LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS Į S A K Y M A S DĖL AVOPARCINO IR MONENSINO NATRIO DRUSKOS KIEKIO PAŠARUOSE NU

LIETUVOS RESPUBLIKOS ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS Į S A K Y M A S DĖL AVOPARCINO IR MONENSINO NATRIO DRUSKOS KIEKIO PAŠARUOSE NUSTATYMO TECHNINIO REGLAMENTO PATVIRTINIMO 2001 m. gruodžio 28 d. Nr. 465 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos pašarų įstatymu (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir atsižvelgdamas į Europos Sąjungos direktyvos 81/715/EEB, nustatančios analizės metodus, taikomus oficialiai kokybės kontrolei: 1. Tvirtinu Avoparcino ir monensino natrio druskos kiekio pašaruose nustatymo techninį reglamentą (pridedama). 2. Nustatau, kad techninis reglamentas įsigalioja 2002 m. kovo 1 d. ŽEMĖS ŪKIO MINISTRAS JERONIMAS KRAUJELIS ______________ Patvirtinta Lietuvos Respublikos žemės ūkio ministro 2001 m. gruodžio 28 d. įsakymu Nr. 465 AVOPARCINO IR MONENSINO NATRIO DRUSKOS kiekio pašaruose nustatymo techninis reglamentas Parengtas pagal 1981 m. liepos 31 d. devintąją Europos Komisijos direktyvą 81/715/EEB „Dėl Bendrijos cheminės analizės metodų, kuriuos valstybės institucijos taiko pašarams kontroliuoti“. I. Bendrosios nuostatos 1. Šis techninis reglamentas nustato į rinką tiekiamų pašarinių žaliavų, kombinuotųjų pašarų cheminės analizės metodus pašarų kokybės valstybinei kontrolei vykdyti. (Kai kuriems pašarams dėl jiems būdingų sudėties savybių reikia taikyti atskirus, tik jiems tinkamus cheminės analizės metodus. Šie atvejai nurodyti metodų aprašymuose su nuoroda „Pastabos“). 2. Jei pašarų analitei nustatyti taikomi du ar daugiau metodų, taikomą metodą, jei nenurodyta kitaip, pasirenka cheminę analizę atliekanti laboratorija, tačiau šis metodas turi būti nurodomas analizės sertifikate. 3. Šio techninio reglamento reikalavimų privalo laikytis visi prekinius pašarus gaminantys, laikantys, gabenantys, naudojantys, tarpininkaujantys juos parduodant ir jais prekiaujantys ūkio subjektai ir pašarų kokybės valstybinė kontrolės institucija. 4. Šio techninio reglamento reikalavimai netaikomi pašarams: 4.1. skirtiems eksportuoti ne į Europos Sąjungos valstybes nares; 4.2. gabenamiems uždarose transporto priemonėse arba uždarose pakuotėse tranzitu per Lietuvos Respublikos teritoriją. II. Sąvokos ir sutrumpinimai 5. Šiame techniniame reglamente vartojamos sąvokos: Drėgnis – laisvo vandens procentinis kiekis medžiagoje. Flavofosfolipolis – mažiausiai keturių antibiotikų (moenomicinų A, B1, B2 ir C) kompleksas, kuriame pagrindinis komponentas yra moenomicinas A. Kitos šiame reglamente vartojamos sąvokos turi tą pačią reikšmę kaip Lietuvos Respublikos pašarų įstatyme (Žin., 2000, Nr. 34-952) ir žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 205 (Žin., 2000, Nr. 69-2064) patvirtintame Pašarų klasifikatoriuje. 6. Metodų aprašymuose vartojami cheminių junginių trivialieji pavadinimai ir juos atitinkantys IUPAC terminai: acetonas-propanonas, CH3COCH3; agar-agaras – agaras, (C12H18O9)n; aliuminio oksidas – dialiuminio trioksidas, Al2O3; avoparcino sulfatas – C89H102ClN9O36·H2SO4; druskos rūgštis – vandenilio chloridas, HCl; etanolis – C2H5OH; gliukozė – C6H12O6; kalio-divandenilio fosfatas – kalio-divandenilio tetraoksofosfatas, KH2PO4; kalio-vandenilio fosfatas – dikalio-vandenilio tetraoksofosfatas, K2HPO4; metanolis – CH3OH; monensino natrio druska – C36H61O11Na; natrio