← Lietuva

Patvirtinta Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos ministro 1995 m. gegužės 11 d. įsakymu Nr. 83 PASTABA: Normatyvinis d

Patvirtinta Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos ministro 1995 m. gegužės 11 d. įsakymu Nr. 83 PASTABA: Normatyvinis dokumentas Įsigaliojo nuo 1995 m. liepos 1 d. ir galioja 3 metus Biologinio paviršinių vandenų užterštumo nustatymo metodai (LAND 5-95/M–01) Vadovaujantis Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos įstatymu, Aplinkos apsaugos ministerijos nuostatais, patvirtintais 1994 m. rugsėjo 9 d., Lietuvos Respublikos Vyriausybės nutarimu Nr. 842, Aplinkos apsaugos ministerijos patvirtinti normatyviniai reikalavimai yra privalomi visiems Lietuvos Respublikos juridiniams ir fiziniams asmenims.

  1. Paviršinių vandenų fitoplanktono tyrimo metodika Fitoplanktonas (dumbliai) – tai mikroskopiniai organizmai, laisvai judantys vandens telkinyje ir vykdantys fotosintezę. Pasisavindami organinius junginius, dumbliai apvalo vandenį. Apie indikatorines planktono savybes galima spręsti ne tik pagal tai, kad kai kurių rūšių dumbliai smarkiau vystosi arba jų nėra, bet ir pagal skirtingų rūšių kiekybinį santykį, todėl vandens telkinio užterštumui nustatyti labai svarbu žinoti dumblių rūšinę sudėtį, ląstelių gausumą ir biomasę. Fitoplanktono paėmimas Fitoplanktono bandiniai semiami į 1 l talpos plastmasinius butelius. Butelis panardinamas į vandenį prieš srovę 0,2–0,3 m gylyje. Pasemtas bandinys konservuojamas 40% formalino 5–10 ml kiekiu. Pritvirtinama etiketė, kurioje nurodytas telkinio pavadinimas, pjūvis, vandens toC, skaidrumas, mėginio paėmimo data. Fitoplanktono sedimentacija ir koncentracija 7–10 parų palaikius fitoplanktoną tamsoje, kad nusistotų, virš nusėdusių dumblių atsargiai panardinamas sifonas ir nusiurbiamas vanduo, paliekant apie 100 cm3 bandinio. Likęs turinys perpilamas į graduotus tamsaus stiklo buteliukus. Po 2–3 parų bandinys koncentruojamas iki 10 cm
  2. Prie kiekvieno buteliuko pritvirtinama etiketė, kur, be anksčiau nurodytų duomenų, užrašomi kiti požymiai, pavyzdžiui, naftos, pelėsių plėvelė, šiukšlės, nespecifinis kvapas. Toliau atliekamas kokybinis ir kiekybinis tyrimas. Kokybinis fitoplanktono tyrimas Mikroskopu tiriant pavyzdį (mikroskopu „Ergaval“), identifikuojamos dumblių rūšys, suskaičiuojamos individų ląstelės, išmatuojami ląstelių matmenys. Kokybinio tyrimo galutinis rezultatas yra nustatytas indikatorinių organizmų saprobiškumo indeksas (SI), kuris nusako tiriamojo vandens kokybę, todėl fitoplanktono individai iki rūšies apibūdinami naudojant klasifikatorius (lit. sąr.4,12). Kiekybinis metodas Gausumo nustatymas Dumblių gausumui nustatyti naudojama Goriajevo kamera. Prieš pradedant darbą su kamera, ji ir dengiamieji stikleliai gerai išplaunami etilo spiritu. Dengiamasis stiklelis turi gerai priglusti prie aplink tinklelį esančios plokštelės paviršiaus, kad susidarytų Niutono žiedai. Prieš atliekant skaičiavimus, bandinys kruopščiai išmaišomas ir lašas vandens įlašinamas į kamerą. Nusėdus dumbliams į kameros dugną, pradedama skaičiuoti. Kamera peržiūrima mažuoju ir didžiuoju, taip pat sausuoju ir imersiniu objektyvu, paeiliui skaičiuojami visi kameros tinklelio kvadratai. Individas, apibūdintas iki rūšies, pažymimas tašku populiaciją atitinkančioje skiltyje; taškai komponuojami dešimtimis pagal bendrą sistemą. Bendras dumblių ląstelių skaičius bandinyje nustatomas pagal formulę: nv1 N = ———; v2w čia N – ląstelių skaičius 1 cm3 vandens, n – ląstelių skaičius kameroje, v1 – koncentruoto mėginio tūris, v2 – kameros tūris, w – pradinis paimto bandinio tūris. Norint gauti patikimus tyrimo rezultatus, fitoplanktono tankumas pavyzdyje turi būti ne mažiau kaip 3 tūkst. ląstelių/ml. Biomasės nustatymas Kiekvienas rastas dumblis išmatuojamas okuliariniu mikrometru arba okuliare esančiu tinkleliu. Išmatavus dumblių ląstelių parametrus, ląstelė prilyginama artimam geometriniam kūnui (kvadratas, cilindras, elipsė). Išmatavus daug kartų, sudaromos vidutinių svorių lentelės. Kiekvienos ląstelės tūrį (mm3) padauginus iš jos gausumo, gaunama atitinkamos rūšies biomasė, išreikšta mg/l. Vandens kokybės nustatymas pagal fitoplanktoną Vertinant vandens užterštumą, naudojamas indikatorinių organizmų metodas pagal R. Pantle ir H. Buck (Sladečeko modifikacija). Taikant šį metodą, biologinių tyrimų rezultatus galima išreikšti skaitine verte ir palyginti įvairių vandens telkinių užterštumo būklę, nusakomą saprobiškumo indeksu (SI), apskaičiuojamu pagal formulę: ∑ sh S = ———; ∑ h čia S – saprobiškumo indeksas, s – atskiro individo saprobiškumo indeksas, h – santykinis pasitaikymo dažnumas (atskirų rūšių % santykis su penkiomis saprobiškumo sistemos pakopomis). lentelė Vienos rūšies ind. Dažnumo reikšmė skaičius, % nuo bendro h individų skaičiaus <1 1 2–3 2 4–10 3 10–20 5 20–40 7 40–100 9 SI dydis apskaičiuojamas 0,01 tikslumu. Remiantis SI, skiriamos keturios vandens saprobiškumo zonos (R. Kolkwiz, Marsonn). 2 lentelė Saprobiškumo SI zona Oligosaprobinė 0,50–1,50 Betamezosaprobinė 1,51–2,50 Alfamezosaprobinė 2,51–3,50 Polisaprobinė 3,51–4,00 Nustačius pavyzdžio saprobiškumo indeksą, naudojantis 3 lentele nustatoma vandens kokybės klasė pagal fitoplanktoną. 3 lentelė Vandens kokybės Vanduo Saprobiškumo indeksas klasė pagal R. Pantle ir H. Buck I Labai švarus <1 II Švarus 1,10–1,50 IIIA Pusiau vidutiniškai užterštas 1,51–2,00 IIIB Vidutiniškai užterštas 2,01–2,50 IV Užterštas 2,51–3,50 V Smarkiai užterštas 3,51–4,00 VI Labai smarkiai užterštas >4 Literatūra
  3. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и дoнных отложений.– Гидрометеоиздат,
  5. Киселев И. А. Планктон морей и континентальных водоемов.– Изд. „Наука“. – Ленинград,
  7. Polska Akademia Nauk. Flora slodkowodna Polske. Tom 1–2–3–4–5.– Panstvowe wydawnictwo naukowe,– Warszawa,
  9. Определитель низших растений в пяти томах,– Гос. изд. „Сов. наука“,
  11. Васильева И. И. Эвгленовые и желтозеленые водоросли Якутии.– Изд. „Наука“,
  13. Tikkanen T. Kasviplanktonopas – Suomen L. Tr. Oy. Helsinki,
  15. Dr. Lothar Kalbe. Kieselalgen in Bionengewassern. – A. Ziemsen Verlag,
  17. Urania. Pflancenreich. – Leipzig–Jena,
  19. Liebmann. Handbuch der Frischwasser und Abwasser. – Jena,
  21. Pantle R., Buck H. Die biologische Uberwachung der Gewasser und die Darstellung der Ergebnisse. – Gas und Wasserfach. – 1955, Bd. JG N18.– 604 S.
  22. Sladeček V. System of waterquality from the biological point of view. – Arch. Hidrobiol. Ergehnisse der Limnologic, 1973, Bd. 7.– 218 S.
