tilbageretningen til den gamle udgave skyldtes en fejl hos millenniums fuldmægtig awa patent i forbindelse med en frivillig central begrænsning i krav 1, der ikke vedrører nærværende tvist. teva gjorde opmærksom på problemstillingen ved processkrift i nærværende sag den
  9. august
  10. millennium indleverede herefter ved brev af
  11. september 2017 til patent- og varemærkesty- relsen en ny oversættelse, hvor ”eller boronatester deraf” på ny fremgår. patent- og varemærkestyrelsen tilkendegav i e-mail af
  12. september 2017, at milenniums ændring ville blive publiceret i patentidende den
  13. september
  14. - 28 - teva danmark a/s protesterede ved brev af
  15. september 2017 til patent- og varemærkesty- relsen mod, at der blev foretaget den ovennævnte rettelse. patent- og varemærkestyrelsen traf ved brev af
  16. september 2017 afgørelse om at bekendt- gøre den pågældende rettelse og meddelte, at rettelsen i stedet ville blive publiceret den
  17. september 2017 i patenttidende. krav 23 i ep 360 indeholdt formuleringen ”or boronate ester thereof” under hele ovenståen- de periode. epo´s sagsbehandling vedrørende ep 360 i den supplerende europæiske søgerapport fra epo, der er dateret den
  18. februar 1998, er under ”documents considered to be relevant” angivet følgende: ep 0 315 574 a (hoechst ag), wo 95 25533 a (the president and fellows of harvard college) og wo 95 24914 a (myogenics, inc). ved brev af
  19. april 2001 anførte epo bl.a.: … - 29 - … patentbureauet mathys & squire svarede på vegne af millennium epo ved brev af
  20. de- cember 2001, hvoraf bl.a. fremgik: - 30 - … … - 31 - … - 32 - ep 360 blev herefter udstedt den
  21. maj 2003 uden yderligere indsigelser fra epo. millenniums supplerende beskyttelsescertifikat millennium ansøgte den
  22. maj 2004 om et supplerende beskyttelsescertifikat (spc) på bag- grund af dk/ep 360, der således udgør grundpatentet i henhold til spc-forordningen. patent- og varemærkestyrelsen skrev den
  23. april 2008 bl.a. således til millennium: ….. ….. millennium fremsendte herefter rettet oversættelse af dk/ep 360, hvor ”eller boronatester deraf” blev tilføjet, jf. nærmere herom afsnittet ovenfor om millenniums grundpatent. millennium skrev herefter til patent- og varemærkestyrelsen bl.a.: ….. - 33 - den
  24. april 2009 blev spc´et udstedt, hvoraf bl.a. følgende fremgik: - 34 - ….. tevas produkt og markedsføring det fremgår af lægemiddelstyrelsens produktresumé af
  25. december 2016 vedrørende ”bortezomib ”teva”, pulver til injektionsvæske, opløsning” bl.a.: … … - 35 - det fremgår af lægemiddelstyrelsens produktresumé af
  26. august 2017 vedrørende samme produkt, at teva b.v i holland nu er indehaver af markedsføringstilladelsen med teva denmark a/s som repræsentant. af offentlig udbudsbekendtgørelse fra amgros dateret
  27. februar 2017 fremgår bl.a.: … … - 36 - følgende fremgår bl.a. af bekendtgørelse om indgåede kontrakter dateret
  28. april 2017: … - 37 - for prisperioden
  29. august til
  30. september 2017 fremgår følgende på medicinpriser.dk vedrørende bortezomib: kendt viden - 38 - der er under sagen som kendt viden fra før prioritetsdatoen for millenniums patent frem- lagt: gross og meinhofer ”the peptides, vol. 3” 1981, wilk og orlowski ”evidence that pituitary cation-sensitive neutral endopeptidase is a mul- ticatalytic protease complex” 1983, kettner og shenvi ”inhibition of the serine proteases leukocyte elastase, pancreatic elastase, cathepsin g, and chymotrypsin by petide boronic acids” 1984, us 4,449,082 (shenvi)
  31. februar 1985, us 5,106,948 (kinder)
  32. april 1992, us 5,169,841 (kleeman)
  33. december 1992, tomkinson et al. ”synthetic analogues of chymostatin” 1992, ghosh et al. ”potent hiv protease inhibitors: the development of tetrahydrofuranalclycines as novel p2-ligands and pyrazine amides as p2 ligands” 1993, savory et al. ”reaction of preteasomes with peptidylchloromathanes and peptidyldiazome- thanes” 1993, rock et al. “inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on mhc class i molecules” 1994, j.m. peters “proteasomes: protein degradation machines of the cell” 194, vinitsky et al. “inhibition of proteolytic activity of the multicatalytic proteinase complex (proteasome) by substrate-related peptidyl aldehydes” 1994, seemüller et al. “proteasome from thermoplasma acidophilum: a threonine protease”
  34. april 1995, löwe et al. “crystal structure of the 20s proteasome from the archaeon t. acidophilum at 3.4 resolution”
  35. april 1995, iupac recommendations ”glossary of class names of organic compounds and reactive intermediates based on structure”
  36. der er derudover fremlagt pct patentansøgning wo 91/13904 (herefter wo 904), som teva gør gældende, er den nærmest kendte teknik. wo 904 er blevet internationalt publiceret
  37. september 1991, og det fremgår af patentansøgningen bl.a.: - 39 - … … - 40 - … … - 41 - … … … - 42 - … - 43 - - 44 - - 45 - - 46 - - 47 - … - 48 - … … - 49 - … - 50 - … - 51 - … - 52 - … - 53 - … - 54 - - 55 - - 56 - … - 57 - - 58 - - 59 - - 60 - - 61 - - 62 - - 63 - publikationer efter prioritetsdatoen der er under sagen fremlagt følgende publikationer dateret efter prioritetsdatoen: pct wo 95/24914 1995, kessler et al ”extended peptide-based inhibitors efficiently target the proteasome and reveal overlapping specificities of the catalytic β-subunits" 2001, - 64 - groll et al ”crystal structure of the boronic acid-based proteasome inhibitor bortezomib in complex with the yeast 20s proteasome” 2006, shi et al ”design, synthesis and docking studies of novel dipeptidyl boronic acid proteasome inhibitors constructed from aa- and ab-amino acids”
  38. erklæringer der er både til denne og til tidligere sager mellem parterne i udlandet afgivet en række ek- sperterklæringer. følgende fremgår af den danske oversættelse af professor herman overkleefts erklæring, der er indgivet til en parallel hollandsk sag: ”jeg, professor hermen overkleeft, fra leiden universitet, erklærer som følger: 1 relevant baggrund
  39. jeg er professor i bioorganisk syntese ved universitetet i leiden, hvor jeg også (fra
  40. juli 2017) vil være den videnskabelige leder for leidens kemiske institut (lic).
  41. jeg opnåede i 1997 min phd-grad på universitetet i amsterdam inden for emnet iminosukre som glycosidase-inhibitorer. jeg udførte post-doktoral forskning sammen med professor jac- ques van boom (leiden universitet, holland, 1997-1999) vedrørende ring-lukkende metatese i syntesen af polyhydroxylerede oxacykler og azacykler, og sammen med professor hidde ploegh (harvard medical school, boston, ca, usa, 1999-2001) vedrørende inhiberingen af pro- teaser involverede i human adaptiv immunitet. jeg kom tilbage til holland i 2001 for at varetage min nuværende stilling i relation til bioorganisk syntetisk kemi ved leiden universitet.
  42. jeg vedlægger som bilag ho-1 en kopi af mit cv, som også inkluderer min publikationsliste.
  43. min nuværende forskning fokuserer på enzym-inhibitorer og aktivitetsbaserede prober i ke- misk biologi og medicinsk kemi, særligt i glycobiologi og immunologi. komparative, aktivitets- baserede proteinprofileringseksperimenter bruges til at studere cysteinproteaser, proteasomer og bevare glycosidaser. fokus for mit laboratorium er for tiden på udviklingen af en dobbelt glucosylceramid-syntase/neutral glucosylceramidase-inhibitor som et potentielt skridt på vejen mod klinisk udvikling i forhold til gaucher sygdom og neuropatologiske lidelser.
  44. min nuværende forskning vedrørende proteasom-inhibitorer fokuserer på inhibitorer, der kan udvælges til individuelle, katalytiske aktiviteter for humane konstitutive proteasomer og im- munoproteasomer, såvel som inhibitorer, der kan inhibere en kombination af disse aktiviteter. der er i alt seks aktiviteter: tre konstitutive proteasom-aktiviteter og tre immunoproteasom- aktiviteter. - 65 -
  45. mit forskningshold har fundet ud af, at oligopeptider med n-terminal-forlængelser er mere po- tente, selvom de er mindre selektive hvad angår blokering af individuelle proteasom-aktiviteter end deres tilsvarende tri- eller tetrapeptider. dette arbejde er beskrevet i (blandt andre artikler) kessler et al, extended peptide based inhibitors efficiently target the proteasome and reveal overlapping specificities of the catalytic β-subunits, chemistry & biology 8

(2001), 913-929, som jeg vedlægger som bilag ho-2. 7. i vores nyere arbejde har vi udviklet inhibitorer, der er selektive for hver af de seks katalytiske aktiviteter, såvel som aktivitetsbaserede prober, som kan rapportere om de individuelle aktivi- teter fra humant væv, inklusive primært patientvæv. noget af dette arbejde er beskrevet i de bruin et al, a set of activity based probes to visualize human (immuno)proteasome activities, an- gew. chem. int. ed. 55, 4199-4203 (bilag ho-3). 2 min rolle som ekspertvidne 8. jeg er af millennium pharmaceuticals inc. blevet bedt om at fungere som ekspertvidne i hervæ- rende hollandske sag. jeg forstår, at denne erklæring kan få betydning i sagen for retten i haag (district court of the hague). det er blevet forklaret for mig, at jeg har pligt til af være retten behjælpelig på områder, der falder inden for min ekspertise, og at denne pligt har forrang i for- hold til den pligt, jeg måtte føle over for dem, der har engageret mig. mine instruktioner 9. jeg er blevet bedt om at gennemgå og komme med mine kommentarer til de argumenter og den kendte teknik, som teva henholder sig til i sin ugyldighedsstævning af 13. marts 2017. 10. jeg er især blevet bedt om at forklare, hvordan en fagmand inden for organisk kemi med erfa- ring inden for proteasekemi ville forstå det, der anføres i wo 91/13904 (wo 904); og at overveje om bortezomib er nærliggende alene set i lyset af dette dokument eller i kombination med an- dre dokumenter, som teva henholder sig til. 11. jeg har også fået udleveret en kopi af ep 0 788 360 b3 (ep 360) og millenniums begæring om midlertidigt forbud. 12. jeg er klar over, at denne erklæring afgives i konteksten af en strid i relation til bortezomib, som er en forbindelse med følgende formel. wo 904 13. wo 904 vedrører metoder til sporing af proteaser, som menes at være impliceret i alzheimers sygdom, ved hjælp af substrater med formlen i. “substrater” er i denne sammenhæng oligope- ptider indeholdende en såkaldt betinget rapporteringsdel. dette betyder, at et rapporterings- - 66 - signal, der viser protease-aktivitet i substratet, kun viser sig, når substratet faktisk processeres af en protease. 14. substraterne anvendt i wo 904 er oligopeptider, som udviser elementer, der er inherente for de peptider, der menes at være impliceret i alzheimers sygdom. de bærer også en c-terminal rap- porteringsdel (en p-nitroanilin eller “pna”-gruppe), som efter en protease-medieret spaltning under fysiologiske forhold bliver lilla (405 nm). denne såkaldte “kolorimetriske gruppe” an- vendes til at spore og signalere aktivitet. wo 904 vedrører også tilvejebringelsen af protease- inhibitorer med formlen ii, og metoder til behandling af alzheimers ved brug af sådanne inhi- bitorer. formel ii 15. formel ii er som følger: r-a4-a3-a2-y 16. denne formel er misvisende kort. faktisk defineres hver af variablerne i formlen i wo 904 ved henvisning til andre forbindelser og andre formler, hvor mange af disse selv indeholder talrige variabler. i nogle tilfælde er de mulige substitutioner ikke begrænsede til en fastlagt liste, men defineres i stedet funktionelt. for eksempel: (
  1. a)y-gruppen indeholder to yderligere variabler, r2 og r3 (se side 10, linie 32 – side 11, li- nie 23). (
  2. b)a2 kan være en aminosyre (inklusive både naturlige og unaturlige aminosyrer) eller en ”konservativ aminosyresubstituent” (se side 3, linie 4 – side 4, linie 7; og side 6, linie 3- 8). (
  3. c)adskillige muligheder er angivet for a3: en kovalent binding; en d-aminosyre; phe, tyr, val; eller en konservativ aminosyresubstituent (side 5, linie 32 – side 6, linie 3). (
  4. d)adskillige muligheder er angivet for a4: en kovalent binding; en aminosyre eller en hvilken som helst peptidgruppe (side 5, linie 30 – 32). (
