LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTRO Į S A K Y M A S DĖL APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIO DOKUMENTO LAND 45-2001 PATVIRTINIMO 2002 m. sausio 3 d. Nr. 4 Vilnius Vadovaudamasis Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų įstatymo (Žin., 2000, Nr. 36-987) trečiojo skirsnio 6 straipsniu „Cheminių medžiagų ir preparatų tyrimas“, Lietuvos Respublikos cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų aplinkai, savybių tyrimo tvarka (Žin., 2001, Nr. 3-60): 1. Tvirtinu Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinį dokumentą LAND 45-2001 „Cheminių medžiagų ir preparatų ekotoksiškumo tyrimo metodai“ (pridedama). 2. Pavedu Aplinkos ministerijos Jungtiniam tyrimų centrui, atsižvelgiant į Tarybos direktyvą 67/458/EC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą bei ženklinimą reglamentuojančių įstatymų ir kitų teisės aktų derinimo su Komisijos direktyvų 98/73/EC ir 2001/59/EC pakeitimais, parengti ir pateikti tvirtinimui Lietuvos aplinkos normatyvinio dokumento LAND 45-2001 papildymų projektus, perkeliant: Komisijos Direktyvos 98/73/EC nuostatas – iki 2003-04-01: (C13) Biokoncentravimas: Testas žuvims srovės pratekėjimo sąlygomis; Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-04-01: (C14) Žuvų jauniklių augimo testas; (C15) Trumpalaikio toksiškumo testas žuvims embriono ir trynio maišelio stadijose; (C20) Daphnia magna reprodukcijos testas; Komisijos Direktyvos 2001/59/EC nuostatas – iki 2003-11-01: (C16) Bitės – Oralinis toksiškumo testas; (C17) Bitės – Ūmus kontaktinio toksiškumo testas; (C18) Adsorbcijos/desorbcijos statinis pusiausvyros metodas; (C19) Adsorbcijos koeficiento nustatymas (KOC) dirvožemyje ir aktyviajame dumble aukštos skyrimo galios skystine chromatografija. 3. Aplinkos ministerijos informacijos kompiuterinėje sistemoje vadovautis reikšminiais žodžiais „valdymo sistema“, „cheminės medžiagos“. Aplinkos Ministras                                                                                                     Arūnas Kundrotas PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2002 m. sausio 3 d. įsakymu Nr. 4 CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ IR PREPARATŲ EKOTOKSIŠKUMO TYRIMO METODAI LAND 45-2001 BENDRASIS ĮVADAS Šiame normatyviniame dokumente pateikiami metodai skirti cheminių medžiagų arba preparatų ekotoksikologinių savybių tyrimams atlikti. Šių tyrimų tikslas: – toksiškumo vandens ekosistemoms nustatymas; – biologiškai skaidomų medžiagų savybių nustatymas; – biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas; – cheminio deguonies suvartojimo nustatymas; – toksiškumo dirvožemio ekosistemoms nustatymas. Žemiau aprašyti cheminių medžiagų ir preparatų tyrimų metodai parengti vadovaujantis Europos Tarybos direktyva 67/548/EEC dėl pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą reglamentuojančių įstatymų, įstatymų papildomų aktų ir administracinių nuostatų derinimo (Council Directive of 27 June 1967 on the approximation of the laws reguliations and administrative provisions relating to the classification packaging and labelling of dangerous substances (67/548/EEC)). Šiame normatyviniame dokumente pateikti ekotoksiškumo tyrimo metodai neapima: – ilgalaikio toksiškumo tyrimo su Daphnia magna; – ilgalaikio toksiškumo tyrimo su žuvimis; – bandymų su aukštesniaisiais augalais. Šių savybių nustatymui parengti metodai bus išleisti dokumentų, skirtų technikos pažangai, pavidalu. Iki to laiko turi būti taikomi atitinkami, tarptautiniu mastu pripažinti ir patvirtinti metodai. ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS ŽUVIMS 1. metodas 1.1. ĮVADAS Šio metodo tikslas yra nustatyti bandomosios medžiagos ūminį letalinį toksiškumą gėlavandenėms žuvims. Norint sėkmingiau pasirinkti tinkamiausią bandymo metodą (stacionarų, pusiau stacionarų ar pratekėjimo sąlygomis), kad visą bandymo laiką būtų užtikrinta pakankamai pastovi bandomosios medžiagos koncentracija, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą. Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą, Pow). 1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Ūminis toksiškumas yra pastebimas neigiamo poveikio reiškinys, sukeltas bandomajai medžiagai veikiant trumpą laiką (kelias paras). Šiame bandyme ūminis toksiškumas išreikiamas medianine letaline koncentracija (LC50) – tokia medžiagos koncentracija vandenyje, kai per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, žūsta 50% bandyme naudotos žuvų populiacijos. Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra išreiškiama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg). 1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymo sąlygomis naudotų rūšių atsakas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga. Šiam bandymui etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos. 1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Ribinis bandymas atliekamas su 100 mg/litre bandomosios medžiagos koncentracija, siekiant parodyti, kad LC50 yra didesnė už šią koncentraciją. Atliekant pilnos apimties bandymą, žuvys 96 valandas veikiamos bandomąja medžiaga, įdėta į vandenį tam tikrame koncentracijų intervale. Mirtingumo duomenys turi būti užrašomi ne mažiau kaip kas 24 valandas ir, jei įmanoma, kiekvienai stebėjimo laiko atkarpai skaičiuojama koncentracija, kuriai esant žūsta 50% žuvų (LC50). 1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso bandymo metodui. Mirtingumas kontroliniuose bandymuose bandymo pabaigoje neturi būti didesnis kaip 10% (arba viena žuvis, jei naudojama mažiau kaip dešimt žuvų). Ištirpusio deguonies koncentracija visą laiką turi būti ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės. Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose. Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti. Medžiagų, kurios: (i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba (ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba (iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose, pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta tirpale (arba, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymams skirtų žuvų įleidimą. Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai. pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu. 1.6. bandymų METODO aprašymas Galima naudoti trijų tipų procedūras: Statinis bandymas (stacionariomis sąlygomis): Toksiškumo bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka (tirpalai visą bandymą nėra atnaujinami, lieka tie patys). Pusiau statinis bandymas (pusiau stacionariomis sąlygomis): Bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka, tačiau per ilgesnį laiko tarpą (pvz., kas 24 valandas) daromas reguliarus dozuojamasis bandomojo tirpalo atnaujinimas. Bandymas pratekėjimo sąlygomis: Toksiškumo bandymas, kai vanduo bandymo talpose atnaujinamas visą laiką, bandomąją medžiagą tiekiant su vandeniu, naudojamu bandymo terpei atnaujinti. 