  23. Определитель пресневодных водорослей СССР.– Гос. изд. „Сов. наука“,
  25. Преснoводные диатомовые и синезеленые водоросли водоемов Якутии. – М.: Изд. „Наука“,
  27. СЭВ. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть III. методы биологического анализа вод. Атлас сапробных организмов. – Москва, 1977;
  29. Upių ir ežerų zooplanktono tyrimo metodika Zooplanktono bandiniams paimti naudojamas planktoninis Apšteino tinklelis (Nr. 64–77). Vanduo semiamas prieš srovę 0,2–0,5 m gylyje. Per tinklelį filtruojamas ne mažesnis kaip 50 l vandens kiekis. Pavyzdžio vanduo iš tinklelio išpilamas į 100 ml talpos graduotą buteliuką. Filtratas fiksuojamas 40% formalino 2–3 ml kiekiu. Pritvirtinama etiketė, kurioje nurodytas upės pavadinimas, pjūvis ir bandinio paėmimo data. Bandiniai laikomi taip, kad jų neveiktų tiesioginė patalpų šviesa. Nusistojus bandiniui, vanduo iš buteliuko nusiurbiamas pipete, ant kurios pritvirtinamas tinkliukas Nr. 76, kad su vandeniu nebūtų nusiurbti zooplankteriai. Nusiurbus buteliuke paliekama apie 10 ml bandinio tūrio, kuris kartu su zooplankteriais išpilamas į Bogorovo kamerą ir stebimas pro binokuliarą. Jeigu apibūdinant zooplankterius kyla neaiškumų, zooplankteris preperavimo adatėle perkeliamas ant objektyvo stiklelio, prispaudžiamas dengiamuoju stiklu ir tiriamas mikroskopu. Kai zooplankterių labai daug ir neįmanoma suskaičiuoti, turinys iš Bogorovo kameros išpilamas į švarų buteliuką. Iš buteliuko pipete paimama 1 ml turinio ir 9 ml distiliuoto vandens, sumaišoma ir vėl išpilama į Bogorovo kamerą. Jeigu dar neįmanoma suskaičiuoti, tai turinys dar kartą analogiškai atskiedžiamas. Skiedžiama tol, kol tampa įmanoma suskaičiuoti zooplankterius. Tada atskirai suskaičiuojami kiekvienos rūšies plankteriai ir nustatomas jų procentas bandinyje. Tuomet pagal 1 lentelę nustatomas zooplankterio pasitaikymo dažnumas bandinyje (h). 1 lentelė Vienos rūšies egzempliorių Dažnumo reikšmė skaičius % nuo bendro (h) egzempliorių skaičiaus <1% 1 1–3% 2 3–10% 3 10,1–20% 5 20,1–40% 7 40,1–100% 9 Organizmų gausumas 1 m3 apskaičiuojamas pagal tokią formulę: n.1000 X= ————; v čia X – organizmų skaičius 1 m3 vandens (vnt./m3); n – organizmų skaičius bandinyje (vnt.); v – perfiltruoto vandens kiekis (50 l). Pavyzdžiui: rasti du zooplankteriai dešimtyje ml vandens, tai
  30. 1000 X= ———— = 40 vnt./m3; jeigu buvo skaičiuota iš 1 ml vandens, tai 50 atitinkamai 20.1000 X= ————— = 400 vnt./m3 ir t.t. 50 Organizmų biomasė apskaičiuojama padauginus zooplankterio svorį iš individų skaičiaus 1 m3 vandens. Pavyzdžiui: individo svoris 0,006 mg, gausumas 400 vnt./m3; tada biomasė 0,006x400= 2,4 mg/m
  31. Vandens užterštumo būklei įvertinti naudojamas indikatorinių organizmų metodas pagal Pantle ir Buck

(1955)Sladečeko modifikacijoje. Saprobiškumo indeksas apskaičiuojamas pagal formulę: ∑ (
  1. sh)SI= ————; ∑ h čia SI – saprobiškumo indeksas; s – individo saprobiškumo indeksas; h – pasitaikymo dažnumas; ∑ – suma; ∑ (sh)=h1s1+h2s2+h3s3+... ir t.t; ∑ h – visų rūšių pasitaikymo dažnumų suma. Nustačius pavyzdžio saprobiškumo indeksą, pagal 2 lentelę nustatoma vandens kokybės klasė pagal zooplanktoną. 2 lentelė Vandens kokybės Vanduo Saprobiškumo indeksas klasė pagal Pantle ir Buck (Sladečeko modifikacija) I Labai švarus <1 II Švarus 1,01–1,50 IIIA Pusiau vidutiniškai užterštas 1,51–2,0 IIIB Vidutiniškai užterštas 2,01–2,50 IV Užterštas 2,51–3,50 V Smarkiai užterštas 3,51–4,0 VI Labai užterštas >4 Saprobiškumo indeksas nurodomas vienos šimtosios tikslumu. Kad tyrimo rezultatai būtų statistiškai patikimi, pavyzdyje turi būti ne mažiau kaip 12 rūšių indikatorinių organizmų, kurių pasitaikymo dažnio bendra suma ne mažesnė kaip 30. Literatūra 1. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и дoнных отложений.– Гидрометеоиздат, 1983. 2. Киселев И. А. Изучение планктона водоемов. В кн.: В помощь работающим на полезащитных лесных полосах.– М.–Л.: Изд–во АН СССР, 1950. 3. Киселев И. А. Методы исследования планктона. В кн.: Жизнь пресных вод СССР. Т.4, вып.1. – М.–Л., Изд–во АН СССР, 1956. 4. Свирская Н. Л. Методические указания по исследованию зоопланктона для определения состояния фоновых пресноводных экосистем.– Москва: Гидрометеиздат, 1987. 5. Кутикова Л. А. Коловратки Rotatoria фауны СССР – М.–Л.: Наука, 1970. 6. Кутикова Л. А., Старобогатов Я. И. Определитель пресноводных беспозвоночных Европейской части СССР. – Гидрометеоиздат, 1977. 7. Совет экономической взаимопомощи. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть III. Методы биологического анализа вод.– Атлас сапробных организмов.– Москва, 1977 и 1983. 8. Рылов В. М. Пресноводные Calanoida СССР. Пресноводная фауна. Вып. I. Определители организмов пресных вод СССР. – Л.: Изд–во Ин–та рыбного хозяйства и промышленных иследований, 1930. 9. Рылов В. М. Ветвистоусые ракообразные Cladocera. В кн.: Жизнь пресных вод СССР. т. I.– М.–Л.: Изд–во Ан СССР, 1940. 10. Рылов В. М. Свободноживущие веслоногие ракообразные Copepoda. В кн.: Жизнь пресных вод СССР. Т. I.– М.–Л.: Изд–во АН СССР, 1940. 11. Pantle R. Buck H. Die biologische Uberwachung der Gewasser und die Darstellung der Ergebnisse.– Gas und Wasserfach, 1955, Bd.96, N 18.–604 S. 12. Sladeček V. System of water quality from the biological point of view.– Arch. Hidrobiol. Ergehnisse der Limnologie, 1973, Bd.7.– 218 S. 3. Makrozoobentoso tyrimo metodai Kontroliuojant paviršinius vandenis, vykdoma struktūrinė dugninių (bentosinių) organizmų populiacijų, biocenozių analizė. Kokybinis ir kiekybinis bentosinių organizmų biocenozių išsivystymas akivaizdžiai nusako dugno nuosėdų ir priedugnio vandens sluoksnio užterštumo laipsnį. Biocenozių sudėtis palyginti stabili, kol nekinta jų biotopas. Pakankamai švariuose vandenyse, gerai deguonimi prisotintose dugno vietose bentoso bendrijoms būdinga didelė rūšinė įvairovė. Tai rodo, kad vandens ekosistemos būklė normali. Užterštuose vandens telkiniuose išnyksta tos organizmų grupės, kurios jautriausios kai kurioms teršiančioms medžiagoms. Vyksta rūšinis biocenozių perskirstymas, kartais užsibaigiantis katastrofa – rūšių išnykimu. Zoobentosiniai organizmai vandens telkinyje užima du pagrindinius biotopus: dugno nuosėdas (paviršinį bei dumblo sluoksnį) ir augalus. Judantys organizmai gali atitrūkti nuo substrato paviršiaus ir plaukioti vandenyje, užimdami trečią biotopą – vandens sluoksnį priedugnio vandens sluoksnio ribose arba vandens erdvę tarp sužėlusių makrofitų. Kai kurios organizmų rūšys gali gyventi bet kuriame iš trijų biotopų skirtingomis užterštumo sąlygomis, nes dugno nuosėdų užterštumas dažniausiai yra didesnis negu vandens sluoksnio. Dugno nuosėdose telkinio pakraščiuose ir gelmėje gali susikaupti skirtingos koncentracijos įvairių teršalų rūšių. Atsižvelgiant į organizmų dydį, vidaus vandenų zoobentosą sutarta skirstyti į 3 grupes: 1) makrobentosą – daugiau kaip 2–3 mm, 2) mezobentosą – 0,5–3 mm, 3) mikrobentosą – mažiau kaip 0,5 mm. Pagal tokį suskirstymą makrobentosui gali būti priskirti stambūs organizmai, pavyzdžiui, dvigeldžiai moliuskai, paskutinių stadijų chironomidų lervos, lytiškai subrendę oligochetai. Mezobentosui priskiriami tie organizmai, kurie