← Lietuva

LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS MAISTO IR VETERINARIJOS TARNYBOS DIREKTORIAUS Į S A K Y M A S DĖL ŽUVŲ VIRUSINĖS HEMORA

LIETUVOS RESPUBLIKOS VALSTYBINĖS MAISTO IR VETERINARIJOS TARNYBOS DIREKTORIAUS Į S A K Y M A S DĖL ŽUVŲ VIRUSINĖS HEMORAGINĖS SEPTICEMIJOS IR INFEKCINĖS HEMATOPOEZINĖS NEKROZĖS KONTROLĖS REIKALAVIMŲ PATVIRTINIMO 2002 m. birželio 14 d. Nr. 278 Vilnius Įgyvendindamas Lietuvos Respublikos Vyriausybės 2002 m. vasario 27 d. nutarimu Nr. 300 „Dėl Lietuvos pasirengimo narystei Europos Sąjungoje programos (Nacionalinė ACQUIS priėmimo programa) teisės derinimo priemonių ir ACQUIS įgyvendinimo priemonių 2002 metų planų patvirtinimo“ (Žin., 2002, Nr. 25-910) patvirtintą Teisės derinimo priemonių 2002 metų planą (priemonės kodas 3.7.4.1-T25):

  1. Tvirtinu pridedamus Žuvų virusinės hemoraginės septicemijos ir infekcinės hematopoezinės nekrozės kontrolės reikalavimus.
  2. Pavedu įsakymo vykdymo kontrolę Gyvūnų sveikatingumo skyriui. DIREKTORIUS KAZIMIERAS LUKAUSKAS ______________ PATVIRTINTA Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2002 m. birželio 14 d. įsakymu Nr. 278 VIRUSINĖS HEMORAGINĖS SEPTICEMIJOS IR INFEKCINĖS HEMATOPOEZINĖS NEKROZĖS KONTROLĖS REIKALAVIMAI Virusinės hemoraginės septicemijos ir infekcinės hematopoezinės nekrozės kontrolės reikalavimai (toliau –Reikalavimai) parengti vadovaujantis Lietuvos Respublikos veterinarijos įstatymu (Žin., 1992, Nr. 2-15) ir įgyvendina Europos Sąjungos Komisijos sprendimą 2001/183/EB. I. BENDROSIOS NUOSTATOS
  3. Reikalavimų tikslas – nustatyti žuvų virusinės hemoraginės septicemijos (toliau – VHS) ir infekcinės hematopoezinės nekrozės (toliau – IHN) mėginių ėmimo planus bei ligos diagnozavimo ir patvirtinimo metodus.
  4. Vartojamos sąvokos: Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba (toliau – VMVT) Lietuvos Respublikos kompetentinga institucija. Valstybinis veterinarijos gydytojas – VMVT įgaliotas veterinarijos gydytojas. VHS ir IHN neapimto ūkio arba teritorijos statusas – ūkis arba teritorija, kurie įgyja VHS ir IHN neapimto ūkio arba teritorijos statusą, kai oficialiai juose nenustatoma VHS ir IHN.
  5. VMVT, atsižvelgusi į žuvų klinikinio tyrimo rezultatus, VHS bei IHN laboratorinių tyrimų rezultatus, suteikia ūkiui ar teritorijai VHS ir IHN neapimto ūkio ar teritorijos statusą. Jei tokį statusą turinčiame ūkyje ar teritorijoje pasireiškia VHS ir IHN, statusas yra panaikinamas.
  6. VHS ir IHN neapimtos teritorijos statuso neturinčioje teritorijoje gali būti ūkiai, turintys VHS ir IHN neapimto ūkio statusą.
  7. Teritorijose ir ūkiuose, turinčiuose VHS ir IHN neapimtos teritorijos ar ūkio statusą, nuolat kontroliuojama VHS ir IHN – atliekami klinikiniai tyrimai, imami mėginiai VHS ir IHN tyrimams.
  8. Teritorija ar ūkis gali gauti VHS ir IHN neapimtos teritorijos ar ūkio statusą, jei: 6.
  9. vykdoma dvejų metų trukmės priežiūros programa ir ne mažiau kaip dvejus metus nenustatoma VHS ir IHN; mėginiai tokiose teritorijose ar ūkiuose imami ir tiriami kaip nurodyta 1 priede pagal Reikalavimų nuostatas; 6.
  10. oficialios patikros dokumentuose nurodoma, kad per paskutinius ketverius metus teritorijoje ar ūkyje nebuvo nustatyta VHS ir IHN, ir vykdoma dvejų metų trukmės priežiūros programa (tiriama du kartus per metus, bet imamas mažesnis mėginių skaičius); per dvejų metų kontrolinį laikotarpį negali būti diagnozuota VHS ir IHN; mėginiai turi būti imami ir tiriami kaip nurodyta 2 priede pagal Reikalavimų nuostatas.
