LIETUVOS RESPUBLIKOS APLINKOS MINISTERIJA Į S A K Y M A S DĖL LIETUVOS APLINKOS APSAUGOS NORMATYVINIŲ DOKUMENTŲ LAND 74-2005, LAND 75-2005, LAND 76-2005 IR LAND 77-2005 PATVIRTINIMO 2005 m. spalio 3 d. Nr. D1-478 Vilnius Vadovaudamasis Cheminių medžiagų ir preparatų, galinčių sukelti pavojų žmogaus sveikatai ir aplinkai, savybių tyrimo tvarkos, patvirtintos sveikatos apsaugos ministro ir aplinkos ministro 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymu Nr. 762/556 (Žin., 2001, Nr. 3-60), 11 punktu, 1. Tvirtinu pridedamus Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyvinius dokumentus: 1.1. LAND 74-2005 „Dirvožemio mikroorganizmai. Azoto transformavimo tyrimas (C.21)“; 1.2. LAND 75-2005 „Dirvožemio mikroorganizmai. Anglies transformavimo tyrimas (C.22)“; 1.3. LAND 76-2005 „Aerobinis ir anaerobinis transformavimas dirvožemyje (C.23)“; 1.4. LAND 77-2005 „Aerobinis ir anaerobinis transformavimas vandens telkinių dugno nuosėdų sistemose (C.24)“. 2. Nustatau, kad 1 punkte nurodyti Lietuvos Respublikos aplinkos apsaugos normatyviniai dokumentai yra privalomi juridiniams ir fiziniams asmenims, nustatyta tvarka atliekantiems cheminių medžiagų ir preparatų tyrimus. APLINKOS MINISTRAS                                                                          ARŪNAS KUNDROTAS ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478 LAND 74-2005 „DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. AZOTO TRANSFORMAVIMO TYRIMAS (C.21)“ I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šiame aplinkos apsaugos normatyviniame dokumente aprašytas laboratorinis metodas, skirtas tirti ilgalaikius cheminių medžiagų vienkartinio veikimo poveikius azoto transformavime dalyvaujančių dirvožemio mikroorganizmų aktyvumui. Tyrimų metodas daugiausia pagrįstas Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijos (European and Mediterranean Plant Protection Organization) rekomendacijomis (1). Tačiau buvo atsižvelgta ir į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos Biologische Bundesanstalt (2), JAV Aplinkos apsaugos agentūros (3), SETAC (4) ir Tarptautinės standartizacijos organizacijos (5) rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių ir nuosėdų atrankos (6) buvo susitarta dėl šiam tyrimui skirtų  naudoti dirvožemių tipo ir skaičiaus. Dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (7) ir Belgirate seminaro rekomendacijomis. Įvertinant tiriamųjų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti jų poveikio dirvožemio mikrobiniam aktyvumui efektus, pvz., kai reikia turėti duomenis apie galimus šalutinius augalų apsaugos produktų poveikius (šalutinius efektus) dirvožemio mikroflorai arba kai tikimasi kitų, nei augalų apsaugos produktai, cheminių medžiagų galimo poveikio dirvožemio mikroorganizmams. Azoto transformavimo tyrimas atliekamas siekiant nustatyti tokių cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroflorai efektus. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos (pvz., augalų apsaugos produktai, trąšos, miškininkystėje naudojamos cheminės medžiagos), atliekami azoto ir anglies transformavimo tyrimai. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, pakanka azoto transformavimo tyrimo. Tačiau, jei atliekant tokių cheminių medžiagų azoto transformavimo tyrimą, jų EC50 vertės patenka į intervalą, nustatytą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitrapirinui), papildomai informacijai gauti gali būti atliekamas anglies junginių transformavimo tyrimas. Dirvožemis susideda iš gyvųjų ir negyvųjų komponentų, esančių sudėtiniuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai vaidina svarbų vaidmenį derlingų dirvožemių organinių medžiagų visumos skaidyme ir transformavime, kur didelis skaičius rūšių daro poveikį  dirvožemio derlingumui. Visoks ilgalaikis tokių biocheminių procesų trukdymas gali pažeisti mitybinių komponentų ciklą, ir tai gali pakeisti dirvožemio derlingumą. Anglies ir azoto junginių transformavimas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors mikroorganizmų bendrijos, kurių dėka šie procesai vykdomi, įvairiuose dirvožemiuose vienas nuo kito skiriasi, transformavimo keliai iš esmės yra tie patys. Aprašytas tyrimo metodas skirtas nustatyti tiriamosios medžiagos ilgalaikius neigiamus poveikius (efektus) azoto transformavimui aerobiniuose paviršiniuose dirvožemiuose. Be to, šis tyrimų metodas leidžia įvertinti tiriamosios medžiagos poveikio efektus mikrofloros vykdomam  anglies junginių transformavimui. Nitratų susidarymas vyksta po anglies ir azoto jungčių skilimo. Taigi jei yra nustatyta, kad apdorotame ir kontroliniame dirvožemiuose nitratų sudarymo greitis yra vienodas, yra labai tikėtina, kad pagrindiniai anglies junginių skilimo keliai yra nepaliesti ir funkcionuoja. Tyrimui parinktas substratas (liucernos šieno milteliai) turi tinkamą anglies ir azoto santykį (paprastai nuo 12/1 iki 16/1). Dėl šios priežasties anglies trūkumas tyrimo metu būna sumažintas ir, jei cheminė medžiaga pažeistų mikroorganizmų  bendrijas, jos galėtų atsistatyti per laikotarpį iki 100 parų. Tyrimai, kurių pagrindu parengtas šis tyrimų metodas, iš pradžių buvo skirti medžiagoms, kurių atveju kiekį, pasiekiantį dirvožemį, buvo galima numatyti. Taip būna, pvz., naudojant augalų apsaugos produktus, kurių laukuose naudojama medžiagos norma yra žinoma. Tiriant agrochemines medžiagas pakanka dviejų dozių, atitinkančių numatomą arba prognozuojamą naudojimo normą. Agrochemines medžiagas galima tirti skaičiuojant arba tyrimui imti kaip veikliuosius ingredientus (a. i.), arba kaip preparatus. Tačiau tyrimo galimybės nėra apribotos agrocheminėmis medžiagomis. Keičiant tiek į dirvožemį dedamos tiriamosios medžiagos kiekį, tiek ir duomenų įvertinimo būdą, tyrimo metodą dar galima panaudoti ištirti cheminėms medžiagoms, kurių kiekis, tikėtinai patenkantis į dirvožemį, nėra žinomas. Taigi jei tai neagrocheminės medžiagos, nustatoma kaip kelių skirtingų koncentracijų medžiaga veikia azoto transformavimą. Šių tyrimų duomenys yra naudojami dozės ir atsako santykio kreivei sudaryti ir ECx vertei apskaičiuoti, kur x yra apibrėžiamas kaip poveikio efekto  %. II. NUORODOS 2. Šis tyrimų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos OECD TG 216 (2000) metodą. III. APIBRĖŽIMAI 3. Azoto transformavimas – mikroorganizmų atliekamas azoto turinčių organinių medžiagų visumos galutinis skaidymas, praeinantis per amonifikacijos ir nitrifikacijos procesus iki būdingo galutinio produkto – nitrato. 4. ECx (efektyvioji koncentracija) – tiriamosios medžiagos dirvožemyje koncentracija, dėl kurios azoto transformavimas iki nitrato inhibuojamas x procentų. 5. EC50 (medianinė efektyvioji koncentracija) – tiriamosios medžiagos dirvožemyje koncentracija, kuriai esant azoto transformavimas iki nitrato inhibuojamas 50 procentų (50  %). IV. ETALONINĖS MEDŽIAGOS 6. Etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos. V. PRINCIPAS 7. Prasijotas dirvožemis yra pagerinamas augalinių pašarų milteliais ir apdorojamas įmaišant tiriamosios medžiagos arba paliekamas neapdorotas (kontrolinis). Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, rekomenduojama naudoti bent dvi tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurios parenkamos pagal didžiausią laukuose numatomą koncentraciją. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo parų apdoroti ir kontroliniai dirvožemio mėginiai ekstrahuojami tinkamu tirpikliu ir ekstraktuose nustatomas nitrato kiekis. Lyginamas nitrato sudarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose mėginiuose ir apskaičiuojamas apdorotojo mėginio procentinis nuokrypis nuo kontrolinio mėginio. Visi tyrimai vykdomi ne mažiau kaip 28 paras. Jei 28 parą skirtumas tarp apdoroto ir neapdoroto dirvožemio yra 25  % arba didesnis, matavimai tęsiami ne daugiau kaip iki 100 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, sudaromos serijos į dirvožemio mėginius dedant kelių koncentracijų tiriamosios medžiagos, ir susidariusio nitrato kiekis apdorotuose ir kontroliniuose mėginiuose matuojamas po 28 inkubavimo parų. Daugelio koncentracijų tyrimo rezultatai analizuojami pagal regresijos modelį ir apskaičiuojama ECx vertė (t. y. EC50, EC25 ir/arba EC10). Žr. apibrėžimus. VI. TYRIMO PAGRĮSTUMAS 8. Tyrimų su agrocheminėmis medžiagomis rezultatų įvertinimas yra pagrįstas sąlyginai mažu [t. y. vidutinė vertė (±25  %)] nitrato koncentracijos skirtumu tarp kontrolinių ir apdorotų dirvožemio mėginių, taigi didelė kontrolinių mėginių duomenų sklaida gali būti klaidingų rezultatų priežastis. Todėl kartotinių kontrolinių mėginių rezultatų skirtumas turi būti mažesnis kaip (±15)  %. VII. TYRIMO EIGA 9. Aparatūra 9.1. Naudojami tyrimui skirti indai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos. Jie turi būti reikiamos talpos, atsižvelgiant į esamą dirvožemių inkubavimo procedūrą, t. y. inkubavimą vieno  vientiso mėginio arba serijos atskirų dirvožemio vienkartinių mėginių (žr. 15.1.2 punktą). Reikia imtis priemonių kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo pačiu užtikrinti dujų mainus tyrimo metu (pvz., indai gali būti uždengiami polietileno plėvele, kurioje padaryta skylučių). Tiriant lakias medžiagas, reikia naudoti sandariai uždaromus ir nepralaidžius dujoms indus. Jų dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio mėginys sudarytų maždaug vieną ketvirtąją indo talpos. 9.2. Naudojama standartinė laboratorinė įranga, įskaitant šią: 9.2.1. maišymo įrenginys: mechaninė kratyklė arba lygiavertė įranga; 9.2.2. centrifuga (3 000 g) arba filtravimo įtaisas (kuriame naudojamas filtrinis popierius turi būti be nitratų); 9.2.3. atitinkamo jautrio ir atkuriamumo nitratų analizės prietaisas. 10. Dirvožemių parinkimas ir skaičius Naudojamas vienas ir tas pats dirvožemis. Rekomenduojamos dirvožemio charakteristikos yra tokios, kaip čia nurodyta: - smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50  % ir ne didesnis kaip 75  %; - pH: 5,5-7,5; - organinės anglies kiekis: (0,5-1,5)  %; - mikrobinės biomasės kiekis turi būti išmatuotas (8)(9) ir jos anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % bendros dirvožemio organinės anglies. Daugeliu atvejų tokių charakteristikų dirvožemis atitinka blogiausio atvejo būseną, kadangi tiriamosios cheminės medžiagos absorbcija tuo atveju yra mažiausia, o jos prieinamumas mikroflorai yra didžiausias. Taigi tyrimai su kitais dirvožemiais paprastai nereikalingi. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jei medžiagą daugiausia numatoma naudoti kokiame nors apibrėžtame  dirvožemyje, pvz., tokiame kaip rūgštus miško dirvožemis, arba jei naudojamos elektrostatinį krūvį turinčios cheminės medžiagos, gali tekti naudoti papildomą kitos rūšies dirvožemį. 11. Dirvožemio mėginių rinkimas ir laikymas 11.1. Rinkimas Reikia turėti detalią informaciją apie lauko vietos, iš kurios imamas tyrimams skirtas dirvožemis, istoriją. Nurodoma tiksli vietos padėtis, augalų danga, apdorojimo augalų apsaugos produktais datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba atsitiktiniai užteršimai. Dirvožemio ėmimui parinkta vieta turėtų užtikrinti ilgalaikį vartojimą. Tinka nuolatinės ganyklos, laukai su vienmečių grūdinių kultūrų pasėliais (išskyrus kukurūzų) arba tankiai apsėtų žaliųjų trąšų laukai. Parinkta mėginio ėmimo vieta neturi būti buvusi apdorota augalų apsaugos produktais bent vienerius metus iki mėginių ėmimo. Be to, bent šešis mėnesius neturėjo būti įterpiama organinių trąšų. Mineralines trąšas naudoti leistina tik tuo atveju, jei tai buvo daryta pasėlių poreikiams užtikrinti, o dirvožemio mėginiai imami ne anksčiau kaip trys mėnesiai po tręšimo. Reikia nenaudoti dirvožemo, apdoroto trąšomis, turinčiomis žinomas biocidines savybes (pvz., kalcio cianamidu). Reikia neimti mėginių esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Suartų dirvožemių mėginiai imami iš viso, nuo 0 iki 20 cm gylio, sluoksnio. Pievose (ganyklose) arba kituose ilgą laiką (bent vieną auginimo sezoną) neartuose dirvožemiuose didžiausias mėginio ėmimo gylis gali būti šiek tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm). Dirvožemio mėginiai vežami tokiose talpose ir esant tokiai temperatūrai, kurios garantuotų, kad pradinės dirvožemio savybės nebus reikšmingiau pakeistos. 11.2. Laikymas Pirmenybė teikiama atvejui, kai  naudojami šviežiai lauke paimti dirvožemiai. Jei laikymo laboratorijoje išvengti neįmanoma, dirvožemiai gali būti laikomi tamsoje, esant (4±2) °C ne ilgiau kaip tris mėnesius. Dirvožemių laikymo metu turi būti užtikrintos aerobinės sąlygos. Jei dirvožemiai imami iš vietų, kuriose jie būna įšalę bent tris mėnesius per metus, galima numatyti šešių mėnesių laikymą, esant nuo (-18) °C iki (-22) °C. Laikomo dirvožemio mikrobinės biomasės kiekis matuojamas prieš kiekvieną tyrimą ir biomasės anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % viso dirvožemio organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 punktą). 12. Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui 12.1. Pradinis inkubavimas Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 11.2 punktą), rekomenduojama daryti pradinį inkubavimą, kurio trukmė būtų nuo 2 iki 28 parų. Temperatūra ir dirvožemio drėgmės kiekis pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti tyrimo sąlygas (žr. 12.2 ir 15.1.3 punktus). 12.2. Fizinės ir cheminės charakteristikos Iš dirvožemio rankiniu būdu pašalinami dideli daiktai (pvz., akmenys, augalų dalys ir t. t.), tuomet drėgnas dirvožemis sijojamas iki 2 mm arba mažesnio dalelių dydžio, neleidžiant jam per daug išdžiūti. Drėgmės kiekis dirvožemio mėginyje reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vertės, sudarančios 40 %-60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. 12.3. Gerinimas pridedant organinio substrato Dirvožemį reikia pagerinti tinkamu organiniu substratu, pvz., liucernos žaliosios masės šieno milteliais (pagrindinis komponentas: Medicago sativa), kurių C/N santykis yra nuo 12/1 iki 16/1. Rekomenduojamas liucernos ir dirvožemio santykis yra 5 g liucernos vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). 