hidroksidas – NaOH. 7. Metodų aprašymuose vartojama santrumpa: v/v – tūrių santykis. III. Mėginių paruošimas cheminei analizei 8. Pašarų cheminių analizių metodų bendrosios nuostatos: 8.1. Mėginių paruošimas cheminėms analizėms: 8.1.1. aprašyti veiksmai toliau taikomi galutiniams mėginiams (toliau – mėginiai), atsiųstiems į kontrolės laboratorijas po mėginių paėmimo pagal žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 208 (Žin., 2000, Nr. 60-1786) patvirtintą Pašarų mėginių paėmimo ir paruošimo techninį reglamentą; 8.1.2. galutiniai mėginiai turi būti paruošti tokiu būdu, kad pasverti kiekiai, numatyti analizių metoduose, būtų homogeniniai ir atitiktų galutinį mėginį. 8.2. Atsargumo priemonės mėginių paruošimo metu: 8.2.1. visi būtini veiksmai turi būti atliekami išvengiant mėginio užteršimo ir jo sudėties pokyčio. Malimas, maišymas ir sijojimas turi būti atliekami kaip galima greičiau, kuo trumpiau mėginį veikiant oru ir šviesa. Neturi būti naudojami malūnai ir smulkintuvai, pastebimai įšildantys mėginį. Pašarus, kurie yra ypač jautrūs šilumai, rekomenduojama smulkinti rankomis. Reikėtų įsitikinti, kad patys prietaisai nėra mikroelementų taršos šaltinis; 8.2.2. jei mėginys negali būti paruoštas be ryškaus mėginio drėgnio pokyčio, prieš paruošimą ir po jo nustatomas drėgnis pagal žemės ūkio ministro 2000 m. birželio 30 d. įsakymu Nr. 206 patvirtintą Drėgnio, lakiųjų azoto bazių, suminio fosforo, žalio aliejaus ir riebalų kiekio nustatymo pašaruose techninį reglamentą. 8.3. Galutinio mėginio paruošimo eiga: 8.3.1. galutinis mėginys kruopščiai sumaišomas maišytuvu arba rankomis. Mėginys padalijamas į dvi lygias dalis (jei tinka, turi būti naudojamas ketvirčiavimo metodas). Viena dalis saugoma tinkamoje švarioje, sausoje talpykloje, su oro nepraleidžiančiu kamščiu, antroji dalis (arba jai būdinga mažiausiai 100 g dalis) paruošiama, kaip nurodyta toliau: 8.3.1.1. pašarai gali būti malami iš karto, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip. Visas sumaltas mėginys persijojamas per sietą su kvadratinėmis akutėmis, kurios kraštinės ilgis 1 mm (pagal rekomendaciją ISO R565). Vengiama per smulkaus sumalimo. Persijotas mėginys išmaišomas ir surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei, mėginys vėl išmaišomas; 8.3.1.2. pašarai gali būti sumalami juos išdžiovinus, jei cheminės analizės metode nenurodyta kitaip; mėginys džiovinamas, siekiant sumažinti drėgnį iki 8 %–12 % pagal parengtinio džiovinimo procedūrą, nurodytą drėgnio nustatymo metodo 4.3 punkte. Toliau dirbama, kaip nurodyta šio techninio reglamento 8.3.1.1 punkte; 8.3.1.3. skysto ir pusiau skysto pašaro mėginys surenkamas į tinkamą, švarią, sausą talpyklą su oro nepraleidžiančiu kamščiu. Prieš pat svėrimą cheminei analizei mėginys kruopščiai išmaišomas; 8.3.1.4. kitų pašarų mėginiai, kurie negali būti paruošti vienu iš nurodytų būdų, turi būti paruošiami bet kokiu kitu būdu, garantuojančiu, kad cheminei analizei pasvertas mėginys yra homogeninis ir būdingas galutiniam mėginiui. 8.4. Mėginiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Mėginiai, kuriuose numatyta analizuoti vitaminus ar kitas iš dalies šviesai jautrias medžiagas, turi būti laikomi rudo stiklo induose. 8.5. Reikalavimai reagentams ir prietaisams, naudojamiems cheminės analizės metoduose: 8.5.1. visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. p.), jei cheminės analizės metoduose nenurodyta kitaip. Nustatant mikroelementus, reagentų grynumas turi būti tikrinamas tuščiuoju bandymu. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali būti reikalingas tolesnis reagentų gryninimas; 8.5.2. jei analizės metodų veiksmuose, susietuose su tirpalų ruošimu, skiedimu, skalavimu ar plovimu, nenurodoma naudojamo tirpiklio ar skiediklio prigimtis, suprantama, kad turi būti naudojamas vanduo. Vanduo turi būti tik demineralizuotas ar distiliuotas. Kai kuriais analizių metoduose nurodytais atvejais jis turi būti gryninamas specialiomis priemonėmis; 8.5.3. atsižvelgiant į kontrolės laboratorijose esančią įrangą, cheminės analizės metoduose leidžiama naudoti tik specialius ar specifinio naudojimo reikalaujančius instrumentus ir prietaisus. Jie turi būti ypač švarūs, nustatant labai mažus medžiagų kiekius. 8.6. Cheminės analizės metodų taikymas ir rezultatų išraiška: 8.6.1. kiekviena medžiaga pašaruose paprastai nustatoma atskiru metodu. Jei yra pateikta keletas metodų, kontrolės laboratorijoje naudotas metodas turi būti nurodomas analizės ataskaitoje; 8.6.2. analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas išreiškiamas mažiausiai dviejų matavimų, atliktų su atskiromis mėginio dalimis, vidurkiu, esant patenkinamam šių matavimų pakartojamumui. Šis rezultatas išreiškiamas reikšmingų skaitmenų skaičiumi analizės metoduose nurodytu būdu ir, jei reikia, koreguojamas pagal drėgnio kiekį, esantį galutiniame mėginyje, prieš jo paruošimą. IV. Mėginių cheminė analizė 9. Avoparcino kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 1 priede nurodytą metodą. 10. Monensino natrio druskos kiekis pašaruose nustatomas taikant šio techninio reglamento 2 priede nurodytą metodą. SUDERINTA SUDERINTA Nacionalinės veterinarijos Lietuvos gyvulininkystės laboratorijos direktorius instituto direktorė Jonas Milius Violeta Juškienė 2001 m. gruodžio 21 d. 2001 m. gruodžio 20 d. ______________ Avoparcino ir monensino natrio druskos kiekio pašaruose nustatymo techninio reglamento 1 priedas AVOPARCINO NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE 1. Tikslas ir taikymo sritis Šiuo metodu nustatomas avoparcino kiekis pašaruose ir premiksuose. Radimo riba yra 2 mg/kg. Polieterinių antibiotikų buvimas mėginyje gali trukdyti nustatymui. 2. Metodo esmė Mėginys ekstrahuojamas acetono, vandens ir druskos rūgšties mišiniu. Antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant avoparcino difuziją agare, kuriame pasėta Bacillus subtilis. Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui. 3. Mikroorganizmas: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas Mėgintuvėliuose su gulsčiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Bacillus subtilis. Inkubuojama per naktį 30 oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve 4 oC temperatūroje. Persėjama kas mėnesį. 3.2. Sporų suspensijos ruošimas1. Jauna kultūra iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) išplaunama 2 ml –3 ml sterilaus vandens. Ši suspensija sėjama Roux kolboje su 300 ml mitybinės terpės (4.1) ir inkubuojama 3–5 dienas 30 oC temperatūroje. Patikrinus sporų susidarymą mikroskopu, kultūra surenkama su 15 ml etanolio (4.2) ir sumaišoma. Ši suspensija, laikoma 4 oC temperatūroje, gali būti naudojama 5 mėnesius. 4. Mitybinės terpės ir reagentai: 4.1. Mitybinė terpė2: mėsos peptonas 6,0 g tripsino peptonas 4,0 g mielių ekstraktas 3,0 g mėsos ekstraktas 1,5 g gliukozė 1,0 g agaras 15,0 g vanduo 1000 ml pH (po sterilizavimo) 6,5. 