| Europaius

Trumpai

Šis teisės aktas patvirtina aplinkos apsaugos normatyvinį dokumentą LAND 45-2001, kuriame nustatomi cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai. Jis skirtas įvertinti cheminių medžiagų poveikį aplinkai, ypač vandens ir dirvožemio ekosistemoms.

Ką jis reguliuoja

Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksikologinių savybių tyrimo metodus.
Toksiškumo vandens ir dirvožemio ekosistemoms nustatymą.
Biologiškai skaidomų medžiagų savybių, biocheminio ir cheminio deguonies suvartojimo nustatymą.
Ūminio letalinio toksiškumo gėlavandenėms žuvims nustatymo metodiką.

Kam jis skirtas

Aplinkos ministerijos Jungtiniam tyrimų centrui, atsakingam už papildymų rengimą.
Laboratorijoms ir specialistams, atliekantiems cheminių medžiagų ekotoksiškumo tyrimus.

Pagrindiniai punktai

Patvirtinamas dokumentas LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“.
Iki 2003-04-01 ir 2003-11-01 turi būti parengti ir patvirtinti LAND 45-2001 papildymų projektai, perkeliant Komisijos direktyvų 98/73/EC ir 2001/59/EC nuostatas.
Ūminis toksiškumas žuvims nustatomas kaip medianinė letalinė koncentracija (LC50), kai per nurodytą laikotarpį žūsta 50% žuvų populiacijos.
Ribinis bandymas atliekamas su 100 mg/litre bandomosios medžiagos koncentracija, o pilnos apimties bandyme žuvys veikiamos 96 valandas.
Kontroliniuose bandymuose mirtingumas neturi būti didesnis kaip 10%, o ištirpusio deguonies koncentracija – ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės.
Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose.
Žuvys turi būti laikomos bent 12 parų prieš bandymą, o jų mirtingumas per septynias paras prieš bandymą neturi viršyti 10%.
Bandymui naudojamos žuvys turi būti adaptuotos bent septynias paras vandenyje, atitinkančiame bandymo sąlygas.
Vienai koncentracijai naudojama ne mažiau kaip 7 gyvūnai, o bandomoji koncentracija turi apimti ne mažiau kaip penkias koncentracijas, kurios skiriasi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 2,2.

Įstatymo tekstas

LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 45-2001 PATVIRTINIMO 2002 m. sausio 3 d. Nr. 4 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) trečiojo skirsnio 6 straipsniu „Cheminių medžiagų ir preparatų tyrimas“, Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų aplinkai, savybių tyrimo tvarka (Žin., 2001, Nr. 3-60): 1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinį dokumentą LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“ (pridedama). 2. Pavedu Aplinkos ministerijos Jungtiniam tyrimų centrui, atsižvelgiant į Tarybos direktyvą 67/458/EC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą bei ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų derinimo su Komisijos direktyvų 98/73/EC ir 2001/59/EC pakeitimais, parengti ir pateikti tvirtinimui Lietuvos aplinkos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 papildymų projektus, perkeliant: Komisijos Direktyvos 98/73/EC nuostatas – iki 2003-04-01: (C13) Biokoncentravimas: Testas žuvims srovės pratekėjimo sąlygomis; Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-04-01: (C14) Žuvų jauniklių augimo testas; (C15) Trumpalaikio toksiškumo testas žuvims embriono ir trynio maišelio stadijose; (C20) Daphnia magna reprodukcijos testas; Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-11-01: (C16) Bitės – Oralinis toksiškumo testas; (C17) Bitės – Ūmus kontaktinio toksiškumo testas; (C18) Adsorbcijos/desorbcijos statinis pusiausvyros metodas; (C19) Adsorbcijos koeficiento nustatymas (KOC) dirvožemyje ir aktyviajame dumble aukštos skyrimo galios skystine chromatografija. 3. Aplinkos ministerijos informacijos kompiuterinėje sistemoje vadovautis reikšminiais žodžiais „valdymo sistema“, „cheminės medžiagos“. Aplinkos Ministras Arūnas Kundrotas PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2002 m. sausio 3 d. įsakymu Nr. 4 CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI LAND 45-2001 BENDRASIS ĮVADAS Šiame normatyviniame dokumente pateikiami metodai skirti cheminių medžiagų arba preparatų ekotoksikologinių savybių tyrimams atlikti. Šių tyrimų tikslas: – toksiškumo vandens ekosistemoms nustatymas; – biologiškai skaidomų medžiagų savybių nustatymas; – biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas; – cheminio deguonies suvartojimo nustatymas; – toksiškumo dirvožemio ekosistemoms nustatymas. Žemiau aprašyti cheminių medžiagų ir preparatų tyrimų metodai parengti vadovaujantis Europos Tarybos direktyva 67/548/EEC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų, įstatymų papildomų aktų ir administracinių nuostatų derinimo (Council Directive of 27 June 1967 on the approximation of the laws reguliations and administrative provisions relating to the classification packaging and labelling of dangerous substances (67/548/EEC)). Šiame normatyviniame dokumente pateikti ekotoksiškumo tyrimo metodai neapima: – ilgalaikio toksiškumo tyrimo su Daphnia magna; – ilgalaikio toksiškumo tyrimo su žuvimis; – bandymų su aukštesniaisiais augalais. Šių savybių nustatymui parengti metodai bus išleisti dokumentų, skirtų technikos pažangai, pavidalu. Iki to laiko turi būti taikomi atitinkami, tarptautiniu mastu pripažinti ir patvirtinti metodai. ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS ŽUVIMS 1. metodas 1.1. ĮVADAS Šio metodo tikslas yra nustatyti bandomosios medžiagos ūminį letalinį toksiškumą gėlavandenėms žuvims. Norint sėkmingiau pasirinkti tinkamiausią bandymo metodą (stacionarų, pusiau stacionarų ar pratekėjimo sąlygomis), kad visą bandymo laiką būtų užtikrinta pakankamai pastovi bandomosios medžiagos koncentracija, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą. Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą, Pow). 1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Ūminis toksiškumas yra pastebimas neigiamo poveikio reiškinys, sukeltas bandomajai medžiagai veikiant trumpą laiką (kelias paras). Šiame bandyme ūminis toksiškumas išreikiamas medianine letaline koncentracija (LC50) – tokia medžiagos koncentracija vandenyje, kai per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, žūsta 50% bandyme naudotos žuvų populiacijos. Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra išreiškiama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg). 1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymo sąlygomis naudotų rūšių atsakas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga. Šiam bandymui etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos. 1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Ribinis bandymas atliekamas su 100 mg/litre bandomosios medžiagos koncentracija, siekiant parodyti, kad LC50 yra didesnė už šią koncentraciją. Atliekant pilnos apimties bandymą, žuvys 96 valandas veikiamos bandomąja medžiaga, įdėta į vandenį tam tikrame koncentracijų intervale. Mirtingumo duomenys turi būti užrašomi ne mažiau kaip kas 24 valandas ir, jei įmanoma, kiekvienai stebėjimo laiko atkarpai skaičiuojama koncentracija, kuriai esant žūsta 50% žuvų (LC50). 1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso bandymo metodui. Mirtingumas kontroliniuose bandymuose bandymo pabaigoje neturi būti didesnis kaip 10% (arba viena žuvis, jei naudojama mažiau kaip dešimt žuvų). Ištirpusio deguonies koncentracija visą laiką turi būti ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės. Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose. Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti. Medžiagų, kurios: (

i)mažai tirpsta bandymo terpėje, arba (
ii)gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba (iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose, pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta tirpale (arba, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymams skirtų žuvų įleidimą. Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai. pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu. 1.6. bandymų METODO aprašymas Galima naudoti trijų tipų procedūras: Statinis bandymas (stacionariomis sąlygomis): Toksiškumo bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka (tirpalai visą bandymą nėra atnaujinami, lieka tie patys). Pusiau statinis bandymas (pusiau stacionariomis sąlygomis): Bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka, tačiau per ilgesnį laiko tarpą (pvz., kas 24 valandas) daromas reguliarus dozuojamasis bandomojo tirpalo atnaujinimas. Bandymas pratekėjimo sąlygomis: Toksiškumo bandymas, kai vanduo bandymo talpose atnaujinamas visą laiką, bandomąją medžiagą tiekiant su vandeniu, naudojamu bandymo terpei atnaujinti. 1.6.1. Reagentai 1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2. Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinama praskiedimo vandenyje tiesiogiai. Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms arba kurių didelis Pow, arba toms, kurios labiau sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) labiau užtikrinti galimybę pasiekti soties/pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui ir t.t.). Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, taip pat kontrolinės žuvys turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti parinkta mažiausia įmanoma ir turi būti ne didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės. Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje. 1.6.1.2. Laikymo ir skiedimo vanduo Galima naudoti geriamąjį vandentiekio vandenį (neužterštą potencialiai kenksmingos koncentracijos chloru, sunkiaisiais metalais ar kitomis medžiagomis), geros kokybės gamtinį vandenį arba skiedimo vandenį (žr. 1 priedą). Geriausiai tinka vanduo, kurio bendrasis kietumas yra nuo 10 iki 250 mg/litre (skaičiuojant CaCO3) ir kurio pH yra nuo 6,0 iki 8,5. 1.6.2. Aparatūra Visa aparatūra turi būti pagaminta iš chemiškai inertiškų medžiagų: – automatinio skiedimo sistema (bandymui pratekėjimo sąlygomis), – deguonies matuoklis, – įranga vandens kietumui nustatyti, – atitinkama termostatavimo aparatūra, – pH-metras. 1.6.3. Bandymams skirtos žuvys Žuvys turi būti sveikos ir neturėti jokių matomų apsigimimo požymių. Žuvų rūšį reikia rinktis remiantis praktiniais kriterijais, pvz., lengvumu žuvis gauti ištisus metus ir jas prižiūrėti, patogumu bandyti, santykiniu jautrumu cheminėms medžiagoms, bei kiek nors susijusiais ekonominiais, biologiniais ar ekologiniais faktoriais. Be to, renkantis žuvų rūšis, reikia nepamiršti apie gautų duomenų palyginamumo būtinybę ir esamą tarptautinį derinimą (1 nuoroda). Žuvų, kurios rekomenduojamos naudoti šiame bandyme, sąrašas pateiktas 2 priede. Tinkamiausios rūšys yra danija ir vaivorykštinis upėtakis. 1.6.3.1. Laikymas Geriausia, jei bandymų žuvys būtų vienos populiacijos ir panašaus ilgio bei amžiaus. Žuvys turi būti laikomos bent 12 parų tokiomis sąlygomis: įkrova: atitinkanti sistemą (su recirkuliavimu ar su pratekėjimu) ir žuvų rūšį, vanduo: žr. 1.6.1.2, šviesa: kasdienis apšvietimas nuo 12 iki 16 valandų, ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažiau kaip 80% oro soties vertės, maitinimas: tris kartus per savaitę ar kasdieną, nutraukiant maitinimą prieš 24 valandas iki bandymo pradžios. 1.6.3.2. Mirtingumas Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi tokie kriterijai: – populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%: visa partija atmetama, – populiacijos mirtingumas 5–10%: papildomai laikoma dar septynias paras. Jei mirtingumas nedidėja, partija priimama, priešingu atveju turi būti atmesta, – populiacijos mirtingumas mažesnis kaip 5%: partija priimama. 1.6.4. Adaptavimas Prieš naudojimą visas žuvis bent septynias paras būtina laikyti vandenyje, kurio kokybė ir temperatūra atitinka bandymo sąlygas. 1.6.5. Bandymo eiga Prieš galutinį bandymą gali būti atliekamas koncentracijų intervalo nustatymo bandymas. Atliekamas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia arba jei tai svarbu, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga. Pagal tai, kokios yra bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės, turi būti pasirinktas statinis bandymas, pusiau statinis ar pratekėjimo sąlygomis, kad būtų įvykdyti kokybės kriterijai. Žuvys veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta žemiau: – trukmė: 96 valandos, – gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 7 vienai koncentracijai, – talpos (indai): tinkamo tūrio, atsižvelgiant į rekomenduotą įkrovą, – įkrova: didžiausia rekomenduota bandymo statinėmis ir pusiau statinėmis sąlygomis įkrova – 1 g/litre; sistemoms su pratekėjimu priimtina didesnė įkrova, – bandomoji koncentracija: ne mažiau kaip penkios koncentracijos, kurios skiriasi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 2,2, bei, kiek įmanoma, apima mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100%, – vanduo: žr. 1.6.1.2, – šviesa: kasdienis apšvietimas, kurio trukmė nuo 12 iki 16 valandų, – temperatūra: tinkama rūšiai (2 priedas), tačiau konkrečiame bandyme palaikoma ± 1°C tikslumu, – ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės pasirinktos temperatūros sąlygomis, – maitinimas: jokio. Žuvys tikrinamos iš pradžių po 2–4 valandų, po to – ne rečiau kaip kas 24 valandas. Žuvis laikoma negyva, jei, liečiant uodeginį peleką (caudal peduncle), ji nereaguoja ir nesimato jokių kvėpavimo judesių. Po apžiūros negyvos žuvys pašalinamos ir užrašomas negyvų žuvų skaičius. Užrašomi visi pastebimi pakitimai (pvz., pusiausvyros netekimas, plaukimo pobūdžio pasikeitimas, kvėpavimo funkcijos, pigmentacijos pokyčiai ir t.t.). Ištirpęs deguonis, pH ir temperatūra turi būti matuojami kiekvieną dieną. Ribinis bandymas Ribinis bandymas atliekamas ta pačia tvarka kaip pilnos apimties bandymas, bet naudojant 100 mg/litre koncentraciją, siekiant įrodyti, kad LC50 yra didesnė už šią koncentraciją. Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymui skirtame vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą). Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 7–10 žuvų, toks pat žuvų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Pagal binominę teoriją, jei bandyme su 10 žuvų mirtingumas yra nulinis, pasikliovimo tikimybė, kad LC50 yra didesnė nei ribiniame bandyme naudota koncentracija, yra 99,9%. Mirtingumo nebuvimas, naudojant 7, 8 ar 9 žuvis, užtikrina bent 99% pasikliovimo tikimybę, kad LC50 yra didesnė nei naudota koncentracija. Jei mirtingumo atvejai pasitaiko, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. Jei stebimi subletaliniai padariniai, tai turi būti užrašyta ataskaitoje. 2. DUOMENYS IR VERTINIMAS Kiekvienam laikotarpiui, kuriam buvo užrašyti rezultatai (24, 48, 72 ir 96 valandos), logaritminiame tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo, nustatyto kiekvienam rekomenduotam veikimo laikotarpiui, procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti LC50 ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas, šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno arba daugiausia iki dviejų reikšmingų skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21). Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės polinkis yra per status, kad būtų galima skaičiuoti LC50, pakanka grafinio šios vertės įverčio. Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% mirtingumo vertės, šių dviejų verčių pakanka nustatyti intervalui, į kurį patenka LC50. Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatus interpretuoti reikia atsargiai. 3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – informacija apie bandymų žuvis (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas, dydis ir kiekvienai bandomajai koncentracijai naudotų žuvų skaičius); – skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, kietumas, temperatūra); – mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas; – visų pagalbinių medžiagų koncentracijos; – naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą naudotos koncentracijos bandomajame tirpale; – jei daroma cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai; – ribinio bandymo, jei jis buvo daromas, rezultatai; – taikytos bandymo metodikos pasirinkimo priežastys ir detalės (pvz., stacionariomis sąlygomis, pusiau stacionariomis sąlygomis, dozavimo srautas, pratekėjimo srautas, ar buvo naudojamas aeravimas, žuvų įkrova ir t.t.); – bandymų įrangos aprašymas; – apšvietimo režimas; – ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra kas 24 valandas; – įrodymas, kad kokybės kriterijai įvykdyti; – lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui pateiktas bendras mirtingumas kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia); – atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje; – jei įmanoma, LC50 vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo ribomis); – statistinės metodikos, taikytos LC50 vertėms nustatyti; – gauti rezultatai, jei naudota etaloninė medžiaga; – didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant mirtingumas bandymo laikotarpiu yra nulinis; mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% mirtingumą. 4. NUORODOS

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C

(81)30 final and updates.