1.6.1. Reagentai 1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2. Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinama praskiedimo vandenyje tiesiogiai. Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms arba kurių didelis Pow, arba toms, kurios labiau sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) labiau užtikrinti galimybę pasiekti soties/pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui ir t.t.). Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, taip pat kontrolinės žuvys turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti parinkta mažiausia įmanoma ir turi būti ne didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės. Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje. 1.6.1.2. Laikymo ir skiedimo vanduo Galima naudoti geriamąjį vandentiekio vandenį (neužterštą potencialiai kenksmingos koncentracijos chloru, sunkiaisiais metalais ar kitomis medžiagomis), geros kokybės gamtinį vandenį arba skiedimo vandenį (žr. 1 priedą). Geriausiai tinka vanduo, kurio bendrasis kietumas yra nuo 10 iki 250 mg/litre (skaičiuojant CaCO3) ir kurio pH yra nuo 6,0 iki 8,5. 1.6.2. Aparatūra Visa aparatūra turi būti pagaminta iš chemiškai inertiškų medžiagų: – automatinio skiedimo sistema (bandymui pratekėjimo sąlygomis), – deguonies matuoklis, – įranga vandens kietumui nustatyti, – atitinkama termostatavimo aparatūra, – pH-metras. 1.6.3. Bandymams skirtos žuvys Žuvys turi būti sveikos ir neturėti jokių matomų apsigimimo požymių. Žuvų rūšį reikia rinktis remiantis praktiniais kriterijais, pvz., lengvumu žuvis gauti ištisus metus ir jas prižiūrėti, patogumu bandyti, santykiniu jautrumu cheminėms medžiagoms, bei kiek nors susijusiais ekonominiais, biologiniais ar ekologiniais faktoriais. Be to, renkantis žuvų rūšis, reikia nepamiršti apie gautų duomenų palyginamumo būtinybę ir esamą tarptautinį derinimą (1 nuoroda). Žuvų, kurios rekomenduojamos naudoti šiame bandyme, sąrašas pateiktas 2 priede. Tinkamiausios rūšys yra danija ir vaivorykštinis upėtakis. 1.6.3.1. Laikymas Geriausia, jei bandymų žuvys būtų vienos populiacijos ir panašaus ilgio bei amžiaus. Žuvys turi būti laikomos bent 12 parų tokiomis sąlygomis: įkrova: atitinkanti sistemą (su recirkuliavimu ar su pratekėjimu) ir žuvų rūšį, vanduo: žr. 1.6.1.2, šviesa: kasdienis apšvietimas nuo 12 iki 16 valandų, ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažiau kaip 80% oro soties vertės, maitinimas: tris kartus per savaitę ar kasdieną, nutraukiant maitinimą prieš 24 valandas iki bandymo pradžios. 1.6.3.2. Mirtingumas Po 48 valandų stabilizavimo laikotarpio užrašomi mirtingumo duomenys ir taikomi tokie kriterijai: – populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10%: visa partija atmetama, – populiacijos mirtingumas 5–10%: papildomai laikoma dar septynias paras. Jei mirtingumas nedidėja, partija priimama, priešingu atveju turi būti atmesta, – populiacijos mirtingumas mažesnis kaip 5%: partija priimama. 1.6.4. Adaptavimas Prieš naudojimą visas žuvis bent septynias paras būtina laikyti vandenyje, kurio kokybė ir temperatūra atitinka bandymo sąlygas. 1.6.5. Bandymo eiga Prieš galutinį bandymą gali būti atliekamas koncentracijų intervalo nustatymo bandymas. Atliekamas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia arba jei tai svarbu, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga. Pagal tai, kokios yra bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės, turi būti pasirinktas statinis bandymas, pusiau statinis ar pratekėjimo sąlygomis, kad būtų įvykdyti kokybės kriterijai. Žuvys veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta žemiau: – trukmė: 96 valandos, – gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 7 vienai koncentracijai, – talpos (indai): tinkamo tūrio, atsižvelgiant į rekomenduotą įkrovą, – įkrova: didžiausia rekomenduota bandymo statinėmis ir pusiau statinėmis sąlygomis įkrova – 1 g/litre; sistemoms su pratekėjimu priimtina didesnė įkrova, – bandomoji koncentracija: ne mažiau kaip penkios koncentracijos, kurios skiriasi pastoviu daugikliu, ne didesniu kaip 2,2, bei, kiek įmanoma, apima mirtingumo intervalą nuo 0 iki 100%, – vanduo: žr. 1.6.1.2, – šviesa: kasdienis apšvietimas, kurio trukmė nuo 12 iki 16 valandų, – temperatūra: tinkama rūšiai (2 priedas), tačiau konkrečiame bandyme palaikoma ± 1°C tikslumu, – ištirpusio deguonies koncentracija: ne mažesnė kaip 60% oro soties vertės pasirinktos temperatūros sąlygomis, – maitinimas: jokio. Žuvys tikrinamos iš pradžių po 2–4 valandų, po to – ne rečiau kaip kas 24 valandas. Žuvis laikoma negyva, jei, liečiant uodeginį peleką (caudal peduncle), ji nereaguoja ir nesimato jokių kvėpavimo judesių. Po apžiūros negyvos žuvys pašalinamos ir užrašomas negyvų žuvų skaičius. Užrašomi visi pastebimi pakitimai (pvz., pusiausvyros netekimas, plaukimo pobūdžio pasikeitimas, kvėpavimo funkcijos, pigmentacijos pokyčiai ir t.t.). Ištirpęs deguonis, pH ir temperatūra turi būti matuojami kiekvieną dieną. Ribinis bandymas Ribinis bandymas atliekamas ta pačia tvarka kaip pilnos apimties bandymas, bet naudojant 100 mg/litre koncentraciją, siekiant įrodyti, kad LC50 yra didesnė už šią koncentraciją. Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymui skirtame vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą). Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 7–10 žuvų, toks pat žuvų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Pagal binominę teoriją, jei bandyme su 10 žuvų mirtingumas yra nulinis, pasikliovimo tikimybė, kad LC50 yra didesnė nei ribiniame bandyme naudota koncentracija, yra 99,9%. Mirtingumo nebuvimas, naudojant 7, 8 ar 9 žuvis, užtikrina bent 99% pasikliovimo tikimybę, kad LC50 yra didesnė nei naudota koncentracija. Jei mirtingumo atvejai pasitaiko, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. Jei stebimi subletaliniai padariniai, tai turi būti užrašyta ataskaitoje. 2. DUOMENYS IR VERTINIMAS Kiekvienam laikotarpiui, kuriam buvo užrašyti rezultatai (24, 48, 72 ir 96 valandos), logaritminiame tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo, nustatyto kiekvienam rekomenduotam veikimo laikotarpiui, procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti LC50 ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas, šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno arba daugiausia iki dviejų reikšmingų skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21). Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės polinkis yra per status, kad būtų galima skaičiuoti LC50, pakanka grafinio šios vertės įverčio. Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% mirtingumo vertės, šių dviejų verčių pakanka nustatyti intervalui, į kurį patenka LC50. Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatus interpretuoti reikia atsargiai. 3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – informacija apie bandymų žuvis (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas, dydis ir kiekvienai bandomajai koncentracijai naudotų žuvų skaičius); – skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, kietumas, temperatūra); – mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas; – visų pagalbinių medžiagų koncentracijos; – naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą naudotos koncentracijos bandomajame tirpale; – jei daroma cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai; – ribinio bandymo, jei jis buvo daromas, rezultatai; – taikytos bandymo metodikos pasirinkimo priežastys ir detalės (pvz., stacionariomis sąlygomis, pusiau stacionariomis sąlygomis, dozavimo srautas, pratekėjimo srautas, ar buvo naudojamas aeravimas, žuvų įkrova ir t.t.); – bandymų įrangos aprašymas; – apšvietimo režimas; – ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra kas 24 valandas; – įrodymas, kad kokybės kriterijai įvykdyti; – lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui pateiktas bendras mirtingumas kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia); – atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje; – jei įmanoma, LC50 vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo ribomis); – statistinės metodikos, taikytos LC50 vertėms nustatyti; – gauti rezultatai, jei naudota etaloninė medžiaga; – didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant mirtingumas bandymo laikotarpiu yra nulinis; mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% mirtingumą. 4. NUORODOS (1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates. (2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio – Static and Flow Through methods – NFT 90-303 June 1985. (3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri – Static and Flow – Through methods – NFT 90-305 June 1985. (4) ISO 7346/1, /2 and /3 – Water Quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cyprinidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow-through method. (5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien für Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden – Part II 1974. (6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15). (7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. (8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980. (9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. (10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978. (11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Pan IV, 16 March 1979. (12) Standard methods for the examination of water and wastewater, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975. (13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979. (14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph. P. und Boje. R. Ökotoxikologie Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. (15) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm. Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99. (16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978. (17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821. (18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32. (19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84. (20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA. 1 priedas Atkurtasis vanduo (Skiedimo vanduo) Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos. Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių. Pradiniai tirpalai CaCl2×2H2O (kalcio chloridas, dihidratas): 11,76 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. MgSO4×7H2O (magnio sulfatas, heptahidratas): 4,93 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas): 2,59 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. KCl (kalio chloridas): 0,23 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Atkurtasis skiedimo vanduo Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir praskiedžiama vandeniu iki 1 litro. Aeruojama tol, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties vertę (OSV). pH turi būti 7,8 ± 0,2. Prireikus pH reguliuojamas NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi). Taip paruoštas skiedimo vanduo laikomas padėtas 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti. Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre (5 mgekv/l). Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis – 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre. Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių. 2 priedas Žuvų rūšys, kurias rekomenduojama naudoti bandymuose: Rekomenduojamos rūšys Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas, °C Rekomenduojamas bandymų gyvūno bendras kūno ilgis, cm Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) nuo 20 iki 24 3,0 ± 0,5 Dryžuotasis danio Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Rainė nuo 20 iki 24 5,0 ± 2,0 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) nuo 20 iki 24 6,0 ± 2,0 Paprastasis karpis Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae nuo 20 iki 24 3,0 ± 1,0 (Tomminck and Schlegel 1850) Red killifish Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae (Peters 1859) Gupi nuo 20 iki 24 3,0 ± 1,0 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) nuo 20 iki 24 5,0 ± 2,0 (Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) nuo 12 iki 17 6,0 ± 2,0 (Walbaum 1988) Margasis upėtakis Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) nuo 20 iki 24 6,0 ± 2,0 Golden orfe Lentelėje nurodytas žuvis lengva auginti ir (arba) jų galima gauti ištisus metus. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandymams skirti gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų. 3 priedas Koncentracija: mirtingumo dalis procentais LC50 nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių ŪMINIS TOKSINIS POVEIKIS DAFNIJOMS 1. metodas 1.1. ĮVADAS Šio bandymo tikslas yra nustatyti tiriamosios medžiagos medianinę efektyvią koncentraciją (EC50) sukeliančią pusės Daphnia magna individų nejudrumą gėlame vandenyje. Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, stabilumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą. Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą). 1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Direktyvos reikalavimas dėl dafnijas veikiančios LC50 laikomas įvykdytu, jei EC50 nustatoma tiksliai šiame bandymo metode aprašytomis sąlygomis. Šiame bandyme ūminis toksinis poveikis išreikiamas medianine efektyvia judrumo slopinimo (imobilizavimo) koncentracija (EC50). Tai koncentracija, išreikšta pradine koncentracijos verte, kurią naudojant per nuolatinio veikimo laikotarpį, kuris turi būti nurodytas, slopinamas 50% bandyme naudotų Daphnia organizmų judrumas. Imobilizavimas: Imobilizuotais laikomi tie gyvūnai, kurie negali plaukti 15 sekundžių laikotarpiu po švelnaus bandymų indo pajudinimo. Visos bandomosios medžiagos koncentracijos yra pateikiamos mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg). 1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga. EEC tarplaboratorinio lyginimo bandymo rezultatų, gautų keturioms medžiagoms, suvestinė pateikta 2 priede. 1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Dafnijos 48 valandas veikiamos bandomąja medžiaga (įdėta į vandenį) tam tikrame koncentracijų intervale. Jei bandymo trukmė mažesnė, tai turi būti patvirtinta bandymų ataskaitoje. Kai kitos bandymų sąlygos yra identiškos ir kai bandomoji medžiaga naudojama atitinkamame koncentracijų intervale, vidutinis poveikio į dafnijos gebėjimą plaukti laipsnis dėl skirtingos bandomosios medžiagos koncentracijos yra taip pat nevienodas. Bandymo pabaigoje negalinčių plaukti dafnijų procentinė dalis, esant skirtingoms koncentracijoms, bus nevienoda. Koncentracijos, kurias naudojant imobilizavimas nulinis arba 100%, gaunamos tiesiogiai, remiantis bandymo metu darytais stebėjimais, tuo tarpu 48 valandų EC50 skaičiuojama, jei tai įmanoma. Šiame metode naudojama statinė sistema, veikimo laikotarpiu bandomieji tirpalai neatnaujinami. 1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Kokybės kriterijai turi būti taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir pilnos apimties bandymo metodui. Bandymo pabaigoje imobilizavimas kontroliniuose bandymuose neturi būti didesnis kaip 10%. Kontrolinėse grupėse bandymams panaudoti Daphnia gyvūnai neturi būti pakibę vandens paviršiuje. Pageidautina, kad ištirpusio deguonies koncentracija bandymų induose visą bandymo laiką turi būti ne mažesnė kaip 3 mg/l. Tačiau jokiomis aplinkybėmis ištirpusio deguonies koncentracija neturi būti mažesnė kaip 2 mg/l. Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti palaikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose. Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti. Medžiagų, kurios: (i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba (ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba (iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose, pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, išmatuota tirpale (ar, jei techniškai tai neįmanoma, išmatuota vandens tūryje) bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš bandymų organizmų įleidimą. Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti atliekami tolesni matavimai. pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu. 1.6. bandymų METODO aprašymas 1.6.1. Reagentai 1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2. Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Jei bandomos didelės koncentracijos, medžiaga gali būti ištirpinta praskiedimo vandenyje tiesiogiai. Paprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant kai kurioms medžiagoms (pvz., vandenyje mažai tirpioms medžiagoms ar kurių didelis Pow, ar toms, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) užtikrinti sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t.t.). Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, kaip papildomas priemones galima panaudoti dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis, ir papildomai kontrolinės dafnijos turi būti veikiamos pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu būdu neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės. Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei pH vertė turi polinkį žymiai pasikeisti, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HCl ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti atliekamas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija arba bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje. 1.6.1.2. Bandymų vanduo Šiame bandyme naudojamas atkurtasis vanduo (žr. 1 priedą ir 2 nuorodą: ISO 6341). Daphnia veisimui rekomenduojama naudoti vandenį, kurio kokybė (pH, kietumas) būtų panaši į bandyme naudojamo vandens kokybę, kad prieš bandymą nereikėtų aklimatizuoti. 1.6.2. Aparatūra Turi būti naudojama įprasta laboratorinė aparatūra ir įranga. Pageidautina, kad su bandomaisiais tirpalais kontaktuojanti įranga būtų pagaminta vien tik iš stiklo: – deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kitokiu įtaisu, tinkamu matuoti ištirpusį deguonį mažo tūrio bandiniuose), – atitinkama termostatavimo aparatūra, – pH-metras, – vandens kietumo nustatymo įranga. 1.6.3. Bandomieji organizmai Daphnia magna yra labiausiai bandymui naudotina rūšis, nors leidžiama naudoti ir Daphnia pulex. Bandymų gyvūnų amžius bandymo pradžioje turi būti ne didesnis kaip 24 valandos, jie turi būti užauginti laboratorijoje, nesirgti akivaizdžiomis ligomis ir būti žinomos kilmės (pvz., veisimo sąlygos, bet koks pradinis apdorojimas ir t.t.). 1.6.4. Bandymų procedūra Siekiant gauti informacijos apie koncentracijų, kurias reikia naudoti pagrindiniame bandyme, intervalą, prieš galutinį bandymą gali būti daromas intervalo nustatymo bandymas. Daromas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos ir, jei reikia, bandymų serija papildoma dar vienu kontroliniu bandymu, kuriame naudojama pagalbinė medžiaga. Dafnijos veikiamos medžiaga, kaip tai aprašyta toliau: – trukmė: geriau 48 valandos, – gyvūnų skaičius: ne mažiau kaip 20 gyvūnų kiekvienai bandomajai koncentracijai, pageidautina, kad jie būtų padalyti į keturias grupes po penkis gyvūnus ar į dvi grupes po dešimt gyvūnų, – įkrova: kiekvienam gyvūnui turi tekti ne mažiau kaip 2 ml bandomojo tirpalo, – bandomoji koncentracija: bandomasis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat dafnijų įleidimą, ir geriau būtų nenaudoti jokio tirpiklio, išskyrus vandenį. Koncentracija parenkama pagal geometrinę progresiją, santykis tarp gretimų koncentracijų turi būti ne didesnis kaip 2,2. Kartu su kontroliniais bandiniais