  11. Naujai veiklą pradedantys ūkiai, auginantys žuvis, ikrus, gametas, gautus iš VHS ir IHN neapimto ūkio ar teritorijos statusą turinčios teritorijos ar ūkio, gali gauti VHS ir IHN neapimto ūkio statusą pagal VMVT nustatytus reikalavimus. Tokiems ūkiams netaikomi mėginių ėmimo ir tyrimo reikalavimai, nurodyti 6.1 ir 6.2 punktuose.
  12. Siekiant išlaikyti VHS ir IHN neapimtos teritorijos ar ūkio statusą, mėginiai imami pagal 3 priedą, laikantis Reikalavimų nuostatų. II. KLINIKINIS TYRIMAS IR MĖGINIŲ ĖMIMAS, PARUOŠIMAS IR TRANSPORTAVIMAS
  13. Klinikinis tyrimas turi būti atliekamas spalio-birželio mėnesiais, kai vandens temperatūra yra žemesnė nei 14°C. Kai ūkiai kliniškai tiriami du kartus per metus, tarp tyrimų turi būti ne mažesnė kaip keturių mėnesių pertrauka. Visi vandens telkiniai (tvenkiniai, rezervuarai ir kt.) turi būti patikrinti, ar juose nėra negyvų, silpnų arba sergančių žuvų. Būtina apžiūrėti vandens ištekėjimo kanalus, kuriuose susirenka vandens srovės atneštos silpnos žuvys.
  14. Žuvų mėginiai atrenkami taip: 10.
  15. jei auginami tik vaivorykštiniai upėtakiai, imamai jų mėginiai; jei vaivorykštiniai upėtakiai neauginami, vadovaujantis VMVT reikalavimais turi būti paimti kitų auginamų žuvų, kurios gali sirgti VHS ar IHN, mėginiai; mėginyje turi būti reprezentacinis žuvų rūšių skaičius; 10.
  16. jei žuvys auginamos daugiau nei viename vandens telkinyje, žuvų mėginys paimamas iš visų vandens telkinių; 10.
  17. jei vandens telkinyje yra silpnų, sergančių arba nugaišusių žuvų, pirmiausia imami tokių žuvų mėginiai; jei tokių žuvų nėra, imami sveikų įvairaus amžiaus žuvų mėginiai; mėginiai imami įvairiose vandens telkinių vietose; mėginyje turi būti reprezentacinis žuvų rūšių skaičius.
  18. Žuvų organų mėginiai paimami steriliais įrankiais ir įdedami į sterilius indelius, kuriuose yra ląstelių terpė, pvz., ląstelių kultūros terpė, kurios sudėtyje yra 10% veršelių serumo ir antibiotikų. Rekomenduojama į ląstelių terpę įdėti 200 TV penicilino, 200 µg streptomicino ir 200 µg kanamicino vienam mililitrui ląstelių terpės. Galima naudoti ir kitus leidžiamus antibiotikus. Tyrimui imami blužnies, inkstų priekinės dalies bei širdies ar galvos smegenų mėginiai. Kai kada gali būti imamas ir kiaušidžių skystis, kaip nurodyta 1, 2 ir 3 prieduose. Į vieną mėgintuvėlį patalpinami organų gabalėliai ar kiaušidžių skystis, kurie surenkami iš ne daugiau kaip 10 žuvų, kaip nurodyta 1–3 prieduose. Sudarant bendrą mėginį, mėgintuvėlis turi būti pripildytas ne mažiau kaip 4 ml audinių terpės. Kiekviename mėgintuvėlyje turi būti ne mažiau kaip 0,5 g audinių. Mėginiai turi būti transportuojami sudėti į izotermines talpyklas (pvz., polistirolo dėžę), kuriose būtų ledo arba šaldymo blokų, kad mėginiai būtų vėsinami juos transportuojant į laboratoriją. Mėginių negalima užšaldyti. Mėginio temperatūra transportavimo metu neturi viršyti 10 °C. Izoterminėje talpykloje ledas arba ledo blokai transportuojant mėginius turi būti neištirpę. Virusologinis tyrimas turi būti atliekamas kaip įmanoma greičiau, bet ne vėliau nei 48 val. po mėginio paėmimo. Išimties atvejais, jei mėginiai buvo transportuoti ląstelių terpėje neviršijant 10 °C, jie gali būti ištirti per 72 val. po paėmimo. Jei imama visa žuvis, ji turi būti įvyniota į sugeriamąjį popierių, įdedama į plastikinį maišelį ir atšaldoma. Galima gabenti gyvą žuvį. Mėginių pakavimas, ženklinimas ir transportavimas turi atitikti Lietuvos Respublikos teisės aktuose numatytus bei tarptautinius reikalavimus. Suderinus su laboratorija, tyrimui gali būti siunčiami ir kiti audiniai, jei tai reikalinga papildomiems tyrimams atlikti. III. MĖGINIŲ PARUOŠIMAS VIRUSOLOGINIAM TYRIMUI
  19. Kai per 48 val. yra neįmanoma ištirti mėginių (dėl blogų oro sąlygų, nedarbo dienų, kitų priežasčių), galima juos užšaldyti ląstelių terpėje – 20°C ar dar žemesnėje temperatūroje ir atlikti tyrimus per 14 dienų. Sušaldytus audinius galima atšildyti tik prieš atliekant tyrimus. Duomenys apie audinių mėginių sušaldymo priežastis turi būti registruojami laboratorijoje.