(2)AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985.

(3)AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow – Through methods – NFT 90-305 June 1985.

(4)ISO 7346/1, /2 and /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method.

(5)Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974.

(6)DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L

(15).

(7)JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.

(8)NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980.

(9)Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.

(10)Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978.

(11)Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Pan IV, 16 March 1979.

(12)Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.

(13)Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.

(14)Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph. P. und Boje. R. Ökotoxikologie Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(15)Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.

(16)Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(17)Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(18)Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(19)Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84.

(20)Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA. 1 priedas Atkurtasis vanduo (Skiedimo vanduo) Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos. Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių. Pradiniai tirpalai CaCl2×2H2O (kalcio chloridas, dihidratas): 11,76 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. MgSO4×7H2O (magnio sulfatas, heptahidratas): 4,93 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas): 2,59 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. KCl (kalio chloridas): 0,23 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Atkurtasis skiedimo vanduo Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir praskiedžiama vandeniu iki 1 litro. Aeruojama tol, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties vertę (OSV). pH turi būti 7,8 ± 0,2. Prireikus pH reguliuojamas NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi). Taip paruoštas skiedimo vanduo laikomas padėtas 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti. Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre (5 mgekv/l). Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis – 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre. Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių. 2 priedas Žuvų rūšys, kurias rekomenduojama naudoti bandymuose: Rekomenduojamos rūšys Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendras kūno ilgis, cm Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) nuo 20 iki 24 3,0 ± 0,5 Dryžuotasis danio Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Rainė nuo 20 iki 24 5,0 ± 2,0 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) nuo 20 iki 24 6,0 ± 2,0 Paprastasis karpis Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae nuo 20 iki 24 3,0 ± 1,0 (Tomminck and Schlegel 1850) Red killifish Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae (Peters 1859) Gupi nuo 20 iki 24 3,0 ± 1,0 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) nuo 20 iki 24 5,0 ± 2,0 (Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) nuo 12 iki 17 6,0 ± 2,0 (Walbaum 1988) Margasis upėtakis Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) nuo 20 iki 24 6,0 ± 2,0 Golden orfe Lentelėje nurodytas žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandymams skirti gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų. 3 priedas Koncentracija: mirtingumo dalis procentais LC50 nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS DAFNIJOMS 1. metodas 1.1. ĮVADAS Šio bandymo tikslas yra nustatyti tiriamosios medžiagos medianinę efektyvią koncentraciją (EC50) sukeliančią pusės Daphnia magna individų nejudrumą gėlame vandenyje. Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, stabilumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą. Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą). 1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Direktyvos reikalavimas dėl dafnijas veikiančios LC50 laikomas įvykdytu, jei EC50 nustatoma tiksliai šiame bandymo metode aprašytomis sąlygomis. Šiame bandyme ūminis toksinis poveikis išreikiamas medianine efektyvia judrumo slopinimo (imobilizavimo) koncentracija (EC50). Tai koncentracija, išreikšta pradine koncentracijos verte, kurią naudojant per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, slopinamas 50% bandyme naudotų Daphnia organizmų judrumas. Imobilizavimas: Imobilizuotais laikomi tie gyvūnai, kurie negali plaukti 15 sekundžių laikotarpiu po švelnaus bandymų indo pajudinimo. Visos bandomosios medžiagos koncentracijos yra pateikiamos mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg). 1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga. EEC tarplaboratorinio lyginimo bandymo rezultatų, gautų keturioms medžiagoms, suvestinė pateikta 2 priede. 1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Dafnijos 48 valandas veikiamos bandomąja medžiaga (įdėta į vandenį) tam tikrame koncentracijų intervale. Jei bandymo trukmė mažesnė, tai turi būti patvirtinta bandymų ataskaitoje. Kai kitos bandymų sąlygos yra identiškos ir kai bandomoji medžiaga naudojama atitinkamame koncentracijų intervale, vidutinis poveikio į dafnijos gebėjimą plaukti laipsnis dėl skirtingos bandomosios medžiagos koncentracijos yra taip pat nevienodas. Bandymo pabaigoje negalinčių plaukti dafnijų procentinė dalis, esant skirtingoms koncentracijoms, bus nevienoda. Koncentracijos, kurias naudojant imobilizavimas nulinis arba 100%, gaunamos tiesiogiai, remiantis bandymo metu darytais stebėjimais, tuo tarpu 48 valandų EC50 skaičiuojama, jei tai įmanoma. Šiame metode naudojama statinė sistema, veikimo laikotarpiu bandomieji tirpalai neatnaujinami. 1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir pilnos apimties bandymo metodui. Bandymo pabaigoje imobilizavimas kontroliniuose bandymuose neturi būti didesnis kaip 10%. Kontrolinėse grupėse bandymams panaudoti Daphnia gyvūnai neturi būti pakibę vandens paviršiuje. Pageidautina, kad ištirpusio deguonies koncentracija bandymų induose visą bandymo laiką turi būti ne mažesnė kaip 3 mg/l. Tačiau jokiomis aplinkybėmis ištirpusio deguonies koncentracija neturi būti mažesnė kaip 2 mg/l. Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose. Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti. Medžiagų, kurios: (

i)mažai tirpsta bandymo terpėje, arba (
ii)gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba (iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose, pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, išmatuota tirpale (ar, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymų organizmų įleidimą. Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti atliekami tolesni matavimai. pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu. 1.6. bandymų METODO aprašymas 1.6.1. Reagentai 1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2. Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinta praskiedimo vandenyje tiesiogiai. Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms ar kurių didelis Pow, ar toms, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) užtikrinti sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t.t.). Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, ir papildomai kontrolinės dafnijos turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu būdu neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės. Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei pH vertė turi polinkį žymiai pasikeisti, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HCl ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija arba bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje. 1.6.1.2. Bandymų vanduo Šiame bandyme naudojamas atkurtasis vanduo (žr. 1 priedą ir 2 nuorodą: ISO 6341). Daphnia veisimui rekomenduojama naudoti vandenį, kurio kokybė (pH, kietumas) būtų panaši į bandyme naudojamo vandens kokybę, kad prieš bandymą nereikėtų aklimatizuoti. 1.6.2. Aparatūra Turi būti naudojama įprasta laboratorinė aparatūra ir įranga. Pageidautina, kad su bandomaisiais tirpalais kontaktuojanti įranga būtų pagaminta vien tik iš stiklo: – deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kitokiu įtaisu, tinkamu matuoti ištirpusį deguonį mažo tūrio bandiniuose), – atitinkama termostatavimo aparatūra, – pH-metras, – vandens kietumo nustatymo įranga. 1.6.3. Bandomieji organizmai Daphnia magna yra labiausiai bandymui naudotina rūšis, nors leidžiama naudoti ir Daphnia pulex. Bandymų gyvūnų amžius bandymo pradžioje turi būti ne didesnis kaip 24 valandos, jie turi būti užauginti laboratorijoje, nesirgti akivaizdžiomis ligomis ir būti žinomos kilmės (pvz., veisimo sąlygos, bet koks pradinis apdorojimas ir t.t.). 1.6.4. Bandymų procedūra Siekiant gauti informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą, prieš galutinį bandymą gali būti daromas intervalo nustatymo bandymas. Daromas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga. Dafnijos veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta toliau: – trukmė: geriau 48 valandos, – gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 20 gyvūnų kiekvienai bandomajai koncentracijai, pageidautina, kad jie būtų padalyti į keturias grupes po penkis gyvūnus ar į dvi grupes po dešimt gyvūnų, – įkrova: kiekvienam gyvūnui turi tekti ne mažiau kaip 2 ml bandomojo tirpalo, – bandomoji koncentracija: bandomasis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat dafnijų įleidimą, ir geriau būtų nenaudoti jokio tirpiklio, išskyrus vandenį. Koncentracija parenkama pagal geometrinę progresiją, santykis tarp gretimų koncentracijų turi būti ne didesnis kaip 2,2. Kartu su kontroliniais bandiniais turi būti išbandytos koncentracijos, kuriose imobilizacija po 48 valandų yra 0 ir 100%, ir intervalas tarpinius imobilizacijos laipsnius atitinkančių koncentracijų, leidžiančių skaičiuoti 48 valandų EC50, – vanduo: žr. 1.6.1.2, – šviesa: šviesos ir tamsos ciklas pasirenkamas laisvai, – temperatūra: bandymų temperatūra turi būti nuo 18 iki 22°C, tačiau kiekviename atskirame bandyme ji turi būti palaikoma ± 1°C ribose, – aeravimas: bandomieji tirpalai neturi būti aeruojami burbulais, – šėrimas: šerti neleidžiama. Kontrolinių ir bandomųjų tirpalų pH ir deguonies koncentracija turi būti matuojama bandymo pabaigoje; bandomųjų tirpalų pH vertė turi būti nekeičiama. Lakios medžiagos turi būti bandomos visiškai užpildytuose uždaruose induose, kurie būtų pakankamai dideli, kad juose negalėtų pritrūkti deguonies. Dafnijos tikrinamos ne vėliau kaip po 24 veikimo valandų ir dar kartą po 48 valandų. Ribinis bandymas Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą, esant 100 mg/litre koncentracijai, siekiant parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos pasiekti bandymų vandenyje negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas esant koncentracijai, lygiai medžiagos tirpumui (arba esant didžiausiai koncentracijai, kurioje dar gali susidaryti patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą). Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 20 dafnijų, padalytų į dvi ar keturias grupes, tas pat dafnijų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Jei pasitaiko imobilizacijos atvejų, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. 2. DUOMENYS IR VERTINIMAS Kiekvienam laikotarpiui, kuriam rezultatai buvo užrašyti (24 ir 48), logaritminiame-tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti EC50 ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas; šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno ar daugiausia iki dviejų reikšminių skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21). Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės nuožulnumas yra per status, kad būtų galima skaičiuoti EC50, pakanka grafinio šios vertės įverčio. Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% imobilizavimo vertės, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalui, į kurį patenka EC50. Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai. 3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – informacija apie bandymui panaudotą organizmą (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas ar šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, auginimo metodas, įskaitant maisto šaltinį, rūšį ir kiekį, maitinimo dažnį); – skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, temperatūra, kietumas); – mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas; – visų pagalbinių medžiagų koncentracija; – naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą bandomajame tirpale; – jei atlikta cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai; – ribinio bandymo, jei jis buvo atliktas, rezultatai; – bandymų įrangos aprašymas; – apšvietimo režimas; – ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra; – įrodymai, kad kokybės kriterijai įvykdyti; – lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam nustatymo laikotarpiui (24 ar 48 valandos) pateiktas bendras imobilizuotų dafnijų skaičius kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia); – atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje; – jei įmanoma, EC50 vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo riba); – statistinės metodikos, taikytos EC50 vertėms nustatyti; – jei panaudota etaloninė medžiaga, gauti rezultatai; – didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant imobilizavimas bandymo laikotarpiu yra nulinis; – mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% imobilizavimą. 4. NUORODOS

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C

(81)30 final and updates.

(2)International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989.

(3)AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crusiacea) NFT 90 301 (January 1983).

(4)Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.

(5)DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (LII).

(6)Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978.

(7)Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.

(8)Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.

(9)Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.

(10)Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.