  5. e)r kan være hydrogen eller en af en række af typer af grupper, hvilket vil sige at valg- muligheder for r-konstituenten er næsten grænseløse. 17. formel ii og dens substitutioner omfatter i kraft af sin ubegrænsede karakter et stort set ende- løst antal mulige forbindelser. hvis man ignorerer de ubegrænsede funktionelle definitioner og i stedet tager de specifikke eksempler på substituenter foreslået i wo 904 i betragtning, så er det muligt at lave en løselig beregning for at fastslå cirka hvor mange forbindelser, der er dækket af denne formel. jeg har lavet en sådan løselig beregning, som vedlægges som bilag ho-4. i min beregning har jeg for at være på den sikre side bevidst begrænset de ubegrænsede variabler til kun en enkelt mulighed. hvor en af variablerne anføres som værende eksempelvis “lavere al- kyl”, har jeg således medregnet denne som værende en enkelt funktionel gruppe, på trods af den kendsgerning at “lavere alkyl”-grupper kan have mange former. selv under anvendelse af denne tilgang, som signifikant undervurderer det teoretiske antal af forbindelser, som faktisk er dækket af formel ii, så er antallet af omfattede forbindelser omkring 90 billioner. 18. for at sætte dette antal i en form for perspektiv: hvis et team af fagfolk (kemikere) skulle synte- tisere og teste 200 forbindelser om ugen, eller 10.400 forbindelser om året, så ville det tage dem - 67 - 9 x 109 (= 9 milliarder) år at undersøge alle de forbindelser, der teoretisk kan falde inden for formel ii. det er cirka to gange den estimerede alder for planeten jorden. 19. kun en meget lille brøkdel af en så kolossal og ubegrænset klasse af forbindelser kan forventes at være effektive proteaseinhibitorer (langt færre: proteasominhibitorer). sådan aktivitet vil af- hænge af formning, steriske faktorer og funktionaliteten for grupperne på molekylet. relativt små ændringer i strukturen kan have en signifikant indflydelse på molekylets egenskaber, som vinitsky 94, som teva henholder sig til i afsnit 115-116 i sin stævning, gør klart. 20. i den reference undersøgte forfatterne virkningen af en transposition af positionen for pro- aminosyren på p3-positionen. de fandt at “transpositionen af pro- og gly-residualerne forårsagede et næsten 30-fold fald i ki for cht-l-aktiviteten (fra 471 til 16.4 μm) og kun en 2-fold stigning i ki mod snaap-komponenten. disse ændringer viser vigtigheden af at have pro-residualen på p3-positionen for at opnå en mere selektiv inhibering af braap-komponenten”. se s. 29863, venstre spalte, første afsnit, i vinitsky. 21. dette viser den betydelige virkning, som en tilsyneladende mindre ændring i molekylet kan have på selektiviteten. 22. wo 904 tilvejebringer ikke nogen data af betydning til fagmanden, som kan bruges til at knytte nogen detaljeret sammenhæng mellem strukturen og aktiviteten og selektiviteten for inhibie- ringsforbindelserne. fagmanden må derfor foretage sin søgning efter passende inhibitorer i blinde. den faktiske tilgang anvendt i wo 904. 23. selv om opfinderne af wo 904 gør krav på et ekstremt bredt (og måske endda grænseløst) antal forbindelser, så udgør de substrater og inhibitorer som faktisk er eksemplificeret i wo 904 en ekstremt smal delmængde af enten formel i eller ii. delmængden af formel i starter med en særlig aminosyresekvens, baseret på beta-amyloidsekvensen – et protein impliceret i alzhei- mers sygdom. 24. wo 904 beskriver opdagelsen af to proteaser, som er i stand til at spalte mellem methionin- og asparaginsyre i “19 aminosyre-forbindelsespeptidet” i beta-amyloidsekvensen der henvises til ovenfor (og se linie 16-20 på s. 45 i wo 904). to proteaser (chymase og den multikatalytiske protease) identificeres og oprenses. disse proteaser er i stand til at processere det kolorimetriske tetrapeptid, meosuc-glu-val-lys-met-pna. 25. baseret på den sekvens, syntetiseres en mængde potentielle substrater for både chymase (en protease der ikke er relateret til proteasomet) og proteasomet (henvist til i wo 904 som den multikatalytiske protease). de fleste data i wo 904 fokuserer på proteasen, chymase. dog forbe- redes eller skaffes i alt 48 substrater for proteasomet, og de testes for at afgøre i hvilken grad de kan hydrolyseres af den multikatalytiske protease. 26. resultaterne opnået ved disse forsøg fremgår af tabellen i figur 14 i wo 904, med en procentvis hydrolyserate der er indikativ for genkendelsen af sekvenser. jo højere antal, jo mere effektivt er turnover, og derfor vil det være mere sandsynligt at sekvensen giver en effektiv inhibitor. 27. det ses at figur 14 indeholder et antal tri- og tetrapeptidsubstrater (for eksempel række 8 og 45) med en åbenbart meget højere hydrolyseeffektivitet (med moder-substratet i række 1 normali- seret ved 100%). det fremgår også, at de to rækker, der vedrører dipeptidsubstrater (rækkerne 31 og 32) beskriver forbindelser med kun beskeden hydrolyserate. - 68 - 28. disse resultater er også i overensstemmelse med hvad en fagmand kunne tænkes at have for- ventet. proteasomer er endopeptidaser, som processerer fuld-længde, denaturede proteiner til oligopeptider af cirka 3-30 aminosyrer, med en gennemsnitlig produktlængde på cirka 8-12 aminosyrer. enzymer har generelt affinitet med deres substrater, såvel som et enzymsubstrat- mellemstofkompleks (overgangstilstanden). dog har de langt mindre affinitet med deres pro- dukter. baseret på dette ræsonnement, ville man forvente at proteasominhibitorer var sammen- sat af mindst tre aminosyrer, fremfor færre end tre. 29. litteraturrapporter hælder til at bekræfte denne teori: oligopeptider med n-terminal forlæn- gelse er generelt de mere aktive reagenser, selv om de nogle gange også er mindre selektive i proteasomkatalytiske aktiviteter. faktisk bekræfter vinitsky 94, som teva henholder sig til i af- snit 115-116 i stævningen, at andre forskningsgrupper også havde fokus på (
  6. i)tetrapeptider (fremfor dipeptider); (
  7. ii)at have en aldehydgruppe (fremfor en boronsyre- eller -estergruppe). 30. fra listen med 48 substrater i figur 14 i wo 904, er to forbindelser anvendt som en basis for in- hibitordesign. disse er meosuc-glu-val-lys-pna (række 2) og meosuc-glu-val-lys-nle-pna (række 4). 31. de substrater, opfinderne valgte, er tætte analoger til det mest lovende substrat, med methion- in-residualen substitueret med enten phe eller nle. fra disse to substrater syntetiseres seks in- hibitorer, hvoraf kun to (fig. 13b) testes som inhibitorer af multikatalytiske proteaser (rækker- ne 8 og 9; jeg bemærker at y (enkeltbogstavskoden for tyrosin) formentlig er en skrivefejl for v (valin): det er sandsynligt at de to testede forbindelser var meosuc-glu-val-lye-phenylalaninal og meosuc-glu-val-lys-borophenylalanin). 32. strategien med at designe multikatalytiske protease(proteasom)inhibitorer er beskrevet på side 50 (linie 26) og 51 (frem til linie 15). jeg har sammenfattet trinnene, som opfinderne af wo 904 har taget i reaktionsskemaet nedenfor (som jeg også vedlægger i forstørret form for bedre læse- venlighed som bilag ho-5). - 69 - 33. bortezomib er, naturligvis, et dipeptid, fremfor et tetrapeptid; med en boronsyre- eller - estergruppe, fremfor en aldehydgruppe. baseret på wo 904, og særligt baseret på resultaterne vedrørende de kolorimetriske substrater i rækkerne 31-32, ville fagmanden ikke forvente at dipeptider generelt var særligt effektive proteasominhibitorer. listen af forbindelser i figur 16 34. i fig. 16 anføres en lang liste af forbindelser, som siges at være inhibitorer. 35. med en enkelt undtagelse ser ingen af forbindelserne på listen ud til at have være blevet synte- tiseret af opfinderne af wo 904. i det omfang fagmanden kan se noget mønster i denne liste af forbindelser, så ser det ud til at: a. tri- og tetrapeptider er foretrukne forbindelser. dette er i overensstemmelse med den tro, der herskede på denne tid, om at længere fremfor kortere peptider havde størst sandsyn- lighed for at tilvejebringe de mest passende inhibitorer. dette synes at pege væk fra borte- zomib, som er et dipeptid; b. basiske (hovedsagligt lysin (lys), men også arginin (arg), ornithin (orn)) aminosyrer sy- nes at være de foretrukne p2-aminosyrer (dvs. den aminosyre, som n-terminalt flankerer den c-terminalt modificerede aminosyre, som bærer elektrofilen 1). sådanne aminosyrer bærer en amingruppe (guanin i arg), som ved fysiologisk ph er protoneret, derfor ladet, derfor polær. i bortezomib, derimod, er p2 phenylalanin, som er apolær; 1 med hensyn til formel ii, så er p2 = a2 hvis y selv omfatter en aminosyreanalog. hvis y derimod ikke er en aminosyreana- log, så er p2 = a3. - 70 - c. i gennemsnit synes alifatiske (meosuc, ad, az, suc) n-terminale beskyttelsesgrupper at foretrækkes frem for aromatiske n-terminale beskyttelsesgrupper, med et betydeligt antal n-terminalt ladede residualer (enten frie aminer eller carboxylater). i bortezomib, der- imod, er den n-terminale beskyttelsesgruppe en heteroaromatisk acylgruppe. fokus for opfinderne af wo 904 36. på grund af det kolossale (og endeløse) antal forbindelser omfattet af formel ii, er det min op- fattelse, at fagmanden, når han læser wo 904, ville være tilbøjelig til at zoome ind på det lille antal forbindelser, som opfinderne af wo 904 faktisk lavede og testede. 37. af de seks inhibitorer, som opfinderne af wo 904 faktisk lavede, blev tre testet for inhibering af chymase og multikatalytisk protease. som anført ovenfor blev rapporteringsgruppen i inhibito- rerne udskiftet med hvad de kalder en “reaktiv c-terminal gruppe", i stand til at inhibere pro- teaseaktivitet. 38. som det fremgår af deres strukturer, og som diskuteret nedenfor, så ligner de testede forbindel- ser overhovedet ikke bortezomib. wo 904 bortezomib o oh h n n b n oh h o n bortezomib 39. der er hverken i wo 904 eller i nogen af de andre dokumenter citeret af teva nogen indikatio- ner som kunne pege på, at der skal foretages ændringer i de testede forbindelser for at opnå - 71 - bortezomib. hvis noget, så afslører en sammenligning, at aldehydet i fig. 13b, nr. 8, overgår bo- ronesteren (fig. 13b, nr. 9). dette peger umiddelbart væk fra bortezomib. 40. jeg ser ingenting i wo 904 eller i nogen af de andre dokumenter citeret af teva, som peger mod en boronsyre- eller -estergruppe i kombination med en optimeret dipeptidsekvens, som har en phe-leu-sekvens og den særlige n-terminale beskyttelsesgruppe, som findes i bortezomib. der er bestemt ikke noget i wo 904, som ville pege på, at de ændringer, der er nødvendige for at opnå bortezomib, ville føre til en forbindelse med en sådan god aktivitet og en god selektivitet for proteasomer. 41. begge disse egenskaber er vist for bortezomib i de data, der findes i ep 360. i denne forbindelse skal det bemærkes, at i modsætning til det, teva anfører i afsnit 72 i sin stævning, så ansås (og anses fortsat) den type inhiberings- og selektivitetstests som anføres i ep 360 generelt som pe- gende på sandsynlighed for at kunne præstere som lægemiddel in vivo. fagmanden ville især lægge stor vægt på cellelinietestresultaterne angivet i tabel vi og vii, såvel som selektivitetsda- taene anført i tabel ii. 42. i den henseende er jeg blevet forsynet med en kopi af millenniums forbudsbegæring i denne sag, og jeg er enig i beskrivelsen af data præsenteret i afsnit 30 til 51 i forbudsbegæringen. betydning af termen “arylcarbonyl” i wo 904 43. slutteligt er jeg blevet bedt om mine synspunkter om betydningen af termen “arylcarbonyl” i wo 904. denne er en af de mange muligheder nævnt i wo 904 for den n-terminale beskyttel- sesgruppe. termen “arylcarbonyl” nævnes på side 8, linie 4 i wo 904. teva giver i sin stævning udtryk for at dette inkluderer hetero-arylgrupper, såsom (2-pyrazin)carbonylgruppen i borte- zomib. 44. jeg er ikke enig. side 8, linie 15-17 i wo 904 forklarer, hvad der i wo 904 menes med “aryl”: 45. kravet om mindst 6 kulstofatomer i den aromatiske del betyder, at en kulstofheteroarylcar- bonylgruppe på 4 eller 5 (i hvilken en eller to af kulstofatomerne i ringen er udskiftet med et atom som ikke er kulstof, såsom n, o eller
  8. s)i wo 904 er udelukket fra definitionen af ”aryl”. (2-pyrazin)carbonylgruppe i bortezomib, som er vist her med en pil, indeholder 4 kulstofato- mer: 46. de “substituerede alkyl”-grupper, der er nævnt i linie 17, defineres desuden i linie 18 til 20 på side 8 som følger: - 72 - 47. denne passage tyder på, at opfinderne af wo 904 var udmærket opmærksomme på (og havde til hensigt at gøre krav på) n-terminale beskyttelsesgrupper indeholdende et heteroatom i grup- pen vedhæftet den aromatiske ring. jeg noterer mig også i den forbindelse, at eksemplerne anført i figur 16 ikke indeholder en heteroaromatisk n-terminal beskyttelsesgruppe (og i det hele taget kun relativt få aromatiske n-terminale beskyttelsesgrupper). 48. opfinderne af wo 904 var formentlig også opmærksomme på, at der var n-terminale beskyt- telsesgrupper tilgængelige, som indeholdt et heteroatom (eller atomer) i selve ringstrukturen (he- teroarylcarbonylgrupper). den kendsgerning, at de ikke nævnte sådanne grupper, på trods af at de udspecificerede at kolossalt antal andre variabler for substituenterne i formel ii, tyder på at de ikke ønskede at gøre krav på heteroarylcarbonylbeskyttelsesgrupper. 49. jeg noterer mig at teva i afsnit 91 i sin stævning søger at henholde sig til iupac nomenklaturet som støtte for sit argument herom. jeg mener, at fagmanden ville være mere tilbøjelig til at se på, hvad wo 904 siger om termen, fremfor at vende sig mod de formaliserede iupac regler for kemisk nomenklatur, som for mange kemikere mere er en kilde til forvirring end til oplysning. 50. teva prøver også at “importere” yderligere grupper under henvisning til siderne 3 til 81 i en lærebog, der er nævnt i wo 904 (se afsnit 93 – 94 i tevas stævning). i mine øjne ville fagmanden være mere tilbøjelig til at konkludere, at den klare definition af “aryl” i wo 904 ville “trumfe” enhver anden potentiel modstridende information fra en lærebog. 51. teva henviser også (i afsnit 95 i stævningen) til en publikation af ghosh, og søger at kombinere dette med læren fra wo 904. jeg har ikke fundet nogen henvisning til ghosh i wo 904, og jeg mener ikke, at fagmanden i sin fortolkning af wo 904 ville vende sig mod dette dokument som nogen selvfølge. jeg mener heller ikke, at han effektivt ville “omskrive” den klare definition af “aryl” i wo 904 under henvisning til dette dokument. 3 konklusion 52. efter min mening var kombinationen af små, opløselige dipeptider opbygget af hydrophobiske aminosyrer, kompenseret for med en hydrofil n-beskyttelsesgruppe, ikke nærliggende i lyset af de dokumenter, teva henholder sig til.” følgende fremgår af professor achiel haemers erklæring af 30. juni 2017, der er indgivet i en parallel hollandsk sag: - 73 - … - 74 - - 75 - - 76 - - 77 - - 78 - - 79 - - 80 - følgende fremgår af professor achiel haemers supplerende erklæring af 3. juli 2017, der li- geledes er indgivet i den parallelle hollandsk sag: - 81 - - 82 - - 83 - - 84 - følgende fremgår af den danske oversættelse af professor alexei kisselevs erklæring af 15. august 2017, der er indgivet i en parallel tysk sag: ”eksperterklæring af professor alexei kisselev jeg, alexei kisselev, 5 cambridge place, west lebanon, nh 03784 usa, erklærer som følger: 4 kvalifikationer, erfaring og instruktioner 4.1 jeg er af millennium pharmaceuticals inc. blevet bedt om at fungere som ekspertvidne i her- værende sag. 4.2 jeg forstår, at det er min pligt som ekspertvidne at sige sandheden og ikke give misvisende information, så vidt min viden rækker, og at være retten behjælpelig på områder inden for min ekspertise, og at denne pligt har forrang for enhver pligt over for millennium pharma- ceuticals inc. jeg forstår min forpligtelse over for retten, og jeg har opfyldt og vil fortsætte med at opfylde denne forpligtelse. akademisk karriere - 85 - 4.3 jeg vedlægger som bilag 1 en komplet version af mit curriculum vitae, inklusive min publi- kationsliste. 4.4 jeg opnåede min kandidatgrad (m.sc.) i kemi ved universitetet i moskva i 1991. min phd- grad i bioorganisk kemi vedrørte human immundefektvirus type 1 ("hiv-1")-proteinase og tildeltes mig af universitetet i moskva i 1995. under min phd var jeg gæstestuderende på max-von-pettenkoffer-institut ved universitetet i münchen. 