  20. Audiniai mėgintuvėlyje turi būti visiškai homogenizuoti ir vėliau perkelti į audinių terpę. Homogenizuojama homogenizatoriumi, mikseriu arba maišant piestele su steriliu smėliu. Jei mėginį sudaro žuvis, kuri yra mažesnė nei 4 cm, ji susmulkinama skalpeliu ar žirklėmis, prieš tai pašalinus kūno dalį, esančią už žarnos angos. Jei tiriama visa žuvis, kuri yra 4–6 cm ilgio, mėginį turi sudaryti vidaus organai ir inkstai. Jei mėginį sudaro visa žuvis, kuri yra didesnė nei 6 cm, tyrimui imami žuvų audinių mėginiai, laikantis 11 punkto nuostatų. Audinių mėginiai yra susmulkinami skalpeliu, žirklėmis ar homogenizuojami ir patalpinami į audinių terpę. Galutinis audinio ir audinių terpės santykis, kuris nustatomas laboratorijoje, turi būti 1:
  22. Homogenatas yra centrifuguojamas 15 min. šaldomoje centrifugoje, kurios apsisukimai 2 000–4000 × g, 2°C – 5°C temperatūroje. Atlikus centrifugavimą, supernatantas yra nupilamas, įdedama 1 mg/ml gentamicino ir 4 val. laikoma 15 °C arba 4 °C per naktį. Tuo atveju, kai mėginiai transportuojami ląstelių terpėje su antibiotikais, antibiotikų į supernatantą pridėti bei jį filtruoti nereikia. Jei supernatantas yra laikomas 48 val. –80 °C, virusologiniam tyrimui jis gali būti panaudotas tik vieną kartą. Jei dėl techninių problemų (sugedo įranga, nepakanka ląstelių terpės) per 48 val. po mėginių surinkimo neįmanoma atlikti tyrimų, galima supernatantą sušaldyti iki –80 °C ir atlikti virusologinius tyrimus per 14 dienų. Prieš užkrečiant ląsteles, supernatantas lygiomis dalimis sumaišomas su infekcinės kasos nekrozės viruso vietinių padermių tinkamai atskiestu antiserumu ir inkubuojamas mažiausiai 1 val. 15 °C arba ne ilgiau kaip 18 val. 4 °C. Antiserumo titras turi būti ne mažesnis kaip 1/2000 50 % neutralizacijos testo ploto. Užkrato apdorojimas infekcinio kasos nekrozės viruso antiserumu apsaugo ląsteles nuo citopatinio poveikio, kurį sukelia infekcinės kasos nekrozės virusas besidauginančiose užkrėstų ląstelių kultūrose. Tokiu būdu sutrumpėja virusologinis tyrimas bei klaidingų dėl infekcinio kasos nekrozės viruso citopatinio poveikio virusologinių tyrimų skaičius. Tais atvejais, kai mėginiai pristatomi iš ūkių, kurie neapimti infekcinės kasos nekrozės, supernatanto apdorojimas infekcinės kasos nekrozės antiserumu nėra būtinas. IV. VIRUSOLOGINIS TYRIMAS
  23. Mėlynojo mailiaus žiaunų ląstelių linija (toliau – BF-2) ar vaivorykštinių upėtakių lytinių liaukų ląstelių linija (toliau – RTG-2) ir kita epitelinė papiloma ląstelių linija (toliau – EPC), ar aukšlių ląstelių linija (toliau – FHM) auginamos joms tinkamose terpėse 30 °C temperatūroje, pvz.: Iglo terpėje ar jos modifikuotoje terpėje. Į Iglo terpę pridedama 10 % galvijų vaisiaus serumo ir standartinė antibiotikų dozė. Jei ląstelės yra auginamos sandariuose indeliuose, rekomenduojama į terpę įdėti bikarbonatų. Jei ląstelės yra auginamos uždaruose induose, į terpę pridedama Tris-HCl (23 mM) ir natrio bikarbonato (6 mM). Terpės pH turi būti 7,6 ±0,
  24. Ląstelių kultūros, kurios naudojamos audinių medžiagoms užkrėsti, turi būti aktyvios augimo fazės ir ne senesnės kaip 4–48 val.