(11)Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50 US EPA. 1 priedas Atkurtasis vanduo Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys (pagal ISO 6341) Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos. Vanduo turi būti geros kokybės, distiliuotas vanduo ar dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių. Pradiniai tirpalai CaCl2 2H2O (kalcio chloridas, dihidratas): 11,76 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. MgSO4 7H2O (magnio sulfatas, heptahidratas): 4,93 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas): 2,59 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. KC1 (kalio chloridas): 0,23 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Atkurtasis skiedimo vanduo Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir bendras tūris papildomas vandeniu iki 1 litro. Skiedimo vanduo aeruojamas, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties lygį. Paruošto skiedimo vandens pH turi būti 7,8 ± 0,2. Jeigu yra būtina, pH vertė koreguojama NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi). Taip paruoštas skiedimo vanduo paliekamas stovėti 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti. Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre. Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis lygus 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre. Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių. 2 priedas EEC tarplaboratorinio palyginamojo bandymo (ring test), atlikto 1978 (taip pat cituojamo 2 nuorodoje), rezultatų suvestinė Įspėjimas: šio tarplaboratorinio palyginamojo bandymo tikslas buvo nustatyti 24 valandų EC50. Naudota medžiaga: 1) Kalio bichromatas 2) Tetrapropilbenzeno sulfoninė rūgštis 3) Tetrapropilbenzeno natrio sulfonatas 4) Kalio 2,4,5-trichlorfenoksiacetatas Medžiaga Dalyvavusių laboratorijų skaičius Skaičiavimams naudotų rezultatų skaičius 24 h EC50, mg/l,vidutinė vertė 1 46 129 1,5 2 36 108 27 3 31 84 27 4 32 72 770 3 priedas Koncentracijos pavyzdys: imobilizavimo procentinė dalis EC50 nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių Imobilizacija,% DUMBLIŲ SLOPINIMO BANDYMAS 1. metodas 1.1. ĮVADAS Šio bandymo tikslas yra nustatyti pasekmes, tiriamajai medžiagai veikiant vienaląsčių žaliųjų dumblių rūšių augimą. Per palyginti trumpai (72 valandas) trunkančius bandymus galima įvertinti poveikį kelioms kartoms. Šį metodą galima pritaikyti įvairioms vienaląsčių dumblių rūšims, tokiu atveju su bandymo ataskaita turi būti pateiktas metodo aprašymas. Šį metodą lengviausia taikyti vandenyje tirpioms medžiagoms, kai tikimasi, kad bandymo sąlygomis jos išlieka vandenyje. Metodą galima taikyti medžiagoms, kurios tiesiogiai netrukdo matuoti dumblių augimo. Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą. Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą). 1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Ląstelių tankis: ląstelių skaičius viename mililitre. Augimas: ląstelių tankio padidėjimas per bandymo laiką. Augimo greitis: ląstelių tankio didėjimas per laiko vienetą. EC50: šiame metode – tai tokia bandomosios medžiagos koncentracija, kurioje 50% sumažėja augimas (EbC50) arba augimo greitis (ErC50), lyginant su kontroliniu bandymu. NOEC (maksimali neveikianti koncentracija): šiame metode – tai didžiausia bandomoji koncentracija, kurioje nėra statistiškai patikimo augimo arba augimo greičio sumažėjimo, lyginant su kontroliniu bandymu. Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra skaičiuojama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg). 1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga. Jei panaudota etaloninė medžiaga, rezultatai turi būti pateikti ataskaitoje. Etalonine medžiaga galima naudoti kalio bichromatą, tačiau jo spalva gali turėti įtakos šviesos, kurią gauna ląstelės, kokybei ir intensyvumui bei spektrofotometrinių nustatymų, jei jie daromi, rezultatams. Kalio bichromatas buvo naudojamas tarptautiniame tarplaboratoriniame bandyme (žr. 3 nuorodą ir 2 priedą). 1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Eksponentiškai augančios atrinktų žaliųjų dumblių kultūros apibrėžtomis sąlygomis per kelias kartas yra veikiamos įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpaluose. Bandomieji tirpalai inkubuojami 72 valandoms; per tą laiką ne mažiau kaip kas 24 valandas kiekviename tirpale matuojamas ląstelių tankis. Nustatomas augimo slopinimas, lyginant su kultūros augimu kontroliniame bandyme. 1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Kokybės kriterijai turi būti taikomi tiek ribinio bandymo metodui, tiek ir pilnos apimties bandymo metodui. Ląstelių tankis kontrolinių bandymų kultūrose per tris paras turi būti padidėjęs bent 16 kartų. Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti laikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose. Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad bandomosios koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti. Medžiagų, kurios: (

i)mažai tirpsta bandymo terpėje, arba (
ii)gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba (iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose, pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra. Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai. Yra pripažįstama, kad per tą laiką, kol vyksta bandymas, žymus bandomosios medžiagos kiekis gali būti sulaikytas dumblių biomasėje. Taigi, siekiant parodyti, kad vykdomi aukščiau minėti kokybės kriterijai, turi būti atsižvelgta ir į medžiagos kiekį, kuris patenka į dumblių biomasę, ir į medžiagos kiekį tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, į vandens tūryje nustatytą medžiagos kiekį). Tačiau, kadangi medžiagos koncentracijos dumblių biomasėje nustatymas gali kelti esminių techninių problemų, atitikimas kokybės kriterijams gali būti parodytas atliekant bandymą su didžiausia medžiagos koncentracija, bet be dumblių, ir išmatuojant jos koncentraciją tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, vandens tūryje) bandymo pradžioje ir pabaigoje. 1.6. bandymų PROCEDŪROS aprašymas 1.6.1. Reagentai 1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant tiriamąją medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2. Pasirinktų bandymo koncentracijų tirpalai ruošiami kartotines pradinio tirpalo dalis įpilant į dumblių pradinę kultūrą (žr. 1 priedą). Įprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant užtikrinti kai kurių medžiagų (pvz., vandenyje mažai tirpių medžiagų ar kurių didelis Pow, arba tų, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t.). Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, galima panaudoti kaip papildomas priemones dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius ar dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis ir papildomi kontroliniai bandiniai turi būti veikiami pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu atveju neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės. Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje. 1.6.1.2. Bandymų terpė Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų mažesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių. Rekomenduojama terpė: Pagal žemiau pateiktą lentelę ruošiami keturi pradiniai tirpalai. Pradiniai tirpalai sterilizuojami membraninės filtracijos arba autoklavavimo būdu ir laikomi tamsoje 4°C temperatūroje. Pradinis tirpalas Nr. 4 turi būti sterilizuojamas, tik filtruojant pro membraną. Šie pradiniai tirpalai skiedžiami, kad bandomuosiuose tirpaluose būtų gautos galutinės mitybinių medžiagų koncentracijos. Mitybinė terpė Koncentracija pradiniame tirpale Galutinė koncentracija bandomajame tirpale 1 pradinis tirpalas: mitybiniai makroelementai NH4C1 1,5 g/l 15 mg/l MgCl2 6H2O 1,2 g/l 12 mg/l CaCl2 2H2O 1,8 g/l 18 mg/l MgSO4 7H2O 1,5 g/l 15 mg/l KH2PO4 0,16 g/l 1,6 mg/l 2 pradinis tirpalas: Fe-EDTA FeCl3·6H2O 80 mg/l 0,08 mg/l Na2EDTA 2H2O 100 mg/l 0,1 mg/l 3 pradinis tirpalas: mikroelementai H3BO3 185 mg/l 0,185 mg/l MnCl2 4H2O 415 mg/l 0,415 mg/l ZnCl2 3 mg/l 3 × 10-3 mg/l CoCl2 6H2O 1,5 mg/l 1,5 × 10-3 mg/l CuCl2 2H2O 0,01 mg/l 10-5 mg/l Na2MoO4 2H2O 7 mg/l 7 × 10-3 mg/l 4 pradinis tirpalas: NaHCO3 50 g/l 50 mg/l NaHCO3 Kai nusistovi pusiausvyra su oru, terpės pH vertė yra lygi maždaug 8. 1.6.2. Aparatūra – Įprastoji laboratorijos įranga. – Atitinkamo tūrio bandymų kolbos (pvz., jei bandomojo tirpalo tūris 100 ml, tinka 250 ml tūrio kūginės kolbos). Visos kolbos turi būti vienodos medžiagos ir matmenų atžvilgiu. – Kultūros auginimo aparatūra: spinta ar kamera, kurioje temperatūrą būtų galima palaikyti intervale nuo 21°C iki 25°C ± 2oC tikslumu ir kurioje būtų nuolatinis tolygus apšvietimas intervale nuo 400 iki 700 nm. Jei dumblių kontrolinės kultūros pasiekė rekomenduotą augimo greitį, galima daryti prielaidą, kad augimo sąlygos, įskaitant šviesos intensyvumą, buvo tinkamos. – Rekomenduojama, kad šviesos intensyvumas bandomųjų tirpalų viduriniame lygyje būtų intervale nuo 60 iki 120 μE m-2 s-1 (nuo 35 iki 70 × 1018 fotonų m-2 s-l), kai matuojama intervale nuo 400 iki 700 nm, naudojant tinkamą jutiklį. Jei naudojami apšvietos matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, yra priimtinas lygiavertis intervalas nuo 6 000 iki 10 000 lx. Tokį šviesos intensyvumą galima pasiekti, jei 0,35 m atstumu nuo dumblių kultūros pastatomos nuo keturių iki septynių 30 W universalaus tipo baltų dienos šviesos lempų (spalvos temperatūra maždaug 4300 K). – Ląstelių tankio matavimai turi būti atliekami naudojant tiesioginį gyvų ląstelių skaičiavimo metodą, pvz., mikroskopą su skaičiavimo kamera. Tačiau gali būti naudojami kiti metodai (fotometrija, turbidimetrija,…), jei jie yra pakankamai jautrūs ir jei būtų parodyta, kad jų rezultatai pakankamai gerai koreliuoja su ląstelių tankiu. 1.6.3. Bandomieji organizmai Patariama naudoti greitai augančių žaliųjų dumblių rūšis, nes jas patogu auginti ir bandyti. Geriausia naudoti šias rūšis: Selenastrum capricornutum, pvz., ATCC 22662 arba CCAP 278/4, Scenedesmus subspicatus, pvz., 86.81 SAG, Pastaba: ATCC = American Type Culture Collection (U. S. A.) CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U. K.) SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F. R. G.) Jei naudojamos kitos rūšys, turi būti nurodyta padermė. 1.6.4. Bandymų procedūra Koncentracijos intervalas, kuriame tiriamosios medžiagos veikimas būtų pamatuojamas, nustatomas remiantis intervalo nustatymo bandymų rezultatais. Du augimo matavimo būdai (biomasės kiekio ir augimo greičio nustatymas) gali duoti nesulyginamus augimo inhibavimo rezultatus; abu turi būti taikomi intervalo nustatymo bandyme, siekiant užtikrinti, kad geometrine progresija parinktos koncentracijos leistų įvertinti EbC50 ir ErC50. Pradinis ląstelių tankis Rekomenduojama, kad pradinis bandymo kultūrų Selenastrum capricornutum ir Scenedesmus subspicatus ląstelių tankis būtų apie 104 ląstelių/ml. Kai naudojamos kitos rūšys, biomasė turi būti panaši. Bandomosios medžiagos koncentracija Bandymui imamos bent penkios geometrine progresija didėjančios koncentracijos, kad santykis tarp gretimų būtų ne didesnis kaip 2,2. Mažiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi neveikti dumblių augimo. Didžiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi inhibuoti augimą bent 50%, lyginant su kontroliniu bandymu, ir būtų geriausia, jei augimas būtų visiškai sustabdytas. Lygiagrečių bandymų skaičius ir kontroliniai bandymai Pagal bandymo schemą su kiekviena bandomąja koncentracija turi būti atliekami trys lygiagretūs bandymai. Daromi trys kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, ir, jei reikia, dar daromi trys kontroliniai bandymai su pagalbine medžiaga. Jei pasiteisina, bandymo schemą galima keisti, didinant koncentracijų skaičių ir mažinant kartotinių bandymų vienai koncentracijai skaičių. Bandymų eiga Bandymų kultūros su reikiama bandomosios medžiagos koncentracija ir reikiamu dumblių kiekiu ruošiamos į reikiamą kiekį iš anksto paruoštos dumblių kultūros pilant kartotinius bandomosios medžiagos pradinių tirpalų tūrius (žr. 1 priedą). Kolbos su kultūra supurtomos ir statomos į kultūros auginimo aparatą. Siekiant bandomuosiuose tirpaluose pagerinti dujų apykaitą ir sumažinti pH kitimą, dumblių ląstelės suspenduojamos, tirpalus purtant, maišant ar barbotuojant per juos orą. Kultūros turi būti laikomos temperatūrų intervale nuo 21 iki 25°C, reguliuojant ± 2°C tikslumu. Kiekvienoje kolboje ląstelių tankis nustatomas bent po 24, 48 ir 72 valandų nuo bandymo pradžios. Kai ląstelių tankis matuojamas kitu nei tiesioginis skaičiavimas metodu, fonui nustatyti naudojama filtruota dumblių terpė su atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija. pH vertė nustatoma bandymo pradžioje ir po 72 valandų. pH vertė kontroliniuose bandymuose per visą bandymo laiką neturi pasikeisti daugiau kaip 1,5 vieneto. Lakių tiriamųjų medžiagų bandymas Iki šiol nėra visuotinai priimto būdo lakių medžiagų išbandymui. Jei žinoma, kad medžiaga turi polinkį garuoti, galima naudoti uždaras bandymų kolbas su padidintu laisvu tūriu virš tirpalo. Skaičiuojant uždarų kolbų laisvąjį tūrį, turi būti atsižvelgta į CO2 trūkumo galimybę. Buvo pasiūlyti šio metodo variantai (žr. 4 nuorodą). Reikia stengtis nustatyti tirpale likusios medžiagos kiekį, ir patariama ypač atsargiai interpretuoti bandymų rezultatus, gautus su lakiomis medžiagomis uždaroje sistemoje. Ribinis bandymas Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai siekiama įrodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymų vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (ar su didžiausia koncentracija, kurioje dar susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą). Turi būti atliekama ne mažiau kaip trys ribiniai bandymai, toks pat turi būti ir kontrolinių bandymų skaičius. Ribiniame bandyme turi būti naudojami du augimo matavimo būdai (biomasės kiekis ir augimo greitis). Jei ribiniame bandyme, lyginant su kontroliniu bandymu, nustatomas 25% arba didesnis vidutinis biomasės kiekio arba augimo greičio mažėjimas, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. 2. DUOMENYS IR VERTINIMAS Išmatuotas ląstelių tankis bandomosiose kultūrose ir kontroliniuose bandiniuose kartu su bandomosios medžiagos koncentracijomis ir matavimo laikais pateikiamas lentelėje. Norint gauti augimo kreives, vidutinė ląstelių tankio vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai ir kontroliniuose bandiniuose vaizduojama grafiškai laiko atžvilgiu (0–72 h). Turi būti taikomi du žemiau pateikti būdai, kad būtų galima įvertinti koncentracijos ir jos poveikio priklausomybę. Kai kurios medžiagos, būdamos mažos koncentracijos, gali skatinti augimą. Turi būti įskaitomi tik tie duomenų taškai, kuriuose inhibavimas kinta nuo 0 iki 100%. 2.1. Plotų po augimo kreivėmis lyginimas Plotas tarp augimo kreivės ir horizontaliosios tiesės N = N0 gali būti apskaičiuotas taikant formulę: čia: A = plotas, N0 = ląstelių skaičius laiku t0 (bandymo pradžia), N1 = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku t1, Nn = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku tn, t1 = pirmojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios, tn = n-ojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios, n = nuo bandymo pradžios darytų matavimų skaičius. Ląstelių augimo inhibavimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (IA) apskaičiuojama taikant formulę: čia: Ac = plotas tarp augimo kreivės, gautos kontroliniame bandyme, ir horizontaliosios tiesės N = N0, At = plotas tarp augimo kreivės, gautos koncentracijai t, ir horizontaliosios tiesės N = N0. IA vertės atitinkamų koncentracijų atžvilgiu atidedamos pusiau logaritminiame ar pusiau logaritminiame tikimybiniame popieriuje. Jei vertės atidedamos tikimybiniame popieriuje, per taškus vedama tiesė arba iš akies, arba skaičiuojant iš regresijos lygties. EC50 įvertinama iš regresijos tiesės, randant joje koncentracijos vertę, kuri atitinka 50% inhibavimą (IA = 50%). Norint šią vertę pažymėti vienareikšmiai, kaip gautą būtent šiuo skaičiavimo metodu, pasiūlyta vartoti simbolį EbC50. Svarbu, kad EbC50 būtų kiekybiškai nustatomas ir pateikiamas kartu su atitinkamu veikimo laikotarpiu, pvz., EbC50 (0–72 h). 2.2. Augimo greičių lyginimas Vidutinis eksponentiškai augančių kultūrų savitasis augimo greitis (μ) gali būti apskaičiuotas pagal formulę: čia: t0 – bandymo pradžios laikas. Kitaip augimo vidutinio savitojo greičio vertė gali būti gauta iš regresijos tiesės kampinio koeficiento ln N priklausomybės nuo laiko grafike. Savitojo augimo greičio mažėjimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (Iμt) skaičiuojama pagal formulę: čia: μc= vidutinis savitasis augimo greitis kontroliniame bandyme, μt = vidutinis savitasis augimo greitis, kai bandomoji koncentracija t. Kiekvienai koncentracijai gautos savitojo augimo greičio mažėjimo vertės ir kontrolinės greičio vertės santykio procentinė vertė brėžiama koncentracijos logaritmo atžvilgiu. Iš gauto grafiko galima gauti EC50 vertę. Norint vienareikšmiai pažymėti šiuo metodu gautą EC50, pasiūlyta naudoti simbolį ErC50. Turi būti nurodytos matavimo laiko ribos, pvz., jei vertė gauta 0 ir 72 valandų laikotarpiui, simbolis užrašomas ErC50 (0–72 h). Pastaba: savitasis augimo greitis yra logaritminis dydis, ir nedideli augimo greičio pokyčiai gali būti didelių biomasės pokyčių priežastimi. Taigi EbC ir ErC skaitmeninės vertės nėra palyginamos. 2.3. NOEC skaičiavimas NOEC (maksimali neveikianti koncentracija) nustatoma taikant didelio skaičiaus bandinių lyginimo statistinę procedūrą (pvz., dispersinė analizė ir Dunnett’o testas), naudojant individualias kartotines vertes A (žr. 2.1 poskyrį) arba μ (žr. 2.2 poskyrį) reikšmes. 3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys; bandomieji organizmai: kilmė, laboratorinė kultūra, padermės numeris, ir auginimo metodas; – bandymų sąlygos: – bandymo pradžios ir pabaigos data bei jo trukmė, – temperatūra, – terpės sudėtis; – auginimo aparatūra; – tirpalų pH bandymo pradžioje ir pabaigoje (turi būti pateiktas aiškinimas, jei stebimas pH vertės nukrypimas yra didesnis nei 1,5 vieneto); – nešiklis ir metodas, taikytas soliubilizuoti bandomąją medžiagą, bei nešiklio koncentracija bandomuosiuose tirpaluose; – šviesos intensyvumas ir kokybė; – bandomosios koncentracijos (matuotos ar vardinės); – rezultatai: – ląstelių tankis kiekvienoje kolboje bei kiekviename matavimo taške, taip pat ląstelių tankio nustatymo metodas, – ląstelių tankio vidutinės vertės, – augimo kreivės, – koncentracijos poveikio priklausomybių grafinis vaizdavimas, – EC vertės ir skaičiavimo metodas, – NOEC, – kiti pastebėti reiškiniai. 4. NUORODOS