4.5 i 1995 udførte jeg post-doktoralt arbejde ved max-planck-instituttet for biokemi i münchen med fokus på isolation af komplementerende proteiner til efterfølgende krystallisering. jeg arbejdede på instituttet for strukturel biologi, som blev ledet af nobelprismodtageren pro- fessor robert huber, som opklarede strukturer for thermoplasma og gærsvamp- proteasomer. min nærmeste vejleder var dr. wolfram bode, en kendt ekspert inden for pro- teasers strukturelle biologi. 4.6 i juli 1995 flyttede jeg til professor alfred goldbergs laboratorium ved instituttet for cellebio- logi ved harvard medical school. forud for den flytning gennemlæste jeg som forberedelse en betydelig mængde materiale i relation til proteasomer og det arbejde, der udførtes af pro- teasomforskere på det tidspunkt. fra det tidspunkt, hvor jeg flyttede til harvard, har mit ar- bejde været fokuseret på proteasomer. siden 2000 har jeg været involveret i at lave mine eg- ne proteasominhibitorer, i første omgang med henblik på at anvende dem som forsknings- værktøjer, og derefter prøve at udvikle nogle af dem til at kunne bruges terapeutisk. 4.7 i 2004 flyttede jeg til en stilling som adjunkt ved geisel school of medicine ved dartmouth hitchcock medical centre i u.s.a., hvor jeg fortsatte mit arbejde med udvikling af protea- sominhibitorer. jeg blev udnævnt til lektor i 2011, og forblev i denne stilling til 2016. i 2016, fik jeg en forskningsstilling ved the veterans affairs medical center i white river junction vt, mens jeg bibeholdt min fakultetsudnævnelse i dartmouth. i september flytter jeg til au- burn university, som lektor for “drug discovery and development”, hvor jeg vil fortsætte mit arbejde med proteasomer. nuværende arbejde 4.8 mit laboratoriums arbejde fokuserer i øjeblikket på at definere rollerne for proteasomets for- skellige “active sites” og anvendelsen af denne viden til at identificere lægemiddelkandida- ter og at udvikle mere potente proteasominhibitorer til behandling af cancer. 4.9 det er nu kendt, at alle eukaryotiske proteasomer har tre par active sites, som er de chy- motrypsin-lignende, trypsin-lignende, og caspase-lignende sites. bortezomib og efterfølgen- de andengenerationsproteasominhibitorer blev udviklet som inhibitorer af de chymotrypsin- lignende sites, men de fleste inhiberer også et andet eller begge af de andre to sites. vi har udviklet yderst specifikke inhibitorer af alle tre sites for at klarlægge, hvorvidt sam- inhibering ("co-targeting") af de andre to sites er vigtigt for inhibitorer, som bremser udvik- lingen af tumorer. mit arbejde har vist, at specifik inhibering af chymotrypsin-lignende sites ikke er tilstrækkelig til at inducere cytotoksicitet. vi har også påvist, at co-inhibering af de caspase-lignende eller endnu bedre, de trypsin-lignende sites i et proteasom er nødvendigt for at inducere maksimal cytotoksicitet i myelomatoseceller. 4.10 vi har desuden opdaget, at bestemte celle-permeable inhibitorer af trypsin-lignende sites, som vi udviklede, selektivt sensibiliserer myelomatose- og brystkræftceller til bortezomib og carfilzomib (kyprolis, en proteasominhibitor godkendt af fda til behandling af myelom i 2012). mine instruktioner 4.11 jeg er blevet bedt om at gennemgå og komme med mine kommentarer til en patentansøg- ning, wo 91/13904 ("wo 904"), og om at forklare hvordan en biokemiker, beskæftiget som - 86 - en del af et team, som udviklede proteasominhibitorer til terapeutisk brug, ville have fortol- ket dette dokument i 1995. 4.12 jeg er også blevet bedt om at gennemgå og komme med mine kommentarer til ep 0 788 360 b3 ("ep 360"). 4.13 jeg forstår, at denne strid vedrører forbindelsen bortezomib og farmaceutiske produkter, der indeholder det. bortezomib er en proteasominhibitor, som anvendes i behandlingen af can- cer. det har følgende struktur: 4.14 de vigtigste karakteristika for bortezomibs kemiske struktur er: (
  9. a)en dipeptidkæde af leucin og phenylalanin, hvor phenylalaninen er den n-terminale aminosyre og leucin den c-terminale aminosyre; (
  10. b)carboxylsyregruppen (-cooh) i c-terminalen leucin er erstattet med en b(oh)2 gruppe, som tilvejebringer et boronsyre-"sprænghoved"2; og (
  11. c)den n-terminale beskyttelsesgruppe er en pyrazinsyre (2-pyrazin)carbonylgruppe (2-pyz-co), som er en heteroarylcarbonylgruppe. 4.15 bortezomib blev udviklet af en biotechvirksomhed ved navn myogenics, grundlagt af pro- fessorerne alfred goldberg, tom maniatis og kenneth rock sammen med en ”scientific ad- visory board”, dannet af en gruppe af hans kolleger fra harvard. professor goldbergs ud- lægning af historien omkring udviklingen af bortezomib er tilgængelig i et kapitel, han har skrevet, som er vedlagt denne erklæring som bilag 2. 4.16 bortezomib var den første proteasominhibitor, der blev godkendt som lægemiddel. det an- vendes i behandlingen af cancer, og særligt i behandlingen af myelom og lymfom. borte- zomib inhiberer proteasomerne, som nedbryder beskadigede proteiner. for at en celle kan fungere korrekt, skal beskadigede proteiner fjernes. myelomceller (abnorme plasmaceller) producerer flere beskadigede proteiner end andre celler i kroppen og er mere afhængige af proteasomfunktionen end andre celler i kroppen. når denne proces forhales, skabes en ak- kumulation af beskadigede proteiner, som på et tidspunkt fører til et myelomcelleselvmord. 4.17 i 1995 havde proteasomforskningen fokus på en karakterisering af proteasomet, da det var en usædvanlig og lidet forstået protease. i det omfang forskere udviklede inhibitorer af pro- teasomet, blev disse hovedsagligt udviklet som forskningsværktøjer, som tillod, at protea- somet kunne undersøges og blive bedre forstået. ud over forskningsgruppen fra myogenics, så var jeg ikke bekendt med nogen grupper, som fokuserede på udvikling af inhibitorer til terapeutisk brug, fordi man var bekymret over den potentielle toksicitet ved at inhibere pro- teasomet, som opfylder en så vigtig og omfattende rolle i menneskekroppen. 4.18 da jeg første gang så bortezomibs struktur i 1998, var det overraskende for mig, at den var en så effektiv og selektiv inhibitor, og at den også var anvendelig til terapeutisk brug. det 2 "sprænghovedet" repræsenterer den del af inhibitoren, som interagerer med enzymet for at påvirke bindingen af substratet. resten af inhibitoren er nødvendig for at lede sprænghovedet i den rette retning. - 87 - var sjældent at finde en potentiel terapeutisk inhibitor, som har god aktivitet i picomolære3 koncentrationer, og som jeg diskuterer nedenfor ville jeg have forventet, at et dipeptid manglede aktivitet. valget af et boronsyre-sprænghoved var også usædvanligt i lyset af egenskaberne for de inhibitorer, som andre udviklede. jeg var i 1995 ikke bekendt med no- gen præference for at bruge de særlige aminosyrekombinationer, som udgør rygraden i bortezomibdipeptidet. 5 proteasomet 5.1 proteaser er enzymer, (som er proteiner,) som nedbryder andre proteiner. oprindeligt har de været delt ind i fire kategorier, baseret på deres katalytiske virkningsmåde – serinprotea- ser, cysteinproteaser, metalloproteaser og syre- (også kendt som aspargin-) proteaser, som hiv 1-proteasen. 5.2 proteasomet er et enzym, som findes både i cytoplasmaet og i kernen af alle eukaryotiske celler. det udgøres af to funktionelle dele, som henvises til ved deres svedberg sedimentati- onskoefficient (kaldet s): et 20s kerne-katalytisk kompleks og den 19s regulatoriske under- enhed (subunit). hele proteasomet kaldes 26s proteasomet. i 1995 var 20s kerne-komplekset blevet kaldt flere forskellige navne, herunder den multikatalytiske protease. 5.3 proteasomet udfører talrige roller i reguleringen af proteinnedbrydning, og over 80% af alle cellulære proteiner processeres af 26s proteasomkomplekset. 5.4 indtil april 1995 var klassificeringen af proteasomet uklar. især fordi det, selv om det havde nogle af egenskaberne fra serin- og cysteinproteaserne, ikke udviste alle egenskaberne for nogen af grupperne. for eksempel var nogle af de kendte inhibitorer af serinproteaser, så- som di-fluorophosphat, kendt for ikke at være effektive inhibitorer af proteasomet, hvor- imod andre serinproteaseinhibitorer, såsom 3, 4-dichloroisocoumarin, var effektive inhibito- rer af proteasomet. som et resultat var det sådan i starten til midten af 1990’erne, at nogle grupper kaldte proteasomet for en serin-lignende eller atypisk serinprotease, og andre pegede på, at det var en helt ny type enzymkompleks (se for eksempel savory et al biochem. j.
(1993), 296, pp. 602-605, som jeg vedlægger som bilag 3). 5.5 i 1995 udførte wolfgang baumeisters laboratorium ved max planck instituttet for biokemi en detaljeret mutagenese-analyse af den eneste β-underenhed i 20s proteasomet fra arkebak- terien thermoplasma acidophilum. i et parallelt studie opklarede nobelprismodtager professor hubers tilstødende laboratorium strukturen af det arkebakterielle proteasom, alene og i kompleks med en inhibitor. jeg vedlægger som bilag 4 og 5 artikler af seemüller et al og lowe et al, som blev publiceret efter hinanden i ’science’, som beskrev hvert af studierne. dette var enormt vigtige artikler på området, idet de på fundamental vis ændrede vores tankegang om, hvordan proteasomet virkede. forfatterne konkluderede, at proteasomet ikke er en se- rin- eller en cysteinprotease, men i stedet bekræftede de, at det er en ny type af protease. til- stedeværelsen af treonin på det katalytiske site førte til, at proteasomet blev kaldt en tre- oninprotease. efter min opfattelse vil resultatet af dette arbejde hurtigt være blevet kendt for forskere inden for området på den tid. 5.6 seemüllers og lowes resultater var et enormt skridt fremad i forståelsen af, at proteasomet var en ny klasse af proteaser. dog blev den eukaryotiske 20s proteasomstruktur ikke opklaret 3 picomolær (
  1. pm)repræsenterer en koncentration på 10−12 mol/l. nanomolær (
  2. nm)repræsenterer en koncentration på 10−9 mol/l micromolær (μm) repræsenterer en koncentration på 10−6 mol/l - 88 - før to år efter, da 20s gærproteasomstrukturen blev publiceret i ’nature’ af michael groll (som arbejdede i professor hubers laboratorium). 5.7 jeg var bekendt med det arbejde, der udførtes af wolfgang baumeisters og professor hubers teams i relation til at karakterisere både det arkebakterielle proteasom og efterfølgende gær- proteasomet, fordi jeg i min tid på max-planck instituttet i 1995 arbejdede i laboratoriet ved siden af professor hubers team. 6 wo 91/13904 ("wo 904") 6.1 jeg er blevet bedt om at tage stilling til patentansøgning wo 904, som blev indleveret 4. marts 1991, og som jeg forstår, teva i nogle lande har støttet sig til i deres indsigelse mod gyldigheden af ep 360 patentet. denne patentansøgning er rettet mod proteaser der er in- volveret i alzheimers sygdom samt deres substrater 4 and inhibitorer. jeg har nedenfor rede- gjort for den metode der har været anvendt af forfatterne til denne patentansøgning. 6.2 forfatterne anerkender, at et kendt protein, beta-amyloid, er involveret i dannelsen af neuri- tisk plak i hjernen ved alzheimers sygdom. dette protein opstår ved proteolytisk behand- ling af et kendt precursor-protein, beta-amyloid precursor-protein (apper). forfatterne tager udgangspunkt i denne precursor og vælger at teste det mod et antal kendte og almindeligt forekommende serinproteaser (som vist i fig. 6). som jeg bemærkede ovenfor, tog forfatterne fejl, da de antog, at den mulitkatalytiske protease var en serinprotease, idet dennes struktur og klassificering ikke var kendt i 1991. vi ved nu, at det er en threoninprotease. resulaterne af denne test viste imidlertid, at to kendte proteaser var i stand til in vitro at spalte forbindel- sen mellem methionin og asparaginsyre i beta-amyloid precursor-proteinsekvensen til dan- nelse af beta-amyloid. disse to proteaser er: (
  3. i)chymase; og (
  4. ii)mulitkatalytisk protease, nu kendt som proteasomet. 6.3 forfatterne hævdede, at substraterne til disse to proteaser kunne anvendes til at diagnostice- re alzheimers, sygdom og at man ved at hæmme aktiviteten af disse to proteaser ville for- hindre dannelsen af beta-amyloid og ville dermed have anvendelighed i behandling af alz- heimers sygdom. forfatterne anvendte derfor beta-amyloid sekvensen som udgangspunkt til fremstilling af substrater for og efterfølgende inhibitorer af chymase og multikatalytisk protease. jeg vil diskutere dette arbejde i nærmere detaljer nedenfor. 6.4 vi ved nu, at rationalet bag denne patentansøgning var fejlbaseret, idet proteasomet ikke er involveret i alzheimers sygdom. proteasomet, som er lokaliseret i cytosolen og cellekernen, bearbejder i særdeleshed ikke apper, som bearbejdes i oranellerne til den sekretoriske pathway (det endoplasmatiske reticulum og golgi) og derefter sekreres ud af cellen. der er ingen proteasomer i det endoplasmatiske retikulum og golgi. proteasomerne vil derfor in vivo, ikke komme i kontakt med ikke-foldede apper. de resultater, der er vist i wo 904 an- søgningen er det man kalder et in vitro artefakt, og jeg ville ikke forvente, at det ville funge- re in vivo. substraterne i wo 904 6.5 en stor del af arbejdet i wo 904 er rettet mod hydrolyse af substrater ved protease snarere end effekten af inhibitorer. disse substrater anvendes så som udgangspunkt til at designe inhibitorer. 4 et substrat er en specifik forbindelse, der undergår enzymatisk katalyse. for proteaseenzymers vedkommende er substratet det peptid eller protein, der spaltes af proteasen. - 89 - 6.6 de substrater, der syntetiseres i wo 904 ansøgningen, var baseret på enten en sekvens på 19 aminosyrer indeholdt i beta-amyloid (d.v.s., evkmdaefrhdsgvevhhq), som også kal- des “forbindelsespeptidet” ("junction peptide") eller en peptid på fire aminosyrer baseret på de 4 aminosyrer af n-terminalen, der fremkommer efter spaltning mellem met og asp af forbindelsespeptidet (glu-val-lys-met), som vist nedenfor. disse substrater blev testet for at se, om de blev hydrolyseret af forskellige proteaser; de eneste resultater, der relaterer til den multikatalytiske protease, er vist i figur 145. 