4.2. Etanolis, 20 % (v/v): 200 ml etanolio ištirpinama 800 ml vandens. 4.3. Druskos rūgštis (ρ = 1,18–1,19). 4.4. Natrio hidroksidas (2 mol/l); 4.5. Fosfatinis buferinis tirpalas (0,1 mol/l): 13,6 g K2HPO4 ištirpinama vandenyje. Vandeniu praskiedžiama iki 1000 ml. pH sureguliuojamas iki 4,5. 4.6. Acetono, vandens ir druskos rūgšties (4.3) mišinys santykiu 65: 32,5: 2,5 (v/v/v). 4.7. Standartinė medžiaga: žinomo aktyvumo avoparcino sulfatas. 5. Standartiniai tirpalai 4Tiksliai pasveriama g/ml. Šis tirpalas šaldytuve apie 10 mg standartinės medžiagos (4.7), ištirpinama fosfatiniame buferiniame tirpale (4.5) ir šiuo buferiniu tirpalu praskiedžiama, kad avoparcino koncentracija pradiniame tirpale būtų 100 oC temperatūroje uždarame inde gali būti laikomas 7 dienas. 5.1. Premiksams Iš pradinio tirpalo nuosekliai praskiedžiant fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) ruošiami šie tirpalai: S8 g/ml, μg4,0 S4 g/ml, μg 2,0 S2 g/ml, μg 1,0 S1 g/ml. μg 0,5 5.2. Koncentratams Iš pradinio tirpalo nuosekliai praskiedžiant fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) ruošiami šie tirpalai: S8 g/ml, μg 2,0 S4 g/ml, μg 1,0 S2 g/ml, μg 0,5 S1 g/ml. μg 0,25 6. Ekstrakto ir bandymo tirpalų paruošimas: 6.1. Premiksai 10 mg tikslumu pasveriamas mėginio kiekis, kuriame būtų 10–100 mg avoparcino. Svėrinys supilamas į 100 ml matavimo kolbą, užpilamas 60 ml mišinio (4.6) ir 15 min. purtomas mechanine purtykle. Patikrinamas ir, jei reikia, druskos rūgštimi (4.3) iki 2 sureguliuojamas mišinio pH. Mišiniu (4.6) praskiedžiama iki žymės ir gerai sumaišoma. Dalis ekstrakto filtruojama per tam tinkamą filtrinį popierių (pvz., Whatman Nr. 1), pirmuosius 5 ml filtrato išpilant. Paimamas tinkamas filtrato kiekis, natrio hidroksido tirpalu (4.4) pH sureguliuojamas iki 4,5. Skiedžiama fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5), siekiant gauti numatomą 4,0 mg/ml koncentracijos avoparcino tirpalą (U8). Iš šio tirpalo, nuosekliai skiedžiant per pusę (1+1) fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5), paruošiami tirpalai U4 (numatoma koncentracija: 2,0 2 μg /ml), U2 (numatoma koncentracija: 1,0 1 μg /ml).(numatoma koncentracija: 0,5 6.2. Koncentratai Pasveriama 50 g mėginio, įpilama 100 ml mišinio (4.6) ir 30 min. purtoma mechanine purtykle. Ekstraktas nuskaidrinamas centrifuguojant (naudojami uždengiami mėgintuvėliai). Paimamas tinkamas centrifugato kiekis (žr. lentelę žemiau), kurio pH sureguliuojamas iki 4,5 natrio hidroksido tirpalu (4.4). Skiedžiama fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5), siekiant gauti tirpalą U8 (žr. lentelę). Iš šio tirpalo nuosekliai skiedžiant per pusę (1+1) fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) paruošiami tirpalai U4 g/ml), U1 (numatoma koncentracija: 1,0 2 g/ml), U numatoma koncentracija: 0,5 g/ml). (numatoma koncentracija: 0,25 μg) Numatomas avoparcino kiekis 5 7,5 10 15 20 40 mėginyje mg/kg Mėginio masė g 50 50 50 50 50 50 Mišinio (4.6) tūris ml 100 100 100 100 100 100 Nuskaidrinto ekstrakto tūris ml 20 15 20 15 20 10 Galutinis tūris U8 ml 25 25 50 50 100 100 Numatoma U8 g/mlkoncentracija 2 apie 2 2 apie 2 2 2 7. Matavimas: 7.1. Sėjimas į mitybinę terpę Į mitybinę terpę (4.1) 50 oC – 60 oC temperatūroje pasėjama sporų suspensija (3.2). Pradiniuose terpės (4.1) bandymuose ant lėkštelių nustatomas sporų suspensijos kiekis, reikalingas siekiant gauti didžiausias ir aiškiausias inhibavimo zonas su įvairiomis avoparcino koncentracijomis. 