(1)OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C

(81)30 Final.

(2)Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag ‘Hemmung der Zellvermehrung bei der Grünalge Scenedesmus subspicatus, in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.

(3)ISO 8692 – Water quality – Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.

(4)S. Galassi and M. Vighi – Chemosphere, 1981, vol. 10, 1123-1126. 1 priedas Dumblių auginimo metodikos pavyzdys Bendrosios pastabos Šio kultūros auginimo pagal pateikiamą metodiką tikslas yra gauti dumblių kultūras toksiškumo bandymams. Norint užtikrinti, kad dumblių kultūros nebūtų užkrėstos bakterijomis, turi būti naudojami tinkami metodai (ISO 4833). Pageidautina naudoti akseniškas kultūras, tačiau pagrindinės yra vienaląsčių dumblių kultūros. Visi veiksmai turi būti daromi steriliomis sąlygomis, kad nebūtų užkrėsta bakterijomis ir kitais dumbliais. Užkrėstos kultūros turi būti atmestos. Dumblių kultūros paruošimo eiga Mitybinių tirpalų (terpės) ruošimas: Terpė gali būti paruošta, skiedžiant pradinius mitybinių medžiagų koncentruotus tirpalus. Standžiai terpei gauti dedama 0,8% agaro. Naudojama terpė turi būti sterili. Sterilizuojant autoklave, galima prarasti NH3. Pradinė kultūra: Pradinės kultūros yra mažos apimties dumblių kultūros, kurios reguliariai pernešamos į šviežią terpę, kad jas būtų galima naudoti kaip pradinę bandymams skirtą medžiagą. Jei kultūros reguliariai nenaudojamos, jos laikomos ant nuožulnaus agaro, mėgintuvėliuose. Šios kultūros pernešamos į šviežią terpę bent kartą per du mėnesius. Pradinės kultūros auginamos kūginėse kolbose su atitinkama terpe (tūris apie 100 ml). Kai dumbliai inkubuojami 20°C temperatūroje su nuolatiniu apšvietimu, pernešti reikia kas savaitę. Į kolbą su šviežia terpe sterilia pipete reikia pernešti tokį „senos“ kultūros kiekį, kad greitai augančių rūšių atveju pradinė koncentracija būtų maždaug 100 kartų mažesnė nei „senos“ kultūros. Rūšių augimo greitis gali būti nustatytas iš augimo kreivės. Jei greitis žinomas, galima įvertinti, koks turi būti į naują terpę pernešamos kultūros tankis. Tai turi būti daroma prieš tai, kai kultūra pasiekia žūties tarpsnį. Iš anksto paruošta kultūra: Iš anksto paruošta kultūra skirta tam, kad būtų gautas bandomosioms kultūroms sėti reikalingas dumblių kiekis. Iš anksto paruošta kultūra inkubuojama bandymo sąlygomis ir naudojama tuomet, kai dar auga eksponentiškai, paprastai maždaug po trijų inkubavimo parų. Jei dumblių kultūrose randama deformuotų ar nenormalių ląstelių, tokios kultūros turi būti pašalintos. 2 priedas ISO 8692 – Vandens kokybė – Gėlojo vandens dumblių augimo inhibavimo bandymas su Scenedesmus subspicatus ir Selenastrum capricornutum pateikia šiuos tarplaboratorinio palyginamojo bandymo rezultatus, gautus 16-oje laboratorijų, tyrusių kalio bichromatą: Vidutinė vertė, mg/l Intervalas, mg/l ErC50 (0–72

h)0,84 nuo 0,60 iki 1,03 EbC50 (0–72
h)0,53 nuo 0,20 iki 0,75 „LENGVO“ BIOLOGINIO SKAIDOMUMO NUSTATYMAS I dalis. BENDRieji klausimai I.1. ĮVADAS Aprašyti šeši metodai, kurie leidžia chemines medžiagas rūšiuoti pagal jų biologinio skaidomumo aerobinėje vandeninėje terpėje lengvumą:
a)Ištirpusios organinės anglies (IOA) išnykimo (Die-Away) metodas (A metodas).
b)Modifikuotas OECD (Organization for Economic Cooperation and Development – Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacija) atrankos bandymas – IOA išnykimas (B metodas).
c)Anglies dioksido (CO2) susidarymas (modifikuotas Sturm bandymas) (C metodas).
d)Manometrinė respirometrija (D metodas).
e)Uždarytos kolbos (Closed bottle) metodas (E metodas).
f)MITI [Ministry of International Trade and Industry (Tarptautinės prekybos ir pramonės ministerija) – Japonija] (F metodas). Visų šešių bandymų atlikimo sąlygos, bendros ir įprastos, pateiktos metodų I dalyje. Atskiriems metodams specifiniai teiginiai pateikti II–VII dalyse. Prieduose pateikiami apibrėžimai, formulės ir rekomendacijos. OECD tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai, atlikti 1988 m., parodė, kad šiais metodais gauti rezultatai yra tarpusavyje suderinami. Tačiau priklausomai nuo fizikinių bandomosios medžiagos savybių pirmenybė gali būti teikiama vienam arba kitam metodui. I.2. TINKAMO METODO PARINKIMAS Tinkamiausio metodo parinkimą nulemia informacija apie cheminės medžiagos tirpumą, garų slėgį ir adsorbcijos charakteristikas. Teorinių verčių skaičiavimui ir (arba) parametrų išmatuotų verčių patikrinimui, pvz., TDS, TCO2, IOA, BOA, ChDS (žr. I ir II priedus), turi būti žinoma cheminė medžiagos formulė. Bandomosios cheminės medžiagos, kurių tirpumas vandenyje yra bent 100 mg/l, ir jei jos nėra lakios ir neadsorbuojamos, gali būti įvertintos visais metodais. Toms cheminėms medžiagoms, kurios mažai tirpsta vandenyje, yra lakios arba yra adsorbuojamos, tinkami metodai nurodyti 1 lentelėje. Būdas, kaip reikia elgtis su mažai vandenyje tirpiomis ir lakiomis medžiagomis, yra aprašytas III priede. Vidutiniškai lakios cheminės medžiagos gali būti bandomos IOA išnykimo metodu, jei bandymų induose (kurie turi būti tinkamai užkimšti) dujoms yra pakankamai ertmės. Šiuo atveju turi būti įdiegta abiotinė kontrolė, kad būtų galima atsižvelgti į bet kokius fizinius nuostolius. Gautų rezultatų interpretavimui, ypač kai rezultatų kiekybinės vertės yra mažos arba nežymios, reikalinga informacija apie bandomosios medžiagos grynumą arba apie pagrindinių komponentų santykinę dalį. Informacija apie bandomųjų medžiagų toksiškumą bakterijoms (IV priedas) gali būti labai naudinga, kai reikia pasirinkti tinkamas bandomąsias koncentracijas, ir gali būti esminė, kai reikia teisingai paaiškinti, kodėl biologinio skaidymo vertės yra mažos. 1 lentelė. Bandymų metodų tinkamumas Bandymas Analizės metodas Tinkamumas medžiagoms, kurios yra: mažai tirpios lakios adsorbuojamos IOA išnykimas Ištirpusi organinė anglis – – +/- Modifikuotas OECD atrankos Ištirpusi organinė anglis – – +/- bandymas – IOA išnykimas CO2 susidarymas Respirometrija: CO2 susidarymas + – + Manometrinė respirometrija Manometrinė respirometrija: deguonies suvartojimas + +/- + Uždarytos kolbos Respirometrija: ištirpęs deguonis +/- + + MITI Respirometrija: deguonies suvartojimas + +/- + I.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Siekiant patikrinti procedūrą, lygiagrečiai įprastiems bandymams tinkamai paruoštoje kolboje bandomos etaloninės medžiagos, kurios atitinka lengvo biologinio skaidomumo kriterijus. Tinkamos cheminės medžiagos yra anilinas (šviežiai distiliuotas), natrio acetatas ir natrio benzoatas. Visos šios etaloninės medžiagos skaidomos šių bandymų sąlygomis, net jei užkratas ir nėra specialiai įdėtas. Buvo padaryta prielaida, kad reikėtų rasti etaloninę medžiagą, kuri būtų lengvai biologiškai skaidoma, tačiau tik kai yra įdėta užkrato. Buvo pasiūlytas kalio hidroftalatas, tačiau prieš priimant jį kaip etaloninę medžiagą, reikia apie ją surinkti daugiau duomenų. Respirometriniuose bandymuose junginiai, savo sudėtyje turintys azoto, gali turėti įtakos deguonies vartojimui dėl nitrifikavimo (žr. II ir V priedus). I.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Į bandomosios medžiagos tirpalą arba suspensiją mineralinėje terpėje dedamas užkratas ir tirpalas inkubuojamas aerobinėmis sąlygomis tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje. IOA kiekis bandomosios medžiagos tirpale, įterptas su užkratu, turi būti kiek įmanoma mažesnis, lyginant su bandomosios medžiagos IOA kiekiu. Reikia atsižvelgti į užkrato endogeninį aktyvumą, lygiagrečiai darant tuščiuosius bandymus su užkratu, bet be bandomosios medžiagos, nors ląstelių endogeninis aktyvumas, kai yra bandomosios medžiagos, ne visiškai tiksliai atitinka aktyvumą endogeninio aktyvumo kontroliniame bandyme. Atlikimo eigai patikrinti lygiagrečiai daromas bandymas su etalonine medžiaga. Bendruoju atveju skaidymo eiga sekama nustatinėjant parametrus, pvz., IOA, CO2 susidarymą ir deguonies suvartojimą; matavimai daromi pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti biologinio skaidymo pradžią ir pabaigą. Jei naudojami automatiniai respirometrai, matavimas yra nuolatinis. Kai matuojamas kitas parametras, kartais papildomai matuojama IOA, tačiau tai paprastai daroma tik bandymo pradžioje ir pabaigoje. Galima naudoti specifinę cheminę analizę, kai norima įvertinti pradinį bandomosios medžiagos suskaidymą ir nustatyti bet kurios susidariusios tarpinės medžiagos koncentraciją (privaloma MITI bandyme). Paprastai bandymas tęsiamas 28 paras. Tačiau bandymą galima baigti anksčiau nei po 28 parų, t. y. kai biologinio skaidymo kreivė pasiekia gulsčiąją dalį sprendžiant ne mažiau kaip iš trijų iš eilės matavimų. Bandymai gali būti pratęsti ir daromi ilgiau nei 28 paras, jei kreivė rodo, kad biologinis skaidymas prasidėjo, tačiau 28 parą gulsčioji dalis dar nepasiekta. I.5. KOKYBĖS KRITERIJAI I.5.1. Atkuriamumas Dėl biologinio skaidymo prigimties ir dėl užkrato bakterijų populiacijos mišrios sudėties matavimai turi būti daromi bent du kartus. Bendra patirtis rodo, kad kuo didesnė bandymo pradžioje į bandomąją terpę įneštų mikroorganizmų koncentracija, tuo mažesnė bus lygiagrečių bandymų sklaida. Tarplaboratoriniai palyginamieji bandymai taip pat parodė, kad gali būti didelė sklaida tarp rezultatų, gautų skirtingose laboratorijose, tačiau lengvai biologiškai skaidomų junginių atveju paprastai gaunamas geras sutapimas. I.5.2. Bandymų validumas (teisėtumas) Bandymas yra validus (teisėtas), jei skirtumas tarp bandomosios medžiagos šalinimo pakartotinai gautų kraštinių verčių gulsčioje kreivės dalyje bandymo pabaigoje arba 10 parų lango pabaigoje yra mažesnis kaip 20% ir jei etaloninės medžiagos skaidymo procentinė vertė iki 14 paros pasiekė lengvojo biologinio skaidomumo lygį. Jei bet kuri iš šių sąlygų neįvykdyta, bandymas turi būti pakartotas. Mažos apimties vertės dėl metodų tikslumo nebūtinai reiškia, kad bandomoji medžiaga aplinkos sąlygomis biologiškai neskaidoma, tačiau jos rodo, kad biologiniam skaidomumui nustatyti būtinas didesnės apimties darbas. 2 lentelė. Bandymų sąlygos Bandymas IOA išnykimas CO2 susidarymas Manometrinė respirometrija Modifikuotas OECD atrankos bandymas Uždarytos kolbos bandymas MITI (I) Bandomosios medžiagos koncentracija mg/l mg IOA/l mg TDS/l 10–40 10–20 100 50–100 10–40 2–10 5–10 100 koncentracija (ląstelių/l, apytikriai) ≤ 30 mg/l SD ar ≤ 100 ml ištakio/l (107–108) 0,5 ml antrinio ištakio/l