6.7 figur. 14 viser data, der er fremkommet ved at måle hydrolyseringsraten af substratet ved den multikatalytiske protease. hydrolyseringsraten giver en indikation af, hvor godt det ak- tive site genkender sekvensen i et substrat. en højere værdi indikerer, at en sekvens gen- kendes bedre af det aktive site og derved kan danne basis for en bedre inhibitor. forfatterne af wo 904 kommenterer, at med denne metode: "peptide analogs can be carefully tailored which target the multicatalytic protease but spare related chymotrypsin-like enzymes"6. 6.8 denne substrat-drevne tilgang til at designe inhibitorer er kun det første skridt i at designe en inhibitor. de data, der er opnået, (såfremt de er opnået på en videnskabelig solid måde) er forslag til aminosyresekvenser, der kunne undersøges nærmere. enhver forsker ville imidlertid være opmærksom på, at tilføjelsen af et ”sprænghoved” til substratet vil have ind- flydelse på enzymets substrataffinitet, ligesom substituering med forskellige n- beskyttelsesgrupper også vil influere på dette. disse date giver endvidere en begrænset in- dikation af hvordan en inhibitor, der er baseret på en specifik aminosyresekvens vil agere i et cellebaseret assay, endsige in vivo. 6.9 de substrater, der testes i figur 14, er alle baseret på et referencesubstrat, substrat 1 (meo- suc-glu-val-lys-met-pna). dette referencesubstrat har fået en reference hydrolyserate på 100%. herefter blev 47 andre substrater fremstillet og testet. 6.10 resultaterne i denne figur er enkeltstående værdier, der er fremkommet ved, hvad der siges at være kun “en enkelt substratkoncentration” ("a single substrate concentration", side 52, linje 31-32). på baggrund af disse data kan man komme frem til følgende iagttagelser: kædelængde 6.10.1 25 tetrapeptid-, 21 tripeptid- og 2 dipeptidsubstrater blev testet. referencesubstratet (substrat 1) er et tetrapeptid. de to dipeptider, der blev testet, ad-lys-phe og az- lys-phe (forbindelse 31 og 32)7, har lave hydrolyseringsrater på henholdsvis 20% og 38% sammenlignet med referencesubstratet. 5 jeg vedlægger som bilag 10 en note angående den nomenklatur, der er anvendt til at benævne de forskellige ami- nosyrer i denne sag. 6 side 51, linje 4. 7 ad og az er henholdsvis n-terminal beskyttelsesgrupperne adipyl og azelayl (side 4, linje 18-19 af wo 904). - 90 - 6.10.2 jeg finder ikke disse resultater overraskende. jeg kan huske, at det var en standart- fremgangsmåde i 1995 at fremstille inhibitorer med tripeptid- og tetrapeptid- længde, se f.eks. artiklerne af vinitsky et al
(1994)og rock et al
(1994)som jeg vedlæg- ger som henholdsvis bilag 6 og 7. den generelle opfattelse var, at den kortere dipep- tid-kædelængde ikke ville være tilstrækkeligt potent. 6.10.3 det var i 1995 kendt, at peptider kan hydrolyseres in vivo af proteolytiske enzymer, der spalter peptidbindingerne. hvis en peptidinhibitor nedbrydes på denne måde, når den måske ikke frem til rette target site. ved at erstatte peptidbindingerne med bindinger, der ikke kan hydrolyseres kan inhibitorensens kædelængde imidlertid bibeholdes uden risiko for, at inhibitoren nedbrydes på denne måde. denne process kendes som de-peptidiering (depeptidation). denne tilgang ses i strukturen af hiv proteaseinhibitorerne saquinaqvir og ritonavir som var med i kliniske forsøg i 1995. for eksempel er ritonavir en "peptidomimetic", idet det ligner et peptid men mang- ler peptidbindinger. det er derfor mere resistent mod proteaser in vivo, end hvis det var et peptid. n-terminalgruppen 6.10.4 figur 14 viser også effekten af at ændre n-terminalgruppen på substrat 2 og 45-48, hvor dette er den eneste forskel. det ses, at på trods af deres identiske aminosyre- kæder varierer deres komparative hydrolyserater fra 10 til 478. det lader således til, at n-terminalen ikke kun spiller en beskyttende rolle ved at forhindre hydrolyse af substratet, inden det når frem til target, den er endvidere vigtigt for genkendelsen af substratet ved proteasomets active site. præference for p1 og p2 6.10.5 forfatterne af wo 904 fremfører på side 50 linje 32 til side 51 linje 6, at: "for example, while chymase prefers phe at p1 and lys at p2, the multicatalytic protease prefers leu at p1 (although phe, nle, and met are also excellent here) and arg at p2. among the residues tested thus far at the p3 position, ile is the most-preferred." (emphasis added)8 6.10.6 ovennævnte udtalelse finder ikke støtte i de resultater, der er vist i figur 14. med hensyn til den antagede præference for leu på p1 og arg på p2, bemærker jeg føl- gende: (
  1. a)der blev ikke testet nogen substrater med leu på p1 og arg på p2; (
  2. b)udtalelsen om, at leu er foretrukket på p1, er baseret på en enkelt observation for en enkelt analog (substrat 5 i figur 14). 43 af de 48 substrater i figur 14 har faktisk phe på p1, herunder de 8 substrater der virkede bedst; (
  3. c)de syv mest effektive substrater har phe på p1 og lys på p2; (
  4. d)de to inhibitorer, der rent faktisk blev testet for den multikatalytiske protease i figur 13b, var baseret på substrat 2, der har phenylalanin/phe (
  5. f)på p1; (
  6. e)det mest effektive substrat i figur 14 er et tetrapeptid, der har phe på p1 og lys på p2 (se substrat 45, der har en hydrolyserate på 478%); og 8 p1 er den nomenklatur der blev brugt af forfatterne til at beskrive aminosyren ved c-terminalen af de substrater, de havde udviklet. p2 og p3 er opstrøms aminosyrer i kæden og p4 og p5 er forskellige aminosyrer eller n-beskyttelsesgrupper, afhængigt af substratet. - 91 - (
  7. f)forslaget om at sætte ile på p3 leder læseren til at designe en inhibitor, der har en længde på mindst tre aminosyrer. sprænghovedet (warhead) 6.10.7 forbindelserne der vises i figur 14 er substrater, ikke inhibitorer. de har ikke et sprænghoved, og de fortæller intet om et specifikt sprænghoveds inhibering af og selektivitet for proteasomet. konklusion af wo 904s data vedrørende substrater 6.11 de substrater, der blev fremstillet og testet i wo 904, omfatter ikke og foreslår efter min op- fattelse heller ikke bortezomib. i særdeleshed fordi: 6.11.1 der er ikke noget, der ansporer til anvendelse af dipeptider, tværtimod leder ansøg- ningen væk fra dette. 6.11.2 resultaterne for de testede substrater ville ikke anspore mig til at bruge leu på p1 og phe på p2, og sådanne substrater blev ikke undersøgt. 6.11.3 jeg ville på baggrund af figur 14 forstå, at valget af beskyttelsesgruppe på n- terminalen ville have betydning for bindingen til det aktive site på proteasomet. 6.11.4 der er ikke nogen forslag om at anvende en pyrazincarbonyl n-terminal; dog peger resultaterne på, at valget af n-terminal var vigtig. 6.12 det er endvidere under alle forhold vigtigt at notere sig, at data i figur 14 angår et substrat og ikke en inhibitor. selvom substrathydrolysedata kan være en indikation på inhibitor- aktivitet, er det på ingen måde afgjort. inhibitorerne ifølge wo 904 6.13 ud af de 48 substrater, der blev testet i figur 14, blev kun to substrater anvendt som ud- gangspunkt til design af multikatalytiske proteaseinhibitorer. disse var forbindelserne 2 og 4 i figur 14, dvs. tetrapeptiderne meosuc-glu-val-lys-phe-pna og meosuc-glu-val-lys-nle- pna. 6.14 som beskrevet i eksempel 3, blev der syntetiseret seks inhibitorer på baggrund af disse to substrater. det lader ikke til, at resultaterne af substrathydrolyseforsøgene har været be- stemmende for strukturen af disse inhibitorer, på trods af at forfatterne til wo 904 nævner, at disse resultater ville påvirke designet af inhibitoren. af de inhibitorer der blev fremstillet, blev kun dem, der var baseret på meosuc-glu-val-lys-phe, testet, nemlig; et aldehyd – meosuc-glu-val-lys-phenylalaninal (meosuc-glu-val-lys-phe-
  8. al)- 92 - en boronsyre – meosuc-glu-val-lys-phenylalanin boronsyre (meosuc-evkborof) en klormetylketon – meosuc-glu-val-lys-phenylalanin klormetylketon (meosuc-evkf- ch2ci) 6.15 disse tre inhibitorer blev testet som beskrevet i eksempel 8 for at undersøge deres hæm- mende effekt på chymasen og selektiviteten imod chymotrypsin og cathepsin g. resultater- ne er vist i figur 12 a, b og c, hvor aldehydet udviser langt højere selektivitet for chymasen end klormetylketonen eller boronsyren. 6.16 de eneste data i wo 904 ansøgningen, der viser aktiviteten af proteasominhibitorerne, er vist i figur fig. 13b. i denne figur sammenlignes hæmning af menneskehjerne- multikatalytisk protease med et udvalg af indkøbte og syntetiserede inhibitorer, herunder to af de tre inhibitorer, der var blevet fremstillet på baggrund af meosuc-glu-val-lys-met- pna substratet (se aldehydet
(8)og boronsyren
(9)i figur 13b). - 93 - 6.17 jeg bemærker, at der i fodnoten til tabellen ved figur 13b foreslås, at der for boronsyreinhibi- toren bør være en tyrosingruppe (y i et-bogstavskoden) på p3. dette forekommer imidlertid som værende en fejl, og jeg har antaget, at der skulle have stået valin (
  1. v)9. 6.18 hvis denne figur overhovedet bidrager med noget, er det efter min mening at aldehydinhi- bitoren lader til at virke dobbelt så godt som boronsyren, hvilket fører forskeren til at an- vende aldehydinhibitoren. en forsker ville imidlertid efter min mening være forsigtig med at sætte sin lid til disse resultater. jeg bemærker, at hver inhibitor blev testet i forskellige kon- centrationer – f.eks. er inhibitor 5, n-etylmalimidinhibitoren, testet ved en koncentration på 1mm, sammenlignet med 10 µm for inhibitorerne 6, 8 og 9. det er derfor ikke muligt at fore- tage valide sammenligninger imellem data. 6.19 figur 16 viser en liste på 93 “anvendelige inhibitorer” ("useful inhibitors") som “fagmanden kan fremstille” ("skilled person may prepare")10. på nær en enkelt undtagelse (som er den forbin- delse, der testes i figur 12a og 13b), er jeg ikke bekendt med nogen indikationer i wo 904 på, at disse er blevet syntetiseret eller testet. der er ingen indikationer i wo 904 på, at disse så- kaldte inhibitorer skulle være specifikke for proteasomet i forhold til enhver anden protease, og en generisk inhibitor (som dermed ville mangle specificitet) ville ikke være af nogen inte- resse for en forsker og ville ikke forventes at være egnet til udviklingen af et lægemiddel. 6.20 af de såkaldte inhibitorer, der indholder et boronsyre-“sprænghoved” vist i figur 16, er der ingen af dem, der udviser en præference for de substitutioner, der ville være nødvendige for at fremstille bortezomib: 6.20.1 den korteste forbindelse, der er vist, er et tripeptid. bortezomib er et dipeptid. 6.20.2 boronsyren er kun i to tilfælde afledt fra leucin, flertallet er afledt fra phenylalanin. ingen af forbindelserne har en phe-leu kombination som det ses i bortezomib. 6.20.3 det lader til at basiske aminosyrer foretrækkes på p2. disse aminosyrer bærer en po- lær protoneret gruppe; bortezomib har derimod en upolær phenylalanin på p2. 6.20.4 adskillige forbindelser har d-stereokemi, og ville dermed næppe være effektive in- hibitorer af et naturligt forekommende stof (target), hvor l-stereokemi ville være fo- retrukket11. 6.20.5 den heteroaromatiske acylgruppe på n-beskyttelsesgruppen som anvendt i borte- zomib er ikke vist i nogen af eksemplerne. opsummering af resultaterne i wo 904 6.21 sammenfattende ser jeg ikke noget i wo 904 ansøgningens resultater, der ville lede en per- son eller et team, der forsøger at udvikle proteasominhibitorer, i retning af bortezomibs struktur. særligt idet: 6.21.1 en forsker ville ikke blive ledt i retning af et boronsyre-sprænghoved, om noget er resultaterne i figur 12 og 13 en opfordring til at undersøge aldehyder. 9 jeg har gjort denne antagelse fordi:
  2. i)det ville betyde at forfatterne testede to af de tre inhibitorer, der var synteti- seret til at hæmme chymase;
  3. ii)der er i figur 14 ingen analoger med tyrosin ved "p3" der lader til at have været undersøgt, selvom mange er valinanaloger; og iii) "evk" er de tre aminosyrer nærmest n-terminalen af methioninen "m" i app-sekvensen som vist i figur 5, der er ingen "eyk" sekvens ved denne position. 10 side 54, linje 20-23. 11 betegnelsen "l" beskriver i denne kontekst den tredimensionelle placering af de forskellige aminosyregrupper. beg- ge enantiomerer har samme kemiske og fysiske egenskaber bortset fra, at de roterer polariseret lys i modsatrettede retninger. enantiomererne kan endvidere have forskellige farmakologiske egenskaber. naturligt forekommende stoffer har l- konfigurationen. - 94 - 6.21.2 der er intet der peger i retning af anvendelsen af dipeptider; ansøgningen viser der- imod en præference for tri- og tetrapeptider. i de to tilfælde, hvor der testes et dipep- tidsubstrat12, ses en nedgang i aktiviteten. jeg finder ikke denne nedgang i aktivitet, der er forbundet med kortere kædelængde uventet, idet det i 1995 var kendt, at inhibitorer med kortere kædelængde generelt resulterede i forbindelser med lavere potens. som det er vist i vinitsky '94 og rock '95 (se henholdsvis bilag 6 og 7), var den foretrukne kædelængde for potentielle protea- sominhibitorer tetrapeptider og tripeptider. 6.21.3 data i ansøgningen støtter ikke udtalelsen om, at leu på p1 foretrækkes, og borte- zomib indeholder under alle omstændigheder ikke leu og arg på p1 og p2, som det foreslås af ansøgningens fortattere. 6.21.4 data i wo 904 ansøgningen peger på, at valget af n-terminal vil påvirke en inhibi- tors aktivitet, men bortezomibs pyrazin-2-carboxy n-terminalgruppe fremgår ikke af ansøgningen og foreslås ikke af nogen af de mange forbindelser, der er nævnt som potentielle inhibitorer. det er nu blevet bekræftet, at n-terminalgruppen i bortezomib spiller en aktiv rolle i bindingen af bortezomib til proteasomet. jeg vedhæfter som bilag 8 en artikel af groll et al