turi būti išbandytos koncentracijos, kuriose imobilizacija po 48 valandų yra 0 ir 100%, ir intervalas tarpinius imobilizacijos laipsnius atitinkančių koncentracijų, leidžiančių skaičiuoti 48 valandų EC50, – vanduo: žr. 1.6.1.2, – šviesa: šviesos ir tamsos ciklas pasirenkamas laisvai, – temperatūra: bandymų temperatūra turi būti nuo 18 iki 22°C, tačiau kiekviename atskirame bandyme ji turi būti palaikoma ± 1°C ribose, – aeravimas: bandomieji tirpalai neturi būti aeruojami burbulais, – šėrimas: šerti neleidžiama. Kontrolinių ir bandomųjų tirpalų pH ir deguonies koncentracija turi būti matuojama bandymo pabaigoje; bandomųjų tirpalų pH vertė turi būti nekeičiama. Lakios medžiagos turi būti bandomos visiškai užpildytuose uždaruose induose, kurie būtų pakankamai dideli, kad juose negalėtų pritrūkti deguonies. Dafnijos tikrinamos ne vėliau kaip po 24 veikimo valandų ir dar kartą po 48 valandų. Ribinis bandymas Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą, esant 100 mg/litre koncentracijai, siekiant parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos pasiekti bandymų vandenyje negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas esant koncentracijai, lygiai medžiagos tirpumui (arba esant didžiausiai koncentracijai, kurioje dar gali susidaryti patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą). Ribinis bandymas turi būti atliekamas, naudojant 20 dafnijų, padalytų į dvi ar keturias grupes, tas pat dafnijų skaičius turi būti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme (-uose). Jei pasitaiko imobilizacijos atvejų, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. 2. DUOMENYS IR VERTINIMAS Kiekvienam laikotarpiui, kuriam rezultatai buvo užrašyti (24 ir 48), logaritminiame-tikimybiniame popieriuje braižoma mirtingumo procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivė. Kai tai įmanoma ir kiekvienam matavimo laikotarpiui reikia įvertinti EC50 ir pasikliovimo ribas (p = 0,05), taikant standartines metodikas; šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno ar daugiausia iki dviejų reikšminių skaitmenų (apvalinimo iki dviejų skaitmenų pavyzdys: 170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21). Tais atvejais, kai atsako procentinės vertės ir koncentracijos priklausomybės kreivės nuožulnumas yra per status, kad būtų galima skaičiuoti EC50, pakanka grafinio šios vertės įverčio. Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kurių santykis 2,2, gaunamos 0 ir 100% imobilizavimo vertės, šių dviejų verčių pakanka pažymėti intervalui, į kurį patenka EC50. Jei pastebėta, kad bandomosios medžiagos patvarumo ar homogeniškumo užtikrinti neįmanoma, tai turi būti pateikta ataskaitoje, o rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai. 3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – informacija apie bandymui panaudotą organizmą (mokslinis pavadinimas, rūšis, tiekėjas ar šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, auginimo metodas, įskaitant maisto šaltinį, rūšį ir kiekį, maitinimo dažnį); – skiedimo vandens šaltinis ir pagrindinės cheminės savybės (pH, temperatūra, kietumas); – mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju pradinio tirpalo ir bandomųjų tirpalų ruošimo metodas; – visų pagalbinių medžiagų koncentracija; – naudotų koncentracijų sąrašas ir visa turima informacija apie bandomosios medžiagos patvarumą bandomajame tirpale; – jei atlikta cheminė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai; – ribinio bandymo, jei jis buvo atliktas, rezultatai; – bandymų įrangos aprašymas; – apšvietimo režimas; – ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, jų pH vertė ir temperatūra; – įrodymai, kad kokybės kriterijai įvykdyti; – lentelė, kurioje kiekvienam rekomenduotam nustatymo laikotarpiui (24 ar 48 valandos) pateiktas bendras imobilizuotų dafnijų skaičius kiekvienai koncentracijai ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia); – atsako procentinės vertės priklausomybės nuo koncentracijos kreivės grafikas bandymo pabaigoje; – jei įmanoma, EC50 vertes kiekvienam rekomenduotam matavimo laikotarpiui (su 95% pasikliovimo riba); – statistinės metodikos, taikytos EC50 vertėms nustatyti; – jei panaudota etaloninė medžiaga, gauti rezultatai; – didžiausia bandomoji koncentracija, kurią naudojant imobilizavimas bandymo laikotarpiu yra nulinis; – mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu sukelianti 100% imobilizavimą. 4. NUORODOS (1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates. (2) International Standard ISO, Water Quality – Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-1989. (3) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera – crusiacea) NFT 90 301 (January 1983). (4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986. (5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (LII). (6) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U. K., 1978. (7) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113. (8) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821. (9) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32. (10) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84. (11) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R. W. A computer program for calculating an LC50 US EPA. 1 priedas Atkurtasis vanduo Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys (pagal ISO 6341) Visos cheminės medžiagos turi būti analiziškai grynos. Vanduo turi būti geros kokybės, distiliuotas vanduo ar dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų ne didesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių. Pradiniai tirpalai CaCl2 2H2O (kalcio chloridas, dihidratas): 11,76 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. MgSO4 7H2O (magnio sulfatas, heptahidratas): 4,93 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. NaHCO3 (natrio hidrokarbonatas): 2,59 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. KC1 (kalio chloridas): 0,23 g Ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro. Atkurtasis skiedimo vanduo Sumaišoma po 25 ml kiekvieno iš šių keturių tirpalų ir bendras tūris papildomas vandeniu iki 1 litro. Skiedimo vanduo aeruojamas, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro soties lygį. Paruošto skiedimo vandens pH turi būti 7,8 ± 0,2. Jeigu yra būtina, pH vertė koreguojama NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos rūgštimi). Taip paruoštas skiedimo vanduo paliekamas stovėti 12 valandų, jo nereikia daugiau aeruoti. Ca ir Mg jonų koncentracijų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre. Ca ir Mg jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jonų santykis lygus 10:1. Bendrasis šio tirpalo šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre. Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo būdo neturi keisti vandens sudėties arba savybių. 2 priedas EEC tarplaboratorinio palyginamojo bandymo (ring test), atlikto 1978 (taip pat cituojamo 2 nuorodoje), rezultatų suvestinė Įspėjimas: šio tarplaboratorinio palyginamojo bandymo tikslas buvo nustatyti 24 valandų EC50. Naudota medžiaga: 1) Kalio bichromatas 2) Tetrapropilbenzeno sulfoninė rūgštis 3) Tetrapropilbenzeno natrio sulfonatas 4) Kalio 2,4,5-trichlorfenoksiacetatas Medžiaga Dalyvavusių laboratorijų skaičius Skaičiavimams naudotų rezultatų skaičius 24 h EC50, mg/l,vidutinė vertė 1 46 129 1,5 2 36 108 27 3 31 84 27 4 32 72 770 3 priedas Koncentracijos pavyzdys: imobilizavimo procentinė dalis EC50 nustatymo pavyzdys, naudojant logaritminį-tikimybinį popierių Imobilizacija,% DUMBLIŲ SLOPINIMO BANDYMAS 1. metodas 1.1. ĮVADAS Šio bandymo tikslas yra nustatyti pasekmes, tiriamajai medžiagai veikiant vienaląsčių žaliųjų dumblių rūšių augimą. Per palyginti trumpai (72 valandas) trunkančius bandymus galima įvertinti poveikį kelioms kartoms. Šį metodą galima pritaikyti įvairioms vienaląsčių dumblių rūšims, tokiu atveju su bandymo ataskaita turi būti pateiktas metodo aprašymas. Šį metodą lengviausia taikyti vandenyje tirpioms medžiagoms, kai tikimasi, kad bandymo sąlygomis jos išlieka vandenyje. Metodą galima taikyti medžiagoms, kurios tiesiogiai netrukdo matuoti dumblių augimo. Prieš pradedant bandymą, pageidautina turėti kiek galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpumą vandenyje, garų slėgį, cheminį patvarumą, disociacijos konstantas ir biologinį skaidomumą. Planuojant bandymą ir interpretuojant jo rezultatus, turi būti atsižvelgta į papildomą informaciją (pvz., struktūrinę formulę, grynumo laipsnį, reikšmingesnių priemaišų prigimtį ir procentinį kiekį, priedų buvimą ir jų kiekį, pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą). 1.2. APIBRĖŽIMAI IR VIENETAI Ląstelių tankis: ląstelių skaičius viename mililitre. Augimas: ląstelių tankio padidėjimas per bandymo laiką. Augimo greitis: ląstelių tankio didėjimas per laiko vienetą. EC50: šiame metode – tai tokia bandomosios medžiagos koncentracija, kurioje 50% sumažėja augimas (EbC50) arba augimo greitis (ErC50), lyginant su kontroliniu bandymu. NOEC (maksimali neveikianti koncentracija): šiame metode – tai didžiausia bandomoji koncentracija, kurioje nėra statistiškai patikimo augimo arba augimo greičio sumažėjimo, lyginant su kontroliniu bandymu. Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija yra skaičiuojama mase tūrio vienetui (mg/litre) arba mase masės vienetui (mg/kg). 1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS Kaip priemonė parodyti, kad laboratorinėmis bandymų sąlygomis naudojamų rūšių jautrumas žymiai nepakito, gali būti atliekamas bandymas su etalonine medžiaga. Jei panaudota etaloninė medžiaga, rezultatai turi būti pateikti ataskaitoje. Etalonine medžiaga galima naudoti kalio bichromatą, tačiau jo spalva gali turėti įtakos šviesos, kurią gauna ląstelės, kokybei ir intensyvumui bei spektrofotometrinių nustatymų, jei jie daromi, rezultatams. Kalio bichromatas buvo naudojamas tarptautiniame tarplaboratoriniame bandyme (žr. 3 nuorodą ir 2 priedą). 1.4. BANDYMŲ METODO ESMĖ Galima atlikti ribinį bandymą su 100 mg/litre koncentracija, norint parodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Eksponentiškai augančios atrinktų žaliųjų dumblių kultūros apibrėžtomis sąlygomis per kelias kartas yra veikiamos įvairių koncentracijų bandomosios medžiagos tirpaluose. Bandomieji tirpalai inkubuojami 72 valandoms; per tą laiką ne mažiau kaip kas 24 valandas kiekviename tirpale matuojamas ląstelių tankis. Nustatomas augimo slopinimas, lyginant su kultūros augimu kontroliniame bandyme. 1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI Kokybės kriterijai turi būti taikomi tiek ribinio bandymo metodui, tiek ir pilnos apimties bandymo metodui. Ląstelių tankis kontrolinių bandymų kultūrose per tris paras turi būti padidėjęs bent 16 kartų. Bandomosios medžiagos koncentracija visą bandymo laiką turi būti laikoma 80% pradinės koncentracijos vertės ribose. Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terpėje ir kurių tirpalai patvarūs, t.y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, nesuyra, nesihidrolizuoja ar neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardinę medžiagos koncentraciją. Turi būti pateikti įrodymai, kad bandomosios koncentracijos buvo išlaikytos per visą bandymą ir kad kokybės kriterijai buvo įvykdyti. Medžiagų, kurios: (i) mažai tirpsta bandymo terpėje, arba (ii) gali sudaryti patvarias emulsijas ar suspensijas, arba (iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose, pradine koncentracija turi būti laikoma koncentracija, nustatyta bandymo pradžioje. Koncentracija turi būti nustatyta po to, kai nusistovi pusiausvyra. Visais atvejais, norint patvirtinti tikrąsias veikimo koncentracijas arba kokybės kriterijų vykdymą, bandymo metu turi būti daromi tolesni matavimai. Yra pripažįstama, kad per tą laiką, kol vyksta bandymas, žymus bandomosios medžiagos kiekis gali būti sulaikytas dumblių biomasėje. Taigi, siekiant parodyti, kad vykdomi aukščiau minėti kokybės kriterijai, turi būti atsižvelgta ir į medžiagos kiekį, kuris patenka į dumblių biomasę, ir į medžiagos kiekį tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, į vandens tūryje nustatytą medžiagos kiekį). Tačiau, kadangi medžiagos koncentracijos dumblių biomasėje nustatymas gali kelti esminių techninių problemų, atitikimas kokybės kriterijams gali būti parodytas atliekant bandymą su didžiausia medžiagos koncentracija, bet be dumblių, ir išmatuojant jos koncentraciją tirpale (arba, jei tai techniškai neįmanoma, vandens tūryje) bandymo pradžioje ir pabaigoje. 