← Lietuva

LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL AMINORŪGŠČIŲ IR OLAKVINDOKSO KIEKIO NUSTATYMO PAŠARUOSE TEC

LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL AMINORŪGŠČIŲ IR OLAKVINDOKSO KIEKIO NUSTATYMO PAŠARUOSE TECHNINIO REGLAMENTO 2000 m. lapkričio 30 d. Nr. 332 Vilnius Vadovaudamasis Pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952) bei atsižvelgdamas į Europos komisijos direktyvos 98/64/EC „ Dėl Bendrijos analizės metodų aminorūgščių, žalio aliejaus ir riebalų bei olakvindokso nustatymo pašaruose“ nuostatas: 1. Tvirtinu Aminorūgščių ir olakvindokso kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą (pridedama). 2. Nustatau, kad techninis reglamentas įsigalioja nuo 2001 m. sausio 1 d. ŽEMĖS ŪKIO Ministras Kęstutis Kristinaitis ______________ Patvirtinta Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2000 11 30 įsakymu Nr. 332 AMINORūGščIų IR OLAKVINDOKSO kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas Parengtas pagal 1998 m. rugsėjo 3 d. Europos Komisijos direktyvą 98/64/EC „Dėl Bendrijos analizės metodų aminorūgščių, žalio aliejaus ir riebalų bei olakvindokso nustatymo pašaruose“. I. Bendrosios nuostatos 1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Tačiau kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“.) 2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate. 3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija. 4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams: 4.1. skirtiems eksportuoti ne į Europos Sąjungos valstybes nares; 4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją. II. Sąvokos, terminai ir sutrumpinimai 5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos: laisvosios aminorūgštys – aminorūgštys, nesujungtos tarpusavyje arba su kitais junginiais, ekstrahuojamos iš mėginio su praskiesta druskos rūgštimi ir nustatomos pagal šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą; suminis aminorūgščių kiekis – laisvųjų aminorūgščių ir aminorūgščių, sujuntų peptidinėmis jungtimis, kiekis nustatomas pagal šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą; tuščiasis pašaras – pašaras be analitės. 6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai: alaninas – 2-aminopropano rūgštis, CH3CH(NH2)COOH; argininas – 2-amino-5-guanidinpentano rūgštis, H2NC(NH)NH(CH2)3CH(NH2)COOH; asparagino rūgštis – aminobutano dirūgštis, HOOCCH2CH(NH2)COOH; azoto dujos – N2; cistinas – 3,3-ditio-bis(2-aminopropano rūgštis), [SCH2CH(NH2)COOH]2; cisteinas – 2-amino-3-merkaptopropano rūgštis, HSCH2CH(NH2)COOH; cistino rūgštis – 2-amino-3-sulfopropano rūgštis, HO3SCH2CH(NH2)COOH; druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl; fenilalaninas – 2-amino-3-fenilpropano rūgštis, C6H5CH2CH(NH2)COOH; fenolis – benzenolis, C6H5OH; fosforo pentoksidas – difosforo pentoksidas, P2O5; glicinas – aminoetano rūgštis, H2NCH2COOH; glutamino rūgštis – 2-aminopentano dirūgštis, HOOCCH(NH2)CH2CH2COOH; histidinas – 2-amino-3-(1H-imidazolil-4-)-propano rūgštis, C6H9N3O2; izoleucinas – 2-amino-3-metilpentano rūgštis, CH3CH2CH(CH3)CH(NH2)COOH; leucinas – 2-amino-4-metilpentano rūgštis, (CH3)2CHCH2CH(NH2)COOH; lizinas – 2,6-diaminoheksano rūgštis, H2N(CH2)4CH(NH2)COOH; metanolis – CH3OH; metioninas – 2-amino-4-metiltiobutano rūgštis, CH3SCH2CH2CH(NH2)COOH; metionino sulfonas – CH3SO2CH2CH2CH(NH2)COOH; natrio chloridas – NaCl; natrio disulfitas – dinatrio pentaoksodisulfatas, Na2S2O5; natrio hidroksidas – NaOH; ninhidrinas – 2,2-dihidroksi-1,3-indandionas, C6H4 (CO)2C(OH)2; norleucinas – 2-aminoheksano rūgštis, H(CH2)4CH(NH2)COOH; 1-oktanolis – H(CH2)8OH; olakvindoksas – 2-[N-2'-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilkvinoksalino-N1, N4-dioksidas; ornitinas – 2,5-diaminopentano rūgštis, H2N(CH2)3CH(NH2)COOH; perskruzdžių rūgštis – peroksimetano rūgštis, HC(O)OOH; petroleteris – lenvoji benzino frakcija, virimo temperatūra 40 oC – 60 oC; prolinas – 2-pirolidinkarboksirūgštis, NC4H8COOH; serinas – 2-amino-3-hidroksipropano rūgštis, HOCH2CH(NH2)COOH; sieros rūgštis – divandenilio tetraoksosulfatas, H2SO4; skruzdžių rūgštis – metano rūgštis, HCOOH; sulfosalicilo rūgštis dihidratas – 2-hidroksi-5-sulfobenzenkarboksirūgštis dihidratas; HOC6H3(SO3H)COOH × 2H2O; 2,2‘-tiodietenolis – S(CH2CH2OH)2; tirozinas- 2-amino-3-(4-hidroksifenil)propano rūgštis, HOC6H4CH2CH(NH2)COOH; treoninas – 2-amino-3-hidroksibutano rūgštis, CH3CH(OH)CH(NH2)COOH; trinatrio citratas dihidratas – 2-hidroksi-1,2,3-propantrikarboksirūgšties trinatrio druska dihidratas, HOC(COONa)(CH2COONa)2× 2H2O; triptofanas – 2-amino-3-(3-indolil)propano rūgštis, NC8H6CH2CH(NH2)COOH; valinas – 2-amino-3-metilbutano rūgštis, (CH3)2CHCH(NH2)COOH; vandenilio peroksidas – divandenilio dioksidas, H2O2. 