Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 15 kwietnia 2004 r. w sprawie metody analizy zawartości kwasu erukowego w niektórych artykułach

Dziennik Ustaw Nr 73 — 4367 — Poz. 663 663 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1) z dnia 15 kwietnia 2004 r. w sprawie metody analizy zawartoÊci kwasu erukowego w niektórych artyku∏ach rolno-spo˝ywczych2) Na podstawie art. 34 pkt 2 ustawy z dnia 21 grudnia 2000 r. o jakoÊci handlowej artyku∏ów rolno-spo———————— 1) Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje dzia∏em administracji rzàdowej — rynki rolne, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 3 rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca 2002 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305). 2) Przepisy niniejszego rozporzàdzenia cz´Êciowo wdra˝ajà Dyrektyw´ Komisji 80/891/EWG z dnia 25 lipca 1980 r. odnoszàcà si´ do wspólnotowej metody analizy w celu okreÊlania zawartoÊci kwasu erukowego w olejach i t∏uszczach przeznaczonych do spo˝ycia przez ludzi oraz w Êrodkach spo˝ywczych zawierajàcych dodatek olejów i t∏uszczów. Dane dotyczàce og∏oszenia aktów prawa Unii Europejskiej, zamieszczone w niniejszym rozporzàdzeniu, z dniem uzyskania przez Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii Europejskiej, dotyczà og∏oszenia tych aktów w Dzienniku Urz´dowym Unii Europejskiej — wydanie specjalne. ˝ywczych (Dz. U. z 2001 r. Nr 5, poz. 44, z póên. zm.3)) zarzàdza si´, co nast´puje: § 1. Metod´ analizy zawartoÊci kwasu erukowego w olejach i t∏uszczach przeznaczonych do spo˝ycia oraz w sk∏adnikach t∏uszczowych lub olejowych artyku∏ów rolno-spo˝ywczych, okreÊla si´ w za∏àczniku do rozporzàdzenia. § 2. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie z dniem uzyskania przez Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii Europejskiej. Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: W. Olejniczak ———————— 3) Zmiany wymienionej ustawy zosta∏y og∏oszone w Dz. U. z 2001 r. Nr 154, poz. 1802, z 2002 r. Nr 135, poz. 1145 i Nr 166, poz. 1360, z 2003 r. Nr 208, poz. 2020 i Nr 223, poz. 2220 i 2221 oraz z 2004 r. Nr 42, poz. 386. Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 15 kwietnia 2004 r. (poz. 663) METODA ANALIZY ZAWARTOÂCI KWASU ERUKOWEGO W OLEJACH I T¸USZCZACH PRZEZNACZONYCH DO SPO˚YCIA ORAZ W SK¸ADNIKACH T¸USZCZOWYCH LUB OLEJOWYCH ARTYKU¸ÓW ROLNO-SPO˚YWCZYCH Wymagania ogólne I. Przygotowanie próbek Masa próbki dostarczonej do laboratorium w celu przeprowadzenia analizy powinna wynosiç 50 g, o ile nie jest wymagana wi´ksza iloÊç. Przed poddaniem analizie próbka musi byç zhomogenizowana. Tak przygotowanà próbk´ przechowuje si´ w szczelnych pojemnikach, bez dost´pu powietrza i wilgoci. Je˝eli w opisie metody analizy jest mowa o „rozpuszczeniu” lub „rozcieƒczeniu” bez sprecyzowania ˝adnych innych odczynników, nale˝y przez to rozumieç rozpuszczenie lub rozcieƒczenie w wodzie. 