  25. Ląstelės yra užkrečiamos dviejų skirtingų praskiedimų, antibiotikais apdorotų organų suspensija, pvz., pirminio bei antrinio praskiedimų santykiu 1:10 organų suspensija. Galutinis audinių praskiedimas ląstelių kultūroje yra atitinkamai 1:100 ir 1:1
  26. Tai padeda išvengti homologinės interferencijos. Mažiausiai dvi ląstelių linijos turi būti užkrėstos pagal 15 punkto reikalavimus. Užkrato ir ląstelių terpės apimties santykis turi būti 1:
  27. Kiekvienam praskiedimui bei ląstelių linijai reikalingas minimalus 2 cm 2 ląstelių augimo plotas, kuris prilygsta vienam 24 duobučių laboratorinės plokštelės šulinėliui. Patariama naudoti ląstelių auginimo padėklus, nors tinka ir kiti dideli auginimo paviršiai.
  28. Užkrėstos ląstelių kultūros yra inkubuojamos 15 °C temperatūroje 7–10 dienų. Ląstelių terpės spalvos pasikeitimas iš raudonos į geltoną rodo terpės parūgštėjimą. Steriliu bikarbonato ar kitu tirpalu turi būti pakoreguotas terpės pH, kad būtų užtikrintas ląstelių imlumas viruso infekcijai. Kas šeši mėnesiai arba kai įtariamas ląstelių imlumo sumažėjimas, būtina atlikti sušaldytų atsargų titravimą, kad būtų įvertintas ląstelių kultūrų imlumas užkratui. Rekomenduojama titravimo metodika yra nurodyta XI skyriuje.
  29. Užkrėstos ląstelių kultūros mažiausiai tris kartus per savaitę turi būti tiriamos mikroskopu, padidinus vaizdą 40–150 kartų, siekiant nustatyti citopatinį poveikį. Pastebėjus citopatinį poveikį, viruso identifikacija turi būti pradėta nedelsiant pagal V skyriaus reikalavimus.
  30. Jei citopatinis poveikis išsivysto pirminės inkubacijos 7–10 dieną, subkultivavimas atliekamas naujų ląstelių kultūrų tokiame pat plote kaip ir pirminės kultūros. Praėjus 7–10 dienų po užkrėtimo, sudaromas pagal ląstelių liniją bendras visų kultūrų šulinėlių terpės mėginys. Neatskiestos ir atskiestos santykiu 1:10 (galutiniai atskiedimai 1:10 ir 1:100) homologinių ląstelių kultūros užkrečiamos gautu bendru mėginiu, kaip nurodyta 16 punkte. Atsitiktinai parinkti mėginiai, turintys savo sudėtyje 10 % pirminės ląstelių kultūros, yra tiesiogiai įdedami į šulinėlį, kuriame yra jauna ląstelių kultūra. Prieš užkrėtimą gali būti atliekama išankstinė inkubacija su infekcinės kasos nekrozės virusu atskiestu antiserumu, kaip nurodyta 14 punkte. Užkrėstos kultūros yra inkubuojamos 7–10 dienų 15 °C temperatūroje ir tiriamos, kaip nurodyta 18 punkte. Jei citopatinis poveikis pasireiškia per pirmas 3 inkubacijos dienas, galima atlikti subkultivavimą, tačiau tuo atveju ląstelės turi būti inkubuojamos 7 dienas ir vėl subkultivuojamos 7 dienas. Jei citopatinis poveikis pasireiškia po 3 inkubavimo dienų, ląstelės gali būti užkrečiamos dar kartą ir inkubuojamos 14 dienų, skaičiuojant nuo pirminės inkubacijos pradžios. Per paskutines 7 inkubacijos dienas negali būti citopatinio poveikio požymių. Jei nustatomas bakterinis užterštumas, nežiūrint į tai, kad naudoti antibiotikai, prieš subkultivavimą ląstelių kultūra centrifuguojama (centrifugos apsisukimai 2 000 – 4 000 ×g) 15-30 min. 2 – 5 °C temperatūroje arba filtruojama per 0, 45 µm filtrą (nedidelio molekulinio svorio baltymus prijungianti membrana). V. VIRUSO IDENTIFIKAVIMAS
  31. Nustačius citopatinį poveikį ląstelių kultūroje, supernatantas yra tiriamas imunofermentine reakcija (toliau – IFA), imunofluorescencijos ar neutralizacijos metodais. Jei šiais tyrimais per savaitę negalima identifikuoti viruso, mėginys siunčiamas į ES kontrolinę žuvų ligų laboratoriją.
  32. Centrifuguojant, kai centrifugos apsisukimai yra 2 000–4 000 ×g, ar filtruojant per 0, 45 µm filtrą, gautas supernatantas ląstelių terpėje praskiedžiamas santykiu 1:100 ir 1:10
  33. Dviejų atskiestų supernatantų mėginiai yra sumaišomi ir inkubuojami 60 min. 15 °C temperatūroje lygiomis dalimis su šiais reagentais (kiekvienu iš jų atskirai): 21.