7. Metodų aprašymuose vartojamos santrumpos: a. p. – analiziškai grynas; c – medžiagos koncentracija; V/V -tūrių santykis; Mr – molekulinė masė; HPLC – didelio efektyvumo skysčių chromatografija. III. Mėginių paruošimas cheminei analizei 8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos: 8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms: 8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro įsakymu patvirtintus pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo metodus; 8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį. 8.2. Būtinos atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu: 8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reiktų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis; 8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be ženklaus mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnis pagal Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro įsakymu patvirtintą drėgnio nustatymo metodą. 8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga: 8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau: 8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip. Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys vėl išmaišomas; 8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip, mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %–12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte; 8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas; 8.3.1.4. kitų pašarų mėginiai, kurie negali būti paruošti vienu iš nurodytų būdų, turi būti paruošiami bet kokiu kitu būdu, garantuojančiu, kad cheminei analizei pasvertas mėginys yra homogeninis ir būdingas galutiniam mėginiui. 8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose. 8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose: 8.5.1. visi analitiniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas tuščiuoju bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas; 8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis; 8.5.3. atsižvelgiant į kontrolės laboratorijose esančią įrangą, cheminės analizės metoduose leidžiama naudoti tik specialius ar specifinio naudojimo reikalaujančius instrumentus ir prietaisus. Jie turi būti ypač švarūs, nustatant labai mažus medžiagų kiekius. 8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška: 8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje; 8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje prieš jo paruošimą. IV. Mėginių cheminė analizė 9. Aminorūgštys pašaruose nustatomos taikant šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą. Šis metodas netaikomas aminorūgščių druskų, D-, L-amoniorūgščių formų bei triptofano ir aminorūgščių hidroksianalogų matavimui. 10. Olakvindoksas pašaruose nustatomos taikant šio techninio reglamento 2 priede nurodytą metodą. Mažiausia nustatymo riba – 5 mg/kg. SUDERINTA SUDERINTA Nacionalinės veterinarijos laboratorijos direktorius Lietuvos gyvulininkystės instituto direktorius E. Blaževičius J. Jatkauskas 2000 m. lapkričio 20 d. 2000 m. lapkričio 23 d. ______________ 1 priedas Aminorūgščių nustatymas 1. Tikslas ir taikymo sritis Šiuo metodu, naudojant aminorūgščių analizatorių, nustatomas laisvųjų (sintetinių ir natūralių) ir suminis (sujungtų peptiduose ir laisvų) aminorūgščių kiekis pašaruose. Šis metodas tinkamas šioms aminorūgštims: cistinui (cisteinui), metioninui, lizinui, treoninui, alaninui, argininui, asparagino ir glutamino rūgštims, glicinui, histidinui, izoleucinui, leucinui, fenilalaninui, prolinui, serinui, tirozinui ir valinui nustatyti. Šis metodas neišskiria aminorūgščių druskų ir negali atskirti D-, L-aminorūgščių formų. Metodas netinka triptofano ir aminorūgščių hidroksianalogų kiekiams matuoti. 2. Metodo esmė: 2.1. laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta druskos rūgštimi. Kartu išekstrahuotos makromolekulės, turinčios azoto, nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant. Filtruoto tirpalo pH sureguliuojamas iki 2,20. Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai 570 nm srityje vykdant reakciją su ninhidrinu; 2.2. suminio aminorūgščių kiekio nustatymas pasirenkamas pagal tiriamas aminorūgštis. Cistinas (cisteinas) ir metioninas prieš hidrolizę turi būti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono. Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų mėginių hidrolizatuose. Visos kitos aminorūgštys, paminėtos 1 punkte, gali būti nustatomos arba oksiduotuose arba neoksiduotuose mėginiuose. Oksidacija atliekama perskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 oC temperatūroje. Oksidacijos reagento perteklius suskaidomas natrio disulfitu. Oksiduoti ar neoksiduoti mėginiai hidrolizuojami druskos rūgštimi (c = 6 mol/

  1. l)23 val. Hidrolizatų pH sureguliuojamas iki 2,20. Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai 570 nm srityje (prolinui 440