7.2. Lėkštelių paruošimas Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus; U8, U4, U2 ir U1. Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartiniai tirpalai. Kad agaro terpėje būtų galima padaryti bent aštuonias 10 mm–13 mm skersmens skyles, kurių centrai nutolę mažiausiai per 30 mm, parenkamos pakankamai didelės lėkštelės. Bandymai gali būti atlikti lėkštelėse, padarytose iš stiklo plokštelės, iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu. Į lėkšteles įpilama toks kiekis pagal 7.1 apsėtos terpės (4.1), kad susidarytų maždaug 2 mm storio sluoksnis (60 ml–200 mm skersmens lėkštelei). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinami tiksliai išmatuoti bandymo ir standartinių tirpalų kiekiai (nuo 0,10 ml iki 0,15 ml priklausomai nuo skylės skersmens). Kiekviena koncentracija panaudojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas. 7.3. Inkubavimas Lėkštelės inkubuojamos nuo 16 iki 18 valandų 30 oC temperatūroje. 8. Rezultatų įvertinimas 0,1 mm tikslumu išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo. Kiekvienos koncentracijos matavimų vidurkis užrašomas pusiau logaritminiame milimetriniame popieriuje, parodant koncentracijų logaritmo priklausomybę nuo ihibavimo zonų skersmens. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta žemiau esančiame pavyzdyje. Taikant formulę, nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL): (

1. a)SL =(7S1+4S2+S4-2S8) / 10 Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH) pasinaudojant formule: (
2. b)SH =(7S8+4S4+S2-2S1) / 10 Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią UL ir didžiausią UH koncentraciją ekstrakte, pakeičiant aukščiau pateiktose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8. Pažymimos apskaičiuotos SL ir SH vertės tame pačiame grafike ir, jas sujungus, gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiai pažymėjus ir sujungus UL ir UH vertes, gaunama geriausiai ekstraktą atitinkanti tiesė. Nesant trukdžių, šios dvi tiesės turėtų būti lygiagrečios. Praktiškai tieses galima laikyti lygiagrečiomis, jei SH–SL ir UH–UL vertės nuo jų vidurkio nesiskiria daugiau kaip 10 %. Jei tiesės nėra lygiagrečios, U1 ir S1 ar U8 ir S8 gali būti atmesti, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses: (ą) SL = (5S1+2S2-S4) / 6 arba (5S2+2S4-S8) / 6 (b`) SH = (5S4+2S2-S1) / 6 arba (5S8+2S4-S2) / 6 Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH. Turi būti patenkinami tie patys lygiagretumo kriterijai. Faktas, kad rezultatas buvo skaičiuotas pagal tris vertes, turi būti pažymėtas galutinėje ataskaitoje. Kai tiesės laikomos lygiagrečiomis, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš formulių priklausomai nuo to, trys ar keturios vertės buvo naudojamos įvertinant lygiagretumą. Keturioms vertėms: Trims vertėms: Arba Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas. Jei apskaičiuojama, kad santykinis aktyvumas patenka už diapazono nuo 0,5 iki 2,0 ribų, bandymas kartojamas tinkamai sureguliavus ekstrakto, o jei tai neįmanoma, standartinio tirpalo koncentracijas. Kai santykinis aktyvumas negali būti gaunamas tarp reikalaujamų ribų, bet koks gautas rezultatas laikomas apytiksliu ir turi būti nurodytas galutinėje ataskaitoje. Jei tiesės laikomos ne lygiagrečiomis, matavimas kartojamas. Jei lygiagretumas vis dar nepasiektas, matavimas laikomas nepatenkinamu. 