Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobiegani

Dziennik Ustaw Nr 75 — 4518 — Poz. 709 709 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1) z dnia 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegó∏owych sposobów post´powania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus2) Na podstawie art. 10 ust. 1 i art. 15 ust. 3 ustawy z dnia 18 grudnia 2003 r. o ochronie roÊlin (Dz. U. z 2004 r. Nr 11, poz. 94) zarzàdza si´, co nast´puje: § 1. Rozporzàdzenie okreÊla: 1) szczegó∏owe sposoby post´powania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, powodujàcej chorob´ zwanà bakteriozà pierÊcieniowà ziemniaka, w celu zlokalizowania i okreÊlenia rozprzestrzenienia, niedopuszczenia do wystàpienia i rozprzestrzenienia oraz zwalczenia i zniszczenia tej bakterii, w tym:

1. a)metody zwalczania bakterii i zapobiegania jej rozprzestrzenianiu si´,
2. b)metody wykrywania i identyfikacji bakterii,
3. c)sposób wyznaczania stref, w których powinny byç stosowane Êrodki w celu zwalczania lub zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii,
4. d)warunki prowadzenia produkcji, obrotu, przemieszczania, przechowania, nabywania lub zbywania roÊlin; 2) dokument potwierdzajàcy, ˝e w partii bulw ziemniaka wyprowadzanych z terytorium Rzeczypospolitej Polskiej nie stwierdzono wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
5. b)roÊliny nieposadzone w chwili wprowadzania do obrotu lub przemieszczania, lecz przeznaczone do póêniejszego sadzenia; 3) urz´dowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka — sadzeniaki ziemniaka uznane w urz´dowej ocenie za elitarne lub kwalifikowane; 4) miejsce produkcji — wszelkie obiekty, w szczególnoÊci magazyny, przechowalnie, szklarnie, tunele foliowe lub pola znajdujàce si´ w obr´bie jednego gospodarstwa lub jego cz´Êci lub kilku gospodarstw, stanowiàce jednà zorganizowanà ca∏oÊç. § 3. 1. Kontrol´ w celu sprawdzenia wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, zwanà dalej „urz´dowà kontrolà”, przeprowadza wojewódzki inspektor ochrony roÊlin i nasiennictwa, zwany dalej „wojewódzkim inspektorem”, na roÊlinach ziemniaka (Solanum tuberosum L.) znajdujàcych si´ w uprawie oraz na bulwach ziemniaka po zbiorach, w zakresach i terminach uwzgl´dniajàcych systemy produkcji roÊlin ziemniaka oraz biologi´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, a tak˝e wiedz´ naukowà w tym zakresie. 2. Wojewódzki inspektor w ka˝dym przypadku podejrzenia wystàpienia pora˝enia, w celu potwierdzenia lub wykluczenia podejrzeƒ: § 2. U˝yte w rozporzàdzeniu okreÊlenia oznaczajà: 1) pobiera próby bulw z partii ziemniaków, w szczególnoÊci bulw pochodzàcych z przechowalni, i poddaje je badaniom laboratoryjnym; 1) sadzenie — ka˝dà czynnoÊç majàcà na celu umieszczenie roÊlin w sposób umo˝liwiajàcy ich wzrost, reprodukcj´ lub rozmno˝enie; 2) przeprowadza dodatkowo ocen´ wizualnà krojonych bulw ziemniaka. 2) roÊliny przeznaczone do sadzenia:
6. a)roÊliny ju˝ posadzone, które majà pozostaç w pod∏o˝u uprawowym lub byç przesadzone, lub ——————— 1) Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje dzia∏em admini- stracji rzàdowej — rolnictwo, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 1 rozporzàdzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca 2002 r. w sprawie szczegó∏owego zakresu dzia∏ania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305). 2) Przepisy niniejszego rozporzàdzenia wdra˝ajà postanowienia — Dyrektywy Rady 93/85/EEC z dnia 4 paêdziernika 1993 r. w sprawie zwalczania bakteriozy pierÊcieniowej ziemniaka (Dz. Urz. WE, L 259 z 18.10.1993 r.). Dane dotyczàce og∏oszenia aktu prawa Unii Europejskiej, zamieszczone w niniejszym rozporzàdzeniu, z dniem uzyskania przez Rzeczpospolità Polskà cz∏onkostwa w Unii Europejskiej, dotyczà og∏oszenia tego aktu w Dzienniku Urz´dowym Unii Europejskiej — wydanie specjalne. 3. Badania laboratoryjne, o których mowa w ust. 2 pkt 1, przeprowadza si´ z zastosowaniem metod diagnozowania, wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, okreÊlonych w za∏àczniku do rozporzàdzenia. § 4. W przypadku podejrzenia wystàpienia bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus na podstawie pozytywnego wyniku testu immunofluorescencyjnego (IF), wskazujàcego na mo˝liwoÊç wystàpienia tej bakterii, do czasu zakoƒczenia nast´pnych etapów badania i uzyskania ostatecznego jego wyniku, zabezpiecza si´ i przechowuje: 1) wszystkie bulwy lub próby roÊlin ziemniaka, je˝eli jest to mo˝liwe; 2) pozosta∏y ekstrakt i preparaty IF. § 5. 