2) inne odczynniki Wszystkie u˝ywane zwiàzki chemiczne powinny byç o uznanej czystoÊci analitycznej, o ile nie zaznaczono inaczej. III. Aparatura II. Odczynniki 1) woda Odczynnikiem do przeprowadzenia analizy jest woda. W przypadku gdy w analizie wymagana jest woda jako rozpuszczalnik, do rozcieƒczania lub do p∏ukania, nale˝y u˝ywaç wody destylowanej lub demineralizowanej o przynajmniej równowa˝nej czystoÊci. W wykazie aparatury znajdujà si´ tylko pozycje o specjalistycznym przeznaczeniu i zgodnie ze specyfikacjà metody. W celu przeprowadzenia analizy nale˝y stosowaç wag´ analitycznà o dok∏adnoÊci minimum 0,1 mg. IV. Wyra˝anie wyników Wyniki, które przedstawia si´ w oficjalnym raporcie z analizy, powinny byç Êrednimi wartoÊciami, uzy- Dziennik Ustaw Nr 73 — 4368 — skanymi z nie mniej ni˝ dwóch oznaczeƒ, których powtarzalnoÊç jest okreÊlona w cz´Êci Oznaczanie kwasu erukowego w dziale VII pkt 5. Procentowà zawartoÊç wyra˝a si´, o ile nie zaznaczono inaczej, jako procentowy (m/

1. m)udzia∏ C 22:1 do wszystkich kwasów t∏uszczowych w próbce przekazanej do laboratorium. Liczba cyfr znaczàcych w tak przedstawionym wyniku powinna zale˝eç od dok∏adnoÊci stosowanej metody. Oznaczanie kwasu erukowego I. Zakres i obszar stosowania Poni˝sza metoda stosowana jest do oznaczania kwasu erukowego w: 1) olejach i t∏uszczach roÊlinnych i zwierz´cych zawierajàcych kwas cetoleinowy (specyficzny cis-izomer kwasu dokozenowego wyst´pujàcy w olejach rybich) i 2) utwardzonych olejach i t∏uszczach roÊlinnych i zwierz´cych zawierajàcych trans i cis-izomery kwasu dokozenowego, je˝eli ca∏kowita zawartoÊç kwasów dokozenowych lub ca∏kowita zawartoÊç kwasów cis-dokozenowych przekracza 5 % zawartoÊci wszystkich kwasów t∏uszczowych w t∏uszczu. W innych przypadkach zawartoÊç kwasów dokozenowych lub kwasów cis-dokozenowych oznacza si´ metodà okreÊlonà w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i t∏uszcze roÊlinne oraz zwierz´ce. Analiza estrów metylowych kwasów t∏uszczowych metodà chromatografii gazowej. II. Definicja ZawartoÊç kwasu erukowego w rozumieniu rozporzàdzenia oznacza zawartoÊç tego kwasu otrzymanà w wyniku stosowania metody analizy, okreÊlonej w dziale VI. III. Zasada Estry metylowe otrzymane z kwasów t∏uszczowych wchodzàcych w sk∏ad roÊlinnych i zwierz´cych olejów i t∏uszczów sà rozdzielane przy pomocy niskotemperaturowej chromatografii cienkowarstwowej na p∏ytkach z ˝elem krzemionkowym z azotanem srebra i iloÊciowo oznaczane metodà chromatografii gazowej. IV. Odczynniki Do oznaczania kwasu eurkowego stosuje si´ nast´pujàce odczynniki: 1) eter dwuetylowy wolny od nadtlenków, Êwie˝o destylowany; 2) n-heksan; Poz. 663 3) ˝el krzemionkowy G, którego nale˝y u˝ywaç do chromatografii cienkowarstwowej; 4) ˝el krzemionkowy, którego nale˝y u˝ywaç do chromatografii kolumnowej; 5) roztwór azotanu srebra, 200 g/l, przygotowany w nast´pujàcy sposób: rozpuszcza si´ 24 g azotanu srebra w wodzie i uzupe∏nia wodà do obj´toÊci 120 ml; 6) roztwór estru metylowego kwasu erukowego 5 mg/ml, przygotowany w nast´pujàcy sposób: rozpuszcza si´ 50 mg estru metylowego kwasu erukowego w kilku ml n-heksanu i uzupe∏nia n-heksanem do obj´toÊci 10 ml; 7) tetrakozan metylu (standard wewn´trzny), 0,25 mg/ml, przygotowany