  34. serumu, turinčiu specifinių antikūnų nuo VHS viruso, praskiedimas santykiu 1:50; 21.
  35. serumu, turinčiu specifinių antikūnų nuo IHN viruso, praskiedimas santykiu 1:50; 21.
  36. serumo bendru mėginiu, turinčiu specifinių antikūnų nuo vietinės kilmės infekcinės kasos nekrozės viruso (toliau – IKNV), praskiedimas santykiu 1:50; 21.
  37. terpe (teigiama kontrolė). Tam tikrais atvejais ES kontrolinė žuvų ligų laboratorija ląstelių citopatiniam poveikiui nustatyti gali taikyti ir kitus galimus antiserumus. Mažiausiai dvi ląstelių kultūros yra užkrečiamos 50 µl kiekvieno viruso supernatanto serumo mišiniu ir inkubuojamos 15 °C temperatūroje. Citopatinis poveikis kontroliuojamas, kaip nurodyta 18 punkte. Kiekvienos VHS viruso padermės negalima identifikuoti neutralizacijos reakcija, todėl turi būti naudojami IFA ir imunofluorescencijos metodai; gali būti naudojami ir kiti VMVT patvirtinti metodai.
  38. Norint identifikuoti kiekvieną išskirtą virusą, ne mažiau kaip 8 dengiamieji stikleliai padengiami ląstelėmis taip, kad jos nuo inkubacijos pradžios praėjus 24 val. ištisai dengtų 60–90 % ploto. Geriausiai tam tinka EPC ląstelės, nes jos tvirčiausiai prisitvirtina prie stiklo paviršiaus. Galima naudoti ir kitas ląsteles: BF-2, RTG-2 ar FHM. Ląstelėms prisitvirtinus ant stiklo paviršiaus (paprastai praėjus vienai valandai) arba ląstelių kultūras inkubavus 24 val., ląstelių kultūra užkrečiama tiriamu virusu. Keturios ląstelių kultūros užkrečiamos santykiu 1:10, o kitos keturios santykiu 1:
  39. Jos inkubuojamos 15 °C temperatūroje 20-30 valandų. Atlikus inkubaciją, ląstelių kultūros yra du kartus skalaujamos Iglo terpe, kurioje nėra serumo, fiksuojamos ledo šaltumo 80 % acetonu ir dažomos dvisluoksniu netiesioginės imunofluorescencijos metodu. Pirmasis reagento sluoksnis yra kontrolinės kokybės polikloniniai ar monokloniniai antikūnai. Antrasis reagento sluoksnis yra pirmojo sluoksnio imunoglobulinų antiserumas, konjuguotas fluoro chromu. Vykdant tyrimą, būtina turėti teigiamą ir neigiamą kontrolinį mėginius. Rekomenduojama naudoti fluoro chromus, fluoresceino izocianatą (toliau – FITS) arba tetrametilrodamino izocianatą (toliau – TRITC). Dažytos ląstelių kultūros apdorojamos glicerolio druska ir tiriamos ultravioletiniu mikroskopu. Tam naudojamas 10 ar 12 kartų didinantis okuliaras ir 25 ar 40 kartų didinantis objektyvas, kurio apertūros skaičius >0, 7 ir >1, >
  40. Galima naudoti ir kitus alternatyvius IFA metodus.
  41. Laboratorinės plokštelės šulinėliai yra padengiami rekomenduojamomis išgrynintų kontrolinės kokybės imunoglobulinų frakcijomis. Jos inkubuojamos per naktį. Šulinėliai yra praplaunami PBS-Tween-20 buferiniu tirpalu. Tiriamas virusas dukart arba keturiskart praskiestas įdedamas laipsniškai į laboratorinės plokštelės šulinėlius ir inkubuojamas 60 min. 37 °C temperatūroje. Atlikus praplovimą PBS-Tween-20 buferiniu tirpalu, pridedama biotinizuotų antikūnų, turinčių savybę specifiškai reaguoti su įdubimuose jau esančiais antikūnais, ir inkubuojama 60 min. 20 °C temperatūroje. Atlikus kitą praplovimą PBS-Tween-20 buferiniu tirpalu, pridedama HRP (krienų peroksidazė) konjuguoto streptavidino ir inkubuojama 60 min. 20 °C temperatūroje. Atlikus paskutinį praplovimą, pridedama imunofermentinės analizės substratų, kad prijungtas fermentas taptų matomu. Gali būti naudojamos ir kitos efektyvios IFA metodikos. VI. DIAGNOSTINIAI TYRIMAI ĮTARUS VHS IR IHN PROTRŪKĮ
  42. VHS ir IHN nustatyti yra naudojami šie tyrimo metodai: 24.
  43. viruso išskyrimas ir identifikacija; 24.
  44. viruso išskyrimas tuo pat metu atliekant serologinę viruso identifikaciją; 24.