(2006), hvori pyrazin-2-carboxygruppen (n-terminalgruppen) af borte- zomib viser stærke specifikke interaktioner med residualerne af s3 substratbindings- regionen af proteasomets aktive sites (side 454). 6.21.5 endelig er der ikke nogen celleassayresultater eller in vitro resultater i wo 904 an- søgningen, der viser, hvordan nogle af de testede eller foreslåede substrater eller in- hibitorer ville virke i en celle eller i en organisme. i praksis kan selv kandidatforbin- delser, der viser lovende resultater i kinetiske forsøg in vitro vise sig at være uegnede forbindelser, når de testes i celler. formel ii 6.22 på trods af de begrænsede data i wo 904 ansøgningen, har forfatterne foreslået en ekstrem bred formel for noget, der måske kan anvendes til fremstilling af en inhibitor. dette beskri- ves på side 10 som "an inhibitor of a protease, having the formula ii". jeg er blevet bedt om at be- skrive omfanget af denne formel, og hvorvidt bortezomib er omfattet af denne. 6.23 som biokemiker med over 20 års erfaring indenfor proteasom-området har jeg designet og fremstillet mine egne proteasominhibitorer og har også til tider arbejdet sammen med bioor- ganiske kemikere om at udvikle inhibitorer. 6.24 jeg er blevet bedt om at kommentere på udregningen som vist i bilag 9, der er et estimat på 93.8 billioner13 på det antal forbindelser, der er omfattet af formel ii. som jeg har forstået det, er denne udregning foretaget af professor overkleeft til brug for en hollandsk retssag mel- lem millennium og teva. 6.25 efter min mening, er dette estimat på 93.8 billioner forbindelser et signifikant underestimat, idet der er adskillige grupper, der ikke er taget med i udregningen, f.eks. de mulige amino- syrer, der foreslås for position a4 i formel ii. derudover er der ved flere lejligheder define- ret grupper så som "lower alkyl", der behandles som en enkelt enhed, hvorimod en term som "lower alkyl" rent faktisk kunne omfatte et signifikant antal af grupper. 12 i hydrolyse-test af substrat 31 og 32 i figur
  1. 13 93,800,000,000,000 eller 9.38 x
  2. - 95 - 6.26 jeg har forstået, at professor overkleeft har foreslået at et fagligt kvalificeret team omfatten- de medicinske kemikere i 1995 i teorien ville have kunnet fremstille og teste cirka 200 for- bindelser om ugen, eller 10.400 forbindelser på et år. med denne hastighed ville det tage dem 9 x 109 (= 9 milliarder) år at undersøge samtlige af de forbindelser, der teoretisk er om- fattet af formel ii. 6.27 jeg er enig med professor overkleefts konklusion, at det langt fra ville være realistisk at iværksætte et forskningsprojekt, hvor samtlige af de forbindelser, der er omfattet af formel ii skulle fremstilles og undersøges. 6.28 henset til det meget omfattende spænd af strukturer, der er omfattet af denne formel ii, ville jeg kun forvente, at en meget lille andel ville have nogen som helst egenskab som pro- teasominhibitor, for ikke at tale om potentielle terapeutiske kandidater. en inhibitors effek- tive virkning afhænger af faktorer så som forbindelsens konformation samt typen og række- følgen af de funktionelle grupper. for eksempel: 6.28.1 små ændringer i en forbindelse har stor betydning for den måde, hvorpå de binder til det aktive site. en ændring i én funktionel gruppe vil have betydning for effekten af de andre enheder. dette kan ses ved betydningen af substitutionerne af substra- terne i figur 14, for eksempel har forbindelserne 7-13 den samme n- beskyttelsesgruppe (meosuc), phe ved aminosyre 1 og val ved aminosyre
  3. forfat- terne ændrede kun aminosyre 2, mens resultatet af hydrolysen ændredes fra 0 til 432%. tilsvarende har substraterne 2 og 45 til 48 de samme fire peptider og adskiller sig kun fra hinanden ved n-beskyttelsesgruppen, og hydrolyseresultaterne varierer fra 10 til 478%. artiklen af rock et al,
(1994), vedlagt som bilag 7, viser, at små ændringer i en tripep- tidinhibitors rygrads-struktur havde signifikant betydning for forbindelsens virk- ningsgrad som inhibitor. 6.28.2 som nævnt ovenfor, er der et antal af de foreslåede “inhibitorer” i figur 16 i wo 904 ansøgningen, der har d-konfiguration stereokemi. det ville være overraskende, hvis en inhibitor, der har den ”unaturlige” d-konfiguration, var effektiv mod et naturligt target. jeg ville forvente, at enhver effektiv inhibitor stereokemisk skulle have l- konfiguration. dette støttes af data i figur 14, der viser, at den multikatalytiske pro- tease slet ikke hydrolyserer substrater, der har d-konfiguration (se substraterne 3, 25, 26 og 30). 6.29 wo 904 beskriver formel ii som en formel for inhibitorer af enhver protease (s.10, linje 2). som nævnt ovenfor, varierer proteaser enormt i deres struktur og virkemåde og der er til- svarende enorm variation af deres inhibitorer. jeg ville ikke forvente, at en inhibitor univer- selt ville kunne hæmme proteaser fra forskellige klasser, for eksempel både en metallopro- tease og en serinprotease, eller en threoninprotease så som proteasomet. faktisk ville en så- dan mangel på specificitet være uønsket i en potentiel farmaceutisk forbindelse. som disku- teret ovenfor var klassifikationen af proteaser under alle forhold i bedste fald usikker i mid- ten af 1990erne. 7 ep 0 788 360 b3 ("ep 360") 7.1 jeg er blevet bedt om at kommentere på de data, der er fremlagt i ep 360, som jeg forstår er et patent der indehaves af millennium, og som angår bortezomib. 7.2 efter min mening indeholder dette patent data, der viser, at opfinderne fremstillede potente og stærkt selektive inhibitorer. disse data er vist i eksemplernes tabeller, og jeg vil komme nærmere ind på hver enkelt tabel ii – vii nedenfor. - 96 - tabel ii 7.3 table ii i eksempel 18 lister 93 inhibitorer, der er fremstillet af opfinderne og testet for deres evne til at hæmme 20s proteasomet. inhibitoreffekten er angivet som en ki værdi (dissocia- tionkonstanten), hvor lavere værdier indikerer en bedre inhibitorevne. bortezomib er inhibi- toren mg-341 og har en ki værdi på 0.6 nm, og ligger således i dette forsøg i den bedste tred- jedel af de testede forbindelser. 7.4 mange af de forbindelser, der udviste dårligere resultater, kan tilskrives deres strukturelle træk så som d-stereokemi, hvilket ikke er hensigtsmæssigt, når et naturligt forekommende target forsøges hæmmet; eller det kan tilskrives det faktum, at de mangler et boronsyre- sprænghoved. boronsyrer blev af opfinderne i ep 360 opdaget som værende meget potente inhibitorer af proteasomet (dette er almen viden i dag, men var ikke kendt i 1995). 7.5 denne tabel viser mig også, at ændringer i inhibitorens n-terminal kan influere på ki værdi- en. se for eksempel mg-268 og mg-274, som kun adskiller sig ved n-terminalen og som har ki værdier på henholdsvis 998 og 3. tabel iii 7.6 tabel iii sammenligner 20s ki værdien for en dipeptid-boronsyre (mg-274) med det tilsva- rende dipeptidaldehyd (d.v.s. de adskiller sig kun ved deres “sprænghoved”). jeg ville have anset disse resultater som værende væsentlige vidensbidrag i 1995, idet de viser, at dipeptid- boronsyren er en meget effektiv inhibitor i modsætning til aldehydet. 7.7 resultaterne der fremlagdes i ep 360 for dipeptid-inhibitorer var overraskende. jeg ville ha- ve forventet, at en inhibitor med så kort en ikke ville være effektiv og dermed ikke ville være en potent inhibitor, og jeg var overrasket over, hvor potent bortezomib var, da jeg for første gang blev bekendt med dens struktur i 1998. omkring 1995 fokuserede forskningen på inhi- bitorer med længere kæder, så som tripeptider og tetrapeptider mens kortere kædelængder blev anset for at være mindre potente. tabel iv 7.8 denne tabel sammenligner fem boronsyrers (herunder bortezomibs (mg-341)) og to peptid- aldehyders evne til at hæmme proteasomet og en anden almindelig protease, cathepsin b. efter min mening viser denne tabel en række forskellige ting: 7.8.1 boronsyrerne har dissociationkonstanter der er adskillige størrelsesordner bedre (la- vere) for 20s proteasomet end for cathepsin b. 7.8.2 de præsterer også bedre end aldehyderne. jeg har nedenfor lavet en tabel, hvor se- lektiviteten for hver inhibitor er udregnet ved at dele k i værdien for cathepsin b med værdien for proteasomet. en højere værdi indikerer en bedre selektivitet: - 97 - forbindelse selektivitet for 20s proteasomet i inhibitortype forhold til cathepsin b mg-154 0,075 aldehyd mg-191 1,421 aldehyd mg-262 174.285 boronsyre mg-273 1.111.111 boronsyre mg-296 2.353 boronsyre mg-309 160.976 boronsyre mg-341 266.667 boronsyre (bortezomib) 7.8.3 resultaterne i tabel iv viser, at n-terminalgruppen påvirker inhibitorevnen og se- lektiviteten. mg-273 og mg-296 adskiller sig kun fra hinanden ved n-terminalen, li- gesom mg-309 og mg-341 gør det, dog vises det, at de adskiller sig markant for så vidt angår inhibitorevne samt deres grad af selektivitet mellem de forskellige pro- teasomer. denne forskel kan kun forklares med ændringerne i n- beskyttelsesgruppen. 7.9 samlet set er jeg enig med opfindernes kommentarer på side 43 afsnit 0221 om, at: "table iv demonstrates the markedly superior selectivity for the 20s proteasome over other proteases, e.g. cathepsin b, exhibited by the boronic esters/acids as compared to the peptide aldehydes". tabel v 7.10 opfinderne undersøger derefter selektiviteten af fem boronsyreinhibitorer (herunder mg- 341, bortezomib) for 20s proteasomet, sammenlignet med tre almindeligt forekommende se- rinproteaser. jeg har igen udregnet selektiviteten ved at dele ki værdien for hver protease med værdien for 20s proteasomet: forbindelse antal gange større selektivitet for 20s proteasomet i forhold til: human leukocyt cathepsin g chymotrypsin elastase mg-262 500 1.833 233 mg-267 1.500 330.000 23.000 mg-296 21 5.411 44 mg-309 8.537 5.853 567 mg-341 3.833 1.046 536 - 98 - 7.10.1 som ovenfor bemærker jeg, at ændringerne i n-terminalen lader til at påvirke inhibi- torevnen og selektiviteten. mg-309 og mg-341 adskiller sig kun fra hinanden ved n- terminalen. 7.10.2 det eneste tripeptid, der undersøges i dette forsøg, er mg-262 og jeg bemærker, at det i de fleste tilfælde er mindre selektivt end de fleste af de undersøgte dipeptider og i særdeleshed mindre selektivt end bortezomib (mg-341). 7.11 jeg er enig med opfindernes udsagn på side 43, afsnit [0222] om, at: "the selectivity of boronic acid inhibitors of the proteasome is further demonstrated in table v" tabel vi 7.12 i eksempel 19 i ep 360 undersøges proteolyseevnen i en musse-myoblast cellelinje. kort for- talt er metoden i dette forsøg, at proteinerne, der produceres i cellerne, indeholder radioak- tive aminosyrer. når disse proteiner nedbrydes, frigives radioaktiviteten til cellevækstmedi- et, hvor det måles. den målte værdi konverteres til en ic50 værdi, som er den koncentration ved hvilken halvdelen af proteasomets aktivitet er hæmmet. en lav værdi indikerer således en god inhibitor. resultaterne er vist i tabel vi. 7.13 et cellekulturassay som dette er på trods af sine begrænsninger en god indikator for en inhi- bitors aktivitet in vivo. for at vise gode resultater under disse forhold skal inhibitoren funge- re i en celle, den skal f.eks. kunne trænge ind i cellen og fungere under de betingelser, der er i cellen. disse betingelser er ikke til stede i in vitro inhibitor-forsøg som dem, der er vist i ek- sempel 18. selvom resultaterne i tabel ii således er nyttige for at kunne identificere forbin- delser med god aktivitet, er resultaterne i tabel vi bedre til at indikere hvilke inhibitorer, der vil være gode in vivo. 7.14 der blev testet 47 inhibitorer i tabel vi med ic50 værdier, der spænder fra 48 til 64.000 nm. mg-341 (bortezomib) har en ic50 værdi på 69 nm, som er det tredje bedste (laveste) resultat. jeg ved af erfaring, at 69 nm er en meget lav værdi, og at dette kunne være en inhibitor, der ville vise god aktivitet in vivo. tabel vii 7.15 i eksempel 23 sammenlignes tre boronsyreinhibitorers evne til at blokere dth responsen (delayed-type hypersensitivity response) i mus. det forklares i patentet, at dette er en må- ling af en forbindelses evne til at reducere øre-inflammation i en musse-model. inflammati- on er forbundet med proteasomaktivitet, idet proteinkompleks nf-κb (nuclear factor kappa- light-chain-enhancer af aktiverede b-celler) aktiveres af proteasomet og spiller en kritisk rol- le ved inflammation. inhibering af protasomet inhiberer derfor produktionen af nf-κb. 7.16 jeg har ikke foretaget disse test selv, men jeg husker at det var en temmelig almindelig stan- dardtest at udføre i 1995. efter min opfattelse indikerer et godt resultat i dth respons- te- sten, at testforbindelsen har terapeutisk potentiale. resultaterne er vist i tabel vii. 7.17 mg-341 (bortezomib) udviser bemærkelsesværdig bedre inhibitorevne end de to andre for- bindelser, 90% ved en 3 mg/kg dosis. det er min erfaring, at forbindelser der viser god akti- vitet ved koncentrationer, der er lavere end 10 mg/kg, kan anses som værende gode potenti- elle farmaceutiske kandidater. sammenfattende om ep 360 7.18 sammenfattende viser ep 360 efter min mening dipeptid-boronsyreinhibitorer, der er gode inhibitorer af 20s proteasomet, og som er selektive for 20s proteasomet i forhold til en række andre proteaser. - 99 - 7.19 mg-341 udviser gennemgående god inhibitoraktivitet og selektivitet mod almindeligt fore- kommende proteaser. det er en af de forbindelser, der viser det bedste resultat i det celleba- serede assay, og det er tydeligvis den mest effektive forbindelse der blev testet i dyreforsø- get. konklusion 7.20 ingen af de inhibitorer, der blev foreslået i wo 904 ansøgningen, viser samme gode selekti- vitet og effekt i et cellelinjeforsøg og i en in vivo model, som det der vises for mg-341 (borte- zomib) i ep 360. selektivitet og effektivitet under de forhold, der er i celler, er, sammen med virkningsfuldhed helt afgørende egenskaber for potentielle farmaceutiske inhibitorer. der er ingen vejledning i wo 904 ansøgningen, der fortæller en fagmand, hvordan en inhibitor- kandidat, der besidder disse egenskaber, skal designes.” følgende fremgår af den danske oversættelse af patentagent ejvind j. christiansens erklæ- ring af 25. august 2017, der er indgivet i nærværende sag: ”patentsagkyndig erklæring advokat sture rygaard har bedt undertegnede ejvind j. christiansen, europæisk patentagent, zacco, om at afgive en sagkyndig erklæring vedrørende gyldigheden af dk/ep 0 788 360 til anvendelse i en retssag, der er anlagt af millennium pharmaceuticals inc. mod teva denmark a/s. … som grundlag for min erklæring har jeg læst følgende dokumenter dk/ep 788 360 t5 (bilag 3) (“grundpatentet”), og sagsakterne vedr. dk-omprøvningen cr 2004 00012 (bilag 1) ep 788 360 b3 (bilag 4) og sagsakterne vedr. ep-sagsbehandlingen wo 91/13904 (bilag 5) vinitsky et al. (bilag 6) dom afsagt af byretten i haag den 25. juli 2017 dom afsagt af den føderale domstol i ontario den 26. februar 2015 professor overkleefts sagkyndige erklæring af 29. juni 2017 iupac-anbefalinger, "glossary of class names of organic compounds and reactive intermediates based on structure", 1995 (uddrag) (bilag