suaugę pereina į makrobentoso sudėtį, taip pat tie, kurie ir suaugę neviršija 2 mm. Makro– ir mezobentosas surenkamas tais pačiais paėmimo įrankiais ir metodais. Mikrobentosui priskiriami smulkūs organizmai – pirmuonys, verpetės, turbelarijos ir gastrotrichai. Norint šią fauną tinkamai surinkti, reikia tai daryti pagal specialią paėmimo metodiką ir svarbiausia bandinys turi būti apibūdinamas nefiksuotas, nes fiksuoti organizmai deformuojasi ir tada jų apibūdinti neįmanoma. Paėmimo metodika Svarbiausi prietaisai, skirti kiekybinio zoobentoso surinkimui, yra įvairių sistemų dugno semtuvai. Universalaus prietaiso, pritaikyto visų rūšių dugno nuosėdoms semti, nėra, todėl naudojami kelių konstrukcijų dugno semtuvai. Minkštam dumblui semti dažniausiai naudojamas Ekmano–Berdži konstrukcijos semtuvas. Jis pritaikytas ežerų zoobentosui semti. Upių dugnas dažniausiai smėlėtas arba akmenuotas, todėl naudojami Petersono tipo arba štanginiai dugno semtuvai. Lietuvos upių monitoringui visuose aštuoniuose departamentuose naudojami vienodi GR–91 tipo štanginiai dugno semtuvai, kurių aprėpiamasis dugno plotas yra 1/40 m2. Šiuo semtuvu bandinius reikia semti ne mažiau kaip 5 kartus. Norint surinkti zoobentosą kokybiniam pavyzdžiui, naudojamas trikampis gremžtukas, kuriuo pratraukiama upės dugnu 2–5 metrai. Pasemtos dugno nuosėdos išpilamos į kibirą ar vonelę, po to visas turinys perplaunamas pro kaproninį tinklelį (Nr. 23). Gerai išplautos nuosėdos perpilamos į litrinius butelius su trupučiu vandens; prie buteliukų pritvirtinamos etiketės. Jose turi būti nurodyti šie duomenys: 1) vandens telkinio pavadinimas, 2) punkto pavadinimas, 3) prietaiso pavadinimas ir kiek kartų paimta, 4) data, 5) gylis, 6) dugno nuosėdų tipas. Pavyzdžiui: upė Neris aukščiau Vilniaus k. kr. Št x 5 1994 10 15 0,5 m smėlis. Zoobentoso bandiniai nefiksuoti gali būti laikomi 48 val., todėl jie nedelsiant turi būti vežami į laboratoriją. Laboratorijoje bandiniai nedidelėmis porcijomis pilami į specialią plokščiadugnę lėkštę. Gyvi organizmai išrenkami į stiklinius buteliukus ir fiksuojami 95o etilo alkoholiu. Stambūs dvigeldžiai moliuskai sudedami į puslitrinius arba litrinius stiklainius ir taip pat fiksuojami 95o etilo alkoholiu, nes kiti konservantai sugraužia kiautą. Taip užfiksuoti pavyzdžiai gali stovėti ilgą laiką. Fiksuoto pavyzdžio turinys iš buteliuko išpilamas į Petri lėkštelę. Joje organizmai, naudojantis binokuliaru, suskirstomi į sistemines grupes; didesnieji organizmai apibūdinami iki rūšies ir suskaičiuojami. Smulkių organizmų rūšiai nustatyti iš jų smulkių detalių daromas preparatas ir tiriamas mikroskopu. Apibūdinti ir suskaičiuoti organizmai 5 min. džiovinami ir sveriami torsioninėmis BT–500 tipo svarstyklėmis. Kiekviename bandinyje rastas organizmų kiekis ir svoris perskaičiuojamas kvadratiniam metrui. Dugno nuosėdų užterštumo įvertinimas pagal zoobentosą Perspektyviausias upių priekrantinės juostos dugno nuosėdų užterštumo pagal zoobentosą nustatymo metodas yra pasiūlytas Vudiviso ir pritaikytas Anglijoje Trento upėje. Jis apima atskirų taksonų indikatorines reikšmes ir įvairių faunos rūšių kitimą teršimo sąlygomis. Biotinis indeksas pagal Vudiviso sistemą nustatomas naudojantis lentele, kuri atspindi labiausiai paplitusių organizmų išnykimo tendenciją didėjant užterštumui. Faunos įvairovės skaičiavimui pasiūlyta sąvoka „grupė“, vieniems organizmams reiškianti rūšį, o kitiems, sunkiai apibūdinamiems, stambesnius taksonus. Biotiniam indeksui nustatyti pagal grupes naudojamos visos žinomos rūšys plokščiųjų kirmėlių (tipas Plathelminthes); mažašerių kirmėlių (klasė Oligochaeta), išskyrus giminę Nais; visos žinomos dėlių rūšys (klasė Hirudinea), moliuskai (tipas Mollusca), vėžiagyviai (klasė Crustacea), vandens erkės (būrys Acarina), lašalų lervos (būrys Ephemeroptera), išskyrus Baetis rhodani, ankstyvių (būrys Plecoptera), apsiuvų lervos (būrys Trichoptera), didžiasparnių lervos (būrys Megaloptera), vabalų (būrys Coleoptera), suaugę ir blakių lervos (būrys Hemiptera), mašalų šeima (šeima Simulidae), uodų–trūklių lervų šeima (šeima Chironomidae) išskyrus Chironomus thummi; lerva Chironomus thummi. 1 lentelė Biotinio indekso nustatymas Atstovaujantys organizmai Rūšinė įvairovė Biotinis indeksas pagal bendrą atstovaujančių grupių kiekį 0–1 2–5 6–10 11–15 16 ir > Ankstyvių lervos Daugiau kaip 1 rūšis – 7 8 9 10 Tik 1 rūšis – 6 7 8 9 Lašalų lervos Daugiau kaip 1 rūšis 1 – 6 7 8 9 Tik 1 rūšis 1 – 5 6 7 8 Apsiuvų Daugiau kaip 1 rūšis 2 – 5 6 7 8 lervos Tik 1 rūšis 2 – 4 5 6 7 Gamaridai Anksčiau išvardytų rūšių nėra 3 4 5 6 7 Vandens asiliukas Anksčiau išvardytų rūšių nėra 2 3 4 5 6 Tubificidai arba Anksčiau išvardytų rūšių nėra 1 2 3 4 – chironomidų lervos Visų anksčiau išvardytų rūšių nėra Gali atstovauti kai kurios 0 1 2 – – rūšys, nereikalaujančios deguonies 1 Išskyrus Baetis rhodani. 2 Įtraukiant į šį skyrių Baetis rhodani. Žinant biotinį indeksą, dar nustatomas santykinis oligochetų kiekis bandinyje. Pagal biotinio indekso reikšmę ir santykinį oligochetų kiekį, išreikštą procentais, nustatoma punkto dugno nuosėdų pagal zoobentosą užterštumo klasė. Vandens užterštumo klasės nustatomos pagal šešiabalę sistemą, priimtą SEPT šalyse. 2 lentelė Vandens Vandens kokybė Santykinis oligochetų Biotinis klasė kiekis % nuo bendro indeksas dugno organizmų kiekio I Labai švarus 1–20 10 II Švarus 21–35 7–9 III Vidutiniškai užterštas 36–50 5–6 IV Užterštas 51–65 4 V Smarkiai užterštas 66–85 2–3 VI Labai smarkiai užterštas 86–100 arba makrobentoso nerasta 0–1 Literatūra 1. Lietuvos ežerų hidrobiologiniai tyrimai. – Vilnius, 1975. 2. P. Šivickis. Lietuvos moliuskai ir jų apibūdinimas. – Vilnius, 1960. 3. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и дoнных отложений. – Ленинград, 1983. 4. Определитель преснoводных беспозвоночных Европейской части СССР. – Ленинград, 1977. 5. Фауна СССР. Ракообразные. T. I. – Ленинград, 1971. 6. Фауна СССР. Ручейники. T. II. – Ленинград, 1966. 7. Черновский А. А. Определитель личинок кoмaров семейства Tendipedidae. – Москва, 1949. 8. Панкратова В. Я. Личинки и куколки кoмaров подсемейства Orthocladiinae фауны СССР. – Ленинград, 1970. 9. Чекановская О. В. Водные малощетинковые черви фауны СССР. – Ленинград, 1962. 10. Жадин В. И. Жизнь пресных вод СССР. Т. I. – Ленинград, 1940. 11. Жадин В. И. Жизнь пресных вод СССР. Т. III. – Ленинград, 1940. 12. Жадин В. И. Жизнь пресных вод СССР. Т. IV. – Ленинград, 1956. 13. Научные основы контроля поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Труды советско–англиского семинара. – Ленинград, 1977. 14. Научные основы биомониторинга пресноводных экосистем. Труды советско–французкого симпозиума. – Ленинград, 1988. 15. Попченко В. И., Резанов А. Г. Методические указания по исследованию зообентоса для определения состояния фоновых преснoводных экосистем. – Москва, 1987. 16. Липин А. Н. Пресные воды и их жизнь. – Москва, 1950. 17. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть III. Приложение I. – Москва, 1977. 18. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть III. Приложение II. – Москва, 1977. 