  45. kiti diagnozavimo metodai (netiesioginė imunofluorescencija, IFA). Pirmojo VHS ir IHN atvejo patvirtinimui būtina naudoti 24.1–24.3 punktuose nurodytus tyrimo metodus. Kartais be virusologiniam tyrimui skirtų audinių, nustatant diferencinę diagnozę, būtina pristatyti mėginius bakteriologiniam, parazitologiniam, histologiniam ar kitiems tyrimams. VII. VIRUSO IŠSKYRIMAS BEI SEROLOGINĖ IDENTIFIKACIJA
  46. Tyrimui atrenkama ne mažiau kaip 10 žuvų, kurios turi būdingus IHN ar VHS požymius.
  47. Žuvys paruošiamos transportuoti, kaip nurodyta 11 punkte.
  48. Papildomi mėginiai diagnozavimui imami, kaip nurodyta 11 punkte.
  49. Mėginiai paruošiami virusologiniam tyrimui pagal 12–14 punktų reikalavimus.
  50. Virusologinis tyrimas atliekamas pagal 15–19 punktų reikalavimus.
  51. Viruso identifikacija atliekama pagal 20–23 punktų reikalavimus. VIII. VIRUSO IŠKYRIMAS TUO PAČIU METU ATLIEKANT SEROLOGINĘ VIRUSO IDENTIFIKACIJĄ
  52. Mėginiai tyrimui atrenkami, kaip nurodyta 25 punkte.
  53. Mėginiai paruošiami transportuoti pagal 26 punkto reikalavimus.
  54. Papildomi mėginiai diagnozavimui imami, kaip nurodyta 27 punkte.
  55. Organų homogenizavimas atliekamas pagal 13 punkto reikalavimus.
  56. Homogenatas centrifuguojamas šaldomoje centrifugoje 2–5 °C temperatūroje, esant centrifugos apsisukimams 2 000–4000 ×g, 15 min. Supernatantas surenkamas ir pridėjus antibiotikų, pvz., 1 mg/ml gentamicino, laikomas 4 val. 15 °C temperatūroje arba filtruojamas per membraną (0,45 µm), surenkančią mažo molekulinio svorio baltymus.
  57. Antibiotikais apdorota arba perfiltruota organų suspensija atskiedžiama santykiu 1:10 ir 1:1 000 ląstelių kultūros terpe. Mėginiai sumaišomi lygiomis dalimis su reagentais, kurie nurodyti 21 punkte, inkubuojami 60 min. 15 °C temperatūroje.
  58. Ląstelių kultūros ir terpės ruošiamos pagal 15 punkto reikalavimus.
  59. Ne mažiau kaip dvi kiekvienos ląstelių linijos ląstelių kultūros užkrečiamos 50 µl kiekvieno viruso serumo mišiniu, kuris paruoštas pagal 36 punkto reikalavimus.
  60. Ląstelės yra inkubuojamos pagal 15 punkto reikalavimus.
  61. Užkrėstos ląstelės kasdien yra tiriamos mikroskopu, didinančiu 40–150 kartų, siekiant nustatyti citopatinį poveikį. Jeigu serumas apsaugo nuo citopatinio poveikio, galima manyti, kad virusas identifikuotas. Jeigu serumas neapsaugo nuo citopatinio poveikio, viruso identifikavimas atliekamas, kaip nurodyta 20–23 punktuose.
  62. Jei citopatinis poveikis pasireiškia praėjus 7–10 inkubacijos dienų, subkultivuojamos kultūros, kurios buvo užkrėstos supernatantu ir ląstelių terpe, nurodyta 36 punkte, pagal 17 punkto reikalavimus. IX. KITI DIAGNOSTINIAI METODAI
  63. Supernatantas, kuris paruoštas pagal 13 punkto reikalavimus, gali būti tiriamas IFA bei netiesioginės fluorescencijos metodais, kaip nurodyta 22–23 punktuose. Be to, atliekami netiesioginiai tyrimai pagal 25–41 punktų reikalavimus nepraėjus 48 val. nuo mėginio paėmimo, jeigu: 42.
  64. gauti neigiami tyrimo rezultatai; 42.
  65. gauti teigiami tyrimo rezultatai, kai nustatomas pirmas IHN ir VHS atvejis patvirtintoje teritorijoje. Audinių mėginiai gali būti tiriami ir atvirkštinės transkriptazinės polimerazinės grandinės reakcija, imunofluorescencijos ar formaline fiksuotų šaldomuoju mikrotomu suspaustų audinių metodu. Tokiais atvejais visada būtina ląstelių kultūras užkrėsti nefiksuota tiriama medžiaga. X. ŪKIO TIKRINIMO PROGRAMA
  66. Ūkio tikrinimo programa taikoma: 43.
  67. patvirtinus VHS ir IHN likvidavimo programą, kurioje numatytas žuvų likvidavimas ūkyje, valymas, dezinfekcija ir žuvininkystės veiklos atkūrimas; 43.