9. Pakartojamumas Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties tyrėjo, neturi viršyti: 2 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai avoparcino kiekiai yra nuo 2 iki 10 mg/kg, 20 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra nuo 10 mg/kg iki 25 mg/kg, 5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg, 10 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra per 50 mg/kg. ______________ Avoparcino ir monensino natrio druskos kiekio pašaruose nustatymo techninio reglamento 2 priedas MONENSINO NATRIO DRUSKOS NUSTATYMAS MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARE 1. Tikslas ir taikymo sritis Šiuo metodu nustatomas monensino natrio druskos kiekis pašaruose ir premiksuose. Radimo riba yra 10 mg/kg1. 2. Metodo esmė Mėginys ekstrahuojamas 90 % metanoliu. Priklausomai nuo monensino natrio druskos kiekio mėginyje ekstraktui parenkamos atitinkamos procedūros. Antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant monensino natrio druskos difuziją agare, kuriame pasėta Bacillus subtilis. Difuzija matoma pagal inhibavimo zonų susidarymą terpėje su pasėtu mikroorganizmu. Šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui. Natrio jonai mažina metodo jautrumą. 3. Mikroorganizmas: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas Mėgintuvėliuose su gulsčiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Bacillus subtilis. Inkubuojama per naktį 30oC temperatūroje. Kultūra laikoma šaldytuve 4 oC temperatūroje. Persėjama kas mėnesį. 3.2. Sporų suspensijos ruošimas2. Jauna kultūra iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) išplaunama 2 ml–3 ml sterilaus vandens. Ši suspensija sėjama Roux kolboje su 300 ml mitybinės terpės (4.1) ir inkubuojama 3–5 dienas 30oC temperatūroje. Patikrinus sporų susidarymą mikroskopu, kultūra surenkama su 15 ml etanolio (4.3) ir sumaišoma. Ši suspensija, laikoma 4oC temperatūroje, gali būti naudojama 5 mėnesius. 4. Mitybinės terpės ir reagentai: 4.1. Mitybinė terpė3: tripsino peptonas 10,0 g mielių ekstraktas 3,0 g mėsos ekstraktas 1,5 g gliukozė 1,0 g agaras 10,0 g–20,0 g distiliuotas vanduo iki 1000 ml pH (po sterilizavimo) 6,5. 4.2. Bandomoji terpė: mielių ekstraktas 2,5 g gliukozė 10,0 g kalio-vandenilio fosfatas, K2HPO4 0,69 g kalio-divandenilio fosfatas, KH2PO4 0,45 g agaras (švarus) 10 g distiliuotas vanduo iki 1000 ml pH (po sterilizavimo) 6,0. 4.3. Etanolis, 20 % (v/v): 200 ml etanolio ištirpinama 800 ml vandens. 4.4. Metanolis, bevandenis. 4.5. Metanolis 90 %, (v/v): 900 ml metanolio (4.4) praskiedžiama 100 ml vandens. 4.6. Metanolis 50 %, (v/v): 500 ml metanolio (4.4) praskiedžiama 500 ml vandens. 4.7. Aliuminio oksidas, granuliuotas (Alcoa F, mešas 20, activated alumina UG1: F. Lancaster and Co, ar panašus). 4.8. Standartinė medžiaga: žinomo aktyvumo monensino natrio druska (pvz.: iš International Laboratory for Biological Standarts. Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3NB). 5. Prietaisai: 5.1. Sukamasis vakuuminis garintuvas su 250 ml talpos apvaliadugne kolba. 