  2. nm)vykdant reakciją su ninhidrinu. 3. Reagentai: 3.1. turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba atitinkamos kokybės (elektroninis laidumas mažesnis nei 10 µS) vanduo; 3.2. vandenilio peroksidas, 30%; 3.3. skruzdžių rūgštis, 98%–100%; 3.4. fenolis; 3.5. natrio disulfitas; 3.6. natrio hidroksidas; 3.7. 5-sulfosalicilo rūgšties dihidratas; 3.8. druskos rūgštis, tankis apytikriai 1,18 g/ml; 3.9. trinatrio citratas dihidratas; 3.10. 2,2'-tiodietanolis (tiodiglikolis); 3.11. natrio chloridas; 3.12. ninhidrinas; 3.13. petrolio eteris, virimo temperatūros ribos 40ºC–60ºC; 3.14. norleucinas, arba kitas junginys, kurį galima naudoti kaip vidinį standartą; 3.15. azoto dujos (mažiau kaip 10 milijonųjų dalių deguonies); 3.16. 1-oktanolis; 3.17. aminorūgštys: 3.17.1. medžiagų, nurodytų 1 punkte, standartai – gryni junginiai, be kristalizacinio vandens, išdžiovinti vakuume virš P2O5 ar H2SO4 likus savaitei iki naudojimo; 3.17.2. cistino rūgštis; 3.17.3. metionino sulfonas; 3.18. natrio hidroksido tirpalas, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.6) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1litro; 3.19. natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.6) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1litro; 3.20. skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalas: 889 g skruzdžių rūgšties (3.3) sumaišoma su 111 g vandens ir pridedama 4,73 g fenolio (3.4); 3.21. hidrolizuojantis mišinys, HCl c = 6 mol /l su 1 g/l fenolio: 1 g fenolio (3.4) įdedamas į 492 ml HCl (3.8) ir praskiedžiamas vandeniu iki 1 litro; 3.22. ekstrahavimo mišinys, HCl c = 0,1 mol /l su 2 % tiodiglikolio: 8,2 ml HCl (3.8), praskiedžiama su maždaug 900 ml vandens, įpilama 20 ml tiodiglikolio (3.10), praskiedžiama vandeniu iki 1 litro (nemaišyti tiesiogiai 3.8 ir 3.10 punktuose nurodytų medžiagų); 3.23. 5-sulfosalicilo rūgštis, 6 %: 60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (3.7) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama vandeniu iki 1 litro; 3.24. oksiduojantis mišinys (perskruzdžių rūgštis ir fenolis): mažoje stiklinaitėje sumaišoma 0,5 ml vandenilio peroksido (3.2) ir 4,5 ml skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalo (3.20). Laikoma 1 valandą 20ºC–30ºC temperatūroje perskruzdžių rūgščiai susidaryti ir, prieš pridedant į mėginį, atšaldoma ledo-vandens vonioje (15 min). Siekiant išvengti reagentų sąlyčio su oda ir drabužiais, naudoti apsauginius rūbus; 3.25. citratinis buferinis tirpalas, Na+ c = 0,2 mol/l, pH 2,20: apytikriai 800 ml vandens ištirpinama 19,61 g natrio citrato (3.9), 5 ml tiodiglikolio (3.10), 1 g fenolio (3.4) ir 16,50 ml HCl (3.8). Praskiedžiama vandeniu iki 1 litro. pH sureguliuojamas iki 2,20; 3.26. eliuentiniai buferiniai tirpalai ruošiami pagal analizatoriaus instrukcijas (4.9); 3.27. ninhidrino reagentas ruošiamas pagal analizatoriaus instrukcijas (4.9); 3.28. standartiniai aminorūgščių tirpalai. Šie tirpalai turi būti saugomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje: 3.28.1. pradiniai standartiniai aminorūgščių (3.17.1) tirpalai c = 2,5 µmol/ml kiekvienos aminorūgšties druskos rūgštyje. Gali būti perkami; 3.28.2. pradinis standartinis cistino rūgšties ir metionino sulfono tirpalas, c = 1,25 µmol/ml: 0,2115 g cistino rūgšties (3.17.2) ir 0,2265 g metionino sulfono (3.17.3) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.25) 1 litro matavimo kolboje, iki žymės praskiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Saugoma žemesnėje nei 5ºC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių. Šis tirpalas nenaudojamas, jei pradiniame standartiniame tirpale (3.28.1) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono; 3.28.3. pradinis vidinio standarto tirpalas, pvz.: norleucino, c = 20 µmol/ml: 0,6560 g norleucino (3.14) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.25) 250 ml matavimo kolboje, iki žymės praskiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Saugoma žemesnėje nei 5ºC temperatūroje ne ilgiau kaip 6 mėnesius; 3.28.4. standartinių aminorūgščių, naudojamų hidrolizatų matavimui, kalibracinis tirpalas, cistino rūgšties ir metionino sulfono c = 5 nmol/50µl ir kitų aminorūgščių c = 10 nmol/50µl: 2,2 g natrio chlorido (3.11) ištirpinama 30 ml citratinio buferinio tirpalo (3.25) 100 ml stiklinėje. Pridedama 4,00 ml pradinio standartinio amino rūgščių tirpalo (3.28.1), 4,00 ml pradinio standartinio cistino rūgšties ir metionino sulfono tirpalo (3.28.2) ir prireikus 0,50 ml pradinio vidinio standarto tirpalo (3.28.3). Sureguliuojamas pH iki 2,20 su natrio hidroksidu (3.19). Kiekybiškai perpilama į 50 ml matavimo kolbutę, praskiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (3.25) ir sumaišoma. Saugoma žemesnėje nei 5ºC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius (žr. 1 pastabą); 3.28.5. hidrolizatams, paruoštiems pagal 5.3.3.1 papunktį, ir ekstraktams (5.2) matavimo kalibracinis tirpalas ruošiamas pagal 3.28.4, nenaudojant natrio chlorido. Saugoma žemesnėje nei 5ºC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius. 4. Prietaisai: 4.1. 