  68. ūkiuose, kuriuose nenustatyta VHS arba IHN infekcija.
  69. Ūkio tikrinimo programa turi remtis klinikinių ir laboratorinių tyrimų rezultatais.
  70. Į ūkio tikrinimo programą turi būti įtraukti du klinikiniai ūkio patikrinimai, kurie atliekami kasmet pagal 9–23 punktų reikalavimus.
  71. Ne rečiau kaip vieno patikrinimo per metus metu iš kiekvieno ūkio turi būti paimta 30 žuvų ar kiaušidžių skysčio mėginių. Mėginių atrinkimas, paėmimas bei tyrimas atliekamas pagal Reikalavimų nuostatas.
  72. Ūkio tikrinimo programa turi būti tęsiama ne trumpiau kaip 4 metus visuose ūkiuose, neturinčiuose VHS ir IHN neapimto ūkio statuso, esančiuose VHS ir/ar IHN neapimtos teritorijos statuso neturinčioje teritorijoje. Programa patvirtinama, jeigu nenustatoma nė vieno VHS ar IHN atvejo (tiriant kliniškai ar atliekant virusologinį tyrimą). XI. TITRAVIMO METODO APRAŠYMAS, NUSTATANT LĄSTELIŲ KULTŪRŲ IMLUMĄ ŽUVŲ VIRUSINEI LIGAI
  73. Tyrimui turi būti naudojamos ne mažiau kaip dvi VHS viruso ir viena IHN viruso padermės. Tiriant reikia naudoti vieną patogeninę padermę, kuri išskirta gėlavandeniam vaivorykštiniam upėtakiui, ir vieną padermę, patogenišką otui. Be to, tiriant reikia naudoti vieną patogeninę gėlavandeniam vaivorykštiniam upėtakiui viruso padermę, kuri nustatyta Europoje. Galima naudoti žinomas padermes, išskirtas kitose šalyse, bei kontrolines padermes, kurios gaunamos ES kontrolinėje žuvų ligų laboratorijoje. VHS virusai yra dauginami BF-2 arba RTG-2 ląstelių kultūrose, o IHN virusai dauginami EPC arba FHM ląstelių kultūrose. Ląstelių kultūros terpė savo sudėtyje turi turėti ne mažiau kaip 10 % serumo. Gavus citopatinį poveikį, virusas koncentruojamas centrifuguojant ląstelių supernatantą 15 min., esant centrifugos apsisukimams 2 000 ×g, ar filtruojamas per 0, 45 µm filtrą ir išpilstomas į paženklintus kriostatinius mėgintuvėlius. Virusas laikomas –80 °C temperatūroje. Praėjus savaitei po užšaldymo, trys kiekvienos padermės viruso mėgintuvėliai atšildomi šaltame vandenyje ir laipsniškai praskiedžiant (titruojant) tiriamas citopatinis poveikis ląstelių kultūroje. Ne rečiau kaip kas šešis mėnesius ar įtarus, kad ląstelių linijos imlumas sumažėjo, būtina atlikti kiekvienos viruso padermės titravimą. Titravimo procedūros turi būti smulkiai aprašytos, jų turi būti laikomasi. Titravimui turi būti naudojamos ne mažiau kaip šešios virusų padermės. Gauti titrai yra lyginami su prieš tai gautais titrais. Jei bent vieno iš trijų titruojamų virusų padermių titras sumažėja 2 log arba daugiau, palyginti su pirminiais titrais, tokios ląstelių linijos daugiau nenaudojamos kontrolei. Jeigu laboratorijoje laikomos skirtingos ląstelių linijos, kiekviena iš jų turi būti tikrinama atskirai. Duomenys saugomi ne mažiau kaip 10 metų. ______________ Virusinės hemoraginės septicemijos ir infekcinės hematopoezinės nekrozės kontrolės reikalavimų 1 priedas DVEJŲ METŲ LAIKOTARPIUI SUDARYTA TYRIMŲ IR MĖGINIŲ ĖMIMO SCHEMA VHS IR IHN NEAPIMTOS TERITORIJOS AR ŪKIO STATUSO NETURINČIOMS TERITORIJOMS IR ŪKIAMS Klinikinių tyrimų skaičius per metus Laboratorinių tyrimų skaičius Laboratoriniai tyrimai virusui per metus nustatyti1 Auginamų žuvų skaičius (audinių mėginiai) Veislei auginamų žuvų skaičius (kiaušidžių skystis) Kontinentinės teritorijos ir ūkiai Ūkiai, auginantys žuvis veisimui 2 2 120-pirmas patikrinimas2, 150-antras patikrinimas 30-pirmas patikrinimas3, 0-antras patikrinimas Ūkiai, auginantys tik žuvis veisimui 2 1 0 150-pirmas ir antras patikrinimai3 Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui 2 2 150-pirmas ir antras patikrinimai 0 Pakrantės teritorijos ir ūkiai Ūkiai, auginantys žuvis veisimui 2 2 120-pirmas patikrinimas, 150-antras patikrinimas 30-pirmas patikrinimas3, 0-antras patikrinimas Lašišinių žuvų ūkiai, neauginantys žuvų veisimui 2 2 30-pirmas ir antras patikrinimai4 0 Ūkiai, neauginantys lašišinių žuvų veisimui 2 2 150-pirmas ir antras patikrinimai 0 Didžiausias žuvų skaičius bendrame mėginyje yra