1. W przypadku podejrzenia wystàpienia lub w przypadku potwierdzenia w czasie badaƒ laboratoryjnych wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis Dziennik Ustaw Nr 75 — 4519 — ssp. sepedonicus, G∏ówny Inspektor Ochrony RoÊlin i Nasiennictwa powiadamia o tym Komisj´ Europejskà lub inne paƒstwa cz∏onkowskie Unii Europejskiej. 2. W przypadku potwierdzenia w czasie badaƒ laboratoryjnych wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, przez co najmniej miesiàc od dnia powiadomienia, o którym mowa w ust. 1, zabezpiecza si´ i przechowuje: 1) materia∏ wyszczególniony w § 4; 2) prób´ pora˝onego materia∏u roÊlinnego ober˝yny, zainokulowanego ekstraktem z pora˝onych bulw lub roÊlin ziemniaka; 3) wyizolowanà kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. § 6. W przypadku pobrania prób bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych w celu wykluczenia infekcji latentnej lub gdy wzrokowo widoczne sà podejrzane objawy chorobowe, lub gdy uzyskano pozytywne wyniki testu IF lub innych testów, a˝ do zakoƒczenia badaƒ laboratoryjnych potwierdzajàcych lub wykluczajàcych wyst´powanie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus: 1) nie przemieszcza si´ roÊlin ziemniaka lub bulw pochodzàcych z upraw, partii lub przesy∏ek, z których pobrano próby, chyba ˝e przemieszczenie to odbywa si´ pod nadzorem wojewódzkiego inspektora i je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus; 2) bulwy ziemniaka pochodzàce z partii, z których pobrano próby, nie mogà byç przeznaczone do sadzenia i nie mogà byç w czasie zbioru, transportu lub przechowywania mieszane z innymi partiami bulw ziemniaka; 3) wojewódzki inspektor:
7. a)podejmuje czynnoÊci majàce na celu wykrycie êród∏a pochodzenia prawdopodobnego pora˝enia, w przypadku gdy wzrokowo widoczne sà podejrzane objawy chorobowe lub gdy uzyskano pozytywne wyniki testu IF,
8. b)mo˝e wprowadziç inne ni˝ okreÊlone w pkt 1 i 2 dzia∏ania zapobiegajàce rozprzestrzenianiu si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w szczególnoÊci mo˝e przeprowadzaç urz´dowe kontrole przemieszczania roÊlin lub bulw ziemniaka w obr´bie lub poza obiekty gospodarstwa lub miejsca produkcji, zwiàzane z podejrzeniem wystàpienia tej bakterii. § 7. Je˝eli w badaniach laboratoryjnych, przeprowadzonych z zastosowaniem metod diagnozowania, wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, okreÊlonych w za∏àczniku do rozporzàdzenia, zostanie potwierdzona obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w próbie, wojewódzki inspektor: 1) uznaje za pora˝one bulwy lub roÊliny ziemniaka, parti´ roÊlin lub przesy∏k´, z której zosta∏y pobrane próby do badania, oraz okreÊla jako ska˝one maszyny, urzàdzenia, Êrodki transportu, opakowania, przechowalnie lub ich cz´Êci oraz wszelkie inne Poz. 709 przedmioty, które mia∏y kontakt z pora˝onymi bulwami lub roÊlinami ziemniaka, a tak˝e, je˝eli jest to mo˝liwe, wskazuje ska˝one obiekty, szklarnie, tunele foliowe, pola lub miejsca produkcji, z których pochodzà pora˝one bulwy lub roÊliny; 2) ustala zasi´g prawdopodobnego pora˝enia, zgodnie z § 8, bioràc pod uwag´: kontakt przed lub po zbiorze z pora˝onymi roÊlinami ziemniaka, kontakt ze ska˝onymi maszynami, urzàdzeniami, Êrodkami transportu, opakowaniami, przechowalniami lub ich cz´Êciami oraz kontakt ze ska˝onymi obiektami, szklarniami, tunelami foliowymi, polami lub miejscami produkcji, o których mowa w pkt 1, a tak˝e powiàzania produkcyjne ze ska˝onymi miejscami lub przedmiotami oraz okreÊla prawdopodobnie pora˝one roÊliny lub bulwy ziemniaka; 3) wyznacza stref´ na podstawie: stwierdzonego pora˝enia i ska˝enia okreÊlonego w pkt 1, okreÊlonego zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia, zgodnie z pkt 2, oraz zasi´gu mo˝liwego rozprzestrzenienia si´ bakterii zgodnie z § 9, zwanà dalej „strefà zagro˝enia”, w której podejmowane b´dà dzia∏ania w celu zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. § 8. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia bakterià Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus obejmujà: 1) inne bulwy lub roÊliny ziemniaka znajdujàce si´ w miejscu produkcji okreÊlonym jako pora˝one; 2) miejsca produkcji, gospodarstwa lub obiekty, które mia∏y jakikolwiek kontakt z bulwami lub roÊlinami ziemniaka okreÊlonymi jako pora˝one, wraz z miejscami produkcji, w których wspólnie u˝ytkowany jest lub by∏ sprz´t i urzàdzenia u˝ywane w cyklu produkcyjnym; 3) bulwy lub roÊliny produkowane w miejscach wymienionych w pkt 2 lub wyst´pujàce w tych miejscach produkcji w okresie, w którym bulwy lub roÊliny ziemniaka uznane za pora˝one znajdowa∏y si´ w tych miejscach; 4) miejsca przechowywania roÊlin lub bulw ziemniaka pochodzàcych z miejsc wymienionych w pkt 2; 5) maszyny, urzàdzenia, Êrodki transportu, opakowania, przechowalnie lub ich cz´Êci oraz inne przedmioty, które mog∏y mieç kontakt z bulwami lub roÊlinami ziemniaka okreÊlonymi jako pora˝one podczas ostatnich 12 miesi´cy przed stwierdzeniem pora˝enia; 6) bulwy lub roÊliny ziemniaka majàce kontakt z przedmiotami, o których mowa w pkt 5, przed czyszczeniem i dezynfekcjà tych przedmiotów oraz 7) bulwy lub roÊliny ziemniaka pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego co bulwy lub roÊliny uznane za pora˝one, je˝eli badania laboratoryjne wskazujà na mo˝liwoÊç pora˝enia. § 9. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu mo˝liwego rozprzestrzeniania si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus obejmujà: Dziennik Ustaw Nr 75 — 4520 — Poz. 709 1) inne miejsca produkcji, gdzie uprawia si´ ziemniaki lub inne roÊliny ˝ywicielskie, sàsiadujàce z miejscami produkcji uznanymi za pora˝one lub znajdujàcymi si´ w zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia; mo˝liwiajàcy rozprzestrzenianie si´ bakterii, tak aby mog∏y zostaç uznane za niepora˝one. 2) wspólne miejsce wytwarzania rodów sadzeniaków ziemniaka. 1) na pora˝onym polu: § 10. 1. W przypadku pora˝enia bulw lub roÊlin ziemniaka, wojewódzki inspektor przeprowadza badania laboratoryjne wegetatywnych (klonalnych) rozmno˝eƒ rodów ziemniaka, w których wykryto pora˝enie, w sposób umo˝liwiajàcy okreÊlenie pierwotnego êród∏a infekcji i zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia. 2. Na podstawie badaƒ, o których mowa w ust. 1, wojewódzki inspektor okreÊla pora˝enie oraz, je˝eli ma to zastosowanie, wyznacza stref´ zagro˝enia. 3. Dla celów doÊwiadczalnych lub naukowych oraz dla prac nad selekcjà odmian ziemniaka wojewódzki inspektor mo˝e odstàpiç od dzia∏aƒ okreÊlonych w § 7 pod warunkiem, ˝e odst´pstwo to nie zak∏óci zwalczania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i nie stworzy ryzyka jej rozprzestrzeniania si´. § 11. 1. Pora˝onych bulw lub roÊlin ziemniaka nie przeznacza si´ do sadzenia i niszczy si´ je pod nadzorem wojewódzkiego inspektora. 2. Je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, pora˝one bulwy ziemniaka, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, mogà zostaç przeznaczone: 1) do przerobu przemys∏owego w zak∏adzie przetwórczym, posiadajàcym mo˝liwoÊci unieszkodliwiania resztek powsta∏ych w procesie przetwarzania pora˝onych bulw ziemniaka i dezynfekcji miejsc oraz przedmiotów majàcych kontakt z pora˝onymi bulwami ziemniaka, pod warunkiem ich bezpoÊredniego i natychmiastowego dostarczenia do tego zak∏adu przetwórczego; 2) na konsumpcj´ lub pasz´, po ich uprzednim ugotowaniu lub uparowaniu w gospodarstwie, z którego pochodzà. § 12. 1. Bulw lub roÊlin ziemniaków prawdopodobnie pora˝onych nie przeznacza si´ do sadzenia. 2. Je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, bulwy i roÊliny ziemniaka prawdopodobnie pora˝one mogà zostaç przeznaczone na cele, o których mowa w § 11 ust. 2, lub do konsumpcji poza gospodarstwem, po ich uprzednim zapakowaniu i bezpoÊrednim dostarczeniu do odbiorcy, bez koniecznoÊci przepakowywania. 3. Je˝eli istnieje ryzyko rozprzestrzenienia si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, bulwy lub roÊliny ziemniaka prawdopodobnie pora˝one niszczy si´ pod nadzorem wojewódzkiego inspektora. § 13. Ârodki transportu, maszyny, urzàdzenia, opakowania, przechowalnie lub ich cz´Êci oraz inne przedmioty, okreÊlone jako pora˝one lub prawdopodobnie pora˝one, niszczy si´ lub oczyszcza i dezynfekuje, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, w sposób unie- § 14. 1. W pora˝onych miejscach produkcji:
9. a)przez co najmniej trzy lata uprawy nast´pujàce po roku, w którym stwierdzono pora˝enie: — niszczy si´ samosiewy ziemniaka i inne naturalnie wyst´pujàce roÊliny ˝ywicielskie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, — nie sadzi si´ bulw, roÊlin lub nasion ziemniaka ani innych naturalnie wyst´pujàcych roÊlin ˝ywicielskich tej bakterii, a˝ do uznania pola za wolne od samosiewów ziemniaka przez co najmniej 2 kolejne lata uprawy,