  1. g)1. de bedes give et resumé over patenterbarhedsprøvningen, som har ført til stridspatentet (“ep 360”). 1.1 ep 360 er baseret på pct-ansøgningen wo 96/13266, som oprindeligt blev indleveret til us/pto (og udsat for international præliminær prøvning af samme). 1.2 da ansøgningen indtrådte i den regionale fase ved epo, blev der foretaget en supplerende søg- ning, således som det er almindeligt for ansøgninger, der er undersøgt af andre patentmyndigheder. sagsbehandleren citerede ep-ækvivalenten af us 5.169.841 (”kleeman”), som allerede var blevet cite- ret i søgningen, der var udført på pct-ansøgningen af us/pto, såvel som to intervenerende doku- menter wo 95/24914 (myogenics inc.) “wo914” og wo95/25533 (harvard college) “wo533” (offent- liggjort hhv. den 21. og 28. september 1995). - 100 - 1.3 i den første udtalelse dateret den 19. april 2001 (bilag ejc-2), henviste examining division kollektivt til kleeman, de to ovennævnte wo-ansøgninger og to andre dokumenter, us 5106849 (“kinder”) og us 4.499.082 (“shenvi”), som også var blevet citeret af us/pto i søgningen, som oprindeligt blev ud- arbejdet i forhold til pct-ansøgningen (wo 96/13266). examining division påpegede et materielt overlap mellem forbindelserne i krav 1 og især modhold 1 (kleeman), men også modhold 4 (kinder) og 5 (shenvi) og bad om en entydig præcisering før prøv- ning af opfindelseshøjden. det blev anerkendt, at forbindelserne i krav 1 havde nyhed i forhold til wo-ansøgningerne, som beskriver strukturelt relaterede hovedsageligt tripeptidaldehyder, men ikke boronsyrer eller estere. 1.4 som svar herpå indleverede ansøgeren et nyt kravsæt, hvor “alkyl“ og ”aralkyl” var fjernet fra defi- nitionen af n-terminal-beskyttelsesgruppen “p“, som således blev begrænset til heteroaryl og heteroa- rylalkyl. ansøgeren forklarede, at ingen af modholdene 1 (kleeman), 4 (kinder) eller 5 (shenvi) fore- slog eller beskrev en n-terminal-gruppe, indeholdende en heteroaryl- eller heteroarylalkylenhed. jeg bemærker, at kravene i patentet senere blev afgrænset til ikke at omfatte “heteroarylalkyl” i defini- tionen af n-terminal-beskyttelsesgruppen “p“ både i den danske omprøvningssag ifølge paragraf 53e i den danske patentlov (2006-2007) og (2008-2009) i en central begrænsningsprocedure ved epo ifølge artikel 105a i epk, som det fremgår af de senere dk/ep 360 t5 og ep 360 b3 publikationer. som følge heraf kan “heteroarylalkyl” lades ude af betragtning i den nedenstående diskussion. 1.5 for at foregribe diskussionen om opfindelseshøjde definerede ansøgeren problemet, som blev adresseret af den foreliggende opfindelse, som: “tilvejebringelsen af forbindelser, som er potente og meget selektive protea- sominhibitorer og som kan anvendes til at inhibere proteasomfunktionen“ (lige- ledes citeret i afsnit [0013] i ep360). en sådan inhibering kan anvendes inden for behandlingen eller forebyggelsen af bl.a. de sygdomme, der er nævnt i afsnit [0014]-[0022] i ep360, og andre tilstande forårsaget af intracellulær aktivitet. des- uden gjorde ansøgeren gældende at: 1.5.1 kleeman beskrev alfa-aminoboronsyrederivater som inhibitorer af rennin (en naturlig aspartyl- protease). fagmanden ville ikke have forventet, at ansøgerens modificerede forbindelser ville være anvendelige til inhibering af proteasomfunktionen. 1.5.2 kinder angår boronsyreanaloger af dipeptider og tripeptider og deres anvendelse til inhibering af tumorvækst ved inhibering af elastase og chymotrypsin. der er ingen motivation for fagmanden at modificere kinders forbindelser for at nå frem til ansøgerens heteroarylforbindelser med forventning om at fremstille forbindelser, der har en proteasominhiberende virkning. 1.5.3 shenvi er rettet mod alfa-aminoboronsyreforbindelser, som har en proteaseinhiberende virkning, især på neutrophil elastase, som er involveret i patenogenesen af emphysem. på denne baggrund ville fagmanden ikke have overvejet at modificere shenvis forbindelser med forventning om at fremstille forbindelser, der har en proteasominhiberende virkning. en kopi af besvarelsen er vedlagt som bilag ejc-3. 1.6 i den anden udtalelse anførte sagsbehandleren, at: - 101 - “set i lyset af den sammenlignende argumentation fremlagt af ansøgeren med hensyn til den kendte teknik, der er defineret i udtalelsen dateret den 19. april 2001, kan også opfindelseshøjden anerkendes for den genstand, der ønskes pa- tentbeskyttet”. der var nogle få udestående formaliteter såsom en tilpasset beskrivelse, og efter at have bragt dette i orden, blev ansøgningen godkendt og patentet blev udstedt den 28. maj 2003. der blev ikke nedlagt indsi- gelse. som nævnt ovenfor blev der i februar 2006 indleveret en anmodning til dk/pto om iværksættelse af administrativ omprøvning i henhold til afsnit 53e i den danske patentlov, og der blev i marts 2008 ind- leveret en anmodning til epo om begrænsning ifølge artikel 105a i epk for at begrænse kravene i pa- tentet til ikke at omfatte “heteroarylalkyl” i definitionen af beskyttelsesgruppe p. 2. hvad er deres holdning til den kendsgerning, at wo 904 ikke blev anvendt som modhold i for- hold til ansøgningen? 2.1 wo 904 er citeret både i afsnit [0002] ep360 og i pct wo 96/13266 sammen med bl.a. shenvi, kin- der og kleeman. det forekommer således meget usandsynligt, at den amerikanske sagsbehandler ikke også har taget wo 904 i betragtning og anset det for mindre relevant end de andre tre. da ep- sagsbehandleren udførte den supplerende søgning, tilføjede han de to wo-ansøgninger (wo 914 og wo 533 som nævnt ovenfor i punkt 1.2), idet han gjorde opmærksom på, at de var “dokumenter, der var blevet citeret i ansøgningen“ (kode d), se afsnit [0006] og [0007], så det er usandsynligt, at han ik- ke også har taget wo 904 i betragtning og anset det for at være mindre relevant. jeg bemærker, at sagsbehandleren søgte i klasse c07k, som er en af de klasser, wo 904 falder ind under. 2.2 jeg er derfor ikke overbevist om, at nogen af sagsbehandlerne (dvs. hverken ved us/pto eller epo) begik en fejl, da de valgte ikke at citere wo 904. ep-sagsbehandleren angav ikke specifikt, hvad der efter hans opfattelse var den “nærmeste kendte teknik“, da han ikke kunne forudse, hvilke be- grænsninger ansøgeren ville foretage for at tilvejebringe nyhed, men det ville normalt være modhold 1 (kleeman). ansøgeren indtog heller ikke noget standpunkt, men forklarede, hvorfor de nye krav havde opfindelseshøjde i forhold til alle tre modhold, hvorved spørgsmålet om, hvad der skulle be- tragtes som nærmeste kendte teknik, blev akademisk. 2.4 anerkendelsen af patenterbarheden i forhold til hele den citerede kendte teknik er ikke overra- skende for mig set i lyset af epo’s normale praksis i lignende sager og forekommer mig at være kor- rekt i betragtning af ansøgerens argumenter og den udførlige eksperimentelle underbyggelse af pro- teasominhiberingen og dennes selektivitet. 3. er bortezomib efter deres opfattelse omfattet af proteasominhibitorerne, der er beskrevet i wo 904? 3.1 svaret på dette spørgsmål beror i sidste ende på, hvorvidt “heteroarylcarbonyl“ eller mere speci- fikt “(2-pyrazin)carbonyl” n-beskyttelsesgruppen i bortezomib er omfattet af “n-terminal- blokeringsgruppen“ , der er defineret på sige 8 i wo 904, eller mere specifikt af “arylcarbonyl”. 3.2 det er min erfaring, at patentansøgere inden for området organisk kemi normalt definerer speci- fikt, hvad der menes med de forskellige organiske grupper “ifølge opfindelsen”, hvad angår antallet af carbonatomer, mulige substituenter osv. både for at undgå klarhedsindvendinger i henhold til arti- kel 84 i epk og sikre sig muligheder at falde tilbage på, som ikke er i strid med artikel 123 i epk. an- - 102 - søgeren ville også normalt angive specifikke eksempler på de forskellige grupper, som han ønsker at beskytte. dette påvises ved definitionen af carbonatomerne i alkylsidekæderne i wo 904, som forfat- terne specifikt anfører kan substitueres med heteroatomer (se wo 904, side 8, ll. 18-20). 3.4 hvis beskyttelsen af “heteroaryl” er vigtig, f.eks. fordi en patentansøgning beskriver eksempler på heteroarylforbindelser, vil det være naturligt at angive en definition. 3.5 hvis vi vender tilbage til definitionerne i wo 904, så forklares det på side 8, linje 15-17, hvad der menes med "aryl": "med »aryl« menes der en aromatisk enhed, f.eks. phenyl, med 6 til 18 carbona- tomer, som er usubstitueret eller substitueret med en eller flere alkyl-, substitu- eret alkyl-, nitro-, alkoxy- eller halogengrupper;" desuden har jeg læst analysen af definitionerne, der er anvendt i wo 904 i afsnit 43-51, i professor overkleefts erklæring af 29. juni 2017, hvor han konkluderer, at “arylcarbonyl“ som defineret i wo904 - ikke set med en fagmands øjne - ville omfatte “heteroarylcarbonyl“. jeg tilslutter mig helt denne ana- lyse både ud fra et kemisk synspunkt og som patentagent. der er almindelig enighed om, at definitio- nerne i et patent skal anvendes til at fortolke dette patent. 3.6 jeg har fået forklaret, at teva støtter sig til anbefalingerne fra 1995 vedrørende harmoniseret an- vendelse af kemisk nomenklatur inden for organisk kemi, som er udgivet af iupac, the international union of pure and applied chemistry. først og fremmest er det vigtigt at bemærke, at iupac- anbefalinger (inden for organisk kemi eller et andet område) ikke anvendes regelmæssigt af patent- myndighederne som en del af deres patenterbarhedsprøvning. personligt har jeg aldrig set en udtalel- se, der henviste til iupac-anbefalinger. jeg er klar over, at de findes, men har aldrig anvendt dem personligt i forbindelse med mit arbejde. hvis man imidlertid for argumentationens skyld ser på iupac-anbefalingerne fra 1995 (bilag g), så giver dette heller ikke nogen klare retningslinjer. oplys- ningen om “arylgrupper“ lyder således: “grupper, der er afledt af arener ved fjernelse af et hydrogenatom fra et ringcar- bonatom. noc-regel a-13.5. grupper, som på tilsvarende måde er afledt af he- teroarener, er undertiden omfattet af denne definition (se heteroarylgrupper).“ (min understregning) 3.7 der er således efter min opfattelse intet grundlag for at udvide den ordrette lære i wo904 til hver- ken at beskytte selve bortezomib eller andre heteroarylforbindelser fra ep360, og bortezomib kan der- for ikke anses for en “udvælgelse“ blandt forbindelser i wo 904, for slet ikke at tale om “udvælgelse med ikke-opfindelseshøjde“. hvad enten heteroaryl er beskyttet eller ej, så er imidlertid spørgsmålet, når alt kommer til alt, hvorvidt det var nærliggende at vælge forbindelser, som har lige netop “hetero- arylcarbonyl” og mere specifikt 2 –pyrazincarbonyl som n-terminal-beskyttelsesgruppen i betragt- ning af det i wo 904 beskrevne.” følgende fremgår af professor knud jørgen jensens erklæring af 18. august 2017, der er ind- givet til nærværende sag: ”eksperterklæring vedr. dansk patent nr. dk/ep 0 788 360 t5 - 103 - undertegnede, professor knud jørgen jensen, københavns universitet, er af advokat klaus ewald madsen blevet bedt om at give min vurdering af dansk patent nr. dk/ep 0 788 360 t5 (herefter beteg- net ep 360) på baggrund af den kendte teknik, herunder navnlig wo 91/13904, us 4,499,082 og us 5,106,948. advokat klaus ewald madsen har også bedt mig om at give en kort beskrivelse af aminosyrer og pep- tider samt en kort redegørelse af enzymers, specielt proteasers, og inhibitorers virkemåde. jeg er endvidere blevet oplyst om, at ep 360 patentets relevante prioritetsdag er den 16. maj 1995, og at min vurdering derfor skal tage udgangspunkt i, hvad fagmandens viden var på dette tidspunkt. jeg er blevet bedt om at give denne vurdering med udgangspunkt i min egen erfaring og viden inden for dette tekniske område samt den litteratur, jeg er blevet præsenteret for af advokat klaus ewald madsen, hvilket drejer sig om følgende dokumenter: - dk/ep 0 788 360 t5 (bilag 2) - wo 91/13904 (bilag 5) - us 4,499,082 (bilag m – kjj-01) - us 5,106,948 (bilag m – kjj-02) - us 5,169,841 (bilag m – kjj-03) - wo 95/24914 (bilag m – kjj-04) - kettner et al. “inhibition of the serine proteases leukocyte elastase, pancreatic elastase, ca- thepsin g, and chymotrypsin by peptide boronic acid”, the journal of biological chemistry, vol. 259, no. 24, 1984 (bilag
  2. d)- tomkinson et al, biochem j, 1992;286;475-480 (bilag m – kjj-05) - vinitsky et. al., the journal of biological chemistry, vol. 269, nr. 47, 1994 (bilag 6) - iupac recommendations, “glossary of class names of organic compounds and reactive intermediates based on structure”, 1995 (uddrag) (bilag
  3. g)- gross and meienhofer, the peptides, vol. 3, academic press, new york, side 3-81, 1981 (bilag
  4. h)- ghosh et al., “potent hiv protease inhibitors: the development of tetrahydrofuranylglycines as novel p2-ligands and pyrazine amides as p2-ligands”, j. med. chem., 36, side 2300-2310, 1993 (bilag
  5. i)- shi et al., ”design, synthesis and docking studies of novel dipeptidyl boronic acid proteasome inhibitors constructed from - and -amino acids”, bioorganic & medicinal chemistry let- ters 26, side 1958–1962, 2016 (bilag