100 arba 250 ml apvaliadugnė kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi; 4.2. 100 ml borosilikatinio stiklo butelis užsukamu kamšteliu su guminiu ar tefloniniu tarpikliu (pvz.: Duran, Schott), tinkantis naudoti krosnyje; 4.3. krosnis su aktyviąja ventiliacija ir termoreguliatoriumi, kurio tikslumas geresnis nei ± 2ºC; 4.4. pH-metras (trys skaičiai po kablelio); 4.5. membraninis filtras (0,2 µm); 4.6. centrifuga; 4.7. sukamasis vakuuminis garintuvas; 4.8. mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė; 4.9. aminorūgščių analizatorius arba aukšto slėgio skysčių chromatografas su jonų mainų kolonėle, įrengimu ninhidrino reagento paruošimui ir saugojimui, reaktoriumi ir fotometriniu detektoriumi. Kolonėlė užpildyta sulfonuoto polistireno dervomis, galinčiomis atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų ninhidrinu nuspalvinamų junginių. Tekėjimą buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemoje sąlygoja siurbliai, kurių darbo stabilumas ± 0,5 % tiek kalibravimo, tiek ir mėginio matavimo metu. Kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima matuoti hidrolizatus, kuriuose natrio jonų koncentracija 0,8 mol /l ir kuriuose po oksidacijos yra likęs skruzdžių rūgšties perteklius. Kitais analizatoriais blogai atskiriamos tam tikros aminorūgštys, jei hidrolizatuose yra skruzdžių rūgšties likutis ir (
  3. ar)didelė natrio jonų koncentracija. Tokiu atveju po hidrolizės, prieš pH sureguliavimą, rūgšties tūris sumažinamas apytiksliai iki 5 ml nugarinant vakuume ne aukštesnėje nei 40ºC temperatūroje. 5. Matavimas: 5.1. Mėginio paruošimas Mėginys yra sumalamas, kad išbyrėtų per 0,5 mm sietelį. Labai drėgni mėginiai prieš sumalant turi būti arba išdžiovinami iki orasausės medžiagos neviršijant 50ºC temperatūros, arba džiovinami šaldant. Jei mėginiuose yra daug riebalų, jie turi būti pašalinti ekstrahuojant, petrolio eteriu (3.13) prieš sumalant mėginį. 5.2. Laisvųjų aminorūgščių kiekio nustatymas pašaruose ir premiksuose Į konusinę kolbą 0,2 mg tikslumu pasveriamas tinkamas paruošto mėginio (5.1) kiekis (1 g–5
  4. g)ir įpilama 100,0 ml ekstrahavimo mišinio (3.22). Mišinys maišomas 60 min su mechanine purtykle ar magnetine maišykle (4.8). Leidžiama nusistovėti nuosėdoms 10,0 ml supernatanto tirpalo pipete perpilama į 100 ml stiklinę. Maišant įpilama 5,0 ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (3.23) ir maišoma magnetine maišykle 5 minutes. Siekiant pašalinti nuosėdas, supernatantas filtruojamas arba centrifuguojamas. 10,0 ml gauto tirpalo įpilama į 100 ml stiklinę, natrio hidroksido tirpalu (3.19) sureguliuojamas pH iki 2,20 ir naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.25) kiekybiškai perpilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą iki žymės praskiedžiant citratiniu buferiniu tirpalu (3.25). Jei bus naudojamas vidinis standartas, pridedama 1,00 ml vidinio standarto (3.28.3) kiekvienam 100 ml galutinio tirpalo ir praskiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.25). Pereinama prie chromatografijos (5.4). Jei ekstraktai nebus matuojami tą pačią dieną, jie turi būti saugomi žemesnėje nei 5ºC temperatūroje. 5.3. Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas: 5.3.1. Oksidacija 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1 g-1 g paruošto mėginio (5.1) į: - 100 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) „atvirajai“ hidrolizei (5.3.2.3); - 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1), jei reikalinga maža natrio koncentracija (5.3.3.1); - 100 ml butelį užsukamu kamšteliu (4.2) „uždarajai“ hidrolizei (5.3.2.4). Pasvertoje mėginio dalyje azoto kiekis turi būti apie 10 mg, o laisvojo vandens kiekis neviršyti 100 mg. Kolba (butelis) įnardinama į ledo-vandens vonią ir atšaldoma iki 0ºC, įpilama 5 ml oksiduojančio tirpalo (3.24) ir pamaišoma stikline mentele lenktu galiuku. Kolba (butelis) kartu su mentele uždengiama orui nepralaidžia plėvele. Ledo-vandens vonia su uždarytu indu patalpinama į šaldytuvą 0ºC temperatūroje. Po 16 valandų išėmus iš šaldytuvo, oksiduojančio reagento perteklius suskaidomas pridedant 0,84 g natrio disulfito (3.5). Toliau dirbama pagal 5.3.2.1 punktą. 5.3.2. Hidrolizė 5.3.2.1. Oksiduoto mėginio hidrolizė Į oksiduotą mėginį, paruoštą pagal 5.3.1, įpilama 25 ml hidrolizuojančio mišinio (3.21), stengiantis nuplauti prie indo sienelių ir mentelės prilipusius mėginio likučius. Atsižvelgiant į hidrolizės būdą dirbama pagal 5.3.2.3 ar 5.3.2.4. 5.3.2.2. Neoksiduoto mėginio hidrolizė Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) ar į 100 ml butelį užsukamu kamšteliu (4.2) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1 g–1 g paruošto mėginio (5.1). Pasvertoje mėginio dalyje azoto turėtų būti apie 10 mg. Atsargiai įpilama hidrolizuojančio mišinio (3.21) ir sumaišoma su mėginiu. Toliau dirbama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4. 