w nast´pujàcy sposób: rozpuszcza si´ 25 mg tetrakozanu metylu w kilku ml n-heksanu i uzupe∏nia n-heksanem do obj´toÊci 100 ml; 8) uk∏ad rozwijajàcy. Toluen: n-heksan w proporcji 90:100 (v/v); 9) roztwór 2,7 dichlorofluoresceiny 0,5 g/l, przygotowany w nast´pujàcy sposób: rozpuszcza si´ przy jednoczesnym ogrzewaniu i mieszaniu 50 mg 2,7 dichlorofluoresceiny w 100 ml 50 % wodnego roztworu metanolu. V. Aparatura 1. Zestaw do chromatografii cienkowarstwowej powinien zawieraç, w szczególnoÊci: 1) zamra˝ark´ do g∏´bokiego mro˝enia, odpowiednià do przechowywania komory rozwijajàcej i jej zawartoÊci w temperaturze od minus 20° do minus 25 °C; 2) p∏ytki do chromatografii cienkowarstwowej o wymiarach 200 mm x 200 mm; 3) lamp´ ultrafioletowà; 4) szklane kolumny, d∏ugoÊci oko∏o 200 mm, o wewn´trznej Êrednicy oko∏o 10 mm z filtrem z waty szklanej lub spiekiem szklanym. Alternatywnie mo˝na stosowaç ma∏e rozdzielacze z filtrem ze spiekiem szklanym; 5) aplikator, do nanoszenia roztworów na p∏ytki do chromatografii cienkowarstwowej w formie wàskiego pasma. 2. Chromatograf gazowy wraz z integratorem, który u˝ywa si´ w sposób okreÊlony w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i t∏uszcze roÊlinne oraz zwierz´ce. Analiza estrów metylowych kwasów t∏uszczowych metodà chromatografii gazowej. VI. Wykonanie oznaczenia 1. Przygotowanie estrów metylowych kwasów t∏uszczowych Pobiera si´ oko∏o 400 mg olejowego lub t∏uszczowego sk∏adnika próbki do analizy i przygotowuje roz- Dziennik Ustaw Nr 73 — 4369 — twór zawierajàcy oko∏o 20 do 50 mg/ml estrów metylowych kwasów t∏uszczowych w n-heksanie, zgodnie z procedurà okreÊlonà w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i t∏uszcze roÊlinne oraz zwierz´ce. Analiza estrów metylowych kwasów t∏uszczowych metodà chromatografii gazowej. 2. Chomatografia cienkowarstwowa 1) przygotowanie p∏ytek W 500 ml kolbie sto˝kowej umieszcza si´ 60 g ˝elu krzemionkowego G, dodaje 120 ml roztworu azotanu srebra, przygotowanego w sposób okreÊlony w dziale IV pkt 5, i wytrzàsa przez minut´, aby otrzymaç ca∏kowicie jednorodnà mas´. Przygotowanà masà równomiernie pokrywa si´ p∏ytk´, gruboÊç warstwy powinna wynosiç oko∏o 0,5 mm. Ta iloÊç masy jest wystarczajàca do przygotowania pi´ciu p∏ytek o wymiarach 200 mm x 200 mm. Wst´pnie suszy si´ p∏ytki na powietrzu (najlepiej pozostawiajàc je bez dost´pu Êwiat∏a przez oko∏o 30 minut). Ca∏kowicie suszy si´ i aktywuje p∏ytki, umieszczajàc je w suszarce o temperaturze 100 °C ±2 °C przez 2,5 godziny. Po zaktywowaniu zu˝ywa si´ p∏ytki jak najszybciej lub ostro˝nie przechowuje w specjalnej szafce do przechowywania p∏ytek chromatograficznych bez dost´pu Êwiat∏a, nast´pnie ponownie aktywuje si´ przed u˝yciem. Aktywacja w 110 °C przez godzin´ mo˝e okazaç si´ wystarczajàca, o ile p∏ytki nie ciemniejà w wyniku tego procesu. Przed u˝yciem zaznacza si´ lini´ w warstwie z∏o˝a w odleg∏oÊci 10 mm od bocznych i górnych kraw´dzi ka˝dej p∏ytki w celu zredukowania wp∏ywu kraw´dzi podczas rozwijania. 