10. b)w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka nast´pujàcym po okresie, o którym mowa w lit. a, dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem bulw pochodzàcych z tej uprawy do konsumpcji lub przerobu przemys∏owego; uprawa i bulwy ziemniaka podlegajà obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora, w tym tak˝e badaniom laboratoryjnym na obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,
11. c)w kolejnym sezonie uprawy ziemniaka, po zastosowaniu cyklu w∏aÊciwego p∏odozmianu, dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem na sadzeniaki ziemniaka, ziemniaki do konsumpcji lub do przerobu przemys∏owego; uprawa i bulwy ziemniaka podlegajà obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora, w tym tak˝e badaniom laboratoryjnym na obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, albo 2) na pora˝onym polu:
12. a)podczas czterech lat uprawy nast´pujàcych po roku, w którym stwierdzono pora˝enie: — niszczy si´ samosiewy ziemniaka i inne naturalnie wyst´pujàce roÊliny ˝ywicielskie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, — nie u˝ytkuje si´ pola do celów rolniczych lub leÊnych i przeznacza si´ to pole na u˝ytkowanie pastwiskowe, stosujàc cz´ste niskie koszenie lub intensywny wypas,
13. b)w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka nast´pujàcym po okresie, o którym mowa w lit. a, dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem bulw na sadzeniaki ziemniaka, ziemniaki do konsumpcji lub do przerobu przemys∏owego; uprawa i bulwy ziemniaka podlegajà obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora, w tym tak˝e badaniom laboratoryjnym na obecnoÊç bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus; Dziennik Ustaw Nr 75 — 4521 — 3) na polach innych ni˝ pora˝one:
14. a)w roku uprawy nast´pujàcym po roku, w którym stwierdzono pora˝enie: — nie sadzi si´ bulw, roÊlin i nasion ziemniaka ani innych naturalnie wyst´pujàcych roÊlin ˝ywicielskich bakterii oraz niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub — dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem bulw pochodzàcych z tej uprawy na ziemniaki do konsumpcji lub do przerobu przemys∏owego; pod warunkiem, ˝e wojewódzki inspektor stwierdzi, ˝e nie istnieje ryzyko wyst´powania samosiewów ziemniaka i innych naturalnie wyst´pujàcych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus,
15. b)przez co najmniej dwa lata uprawy nast´pujàce po okresie, o którym mowa w lit. a, dopuszcza si´ sadzenie sadzeniaków ziemniaka urz´dowo kwalifikowanych przez wojewódzkiego inspektora, z przeznaczeniem bulw pochodzàcych z tej uprawy na sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki do konsumpcji, lub do przerobu przemys∏owego,
16. c)w ka˝dym roku uprawy, o których mowa w lit. a i b, niszczy si´ samosiewy ziemniaka i inne naturalnie wyst´pujàce roÊliny ˝ywicielskie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, a uprawy podlegajà obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora,
17. d)je˝eli w roku uprawy nast´pujàcym po roku, w którym stwierdzono pora˝enie, sadzone by∏y urz´dowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka z przeznaczeniem na ziemniaki do konsumpcji lub do przerobu przemys∏owego, uprawa podlega obowiàzkowej kontroli wojewódzkiego inspektora w terminach pozwalajàcych na wykrycie bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w ramach której, w szczególnoÊci, przeprowadza si´ badania laboratoryjne samosiewów ziemniaka. 2. Pod nadzorem wojewódzkiego inspektora czyÊci si´ i dezynfekuje wszystkie urzàdzenia, maszyny, Êrodki transportu i przechowalnie lub ich cz´Êci oraz inne przedmioty w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenienie si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus: 1) bezpoÊrednio po stwierdzeniu pora˝enia oraz 2) w ka˝dym nast´pnym roku uprawy, w∏àcznie z pierwszym sezonem, w którym uprawa ziemniaka jest dozwolona na pora˝onych polach. 3. W systemie produkcji, w którym mo˝liwa jest ca∏kowita wymiana pod∏o˝a: 1) nie sadzi si´ bulw, roÊlin i nasion ziemniaka, chyba ˝e obiekt zosta∏ poddany urz´dowo zatwierdzonym zabiegom w celu wyeliminowania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i usuni´cia wszelkich bulw lub innego materia∏u roÊlin psiankowatych, ∏àcznie z ca∏kowità wymianà pod- Poz. 709 ∏o˝a oraz oczyszczeniem i dezynfekcjà tego obiektu i ca∏ego jego wyposa˝enia; 2) po dokonaniu zabiegów, o których mowa w pkt 1, dopuszcza si´ produkcj´ ziemniaka z urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków, minibulw lub mikroroÊlin ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, po uznaniu, ˝e obiekt jest wolny od bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. § 15. 