1.6. bandymų PROCEDŪROS aprašymas 1.6.1. Reagentai 1.6.1.1. Bandomųjų medžiagų tirpalai Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant tiriamąją medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2. Pasirinktų bandymo koncentracijų tirpalai ruošiami kartotines pradinio tirpalo dalis įpilant į dumblių pradinę kultūrą (žr. 1 priedą). Įprastai medžiagos turi būti bandomos tik iki tirpumo ribos. Siekiant užtikrinti kai kurių medžiagų (pvz., vandenyje mažai tirpių medžiagų ar kurių didelis Pow, arba tų, kurios sudaro patvarią dispersiją, o ne tikrąjį tirpalą vandenyje) sąlygas pasiekti soties arba pastovią koncentraciją, priimtina daryti bandymą virš medžiagos tirpumo ribos. Tačiau yra svarbu, kad tokia koncentracija netrikdytų bandymo sistemos kitais atžvilgiais (pvz., kad vandens paviršiuje nesusidarytų bandomosios medžiagos plėvelė, kuri neleistų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t.). Ruošiant vandenyje mažai tirpių medžiagų pradinius tirpalus arba siekiant pagerinti šių medžiagų dispergavimą bandomojoje terpėje, galima panaudoti kaip papildomas priemones dispergavimą ultragarsu, organinius tirpiklius, emulsiklius ar dispergatorius. Kai naudojamos tokios pagalbinės medžiagos, visuose bandomųjų koncentracijų tirpaluose turi būti toks pat pagalbinės medžiagos kiekis ir papildomi kontroliniai bandiniai turi būti veikiami pagalbine medžiaga, kurios koncentracija būtų tokia pat, kaip ir bandymų serijoje. Tokių pagalbinių medžiagų koncentracija turi būti kuo mažesnė ir jokiu atveju neturi būti didesnė kaip 100 mg/litre bandomosios terpės. Bandymas turi būti atliekamas nereguliuojant pH vertės. Jei yra įrodymų apie žymų pH vertės kitimą, patartina bandymą kartoti reguliuojant pH vertę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vertė turi būti pakoreguota iki skiedimo vandens pH vertės, jei nėra ypatingos priežasties to nedaryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH reguliavimas turi būti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncentracija pradiniame tirpale žymiai nepasikeistų. Jei, reguliuojant pH, vyksta kokia nors cheminė reakcija ar bandomoji medžiaga fiziškai krenta į nuosėdas, tai turi būti nurodyta ataskaitoje. 1.6.1.2. Bandymų terpė Vanduo turi būti geros kokybės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, kurio savitasis laidumas būtų mažesnis kaip 5mScm-1. Vandens distiliavimo aparate neturi būti jokių varinių detalių. Rekomenduojama terpė: Pagal žemiau pateiktą lentelę ruošiami keturi pradiniai tirpalai. Pradiniai tirpalai sterilizuojami membraninės filtracijos arba autoklavavimo būdu ir laikomi tamsoje 4°C temperatūroje. Pradinis tirpalas Nr. 4 turi būti sterilizuojamas, tik filtruojant pro membraną. Šie pradiniai tirpalai skiedžiami, kad bandomuosiuose tirpaluose būtų gautos galutinės mitybinių medžiagų koncentracijos. Mitybinė terpė Koncentracija pradiniame tirpale Galutinė koncentracija bandomajame tirpale 1 pradinis tirpalas: mitybiniai makroelementai NH4C1 1,5 g/l 15 mg/l MgCl2 6H2O 1,2 g/l 12 mg/l CaCl2 2H2O 1,8 g/l 18 mg/l MgSO4 7H2O 1,5 g/l 15 mg/l KH2PO4 0,16 g/l 1,6 mg/l 2 pradinis tirpalas: Fe-EDTA FeCl3·6H2O 80 mg/l 0,08 mg/l Na2EDTA 2H2O 100 mg/l 0,1 mg/l 3 pradinis tirpalas: mikroelementai H3BO3 185 mg/l 0,185 mg/l MnCl2 4H2O 415 mg/l 0,415 mg/l ZnCl2 3 mg/l 3 × 10-3 mg/l CoCl2 6H2O 1,5 mg/l 1,5 × 10-3 mg/l CuCl2 2H2O 0,01 mg/l 10-5 mg/l Na2MoO4 2H2O 7 mg/l 7 × 10-3 mg/l 4 pradinis tirpalas: NaHCO3 50 g/l 50 mg/l NaHCO3 Kai nusistovi pusiausvyra su oru, terpės pH vertė yra lygi maždaug 8. 1.6.2. Aparatūra – Įprastoji laboratorijos įranga. – Atitinkamo tūrio bandymų kolbos (pvz., jei bandomojo tirpalo tūris 100 ml, tinka 250 ml tūrio kūginės kolbos). Visos kolbos turi būti vienodos medžiagos ir matmenų atžvilgiu. – Kultūros auginimo aparatūra: spinta ar kamera, kurioje temperatūrą būtų galima palaikyti intervale nuo 21°C iki 25°C ± 2oC tikslumu ir kurioje būtų nuolatinis tolygus apšvietimas intervale nuo 400 iki 700 nm. Jei dumblių kontrolinės kultūros pasiekė rekomenduotą augimo greitį, galima daryti prielaidą, kad augimo sąlygos, įskaitant šviesos intensyvumą, buvo tinkamos. – Rekomenduojama, kad šviesos intensyvumas bandomųjų tirpalų viduriniame lygyje būtų intervale nuo 60 iki 120 μE m-2 s-1 (nuo 35 iki 70 × 1018 fotonų m-2 s-l), kai matuojama intervale nuo 400 iki 700 nm, naudojant tinkamą jutiklį. Jei naudojami apšvietos matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, yra priimtinas lygiavertis intervalas nuo 6 000 iki 10 000 lx. Tokį šviesos intensyvumą galima pasiekti, jei 0,35 m atstumu nuo dumblių kultūros pastatomos nuo keturių iki septynių 30 W universalaus tipo baltų dienos šviesos lempų (spalvos temperatūra maždaug 4300 K). – Ląstelių tankio matavimai turi būti atliekami naudojant tiesioginį gyvų ląstelių skaičiavimo metodą, pvz., mikroskopą su skaičiavimo kamera. Tačiau gali būti naudojami kiti metodai (fotometrija, turbidimetrija,…), jei jie yra pakankamai jautrūs ir jei būtų parodyta, kad jų rezultatai pakankamai gerai koreliuoja su ląstelių tankiu. 1.6.3. Bandomieji organizmai Patariama naudoti greitai augančių žaliųjų dumblių rūšis, nes jas patogu auginti ir bandyti. Geriausia naudoti šias rūšis: Selenastrum capricornutum, pvz., ATCC 22662 arba CCAP 278/4, Scenedesmus subspicatus, pvz., 86.81 SAG, Pastaba: ATCC = American Type Culture Collection (U. S. A.) CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U. K.) SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F. R. G.) Jei naudojamos kitos rūšys, turi būti nurodyta padermė. 1.6.4. Bandymų procedūra Koncentracijos intervalas, kuriame tiriamosios medžiagos veikimas būtų pamatuojamas, nustatomas remiantis intervalo nustatymo bandymų rezultatais. Du augimo matavimo būdai (biomasės kiekio ir augimo greičio nustatymas) gali duoti nesulyginamus augimo inhibavimo rezultatus; abu turi būti taikomi intervalo nustatymo bandyme, siekiant užtikrinti, kad geometrine progresija parinktos koncentracijos leistų įvertinti EbC50 ir ErC50. Pradinis ląstelių tankis Rekomenduojama, kad pradinis bandymo kultūrų Selenastrum capricornutum ir Scenedesmus subspicatus ląstelių tankis būtų apie 104 ląstelių/ml. Kai naudojamos kitos rūšys, biomasė turi būti panaši. Bandomosios medžiagos koncentracija Bandymui imamos bent penkios geometrine progresija didėjančios koncentracijos, kad santykis tarp gretimų būtų ne didesnis kaip 2,2. Mažiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi neveikti dumblių augimo. Didžiausios koncentracijos bandomoji medžiaga turi inhibuoti augimą bent 50%, lyginant su kontroliniu bandymu, ir būtų geriausia, jei augimas būtų visiškai sustabdytas. Lygiagrečių bandymų skaičius ir kontroliniai bandymai Pagal bandymo schemą su kiekviena bandomąja koncentracija turi būti atliekami trys lygiagretūs bandymai. Daromi trys kontroliniai bandymai be bandomosios medžiagos, ir, jei reikia, dar daromi trys kontroliniai bandymai su pagalbine medžiaga. Jei pasiteisina, bandymo schemą galima keisti, didinant koncentracijų skaičių ir mažinant kartotinių bandymų vienai koncentracijai skaičių. Bandymų eiga Bandymų kultūros su reikiama bandomosios medžiagos koncentracija ir reikiamu dumblių kiekiu ruošiamos į reikiamą kiekį iš anksto paruoštos dumblių kultūros pilant kartotinius