(105)≤ 5 ml antrinio ištakio/l (104–106) 30 mg/l SD (107–108) Elementų koncentracija mineralinėje terpėje (mg/

l)P N Na K Mg Ca Fe 116 1,3 86 122 2,2 9,9 0,05–0,1 11,6 0,13 8,6 12,2 2,2 9,9 0,05–0,1 29 1,3 17,2 36,5 6,6 29,7 0,15 pH 7,4 ± 0,2 geriau 7,0 Temperatūra 22 ± 2oC 25 ± 1°C IOA = ištirpusi organinė anglis TDS = teorinis deguonies suvartojimas SD = suspenduotos kietosios dalelės Jei toksiškumo bandyme, kuriame yra ir bandomoji medžiaga, ir etaloninė cheminė medžiaga, skaidymas po 14 parų yra mažesnis kaip 35% (pagal IOA) arba mažesnis kaip 25% (pagal TDS arba TCO2), bandomosios cheminės medžiagos gali būti laikomos inhibuojančiomis (dar žr. IV priedą). Bandymų serijos turi būti pakartotos, jei tai įmanoma, naudojant mažesnę bandomosios medžiagos koncentraciją ir (arba) didesnę užkrato koncentraciją, tačiau ne didesnę kaip 30 mg kietųjų dalelių/litre. I.6. BENDROSIOS PROCEDŪROS IR PREPARATAI Bendrosios bandymų sąlygos apibendrintos 2 lentelėje. Prietaisai ir kitos bandymo atlikimo sąlygos, specifiškai susijusios su kiekvienu atskiru bandymu, aprašytos toliau to bandymo aprašyme. I.6.1. Skiedimo vanduo Naudojamas dejonizuotas ar distiliuotas vanduo, kuriame nėra inhibuojančios nuodingųjų medžiagų (pvz., Cu2+ jonų) koncentracijos. Vandenyje organinės anglies neturi būti daugiau kaip 10% to kiekio, kuris yra bandomojoje medžiagoje. Didelis bandymams skirto vandens grynumas reikalingas tam, kad nesusidarytų didelės tuščiųjų bandinių vertės. Užterštumas gali atsirasti dėl vandeniui būdingų priemaišų ir dėl jonitinių dervų bei bakterijų ir dumblių irimo produktų. Kiekvienai bandymų serijai reikia naudoti tik vienos partijos vandenį, iš anksto patikrintą atliekant IOA analizę. Toks tikrinimas nėra būtinas uždarytos kolbos bandymams, tačiau deguonies suvartojimas vandeniu turi būti mažas. I.6.2. Pradiniai mineralinių komponentų tirpalai Paruošiant bandomuosius tirpalus, ruošiami atitinkamų koncentracijų mineralinių komponentų pradiniai tirpalai. IOA išnykimo, modifikuotos OECD atrankos, CO2 susidarymo, manometrinės respirometrijos, uždarytos kolbos bandymuose galima naudoti tokius pradinius (su skirtingais skiedimo faktoriais) tirpalus. Skiedimo faktoriai ir specialios mineralinės terpės ruošimas MITI bandymui pateikti konkrečių metodų aprašymuose. Pradiniai tirpalai: Paruošiami šie pradiniai tirpalai, naudojamos analiziškai grynos medžiagos.
a)Kalio dihidrofosfatas, KH2PO4 8,50 g kalio hidrofosfatas, K2HP04 21,75 g natrio hidrofosfatas, dihidratas, Na2HPO4 2H2O 33,40 g amonio chloridas, NH4Cl 0,50 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Tirpalo pH turi būti 7,4.
b)Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl2 27,50 g ar kalcio chloridas, dihidratas, CaCl2 2 H2O 36,40 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
c)Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO4 7H2O 22,50 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.
d)Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl3 6 H2O 0,25 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Pastaba: jei nenorite ruošti šį tirpalą prieš patį bandymą, vienam tirpalo litrui įlašinkite vieną lašą konc. HCl arba įdėkite 0,4 g etilendiamintetraacto rūgšties (EDTA) dinatrio druskos. I.6.3. Cheminių medžiagų pradiniai tirpalai Pavyzdys: dejonizuotame vandenyje ištirpinama 1–10 g, kiek reikia, bandomosios arba etaloninės medžiagos ir skiedžiama iki 1 litro, jei tirpumas didesnis kaip 1 g/l. Kitu būdu pradiniai tirpalai ruošiami mineralinėje terpėje arba cheminė medžiaga dedama tiesiai į mineralinę terpę. Kaip ruošti mažiau tirpias chemines medžiagas, žr. III priedą, tačiau MITI bandyme (F metodas) nei tirpikliai, nei emulsikliai neturi būti naudojami. I.6.4. Užkratai Užkratus galima gauti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo, nuotekų ištakių (nechloruotų), paviršinio vandens ir dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių. Jei IOA išnykimo, CO2 susidarymo ir manometrinės respirometrijos bandymams naudojamas aktyvusis dumblas, jis turi būti imamas iš nuotekų valymo įrenginių ar laboratorinių valymo įrenginių, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos. Buvo nustatyta, kad, naudojant užkratus iš kitų šaltinių, rezultatų sklaida didesnė. Modifikuotam OECD atrankos ir uždarytos kolbos bandymui reikia labiau praskiesto užkrato be dumblo dribsnių, todėl labiau pageidautinas šaltinis yra antrinis ištakis iš buitinių nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio. MITI bandymui užkratas ruošiamas iš mišinio, sudaryto iš įvairių šaltinių. Jis aprašytas šio specialaus bandymo skyriuje. I.6.4.1. Užkratas iš aktyviojo dumblo Iš buitines nuotekas valančio valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio aeravimo tanko surenkamas šviežias aktyviojo dumblo bandinys. Prireikus stambios dalelės pašalinamos, filtruojant per tankų tinklinį filtrą. Toliau dumblas laikomas aerobinėmis sąlygomis. Arba pašalinamos visos stambios dalelės, leidžiama dumblui nusistoti, arba centrifuguojama (pvz., 10 min veikiant 1100 g). Skystis nuo dumblo nupilamas. Dumblas gali būti plaunamas mineraline terpe. Koncentruotas dumblas suspenduojamas mineralinėje terpėje taip, kad suspenduotų standžių dalelių koncentracija būtų 3–5 g/l, ir aeruojamas iki jo panaudojimo. Dumblas turi būti imamas iš gerai veikiančio įprastinės technologijos įrenginio. Jei dumblas imamas iš didelio intensyvumo technologijos valymo įrenginio arba jei manoma, kad dumble yra inhibitorių, jis turi būti plaunamas. Gerai sumaišytas, pakartotinai suspenduotas dumblas paliekamas nusistoti arba centrifuguojamas, nuo jo nupilamas skystis ir išplautas dumblas dar kartą suspenduojamas kitame mineralinės terpės tūryje. Šiuos veiksmus reikia kartoti tol, kol bus galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko. Prieš pat dumblo panaudojimą paimamas pilnai suspenduoto ar neapdoroto dumblo bandinys suspenduotų standžiųjų dalelių sausai masei nustatyti. Atliekant kitu būdu, aktyvusis dumblas homogenizuojamas (3–5 g/l suspenduotų kietųjų dalelių). Dumblas maišomas 2 min vidutiniu greičiu mechaniniu maišikliu. Sumaišytas dumblas paliekamas 30 min arba ilgiau, jei to reikia. Dekantuotas skystis bus naudojamas kaip užkratas pagal normą 10 ml/l mineralinės terpės. I.6.4.2. Kiti užkrato šaltiniai Užkratą galima gauti iš valymo įrenginio ar laboratorinio valymo įrenginio, apdorojančių daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio. Paimamas šviežias bandinys ir gabenimo metu laikomas aerobinėmis sąlygomis. Paliekamas nusistoti vieną valandą arba filtruojamas per stambų filtrinį popierių. Dekantuotas ištakis arba filtratas laikomi aerobinėmis sąlygomis, kol bus panaudoti. Vienam litrui mineralinės terpės galima naudoti iki 100 ml šios rūšies užkrato. Kitas užkrato šaltinis yra paviršinis vanduo. Šiuo atveju paimamas tinkamo paviršinio vandens, pvz., upės, ežero, bandinys ir laikomas aerobinėmis sąlygomis, kol bus panaudotas. Prireikus užkratas koncentruojamas filtravimo arba centrifugavimo būdu. I.6.5. Užkratų pradinis kondicionavimas Užkratai gali būti iš anksto kondicionuojami eksperimento sąlygoms, tačiau iš anksto prie bandomosios cheminės medžiagos neadaptuojami. Pradinis kondicionavimas susideda iš aktyviojo dumblo tirpalo mineralinėje terpėje arba antrinio ištakio 5–7 parų trukmės aeravimo bandymo temperatūroje. Kartais pradinis kondicionavimas gerina bandymo metodų tikslumą, nes sumažina tuščiųjų bandinių vertes. Laikoma, kad MITI bandymo užkrato išankstinis kondicionavimas yra būtinas. I.6.6. Abiotinio skaidymo kontroliniai bandymai Kai reikia, nustatomas galimas bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas, matuojant IOA pašalinimą, deguonies suvartojimą arba anglies dioksido susidarimą steriliuose kontroliniuose bandiniuose be užkrato. Sterilizuojama filtravimu per membraną (0,2–0,45 μm) arba pridedant tinkamos reikiamos koncentracijos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento). Jei naudojamas filtravimas per membraną, sterilumui užtikrinti bandiniai imami steriliai. Jei bandomosios medžiagos adsorbcija nebuvo iš anksto pašalinta, bandymai, kuriuose skaidymas nustatomas, matuojant IOA šalinimą, ypač jei užkratas iš aktyviojo dumblo, turi būti atliekami kartu su abiotinio skaidymo kontroliniu bandymu, į kurį dedamas užkratas ir nuodas (nuodytojas). I.6.7. Kolbų skaičius Kolbų skaičius tipiškame bandyme yra nurodytas kiekviename skyriuje su atitinkamo metodo aprašymu. Galima naudoti tokio tipo kolbas: bandomoji suspensija: su bandomąja medžiaga ir užkratu; užkrato tuščiasis bandymas: tik su užkratu; atlikimo eigos tikrinimo bandymas: su etalonine medžiaga ir užkratu; abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas: sterilus, su bandomąja medžiaga (žr. I.6.6); adsorbcijos kontrolinis bandymas: su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu; toksiškumo kontrolinis bandymas: su bandomąja medžiaga, etalonine medžiaga ir užkratu. Būtina, kad matavimai bandomojoje suspensijoje ir užkrato tuščiajame bandyme būtų daromi lygiagrečiai. Patartina matavimus ir kitose kolbose taip pat daryti lygiagrečiai. Tačiau tai ne visuomet įmanoma. Reikia užtikrinti, kad būtų paimtas pakankamas skaičius bandinių arba padaryta matavimų, norint įvertinti pašalinimo procentinę vertę po 10 parų lango. I.7. DUOMENYS IR VERTINIMAS Skaičiuojant skaidymo procentinę vertę, Dt, naudojamos dviejų parametro matavimų vidutinės vertės bandymo ir tuščiojo bandymo su užkratu kolboje. Formulės pateiktos kituose konkrečius bandymus aprašančiuose skyriuose. Skaidymo eiga vaizduojama grafiškai ir pažymimas 10 parų langas. Apskaičiuojama ir pateikiama medžiagos šalinimo, baigiantis 10 parų langui, procentinė vertė ir gulsčiąją kreivės dalį atitinkanti vertė arba bandymo pabaigos vertė, kuri tinka. Respirometriniuose bandymuose junginiai, savo sudėtyje turintys azoto, gali veikti deguonies suvartojimą dėl nitrifikavimo (žr. II ir V priedus). I.7.1. Skaidymo nustatymas pagal IOA kiekio matavimą Skaidymo procentinė vertė, Dt, kiekvieną kartą, kai buvo paimtas bandinys, turi būti skaičiuojama atskirai kolboms su bandomąja medžiaga, naudojant dviejų IOA matavimų vidutines vertes, kad būtų galima įvertinti bandymo validumą (teisėtumą) (žr. I.5.2). Skaidymas skaičiuojamas pagal lygtį: čia: Dt = skaidymo% laiku t, C0 = vidutinė pradinė DOC koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir užsėtu užkratu (IOA mg/l), Ct = vidutinė IOA koncentracija terpėje su bandomąja medžiaga ir užsėtu užkratu laiku t (IOA mg/l), Cb0 = vidutinė pradinė IOA koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su užsėtu užkratu (IOA mg/l), Cbt = vidutinė IOA koncentracija tuščiojo bandinio terpėje su užsėtu užkratu (IOA mg/l). Visos koncentracijos nustatomos eksperimentiškai. I.7.2. Skaidymo nustatymas, darant specifinę analizę Kai yra specifinės analizės duomenys, pradinis biologinis skaidymas skaičiuojamas pagal formulę: čia: Dt = skaidymo% laiku t, paprastai 28 paros, Sa = likutinis bandomosios medžiagos kiekis terpėje su užkratu bandymo pabaigoje (mg), Sb = likutinis bandomosios medžiagos kiekis tuščiajame bandinyje su vandeniu (terpe), į kurį buvo įdėta tik bandomoji medžiaga (mg). I.7.3. Abiotinis skaidymas Naudojant sterilų kontrolinį bandymą abiotiniam skaidymui nustatyti, abiotinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal formulę: čia: Ca