1. W obr´bie strefy zagro˝enia, oprócz wymagaƒ okreÊlonych w § 14, bezpoÊrednio po stwierdzeniu pora˝enia i przez nast´pne co najmniej trzy sezony uprawy: 1) miejsca produkcji lub gospodarstwa, w których uprawia si´, przechowuje lub przemieszcza bulwy ziemniaka oraz wykorzystuje maszyny, urzàdzenia, narz´dzia i Êrodki transportu zwiàzane z produkcjà ziemniaka, podlegajà kontroli wojewódzkiego inspektora; 2) w razie potrzeby czyÊci si´ i dezynfekuje maszyny, urzàdzenia, narz´dzia, Êrodki transportu, opakowania i przechowalnie w gospodarstwach, o których mowa w pkt 1, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora, w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenienie si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus; 3) dopuszcza si´ sadzenie wy∏àcznie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; 4) oddzielnie zbiera si´, przemieszcza i przechowuje sadzeniaki ziemniaka oraz ziemniaki do konsumpcji lub przerobu przemys∏owego na terenie gospodarstw w obr´bie wyznaczonej strefy zagro˝enia; 5) wojewódzki inspektor przeprowadza urz´dowe kontrole. 2. W obr´bie wyznaczonej strefy zagro˝enia w razie potrzeby, wojewódzki inspektor podejmuje dzia∏ania zmierzajàce do wymiany wszelkiego materia∏u sadzeniakowego ziemniaka. § 16. 1. Sadzeniaki ziemniaka powinny spe∏niaç wymagania specjalne okreÊlone w przepisach wydanych na podstawie art. 20 ust. 1 ustawy z dnia 18 grudnia 2003 r. o ochronie roÊlin oraz pochodziç w prostej linii z materia∏u poddanego urz´dowej ocenie i uznanego za wolny od bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus na podstawie badaƒ laboratoryjnych przeprowadzonych przez wojewódzkiego inspektora. 2. Badania, o których mowa w ust. 1, przeprowadza si´: 1) w przypadkach gdy pora˝enie dotyczy produkcji ziemniaka sadzeniaka — na roÊlinach poczàtkowego rozmno˝enia klonalnego; 2) w innych przypadkach — na roÊlinach z poczàtkowego rozmno˝enia klonalnego albo na reprezentatywnych próbach materia∏u bazowego ziemniaka sadzeniaka lub wczeÊniejszych rozmno˝eƒ. § 17. 1. Bulwy ziemniaków wyprodukowanych na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej mogà byç prze- Dziennik Ustaw Nr 75 — 4522 — mieszczane z przeznaczeniem do paƒstw cz∏onkowskich, je˝eli zosta∏y zaopatrzone w zaÊwiadczenie wydane przez wojewódzkiego inspektora po przeprowadzeniu badaƒ laboratoryjnych stwierdzajàcych, ˝e w partii tych bulw nie stwierdzono wyst´powania bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Poz. 709 2. ZaÊwiadczenie jest wystawiane nie wczeÊniej ni˝ 14 dni przed dniem wyprowadzenia ziemniaków z terytorium Rzeczypospolitej Polskiej. § 18. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie z dniem og∏oszenia. Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: W. Olejniczak Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2004 r. (poz. 709) I. Metody diagnozowania, wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 1. Pobieranie tkanki z cz´Êci przystolonowych bulwy Standardowa próba sk∏ada si´ z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednak˝e badanie mo˝na równie˝ wykonaç dla mniejszych prób: 1) myje si´ 200 bulw pod bie˝àcà wodà; za pomocà regularnie dezynfekowanego skalpela lub skrobaczki do ziemniaków usuwa si´ skórk´ wokó∏ pi´tki ka˝dej bulwy; dezynfekcj´ narz´dzi przeprowadza si´ przez ich zanurzenie w 70 % alkoholu i ich opalenie; 2) z cz´Êci przystolonowej ka˝dej bulwy pobiera si´ niewielki fragment tkanki, obejmujàcy wiàzki przewodzàce, ograniczajàc iloÊç tkanki innej ni˝ przewodzàca do minimum, nast´pnie tkank´ poddaje si´ badaniom w ciàgu 24 godzin, okreÊlonych w ust. 3 lub przechowuje si´ w temperaturze minus 20 °C do dwóch tygodni w sposób okreÊlony w ust. 3. 2. Badanie makroskopowe na obecnoÊç objawów chorobowych Po pobraniu tkanki z cz´Êci przystolonowej ka˝dà bulw´ kroi si´ w poprzek i bada na obecnoÊç objawów ——————— 1) Objawami obserwowanymi najwczeÊniej, g∏ównie w po- bli˝u cz´Êci przystolonowej, jest lekka szklistoÊç lub przejrzystoÊç tkanek, bez rozmi´kczenia tkanki otaczajàcej wiàzki przewodzàce. PierÊcieƒ wiàzek przewodzàcych w cz´Êci przystolonowej mo˝e byç nieznacznie ciemniejszy ni˝ normalnie. Pierwszym, ∏atwym do rozpoznania objawem jest przebarwienie pierÊcienia wiàzek przewodzàcych na ˝ó∏tawo oraz wydostawanie si´ z nich serowatej masy po lekkim ÊciÊni´ciu bulwy. Wyciek ten zawiera miliony bakterii. W tym stadium wiàzki przewodzàce mogà