13. Tiriamosios medžiagos paruošimas įterpti į dirvožemį Tiriamoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešiklį. Nešiklis gali būti vanduo (vandenyje tirpioms medžiagoms) arba inertinė kieta medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis smėlis (dalelių dydis: 0,1–0,5 mm). Kitų nei vanduo skystų nešiklių (pvz., organinių tirpiklių, tokių kaip acetonas, chloroformas) nereikia naudoti, kadangi jie gali pakenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas smėlis, jo daleles galima padengti tiriamąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota tinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais, prieš maišant su dirvožemiu, tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti tiriamąją medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g smėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). Kontroliniai mėginiai apdorojami maišant tik su lygiaverčiu vandens ir/arba kvarcinio smėlio kiekiu. Jei tiriamos lakios cheminės medžiagos, apdorojimo metu reikia kiek įmanoma išvengti nuostolių ir imtis priemonių užtikrinti tolygų pasiskirstymą dirvožemyje (pvz., bandomąją medžiagą reikėtų įšvirkšti keliose dirvožemio mėginio vietose). 14. Tyrimui naudojamos koncentracijos vertės Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, naudojamos ne mažiau kaip dvi koncentracijos. Mažiausioji koncentracija turėtų atitikti ne mažiau kaip didžiausią kiekį, kuris tikėtinai pasiektų dirvožemį praktinėmis sąlygomis, tuo tarpu didesnioji koncentracija turėtų būti mažesniosios koncentracijos kartotinis dydis. Į dirvožemį įterpiamos tiriamosios medžiagos koncentracijos apskaičiuojamos laikant, kad įterpimas yra tolygus iki 5 cm gylio ir dirvožemio sąlyginis tankis yra 1,5. Agrocheminių medžiagų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožemį, arba cheminių medžiagų, kurių atveju dirvožemį pasiekiantis kiekis gali būti numatytas ar spėjamas, rekomenduojamos tiriamosios koncentracijos vertė yra didžiausia numatoma aplinkos koncentracija (Predicted Environmental Concentration – PEC) ir penkis kartus už ją didesnė koncentracija. Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožemį kelis kartus per vieną sezoną, tiriamos esant koncentracijoms, gautoms PEC vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. Tačiau viršutinė tiriamoji koncentracija  neturi būti daugiau kaip dešimt kartų didesnė už didžiausią vienkartinio įterpimo dydį. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojama ne mažiau kaip penkių koncentracijų eilė pagal geometrinę progresiją. Tiriamosios koncentracijos turi atitikti intervalą, reikalingą ECx vertei nustatyti. 15. Procedūra 15.1. Veikimo sąlygos 15.1.1. Apdorojami ir kontroliniai mėginiai Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į tris vienodos masės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turinčiu nešikliu, o trečioji maišoma su produkto neturinčiu nešikliu (kontrolinis tyrimas). Rekomenduojama paruošti bent tris tokias apdorotų dirvožemio dalių ir neapdorotos dalies kartotines serijas. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į šešias vienodos masės dalis. Penki mėginiai maišomi su tiriamosios medžiagos turinčiu nešikliu, o šeštasis mėginys sumaišomas su nešikliu be šios cheminės medžiagos. Rekomenduojama paruošti bent tris apdorotų dirvožemio mėginių dalis ir neapdorotos dirvožemio mėginio dalies kartotines serijas. Reikia, kad būtų užtikrintas tolygus tiriamosios medžiagos pasiskirstymas apdorotuose dirvožemio mėginiuose. Maišant reikia vengti dirvožemio sutankinimo ir grumstų susidarymo. 15.1.2. Dirvožemio mėginių inkubavimas Dirvožemio mėginius galima inkubuoti dviem būdais: kaip vientisus kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginius arba kaip serijas atskirų kiekvieno apdoroto ir neapdoroto vienodo dydžio dirvožemio mėginių. Tačiau tiriant lakias medžiagas, tyrimas atliekamas tik vienu būdu, naudojant atskirų mėginių seriją. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas mėginys, paruošiami dideli kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio kiekiai ir prireikus tyrimo metu imami jos mėginiai analizei. Kiekvienam apdorojimui ir kontroliniams mėginiams iš pradžių paruoštas kiekis priklauso nuo mėginių dydžio, analizei naudojamų kartotinių mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio mėginių ėmimo kartų skaičiaus. Dirvožemiai, inkubuojami kaip vientisas mėginys, prieš imant mėginius turi būti gerai sumaišomi. Kai dirvožemiai inkubuojami kaip serija atskirų dirvožemio mėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio mėginys dalijamas į reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Atliekant tyrimus, kuriuose gali būti numatyta mėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti pakankamą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus kartotinius mėginius ir mėginių ėmimo kartų skaičių. Bent trys tyrimui skirti dirvožemio kartotiniai mėginiai inkubuojami aerobinėmis sąlygomis (žr. 15.1.1 punktą). Atliekant visus tyrimus turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo tūrio laisvąja erdve, kad būtų išvengta anaerobinių sąlygų susidarymo. Kai tiriamos lakios medžiagos, tyrimas turi būti atliekamas naudojant atskirų mėginių serijas. 15.1.3. Tyrimo sąlygos ir trukmė Tyrimai atliekami tamsoje, esant (20±2) °C temperatūrai. Drėgmės kiekis dirvožemio mėginiuose visą tyrimo laiką turi būti palaikomas (±5)  % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40  % iki 60  % dirvožemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 12.2 punktą). Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens. Mažiausia tyrimų trukmė – 28 dienos. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, lyginamas nitratų sudarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 parą jis skiriasi daugiau kaip 25  %, tyrimas tęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, bet ne ilgiau kaip 100 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, tyrimas baigiamas po 28 parų. 28 parą nustatomas nitratų kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio mėginiuose ir apskaičiuojama ECx vertė. 15.2. Dirvožemio mėginių ėmimas ir analizė 15.2.1. Dirvožemio mėginių ėmimo grafikas Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginiai nitratui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 parą. Jei tyrimą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28 dienos atliekami kas 14 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojamos bent penkios tiriamosios koncentracijos ir dirvožemio mėginiai nitratui nustatyti analizuojami prieš tyrimo pradžią (0 para) ir veikimo (ekspozicijos) laikotarpiui pasibaigus (28 parą). Jei laikoma, kad būtinas tarpinis matavimas, jį galima atlikti, pvz., 7 parą. Duomenys, gauti 28 parą, naudojami cheminės medžiagos ECx vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontrolinių mėginių duomenys gali būti naudojami pradinei nitrato koncentracijai dirvožemyje pateikti. 15.2.2. Dirvožemio mėginių analizė Nitrato kiekis, sudarytas kiekviename ir apdorotame, ir neapdorotame kartotiniame mėginyje, nustatomas kaskart, kai tam paimami mėginiai. Nitratas ekstrahuojamas iš dirvožemio, mėginius kratant atitinkamame ekstrahavimo tirpiklyje, pvz., 0,1 mol/l kalio chlorido tirpale. Rekomenduojamas santykis – 5 ml KCl tirpalo vienam gramui dirvožemio, skaičiuojant sauso dirvožemio masei. Ekstrahavimui optimizuoti dirvožemio ir ekstrahavimo tirpalo bendras tūris turi būti ne didesnis kaip pusė indo tūrio. Mišiniai kratomi 60 min. esant 150 min-1. apsukų dažniui. Mišiniai centrifuguojami arba filtruojami ir skystoji fazė analizuojama nustatyti nitratui. Dalelių neturinčius skystus ekstraktus galima laikyti prieš analizę ne ilgiau kaip šešis mėnesius, esant minus (20±5) °C. 16. Duomenys 16.1. Rezultatų apdorojimas Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, sužymimas kiekviename kartotiniame dirvožemio mėginių serijos mėginyje sudaryto nitrato kiekis ir visų kartotinių serijų vidutinė vertė pateikiama lentelių pavidalu. Azoto transformacijos greitis įvertinamas naudojant atitinkamus visuotinai priimtus statistinius metodus (pvz., F kriterijus, 5 % reikšmingumo lygmuo). Sudaryto nitrato kiekis išreiškiamas nitrato miligramais vienam sauso dirvožemio kilogramui per parą. Nitrato sudarymo kiekviename apdorotame mėginyje greitis lyginamas su greičiu, gautu kontroliniuose mėginiuose, ir apskaičiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio mėginio (arba mėginių) vertė. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, nustatomas kiekvienoje kartotinėje mėginių serijoje sudaryto nitrato kiekis, ir ECx vertėms įvertinti sudaroma dozės ir atsako santykio kreivė. Nitrato kiekis (t. y. nitrato kiekis mg vienam sauso dirvožemio kilogramui), nustatytas apdorotuose mėginiuose po 28 parų, lyginamas su kontroliniuose mėginiuose nustatytu kiekiu. Pagal šiuos duomenis kiekvienai tiriamajai koncentracijai apskaičiuojama inhibavimo procentinė vertė. Šie procentiniai duomenys pateikiami grafike kaip koncentracijos funkcija, ir ECx vertei apskaičiuoti naudojamos statistinės procedūros. Be to, pagal tipines procedūras (10)(11)(12) nustatomi apskaičiuotos ECx vertės pasikliovimo rėžiai (p = 0,95). Didelį azoto kiekį turinčios bandomosios medžiagos gali prisidėti prie susidariusio nitrato kiekio padidėjimo atliekant tyrimą. Jei šios medžiagos tiriamos esant didelei jų koncentracijai (pvz., cheminės medžiagos, kurias numatoma naudoti dedant kelis kartus), į tyrimo eigą turi būti įtraukti atitinkami kontroliniai mėginiai (t. y. dirvožemis su tiriamąja medžiaga, bet be augalinių miltelių). Į šių kontrolinių mėginių duomenis turi būti atsižvelgta apskaičiuojant ECx vertę. 16.2. Rezultatų interpretavimas Jei įvertinant agrocheminių medžiagų tyrimų rezultatus mėginyje, turinčiame mažesniąją apatinę koncentraciją (t. y. maksimalią numatomą koncentraciją), ir kontroliniame mėginyje nitrato sudarymo greičio skirtumas yra lygus 25 % arba mažesnis, bet kuriuo mėginių ėmimo metu po 28 paros produktą galima įvertinti kaip nepasižymintį ilgalaikiu poveikiu azoto transformacijai dirvožemiuose. Kai įvertinami kitų nei agrocheminės medžiagos cheminių medžiagų tyrimo rezultatai, naudojama EC50, EC25 ir/arba EC10 vertė. VIII. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS 17. Tyrimų ataskaita Tyrimų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija: 17.1. Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant: - geografinę vietos nuorodą (platuma, ilguma); - informaciją apie vietos istoriją (t. y. augalinė danga, apdorojimas augalų apsaugos produktais, apdorojimas trąšomis, atsitiktinis užteršimas ir t. t.); - naudojimo tipą (pvz., žemės ūkio paskirties žemė, miškas ir t. t.); - mėginio ėmimo gylį (cm); - smėlio, dumblo ir molio kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais); - pH vertę (vandenyje); - organinės anglies kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais); - azoto kiekį (išreikštą sausos medžiagos masės procentais); - pradinę nitrato koncentraciją (nitrato kiekis mg sausos medžiagos masės kilogramui); - jonų mainų talpą (mmol/kg); - mikrobinę biomasę (išreikšta bendros organinės anglies kiekio procentine dalimi); - metodų nuorodas kiekvienam parametrui nustatyti; - visą informaciją apie dirvožemio mėginių ėmimą ir laikymą; - pradinio dirvožemio inkubavimo, jei buvo atliekamas, detales. 17.2. Tiriamoji medžiaga: - fizinė būsena ir, jei tinka, fizinės ir cheminės savybės; - cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y. augalų apsaugos produktų atveju veikliojo ingrediento procentinę dalį), azoto kiekį. 17.3. Substratas: - substrato šaltinis; - sudėtis (t. y. liucernos milteliai, liucernos žaliosios masės milteliai); - anglies, azoto kiekis (išreikštas sausos medžiagos masės procentais); - sieto akučių dydis (mm). 17.4. Tyrimo sąlygos: - dirvožemio gerinimo organiniu substratu detalės (smulkesnis apibūdinimas); - naudotų tiriamosios medžiagos koncentracijų skaičius ir, jei reikia, pasirinktų koncentracijų pagrindimas; - bandomosios medžiagos įterpimo į dirvožemį detalės; - inkubavimo temperatūra; - drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant tyrimą ir jo metu; - naudotas dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas mėginys arba kaip mėginių serija); - kartotinių mėginių skaičius; - mėginių ėmimo analizei skaičius; - metodas, naudotas nitratui iš dirvožemio ekstrahuoti. 17.5. Rezultatai: - analizės procedūra ir įranga, naudota nitratui analizuoti; - duomenys, pateikti lentelių pavidalu, įskaitant atskirus ir vidutinius nitrato analizės rezultatus; - apdorotų ir kontrolinių kartotinių mėginių serijų rezultatų tarpusavio nuokrypis; - apskaičiavimuose daromų pataisų paaiškinimas, jei tinka; - procentais išreikštas nitrato sudarymo greičio nuokrypis iš kiekvieną kartą paimtų mėginių, arba, jei tinka, EC50 vertė esant 95 procentų pasikliovimo rėžiui, kitos ECx vertės (t. y. EC25 arba EC10) ir pasikliovimo rėžiai, dozės ir atsako priklausomybės kreivės; - statistinis rezultatų apdorojimas; - visa informacija ir stebėjimai, kurie padėtų interpretuoti rezultatus. ______________ LAND 74-2005 „Dirvožemio mikroorganizmai. Azoto transformavimo tyrimas“ priedas BIBLIOGRAFIJA 1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. 2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987. 4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles. 5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality – Biological Methods. 6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20 janvier 1995. 7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. 9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 10) Litchfield, J.T. and Wilcokson F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113. 11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York. 12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK. ______________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478 LAND 75-2005 „DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. ANGLIES TRANSFORMAVIMO TYRIMAS (C.22)“ I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šiame aplinkos apsaugos normatyviniame dokumente aprašytas laboratorinis metodas, skirtas tirti ilgalaikius augalų apsaugos produktų ir galbūt kitų cheminių medžiagų vienkartinio veikimo poveikius anglies transformavime dalyvaujančių dirvožemio mikroorganizmų aktyvumui. Tyrimas iš esmės pagrįstas Europos ir Viduržemio jūros augalų apsaugos organizacijos rekomendacijomis (1). Tačiau buvo atsižvelgta į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos Biologische Bundesanstalt (2), JAV Aplinkos apsaugos agentūros (3) SETAC (4) rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame  Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių/nuosėdinių uolienų atrankos (5) buvo susitarta dėl šiame tyrime naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipo. Dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagrįstos ISO vadovu (6) ir Belgirate seminaro rekomendacijomis. Įvertinant tiriamų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti jų poveikį dirvožemio mikrobiniam aktyvumui, pvz., kai reikia turėti duomenis apie galimus šalutinius augalų apsaugos produktų poveikio dirvožemio mikroflorai efektus arba kai tikimasi kitų nei augalų apsaugos produktai cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroorganizmams. Anglies transformavimo tyrimas atliekamas siekiant nustatyti tokių cheminių medžiagų poveikio dirvožemio mikroflorai efektus. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos (pvz., augalų apsaugos produktai, trąšos, miškininkystėje naudojamos cheminės medžiagos), atliekami ir anglies, ir azoto transformavimo tyrimai. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, pakanka azoto transformavimo tyrimo. Tačiau, jei atliekant tokių cheminių medžiagų azoto transformavimo tyrimą, jų EC50 vertė patenka į intervalą, būdingą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitrapirinui), papildomai informacijai gauti gali būti atliekamas anglies transformavimo tyrimas. Dirvožemiai susideda iš  gyvųjų ir negyvųjų komponentų, esančių sudėtiniuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai atlieka svarbų vaidmenį derlingų dirvožemių organinių medžiagų visumos skaidyme ir transformavime, kur daugelio rūšių indėlis apsprendžia įvairius dirvožemio derlingumo aspektus. Visoks ilgalaikis tokių biocheminių procesų trukdymas gali pažeisti mitybinių komponentų ciklus, o tai gali pakeisti dirvožemio derlingumą. Anglies ir azoto transformavimas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors mikroorganizmų bendrijos atsakingos už šių procesų vykdymą įvairiuose dirvožemiuose, vienos nuo kitų skiriasi,  transformavimo keliai yra iš esmės tie patys. Šis tyrimo metodas skirtas nustatyti tiriamosios medžiagos ilgalaikius neigiamus poveikius (efektus) anglies transformavimui aerobiniuose paviršiniuose dirvožemiuose. Šis tyrimas yra jautrus už anglies transformavimą atsakingų mikroorganizmų bendrijų dydžio ir aktyvumo pokyčiams, kadangi vykdant tyrimą šios bendrijos verčiamos patirti cheminio poveikio įtampą ir anglies badą. Naudojamas smėlėtas dirvožemis, turintis mažai organinių medžiagų. Šis dirvožemis apdorojamas tiriamąja medžiaga ir inkubuojamas sąlygomis, kurios užtikrina greitą mikroorganizmų medžiagų apykaitą. Šiomis sąlygomis greitai išsenka lengvai iš dirvožemio įsisavinamos anglies šaltiniai. Tai sukelia anglies badą, dėl kurio mikrobų ląstelės žūsta, pereina į ramybės būseną arba sporuliuoja. Jei tyrimas vyksta daugiau kaip 28 paras, galima išmatuoti šių atsakų sumą (neapdoroto dirvožemio) kontroliniuose mėginiuose kaip nuoseklų metaboliškai aktyvios mikrobinės biomasės mažėjimą (7). Jei dirvožemyje su anglies trūkumu biomasei tyrimo sąlygomis yra pakenkusi dirvožemyje esanti cheminė medžiaga, biomasės kiekis gali negrįžti iki kontroliniame ėminyje esančio kiekio. Todėl bet kuriuo tyrimo metu tiriamosios medžiagos keliami trukdymai dažnai tęsiasi iki tyrimo pabaigos. Tyrimai, kurių pagrindu buvo parengtas šis tyrimo metodas, iš pradžių buvo skirti medžiagoms, kurių atveju kiekį, pasiekiantį dirvožemį, buvo galima numatyti. Taip būna, pvz., naudojant augalų apsaugos produktus, kurių laukuose naudojama medžiagos norma yra žinoma. Tiriant agrochemines medžiagas, pakanka dviejų dozių, atitinkančių numatomą arba prognozuojamą naudojimo normą. Agrochemines medžiagas galima tirti skaičiuojant kaip veikliuosius ingredientus (a. i.) arba kaip preparatus. Tačiau tyrimo galimybės nėra apribotos vien cheminėmis medžiagomis, turinčiomis prognozuojamas aplinkoje koncentracijos vertes. Keičiant tiek į dirvožemį dedamos tiriamosios medžiagos kiekį, tiek duomenų įvertinimo būdą, tyrimo metodą dar galima panaudoti ištirti cheminėms medžiagoms, kurių kiekis, tikėtinai patenkantis į dirvožemį, nėra žinomas. Taigi jei tai neagrocheminės medžiagos, nustatomi medžiagos kelių koncentracijų serijos poveikio anglies transformavimui efektai. Šių tyrimų duomenys yra naudojami dozės ir atsako santykio kreivei sudaryti ir ECx vertei apskaičiuoti, kur x yra apibrėžiamas kaip poveikio (efekto) %. II. NUORODOS 2. Šis tyrimų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos OECD TG 217 (2000) metodą. III. APIBRĖŽIMAI 3. Anglies transformavimas – mikroorganizmų atliekamas organinių medžiagų visumos skaidymas, sudarant galutinį neorganinį produktą – anglies dioksidą. 4. ECx (efektyvioji koncentracija) – dirvožemyje esanti tiriamosios medžiagos koncentracija, dėl kurios buvimo anglies transformavimas į anglies dioksidą inhibuojamas X procentų. 5. EC50 (medianinė efektyvioji koncentracija) – dirvožemyje esanti tiriamosios medžiagos koncentracija, dėl kurios buvimo anglies transformavimas į anglies dioksidą inhibuojamas 50 procentų. IV. ETALONINĖS MEDŽIAGOS 6. Etaloninės medžiagos nėra apibrėžtos. V. PRINCIPAS 7. Prasijotas dirvožemis apdorojamas tiriamąja medžiaga arba paliekamas neapdorotas (kontrolinis). Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, rekomenduojama naudoti bent dvi  tiriamosios medžiagos koncentracijas, kurios parenkamos pagal didžiausią lauke numatomą koncentraciją. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo parų apdoroti ir kontroliniai dirvožemio mėginiai maišomi su gliukoze ir 12 h nepertraukiamai matuojamas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis. Kvėpavimo greitis yra išreiškiamas kaip išskirto anglies dioksido (mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h) arba suvartoto deguonies (mg deguonies/kg dirvožemio/h) kiekis. Vidutinis kvėpavimo greitis apdorotame dirvožemyje lyginamas su kvėpavimo greičiu kontroliniame mėginyje ir apskaičiuojamas  apdorotojo  mėginio  procentinis  nuokrypis  nuo kontrolinio mėginio. Visi tyrimai vykdomi ne mažiau kaip 28 paras. Jei 28 parą skirtumas tarp apdoroto ir neapdoroto dirvožemio yra 25 % arba didesnis, matavimai tęsiami kas 14 parų, bet ne daugiau kaip iki 100 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, sudaromos serijos į dirvožemio mėginius dedant tiriamosios medžiagos iki kelių koncentracijų ir po 28 parų matuojamas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis (t. y. sudaryto anglies dioksido arba suvartoto deguonies vidutinis kiekis). Koncentracijų serijos tyrimų rezultatai analizuojami pagal regresijos modelį ir apskaičiuojama ECx vertė (t. y. EC50, EC25 ir/arba EC10). Žr. apibrėžimus. VI. TYRIMO PAGRĮSTUMAS 8. Tyrimų su agrocheminėmis medžiagomis rezultatų įvertinimas yra pagrįstas sąlyginai mažu [t. y. vidutinė vertė (±25) %] išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekio kontroliniame ir apdorotame dirvožemio mėginiuose skirtumu, taigi didelė kontrolinių mėginių duomenų sklaida gali būti klaidingų rezultatų priežastis. Todėl kartotinių kontrolinių mėginių rezultatų skirtumas turi būti mažesnis kaip (±15) %. VII. TYRIMO EIGA 9. Aparatūra Naudojami tyrimams skirti indai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos. Jie turi būti reikiamos talpos, atsižvelgiant į esamą dirvožemių inkubavimo procedūrą, t. y. inkubavimą vieno vientiso mėginio arba serijos atskirų dirvožemio vienkartinių mėginių (žr. 15.1.2 punktą). Reikia imtis priemonių kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo pačiu užtikrinti dujų mainus tyrimo metu (pvz., indai gali būti uždengiami polietileno plėvele, kurioje padaryta skylučių). Tiriant lakias medžiagas, reikia naudoti sandariai uždaromus ir nepralaidžius dujoms indus. Jų dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio mėginys sudarytų maždaug vieną ketvirtąją indo talpos. Gliukozės sukeliamam kvėpavimui nustatyti reikia turėti inkubavimo sistemas ir prietaisus anglies dioksido sudarymui arba deguonies suvartojimui matuoti. Tokių sistemų prietaisų pavyzdžiai aprašyti literatūroje (8)(9)(10)(11). 