5.3.2.3. „Atviroji“ hidrolizė Įdedami 3 stikliniai rutuliukai į kolbą su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 ar 5.3.2.2, ir virinama 23 valandas. Pabaigus hidrolizę, kondesatoriaus vidus išplaunamas 5 ml citratinio buferinio tirpalo (3.25). Kolba atjungiama ir atšaldoma ledo vonioje. Toliau dirbama pagal 5.3.3. 5.3.2.4. „Uždaroji“ hidrolizė Butelis su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 ar 5.3.2.2, patalpinamas į krosnį (4.3), įkaitintą iki 110ºC. Siekiant apsisaugoti nuo slėgio padidėjimo (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir išvengti sprogimo, pirmąją hidrolizės valandą indas kamšteliu uždengiamas, bet neužsukamas. Po vienos valandos indas uždaromas kamšteliu ir paliekamas krosnyje 23 valandoms. Pabaigus hidrolizę, indas išimamas iš krosnies, atsargiai atsukamas kamštelis ir butelis įstatomas į ledo-vandens vonią. Atšaldoma. Atsižvelgiant į pH reguliavimo eigą (5.3.3), naudojantis citratiniu buferiniu tirpalu (3.25) butelio turinys kiekybiškai perkeliamas į 250 ml stiklinę ar 250 ml apvaliadugnę kolbą. Toliau dirbama pagal 5.3.3 punktą; 5.3.3. pH reguliavimas Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (4.9) toleranciją natriui, pH reguliavimas tęsiamas pagal 5.3.3.1 ar 5.3.3.2. 5.3.3.1. Chromatografinėms sistemoms (4.9), reikalaujančioms mažos natrio koncentracijos: Kai aminorūgščių analizatoriui reikalinga maža natrio koncentracija (kai rūgšties tūris buvo sumažintas), pageidautina naudoti pradinį vidinio standarto tirpalą (3.28.3), 2,00 ml įpilant į hidrolizatą prieš nugarinimą. Į hidrolizatus, gautus pagal 5.3.2.3 ar 5.3.2.4, įlašinami 2 lašai 1-oktanolio. Naudojantis sukamuoju vakuuminiu garintuvu, esant 40ºC, tūris sumažinamas iki 5 ml–10 ml. Jei atsitiktinai tūris sumažinamas mažiau nei iki 5 ml, hidrolizatas išpilamas, o matavimas atliekamas pakartotinai. Natrio hidroksido tirpalu (3.19) sureguliuojamas pH iki 2,20 ir darbai tęsiami pagal 5.3.4. 5.3.3.2. Visiems kitiems aminorūgščių analizatoriams (4.9): Hidrolizatai, gauti pagal 5.3.2.3 ar 5.3.2.4, iš dalies neutralizuojami, atsargiai pilant ir maišant 17 ml natrio hidroksido tirpalo (3.18). Įsitikinama, kad temperatūra yra žemesnė nei 40ºC. Kambario temperatūroje natrio hiroksido tirpalu (3.18) ir pabaigoje natrio hidroksido tirpalu (3.19) sureguliuojamas pH iki 2,20. Toliau dirbama pagal 5.3.4. 5.3.4. Mėginio hidrolizatas chromatografijai Sureguliavus pH (5.3.3.1 ar 5.3.3.2) hidrolizatas citratinio buferinio tirpalo (3.25) pagalba kiekybiškai perpilamas į 200 ml matavimo kolbą, iki žymės praskiedžiant buferiniu tirpalu (3.25). Jei vidinis standartas (3.28.3) dar nebuvo naudotas, įpilama jo 2,00 ml ir iki žymės praskiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu (3.25). Gerai išmaišoma. Chromatografuojama (5.4). Jei mėginio tirpalai nebus matuojami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5ºC temperatūroje. 5.4. Chromatografija: Prieš chromatografavimą ekstraktas (5.2) ar hidrolizatas (5.3.4) palaikomi kambario temperatūroje. Mišinys suplakamas ir filtruojamas per 0,2 µm poringumo membraninį filtrą (4.5). Galutinis skaidrus tirpalas chromatografuojamas panaudojant aminorūgščių analizatorių (4.9). Injekcija gali būti atliekama rankiniu būdu ir automatiškai. Svarbu, kad į kolonėlę būtų įvedamas toks pat tirpalo kiekis ±0,5 % matuojant tiek standartus, tiek mėginius, išskyrus tuos atvejus, kai naudojamas vidinis standartas, ir kad natrio ir aminorūgščių kiekių santykis standarte ir mėginio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis. Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analitinės sistemos. Standartas ar mėginys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (3.25) siekiant, kad standarto smailės plotas būtų 30–200 % mėginio aminorūgšties smailės ploto. Aminorūgščių chromatografija šiek tiek skiriasi naudojant skirtingus analizatoriaus ir dervų tipus. Pasirinkta sistema turi atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų ninhidrinu nuspalvinamų junginių. Chromatografinė sistema turi duoti linijinį atsaką į aminorūgščių, pridedamų į kolonėlę, kiekio pasikeitimus. Kai matuojami ekvimoliariniai tirpalai (nustatomų aminorūgščių), chromatografuojant naudojamas smailės pagrindo pločio ir aukščio santykis. Šį ekvimoliarinį tirpalą turi sudaryti mažiausiai 30 % kiekvienos su mėginiu pridedamos aminorūgšties maksimalaus kiekio, kurį galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizavimo sistema (4.9). Atskiriant treoniną ir seriną, smailės pagrindo pločio ir aukščio santykis chromatogramoje mažesnės iš persidengiančių aminorūgščių smailės neturi viršyti 2: 10 (jei matuojamas tik cistinas (cisteinas), metioninas, treoninas ir lizinas, nepakankamas skyrimas nuo besišliejančios smailės nepalankiai veikia matavimą). Visoms kitoms aminorūgštims skyrimas turi būti geresnis nei 1:10. Chromatografinė sistema turi garantuoti, kad lizinas būtų atskirtas nuo „lizino artifaktų“ ir ornitino. 