(0)= IOA koncentracija steriliame kontroliniame bandyme 0 parą, Cs(

t)= IOA koncentracija steriliame kontroliniame bandyme t parą. I.8. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – bandomoji ir etaloninė cheminė medžiaga, jų grynumas; – bandymų sąlygos; – užkratas: prigimtis ir ėmimo vieta (-os), koncentracija ir bet koks pradinis kondicionavimas; – nuotekose esančių pramoninių nuotekų dalis ir kiekis, jei tai žinoma; – bandymo trukmė ir temperatūra; – apdorojimo būdas mažai tirpių cheminių medžiagų atveju; – taikytas bandymų metodas; būtina moksliškai pagrįsti ir paaiškinti bet kokį metodikos keitimą; – specifikacija; – visi pastebėti inhibavimo reiškiniai; – bet koks pastebėtas abiotinis skaidymas; – specifinės cheminės analizės duomenys, jei yra; – analiziniai duomenys apie tarpinius produktus, jei yra; – bandomosios medžiagos ir etaloninės medžiagos skaidymo procentinės dalies kitimo laike grafikas; turi būti aiškiai nurodyta lag (vėlavimo) fazė, skaidymo fazė, 10 parų langas ir kreivės krypties koeficientas (I priedas). Jei bandymas atitinka validumo kriterijus, grafikui sudaryti galima naudoti skaidymo procentinių verčių vidutines vertes, gautas kolbose su bandomąja medžiaga; – šalinimo procentinė dalis po 10 parų lango arba kreivės gulsčioje dalyje, arba bandymo pabaigoje. II dalis. IOA išnykimo bandymas (A metodas) II.1. metodo esmė Išmatuotas mineralinės terpės su užkratu ir žinomos koncentracijos bandomąja medžiaga (nuo 10 iki 40 mg/l IOA), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, tūris yra aeruojamas tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2°C temperatūroje. Skaidymas sekamas 28 paras, trumpais intervalais atliekant IOA analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas pašalintos IOA koncentraciją (pataisyta dėl IOA koncentracijos užkrato tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje. II.2. METODO APRAŠYMAS II.2.1. Prietaisai
a)Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, talpa parenkama priklausomai nuo IOA analizei reikalingo tūrio.
b)Mechaninė purtyklė, skirta kūginėms kolboms įstatyti arba su automatiniu termostatavimu, arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas.
c)Filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis.
d)IOA analizatorius.
e)Ištirpusio deguonies nustatymo prietaisas.
f)Centrifuga. II.2.2. Mineralinės terpės ruošimas Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2. Sumaišoma 10 ml (
a)tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(
d)tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro. II.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio arba mišinių iš šių šaltinių. Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5. II.2.4. Kolbų ruošimas Pavyzdžiui, į atskiras 2 l kūgines kolbas įpilama po 800 ml mineralinės terpės ir pakankamą tūrį bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė IOA koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma lygi 7,4. Įdedama į kolbas užkrato iš aktyviojo dumblo arba kito šaltinio (žr. I.6.4), kad galutinė suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Taip pat paruošiamas užkrato tirpalo mineralinėje terpėje kontrolinis bandinys, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos. Jei reikia, vienas indas naudojamas patikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam poveikiui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdėjus užkrato. Be to, jei reikia, paruošiama dar viena sterili kolba su bandomąja medžiaga be užkrato, kad galėtumėte nustatyti, ar vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6). Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandomąją medžiagą žymiai adsorbuoja stiklas, dumblas ir t. t., atliekamas parengiamasis įvertinimas galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir kartu bandymo tinkamumui šiai bandomajai medžiagai (žr. 1 lentelę). Paruošiama kolba su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu. Visi tirpalai kolbose skiedžiami mineraline terpe iki 1 l ir, tirpalus sumaišius, iš kiekvienos kolbos paimamas bandinys IOA pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Kolbų angos uždengiamos, pvz., aliuminio folija, taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvo oro apykaita. Bandymas prasideda įstačius kolbas į purtyklę. II.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle 1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija 3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas 5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas ir pageidautina, kai būtina: 6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas 7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandymas 8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas Žr. taip pat I.6.7. II.2.6. Bandymų eiga Visą bandymo laiką, žinomais laiko tarpais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir šalinimo procentinę vertę 10 parų lango pabaigoje, kiekvienoje kolboje po du kartus nustatoma IOA koncentracija. Imamas tik mažiausias bandomosios suspensijos tūris, būtinas kiekvienam nustatymui. Jei būtina, prieš imant bandinį, kompensuojami garavimo iš kolbų nuostoliai, įpilant reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imant bandinį, reikia gerai sumaišyti kultivuojamą terpę ir užtikrinti, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta ar suspenduota. Paėmus bandinį, jis iš karto filtruojamas pro membraninį filtrą arba centrifuguojamas (žr. II.4 priedą). Nufiltruoti arba centrifuguoti bandiniai analizuojami tą pačią dieną arba laikomi 2–4°C temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip -18°C temperatūroje. II.3. DUOMENYS IR ATASKAITA II.3.1. Rezultatų apdorojimas Apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė laiku t, kaip nurodyta I.7.1 (IOA nustatymas), ir neprivalomai – kaip I.7.2 (specifinė analizė). Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose. II.3.2. Rezultatų tinkamumas Žr. I.5.2. II.3.3. Ataskaita Žr. I.8. II.4. SPECIFIKACIJA Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys. IOA IŠNYKIMO BANDYMAS 1. LABORATORIJA 2. BANDYMŲ PRADŽIOS DATA 3. BANDOMOJI MEDŽIAGA Pavadinimas: Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos 4. UŽKRATAS Šaltinis: Kaip apdorota: Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo: Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l 5. ANGLIES NUSTATYMAS Anglies analizatorius: 8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma) Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l % pirminio skaidymo Sterilus kontrolinis bandymas Sb Bandymo terpė su užkratu Sa Sb-Sa Sb = Í 100 III dalis. MODIFIkuotas OECD atrankos bandymas (B metodas) III.1. metodo esmė Į išmatuotą mineralinės terpės tūrį su žinoma bandomosios medžiagos koncentracija (nuo 10 iki 40 mg/l IOA), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, įpilama užkrato 0,5 ml 1 l terpės. Mišinys yra aeruojamas tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2°C temperatūroje. Skaidymas sekamas 28 paras, trumpais intervalais atliekant IOA analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skaičiuojamas pašalintos IOA koncentraciją (pataisyta dėl IOA koncentracijos užkrato tuščiajame kontroliniame bandinyje) išreiškiant pradinės koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti pagal papildomą cheminę analizę, daromą inkubavimo pradžioje ir pabaigoje. III.2. METODO APRAŠYMAS III.2.1. Prietaisai
a)Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litrų, talpa parenkama priklausomai nuo IOA analizei reikalingo tūrio.
b)Mechaninė purtyklė skirta kūginėms kolboms įstatyti, kuri būtų arba su automatiniu termostatavimu, arba naudojama patalpoje su pastovia temperatūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima būtų palaikyti aerobines sąlygas.
c)Filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis.
d)IOA analizatorius.
e)Ištirpusio deguonies nustatymo aparatas.
f)Centrifuga. III.2.2. Mineralinės terpės ruošimas Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2. Sumaišoma 10 ml (
a)tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(
d)tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro. Šiame metode užkratu naudojama tik 0,5 ml ištakio/litre, ir todėl gali tekti didinti terpės mikroelementų ir augimo faktorių koncentraciją. Tai daroma įpilant po 1 ml kiekvieno šių tirpalų vienam terpės tūrio litrui. Mikroelementų tirpalas: Mangano sulfatas, tetrahidratas, MnSO4 4H2O 39,9 mg Boro rūgštis, H3BO3 57,2 mg Zinko sulfatas, heptahidratas, ZnSO4 7H2O 42,8 mg Amonio heptamolibdatas (NH4)6Mo7O24 34,7 mg Fe-chelatas (FeCl3 ir etilendiamintetraacto rūgštis) 100,0 mg Ištirpinkite skiedimo vandenyje ir praskieskite juo iki 1000 ml. Vitaminų tirpalas: Mielių ekstraktas 15,0 mg Mielių ekstraktas ištirpinamas 100 ml vandens. Sterilizuojamas filtruojant pro 0,2 μm membraną arba pagaminamas šviežiai. III.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas Užkratas ruošiamas iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, valančio daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio, žr. I.6.4.2 ir I.6.5. Naudojama 0,5 ml vienam litrui mineralinės terpės. III.2.4. Kolbų ruošimas Pavyzdžiui, į atskiras 2 l talpos kūgines kolbas įpilama po 800 ml mineralinės terpės ir toks tūris bandomosios ir etaloninės medžiagos pradinių tirpalų, kad ekvivalentinė IOA koncentracija būtų 10–40 mg/l. Patikrinama pH vertė ir prireikus nustatoma lygi 7,4. Įdedama į kolbas po 0,5 ml/l užkrato iš nuotekų ištakio (žr. I.6.4.2). Taip pat paruošiamas užkrato mineralinėje terpėje kontrolinis tirpalas, kuriame nebūtų bandomosios arba etaloninės medžiagos. Jei reikia, vienas indas naudojamas patikrinti galimam bandomosios medžiagos inhibuojamajam veikimui, į panašios koncentracijos bandomosios ir etaloninės medžiagų tirpalą mineralinėje terpėje įdedamas užkratas. Be to, jei reikia, paruošiama dar viena sterili kolba su bandomąja medžiaga be užkrato, kad galima būtų nustatyti, ar vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6). Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandomąją medžiagą žymiai adsorbuoja stiklas, dumblas ir t. t., atliekamas parengiamasis įvertinimas galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir kartu bandymo tinkamumui šiai bandomajai medžiagai (žr. 1 lentelę). Paruošiama kolba su bandomąja medžiaga, užkratu ir sterilizavimo agentu. Visi tirpalai kolbose skiedžiami mineraline terpe iki 1 l, išmaišomi ir iš kiekvienos kolbos paimamas bandinys IOA pradinei koncentracijai nustatyti (žr. II.4 priedą). Kolbų angos uždengiamos, pvz., aliuminio folija, taip, kad tarp kolbos ir ją supančios aplinkos būtų laisvo oro apykaita. Tuomet bandymui pradėti kolbos įstatomos į purtyklę. III.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle 1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija 3 ir 4 kolba: sėjimo kultūros tuščiasis bandymas 5 kolba: procedūros tikrinimo bandymas ir, pageidautina, kai būtina: 6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas 7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandymas 8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas Žr. taip pat I.6.7. III.2.6. Bandymų eiga Visą bandymą žinomais laiko intervalais, bet pakankamai dažnai, kad galima būtų nustatyti 10 parų lango pradžią ir procentinę šalinimo vertę 10 parų lango pabaigoje, nustatoma IOA koncentracija kiekvienoje kolboje po du kartus. Imamas tik minimalus kiekvienam nustatymui būtinas bandomosios suspensijos tūris. Jei būtina, prieš imant bandinį, kompensuojami garavimo iš kolbų nuostoliai, įpilant reikiamą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš imant bandinį, gerai sumaišoma kultūros terpė ir užtikrinama, kad prieš bandinio ėmimą ant kolbos sienelių prilipusi medžiaga būtų ištirpinta ar suspenduota. Paėmus bandinį, jis iš karto filtruojamas pro membraninį filtrą ar centrifuguojamas (žr. II.4 priedą). Nufiltruoti ar centrifuguoti bandiniai analizuojami tą pačią dieną arba laikomi 2–4°C temperatūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – žemesnėje kaip -18°C temperatūroje. III.3. DUOMENYS IR ATASKAITA III.3.1. Rezultatų apdorojimas Apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė laiku t, kaip nurodyta I.7.1 (IOA nustatymas), ir neprivalomai, kaip nurodyta I.7.2 (specifinė analizė). Visi rezultatai užrašomi pateiktose specifikacijose. III.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas) Žr. I.5.2. III.3.3. Ataskaita Žr. I.8. III.4. SPECIFIKACIJA Žemiau pateiktas specifikacijos pavyzdys. MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS 1. LABORATORIJA 2. BANDYMO PRADŽIOS DATA 3. BANDOMOJI MEDŽIAGA Pavadinimas: Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos Pradinė koncentracija terpėje, t0: mg/l, kaip cheminės medžiagos 4. UŽKRATAS Šaltinis: Kaip apdorota: Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo: Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l 5. ANGLIES NUSTATYMAS Anglies analizatorius: 7. ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDYMAS (neprivalomas) Trukmė (paros) 0 t Sterilus kontrolinis bandymas, IOA koncentracija (mg/
l)Cs