10. Dirvožemių pasirinkimas ir skaičius Naudojamas vienas ir tas pats dirvožemis. Rekomenduojamos dirvožemio charakteristikos yra tokios, kaip čia nurodyta: - smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %; - pH: 5,5-7,5; - organinės anglies kiekis: 0,5–1,5 %; - mikrobinės biomasės kiekis turi būti išmatuotas (12)(13), ir jos anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % bendros dirvožemio organinės anglies. Daugeliu atvejų tokių charakteristikų dirvožemis atitinka blogiausio atvejo būseną, kadangi tiriamosios cheminės medžiagos absorbcija tuo atveju yra mažiausia, o jos prieinamumas  mikroflorai yra didžiausias. Taigi tyrimai su kitais dirvožemiais paprastai nebereikalingi. Tačiau tam tikromis aplinkybėmis, pvz., jei medžiagą daugiausia numatoma naudoti kokiame nors apibrėžtame dirvožemyje, tokiame kaip rūgštus miško dirvožemis, arba jei naudojamos elektrostatinį krūvį turinčios cheminės medžiagos, gali tekti jį pakeisti papildomu dirvožemiu. 11. Dirvožemio mėginių rinkimas ir laikymas 11.1. Rinkimas Reikia turėti detalią informaciją apie lauko vietos, iš kurios imamas tyrimams skirtas dirvožemis, istoriją. Nurodoma tiksli vietos padėtis, augalų danga, apdorojimo augalų apsaugos produktais datos, apdorojimas organinėmis ir neorganinėmis trąšomis, biologinių priedų dėjimas arba atsitiktiniai užteršimai. Dirvožemio ėmimui pasirinkta vieta turėtų užtikrinti ilgalaikį vartojimą. Tinka nuolatinės ganyklos, laukai su vienmečių grūdinių kultūrų (išskyrus kukurūzų) pasėliais arba tankiai apsėtų žaliųjų trąšų laukai. Parinkta mėginio ėmimo vieta neturi būti apdorota augalų apsaugos produktais bent vienerius metus iki mėginių ėmimo. Be to, bent šešis mėnesius neturi būti buvę dėta organinių trąšų. Mineralines trąšas naudoti leistina tik tuo atveju, jei tai buvo daryta pasėlių poreikiams, o dirvožemio mėginiai imami ne anksčiau kaip trys mėnesiai po tręšimo. Reikia nenaudoti dirvožemio, apdoroto trąšomis, turinčiomis žinomas biocidines savybes (pvz., kalcio cianamidu). Reikia neimti mėginių esant ilgalaikiam (ilgiau kaip 30 parų) sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Suartų dirvožemių ėminiai imami iš viso nuo 0 iki 20 cm gylio sluoksnio. Pievose (ganyklose) arba kituose ilgą laiką (bent vieną auginimo sezoną) neartuose dirvožemiuose didžiausias mėginio ėmimo gylis gali būti šiek tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm). Dirvožemio mėginiai vežami tokiose talpose ir esant tokiai temperatūrai, kurios garantuotų, kad pradinės dirvožemio savybės nebus reikšmingiau pakeistos. 11.2. Laikymas Pirmenybė teikiama atvejui, kai naudojami šviežiai lauke paimti dirvožemiai. Jei laikymo laboratorijoje išvengti neįmanoma, dirvožemiai gali būti laikomi tamsoje, esant (4±2)° C ne ilgiau kaip tris mėnesius. Laikant dirvožemius, turi būti užtikrintos aerobinės sąlygos. Jei dirvožemiai imami iš vietų, kuriose jie būna įšalę bent tris mėnesius per metus, galima numatyti šešių mėnesių laikymą, esant nuo (-18) °C iki (-22) °C. Laikomo dirvožemio mikrobinės biomasės kiekis matuojamas prieš kiekvieną tyrimą, ir biomasės anglies kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % viso dirvožemio organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 punktą). 12. Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui 12.1. Pradinis inkubavimas Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 12.2 ir 15.1.3 punktus), rekomenduojama daryti pradinį inkubavimą, kurio trukmė būtų nuo 2 iki 28 parų. Temperatūra ir dirvožemio drėgmės kiekis pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti tyrimo sąlygas (žr. 12.2 ir 15.1.3 punktus). 12.2. Fizinės ir cheminės charakteristikos Iš dirvožemio rankiniu būdu pašalinami dideli daiktai (pvz., akmenys, augalų dalys ir t. t.), tuomet drėgnas dirvožemis sijojamas iki 2 mm arba mažesnio dydžio dalelių. Drėgmės kiekis dirvožemio mėginyje reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vertės, sudarančios (40–60) % didžiausios vandens sulaikymo gebos. 13. Tiriamosios medžiagos ruošimas įterpti į dirvožemį Tiriamoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešiklį. Nešiklis gali būti vanduo (vandenyje tirpioms medžiagoms) arba inertinė kieta medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis smėlis (dalelių dydis: 0,1–0,5 mm). Kitų nei vanduo skystų nešiklių (pvz., organinių tirpiklių, tokių kaip acetonas, chloroformas) nereikia naudoti, kadangi jie gali pakenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas smėlis, jo daleles galima padengti tiriamąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota tinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais, prieš maišant su dirvožemiu, tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti tiriamąją medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g smėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos masės). Kontroliniai mėginiai apdorojami maišant tik su lygiaverčiu vandens ir/arba kvarcinio smėlio kiekiu. Jei tiriamos lakios cheminės medžiagos, apdorojimo metu reikia kiek įmanoma vengti nuostolių ir imtis priemonių užtikrinti tolygų pasiskirstymą dirvožemyje (pvz., tiriamąją medžiagą reikėtų įšvirkšti keliose dirvožemio vietose). 14. Tyrimui naudojamos koncentracijos vertė Jei tiriami augalų apsaugos produktai arba cheminės medžiagos, kurių koncentracija aplinkoje gali būti nuspėjama, turi būti tiriamos ne mažiau kaip dvi koncentracijos. Mažesnioji (apatinė) koncentracija turėtų atitikti ne mažiau kaip didžiausią kiekį, kuris tikėtinai pasiektų dirvožemį praktinėmis sąlygomis, tuo tarpu didesnioji koncentracija turėtų būti mažesniosios koncentracijos kartotinis dydis. Į dirvožemį įterpiamos tiriamosios medžiagos koncentracijos vertė apskaičiuojama laikant, kad įterpimas yra tolygus iki 5 cm gylio ir dirvožemio sąlyginis   (subertinis) tankis yra 1,5. Agrocheminių medžiagų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožemį, arba cheminių medžiagų, kurių atveju dirvožemį pasiekiantis kiekis gali būti numatytas ar spėjamas, rekomenduojamos bandymo koncentracijos vertės yra didžiausia numatoma aplinkos koncentracija (Predicted Environmental Concentration – PEC) ir penkis kartus už ją didesnė koncentracija. Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožemį kelis kartus per vieną sezoną, tiriamos esant koncentracijos vertei, gautai PEC vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. Tačiau didesnioji tiriamosios koncentracijos vertė neturi būti daugiau kaip dešimt kartų didesnė už didžiausią vienkartinio įterpimo dydį. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojama ne mažiau kaip penkių koncentracijų eilė pagal geometrinę progresiją. Tiriamos koncentracijos vertė turi atitikti intervalą, reikalingą ECx vertei nustatyti. 