6. Rezultatų apskaičiavimas: 6.1. Matuojamas mėginio ir standarto kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir skaičiuojamas kiekis gramais kilograme mėginio: jei buvo naudotas vidinis standartas, dauginama iš čia: A – hidrolizato ar ekstrakto smailės plotas; B – kalibracinio standartinio tirpalo smailės plotas; C – vidinio standarto hidrolizate ar ekstrakte smailės plotas; D – vidinio standarto kalibraciniame standartiniame tirpale smailės plotas; Mr – matuojamos aminorūgšties molekulinė masė; E – standarto koncentracija mikromoliais mililitre; W – mėginio svoris gramais (koreguotas iki pradinio svorio, jei mėginys buvo džiovintas ar iš jo pašalinti riebalai); F – suminis hidrolizato tūris (5.3.4) ar apskaičiuotas suminis praskiesto ekstrakto tūris (6.1) mililitrais. 6.2. Oksiduotų mėginių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis, bet apskaičiuojami kaip cistinas Mr(C6H12N2O4S2) = 240,30 naudojant Mr = 120,15 (0,5 x 240,30). Oksiduotų mėginių hidrolizatuose metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas, bet apskaičiuojamas kaip metioninas naudojant metionino Mr = 149,21. Pridėtas laisvas metioninas po ekstrakcijos nustatomas kaip metioninas, apskaičiavimui naudojant metionino Mr. 6.3. Suminis praskiesto ekstrakto tūris (F) nustatant laisvąsias aminorūgštis (5.2) apskaičiuojamas taip: čia V – galutinis ekstrakto tūris. 7. Metodo įvertinimas: 7.1. Šis metodas buvo patikrintas ir palygintas tarptautiniu lygiu 1990 metais panaudojant keturis skirtingus pašarus (pašarų mišinys kiaulėms, kombinuotasis lesalas broileriams, baltyminis papildas, premiksas). Matematinio vidurkio ir standartinio nuokrypio rezultatai, atmetus riktus, pateikiami lentelėje: Vidurkiai (g/
  5. kg)Pavyzdinė medžiaga Aminorūgštys Treoninas Cistinas (cisteinas) Metioninas Lizinas Pašarų mišinys kiaulėms 6,94 3,01 3,27 9,55 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Kombinuotasis lesalas broileriams 9,31 3,92 5,08 13,93 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Baltyminis papildas 22,32 5,06 12,01 47,74 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Premiksas 58,42 - 90,21 98,03 n = 16 n = 16 n = 16 n – dalyvaujančių laboratorijų skaičius 7.2. Pakartojamumas Pakartojamumas, išreikštas kaip „laboratorijų vidaus standartinis nuokrypis“ ir nurodytas palyginimuose, pateikiamas lentelėse. Laboratorijų vidaus standartinis nuokrypis (St), g/kg Pavyzdinė medžiaga Aminorūgštys Treoninas Cistinas (cisteinas) Metioninas Lizinas Pašarų mišinys kiaulėms 0,13 0,10 0,11 0,26 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Kombinuotasis lesalas broileriams 0,20 0,11 0,16 0,28 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Baltyminis papildas 0,48 0,13 0,27 0,99 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Premiksas 1,30 - 2,19 2,06 n = 16 n = 16 n = 16 n – dalyvaujančių laboratorijų skaičius Laboratorijų vidaus standartinio nuokrypio (St) variacijos koeficientas (%) Pavyzdinė medžiaga Aminorūgštys Treoninas Cistinas (cisteinas) Metioninas Lizinas Pašarų mišinys kiaulėms 1,9 3,3 3,4 2,8 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Kombinuotasis lesalas broileriams 2,1 2,8 3,1 2,1 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Baltyminis papildas 2,7 2,6 2,2 2,4 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Premiksas 2,2 - 2,4 2,1 n = 16 n = 16 n = 16 n – dalyvaujančių laboratorijų skaičius 7.3. Atitiktis Aukščiau minėtų palyginimų standartinio nuokrypio tarp laboratorijų rezultatai pateikiami lentelėse. Tarplaboratorinis standartinis nuokrypis (St), g/kg Pavyzdinė medžiaga Aminorūgštys Treoninas Cistinas (cisteinas) Metioninas Lizinas Pašarų mišinys kiaulėms 0,28 0,30 0,23 0,30 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Kombinuotasis lesalas broileriams 0,48 0,34 0,55 0,75 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Baltyminis papildas 0,85 0,62 1,57 1,24 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Premiksas 2,49 - 6,20 6,62 n = 16 n = 16 n = 16 n – dalyvaujančių laboratorijų skaičius Tarplaboratorinio standartinio nuokrypio (St) variacijos koeficientas (%) Pavyzdinė medžiaga Aminorūgštys Treoninas Cistinas (cisteinas) Metioninas Lizinas Pašarų mišinys kiaulėms 1,9 3,3 3,4 2,8 n = 15 n = 17 n = 17 n = 13 Kombinuotasis lesalas broileriams 2,1 2,8 3,1 2,1 n = 16 n = 18 n = 18 n = 16 Baltyminis papildas 2,7 2,6 2,2 2,4 n = 16 n = 17 n = 17 n = 15 Premiksas 2,2 - 2,4 2,1 n = 16 n = 16 n = 16 n – dalyvaujančių laboratorijų skaičius 8. Pavyzdinių medžiagų naudojimas Teisingas šio metodo pritaikymas bus patvirtintas atlikus pakartotinius sertifikuotos pavyzdinės medžiagos matavimus. Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotais aminorūgščių kalibraciniais tirpalais. PASTABOS: 1. Dėl aminorūgščių analizatorių skirtumo galutinių standartinių aminorūgščių kalibracinių tirpalų (žr. 3.28.4 ir 3.28.5) ir hidrolizatų (žr. 5.3.4) koncentracijos turėtų būti ruošiamos pagal analizatorių gamintojų instrukcijas. 2. Prietaiso linijinio atsako diapazonas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims. 3. Siekiant, kad smailės plotas būtų diapazono viduryje, standartinis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu. 4. Jei hidrolizatų matavimui buvo naudota didelio efektyvumo skysčių chromatografijos įranga, eksperimentui palankiausios sąlygos turi būti sudaromos pagal gamintojų rekomendacijas. 5. Šiuo metodu tiriant pašarus, kuriuose yra daugiau nei 1 % chloridų (pašarų papildai), yra galimas nepakankamas metionino įvertinimas, todėl turi būti atliktas specialus apdorojimas. SUDERINTA SUDERINTA Nacionalinės veterinarijos laboratorijos direktorius Lietuvos gyvulininkystės instituto direktorius E. Blaževičius J. Jatkauskas 2000 m. lapkričio 20 d. 2000 m. lapkričio 23 d. ______________ 2 priedas OLAKVINDOKSO (2-[N-2'-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilkvinoksalino-N1, N4-dioksido) nustatymas 1. Tikslas ir taikymo sritis Šiuo metodu nustatomas olakvindokso kiekis pašaruose. Mažiausia radimo riba yra 5 mg/kg. 2. Metodo esmė Mėginys ekstrahuojamas vandens-etanolio mišiniu. Olakvindokso kiekis nustatomas atvirkštinių fazių didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) su UV detektorium. 3. Reagentai: 3.1. metanolis; 3.2. metanolis, grynas HPLC; 3.3. vanduo, grynas HPLC; 3.4. HPLC judančioji fazė: vandens (3.3) ir metanolio (3.2) mišinys, 900: 100 (V/V); 3.5. standartinė medžiaga: grynas olakvindoksas, (2-[N-2'-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilkvinoksalino-N1, N4-dioksidas), E 851: 3.5.1. olakvindokso pradinis standartinis tirpalas, 250 µg/ml. Į 200 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriama 50 mg olakvindokso (3.5) ir pripilama apie 190 ml vandens. Kolba 20 min įdedama į ultragarso vonią (4.1). Po apdorojimo ultragarsu tirpalas atvėsinamas iki kambario temperatūros, iki žymės skiedžiamas vandeniu ir išmaišomas. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma šaldytuve. Šis tirpalas gali būti naudojamas vieną mėnesį; 3.5.2. olakvindokso tarpinis standartinis tirpalas, 25 µg/ml. 10,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.5.1) praskiedžiama judančiąja faze (3.4) iki žymės 100 ml matavimo kolboje ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma šaldytuve. Šis tirpalas tinkamas naudoti vieną dieną; 3.5.3. kalibraciniai tirpalai: Į 50 ml matavimo kolbutes įpilama 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml, 10,0 ml, 15,0 ml ir 20,0 ml tarpinio standartinio tirpalo (3.5.2). Praskiedžiama iki žymės judančiąja faze (3.4) ir išmaišoma. Kolba apvyniojama aliuminio folija. Šiuose tirpaluose yra atitinkamai 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,5 µg/ml, 5,0 µg/ml, 7,5 µg/ml ir 10,0 µg/ml olakvindokso. Šie tirpalai tinkami naudoti vieną dieną. 4. Prietaisai: 4.1. ultragarso vonia; 4.2. mechaninė purtyklė; 4.3. didelio efektyvumo skysčių chromatografas su kintamo bangos ilgio UV detektoriumi arba diodinės matricos detektoriumi; skysčių chromatografinė kolonėlė, 250 mm x 4 mm, C18, 10 µm įkrova, ar panaši; 4.4. membraniniai filtrai, 0,45 µm. 5. Matavimas: Olakvindoksas jautrus šviesai, todėl visi matavimai turi būti atlikti blankioje šviesoje ir naudojant rudo stiklo indus. 5.1. Bendrosios nuostatos: 5.1.1. atgavimo testui naudojamas tuščiasis pašaras turi būti be olakvindokso ir to paties tipo kaip ir mėginyje; 5.1.2. tuščiasis pašaras patikrinamas, ar jame tikrai nėra nei olakvindokso, nei trukdančių medžiagų; 5.1.3. atgavimo testą reiktų atlikti pridėjus į tuščiąjį pašarą olakvindokso kiekį, panašų į esantį mėginyje. Norint, kad olakvindokso koncentracija būtų 50 mg/kg, į 250 ml konusinę kolbą įpilama 10,0 ml pradinio standartinio tirpalo (3.5.1) ir tirpalas nugarinamas iki maždaug 0,5 ml. Pridedama 50 g tuščiojo pašaro, gerai išmaišoma ir paliekama 10 min. Prieš ekstrahavimą (5.2) dar keletą kartų pamaišoma. 5.2. Ekstrahavimas Pasveriama 0,01 g tikslumu maždaug 50 g mėginio. Supilama į 1000 ml konusinę kolbą, įpilama 100 ml metanolio (3.1). Kolba 5 min įdedama į ultragarso vonią (4.1). Įpilama 410 ml vandens ir 15 min paliekama ultragarso vonioje. Iš ultragarso vonios išimta kolba 30 min purtoma purtykle (4.2) ir turinys filtruojamas per klostuotą filtrą. 10,0 ml filtrato perpilama į 20 ml matavimo kolbutę, iki žymės praskiedžiama vandeniu ir išmaišoma. Mėginys filtruojamas per membraninį filtrą (4.4) (žr.9 pastabą). Pereinama prie HPLC matavimo (5.3). 