  74. 1 jei laikomasi 6.2, 25 ir 43–47 punktų reikalavimų, mėginių skaičius gali būti mažesnis nei numatyta 2 priede 2 klinikinis tyrimas 3 išimties atvejais, kai neįmanoma paimti kiaušidžių skysčio, gali būti paimti audinių mėginiai 4 jei žuvys perkeltos iš gėlo į sūrų vandenį, mėginiai imami ne anksčiau kaip po trijų savaičių ______________ Virusinės hemoraginės septicemijos ir infekcinės hematopoezinės nekrozės kontrolės reikalavimų 2 priedas DVEJŲ METŲ LAIKOTARPIUI SUDARYTA TYRIMŲ IR MĖGINIŲ ĖMIMO SCHEMA TERITORIJOMS IR ŪKIAMS, SIEKIANTIEMS ĮGYTI VHS IR IHN NEAPIMTOS TERITORIJOS AR ŪKIO STATUSĄ Klinikinių tyrimų skaičius per metus Laboratorinių tyrimų skaičius Laboratoriniai tyrimai virusui per metus nustatyti1 Auginamų žuvų skaičius (audinių mėginiai) Veisimui auginamų žuvų skaičius (kiaušidžių skystis) Kontinentinės teritorijos ir ūkiai Ūkiai, auginantys žuvis veisimui 2 2 0-pirmas patikrinimas1, 30-antras patikrinimas 30-pirmas patikrinimas2, 0-antras patikrinimas Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui patikrinimai 2 2 30 – pirmas ir antras 0 Pakrantės teritorijos ir ūkiai Ūkiai, auginantys žuvis veisimui 2 2 0-pirmas patikrinimas, 30-antras patikrinimas 30-pirmas patikrinimas2, 0-antras patikrinimas Lašišinių žuvų ūkiai, neauginantys žuvų veisimui 2 2 30-pirmas ir antras patikrinimai3 0 Ne lašišinių žuvų ūkiai, neauginantys žuvų veisimui 2 2 30-pirmas ir antras patikrinimai 0 Didžiausias žuvų skaičius bendrame mėginyje yra
  75. 1 klinikinis tyrimas 2 išimties atvejais, kai neįmanoma paimti kiaušidžių skysčio, gali būti paimti audinių mėginiai 3 jei žuvys perkeltos iš gėlo į sūrų vandenį, mėginiai imami ne anksčiau kaip po trijų savaičių ______________ Virusinės hemoraginės septicemijos ir infekcinės hematopoezinės nekrozės kontrolės reikalavimų 3 priedas TYRIMŲ IR MĖGINIŲ ĖMIMO SCHEMA TERITORIJOMS IR ŪKIAMS, SIEKIANTIEMS IŠLAIKYTI VHS IR IHN NEAPIMTOS TERITORIJOS AR ŪKIO STATUSĄ Klinikinių tyrimų skaičius per metus Laboratoriniai tyrimai virusui per metus nustatyti1 Auginamų žuvų skaičius (audinių mėginiai) Veisimui auginamų žuvų skaičius (kiaušidžių skystis) Kontinentinės teritorijos ir ūkiai Ūkiai, auginantys žuvis veisimui 2 20 – pirmas ir antras patikrinimai 10 – pirmas ir antras patikrinimai2 Tik veislinių žuvų ūkiai 2 0 30-pirmas ir antras patikrinimai2 Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui 2 30 0 Pakrantės teritorijos ir ūkiai Ūkiai, auginantys žuvis veisimui 2 20 – pirmas ir antras patikrinimai 10 – pirmas patikrinimas2 Ūkiai, neauginantys žuvų veisimui 1 303 0 Didžiausias žuvų skaičius bendrame mėginyje yra
  76. 1 statusą turinčiose teritorijose mėginiai imami rotacijos principu iš 50% ūkių; iš statuso neturinčioje teritorijoje esančių statusą turinčių ūkių mėginiai imami kasmet 2 išimties atvejais, kai neįmanoma paimti kiaušidžių skysčio, gali būti paimti audinių mėginiai 3 jei žuvys perkeltos iš gėlo į sūrų vandenį, mėginiai imami ne anksčiau kaip po trijų savaičių ______________

🔗 Į oficialų šaltinį

DI paaiškinimas pagal oficialų įstatymo tekstą. Orientacinis, nepakeičia teisinės konsultacijos.