  6. j)min baggrund for at afgive denne erklæring fremgår af vedlagte cv (bilag m – kjj-06), hvoraf det fremgår, at jeg siden 2007 har været professor i nanobioscience på københavns universitet, siden 2012 ved kemisk institut. som det også fremgår af mit cv, blev jeg kandidat fra københavns universitet i 1990 og opnåede i 1992 en phd grad ligeledes fra københavns universitet (i samarbejde med carlsberg laboratorium). fra 1993 til 1996 arbejdede jeg som post doc på university of minnesota. fra 1997 til 2000 var jeg ansat som adjunkt og i perioden 2000-2001 som forskningslektor ved danmarks tekniske universitet. i pe- rioden fra 2001 til 2007 var jeg ansat som lektor ved den kongelige veterinær- og landbohøjskole, hvorefter jeg, som nævnt ovenfor, blev ansat som professor i forbindelse med fusionen med køben- havns universitet. jeg har udgivet mere end 130 videnskabelige artikler i internationalt anerkendte tidsskrifter. jeg er endvidere forfatter og medforfatter på to faglærebøger, der omhandler design og syntese af peptider. - 104 - jeg modtog i 2004 torkil holms forskningspris og i 2012 leonidas zervas award fra european pepti- de society. jeg er endvidere medlem af editorial board på tre forskellige internationalt anerkendte videnskabelige tidsskrifter. mit forskningsområde gennem størstedelen af min karriere har været bioorganisk kemi, specielt pep- tiders kemi. med udgangspunkt i dette har min forskningsgruppe forsket inden for nanobioviden- skab, kemisk biologi og medicinalkemi. i en årrække har min forskningsgruppe i samarbejde med kol- leger på århus universitet og i kina arbejdet med peptid-baserede protease inhibitorer, hvilket har ført til syv artikler inden for dette område. jeg er blevet aflønnet for mit timeforbrug i forbindelse med udarbejdelsen af nærværende erklæring. jeg har ingen økonomiske interesser i nogen af sagens parter. 1. kort beskrivelse af det tekniske område 1.1 aminosyrer en væsentlig bestanddel af alle levende celler er proteiner, der er opbygget af ca. 20 forskellige α- aminosyrer. en α-aminosyre har den kemiske formel vist nedenfor: h o h2n c c oh r aminosyrer indeholder således altid en aminogruppe (h2n-) og en carboxylsyregruppe (-cooh). de enkelte aminosyrer adskiller sig fra hinanden i og med, at r-gruppen i formlen ovenfor er forskellig for de enkelte aminosyrers vedkommende. i den mest simple aminosyre, glycin, er r- gruppen således et hydrogenatom (r = h), hvorimod r-gruppen i aminosyren alanin er en methyl- gruppe (r = ch3). aminosyrer forkortes ofte med tre bogstaver. for eksempel forkortes aminosyren glycin med gly, og aminosyren alanin forkortes med ala. 1.2 peptider i peptider er aminosyrerne bundet sammen i kæder ved en såkaldt peptidbinding, der dannes, når carboxylsyregruppen i én aminosyre reagerer med aminogruppen i en anden aminosyre under fra- spaltning af vand (h2o). dette er illustreret i figuren nedenfor: h h o o h2n c c + h2 n c c oh oh r1 r2 h o h o h2n c c n c c + h 2o oh r1 h r2 peptidbinding det simpleste peptid, et dipeptid, består således af to aminosyrer. et tripeptid består af tre aminosyrer osv. når man ønsker at angive rækkefølgen af aminosyrer i et peptid anvendes aminosyrernes forkortede navne, således at man starter med aminosyren, der indeholder den frie (n-terminale) aminogruppe, - 105 - ofte angivet med –nh2, og slutter med den aminosyre, der indeholder den frie (c-terminale) carboxyl- syregruppe, ofte angivet med –cooh. h-ala-phe-gly-oh angiver således et tripeptid, der består af en n-terminal alanin (ala) efterfulgt af phenylalanin (phe), der igen er efterfulgt af en c-terminal glycin (gly). dette er illustreret i figuren nedenfor: h o h h o o h2n c c n c c n c c oh ch3 h ch2 h h ala phe gly som oftest anvendes betegnelsen oligopeptid, hvis peptidet indeholder 2-10 aminosyrer, og betegnel- sen polypeptid, hvis peptidet indeholder 11-50 aminosyrer. indeholder peptidet mere end 50 amino- syrer karakteriseres det normalt som et protein. det skal bemærkes, at der ikke findes en fast grænse mellem oligopeptider, polypeptider og proteiner. 1.3 enzymer (proteaser) enzymer er proteiner, der findes i alle organismer, lige fra encellede bakterier til flercellede planter og dyr. enzymer er naturens katalysatorer, dvs. et molekyle, der kan forøge hastigheden af kemiske reak- tioner, uden selv at blive ændret. dette betyder, at enzymer kan hjælpe kemiske reaktioner på vej, uden at de selv bliver ødelagt eller forsvinder. enzymer er en del af stort set alle processer i cellen. i mennesket bliver enzymer bl.a. brugt, når maden skal fordøjes, eller når en muskel skal bevæge sig. en særlig klasse af enzymer er de såkaldte proteaser (der igen kan inddeles i underklasser afhængig af strukturen af deres active site, altså det sted i proteasens rumlige struktur, hvor selve den kemiske re- aktion (spaltningen) foregår). proteaser er enzymer som nedbryder peptider og proteiner (der kaldes for enzymets substrater) ved at spalte peptidbindingen mellem bestemte aminosyrer i substratet. mange fordøjelsesenzymer, f.eks. chymotrypsin og trypsin, er proteaser. disse proteaser nedbryder således proteiner, der indtages med føden, til mindre peptider og aminosyrer, der så igen kan optages i tarmen. spaltningen af et dipeptid til to frie aminosyrer er illustreret i figuren nedenfor: h o h o protease h2n c c n c c + h2o oh r1 h r2 peptidbinding h h o o h2n c c + h2n c c oh oh r1 r2 - 106 - fordi et enzym er et protein, folder det på en bestemt måde, så det får en helt særlig tredimensionel form, der har stor betydning for dets funktion. når enzymet er foldet, har det en (eller flere) såkaldt substratbindingsregion, der som regel er formet som en kløft eller et hul på overfladen af enzymet. tæt på substratbindingregionen findes enzymets ”active site”, hvor selve katalysen (den kemiske re- aktion) foregår. det er kun nogle bestemte substrater (peptider), der passer til enzymets (proteasens) substratbindingsregion, og man kan, med en klassisk model, forestille sig enzymets og substratets in- teraktion ved at sammenligne enzymet med en lås, hvor substratet så vil være den nøgle, der lige præcis passer til låsen. hvis et molekyle ikke passer ind i et enzyms substratbindingsregion, vil der ikke ske nogen reaktion. ét bestemt enzym kan således kun katalysere én bestemt (eller meget få) reaktion(
  7. er)med et bestemt substrat. enzymer er med andre ord meget specifikke. man kender en lang række proteaser, der hver især er specifikke i forhold til hvor i et peptid spaltnin- gen af peptidbindingen vil foregå. proteasen chymotrypsin er således karakteriseret ved, at peptid- bindingen, der forekommer umiddelbart efter en aminosyre med en ”stor” sidekæde, vil blive spaltet, dvs. chymotrypsin vil spalte peptidbindingen mellem en aminosyre med en ”stor” sidekæde, såsom eksempelvis phenylalanin (phe), og den efterfølgende aminosyre. dette skyldes, at chymotrypsin har en kløft i overfladen (substratbindsregionen) tæt på det active site, hvor den ”store” sidegruppe kan fastholdes medens selve spaltningen af peptidbindingen foregår. på tilsvarende måde vil proteasen trypsin spalte peptidbindingen mellem en aminosyre med en posi- tivt ladet sidekæde, såsom eksempelvis lysin (lys), og den efterfølgende aminosyre. dette skyldes, at trypsin har en negativt ladet kløft i overfladen (substratbindsregionen) tæt på det active site, hvor den positivt ladede sidegruppe kan fastholdes medens selve spaltningen af peptidbindingen foregår. i proteasen elastase er kløften i overfladen blokeret, hvilket igen medfører, at elastase kun kan spalte peptidbindingen mellem aminosyrer med ”små” sidekæder, såsom eksempelvis glycin (gly) og alanin (ala), og den efterfølgende aminosyre. substratbindingsregionen for henholdsvis chymotrypsin, trypsin of elastase er illustreret i figuren nedenfor: for at lette forståelsen af, hvor i et peptid den protease-katalyserede spaltning foretages, er der vedtaget følgende nomenklatur: aminosyren umiddelbart før det sted, hvor spaltningen finder sted benævnes p1. den foregående aminosyre benævnes p2 osv. aminosyren umiddelbart efter det sted, hvor spaltningen finder sted benævnes p1’. den efterfølgende aminosyre benævnes p2’ osv. det område (substratbindingsregion) i proteasen, hvor p1 aminosyren bindes benævnes s1 og så frem- deles. dette er illustreret i figuren nedenfor. - 107 - det vil i langt de fleste tilfælde være strukturen af p1 aminosyren, der er afgørende for om proteasen vil være i stand til at katalysere spaltningen af et givet peptid. som nævnt ovenfor vil proteasen chy- motrypsin kun katalysere spaltningen af et peptid, hvor p1 aminosyren har en ”stor” sidekæde (såsom eksempelvis phenylalanin (phe)), og proteasen trypsin vil kun katalysere spaltningen af et peptid, hvor p1 aminosyren har en positivt ladet sidekæde (såsom eksempelvis lysin (lys)). hvorvidt de øvri- ge aminosyrer i peptidet (dvs. p2, p3, p1’, p2’ osv.) ”matcher” de tilsvarende substratbindingsregioner i proteasen (dvs. s2, s3, s1’, s2’ osv.) kan have nogen betydning for, hvor godt substratet bindes til pro- teasen, og dermed, hvor hurtigt og effektivt den protease-katalyserede spaltning vil foregå. det er dog, som nævnt ovenfor, i langt de fleste tilfælde p 1-s1 interaktionen (dvs. hvor godt p1 aminosyren ”passer ind” i proteasens s1 substratbindingregion), der er afgørende for, hvor hurtigt og effektivt den protease-katalyserede spaltning vil foregå. 1.4 inhibitorer en (enzym)inhibitor er et molekyle, der binder til enzymet og forringer dets aktivitet. der findes flere forskellige typer inhibitorer, der virker på forskellig måde. i det følgende vil der alene omtales såkald- te ”kompetitive inhibitorer”. en kompetitiv inhibitor vil, på samme måde som et substrat, passe ind i enzymets substratbindingsregion, og vil således konkurrere om enzymets substratbindingsregion med substratet; jo bedre inhibitoren passer ind i enzymets substratbindingsregion, jo mere effektivt vil det være i stand til at udkonkurrere substratet, og jo mere effektiv vil inhiberingen af enzymet være. en inhibitor er designet (enten i laboratoriet eller fra naturens hånd) på en sådan måde, at den passer ind i enzymets substratbindingsregion, men uden at enzymet er i stand til at spalte inhibitoren. en in- hibitor vil således være ”låst fast” i enzymets substratbindingsregion og blokere for substratets bin- ding i substratbindingsregion og dermed forhindre enzymet i at spalte substratet. inhibering af et enzym er illustreret skematisk i figuren nedenfor. i den øverste del af figuren er vist et enzym og et substrat, der passer ind i enzymets substratbindingsregion, og hvor enzymet derfor er i stand til at katalysere den kemiske reaktion (for eksempel spaltningen af et givet peptid til to mindre peptider). i den nederste del af figuren er det samme enzym vist med en inhibitor, der ligeledes passer ind i enzymets substratbindingsregion, dvs. inhibitoren blokerer således for substratet. - 108 - som det forstås, er det på den ene side vigtigt, at inhibitoren bindes effektivt i enzymets substratbin- dingsregion, medens det på den anden side også er afgørende, at inhibitoren ikke spaltes og dermed igen forlader enzymets substratbindingsregion. ved design af proteaseinhibitorer er det således vigtigt, at inhibitoren ligner substratbindingsregionen så meget som muligt, det vil navnlig sige at s1-p1 interaktionen (på samme måde som for et substrat) er effektiv. der findes flere forskellige måder at sikre sig, at proteaseinhibitoren ikke spaltes. èn ofte benyttet stra- tegi er at fremstille et peptid med eksempelvis strukturen p3-p2-p1, dvs. hvor den aminosyre (p1), der er vigtigst for binding til proteasens substratbindingsregion, er den c-terminale aminosyre, men hvor den c-terminale carboxylsyregruppe er blevet modificeret. såfremt carboxylsyregruppen modificeres på passende vis kan man sikre sig, at den modificerede gruppe reagerer med proteasens active site og således bindes kemisk til proteasen. eksempler på sådanne inhibitorer er talrige, og den videnskabelige artikel af tomkinson et al. (bilag m – kjj-05) angiver således chymotrypsininhibitorer med den generelle struktur arg-leu-phe-x, hvor en carboxylsyregruppe (x=
  8. oh)erstattes med et aldehyd, et amid, et imidate eller en semicarbazon. det bemærkes, at inhibitorens p1 aminosyre er phenylalanin (phe), der som nævnt ovenfor passer til chymotrypsins s1 substratbindingsregion og dermed sørger for, at inhibitoren overhovedet genkendes af chymotrypsin. det bemærkes endvidere, at carboxylsyregruppen i den c-terminale phe er modifi- ceret således, at inhibitoren vil reagere med chymotrypsins active site og dermed bindes kemisk til chymotrypsin. hvor effektivt en given inhibitor er i stand til at inhibere et givent enzym udtrykkes ofte ved den så- kaldte inhiberingskonstant (ki). inhiberingskonstanten angiver den mængde (koncentration) af inhibi- tor, der skal til for at reducere enzymets aktivitet med 50%. det bemærkes, at jo lavere k i en given in- hibitor har, des mere effektiv (potent) er inhibitoren. for at en inhibitor kan anvendes som lægemiddel, er det ofte nødvendigt, at inhibitoren udviser høj selektivitet, dvs. at inhibitoren, udover effektivt at inhibere det ønskede enzym, kun i ringe grad eller slet ikke inhiberer andre enzymer, idet inhibering af andre enzymer, der har betydning for kroppens funktion, potentielt vil kunne give anledning til utilsigtede bivirkninger. - 109 - det er desuden et meget vigtigt aspekt ved inhibitoren for at komme i betragtning som lægemiddel kandidat, at den kan formuleres på en passende måde i et farmaceutisk præparat, have egnede farma- kokinetiske karakteristika, herunder være stabil (med en rimelig halveringstid), kunne optages i cellen (biotilgængelighed) og ikke være giftig eller have utilsigtede bivirkninger, herunder ikke indeholde uhensigtsmæssigt reaktive grupper eller være non-selektiv. en proteaseinhibitor kan overordnet set beskrives ved følgende strukturelle og funktionelle elemen- ter/grupper: en "warhead"-gruppe, der binder til og blokerer det aktive site i proteasen. en aminosyresekvens (som giver bindingsspecificitet), der binder til eller i nærheden af det aktive site i proteasen. beskyttelses/blokeringsgrupper: yderligere grupper kan introduceres til molekylet for at opnå en sta- bil struktur (kemisk og biologisk) eller for at optimere fysisk-kemiske egenskaber (fx opløselighed). ovenstående elementer/grupper er beskrevet nærmere på side 11-12 i svarskriftet af 14. august 2017. 