19. Вудивисс Ф. Совместные англо–советские биологические исследования в Нотингеме в 1977 г. – В кн.: Научные основы контроля качества поверхностных вод по г/б показателям. Труды II. Советско–англиского семинара. – Л., Гидрометеоиздат, 1981. 4. Upių ir ežerų perifitono tyrimo metodika Perifitonui nustatyti parenkami 4–5 perifitono organizmais apaugę akmenukai (jie būna su žalsvu arba pilku apnašu). Išimtiniais atvejais galima imti povandenines augalų dalis. Viskas sudedama į 250 ml talpos buteliuką, užpilama vandeniu ir fiksuojama 40% formalino 3–5 ml kiekiu. Pritvirtinama etiketė, kurioje nurodytas tikslus upės pavadinimas, pjūvis ir bandinio paėmimo data. Bandiniai laikomi taip, kad jų neveiktų tiesioginė patalpų šviesa. Laboratorijoje bandinys iš buteliuko perpilamas į kristalizatorių arba Petri lėkštelę ir medžiaga analizuojama. Jeigu bandiniai į laboratoriją pristatomi nefiksuoti ir juose yra stambių organizmų (chironomidų lervų, moliuskų, oligochetų), jie atrenkami į atskirą stiklinaitę ir fiksuojami 70% spiritu arba 40% neutralizuotu formalinu iki 4% koncentracijos ir apibūdinami paskiausiai. Stambūs organizmai (vabzdžių lervos, moliuskai ir kt.) suskaičiuojami visame bandinyje. Jeigu apnašos nelabai tirštos, pirmuonys ir verpetės suskaičiuojamos tiesiog ant stiklo. Po to apaugos nušveičiamos dantų šepetėliu ir nuplaunamos žinomu kiekiu vandens. Judrių formų individai (pirmuonys, verpetės) suskaičiuojami Bogorovo kameroje. Norint kokybiškai įvertinti dumblius, apnašų nuoplovos gerai išmaišomos tam tikrame vandens tūryje. Skaičiavimui imami keli mililitrai tūrio. Skaičiuojama Goriajevo kameroje. Dumblių gausumas N skaičiuojamas pagal formulę: v1n N= ——; v2s čia v1 – vandens tūris kartu su apaugomis; v2 – peržiūrėtos bandinio dalies tūris, kuriame rasta n ląstelių arba kolonijų; s – pavyzdžio substrato plotas. Gausumas išreiškiamas kolonijomis/mm2 arba milijonais kolonijų/m2. Mikroskopinių organizmų rūšies sudėtį pradedama apibūdinti nuo pirmuonių ir verpečių, kurios turi būti apibūdinamos tik gyvos, nes konservuojančios medžiagos jas deformuoja arba visiškai suardo. Bandinio medžiaga apibūdinama apžiūrėjus pro binokuliarą ir mikroskopą. Bakterijos iki rūšinės sudėties nenustatinėjamos, nustatomas tik kolonijų skaičius. Tačiau bakterijas, tokias kaip Sphaerotilus natans, Zooglea ramigera ir kai kurias kitas, kurios sudaro stambias kolonijas, galima identifikuoti ir įtraukti į apskaitą nustatant rūšinę perifitono sudėtį. Bandinys tiriamas tol, kol neberandama naujų rūšių. Paprastai užtenka peržiūrėti 3–4 preparatus. Nustatinėjant kokybinio bandinio rūšinę sudėtį, tuo pat metu nustatomas pasitaikymo dažnumas (h). Pasitaikymo dažnumas vertinamas pagal tokią skalę: 9 – labai daug (kiekviename matymo lauke daug), 7 – dažnai (kiekviename matymo lauke), 5 – nedažnai (ne visuose matymo laukuose), 3 – retai (keliuose matymo laukuose), 2 – labai retai (pavieniai kiekviename preparate), 1 – pavieniai (pavieniai egzemplioriai bandinyje). Ši skalė vėliau naudojama saprobiškumo indeksui apskaičiuoti. Vandens kokybei įvertinti pagal perifitono organizmus naudojamas indikatorinių organizmų pagal Pantle ir Buck Sladečeko modifikacijoje metodas. Saprobiškumo indeksas (SI) apskaičiuojamas pagal formulę: ∑ (
  2. sh)SI= ———; ∑ h čia s – indikatorinė rūšies reikšmė; h – pasitaikymo dažnumas (vertinant pagal aukščiau nurodytą skalę); ∑ – suma ((sh)=h1s1+h2s2+h3s3+... ir t. t.); ∑h – visų rūšių pasitaikymo dažnumo suma. Saprobiškumo indeksas nurodomas vienos šimtosios tikslumu. Ksenosaprobinė zona – 0–0,50; oligosaprobinė – 0,51–1,50, b – mezosaprobinė – 1,51–2,50, a – mezosaprobinė – 2,51–3,50, polisaprobinė – 3,51–4,00. Nustačius bandinio saprobiškumo indeksą, nustatoma vandens kokybės klasė pagal perifitoną naudojantis 1 lentele. 1 lentelė Vandens kokybės Vanduo Saprobiškumo indeksas klasė pagal Pantle ir Buck (Sladečeko modifikacija) I Labai švarus <1 II Švarus 1,10–1,50 IIIA Pusiau vidutiniškai užterštas 1,51–2,00 IIIB Vidutiniškai užterštas 2,01–2,50 IV Užterštas 2,51–3,50 V Smarkiai užterštas 3,51–4,0 VI Labai smarkiai užterštas >4 Kad tyrimo rezultatai būtų statistiškai patikimi, pavyzdyje turi būti ne mažiau kaip 12 rūšių indikatorinių organizmų, kurių pasitaikymo dažnumo bendra suma ne mažesnė kaip 30. Literatūra 1. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и дoнных отложений. – Гидрометеоиздат, 1983. – 39-50 стр. 2. Рылов В. М. Преснoводные Calanoida СССР. Пресноводная фауна. Вып. I. Определители организмов пресных вод СССР. – Л.: Изд. Ин-та рыбного хозяйства и промышленных исследований, 1930. 3. Рылов В. М. Ветвистоусые ракообразные Cladocera. – В кн.: Жизнь пресных вод СССР. Т.1. – М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1940. 4. Рылов В. М. Свободноживущие веслоногие ракообразные Copepoda. В кн.: Жизнь пресных вод СССР. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1940, Т.1. 5. Рылов В. М. Cyclopoida пресных вод. Фауна СССР. Ракообразные. Т.3. Вып.3 – М. – Л.: Изд. АН СССР, 1948. 6. Мануйлова Е. Ф. Ветвистоусые рачки Cladocera фауны СССР. – М. – Л.: Наука, 1964. 7. Кутикова Л. А. Коловратки фауны СССР. – Л.:Изд-во Наука, 1970. 8. Pantle R., Buck H. Die biologische Uberwachung der Gewasser und die Darstellung der Ergebnisse. – Gas und Wasserfach, 1955, Bd. 96. N18. – 604 s. 9. Sladeček V. System of water quality from the biological point of view. – Arch. Hydrobiol. Ergehnisse der Limnologie, 1973, Bd.7.–218 S. 5. Bakteriologiniai vandens užterštumo tyrimo metodai Vandens bandinio paėmimas. Sanitariniam bakteriologiniam tyrimui vanduo imamas į 500 ml arba 250 ml talpos sterilius stiklinius indus, užkimštus vatos su marle kamščiais ir uždengtus popieriniais gaubtais. Prieš imant tyrimui vandenį iš eksploatuojamo vandentiekio, čiaupas nuvalomas sumirkytu spirite tamponu ir apdeginamas spiritinio fakelo liepsna. Vanduo leidžiamas 10–15 min. visiškai atsukus čiaupą ir tik po to pripilamas bandinio indas; iki indo viršaus nepripilama, o paliekama vietos (maždaug 2,5 cm), kad pilstant vanduo geriau išsimaišytų. Pripildyti indai sandariai užkemšami šlifuotais kamščiais, ant viršaus uždedami popieriniai gaubtai. Atliekant chloruoto vandens tyrimą, į 500 ml indus prieš sterilizuojant, įdedama dechloratoriaus – 10 mg natrio hiposulfito. Iš atvirų vandens telkinių vandens bandiniai imami 10–15 cm gylyje (nuo paviršiaus) prieš srovę. Paimtų bandinių bakteriologiniai tyrimai atliekami kaip galima greičiau, ne vėliau kaip po 2 valandų. Jeigu tai neįmanoma (pavyzdžius būtina pervežti), tada ne vėliau kaip po 6 valandų ypatingais atvejais leidžiama po 24 valandų, bet iki tol bandinius reikia laikyti šaldymo konteineriuose to=1–5oC temperatūroje. Įvertinant vandens sanitarinę būklę, nustatomi šie indikatoriniai mikroorganizmai: – bendras koliforminių organizmų kiekis, – fekalinių koliforminių organizmų kiekis, – enterokokai, – Koli fagai, – heterotrofinė mezofilinė mikroflora, – heterotrofinė psichrofilinė mikroflora. Nustatant koliforminius organizmus, fekalinius koliforminius organizmus, enterokokus, naudojamasi m e m –braninio filtravimo metodu. Šis metodas grindžiamas tuo, kad naudojant membraninius filtrus visos (arba beveik visos) bakterijos, kurių