(0)Cs(

t)8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma) Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l % pirminio skaidymo Sterilus kontrolinis bandymas Sb Bandymo terpė su užkratu Sa Sb-Sa Sb = Í 100 IV dalis. CO2 SUSiDArymo bandymas (C metodas) IV.1. metodo esmė Žinomas mineralinės terpės su užkratu tūris, kuriame kaip vienintelis nominalus organinės anglies šaltinis yra žinomos koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga (10–20 mg IOA/l arba BOA/l), tamsoje ar išsklaidytoje šviesoje yra aeruojamas, reguliuojamu greičiu barbotuojant anglies dioksido neturintį orą. Skaidymas stebimas 28 paras, nustatant susidariusio anglies dioksido kiekį, sugeriamo bario arba natrio hidroksidu, kuris matuojamas titruojant likusį hidroksido kiekį arba kaip neorganinė anglis. Iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio anglies dioksido kiekis (pataisytas atimant anglies dioksido, susidariusio tuščiajame bandinyje su sėjimo kultūra, kiekį) yra skaičiuojamas kaip procentinė TCO2 vertė. Kitu būdu biologinio skaidymo laipsnį galima skaičiuoti nustatant papildomą IOA kiekį inkubavimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje. IV.2. METODO APRAŠYMAS IV.2.1. Aparatūra
a)2–5 litrų talpos kolbos, kiekviena su aeravimo vamzdeliu, siekiančiu beveik indo dugną, ir išleidimo anga.
b)Magnetiniai maišikliai, kai vertinamos mažai tirpios cheminės medžiagos.
c)Dujų sugėrimo kolbos.
d)Įtaisas reguliuoti ir matuoti oro srautą.
e)Prietaisas anglies dioksidui išplauti, kuriuo ruošiamas oras, neturintis anglies dioksido; pagal kitą būdą galima naudoti iš balionų tiekiamu CO2 neturinčio deguonies ir CO2 neturinčio azoto mišinį, dujas maišant teisingu santykiu (20% O2: 80% N2).
f)Įtaisas anglies dioksidui nustatyti titravimo būdu arba kokio nors tipo neorganinės anglies analizatorius.
g)Membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas).
f)IOA analizatorius (neprivalomas). IV.2.2. Mineralinės terpės ruošimas Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2. Sumaišoma 10 ml (
a)tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(
d)tirpalų ir skiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro. IV.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių. Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5. IV.2.4. Kolbų ruošimas Kaip pavyzdys, žemiau nurodomi tūriai ir masės 5 litrų kolboms su 3 l suspensijos. Jei naudojami mažesni tūriai, atitinkamai keičiami kiekiai, tačiau reikia užtikrinti, kad būtų galima tiksliai išmatuoti susidariusio anglies dioksido kiekį. Į kiekvieną 5 litrų kolbą įpilama 2400 ml mineralinės terpės. Įpilamas atitinkamas tūris paruošto aktyviojo dumblo (žr. I.6.4.1 ir I.6.5), kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija mišinio su užkratu galutiniame 3 l tūryje būtų ne didesnė kaip 30 mg/l. Kitas būdas, kai paruoštas dumblas iš pradžių skiedžiamas mineralinėje terpėje, paruošiant 500–1000 mg/l suspensiją, po to kartotinis šios suspensijos tūris pilamas į 5 litrų kolbos turinį, kad koncentracija būtų 30 mg/l; tai užtikrina didesnį preciziškumą. Galima naudoti kitus užkrato šaltinius (žr. I.6.4.2). Per naktį šie mišiniai su užkratu aeruojami CO2 neturinčiu oru, kad iš sistemos būtų išvalytas anglies dioksidas. Į vienas lygiagrečiam bandymui skirtas kolbas atskirai įpilami bandomosios ir etaloninės medžiagų žinomi pradinių tirpalų tūriai taip, kad, įdėjus šių medžiagų, būtų gautos nuo 10 iki 20 mg IOA/l arba BOA/l koncentracijos; į kitas kolbas šių medžiagų nededama ir šios kolbos naudojamos kaip užkrato kontroliniai bandymai. Mažai tirpios medžiagos dedamos tiesiai į kolbas pagal masę arba tūrį arba daroma, kaip aprašyta III priede. Jei reikia, viena kolba naudojama bandomosios medžiagos galimam inhibuojamajam veikimui tikrinti, į ją įdedama ir bandomosios, ir etaloninės medžiagų, kurių koncentracija turi būti tokia pat, kaip ir kitose kolbose. Be to, jei reikia patikrinti, ar nevyksta bandomosios cheminės medžiagos abiotinis skaidymas, reikia turėti sterilią kolbą su bandomąja chemine medžiaga be užkrato (žr. I.6.6). Sterilizuojama įdėjus atitinkamos koncentracijos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento). Suspensijos visose kolbose skiedžiamos iki 3 l. Įpilama mineralinės terpės, kuri prieš tai buvo aeruojama CO2 neturinčiu oru. Neprivaloma, bet galima paimti bandinius IOA analizei (žr. II.4 priedą) ir specifinei analizei. Prie kolbų oro išleidimo angų prijungiamos dujų sugėrimo kolbos. Jei naudojamas bario hidroksidas, prie kiekvienos 5 l kolbos nuosekliai prijungiama po tris dujų sugėrimo kolbas, kurių kiekvienoje turi būti 100 ml 0,0125 M bario hidroksido tirpalo. Tirpale neturi būti sulfato ir karbonato nuosėdų ir jo koncentracija turi būti nustatyta prieš pat tirpalo naudojimą. Jei naudojamas natrio hidroksidas, jungiamos dvi gaudyklės, antroji turi būti kontrolinė, siekiant parodyti, kad visas anglies dioksidas buvo absorbuotas pirmoje gaudyklėje. Tinka dujų sugėrimo kolbos, uždarytos serumo butelių kamščiais. Į kiekvieną kolbą įpilama 200 ml 0,05 M natrio hidroksido tirpalo, kurio pakanka sugerti visą kiekį anglies dioksido, susidariusio visiškai suskaidant bandomąją medžiagą. Natrio hidroksido tirpalas, net šviežiai paruoštas, turi karbonatų pėdsakų; pataisa padaroma, atimant tuščiajame bandinyje susidariusio karbonato kiekį. IV.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle 1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija 3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas 5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas ir, pageidautina, kai būtina: 6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandymas 7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas Žr. taip pat I.6.7. IV.2.6. Bandymų eiga Bandymas pradedamas pro suspensiją barbotuojant 30–100 ml/min oro srautą be CO2. CO2 nustatyti periodiškai imami anglies dioksido absorbento bandiniai. Norint identifikuoti 10 parų lango periodą, rekomenduojama pirmąsias dešimt dienų analizę daryti kas antrą arba trečią dieną, o po to iki 28 paros – kas penktą dieną. 28 parą imami bandiniai (neprivalomai) IOA ir (arba) specifinei analizei, išmatuojamos suspensijų pH vertės ir į kiekvieną kolbą įpilama po 1 ml koncentruotos druskos rūgšties; aeruojama per naktį, kad iš bandomųjų suspensijų būtų pašalintas anglies dioksidas. 29 parą atliekama paskutinė išsiskyrusio anglies dioksido analizė. CO2 matavimo dieną atjungiamas arčiausiai kolbos prijungtas absorberis su bario hidroksidu, ir bario hidroksido tirpalas titruojamas 0,05 M HCl tirpalu, indikatoriumi naudojamas fenolftaleinas. Likusieji absorberiai perkeliami per vieną vietą arčiau kolbos ir kitame nuosekliai sujungtų absorberių gale prijungiamas naujas absorberis su 100 ml šviežio 0,0125 M bario hidroksido. Titruojama, kai tai būtina, pvz., kai pirmojoje gaudyklėje matyti daug nuosėdų, bet jų dar nėra antroje, arba bent kartą per savaitę. Iš kitos pusės, jei absorbentu naudojamas NaOH, švirkštu iš arčiau kolbos stovinčio absorberio paimamas nedidelis natrio hidroksido tirpalo bandinys (tai priklauso nuo naudojamo anglies analizatoriaus charakteristikų). Bandinys turi būti purškiamas inžektoriumi į anglies analizatoriaus neorganinės anglies reakcinį indą (NA dalį), kad galima būtų tiesiogiai nustatyti išsiskyrusį anglies dioksidą. Antrosios gaudyklės turinys analizuojamas tik bandymo pabaigoje, kad būtų galima padaryti pataisą dėl galimo anglies dioksido išnešimo. IV.3. DUOMENYS IR ATASKAITA IV.3.1. Rezultatų apdorojimas Absorberyje sugerto CO2 kiekis nustatomas pagal tokią titravimo formulę: mg CO2 = (100 × CB – 0,5 × V × CA) × 44 čia: V = 100 ml absorberio turinio titruoti sunaudotos HC1 tūris (ml), CB = bario hidroksido tirpalo koncentracija (M), CA = druskos rūgšties tirpalo koncentracija (M), jei CB lygi 0,0125 M ir CA lygi 0,05 M, 100 ml bario hidroksido tirpalui titruoti reikia 50 ml, ir CO2 masė nustatoma pagal lygtį: × 44 × ml HC1 sunaudoto titravimui = 1,1 × ml HC1 Taigi šiuo atveju titravimui sunaudoto HC1 tūrio perskaičiavimo į susidariusio CO2 mg daugiklis yra 1,1. Naudojant atitinkamas titravimo vertes, apskaičiuojamos vien iš užkrato bei iš užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos gautos CO2 masės, ir šių masių skirtumas yra masė CO2, susidariusio vien tik iš bandomosios cheminės medžiagos. Pavyzdžiui, jei užkrato bandinio titravimas duoda 48 ml, o užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos bandinio titravimas duoda 45 ml, CO2 iš užkrato = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg CO2 iš užkrato ir bandomosios cheminės medžiagos = 1,1 x (50-45) = 5,5 mg taigi iš bandomosios cheminės medžiagos susidariusio CO2 masė lygi 3,3 mg. Procentinė biologinio skaidymo vertė skaičiuojama pagal formulę: arba 3,67 yra anglies masės perskaičiavimo į anglies dvideginio masę (44/12) daugiklis. Skaidymo po bet kurio laiko intervalo procentinė vertė gaunama pridedant procentines TCO2 vertes, apskaičiuotas kiekvienai parai, iki to laiko, kuriuo jis buvo išmatuotas. Absorberiams su natrio hidroksidu susidariusio anglies dioksido kiekis, išreikštas NA(mg), skaičiuojamas dauginant NA koncentraciją absorbente iš absorbento tūrio. Procentinė skaidymo vertė skaičiuojama pagal: NA kolboje su bandomąja medžiaga (
mg)– NA kolboje su tuščiuoju bandiniu (
mg)Apskaičiuojamas IOA šalinimas (neprivaloma), kaip aprašyta I.7. Užrašomi šie ir visi kiti rezultatai pridėtose specifikacijose. IV.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas) Bandomosios cheminės medžiagos suspensijos mineralinėje terpėje NA kiekis bandymo pradžioje turi būti mažesnis kaip 5% BA, ir tuščiajame bandinyje bandymo pabaigoje viso išsiskyrusio CO2 kiekis paprastai neturi būti didesnis kaip 40 mg/l terpės. Jei gaunamos didesnės kaip 70 mg CO2/litre vertės, duomenys ir eksperimento atlikimo eiga turi būti kritiškai ištirti. Žr. taip pat I.5.2. IV.3.3. Ataskaita Žr. I.8. IV.4. SPECIFIKACIJA Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys. ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMO BANDYMAS 1. LABORATORIJA 2. BANDYMO PRADŽIOS DATA 3. BANDOMOJI MEDŽIAGA Pavadinimas: Pradinio tirpalo koncentracija: mg/l, kaip cheminės medžiagos Pradinė koncentracija terpėje: mg/l, kaip cheminės medžiagos Bendrasis į kolbą įdėtos C kiekis: mg C TCO2: mg CO2 4. UŽKRATAS Šaltinis: Kaip apdorota: Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo: Suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l 5. ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMAS IR SKAIDOMUMAS Metodas: Ba(OH)2/NaOH/kitas 6. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma) Anglies analizatorius: Laikas (paros) Tuščiasis bandinys, mg/l Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l 0 Cb