5.2. Stiklinė chromatografinė kolonėlė, vidinis skersmuo 25 mm, ilgis 400 mm, su 2 mm skersmens anga gale. 5.3. Stiklinė chromatografinė kolonėlė, vidinis skersmuo 11 mm, ilgis apytiksliai 300 mm, su 2 mm skersmens anga gale. 6. Standartiniai tirpalai Tiksliai pasveriamas toks standartinės medžiagos (4.8) kiekis, kad jį ištirpinus etanolyje (4.4) ir praskiedus, būtų gautas pradinis tirpalas, kuriame monensino natrio druskos koncentracija siektų 800 μg/ml oC . Šis tirpalas šaldytuve temperatūroje uždarame inde gali būti laikomas 2 savaites. Iš pradinio tirpalo nuosekliai praskiedžiant 50 % metanoliu (4.6) ruošiami šie tirpalai: S8 8,0 μg/ml S4 4,0 μg/ml S2 2,0 μg/ml S1 1,0 μg/ml 7. Ekstrakto ir bandymo tirpalų paruošimas: 7.1. Ekstrakcija 7.1.1. Premiksai Pasveriama 2,0 g mėginio, užpilama 100 ml 90 % metanolio (4.5), sumaišoma ir keletą minučių centrifuguojama. Centrifugatas skiedžiamas 50 % metanoliu (4.6) siekiant gauti numatomą 8 mg/ml koncentracijos monensino natrio druskos tirpalą (U8). 7.1.2. Koncentratai, kuriuose monensino natrio druskos kiekis ne mažesnis nei 50 mg/kg Pasveriama 10 g–20 g mėginio, užpilama 100 ml 90 % metanolio (4.5), sumaišoma ir 15 min. paliekama nusistoti. Vatos kamšteliu užkemšamas siaurasis stiklinio vamzdelio (5.2) galas, lengvai kratant suberiamas aliuminio oksidas (4.7), kol susidarys 75 mm–80 mm aukščio kolonėlė. Ekstraktas nupilamas į aliuminio oksido kolonėlę, filtratas surenkamas. 30 ml filtrato skiedžiama 50 ml vandens. Toliau skiedžiama 50 % metanoliu (4.6) siekiant gauti numatomą 8 mg koncentracijos monensino natrio druskos tirpalą. 7.1.3. Koncentratai, kuriuose monensino natrio druskos kiekis mažesnis nei 50 mg/kg (apatinė riba 10 mg/
3. kg)Pasveriama 10 g–20 g mėginio, užpilama 100 ml 90 % metanolio (4.5), 15 min. maišoma. Centrifuguojama, kol tirpalas lieka skaidrus. Mėginiui, kuriame monensino natrio druskos kiekis siekia 20 mg/kg, imama 40 ml centrifugato, mėginiui su 10 mg/kg – 80 ml. Tirpalas garinamas iki sausos liekanos vakuuminiu garintuvu (5.1), neviršijant 40 oC temperatūros. Likutis ištirpinamas 10 ml 90 % metanolyje (4.5). Vatos kamšteliu užkemšamas siaurasis stiklinio vamzdelio (5.2) galas, lengvai kratant suberiamas aliuminio oksidas (4.7), kol susidarys 75 mm–80 mm aukščio kolonėlė. Metanolinis likučio tirpalas nupilamas į aliuminio oksido kolonėlę, filtratas surenkamas. Kolonėlė plaunama 10 ml 90 % metanoliu (4.5) abu filtratus sujungiant. Filtratas garinamas iki sausos liekanos vakuuminiu garintuvu (5.1), neviršijant g/ml koncentracijos monensino natrio druskos tirpalą (40o C temperatūros. Likutis ištirpinamas 10 ml bevandenio metanolio (4.4), vandeniu praskiedžiama iki 20 ml. Tirpalas centrifuguojamas ne mažesniu nei 4000 aps./min. greičiu mažiausiai 5 min. Toliau skiedžiama 50 % metanoliu (4.6) siekiant gauti numatomą 88). 7.2. Bandymo tirpalai Iš U8 tirpalo nuosekliai skiedžiant per pusę (1+1) 50 % metanoliu (4.6) paruošiami tirpalai U4 g/ml), (numatoma koncentracija: 4 U2 g/ml), U (numatoma koncentracija: 2U1 g/ml). 8. Matavimas: 8.1. Sėjimas į bandymo terpę Į bandymo terpę (4.2) 50 oC–60 oC temperatūroje pasėjama sporų suspensija (3.2). Pradiniuose terpės (4.2) bandymuose ant lėkštelių nustatomas sporų suspensijos kiekis, reikalingas siekiant gauti didžiausias ir aiškiausias inhibavimo zonas su įvairiomis monensino natrio druskos koncentracijomis. 8.2. Lėkštelių paruošimas Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus U8, U4, U2 ir U1. Kiekvienoje lėkštelėje turi būti keturių koncentracijų ekstrakto ir standartininiai tirpalai. Kad agaro terpėje būtų galima padaryti bent aštuonias 10 mm–13 mm skersmens skyles, kurių centrai nutolę mažiausiai per 30 mm, parenkamos pakankamai didelės lėkštelės. Bandymai gali būti atlikti lėkštelėse, padarytose iš stiklo plokštelės, iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu. Į lėkšteles įpilama toks kiekis pagal 8.1 apsėtos terpės (4.2), kad susidarytų maždaug 2 mm storio sluoksnis (60 ml–200 mm skersmens lėkštelei). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinami tiksliai išmatuoti bandymo ir standartinių tirpalų kiekiai (nuo 0,10 ml iki 0,15 ml priklausomai nuo skylės skersmens). Kiekviena koncentracija panaudojama mažiausiai 4 kartus, taigi kiekviename nustatyme atliekamas 32 inhibavimo zonų įvertinimas. 8.3. Inkubavimas Lėkštelės inkubuojamos apytiksliai 18 valandų 35oC–37oC temperatūroje. 9. Rezultatų įvertinimas 0,1 mm tikslumu išmatuojamas inhibavimo zonų skersmuo. Kiekvienos koncentracijos matavimų vidurkis užrašomas pusiau logaritminiame milimetriniame popieriuje, parodant koncentracijų logaritmo priklausomybę nuo ihibavimo zonų skersmens. Brėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta žemiau esančiame pavyzdyje. Taikant formulę, nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL): (
4. a)SL =(7S1+4S2+S4-2S8) / 10 Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH) pasinaudojant formule: (
5. b)SH =(7S8+4S4+S2-2S1) / 10 Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią UL ir didžiausią UH koncentraciją ekstrakte, pakeičiant aukščiau pateiktose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8. Pažymimos apskaičiuotos SL ir SH vertės tame pačiame grafike ir, jas sujungus, gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiai pažymėjus ir sujungus UL ir UH vertes, gaunama geriausiai ekstraktą atitinkanti tiesė. Nesant trukdžių, šios dvi tiesės turėtų būti lygiagrečios. Praktiškai tieses galima laikyti lygiagrečiomis, jei SH–SL ir UH–UL vertės nuo jų vidurkio nesiskiria daugiau kaip 10 %. Jei tiesės nėra lygiagrečios, U1 ir S1 ar U8 ir S8 gali būti atmesti, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses: (ą) SL = (5S1+2S2-S4) / 6 arba (5S2+2S4-S8) / 6 (b`) SH = (5S4+2S2-S1) / 6 arba (5S8+2S4-S2) / 6 Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH. Turi būti patenkinami tie patys lygiagretumo kriterijai. Faktas, kad rezultatas buvo skaičiuotas pagal tris vertes, turi būti pažymėtas galutinėje ataskaitoje. Kai tiesės laikomos lygiagrečiomis, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš formulių priklausomai nuo to, trys ar keturios vertės buvo naudojamos įvertinant lygiagretumą. Keturioms vertėms: Trims vertėms: arba Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas. Jei apskaičiuojama, kad santykinis aktyvumas patenka už diapazono nuo 0,5 iki 2,0 ribų, bandymas kartojamas tinkamai sureguliavus ekstrakto, o jei tai neįmanoma, standartinio tirpalo koncentracijas. Kai santykinis aktyvumas negali būti gaunamas tarp reikalaujamų ribų, bet koks gautas rezultatas laikomas apytiksliu ir turi būti nurodytas galutinėje ataskaitoje. Jei tiesės laikomos ne lygiagrečiomis, matavimas kartojamas. Jei lygiagretumas vis dar nepasiektas, matavimas laikomas nepatenkinamu. 10. Pakartojamumas Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties tyrėjo, neturi viršyti: 20 % didžiausios vertės, kai monensino natrio druskos kiekiai yra nuo 10 mg/kg iki 25 mg/kg, 5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai kiekiai yra nuo 25 mg/kg iki 50 mg/kg, 10 % didžiausios vertės, kai kiekiai yra per 50 mg/kg. ______________