yra tiriamajame vandenyje, sulaikomos filtre, po to išauginamos standžioje maitinimo terpėje. Tam tikslui naudojami membraniniai filtrai, kurių porų vidutiniai matmenys 0,45–0,7 µm. Išpakuoti filtrai pirmiausia patikrinami, ar nėra defektų (skylučių, įskilimų), o po to sterilizuojami – po vieną panardinami į pakaitintą iki 60–80oC distiliuotą vandenį, kuris palengva užvirinamas; filtrai virinami 10 min. Taip sterilizuojama 2–3 kartus po 10 min., kiekvieną kartą pakeičiant distiliuotą vandenį, kol iš filtro išplaunamos visos pašalinės medžiagos. Paruoštus filtrus galima laikyti sausus arba butelyje su distiliuotu vandeniu. Prieš naudojimą filtrai sterilizuojami verdančiame vandenyje. Tiriamasis vanduo filtruojamas Zeico, Goldmano-Semenovo ar kitokiu prietaisu: prietaisas pritvirtinamas prie Bunzeno kolbos (1,5–2 l talpos), apvalomas sumirkytu spirite vatos tamponu ir apdeginamas. Ant ataušinto prietaiso apatinės dalies (stalelio) padedamas, naudojantis liepsnoje pakaitintu pincetu, sterilus membraninis filtras, prispaudžiamas ir sutvirtinamas prietaiso viršutine dalimi. Po to į prietaiso piltuvėlį pilamas tiriamasis vanduo (laikantis aseptikos taisyklių), o inde (Bunzeno kolboje) sudaromas vakuumas. Pradžioje filtruojami mažiau, o po to labiau užteršti vandens tūriai (100, 10 ir 1 ml švariems vandenims, 0,1; 0,01 ir 0,001 ml užterštiems vandenims). Naudojamas vienas filtravimo prietaisas, bet kiekvienam skiediniui keičiamas filtras. Filtruojant 1 ml ir mažesnius tūrius, jie pradžioje praskiedžiami 9 ml sterilaus vandens ir tik po to filtruojami. Baigus filtruoti, membraninis filtras atsargiai už kraštelio nuimamas steriliu pincetu ir perkeliamas neapverstas (filtruojančiu paviršiumi į viršų) ant Endo terpės paviršiaus: stebima, ar nesusidaro oro burbuliukų tarp terpės ir filtro. Į vieną lėkštutę galima sudėti keturis membraninius filtrus (svarbu, kad jie nesiliestų). Lėkštutės su filtrais (dugnu į viršų) dedamos į 37o C termostatą 18–24 val.; po to įvertinami rezultatai. Išaugusioms kolonijoms suskaičiuoti atrenkami filtrai, ant kurių išaugo ne mažiau kaip po 10 ir ne daugiau kaip 50 kolonijų. Skaičiuojamos visos raudonos ir tamsiai raudonos su metaliniu blizgesiu ir be jo kolonijos. Iš keleto kolonijų paruošiami tepinėliai, dažomi Gramo būdu ir tiriami mikroskopu. Radus tepinėliuose gramneigiamas, trumpas polimorfines, nesudarančias sporų lazdeles, atliekamas oksidazės testas. Jei ant filtro nėra būdingų žarnyno lazdelės grupei bakterijų kolonijų, tai tiriamojo vandens fekalinio užteršimo atsakymas yra neigiamas. Oksidazės testas skirtas Enterobacteriaceae šeimos bakterijoms diferencijuoti nuo gramneigiamų Pseudomadaceae šeimos bakterijų bei kitų vandens saprofitinių bakterijų, kurios turi aktyvią oksidazę ir oksiduoja fenilendiamino junginius iki indofenolo, nudažančio kolonijas ryškiai mėlyna arba mėlynai violetine spalva. Specialus reaktyvas oksidazės testui ruošiamas taip: 1) 1% spiritinis a – naftolo tirpalas ir 2) 0,5% vandeninis bet kokio fenilendiamino junginio (dimetil-n-fenilendiamino, dimetil-n-fenilendiamino druskarūgščio, difenil-n-fenilendiamino) tirpalas. Abu tirpalai gali būti laikomi 1–2 savaites. Prieš naudojimą sumaišoma 2,5 ml pirmojo tirpalo ir 7,5 ml antrojo tirpalo. Membraninis filtras su išaugusiomis ant jo bakterijų kolonijomis pincetu perkeliamas (neapvertus filtro) ant kiek didesnio skersmens filtruojamojo popieriaus, gerai sumirkyto reaktyvu oksidazei nustatyti. Po 2–5 min. įvykus reakcijai, filtras grąžinamas atgal į terpę ir įvertinamas rezultatas. Esant teigiamai reakcijai, kolonijų spalva tampa mėlynai violetinė, esant neigiamai, spalva nesikeičia – tai būdinga žarnyno lazdelės grupės bakterijoms. Nustačius, kad yra žarnyno lazdelės grupės bakterijų, apskaičiuojamas Koli indeksas. Jis gaunamas taip: išaugusių žarnyno lazdelės grupės bakterijų skaičius dauginamas iš 1000 ir dalijamas iš tiriamojo vandens tūrio. Pavyzdžiui: jei perfiltravus 300 ml vandens, išaugo 3 kolonijos, tai tada: 3. 1000 X= ———— = 10. 300 Reiškia, Koli indeksas yra 10. Temperatūrinis testas. Nuodugnesnei analizei atliekamas temperatūrinis testas. Naudojant temperatūrinį testą, nustatomas bendras koliforminių organizmų kiekis ir fekaliniai koliforminiai organizmai. Atlikus oksidazės testą, išaugusios ant Endo terpės filtre kolonijos (membraninis metodas) su neigiama oksidaze išsėjamos, naudojant platininę kilpelę, į Gisso terpę su laktoze ir laktozės terpę su boro rūgštimi. Koliforminiai organizmai fermentuoja Gisso terpę su laktoze 37oC temperatūroje 24–48 valandas. Kai yra koliforminių organizmų, pasikeičia terpės spalva ir susidaro dujos. Terpės rausva spalva pasikeičia į mėlyną ir atsiranda oro burbuliukų; tik esant šiems dviem rodikliams, pasėlio reakciją galima laikyti teigiama. Šių organizmų kiekis vandenyje – tai pagrindinis rodiklis įvertinant vandens tinkamumą. Fekaliniai koliforminiai organizmai fermentuoja laktozę su boro rūgštimi 44,5 + 0,2oC temperatūroje 24 valandas. Kai yra fekalinių koliforminių organizmų, tirpalas pasidaro drumzlinas, o panardintoje plūdelėje išstumiamas skystis. Tik esant šiems dviem rodikliams, pasėlio reakciją galima laikyti teigiama. Jei vandenyje yra šių organizmų, reiškia, vanduo neseniai buvo užterštas fekalijomis ir jame gali būti žarnyno patogenų. Enterokokų nustatymas. Enterokokai vandenyje – papildomas vandens fekalinio užteršimo rodiklis. Tuo tikslu nustatomos visos enterokokų grupės, tačiau sanitarijos požiūriu svarbiausi yra fekaliniai streptokokai. Enterokokų kiekis vandenyje nustatomas naudojant membraninį filtravimo metodą. Vandens pavyzdžiai filtruojami per membraninius filtrus (porų dydis 0,4 mm). Kiekvieno vandens bandinio įvairūs kiekiai (nuo 50 iki 0,001 ml priklausomai nuo užteršimo intensyvumo) filtruojami per atskirus filtrus. Filtrai inkubuojami 48 val. 37oC temperatūroje ant KF terpės pagal Kennerą. Po to suskaičiuojamos stambios rožinės spalvos su vyšniniai raudonu centru smarkiai išgaubtos kolonijos (nekreipiama dėmesio į smulkias įvairių atspalvių kolonijas), mikroskopu nustačius jų diplokokinę-streptokokinę formą. Enterokokų kiekiui apskaičiuoti išvedamas ant kelių filtrų išaugusio kolonijų skaičiaus aritmetinis vidurkis. Heterotrofinės mezofilinės mikrofloros nustatymas. Tam tikslui reikia daryti tokio vandens kiekio pasėlius, kad lėkštelėje su mėsos peptono agaru (m. p. a.) išaugtų nuo 30 iki 300 kolonijų. Pagal standarto GOST 18963-73 reikalavimus nustatoma, kiek 1 ml tiriamojo vandens yra mezofilinių mikroorganizmų, gebančių per parą 37oC temperatūroje išaugti, mėsos peptono agare sudarant kolonijas, matomas plika akimi arba padidinus 2–5 kartus. Iš kiekvieno bandinio daromi ne mažiau kaip du skirtingo tūrio pasėliai. Tiriant vandentiekio vandenį, imama į dvi lėkštutes po 1 ml, švarų telkinio vandenį – 1–0,1 ml, labiau užterštų vandenų – 0,01 ir 0,001 ml vandens. Labai užterštų ir nutekamųjų vandenų tiriama 0,0001 ir 0,00001 ml. Prieš darant pasėlį vanduo gerai išmaišomas (nesušlapinant kamščio). Tiriant 0,1 ir mažesnius tūrius, tiriamasis vanduo praskiedžiamas steriliu distiliuotu vandeniu. Tuo tikslu steriliomis pipetėmis