ulec przebarwieniu na bràzowo. Poczàtkowo objawy te mogà byç ograniczone do cz´Êci pierÊcienia, niekoniecznie w pobli˝u cz´Êci przystolonowej, i mogà rozszerzaç si´ stopniowo na ca∏y pierÊcieƒ. W miar´ rozwoju infekcji dochodzi do zniszczenia wiàzek przewodzàcych; tkanki bulwy kory pierwotnej mogà oddzielaç si´ od mi´kiszu rdzeniowego. W zaawansowanym stadium infekcji na powierzchni bulwy pojawiajà si´ sp´kania, które cz´sto majà czerwonawobràzowe brzegi. Objawy mogà byç maskowane przez wtórne patogeny bakteryjne czy grzybowe, stàd odró˝nienie zaawansowanego stadium bakteriozy pierÊcieniowej od gnicia powodowanego przez inne czynniki mo˝e byç trudne, a nawet niemo˝liwe. bakteriozy pierÊcieniowej1). W tym celu Êciska si´ bulw´ i sprawdza, czy z wiàzek przewodzàcych nie wydostajà si´ zmacerowane tkanki. 3. Przygotowanie prób do testu Grama, testu immunofluorescencji (IF) oraz testu ober˝ynowego 1) tkank´ pobranà z cz´Êci przystolonowej bulw homogenizuje si´ w Êrodku nietoksycznym dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (na przyk∏ad 0,05 M bufor fosforanowy /PBS/ o pH 7,0), w temperaturze poni˝ej 30 °C; zaleca si´ dodanie nietoksycznego Êrodka rozdrabniajàcego; mo˝e byç równie˝ niezb´dne dodanie nietoksycznego Êrodka zapobiegajàcego powstawaniu piany, o którym mowa w cz´Êci II ust. 1; nie mo˝na dopuÊciç do nadmiernej maceracji; 2) zmacerowanà tkank´:
18. a)odwirowuje si´ z zastosowaniem parametru: 180 g/10 minut; uzyskany supernatant odwirowuje si´ z zastosowaniem parametru: 4000 g/10 minut, nast´pnie zlewa si´ i usuwa supernatant albo
19. b)odstawia si´ na 30 minut w celu osadzenia si´ resztek roÊlinnych; zlewa si´ supernatant bez naruszania osadu, a nast´pnie przefiltrowuje przez bibu∏´ filtracyjnà (Whatman nr 1) umieszczonà na filtrze szklanym (nr 2 = 40–100 µm), z zastosowaniem wodnej pompy pró˝niowej; filtrat zbiera si´ do probówki wirówkowej, a nast´pnie przep∏ukuje sterylnym buforem PBS, tak aby uzyskaç maksymalnie 35 ml filtratu, który odwirowuje si´ z zastosowaniem parametru 4000 g/20 minut; 3) osad zawiesza si´ w sterylnym buforze fosforanowym 0,01 M o pH 7,2, o którym mowa w cz´Êci II ust. 2, w taki sposób, aby uzyskaç ca∏kowità obj´toÊç oko∏o 1 ml, a nast´pnie dzieli si´ na dwie równe cz´Êci, jednà z nich pozostawia jako materia∏ referencyjny, zamra˝ajàc w temperaturze –20 °C lub liofilizujàc; pozosta∏à cz´Êç dzieli si´ na po∏ow´; jednà u˝ywa si´ do testu IF i barwienia Grama, drugà do testu ober˝ynowego; 4) wszystkie pozytywne kontrole bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i próby traktuje si´ oddzielnie w celu unikni´cia kontaminacji; ma to zastosowanie w odniesieniu do preparatów IF i testu ober˝ynowego; w czasie wykonywania te- Dziennik Ustaw Nr 75 — 4523 — stu IF i testu ober˝ynowego nale˝y oddzielaç od siebie kontrole pozytywne i badane próby w celu unikni´cia kontaminacji. 4. Test Grama 1) przygotowuje si´ preparaty Grama ze wszystkich rozcieƒczeƒ osadu, o których mowa w ust. 5 pkt 2, i ze wszystkich przeci´tych bulw, o których mowa w ust. 2, które na przekroju wykazujà szklistoÊç, zgnilizn´ czy inne podejrzane objawy; materia∏ do analiz pobiera si´ z brzegu pora˝onych tkanek; 2) przygotowuje si´ preparaty Grama ze znanych kultur bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus oraz, w miar´ mo˝liwoÊci, z naturalnie pora˝onych tkanek, o których mowa w ust. 5 pkt 1; 3) okreÊla si´, które próby zawierajà typowe, Gram dodatnie, maczugowate komórki; komórki bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus majà na ogó∏ d∏ugoÊç 0,8 do 1,2 µm i szerokoÊç 0,4—0,6 µm2); procedura barwienia jest okreÊlona w cz´Êci 2 ust. 3. ——————— 2) W preparatach z naturalnie zainfekowanych tkanek lub Êwie˝o wyizolowanych kultur cz´sto dominujà zaokràglone pa∏eczki, zwykle nieznacznie mniejsze ni˝ komórki ze starszych kultur wyhodowanych na agarze. Na wi´kszoÊci pod∏o˝y hodowlanych komórki bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sà pleomorficznymi, maczugowatymi pa∏eczkami i mogà wykazywaç zmiennoÊç w reakcji Grama. Komórki wyst´pujà pojedynczo, uk∏adajà si´ w pary z charakterystycznym wygi´ciem, co ma zwiàzek z ich podzia∏em, czasami tworzà nieregularne grupy przypominajàce palisady lub chiƒskie litery. Poz. 709 5. Test IF 1) w teÊcie IF u˝ywa si´ przeciwcia∏ na znany szczep bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus — ATCC 33113 (NCPPB 2137) lub NCPPB 2140, o mianie powy˝ej 1:600; w preparacie z badanà próbà uwzgl´dnia si´ kontrol´ PBS w celu sprawdzenia, czy koniugat izotiocyjanianu fluoresceiny przeciw immunoglobulinom króliczym (FITC) nie ∏àczy si´ niespecyficznie z komórkami bakterii; jako kontrol´ pozytywnà na oddzielnym szkie∏ku stosuje si´ kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (ATCC 33113 /NCPPB 2137/NCPPB 2140) oraz w miar´ mo˝liwoÊci umieszcza si´ naturalnie zainfekowanà tkank´ (zachowanà w formie zliofilizowanej lub zamro˝onà w temperaturze –20 °C), zgodnie ze schematem 2; 2) sposób wykonania badania:
20. a)przygotowuje si´ trzy seryjne dziesi´ciokrotne rozcieƒczenia (1:10, 1:100 i 1:1000) osadu w wodzie destylowanej (schemat 1),
21. b)na okienka wielopunktowego szkie∏ka mikroskopowego nanosi si´ za pomocà pipety odmierzonà standardowà obj´toÊç ka˝dego rozcieƒczenia osadu lub zawiesiny bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Êrednio 106 komórek/ml), wystarczajàcà do pokrycia okienka (Êrednio 25 µl), Schemat 1 Preparaty z próby i kontrola PBS Dziennik Ustaw Nr 75 — 4524 — Poz. 709 Schemat 2 Preparat z kontrolà pozytywnà
22. c)preparat suszy si´ w temperaturze oko∏o 37 °C, a nast´pnie utrwala z u˝yciem etanolu lub przez opalenie,
23. d)okienka pokrywa si´ przeciwcia∏ami na bakteri´ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus rozcieƒczonymi w 0,01 M buforze PBS o pH 7,2, o którym mowa w cz´Êci II ust. 2, jak pokazano na schemacie 1; u˝ywa si´ PBS jako kontrol´ FITC; rozcieƒczenie robocze przeciwcia∏ stanowi zwykle po∏ow´ miana; w przypadku u˝ycia innych rozcieƒczeƒ przeciwcia∏, dla ka˝dego rozcieƒczenia przygotowuje si´ oddzielne preparaty,
24. e)preparat inkubuje si´ w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut,
25. f)po inkubacji preparat ostro˝nie sp∏ukuje si´ 0,01 M buforem PBS o pH 7,2, a nast´pnie moczy si´ trzy razy po 5 minut w 0,01 M buforze PBS o pH 7,2,
26. g)ostro˝nie usuwa si´ nadmiar wilgoci,
27. h)ka˝de okienko preparatu pokrywa si´ koniugatem FITC w takim rozcieƒczeniu, jakie by∏o stosowane do okreÊlania miana, i inkubuje si´ w ciemnej, wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej,
28. i)preparat sp∏ukuje si´ i moczy, tak jak w lit. f,
29. j)na ka˝de okienko nanosi si´ Êrednio od 5 do 10 µl 0,1 M buforu fosforanowego z glicerynà o pH 7,6, o którym mowa w cz´Êci II ust 2 (lub podobnego utrwalacza o pH nie ni˝szym ni˝ 7,6) i przykrywa szkie∏kiem nakrywkowym,
30. k)przygotowany preparat przeglàda si´ w mikroskopie zaopatrzonym w êród∏o Êwiat∏a epifluorescencyjnego i filtry przeznaczone do pracy z FITC; stosuje si´ powi´kszenie 400 do 1000; okienka w powtórzeniach przeglàda si´ w poprzek dwóch Êrednic pod kàtem prostym oraz wokó∏ obwodu okienka. Poszukuje si´ fluoryzujàcych komórek w kontrolach pozytywnych i okreÊla si´ miano przeciwcia∏. Na- st´pnie poszukuje si´ fluoryzujàcych komórek w okienku kontrolnym FITC/PBS i, je˝eli si´ ich nie stwierdzi, przechodzi si´ do przeglàdania okienek z badanà próbà. W minimum 10 polach mikroskopu okreÊla si´ Êrednià liczb´ morfologicznie typowych, fluoryzujàcych komórek w polu widzenia i oblicza si´ ich liczb´ w mililitrze nierozcieƒczonego osadu wed∏ug wzoru okreÊlonego w cz´Êci II ust. 4. Przy ocenie preparatów bierze si´ pod uwag´ mo˝liwoÊç wystàpienia reakcji krzy˝owych. W osadzie ziemniaka mogà wyst´powaç populacje fluoryzujàcych komórek o nietypowej dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus morfologii oraz bakterie saprofityczne dajàce reakcje krzy˝owe, o wymiarach i morfologii podobnych do bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, dlatego te˝ bierze si´ pod uwag´ tylko fluoryzujàce komórki o typowych wymiarach i morfologii. Ze wzgl´du na mo˝liwoÊç wyst´powania reakcji krzy˝owych, próby, w przypadku których uzyskano pozytywne wyniki testu IF, poddaje si´ powtórnym badaniom z zastosowaniem innych przeciwcia∏. Techniczna granica wykrywalnoÊci okreÊlona dla tego testu zawiera si´ w przedziale 103-104 komórek/ml nierozcieƒczonego osadu. Próby, w których stwierdza si´ iloÊç typowych fluorescencyjnych komórek na granicy wykrywalnoÊci, sà zwykle wolne od Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, ale mogà byç poddane testowi ober˝ynowemu. Wynik testu IF traktuje si´ jako negatywny w przypadku prób, w których nie stwierdza si´ morfologicznie typowych fluoryzujàcych komórek. Próby takie uznaje si´ za „niepora˝one” przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Test ober˝ynowy nie jest wymagany. Wynik testu IF traktuje si´ jako pozytywny w przypadku prób, w których obecne sà morfologicznie typowe, fluoryzujàce komórki. Próby, w przypadku których uzyskuje si´ pozytywny wynik testu IF z zastosowaniem obydwu rodzajów przeciwcia∏, uznaje si´ za „potencjalnie pora˝one” Dziennik Ustaw Nr 75 — 4525 — przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. W przypadku wszystkich prób uznanych za „potencjalnie pora˝one” wykonuje si´ test ober˝ynowy. 