15. Procedūra 15.1. Veikimo sąlygos 15.1.1. Apdorojami ir kontroliniai mėginiai Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į tris vienodos masės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turinčiu nešikliu, o trečioji maišoma su produkto neturinčiu nešikliu (kontrolinis tyrimas). Rekomenduojama paruošti bent tris tokias apdorotų dalių ir neapdorotos dalies dirvožemio kartotines serijas. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginys dalijamas į šešias vienodos masės dalis. Penki mėginiai maišomi su tiriamąją medžiagą turinčiu nešikliu, o šeštasis mėginys sumaišomas su nešikliu be šios cheminės medžiagos. Rekomenduojama paruošti bent tris apdorotų dirvožemio dalių ir neapdorotos dirvožemio dalies kartotines serijas. Reikia pasirūpinti, kad būtų užtikrintas tolygus tiriamosios medžiagos pasiskirstymas apdorotuose dirvožemio mėginiuose. Maišant reikia išvengti dirvožemio sutankinimo ir grumstų susidarymo. 15.1.2. Dirvožemio mėginių inkubavimas Dirvožemio mėginius galima inkubuoti dviem būdais: kaip vientisus kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginius arba kaip serijas atskirų ir vienodo dydžio kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio mėginių. Tačiau tiriant lakiąsias medžiagas, bandymas atliekamas tik vienu būdu, naudojant atskirų mėginių seriją. Kai dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas mėginys, paruošiami dideli kiekvieno, apdoroto ir neapdoroto, dirvožemio kiekiai ir prireikus tyrimo metu imami jo mėginiai analizei. Kiekvienam apdorojimui ir kontroliniams mėginiams iš pradžių paruoštas kiekis priklauso nuo mėginių dydžio, analizei naudojamų kartotinių mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio mėginių ėmimo kartų skaičiaus. Dirvožemiai, inkubuojami kaip vientisas mėginys, prieš imant mėginius turi būti gerai sumaišomi. Kai dirvožemiai inkubuojami kaip serija atskirų dirvožemio mėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio ėminys dalijamas į reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Atliekant tyrimus, kuriuose gali būti numatyta mėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti pakankamą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus kartotinius mėginius ir mėginių ėmimo  skaičių. Ne mažiau kaip trys tyrimui skirti dirvožemio kartotiniai mėginiai inkubuojami aerobinėmis sąlygomis (žr. 15.1.1 punktą). Atliekant visus tyrimus, turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo tūrio laisvąja erdve,  kad  būtų  išvengta  anaerobinių  sąlygų  susidarymo. Kai tiriamos lakios medžiagos, tyrimas turi būti atliekamas naudojant atskirų mėginių serijas. 15.1.3. Tyrimo sąlygos ir trukmė Tyrimas vykdomas tamsoje, esant (20±2)° C temperatūrai. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminiuose visą bandymo laiką turi būti palaikomas (±5) % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvožemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 12.2 punktą). Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens. Mažiausia tyrimų trukmė 28 dienos. Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, lyginami išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekiai apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 parą jie skiriasi daugiau kaip 25 %, bandymas tęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, arba iki 100 parų, žiūrint kas trumpiau. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, tyrimas baigiamas po 28 parų. 28 parą nustatomas išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio mėginiuose ir apskaičiuojama ECx vertė. 15.2. Dirvožemių mėginių ėmimas ir analizė 15.2.1. Dirvožemio mėginių ėmimo grafikas Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, dirvožemio mėginiai gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičiui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 parą. Jei tyrimą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28-tos dienos atliekami kas 14 parų. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, naudojamos bent penkios tiriamosios koncentracijos ir dirvožemio mėginiai gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičiui nustatyti analizuojami prieš tyrimo pradžią (0 para) ir ekspozicijos (veikimo) laikotarpiui pasibaigus (28 parą). Jei laikoma, kad būtinas tarpinis matavimas, jį galima atlikti, pvz., 7 parą. Duomenys, gauti 28 parą, naudojami cheminės medžiagos ECx vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontrolinių mėginių duomenys gali būti naudojami pradiniams veikliosios mikrobinės biomasės, dalyvaujančios medžiagų apykaitoje, kiekiams dirvožemyje įvertinti (12). 15.2.2. Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičio matavimas Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis kiekviename ir apdorotame, ir kontroliniame kartotiniame mėginyje nustatomas kiekvieną kartą paėmus mėginius. Dirvožemio mėginiai maišomi su pakankamu gliukozės kiekiu didžiausiam to momento kvėpavimo atsakui nustatyti. Gliukozės kiekis, reikalingas konkretaus dirvožemio didžiausiam kvėpavimo atsakui nustatyti, gali būti nustatytas, atliekant pradinį tyrimą su kelių gliukozės koncentracijų serija (14). Tačiau smėlingiems dirvožemiams, turintiems (0,5–1,5) % organinės anglies, paprastai pakanka 2 000 mg-4 000 mg gliukozės vienam kg sauso dirvožemio. Gliukozę galima sumalti į miltelius su praplautu kvarciniu smėliu (10 g smėlio/kg sauso dirvožemio) ir sumaišyti su dirvožemiu, kol bus gautas vienalytis mišinys. Gliukoze pagerinto dirvožemio mėginiai inkubuojami tinkamame aparate kvėpavimo greičiui matuoti nepertraukiamai, kas valandą arba kas dvi valandas (žr. 9 punktą), esant (20±2) °C. Išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis  matuojamas 12 valandų iš eilės, matavimus pradedant kiek įmanoma anksčiau, t. y. anksčiau nei 1 ar 2 h po gliukozės pridėjimo. Išmatuojamas suminis per 12 valandų išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis ir nustatomas vidutinis kvėpavimo greitis. 16. Duomenys 16.1. Rezultatų apdorojimas Jei tiriamos agrocheminės medžiagos, užrašomas kiekviename kartotiniame dirvožemio mėginyje sudaryto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis, ir visų kartotinių mėginių vidutinė vertė pateikiama lentelių pavidalu. Rezultatai įvertinami visuotinai priimtais statistiniais metodais (pvz., F kriterijus, 5 % reikšmingumo lygmuo). Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis išreiškiamas mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h. Vidutinis anglies dioksido išskyrimo arba deguonies suvartojimo greitis kiekviename apdorotame mėginyje lyginamas su greičiu, gautu kontroliniame mėginyje, ir apskaičiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio mėginio vertė. Jei tiriamos neagrocheminės medžiagos, nustatomas kiekviename kartotiniame mėginyje išskirto anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis, ir ECx vertei įvertinti braižoma dozės ir atsako priklausomybės kreivė. Gliukozės sukeliamo kvėpavimo greitis (t. y. mg anglies dioksido arba mg deguonies/kg sauso dirvožemio/h), nustatytas apdorotuose mėginiuose po 28 parų, lyginamas su kontroliniuose mėginiuose nustatytu greičiu. Iš šių duomenų kiekvienai tiriamajai koncentracijai apskaičiuojama inhibavimo procentinė (%) vertė. Šios procentinės vertės pateikiamos grafike kaip koncentracijos funkcija, ir ECx vertei apskaičiuoti naudojamos statistinės procedūros. Be to, naudojant tipines procedūras (15)(16)(17), nustatomi apskaičiuotos ECx vertės pasikliovimo rėžiai (p = 0,95). 