bandomosios medžiagos pradinių tirpalų tūrius (žr. 1 priedą). Kolbos su kultūra supurtomos ir statomos į kultūros auginimo aparatą. Siekiant bandomuosiuose tirpaluose pagerinti dujų apykaitą ir sumažinti pH kitimą, dumblių ląstelės suspenduojamos, tirpalus purtant, maišant ar barbotuojant per juos orą. Kultūros turi būti laikomos temperatūrų intervale nuo 21 iki 25°C, reguliuojant ± 2°C tikslumu. Kiekvienoje kolboje ląstelių tankis nustatomas bent po 24, 48 ir 72 valandų nuo bandymo pradžios. Kai ląstelių tankis matuojamas kitu nei tiesioginis skaičiavimas metodu, fonui nustatyti naudojama filtruota dumblių terpė su atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija. pH vertė nustatoma bandymo pradžioje ir po 72 valandų. pH vertė kontroliniuose bandymuose per visą bandymo laiką neturi pasikeisti daugiau kaip 1,5 vieneto. Lakių tiriamųjų medžiagų bandymas Iki šiol nėra visuotinai priimto būdo lakių medžiagų išbandymui. Jei žinoma, kad medžiaga turi polinkį garuoti, galima naudoti uždaras bandymų kolbas su padidintu laisvu tūriu virš tirpalo. Skaičiuojant uždarų kolbų laisvąjį tūrį, turi būti atsižvelgta į CO2 trūkumo galimybę. Buvo pasiūlyti šio metodo variantai (žr. 4 nuorodą). Reikia stengtis nustatyti tirpale likusios medžiagos kiekį, ir patariama ypač atsargiai interpretuoti bandymų rezultatus, gautus su lakiomis medžiagomis uždaroje sistemoje. Ribinis bandymas Taikant šiame bandymo metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai siekiama įrodyti, kad EC50 yra didesnė nei ši koncentracija. Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos bandymų vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi būti atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (ar su didžiausia koncentracija, kurioje dar susidaro patvari suspensija) naudojamoje terpėje (taip pat žr. 1.6.1.1 punktą). Turi būti atliekama ne mažiau kaip trys ribiniai bandymai, toks pat turi būti ir kontrolinių bandymų skaičius. Ribiniame bandyme turi būti naudojami du augimo matavimo būdai (biomasės kiekis ir augimo greitis). Jei ribiniame bandyme, lyginant su kontroliniu bandymu, nustatomas 25% arba didesnis vidutinis biomasės kiekio arba augimo greičio mažėjimas, turi būti atliekamas pilnos apimties bandymas. 2. DUOMENYS IR VERTINIMAS Išmatuotas ląstelių tankis bandomosiose kultūrose ir kontroliniuose bandiniuose kartu su bandomosios medžiagos koncentracijomis ir matavimo laikais pateikiamas lentelėje. Norint gauti augimo kreives, vidutinė ląstelių tankio vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai ir kontroliniuose bandiniuose vaizduojama grafiškai laiko atžvilgiu (0–72 h). Turi būti taikomi du žemiau pateikti būdai, kad būtų galima įvertinti koncentracijos ir jos poveikio priklausomybę. Kai kurios medžiagos, būdamos mažos koncentracijos, gali skatinti augimą. Turi būti įskaitomi tik tie duomenų taškai, kuriuose inhibavimas kinta nuo 0 iki 100%. 2.1. Plotų po augimo kreivėmis lyginimas Plotas tarp augimo kreivės ir horizontaliosios tiesės N = N0 gali būti apskaičiuotas taikant formulę: čia: A = plotas, N0 = ląstelių skaičius laiku t0 (bandymo pradžia), N1 = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku t1, Nn = išmatuotas ląstelių skaičius/ml laiku tn, t1 = pirmojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios, tn = n-ojo matavimo laikas nuo bandymo pradžios, n = nuo bandymo pradžios darytų matavimų skaičius. Ląstelių augimo inhibavimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (IA) apskaičiuojama taikant formulę: čia: Ac = plotas tarp augimo kreivės, gautos kontroliniame bandyme, ir horizontaliosios tiesės N = N0, At = plotas tarp augimo kreivės, gautos koncentracijai t, ir horizontaliosios tiesės N = N0. IA vertės atitinkamų koncentracijų atžvilgiu atidedamos pusiau logaritminiame ar pusiau logaritminiame tikimybiniame popieriuje. Jei vertės atidedamos tikimybiniame popieriuje, per taškus vedama tiesė arba iš akies, arba skaičiuojant iš regresijos lygties. EC50 įvertinama iš regresijos tiesės, randant joje koncentracijos vertę, kuri atitinka 50% inhibavimą (IA = 50%). Norint šią vertę pažymėti vienareikšmiai, kaip gautą būtent šiuo skaičiavimo metodu, pasiūlyta vartoti simbolį EbC50. Svarbu, kad EbC50 būtų kiekybiškai nustatomas ir pateikiamas kartu su atitinkamu veikimo laikotarpiu, pvz., EbC50 (0–72 h). 2.2. Augimo greičių lyginimas Vidutinis eksponentiškai augančių kultūrų savitasis augimo greitis (μ) gali būti apskaičiuotas pagal formulę: čia: t0 – bandymo pradžios laikas. Kitaip augimo vidutinio savitojo greičio vertė gali būti gauta iš regresijos tiesės kampinio koeficiento ln N priklausomybės nuo laiko grafike. Savitojo augimo greičio mažėjimo procentinė vertė kiekvienai bandomosios medžiagos koncentracijai (Iμt) skaičiuojama pagal formulę: čia: μc= vidutinis savitasis augimo greitis kontroliniame bandyme, μt = vidutinis savitasis augimo greitis, kai bandomoji koncentracija t. Kiekvienai koncentracijai gautos savitojo augimo greičio mažėjimo vertės ir kontrolinės greičio vertės santykio procentinė vertė brėžiama koncentracijos logaritmo atžvilgiu. Iš gauto grafiko galima gauti EC50 vertę. Norint vienareikšmiai pažymėti šiuo metodu gautą EC50, pasiūlyta naudoti simbolį ErC50. Turi būti nurodytos matavimo laiko ribos, pvz., jei vertė gauta 0 ir 72 valandų laikotarpiui, simbolis užrašomas ErC50 (0–72 h). Pastaba: savitasis augimo greitis yra logaritminis dydis, ir nedideli augimo greičio pokyčiai gali būti didelių biomasės pokyčių priežastimi. Taigi EbC ir ErC skaitmeninės vertės nėra palyginamos. 2.3. NOEC skaičiavimas NOEC (maksimali neveikianti koncentracija) nustatoma taikant didelio skaičiaus bandinių lyginimo statistinę procedūrą (pvz., dispersinė analizė ir Dunnett’o testas), naudojant individualias kartotines vertes A (žr. 2.1 poskyrį) arba μ (žr. 2.2 poskyrį) reikšmes. 3. ATASKAITA Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta, jei įmanoma, tokia informacija: – bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys; bandomieji organizmai: kilmė, laboratorinė kultūra, padermės numeris, ir auginimo metodas; – bandymų sąlygos: – bandymo pradžios ir pabaigos data bei jo trukmė, – temperatūra, – terpės sudėtis; – auginimo aparatūra; – tirpalų pH bandymo pradžioje ir pabaigoje (turi būti pateiktas aiškinimas, jei stebimas pH vertės nukrypimas yra didesnis nei 1,5 vieneto); – nešiklis ir metodas, taikytas soliubilizuoti bandomąją medžiagą, bei nešiklio koncentracija bandomuosiuose tirpaluose; – šviesos intensyvumas ir kokybė; – bandomosios koncentracijos (matuotos ar vardinės); – rezultatai: – ląstelių tankis ki …