5.3. HPLC matavimas: 5.3.1. Parametrai: Siūloma taikyti šias arba kitas sąlygas, jei jos duoda panašius rezultatus: analitinė kolonėlė (4.3.1); judančioji fazė (3.4): vandens (3.3) ir metanolio (3.2) mišinys, 900: 100 (V / V); tekėjimo greitis: 1,5 ml/min – 2 ml/min; matavimo bangos ilgis: 380 nm; injekcijos tūris: 20-100 µl. Chromatografinės sistemos stabilumas patikrinamas keletą kartų įleidžiant 2,5 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.5.3), kol olakvindokso smailių aukščiai ir sulaikymo trukmės chromatogramose bus vienodi. 5.3.2. Kalibracinė kreivė Įleidžiamas po keletą kartų kiekvienas kalibracinis tirpalas (3.5.3) ir išmatuojamas kiekvienos koncentracijos smailės aukščių (plotų) vidurkis. Nubraižoma kalibracinė kreivė ant ordinačių ašies atidedant kalibracinių tirpalų smailių aukščių (plotų) vidurkius, ant abscisių – atitinkamas koncentracijas µg/ml. 5.3.3. Mėginio tirpalas Keletą kartų įleidžiamas tokio pat tūrio mėginio ekstraktas (5.2) kaip ir kalibracinių tirpalų ir išmatuojamas olakvindokso smailių aukščių (plotų) vidurkis. 6. Rezultatų apskaičiavimas Pagal mėginio tirpalo olakvindokso smailių aukščių (plotų) vidurkį, remiantis kalibracine kreive (5.3.2), nustatoma mėginio tirpalo koncentracija mikromoliais mililitre. Olakvindokso kiekis w miligramais kilograme mėginio apskaičiuojamas pagal tokią formulę: čia: c – olakvindokso koncentracija mėginio ekstrakte (5.2) mikrogramais mililitre, m – matavimui paimto mėginio dalies svoris gramais (5.2). 7. Rezultatų patvirtinimas: 7.1. Tapatumas Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos ar diodinės matricos detektoriaus pagalba, lyginant mėginio ekstrakto (5.2) ir 5,0 µg/ml kalibracinio tirpalo (3.5.3) spektrus: 7.1.1. Kochromatografija Mėginio ekstraktas (5.2) papildomas pridedant į jį tinkamą kalibracinio tirpalo (3.5.3) kiekį. Pridedamo olakvindokso kiekis turėtų būti panašus į išmatuotą olakvindokso kiekį mėginio ekstrakte. Atsižvelgiant tiek į pridėtą kiekį, tiek į ekstrakto praskiedimą, padidėti turėtų tik olakvindokso smailės aukštis. Smailės plotis pusėje jos aukščio turėtų būti ± 10 % nepapildyto mėginio ekstrakto olakvindokso smailės pločio. 7.1.2. Nustatymas diodine matrica Rezultatai vertinami remiantis šiais kriterijais: 7.1.2.1. mėginio ir standarto spektrų absorbcijos maksimumo bangos ilgis, užregistruotas chromatogramos smailės viršūnėje, turi neviršyti detekcinės sistemos skiriamosios gebos nustatytų ribų. Detekcijai diodine matrica yra ± 2 nm; 7.1.2.2. tarp 220 nm ir 400 nm mėginio ir standarto spektrai, užregistruoti chromatogramos smailės viršūnėje, neturi skirtis, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui nėra nei vieno taško, kuriame nuokrypis tarp dviejų spektrų viršytų 15 % standarto analitės absorbcijos; 7.1.2.3. tarp 220 ir 400 nm mėginio ekstrakto smailių profilių spektrai neturi skirtis vienas nuo kito, kai santykinė absorbcija yra nuo 10 % iki 100 %. Šis kriterijus patenkinamas, kai esant tam pačiam absorbcijos maksimumui visuose stebimuose taškuose nuokrypis tarp spektrų neviršija 15 % smailės viršūnės spektro absorbcijos. Jei nors vienas iš šių kriterijų nepatenkinamas, analitės buvimas nėra patvirtintas. 7.2. Pakartojamumas Skirtumas tarp dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio matavimų verčių neturi būti didesnis nei 15 % nuo santykinai didesnės vertės, kai olakvindokso kiekis yra tarp 10 mg/kg ir 200 mg/kg. 7.3. Atgavimas Atgavimas su papildytu tuščiuoju mėginiu turi būti ne mažesnis kaip 90 %. 8. Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai EK organizavo tarplaboratorinius tyrimus, kurių metu 13-oje laboratorijų išanalizuoti keturi kiaulių pašarų mėginiai, įskaitant tuščiąjį pašarą. Rezultatai: 1 mėginys 2 mėginys 3 mėginys 4 mėginys L 13 10 11 11 n 40 40 44 44 Vidurkis (mg/
  6. kg)- 14,6 48,0 95,4 (St) (mg/
  7. kg)- 0,82 2,05 6,36 (SR) (mg/
  8. kg)- 1,62 4,28 8,42 CVt (%) - 5,6 4,3 6,7 CVR (%) - 11,1 8,9 8,8 Nominalus kiekis (mg/
  9. kg)- 15 50 100 Atgavimas (%) - 97,3 96,0 95,4 L – laboratorijų skaičius; n – vienetinių verčių skaičius; St – pakartojamumo standartinis nuokrypis; SR – atkartojamumo standartinis nuokrypis; CVt – pakartojamumo variacijos koeficientas; CVR – atkartojamumo variacijos koeficientas. PASTABA. Nors metodas nebuvo patvirtintas pašarams, kuriuose olakvindokso yra daugiau kaip 100 mg/kg, patenkinamus rezultatus galima gauti naudojant mažesnį mėginio svorį ir (
  10. ar)praskiedžiant ekstraktą (5.2), siekiant gauti koncentraciją, tarp kalibracinės kreivės ribų (5.3.2). SUDERINTA SUDERINTA Nacionalinės veterinarijos laboratorijos Lietuvos gyvulininkystės instituto direktorius direktorius E. Blaževičius J. Jatkauskas 2000 m. lapkričio 20 d. 2000 m. lapkričio 23 d. ______________

🔗 Į oficialų šaltinį

DI paaiškinimas pagal oficialų įstatymo tekstą. Orientacinis, nepakeičia teisinės konsultacijos.