16.2. Rezultatų interpretavimas Jei, įvertinant agrocheminių medžiagų tyrimų rezultatus, mėginyje, turinčiame mažesniąją  koncentraciją (t. y. didžiausią numatomą koncentraciją), bei kontroliniame mėginyje kvėpavimo greičio skirtumas bet kuriuo mėginio ėmimo metu po 28 paros yra lygus 25 % arba mažesnis, produktą galima įvertinti kaip nepasižymintį ilgalaikiu poveikiu anglies transformavimui dirvožemiuose. Kai įvertinami kitų nei agrocheminės medžiagos cheminių medžiagų tyrimo rezultatai, naudojama EC50, EC25 ir/arba EC10 vertė. VIII. BAIGIAMOSIOS NUOSTATOS 17. Tyrimo ataskaita Tyrimų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija: 17.1. Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant: - geografinę vietos nuorodą (platuma, ilguma); - informaciją apie vietos istoriją (t. y. augalinė danga, apdorojimas augalų apsaugos produktais, apdorojimas trąšomis, atsitiktinis užteršimas ir t. t.); - naudojimo tipą (pvz., žemės ūkio paskirties žemė, miškas ir t. t.); - mėginio ėmimo gylį (cm); - smėlio, dumblo ir molio kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais); - pH vertę (vandenyje); - organinės anglies kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais); - azoto kiekį (išreikštas sausos medžiagos masės procentais); - jonų mainų talpą (mmol/kg); - pradinę mikrobinę biomasę (išreikšta bendro organinės anglies kiekio procentine dalimi); - metodų kiekvienam parametrui nustatyti nuorodas; - visą informaciją apie dirvožemio mėginių ėmimą ir laikymą; - pradinio dirvožemio inkubavimo, jei buvo atliekamas, detales. 17.2. Tiriamoji medžiaga: - fizikinė būsena ir, jei tinka, fizinės ir cheminės savybės; - cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant struktūrinę formulę, grynumą (t. y. augalų apsaugos produktų atveju veikliojo ingrediento procentinę dalį), azoto kiekį. 17.3. Tyrimo sąlygos: - dirvožemio gerinimo organiniu substratu smulkesnis apibūdinimas; - naudotų tiriamosios medžiagos koncentracijos verčių skaičius ir, jei reikia, pasirinktų koncentracijos verčių pagrindimas; - tiriamosios medžiagos įterpimo į dirvožemį smulkesnis apibūdinimas; - inkubavimo temperatūra; - drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant tyrimą ir jo metu; - dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas mėginys arba kaip mėginių serija); - kartotinių mėginių skaičius; - mėginių ėmimo analizei skaičius (ir laikas). 17.4. Rezultatai: - metodas ir įranga kvėpavimo greičiui matuoti; - lentelių duomenys, įskaitant atskiras ir vidutines anglies dioksido arba deguonies vertes; - apdorotų ir kontrolinių kartotinių mėginių serijų rezultatų tarpusavio nuokrypis; - apskaičiavimuose daromų pataisų paaiškinimas, jei tinka; - procentais išreikštas gliukozės sukeliamo kvėpavimo greičio nuokrypis iš kiekvieną kartą paimtų mėginių arba, jei tinka, EC50 vertė esant 95 procentų pasikliovimo rėžiui, kitos ECx vertės (t. y. EC25 arba EC10) ir pasikliovimo rėžiai, dozės ir atsako priklausomybės kreivė; - statistinis rezultatų apdorojimas, kur to reikia; - visa informacija ir stebėjimai, kurie padėtų interpretuoti rezultatus. ______________ LAND 75-2005 „Dirvožemio mikroorganizmai. Anglies transformavimo tyrimas (C.22)“ priedas BIBLIOGRAFIJA 1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994. 2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990). 3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987. 4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels. 5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995. 6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60. 8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. Agronomy Monograph N° 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831- 871. 9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions. 10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions. 11) Heinemeyer O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81. 12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method. 13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method. 14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120. 15) Litchfield, J.T. and Wilcokson, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113. 16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York. 17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK. _____________ PATVIRTINTA Lietuvos Respublikos aplinkos ministro 2005 m. spalio 3 d. įsakymu Nr. D1-478 LAND 76-2005 „AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS DIRVOŽEMYJE (C.23)“ I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Šiame aplinkos apsaugos normatyviniame dokumente aprašytas metodas skirtas cheminių medžiagų aerobiniam ir anaerobiniam transformavimui dirvožemyje įvertinti. Šis tyrimų metodas pagrįstas esamais nurodymais (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Tyrimai atliekami, siekiant nustatyti: i) tiriamosios medžiagos transformavimo greitį ir ii) transformavimo produktų, kurie gali veikti augalus bei dirvožemio organizmus, tipą ir susidarymo bei išnykimo greitį. Taip turi būti tiriamos cheminės medžiagos, kurios tiesiogiai įterpiamos į dirvožemį arba kurios gali pasiekti dirvožemio aplinką. Be to, tokių laboratorinių tyrimų rezultatai gali būti naudojami atitinkamų lauko tyrimų mėginių ėmimo ir analizės protokolams kurti. Aerobinių ir anaerobinių tyrimų, naudojant vieno tipo dirvožemį, paprastai pakanka transformavimo keliams įvertinti (8)(10)(11). Transformavimo greičiai turėtų būti nustatomi bent trijuose papildomuose dirvožemiuose (8)(10). Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos (OECD – Organization for Economic Cooperation and Development) seminare dėl dirvožemių ir nuosėdų atrankos (10) buvo konkrečiai sutarta dėl šiame tyrime naudojamų dirvožemių skaičiaus ir tipų. Tiriamų dirvožemių tipai turėtų atitikti aplinkos sąlygas, kuriose medžiagos bus naudojamos arba kur jos pasklinda. Pvz., cheminės medžiagos, kurios gali pasklisti subtropinio arba tropinio klimato sąlygomis, turėtų būti tiriamos Ferrasol arba Nitosol tipo dirvožemiuose (Maisto ir žemės ūkio organizacijos sistema) (FAO sistema). Be to, seminare buvo pateiktos dirvožemio mėginių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos, pagrįstos ISO vadovu (15). Be to, šis metodas nagrinėja ryžių laukų dirvožemius. II. NUORODOS 2. Šis tyrimų metodas atitinka Ekonominio bendradarbiavimo ir vystymosi organizacijos OECD TG 307 (2002) metodą. III. APIBRĖŽIMAI 3. Tiriamoji medžiaga – bet kuri medžiaga, ar tai būtų pradinis junginys, ar su tiriamuoju dalyku susiję jos transformavimo produktai. 4. Transformavimo produktai – visos medžiagos, susidariusios įvykus tiriamosios medžiagos biotinio transformavimo arba abiotinių virsmų reakcijoms, įskaitant CO2 ir surištuosius likučius. 5. Surištieji likučiai – sąvoka „surištieji likučiai“ reiškia dirvožemyje, augale arba gyvūne esančius junginius, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradinės medžiagos arba jos metabolito, metabolitų bei transformavimo produktų pavidalu. Ekstrahavimo metodas turi iš esmės nepakeisti pačių junginių ar matricos struktūros. Ryšio prigi …