2 dansk patent nr. dk/ep 0 788 360 t5 (”ep 360”) 2.1 beskrivelse på side 1, linje 2-4 (opfindelsens/område) beskrives det helt generelt, at opfindelsen angår boronsyre- og boronsyreesterforbindelser samt deres fremstilling og anvendelse. på side 1, linje 7-18 (beskrivelse af kendt teknik) henvises til kendt litteratur, der beskriver fremstilling af boronsyre- og boronsyreesterforbindelser. det forklares, at sådanne forbindelser har vist sig at være inhibitorer for visse proteaser (benævnt proteolytiske enzymer i dette afsnit) samt at visse af disse for- bindelser har vist sig effektive til at inhibere væksten af kræftceller. det fremgår endvidere, at n- terminal peptidylboronsyreestere og syreforbindelser såvel som deres evne som inhibitorer var kendt i 1995. i den forbindelse henviser ep 360 bl.a. til wo 91/13904 (“wo 904”). på side 1, linje 19-26 omtales 20s proteasomet, og dets struktur samt betydning for cellens nedbryd- ning (spaltning) af proteiner diskuteres. i de efterfølgende afsnit beskrives baggrunden for opfindel- sen nærmere, ligesom der henvises til en lang række videnskabelige publikationer, der beskriver for- skellige inhibitorer af 20s proteasomet. under ”resume af opfindelsen”, side 2, linje 39 og frem, beskrives en række såkaldte udførelsesformer. under overskriften ”beskrivelse af foretrukne udførelsesformer”, der strækker sig fra side 4 til side 20, be- skrives forskellige boronsyre- og boronsyreesterforbindelser. rent indledningsvist beskrives disse med henvisning til den generelle formel 1a: - 110 - herefter defineres de enkelte grupper p, r, b1, r1, x1, r2, x2, r3, z1 og z2 og a. det bemærkes, at formel 1a ikke er begrænset til peptidinhibitorer, men såfremt de enkelte grupper i formal 1a vælges således, at der rent faktisk er tale om et peptid, da angiver formel 1a peptidinhibitorer, der enten er di- tri- eller tetrapeptider afhængig af om a vælges til at være 0, 1 eller 2. i resten af afsnittet (frem til side 20) anføres forskellige definitioner af forskellige begreber, og fore- trukne valg af ovennævnte grupper beskrives. det bemærkes, at n-(2-pyrazinyl)carbonyl-l- phenylalanin-l-leucin boronsyre (bortezomib) er nævnt på side 13, linje 24, som en egnet protea- sominhibitor. fra side 20 til 25 beskrives inhibitorernes forskellige medicinske anvendelser, primært indenfor for- skellige typer af kræftbehandling. eksempel 1 til 17 beskriver den kemiske syntese af en række inhibitorer. eksempel 18 til og med 23 vedrører forsøg med inhibitorerne.de eksperimentelle data diskuteres yderligere under punkt 2.3 nedenfor. fra side 64 til 67 er patentkravene angivet. 2.2 patentkrav krav 1 angår forbindelser, samt farmaceutisk acceptable salte deraf, der er beskrevet med henvisning til den generelle formel 1a: "1.forbindelse med formlen:
(1a)eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, hvor p is r7-c(o)-, r7-nh-c(o)-, r7-o-c(o)- eller r7-so2, hvor r7 er heteroaryl; eller når p er r7-c(o), kan r7 også være n-morpholinyl; b1 er ved hver forekomst uafhængigt enten n eller ch; x1, er ved hver forekomst uafhængigt enten -c(o)-nh-. -ch2-nh-, -ch(
  1. oh)- ch2-, -ch(oh)-ch(oh)-, -ch (oh)-ch2-nh-, -ch=ch-, c(o)-ch2-, so2-nh- , -so2-ch2- eller -ch(oh)-ch2-c(o)-nh-, forudsat at når b1 er n, så er x1 for- bundet til b1 er -c(o)-nh-; x2 er enten -c(o)-nh-, -ch(oh)-ch2-, -ch(oh)-ch(oh)-, -c(o)-ch2-, so2 - nh-, -so2-ch2- eller-ch (oh)-ch2-c(o)-nh-, r er hydrogen eller alkyl, eller r danner sammen med den hosliggende r1 eller, når a er nul, danner sammen med den hosliggende r2 et nitrogenholdigt mo-no, bi- eller tri- cyklisk mættet eller delvist mættet ringsystem med 4-14 ringatomer, der eventuelt kan være substitueret med en eller to keto, hydroxy, alkyl, aryl, aralkyl, alkoxy eller aryloxy; - 111 - r1 er ved hver forekomst uafhængigt enten hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, en 5-10 led- det mættet, delvist mættet eller aromatisk heterocyclisk gruppe eller -ch2-r5, hvor ring- delen af enhver af denne aryl, aralkyl, alkaryl eller heterocykliske gruppe eventuelt kan være substitueret; r2 er enten hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, en 5-10 leddet mættet, delvist mættet eller aromatisk heterocyclisk gruppe eller -ch2-r5, hvor ringdelen af enhver af denne aryl, aralkyl, alkaryl eller heterocykliske gruppe eventuelt kan være substitueret; r3 er enten hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, en 5-10 leddet mættet, delvist mættet eller aromatisk heterocyclisk gruppe eller -ch2-r5, hvor ringdelen af enhver af denne aryl, aralkyl, alkaryl eller heterocykliske gruppe eventuelt kan være substitueret; r5 er ved hver forekomst enten aryl, aralkyl, alkaryl, cycloalkyl, en 5-10 leddet mættet, delvist umættet eller aromatisk heterocyklisk gruppe eller -w-r6, hvor w er en chalcogen og r6 er alkyl, hvor ring-delen af enhver af denne aryl, aralkyl, alkaryl, eller den hetero- cykliske gruppe eventuelt kan være substitueret; z1 og z2 er uafhængigt af hinanden enten alkyl, hydroxy, alkoxy eller aryloxy, eller z1 og z2 danner sammen en del afledt af en dihydroxyforbindelse med mindst to hydro- xygrupper adskilt af mindst to forbindende atomer i en kæde eller ring, hvilken kæde eller ring omfatter carbonatomer og eventuelt et heteroatom eller heteroatomer, det kan være n, s eller o; og a is 0, 1 or 2.” (hvor valgene, som fører til bortezomib, er markeret med fed) i krav 1 defineres de enkelte grupper p, r, b1, r1, x1, r2, x2, r3, z1 og z2 og a, som anført ovenfor. formel 1a omfatter både di-, tri- og tetrapeptider afhængig af om a vælges til at være 0, 1 eller 2. i kravene 2 til 21 anføres stadig snævrere definitioner af de i formel 1a anførte grupper p, r, b 1, r1, x1, r2, x2, r3, z1 og z2 og a. krav 22 angår ni specifikke boronsyreforbindelser, herunder n-(2-pyrazinyl)carbonyl-l-phenylalanin- l-leucin boronsyre (bortezomib), samt deres farmaceutisk acceptable salte. krav 23 er helt specifikt rettet mod n-(2-pyrazinyl)carbonyl-l-phenylalanin-l-leucin boronsyre (bortezomib) samt dets farmaceutisk acceptable salte. krav 24 angår et farmaceutisk præparat, der, udover at indeholde en af de i krav 1 til 23 definerede boronsyre- eller boronsyreesterforbindelser, også indeholder et farmaceutisk acceptabelt bæremiddel eller fortyndingsmiddel. krav 25 angår et farmaceutisk præparat som defineret i krav 24, hvor boronsyre- eller boronsyreester- forbindelsen er til stede i en mængde, der kan inhibere proteasomfunktionen hos et pattedyr. krav 26 angår anvendelsen af en af de i krav 1 til 23 definerede boronsyre- eller boronsyre- esterforbindelser til fremstilling af et farmaceutisk præparat til forskellige behandlinger, herunder in- hibering af vækst af kræftceller. - 112 - krav 27 henviser tilbage til krav 26 og anfører, at de behandlinger, der er nævnt i krav 26, er rettet mod personer, der er blevet diagnosticeret med, eller har risiko for at udvikle, en af følgende syg- domme: vævsfrastødning, organfrastødning, arthritis, infektion, dermatosis, inflammatorisk tarmsyg- dom, astma, osteoporosis, osteoarthritis og autonome sygdomme. 2.3 eksperimentelle data i ep 360 som nævnt ovenfor omfatter beskrivelsen for ep 360 en række forsøg, der har til hensigt at underbyg- ge virkningen af inhibitorerne, som er defineret ifølge patentkravene for ep 360. disse forsøg er som nævnt beskrevet i eksempel 18 til 23. jeg vil gennemgå resultaterne og deres be- tydning nedenfor. i eksempel 18 (kinetiske eksperimenter) er anført resultater for inhiberingen af 20s proteasomet med en række boronsyre- og boronsyreesterforbindelser, dog primært boronsyreforbindelser, og effektiviteten af inhiberingen er i tabel ii angivet ved deres ki værdi, det vil sige deres affinitet for 20s proteasomet. tabel ii viser data for inhibering af 20s proteasomet for 92 forbindelser (lavere ki indikerer bedre in- hibitor binding). samtlige undersøgte forbindelser har leucin (leu) i p1 positionen. ki værdien for bortezomib (der har det interne nummer mg-341) er på side 53 angivet til at være 0,6 nm. 28 forbin- delser er bedre end mg-341 (bortezomib). 16 af de 28 forbindelser, som er bedre end mg-341 (bortezomib), har ikke en heteroaryl- eller n- morpholincarbonyl-beskyttelsesgruppe og er dermed ikke omfattet af krav 1 ifølge ep 360. det vil si- ge, at over halvdelen af de forbindelser, som er bedre end bortezomib, ikke indeholder en heteroaryl- eller n-morpholincarbonyl-beskyttelsesgruppe. det skal også bemærkes, at der er testet en række øvrige inhibitorer, der er identiske med bortezomib, bortset fra, at den n-terminale beskyttelsesgruppe ikke er (2-pyrazin)carbonyl. disse forbindelser er mg-309, mg-336, mg-343, mg-350, mg-352, mg-353, mg-356, mg-358, mg-361 og mg 380. bortset fra mg-380, der har en ki værdi på 4.4 nm, har alle de øvrige bortezomib-lignende forbindelser ki værdier i området fra 0,14 til 0,82 nm, dvs. ki værdier af samme størrelsesorden som bortezomib. følgende fem forbindelser mg-350 (ki=0,14), mg-352 (ki=0,15), mg-353 (ki=0,15), mg-356 (ki=0,13), mg-358 (ki=0,17) har samme dipeptidsekvens som bortezomib (mg-341; ki=0,6), nemlig phe-leu, men en beskyttelsesgruppe, som ikke indeholder en heteroaryl eller n-morpholincarbonyl-gruppe. de er således ikke omfattet af krav 1 i ep 360. som det kan ses, er de fem forbindelser umiddelbart mere potente inhibitorer af 20s proteasomet end bortezomib med heteroaryl-beskyttelsesgruppen, (2-pyz)- c(o). mg-336 (ki=0,25) og mg-343 (ki=0,42), mg-361 (ki=0,41) og mg-380 (ki=4,4) har samme dipeptidse- kvens som bortezomib, men en anden heteroaryl-beskyttelsesgruppe. med undtagelse af mg-380 har disse ligeledes en højere affinitet for 20s proteasomet end mg-341 (bortezomib), men lidt lavere end de ovennævnte fem forbindelser (der som nævnt ikke er omfattet af krav 1 ifølge ep 360). de bedste resultater (ki mindre end 0,1) blev rapporteret for følgende forbindelser anført med den bedste først: mg-304 (ki=0,022), mg-329 (ki=0,03), mg-261 (ki=0,032), mg-262 (ki=0,035), mg-298 (ki=0,075) og mg-328 (ki=0,088). det er kun mg-298, som rent faktisk indeholder en heteroaryl- beskyttelsesgruppe og dermed er omfattet af definitionen i krav 1 ifølge ep 360. - 113 - tabel iii omfatter kun resultater for to peptidderivater (mg-105 og mg-274) afledt fra dipeptidet leu- leu angiveligt for at vise, at boronsyreforbindelser er mere potente i forhold til tilsvarende aldehyd- forbindelser. den n-terminale beskyttelsesgruppe er angivet til z (carbobenzyloxy), som ikke er en heteroaryl beskyttelsesgruppe. mg-274 (boronsyreforbindelsen) er således ikke omfattet af krav 1 ifølge ep 360. forsøget viser derfor ikke, at boronsyreforbindelserne ifølge opfindelsen generelt er bedre end tilsvarende aldehydforbin- delser. tabel iv viser i lighed med tabel ii affiniteten (
  2. ki)for 20s proteasomet, men disse værdier sammen- lignes nu med tilbøjeligheden til at hæmme en anden protease, cathepsin b. tabel iv anfører kun værdier for syv inhibitorer. det kan konstateres, at to aldehyder er medtaget, men at alle de bedste forbindelser i tabel ii ikke er medtaget. det er således kun mg-262, som er medtaget blandt de bedste forbindelser fra tabel ii. mg-262 udviser en høj selektivitet samt som nævnt en noget højere affinitet for 20s end mg-341 (bortezomib). blandt de syv inhibitorer i tabel iv skiller mg-341 (bortezomib) sig ikke ud med hensyn til højest se- lektivitet. mg-273 har rent faktisk både en bedre/lavere ki-værdi og en højere/bedre selektivitet (0,18:200.000 = 1:1.111.111 for mg-273 vs. 0,6:160.000 = 1:266.667 for bortezomib). tabel v viser selektiviteten for fem forbindelser nu mod tre proteaser. sammenlignet med forbindel- serne i tabel iv er mg-154, mg-191 og mg-273 udeladt, mens mg-267 er taget med. mg-273, som udviste den højeste selektivitet i det foregående selektivitetsforsøg illustreret i tabel iv er ikke medtaget i det udvidede selektivitetsforsøg illustreret i tabel v. heller ikke de bedste inhibitorer fra tabel ii er inkluderet i tabel v. mg-341 (bortezomib) skiller sig igen ikke ud med hensyn til selektivitet. mg-309 fremstår rent faktisk mere selektiv. mg-267 har en højere affinitet for 20s proteasomet men en lidt lavere selektivitet i for- hold til elastasen 0,1:150=1:1.500), men en temmelig høj selektivitet i forhold til cathepsin g (0,1:33.000= 1:330.000) og chymotrypsin (0,1:2.300=1:23.000). tabel vi viser data relateret til inhibering i celler og omfatter data for 47 forbindelser. udvalget af for- bindelser virker tilfældigt og mg-267, der var en af de mest lovende forbindelser ifølge table v, er for eksempel ikke omfattet. hvor mg-341 (bortezomib) har en ic50-værdi på 69 nm, har 5 andre inhibitorer ligeledes en ic50 værdi under 100 nm, to inhibitorer, mg-329 og mg-343, har endda en lavere ic50-værdi end mg-341. mg-341 udviser igen en god inhibitionsevne, men det samme gør fire andre inhibitorer. det kan konstateres, at mg-350, mg-352, mg-353, mg-356 og mg-358, der har samme dipeptidse- kvens som mg-341 (bortezomib), nemlig phe-leu, men en beskyttelsesgruppe forskellig fra heteroa- ryl- eller n- morpholincarbonyl-gruppe, ikke er medtaget i forsøget, som ligger til grund for resulta- terne i tabel vi, selvom disse forbindelser har en mere potent virkning end mg-341 (bortezomib) i ta- bel ii. ved at medtage disse forbindelser i forsøget kunne man have belyst om der var fordele ved be- skyttelsesgruppen ifølge ep 360 i forhold til den kendte teknik. forbindelserne mg-350, mg-352, mg- 353, mg-356 og mg-358 er som nævnt nedenfor under punkt 3.1 omfattet af wo 904, men ikke af ep 360. - 114 - tabel vii viser resultatet af in vivo forsøg på dth responset i mus og sammenligner tre forbindelser, herunder mg-341 (bortezomib). det er uklart, hvorfor andre forbindelser, der umiddelbart virker som bedre kandidater baseret på de forudgående forsøg, ikke er medtaget. på baggrund af tabel vi ville mg-328 (ic50-værdi på 69 nm i tabel vi), mg-329 (ic50-værdi på 48 nm i tabel
  3. vi)og mg-343 (ic50-værdi på 57 nm i tabel
  4. vi)have været mere oplagte bud til sammen- ligning med bortezomib, mg-341 (ic50-værdi på 69 nm i tabel vi). i stedet har man valgt mg-296 (ic50-værdi på 738 nm i tabel
  5. vi)og mg-309 (ic50-værdi på 250 nm i tabel
  6. vi)uden nærmere forkla- ring. de samme betragtninger gør sig gældende i forhol

🔗 Til officiel kilde

AI-forklaring ud fra den officielle lovtekst. Vejledende, erstatter ikke juridisk rådgivning.