(0)C0 28* Cb(

t)C1 * ar inkubavimo pabaigoje 7. ABIOTINIS SKAIDYMAS (neprivalomas) v dalis. MANOMETRInis RESPIROMETRinis bandymas (D metodas) V. I. METODO ESMĖ Išmatuotas mineralinės terpės su užkratu tūris, turintis žinomos koncentracijos bandomąją cheminę medžiagą (100 mg/litre bandomosios medžiagos, duodančios ne mažiau kaip 50–100 mg TDS/litre), kuri nominaliai yra vienintelis organinės anglies šaltinis, pastovioje temperatūroje (± 1oC ar tiksliau) maišomas graduotoje kolboje iki 28 parų. Deguonies suvartojimas nustatomas arba matuojant deguonies (elektrolitiškai pagaminto) kiekį, kurio reikia pastoviam dujų tūriui respirometro kolboje palaikyti, arba pagal tūrio arba slėgio (arba abiejų kartu) kitimą aparate. Išsiskyręs anglies dioksidas sugeriamas kalio hidroksido tirpalu ar kitu tinkamu absorbentu. Bandomąja chemine medžiaga suvartoto deguonies kiekis (darant pataisą deguonies kiekiui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme su užkratu) yra reiškiamas procentine TDS arba ChDS verte. Neprivalomai iš papildomos specifinės analizės, kuri atliekama bandymo pradžioje ir pabaigoje, duomenų galima apskaičiuoti pirminį biologinį skaidymą, o darant IOA analizę, – biologinį suskaidymą. V.2. METODO APRAŠYMAS V.2.1. Aparatūra
a)tinkamas respirometras;
b)termostatas, palaikantis temperatūrą ± 1°C tikslumu;
c)membraninio filtravimo įrenginys (neprivalomas);
d)anglies analizatorius (neprivalomas). V.2.2. Mineralinės terpės ruošimas Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2. Sumaišoma 10 ml (
a)tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilama po 1 ml (b)–(
d)tirpalų ir praskiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro. V.2.3. Užkrato ruošimas ir pradinis kondicionavimas Užkratą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyviojo dumblo; nuotekų ištakių; paviršinio vandens; dirvožemio ar mišinių iš šių šaltinių. Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5. V.2.4. Kolbų ruošimas Pradinius tirpalus skiedžiant mineraline terpe, paruošiamos atskiros serijos bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalų, kuriuose šių medžiagų koncentracija turėtų būti 100 mg/litre (kad TDS būtų ne mažiau kaip 50–100 mg/litre). TDS skaičiuojamas pagal amonio druskų susidarymą, jei nesitikima nitrifikavimo, kada skaičiuoti reikia pagal nitratų susidarymą (žr. II.2 priedą). Pamatuojamos pH vertės ir prireikus nustatoma 7,4 ± 0,2 vertė. Mažai tirpios medžiagos turi būti pridedamos vėlesniame etape (žr. žemiau). Jei reikia nustatyti bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą, ruošiamas dar vienas tirpalas mineralinėje terpėje, kuriame būtų ir bandomoji, ir etaloninė medžiaga tokios koncentracijos, kokios yra atskiruose tirpaluose. Jei reikia matuoti fizikocheminį deguonies suvartojimą, ruošiamas bandomosios cheminės medžiagos tirpalas, paprastai 100 mg TDS/litre, kuris buvo sterilizuotas pridedant tinkamos nuodingos medžiagos (sterilizavimo agento) (žr. I.6.6.). Bandomosios ir etaloninės medžiagų reikiami tirpalų tūriai įpilami atitinkamai bent į dvi kolbas. Į kitas kolbas įpilama tik mineralinės terpės (užkrato kontroliniai bandymai) ir, jei reikia, maišyto bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų tirpalo ir sterilaus tirpalo. Jei bandomoji medžiaga mažai tirpi, dėkite jos pagal masę arba tūrį tiesiai šioje pakopoje arba apdorokite, kaip aprašyta III priede. Į CO2 – absorberio sekcijas įpilkite kalio hidroksido, natrio kalkių granulių ar kito absorbento. V.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle 1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija 3 ir 4 kolba: užkrato tuščiasis bandymas 5 kolba: procedūros (atlikimo eigos) tikrinimo bandymas ir, pageidautina, kai būtina: 6 kolba: sterilus kontrolinis bandymas 7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandymas Žr. taip pat I.6.7. V.2.6. Bandymų eiga Leidžiama kolboms pasiekti tinkamą temperatūrą ir į atitinkamas kolbas įdedama tiek užkrato iš paruošto aktyviojo dumblo arba kitokio jo šaltinio, kad suspenduotų kietųjų dalelių koncentracija būtų ne didesnė kaip 30 mg/litre. Surenkama įranga, įjungiamas maišiklis, patikrinamas hermetiškumas ir pradedama matuoti deguonies suvartojimą. Paprastai toliau prižiūrėti nereikia, išskyrus tai, kad užrašomi būtini rodmenys ir daromi kasdieniniai patikrinimai, ar teisinga temperatūra ir atitinkamas maišymas. Pagal dažnai ir reguliariais tarpais užrašomus rodmenis skaičiuojamas deguonies suvartojimas (taikomi įrangos gamintojo nurodyti metodai). Inkubavimo pabaigoje, paprastai po 28 parų, matuojamas kolbų tūrinio pH, ypač jei deguonies suvartojimas yra mažas arba didesnis nei TDSNH (azoto turintiems junginiams). Jei reikia, bandymo pradžioje ir pabaigoje iš respirometrinių kolbų imami bandiniai IOA analizei arba specifinei cheminei analizei (žr. II.4 priedą). Imant bandymo pradžioje, reikia užtikrinti, kad kolboje likusios bandomosios suspensijos tūris būtų žinomas. Kai deguonį vartoja azoto turinti bandomoji medžiaga, nustatomas nitrito ir nitrato koncentracijų didėjimas per 28 paras ir apskaičiuojama pataisa dėl deguonies, suvartoto nitrifikavimui (V priedas). V.3. DUOMENYS IR ATASKAITA V.3.1. Rezultatų apdorojimas Padalijamas kiekis (
mg)deguonies, suvartoto bandomajai cheminei medžiagai per tam tikrą laiką (pataisytą kiekiu deguonies, suvartoto per tą patį laiką tuščiajame užkrato bandinyje) iš paimtos bandomosios cheminės medžiagos masės. Taip gaunamas BDS, skaičiuojamas mg deguonies/mg bandomosios cheminės medžiagos, taigi: biologinio skaidymo procentinė vertė skaičiuojama pagal: arba pagal: Reikia pažymėti, kad šie du metodai nebūtinai duoda tą pačią vertę; geriau naudoti pirmąjį metodą. Azoto turinčioms medžiagoms naudojamos atitinkamos TDS vertės (NH ar NO pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo galimybę ar ko iš jo laukiama (II.2 priedas). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui turi būti skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas). Kai atliekama neprivaloma organinės anglies ir (arba) specifinė analizė, apskaičiuojama skaidymo procentinė vertė, kaip tai aprašyta I.7. Visi rezultatai užrašomi į pridedamas specifikacijas. V.3.2. Rezultatų validumas (teisėtumas) Paprastai deguonies suvartojimas sėjimo kultūros tuščiajame bandinyje per 28 paras yra 20–30 mg O2/litre ir neturi būti didesnis kaip 60 mg/litre. Jei vertės didesnės kaip 60 mg/litre, būtina kritiškai ištirti duomenis ir eksperimento atlikimo eigą. Jei pH vertė nepatenka į 6–8,5 intervalą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau kaip 60%, bandymas turi būti pakartotas su mažesne bandomosios medžiagos koncentracija. Žr. I.5.2. V.3.3. Ataskaita Žr. I.8. V.4. SPECIFIKACIJA Toliau pateikiamas specifikacijos pavyzdys. MANOMETRINĖS RESPIROMETRIJOS BANDYMAS 1. LABORATORIJA 2. BANDYMO PRADŽIOS DATA 3. BANDOMOJI MEDŽIAGA Pavadinimas: Pradinio tirpalo koncentracija: mg/litre Pradinė koncentracija terpėje, C0: mg/litre Tūris bandymų kolboje (V): ml TDS arba ChDS: mg O2/mg bandomosios medžiagos (NH ar NO) 4. UŽKRATAS Šaltinis: Kaip apdorota: Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo: Suspenduotų standžiųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: mg/l 5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS: BIOLOGINIS SKAIDOMUMAS 6. PATAISA DĖL NITRIFIKAVIMO (žr. V priedą) Para 0 28 Skirtumas (
i)Nitrato koncentracija (mg N/litre) (N) (
ii)Deguonies ekvivalentas (4,57 × N × V) (
mg)– – (iii) Nitrito koncentracija (mg N/litre) (N) (
iv)Deguonies ekvivalentas (3,43 × N × V) (
mg)– – (ii +
iv)Bendrasis deguonies ekvivalentas – – 7. ANGLIES ANALIZĖ (neprivaloma) Anglies analizatorius: Laikas (paros) Tuščiasis bandinys, mg/l Bandomoji cheminė medžiaga, mg/l 0 Cb

(0)C0 28* Cb(

t)C1 * ar inkubavimo pabaigoje 8. SPECIFINĖ CHEMINĖ ANALIZĖ (neprivaloma) Bandomosios medžiagos likutinis kiekis bandymo pabaigoje, mg/l % pirminio skaidymo Sterilus kontrolinis bandymas Sb Bandymo terpė su užkratu Sa Sb-Sa Sb = Í 100 Sb = koncentracija po fizikocheminių pakitimų (steriliame) kontroliniame bandyme po 28 parų. Sa = koncentracija kolboje su užkratu po 28 parų. 9. ABIOTInis skaidymas (neprivalomas) a = deguonies suvartojimas steriliose kolbose po 28 parų, (
mg)deguonies suvartojimas mg bandomosios cheminės medžiagos =. (žr. 1 ir 3 skyrius) VI dalis. uždarytos kolbos bandymas (E metodas) VI.1. BANDYMŲ METODO ESMĖ Į bandomosios cheminės medžiagos tirpalą mineralinėje terpėje, paprastai 2–5 mg/litre, įnešamas užkratas, turintis palyginti mažai mikroorganizmų iš mišrios populiacijos, ir laikomas tamsoje, visiškai pilnose ir uždarytose kolbose pastovios temperatūros sąlygomis. Skaidymas sekamas 28 paras, analizuojant ištirpusį deguonį. Bandomąja medžiaga suvartotas deguonies kiekis, padarius pataisą deguoniui, suvartotam lygiagrečiai daromame tuščiajame bandyme tik su užkratu, yra išreiškiamas procentine TDS arba ChDS verte. VI.2. METODO APRAŠYMAS Vl.2.1. Aparatūra
a)BDS kolbos, su šlifo kamščiais, pvz., 250–300 ml.
b)Vandens vonia arba inkubatorius kolboms laikyti pastovioje temperatūroje (± 1°C) ir be apšvietimo.
c)Didelės stiklinės kolbos (2–5 litrų) terpei ruošti ir BDS kolboms pildyti.
d)Deguonies elektrodas ir matuoklis arba įranga ir reagentai titruoti Winkler’io metodu. VI.2.2. Mineralinės terpės ruošimas Apie pradinių tirpalų ruošimą žr. I.6.2. Sumaišoma po 1 (vieną) ml (a)–(
d)tirpalų ir praskiedžiama skiedimo vandeniu iki 1 litro. VI.2.3. Užkrato ruošimas Užkratas paprastai gaunamas iš nuotekų valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įrenginio, į kuriuos daugiausia patenka buitinės nuotekos, antrinio ištakio. Alternatyvus užkrato šaltinis yra paviršinis vanduo. Paprastai 1 litrui terpės naudojama nuo vieno lašo (0,05
ml)iki 5 ml filtrato; gali tekti daryti bandymus, kad būtų nustatytas tam tikram ištakiui optimalus tūris (žr. I.6.4.2 ir I.6.5). VI.2.4. Kolbų ruošimas Mineralinė terpė stipriai aeruojama ne mažiau kaip 20 min. Kiekviena bandymų serija daroma su mineraline terpe, pagaminta vienoje partijoje. Paprastai terpė yra tinkama naudoti po 20 h laikymo bandymo temperatūroje. Kontrolės tikslams nustatoma ištirpusio deguonies koncentracija; jo vertė 20°C temperatūroje turi būti apie 9 mg/litre. Visi oru prisotintos terpės pernešimo ir užpildymo veiksmai turi būti daromi taip, kad nesusidarytų oro burbuliukai, pvz., naudojami sifonai. Lygiagrečiai paruošiamos BDS kolbų grupės bandomajai ir etaloninei cheminei medžiagai nustatyti, tuo pat metu daromų bandymų serijose. Paruošiamas būtinas skaičius BDS kolbų, įskaitant kolbas tuščiajam bandymui su užkratu, kad galima būtų atlikti ne mažiau kaip po du deguonies suvartojimo matavimus tinkamais laiko tarpais, pvz., po 0, 7, 14, 21 ir 28 parų. Norint užtikrinti galimybę identifikuoti 10 parų langą, kolbų gali reikėti ir daugiau. Į dideles kolbas įpilama visiškai aeruotos mineralinės terpės, kad ji užimtų maždaug trečdalį kolbos tūrio. Tuomet į atskiras dideles kolbas įpilamas reikiamas kiekis bandomosios ir etaloninės cheminių medžiagų pradinių tirpalų taip, kad galutinė cheminių medžiagų koncentracija būtų ne didesnė kaip 10 mg/litre. Į kolbą su tuščiojo kontrolinio bandinio terpe cheminių medžiagų nededama. Norint užtikrinti, kad užkrato aktyvumas nebūtų ribojamas, deguonies koncentracija BDS kolbose neturi sumažėti daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Tai nustato maždaug 2 mg/litre bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ribą. Tačiau sunkiai skaidomų junginių ir tų junginių, kurių TDS mažas, koncentracija gali būti 5–10 mg/litre. Kai kuriais atvejais reikia daryti lygiagrečias bandymų serijas su dviem bandomosios cheminės medžiagos koncentracijomis, pvz., 2 ir 5 mg/litre. Paprastai TDS skaičiuojama remiantis amonio druskų susidarymu, tačiau, jei manoma arba žinoma, kad gali vykti nitrifikavimas, skaičiuojama remiantis nitrato susidarymu (TDSNO3: žr. II.2 priedą). Jei nitrifikavimas vyksta, tačiau ne iki galo, pataisos nitrifikuoti suvartotam deguoniui skaičiuojamos pagal nitrito ir nitrato koncentracijų pokyčius (V priedas). Jei turi būti ištirtas bandomosios medžiagos toksiškumas (pvz., jei anksčiau buvo nustatytos mažos biologinio skaidomumo vertės), reikia turėti dar vieną kolbų seriją. Paruošiama dar viena didelė kolba, kurioje būtų aeruota mineralinė terpė (maždaug trečdalis kolbos tūrio) ir bandomoji bei etaloninė cheminės medžiagos, kurių galutinė koncentracija būtų tokia pati, kaip ir kitose didelėse kolbose. Į tirpalus didelėse kolbose įpilama užkrato iš antrinio ištakio (nuo vieno lašo arba apie 0,05 ml iki 5 ml/litre) arba iš kito šaltinio, pvz., upės vandens (žr. I.6.4.2). Pabaigoje tirpalai skiedžiami aeruota mineraline terpe iki žymės ant kolbos, naudojant į jos dugną nuleistą žarną, kad būtų pasiektas pakankamas maišymas. VI.2.5. Kolbų skaičius tipiškame bandymų cikle Tipiškame bandyme naudojamos tokios kolbos: ne mažiau kaip 10 su bandomąja chemine medžiaga ir užkratu (bandomoji suspensija), ne mažiau kaip 10 tik su užkratu (tuščiasis užkrato bandymas), ne mažiau kaip 10 su etalonine chemine medžiaga ir užkratu (procedūros tikrinimo bandymas), ir, jei būtina, 6 kolbos su bandomąja chemine medžiaga, etalonine chemine medžiaga ir užkratu (toksiškumo kontrolinis bandymas). Tačiau, norint užtikrinti galimybę įdentifikuoti 10 parų langą, kolbų reikėtų maždaug du kartus daugiau. VI.2.6. Bandymų eiga Naudojant žarną, nuleistą į apatinį atitinkamos didelės kolbos ketvirtį (ne į dugną), iš karto išpilstomas kiekvienas paruoštas tirpalas į atitinkamą BDS kolbų grupę, taip kad visos BDS kolbos būtų visiškai užpildytos. Kolbos švelniai patapšnojamos, kad būtų pašalinti visi oro burbuliukai. Taikant Winkler’io arba elektrometrinį metodą, kolbose nustatoma pradinė deguonies koncentracija. Kolbų turinį galima išsaugoti vėlesnei analizei Winkler’io metodu, pridedant mangano (II) sulfato ir natrio hidroksido (pirmasis Winkler’io reagentas). Gerai užkimštos kolbos su deguonimi, surištu į rudą mangano (III) hidratuotą oksidą, laikomos tamsoje 10–20°C temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas, prieš darant likusius veiksmus

DI paaiškinimas pagal oficialų įstatymo tekstą. Orientacinis, nepakeičia teisinės konsultacijos.