praskiedžiama dešimt kartų: į mėgintuvėlį su 9 ml sterilaus vandens pripilama 1 ml tiriamojo vandens, gerai išmaišoma ir 1 ml šio 10 kartų praskiesto vandens įpilama į kitą mėgintuvėlį su 9 ml sterilaus vandens (100 kartų skiedžiamo) ir t.t. iki reikiamo praskiedimo. Kiekvieną kartą iš kiekvieno praskiedimo pilama po 1 ml į dvi sterilias Petri lėkšteles (iš anksto pažymėjus bandymo numerį, vandens kiekį ir datą) ir užpilama 10–12 ml išlydytu ir atvėsintu iki 45oC 1,5% mėsos peptono agaru. Gerai išmaišyta (lengvai kraipant lėkštutę įvairiomis kryptimis) terpė ataušinama, laikant horizontalioje padėtyje iki visiško agaro sustingimo. Po to lėkštutės su terpėmis dedamos (dugnu į viršų) 24 valandoms į termostatą ir laikomos 37oC temperatūroje. Po inkubacijos, naudojantis 2–5 kartus didinančia lupa, suskaičiuojamos visos išaugusios kolonijos. Tačiau įvertinti galima tik tokius rezultatus, kai kolonijų skaičius lėkštelėse svyruoja nuo 30 iki 300. Visi gauti skaičiai susumuojami. Jeigu vertinamos kolonijos, išaugusios iš 0,1 ml vandens, tai gautoji suma dauginama iš 10. Abiejose Petri lėkštelėse išaugusių kolonijų suma dalijama iš dviejų ir taip gaunamas vidutinis bakterijų skaičius 1 ml nepraskiesto vandens. Heterotrofinis psichrofilinės mikrofloros nustatymas. Heterotrofiniai psichrofiliniai mikroorganizmai auginami standartiniame maitinamajame agare. Vanduo priklausomai nuo užterštumo laipsnio skiedžiamas steriliu distiliuotu vandeniu (analogiškai kaip anksčiau aprašytu mezofilinių mikroorganizmų nustatymo atveju). Kiekvieno vandens pavyzdžio daroma ne mažiau kaip du skirtingi kiekiai pasėlio. Įpilama į Petri lėkšteles po 1 ml tiriamo praskiedimo, kuris užpilamas ant 10–15 ml ištirpinto ir ataušinto iki 40–45oC maitinamojo agaro. Lėkštutės su pasėliu inkubuojamos termostate 72 + 2 val. 20–22oC temperatūroje. Išaugusių kolonijų skaičius randamas apskaičiavus kelių lėkštelių kolonijų skaičiaus aritmetinį vidurkį. Koli fago nustatymas. Norint visapusiškiau įvertinti sanitarinę vandens būklę, nustatomi bakteriofagai. Koli fagai nustatomi agarizuotų terpių sluoksniuose, inkubuojant 37oC temperatūroje 18–24 val. Darbo tvarka: 1. Iš vakaro pripildomas 1,5% maitinamojo agaro po 25–30 ml reikiamas kiekis Petri lėkštelių. 2. Petri lėkštelės uždengiamos steriliu popieriumi ir džiovinamos baktericidine lempa 1 val. Po to Petri lėkštelės uždengiamos ir apverčiamos dugnu į viršų. 3. Iš vakaro į mėgintuvėlius su nuožulniu agaru pasėjama Escherichia coli b. 4. Paruošiami bandinio praskiedimai ir užpilami 1–2 ml chloroformo. Paliekama 15 min. nusistovėti. 5. 1 ml vandens kiekis, esantis virš chloroformo, pasėjamas į Petri lėkšteles su maitinamuoju agaru. 6. Į mėgintuvėlį su 0,7% maitinamojo agaro įpilama 18 valandų amžiaus E. coli 0,1–0,2 ml ir atsargiai sumaišoma. 7. Maitinamojo agaro mišinys su E. coli užpilamas ant bandinio, esančio Petri lėkštelėse su maitinamuoju agaru, ir tolygiai paskirsčius paliekamas sustingti. 8. Maždaug po 30 min. apverstos Petri lėkštelės dugnais į viršų sudedamos į termostatą, kur 37oC temperatūroje laikomos 18–24 valandas. 9. Po 18-24 val. suskaičiuojamas negatyvių kolonijų skaičius ir nustatomas Koli fago indeksas. Maitinamųjų terpių sudėtis ir paruošimas. Mėsos-peptono agaro gaminimas. Į pagamintą buljoną pridedama 2% iš anksto išbrinkinto ir išplauto agaro ir virinama 30 min. Kocho katile 100o C arba 20 min. autoklave 120oC temperatūroje. Po to jis pašarminamas NaHCO3 iki silpnai šarminės (pagal lakmusą) reakcijos ir paprastai nefiltruotas išpilstomas į mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai užkemšami vatos kamščiais ir sterilizuojami 30 min. autoklave 120o C temperatūroje arba 3 dienas po 30 min. Kocho katile. Sausas maitinamasis agaras. Jis yra miltelių pavidalo. 20–50g miltelių įberiama į 1l distiliuoto vandens, ištirpinama, nustatomas reikiamas rūgštingumas ir nufiltruojama pro vatos filtrą. Filtratas išpilstomas į mėgintuvėlius ir sterilizuojamas 120o C temperatūroje 25–30 min. Endo terpė. Yra violetinės spalvos milteliai; laikomi šviesoje jie tampa nekokybiški. 40 g miltelių ištirpinama 1000 ml šalto distiliuoto vandens. Kaitinama 3–5 min. iki virimo. Karšta terpė perfiltruojama ir vėl kaitinama iki virimo. Atvėsinus maždaug iki 45–50o C išpilstoma į sterilias Petri lėkšteles. Su terpe Petri lėkštelės pradžiovinamos termostate. Terpė ruošiama prieš darbą. 1 lentelė Upių vandens kokybės klasifikacija Mikrobiologiniai kriterijai Raiškos vienetai Vandens kokybės klasės I II III IV V VI Koliforminės bakterijos sk./l <103 <104 <105 <106 <107 >107 Fekalinės koliforninės bakterijos sk./l <103 <5.104 <5.105 <5.106 >5.106 Enterokokai sk./ml <10 <100 <500 <2000 >2000 Heterotrofinė mezofilinė mikroflora sk./ml <500 <2000 <10000 <50000 >50000 Heterotrofinė psichrofilinė mikroflora sk./ml <3000 <10000 <30000 <200000 >200000 I klasė – labai švarus vanduo II klasė – švarus vanduo III klasė – mažai užterštas vanduo IV klasė – vidutiniškai užterštas vanduo V klasė – smarkiai užterštas vanduo VI klasė – labai smarkiai užterštas vanduo Gisso terpė su laktoze. 15 gr. miltelių ištirpinama 1 l distiliuoto vandens, virinama iki visiško agaro ištirpimo. Terpė perfiltruojama ir išpilstoma į mėgintuvėlius. Autoklave laikoma 110o C temperatūroje 20 min. Laktozės terpė su boro rūgštimi: 10 g peptono; 12,2 g – K2HPO4; 4,1 g – KH2PO4; 3,2 g – boro rūgšties; 5 g – laktozės. Visi komponentai ištirpinami 1 l distiliuoto vandens. Nustatoma terpės pH – 7,2–7,4. Terpė išpilstoma į mėgintuvėlius su plūdelėmis po 5 ml. Autoklave laikoma 112o C temperatūroje 12 min. KF terpė pagal Kennerą: 100 g – peptono; 2,5 g – NaCl; 5 g – mielių ekstrakto; 5 g – glicerofosfato; 10 g – maltozės; 0,5 g – laktozės; 0,2 g – natrio azido; 0,3 g – sodos; 10 g – agar agaro; 0,5 ml 1,5% bromkrezolpurpuro tirpalo; 500 ml distiliuoto vandens. Autoklave laikoma 1200 C temperatūroje 10 min. Ataušinus pridedama 2–3–5 trifenil-tetrazolchlorido 1% – 5 ml, pH 7,2–7,4. Literatūra 1. Ambrazienė Ž. Lietuvos TSR upių sanitariniai – mikrobiologiniai tyrimai. Disertacija. – Vilnius, 1973. 2. Корш Л. Е., Артемова Т. З. Ускоренные методы санитарно – бактериологического исследования воды. – Москва, 1978. 3. Гирина В. Н., Григорьева Л. В. Санитарно – бактериологическое исследование воды. – Москва, 1978. 4. Унифицированные методы исследования качества вод. Часть IV. – Москва, 1977. 5. Единые критерии качества вод. – Москва, 1982. 6. Абакумов В. А. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и дoнных отложений. – Ленинград, 1983. 7. Сидоренко Г. И. Методы санитарно-микробиологического исследования объектов окружающей среды. – Москва, 1978. 8. Черкес Ф. К., Богоявленская Л. Б., Бельская И. А. Микробиология. – Москва, 1986. 9. Государственные стандарты союза ССР. – Москва, 1984. 10. Беляев И. И. Санитарно-гигиенический контроль. – Москва, 1968. 11. Марголина Г. Л., Абакумов В. А. Методические указания по исследованию бактериопланктона для определения качества поверхностных вод суши. – Москва, 1977. 12. Sanitary conditions and bathing. Update 1992 08 14. 