2) nanoszenie estrów metylowych Przy pomocy aplikatora, spe∏niajàcego warunki okreÊlone w dziale V ust. 1 pkt 5, nanosi si´ 50 µl roztworu estrów metylowych, okreÊlonego w ust. 1, przygotowanego z próbki, wàskim pasmem o d∏ugoÊci oko∏o 50 mm, co najmniej 40 mm od bocznych kraw´dzi i 10 mm od dolnej kraw´dzi p∏ytki. W ten sam sposób nanosi si´ 100 µl roztworu zawierajàcego równe obj´toÊci przygotowanego roztworu estrów metylowych, okreÊlonego w ust. 1 i roztworu estru metylowego kwasu erukowego, przygotowanego w sposób okreÊlony w dziale IV pkt 6. Roztwory nale˝y nanosiç ze szczególnà ostro˝noÊcià ze wzgl´du na delikatnoÊç pokrycia. JeÊli potrzeba, mo˝na nanieÊç na p∏ytk´ 50 µl roztworu eruczanu metylu, przygotowanego w sposób okreÊlony w dziale IV pkt 6, w celu u∏atwienia identyfikacji prà˝ka tego estru po rozwini´ciu. Po naniesieniu estrów metylowych wstawia si´ p∏ytk´ dolnà kraw´dzià do eteru etylowego, dopóki eter nie osiàgnie wysokoÊci oko∏o 5 mm powy˝ej miejsca naniesienia próbki. To koncentruje estry etylowe w wàskim paÊmie. 3) rozwijanie p∏ytek Poz. 663 Uk∏ad rozwijajàcy, spe∏niajàcy warunki, o których mowa w dziale IV pkt 8, wlewa si´ do komory chromatograficznej na wysokoÊç oko∏o 5 mm, przykrywa pokrywà i umieszcza w pojemniku zamra˝arki, spe∏niajàcej warunki okreÊlone w dziale V ust. 1 pkt 1, o temperaturze –25 °C, lub w temperaturze jak najbardziej do niej zbli˝onej (w niektórych przypadkach korzystne mo˝e byç wyÊcie∏anie naczynia bibu∏à filtracyjnà). Pod dwóch godzinach p∏ytk´ ostro˝nie umieszcza si´ w komorze chromatograficznej i pozwala, aby rozpuszczalnik osiàgnà∏ wysokoÊç oko∏o po∏owy lub dwóch trzecich wysokoÊci p∏ytki. P∏ytk´ wyjmuje si´ i delikatnie odparowuje rozpuszczalnik w strumieniu azotu pod wciàgiem. Ponownie umieszcza si´ p∏ytk´ w komorze, pozwala si´, aby rozpuszczalnik osiàgnà∏ górnà kraw´dê p∏ytki. P∏ytk´ wyjmuje si´ i, jak poprzednio, suszy w strumieniu azotu, nast´pnie ostro˝nie spryskuje roztworem 2,7 dichlorofluoresceiny przygotowanego w sposób okreÊlony w dziale IV pkt 9. P∏ytk´ oglàda si´ w Êwietle ultrafioletowym i lokalizuje pasmo zawierajàce eruczan metylu w badanej próbce poprzez odniesienie do wzmocnionego pasma w próbce, do której dodano eruczan metylu. 4) rozdzielanie frakcji estrów metylowych Ostro˝nie zeskrobuje si´ pasmo eruczanu metylu uzyskane z badanej próbki do 50 ml zlewki, unikajàc strat. W ten sam sposób przenosi si´ warstw´ ˝elu krzemionkowego umieszczonà nad i pod pasmem estrów metylowych do drugiej 50 ml zlewki. To pasmo b´dzie zawieraç frakcje wszystkich innych estrów metylowych kwasów t∏uszczowych. Do ka˝dej zlewki dodaje si´ 1,0 ml standardowego roztworu tetrakozanu metylu, przygotowanego w sposób okreÊlony w dziale IV pkt 7, i 10 ml eteru dwuetylowego, wolnego od nadtlenków, Êwie˝o destylowanego. Miesza si´ i przenosi zawartoÊç zlewek do rozdzia∏u na oddzielnych kolumnach lub rozdzielaczach, okreÊlonych w dziale V ust. 1 pkt 4 zawierajàcych oko∏o 1 g ˝elu krzemionkowego, u˝ywanego do chromatografii kolumnowej; eluuje si´ estry metylowe u˝ywajàc trzech lub czterech 10 ml porcji eteru dwuetylowego. Filtraty zbiera si´ do ma∏ych kolb okrog∏odennych lub gruszkowych o sto˝kowym dnie. Ka˝dy filtrat odparowuje si´ do ma∏ej obj´toÊci, u˝ywajàc ∏agodnego strumienia azotu. Estry metylowe przenosi si´ do ma∏ych szklanych probówek o sto˝kowym dnie. Rozpuszczalnik usuwa si´ przez odparowanie w strumieniu azotu tak, aby estry metylowe koncentrowa∏y si´ na dnie probówek. Estry metylowe rozpuszcza si´ w oko∏o 25—50 µl n-heksanu. 