6. Vandens didelio toksiškumo nustatymo kiekybinis metodas naudojant Daphnia rūšies vėžiagyvius Bandymams naudojama rūšis Daphnia Magna Straus. Šis smulkus vėžiagyvis yra įprastinis stovinčių (nepratekančių), smarkiai eutrofuotų vandens baseinų, tvenkinių planktono gyventojas. D. magna yra alfa-mezosaprobinių vandenų, linkusių į polisaprobiškumą, atstovas. D. magna pakankamai jautrus sužalojimams, todėl, norint pasiekti gerų rezultatų, bandymo metu būtina, ypač perkeliant vėžiagyvius, laikytis atitinkamo atsargumo. Dideliu toksiškumu laikomas toks nutekamojo vandens (ar tiriamosios medžiagos tirpalo koncentracijos) toksiškumas, kai dafnijos žūsta arba nustoja judėti per laikotarpį nuo 10 min. iki 96 val. (4 paras). Chroniškas toksiškumas – toks, kai per 30 parų dafnijos žūsta arba sumažėja jų vaisingumas. Aparatūra Kristalizatoriai ar kiti indai (pavyzdžiui, stiklinė su lygiu dugnu), apie 150 ml ar didesnės talpos, pipetės su plačiais ir siaurais galais, akvariumai ar stikliniai indai, 5 l talpos, skirti dafnijoms kultivuoti, kolbos, 1–3 l talpos, skirtos dumbliams auginti, laikrodiniai stikliukai, dechloruotas vandentiekio vanduo, aeruotas purtyklėje ar naudojant kompresorių, skirtas praskiedimams ir dafnijoms auginti. Bandymų seka Paruošiama serija skirtingų bandomojo nutekamojo vandens (ar tiriamosios medžiagos tirpalo) praskiedimų: paprastai ruošiama švariuose ir sausuose induose, kurių bendras tūris 100 ml. Pradžioje orientacijai paruošiama keletas praskiedimų (100, 10, 1, 0,1%...), palyginamoji kontrolinė terpė – praskiedimo vanduo. Priklausomai nuo žuvusių organizmų kiekio per pirmąsias 24 bandymo valandas naudojamos mažesnės (tarpinės) nutekamojo vandens koncentracijos. Kiekvienos pasirinktos koncentracijos imami 2 arba 3 bandiniai; taip pat turi būti 2 arba 3 kontroliniai indai. Į kiekvieną indą įdedama 10 arba 20 sveikų vėžiagyvių, kurie yra vienodo dydžio ir neturi ketvirtosios vystymosi stadijos. Pipete su plačiu galu jie perkeliami ant laikrodinio stiklelio, siauro galo pipete nusiurbiamas vandens perteklius ir iš karto visas vėžiagyvių kiekis nuplaunamas atitinkamu tirpalu į bandymui skirtą indą taip, kad į paruoštą tirpalą nebūtų perpilta daug vandens, skirto praskiedimams. Pradinis vėžiagyvių skaičius bandomajame inde (10 ar 20) laikomas lygiu 100%. Šalia bandomųjų indelių, kuriuose yra vėžiagyviai bei skirtingos koncentracijos nutekamojo vandens ar tiriamosios cheminės medžiagos tirpalai, statomi 2–3 kontroliniai indeliai, kuriuose yra tas pats kiekis vėžiagyvių, įleistų į praskiedimams skirtą vandenį. Bandymų įvertinimas Užregistruojama staigi vėžiagyvių mirtis, praėjus 1, 4, 8, 24, 48 ir 96 valandoms, ir bandymas baigiamas. Kenksminga cheminių medžiagų koncentracija arba nutekamojo vandens praskiedimas užfiksuojamas tada, kai organizmai pasidaro ne tokie judrūs (ribotas judrumas) arba kai kurie egzemplioriai (ne daugiau kaip 20% viso kiekio) žūsta. Tai vadinamoji letalinė koncentracija 20 (Letal Concentration 20, LC20); ji yra griežtesnė už plačiai įvairiose standartinėse metodikose naudojamą LC50; LC50 – tai dažniausiai vartojamas dydis, kuriuo operuojama ir įvairiose kompiuterinėse toksiškumo įvertinimo biocenozei bei palyginimo tarp rūšių programose. Matyt, taip yra todėl, kad tradiciškai įvairių laboratorijų duomenų bankai yra sudaryti LC50 matavimo standarto pagrindu (žr.[2]). Norint nustatyti medžiagų (vandens) kenksmingumo grįžtamojo poveikio galimybę, organizmai iš kenksmingos koncentracijos po 96 (arba po 48, jei bandymas trumpas) valandų perkeliami į švarų praskiedimo vandenį. Jeigu žūsta 50% visų perkeltųjų organizmų skaičiaus, tokia koncentracija laikoma mirtina. Nekenksminga koncentracija laikoma tokia, kuriai esant bandomųjų organizmų elgesys yra visiškai normalus ir nesiskiria nuo jų elgesio palyginamojoje terpėje. Jeigu gautuosius rezultatus reikia statistiškai apdoroti, tai bandymas atliekamas tokiu būdu, kad vieno pasirinkto praskiedimo būtų mažiausiai 3 bandiniai. Rezultatai pateikiami lentelėje arba grafike, pavyzdžiui: 1 lentelė Dafnijų gyvybiškumo priklausomybė nuo fenolio koncentracijos vandenyje Band. Tūris Prask. Galut. Nr. (
  3. ml)X konc. (M ar %) 1 100 0 100% 2 100 10 10% TĘSINYS: Dafnijų gyvybiškumas po atitinkamo laiko (val.) 1 4 8 24 48 72 96 123 123 123 123 123 123 123 ABC ... ... ... ZYX ... ... ... Vidutinis aritmetinis gyvybiškumo dydis apskaičiuojamas šitaip: Vi ∑ (Vi-M)2 M= ——; σ = ——————- n n-1 čia M – vidutinis aritmetinis gyvybiškumas; σ – vidutinis kvadratinis nukrypimas; Vi – gyvų individų skaičius; 1 – po 24 val.; n – pakartojimų skaičius. 2 – po 48 val.; 3 – po 72 val. ir t.t. M (%) Pav.1. Daphnia Magna gyvybiškumo priklausomybė nuo fenolio koncentracijos vandenyje. Pastaba: 1 pav. abscisių ašyje gali būti patogiau atidėti koncentracijos logaritmą (lg C) – tada grafiko kreivės įgautų kitą pavidalą; tuo atveju LC50 arba LC20 būtų analogiškai apskaičiuoti iš grafiko. Standartinėje metodikoje LC50 (ar LC20) skaičiuojama po 4 parų (96 val.). Šių bandymų rezultatai naudojami maždaug įvertinti galimybei nuleisti nutekamuosius vandenis į vandens telkinius, t. y. norint apskaičiuoti, kiek kartų reikia praskiesti nutekamąjį vandenį, kad jo poveikis vandens telkinio organizmams nebūtų kenksmingas. Chroniško ir didelio toksiškumo bendrasis įvertinimas atliekamas remiantis šiais standartinėje metodikoje
(1)skelbiamais kriterijais (žr.2 lentelę). 2 lentelė Testuojamo vandens mėginių toksiškumo įvertinimas Balai Vandens bandinių charakteristika Biotestavimo rezultatai Biotestavimo trukmė 0 Neturi chroniško Nėra nukrypimų nuo kontrolinių 30 parų toksinio poveikio gyvybiškumo ir vaisingumo dydžių arba jie nežymūs 1 Veikia chroniškai Aiškūs nukrypimai nuo 30 parų toksiškai kontrolinių gyvybiškumo ir vaisingumo dydžių 2 Nelabai toksiškas Nukrypimo procentas nuo 96 val. dafnijų gyvybiškumo kontrolinio dydžio mažesnis negu 10% 3 Vidutinio tok- Nukrypimo procentas nuo Nuo 24 iki siškumo dafnijų gyvybiškumo dydžio 96 val. lyginant su kontroliniu didesnis negu 10% 4 Toksiškas Nukrypimo procentas nuo Nuo 1 val. dafnijų gyvybiškumo dydžio iki 24 val. lyginant su kontroliniu didesnis negu 10% 5 Ypač Nukrypimo procentas nuo Iki 1 val. toksiškas dafnijų gyvybiškumo dydžio lyginant su kontroliniu didesnis negu 10% Kitos standartinės toksiškumo bandymo sąlygos
  1. Dafnijos auginamos laboratorinėmis sąlygomis stikliniuose apie 5 l talpos akvariumuose (arba dideliuose kristalizatoriuose). Du kartus per savaitę indai pripildomi iki 1/3 šviežiu švariu vandeniu (aeruotu ar nusistovėjusiu) ir vieną kartą per savaitę nusiurbiamas prie jų dugno esantis vandens sluoksnis, pilnas įvairių teršalų. Vandeniui valyti galima panaudoti mažas sraiges. Dafnijos maitinamos kiekvieną dieną chlorelos dumblių kultūra, išauginta maistingajame tirpale (imama apie 20 ml į vatiniais tamponais uždengtas 1–3 l talpos kolbas). Be chlorelos davinio, rekomenduojama įlašinti keletą lašų praskiestų mielių. Maistingasis tirpalas chlorelai ruošiamas šitaip: 10 ml kalio nitrato (KNO3), 1ml magnio sulfato (MGSO
  2. 7H2O), 1 ml kalio hidrofosfato (K2HPO4), trys lašai geležies trichlorido (FeCl3), – visi tirpalai yra 1% koncentracijos; toks kiekis skirtas vienam litrui distiliuoto vandens.
  3. Vandens mėginių paėmimas. Iš vandens objektų biotestavimui vanduo semiamas laikantis tam tikrų reikalavimų (pavyzdžiui, TSRS reikalavimai išdėstyti standarte GOST 17.1.3.07-82), pagal kuriuos paimto biotestavimui vandens bandinių užšaldyti ir konservuoti negalima. Atvežti į laboratoriją bandiniai biotestuojami kiek galima skubiau: testuojamojo vandens temperatūra turi būti +180C –240C; šio vandens atsargas galima laikyti šaldytuve. Prieš biotestavimą, jei tai būtina, vandens bandiniai filtruojami per planktoninį (miltų sijojimo) tinkliuką Nr. 26-35 (arba leidžiama nusistovėti), kad neužsikimštų dafnijų filtravimo organai. Jei biotestuojama „chroniško“ eksperimento sąlygomis, tai tiriamasis vanduo turi būti keičiamas kas 2 paras (taip pat ir kontrolinių indų vanduo). Literatūra
  4. Методические указания по биотестированию сточных вод с использованием рачка Дафния магна. – Москва: В/О „Союзводпроект“ ОМПРиВП,
  6. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th edition. – Washington D. C.,
  8. Neumann E. über die Texicitat des Kupfersulfates für Daphnia magna. – „Kungl. Fisiografiska. Sallskapets“, 1933, – S.
  10. Zelinka M., Marvan P. Toxicita odpadnich vod. In: Petru A. Promyslove odpadni vody. SNTL. – Praha,
  11. P.299-
  13. СЭВ. Совещание руководителей водохозяйственных органов стран СЭВ. Унифицированные методы исследования качества вод. Методы биологического анализа вод (Часть III). – Москва,
  15. Vandens toksiškumo nustatymas naudojant E. coli bakterijas Maitinamosios terpės sudėtis ir paruošimas
  16. Bakterijos kamienui palaikyti naudojamas standartinis mėsos peptono agaras.
  17. Skysta terpė bakterijų kultivavimui: peptonas – 10,0 g; laktozė – 5 g; 1,5% bromtimolo; mėlynės vandeninis tirpalas – 10,0 ml; vandentiekio vanduo – 1000 ml. Komponentai tokia seka, kokia pateikta, ištirpinami vandenyje (išskyrus indikatorių) ir mišinys pakaitinamas iki virimo, pH – 7,4–7,
  18. Filtruojama per popierinį filtrą ir pridedamas indikatorius. Terpė sterilizuojama virš garų. Bandymo eiga ir rezultatų įvertinimas Bandymas atliekamas 300 ml Erlenmejerio kolbose, terpės pilama 50 ml. Priklausomai nuo to, kiek kolbų bus naudojama bandyme, steriliai nupilamas reikalingas laktozinio buljono kiekis (skysta terpė) ir inokuliuojama 5–10 lašų į 1 l terpės E. coli suspensijos, paruoštos iš 24 val. amžiaus kultūros, nuimtos nuo agaro. Gerai išmaišius terpė išpilstoma į kolbas po 50 ml. Pridedama tiriamosios medžiagos, prieš tai nupylus tokį kiekį terpės, kad nepasikeistų terpės tūris (jis būtų 50 ml). Pageidautina naudoti koncentruotesnius tirpalus, kad reikėtų pridėti kiek galima mažesnius tiriamosios medžiagos kiekius. Nustatoma terpės pH 7,4–7,6 ribose. Terpė esti žalios spalvos. Kultivuojama 24 val. 37o C temperatūroje. Jeigu tiriamoji medžiaga sunkiai tirpsta vandeninėje terpėje ir gaunama suspensija arba emulsija, tai kultivuojant naudojamas kratytuvas. Jeigu tiriamojoje medžiagoje toksinių medžiagų nėra, laktozė E. coli bakterijų yra suskaldoma, o padidėjus rūgštingumui, pH nukrinta iki 4,0–5,0, todėl terpės spalva iš žalios pasikeičia į geltoną. Kai yra toksinių medžiagų, laktozės skaldymas slopinamas, o pH ir terpės spalva nesikeičia ir išlieka panaši kaip kontrolinėje kolboje, kurioje tiriamosios medžiagos nėra. Literatūra Совет экономической взаимопомощи. Совещание руководителей водохозяйственных органов стран – членов СЭВ. – Унифицированные методы исследования качества вод. Часть III. Методы биологического анализа вод. – 108–111 с.
  19. Toksiškumo nustatymo bioliuminescenciniu testu metodika Ląstelių suspensijos paruošimas a) Pradinė suspensija Lofilizuotos bakterinės kultūros (Photobacterium phosphoreum) flakonėlis suspenduojamas 1 ml 2 % NaCl, prieš tai atšaldžius iki +5o C, po to praskiedžiama iki 10 ml 3% NaCl tirpalu ir paliekama 1 val. +20o C temperatūroje. Suspensija išlieka stabili keletą dienų. b) Darbinė suspensija 1 ml pradinės suspensijos atskiedžiama iki 10 ml 3% NaCl tirpalu. Suspensija stabili tik vieną dieną. Matavimų atlikimas Matavimai atliekami liuminometru „Emilite – 1003“. Imama 0,9 ml darbo suspensijos ir supilama į kiuvetę, įpilama 0,1 ml 3% NaCl tirpalo. Turinys sumaišomas ir matuojama bioliuminescencija. Matuojant signalas turi būti 500–1500 mV ribose, jei matavimas atliekamas liuminometru „Emilite 1002“. Jeigu signalas stipresnis, rekomenduojama ląstelių suspensiją atskiesti 3% NaCl tirpalu. Matuojant toksiškumą, vietoj 0,1 ml NaCl tirpalo prie ląstelių suspensijos pridedama 0,1 ml tiriamojo bandinio ir fiksuojamas laikas sekundometru. Švytėjimo intensyvumo kitimas registruojamas savirašiu arba užrašoma tam tikrais laiko tarpais, pavyzdžiui: 5, 15 ir 30 min. Skaičiuojant rekomenduojama naudotis trijų bandinių vidurkiu. Bandinio pH turi būti 7,0 ir joninė jėga turi atitikti 3% NaCl tirpalą. Toksiškumo įvertinimas Bioliuminescencijos slopinimas išreiškiamas gama funkcija: Io – I(t) G(t) = ————; I(t) čia Io – I(t) – švytėjimo intensyvumo kritimas per atitinkamą laikotarpį (5; 15; 30 min.), I(t) – liekamasis švytėjimo intensyvumas per laiko trukmę (t) pridėjus tiriamojo pavyzdžio. Vertinant bandinio toksiškumą, naudojama šitokia gama funkcijos skalė: G = 0 – netoksiškas, G < 0,3 – silpnai toksiškas (švytėjimo slopinimas iki 25%), G = 0,3–3,0 – toksiškas (švytėjimo slopinimas nuo 25 iki 75%), G > 3,0 – labai toksiškas (švytėjimo slopinimas 75% ir daugiau). Apibūdinant įvairius produktus, naudojama reikšmė EC50 – tai tokia bandinio koncentracija (mg/l), kai švytėjimas nuslopinamas 50% per 15 min. Esant EC50, G=1,
  20. EC50 reikšmė paprastai koreliuoja su LD50 reikšme. Nustatant EC50 reikšmę, matuojama keletas bandinio praskiedimų ir sudaroma kalibracinė kreivė: log (G) priklausomybė nuo log bandinio koncentracijos. Literatūra
  21. Кондратьева Е. Н. – Светящиеся бактерии. – Изд-во „Наука“ АН СССР, Новосибирск,
  23. Оборудование и тест – системы для био – и хемилюминесцентного анализа. – Москва: БиоХимМак,
  25. Bittom G., Dutka B. J. – Toxicity Testing Using Miezoorganisms, V. I.
  26. – p.57–
  27. ______________

🔗 Į oficialų šaltinį

DI paaiškinimas pagal oficialų įstatymo tekstą. Orientacinis, nepakeičia teisinės konsultacijos.