5) Po przeprowadzeniu badaƒ uzyskuje si´ typowy chrmatogram cienkowarstwowy pokazujàcy rozdzia∏ estrów metylowych kwasu erukowego, kwasu cetoleinowego i trans-izomerów kwasu dokozenowego, wed∏ug wzoru: Dziennik Ustaw Nr 73 — 4370 — Poz. 663 ———————— 1) Frakcja oznaczajàca eruczan metylu zwykle b´dzie zawieraç estry metylowe innych kwasów mononienasyconych, ale powinna byç wolna od cetoleinianu metylu. 3. Chromatografia gaz-ciecz 1) post´pujàc zgodnie z procedurà okreÊlonà w Polskiej Normie PN-EN ISO 5508:1996 Oleje i t∏uszcze roÊlinne oraz zwierz´ce. Analiza estrów metylowych kwasów t∏uszczowych metodà chromatografii gazowej, analizuje si´ 1—2 µl roztworów estrów metylowych uzyskanych z frakcji zawierajàcej eruczan metylu, okreÊlonej w pkt 2 lit. a i frakcji zawierajàcej pozosta∏e estry metylowe kwasów t∏uszczowych, okreÊlonej w pkt 2 lit b; 2) przy pomocy integratora otrzymuje si´ nast´pujàce powierzchnie pików:
2. a)z chromatogramu frakcji zawierajàcej eruczan metylu: — powierzchni´ piku eruczanu metylu (E), — powierzchni´ piku standardu wewn´trznego (L1), — ca∏kowità powierzchni´ wszystkich pików estrów metylowych z wy∏àczeniem powierzchni piku standardu wewn´trznego (EF),
3. b)z chromatogramu frakcji zawierajàcej pozosta∏e estry metylowe kwasów t∏uszczowych: — ca∏kowità powierzchni´ wszystkich pików estrów metylowych z wy∏àczeniem powierzchni piku standardu wewn´trznego (RF), — powierzchni´ piku standardu wewn´trznego (L2). VII. Obliczanie wyników Metoda obliczania i wzór 1) zawartoÊç kwasu erukowego w badanej próbce, wyra˝ona jako procentowy udzia∏ jego estru metylowego w ca∏kowitej zawartoÊci estrów metylowych kwasów t∏uszczowych, otrzymanych z próbki, jest okreÊlona przez: E —————— x 100 EF RF L1 —— + —— L1 L2 ( ) gdzie E, EF, RF, L1 i L2 sà powierzchniami pików opisanymi w dziale VI ust. 3 pkt 2, skorygowanymi, je˝eli jest to konieczne, za pomocà wspó∏czynników kalibracyjnych. Dziennik Ustaw Nr 73 — 4371 — Dla celów praktycznych wartoÊç eruczanu metylu obliczona za pomocà powy˝szego wzoru jest równowa˝na zawartoÊci kwasu erukowego wyra˝onej jako procent ca∏kowitej zawartoÊci kwasów t∏uszczowych w próbce. Poz. 663 i 664 P0 — powierzchnia piku palmitynianu metylowego uzyskana z chromatogramu estrów metylowych ca∏kowitej iloÊci kwasów t∏uszczowych. 4) wyprowadzenie wzoru Proporcj´ kwasów t∏uszczowych we frakcji zawierajàcej eruczan metylu, wyra˝onà jako procentowà zawartoÊç wszystkich kwasów t∏uszczowych w próbce, okreÊla si´ w nast´pujàcy sposób: 2) je˝eli powierzchnie pików sà wyra˝one w procentach, to wartoÊci EF i RF mogà byç obliczone w nast´pujàcy sposób: EF = 100 – L1 EF —————— x 100 EF RF L1 —— + —— L1 L2 RF = 100 – L2