6. Test ober˝ynowy Sposób uprawy ober˝yny okreÊlony jest w cz´Êci II ust. 5. Test ober˝ynowy przeprowadza si´ w nast´pujàcy sposób: 1) osadem, który otrzymano w sposób okreÊlony w ust 3 pkt 3, inokuluje si´ co najmniej 25 roÊlin ober˝yny w stadium trzeciego liÊcia uzyskanych Poz. 709 w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 5, za pomocà jednej z metod, o których mowa w ust. 6 pkt 2, 3 i 4; 2) inokulacji przez naci´cie na ∏odydze — pierwszy sposób:
31. a)ka˝dà doniczk´ umieszcza si´ poziomo w bloczku z polistyrenu (w przypadku doniczki o Êrednicy 10 cm odpowiedni jest bloczek z polistyrenu z wydrà˝onym z jednej strony miejscem o g∏´bokoÊci 5 cm, szerokoÊci 10 cm i d∏ugoÊci 15 cm), w sposób przedstawiony na schemacie 3; pomi´dzy ∏odygà a bloczkiem, dla ka˝dej próby, umieszcza si´ pasek sterylnej folii aluminiowej; roÊlin´ mo˝na zabezpieczyç za pomocà gumowej opaski na∏o˝onej wokó∏ bloczka, Schemat 3
32. b)pomi´dzy liÊcieniami i pierwszym liÊciem, wykonuje si´ za pomocà skalpela pod∏u˝ne lub lekko ukoÊne naci´cie o d∏ugoÊci 0,5—1,0 cm i g∏´bokoÊci Êrednio 3/4 Êrednicy ∏odygi,
33. c)naci´cie rozchyla si´ za pomocà skalpela i wprowadza do niego inokulum cienkim p´dzelkiem zanurzonym w osadzie. Pozosta∏y osad rozdziela si´ pomi´dzy roÊliny ober˝yny,
34. d)powsta∏à ran´ zabezpiecza si´ 2 ml sterylnej wazeliny naniesionej za pomocà strzykawki; 3) inokulacja przez naci´cie na ∏odydze — drugi sposób:
35. a)trzymajàc roÊlin´ pomi´dzy dwoma palcami, w miejscu pomi´dzy liÊcieniami i pierwszym liÊciem nanosi si´ kropl´ (Êrednio od 5 do 10 µl) zawiesiny osadu,
36. b)za pomocà sterylnego skalpela wykonuje si´ pod∏u˝ne (pod kàtem oko∏o 5 °) naci´cie, o d∏ugoÊci 1,0 cm i g∏´bokoÊci Êrednio 2/3 gruboÊci ∏odygi, rozpoczynajàc od miejsca naniesienia kropli osadu,
37. c)powsta∏à ran´ zabezpiecza si´ sterylnà wazelinà ze strzykawki; 4) inokulacja za pomocà strzykawki — trzeci sposób:
38. a)nie podlewa si´ roÊlin ober˝yny przez jeden dzieƒ przed inokulacjà w celu obni˝enia ciÊnienia turgorowego,
39. b)∏odygi ober˝yny powy˝ej liÊcieni inokuluje si´ za pomocà strzykawki z ig∏à do iniekcji podskórnej (nie mniejszej ni˝ 23 G); osad rozdziela si´ pomi´dzy roÊliny ober˝yny; 5) inokuluje si´ 25 roÊlin ober˝yny kulturà bakterii zidentyfikowanà wczeÊniej jako kultura bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i, w miar´ mo˝liwoÊci, naturalnie zainfekowanà tkankà ziemniaka, o której mowa w ust. 5 pkt 1, za pomocà tej samej metody inokulacji; 6) inokuluje si´ 25 roÊlin sterylnym 0,05 M buforem PBS za pomocà tej samej metody inokulacji; 7) roÊliny inkubuje si´ w odpowiednich warunkach, o których mowa w cz´Êci II ust. 5, przez 40 dni; po 8 dniach obserwuje si´ roÊliny w celu stwierdze- Dziennik Ustaw Nr 75 — 4526 — Poz. 709 nia, czy nie wyst´pujà na nich objawy choroby3) oraz notuje si´ liczb´ roÊlin wykazujàcà objawy; je˝eli w kolejnych testach nie sà obserwowane objawy, prób´ uznaje si´ jako negatywnà. 8) przygotowuje si´ preparaty Grama, o których mowa w ust. 4, dla wszystkich partii ober˝yny wykazujàcych objawy, wykonujàc przekroje przez tkank´ zwi´d∏ego liÊcia lub ∏odygi roÊliny, oraz dokonuje si´ izolacji na odpowiednie pod∏o˝e od˝ywcze, o którym mowa w ust. 7; liÊcie i ∏odygi ober˝yny dezynfekuje si´ powierzchniowo przez zwil˝enie ich 70 % etanolem; 7. Izolacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 9) przy ocenie roÊlin testowych bierze si´ pod uwag´ mo˝liwoÊç wystàpienia infekcji latentnej, szczególnie gdy uprawa nie jest prowadzona w optymalnych warunkach, nawet po 40-dniowej inkubacji. Infekcje takie mogà prowadziç do zahamowania wzrostu i braku wigoru inokulowanych roÊlin; je˝eli wynik testu IF uznany jest za pozytywny, koniecznym mo˝e byç przeprowadzenie dodatkowych badaƒ, dlatego te˝ nale˝y dokonaç porównania tempa wzrostu wszystkich badanych roÊlin ober˝yny z roÊlinami kontrolnymi inokulowanymi sterylnym 0,05 M PBS oraz monitorowanie warunków Êrodowiska szklarni; dalszà ocen´ prowadzi si´ w nast´pujàcy sposób:
40. a)odcina si´ ∏odygi powy˝ej miejsca inokulacji i usuwa si´ liÊcie,
41. b)∏odygi maceruje si´ w 0,05 M buforze PBS o pH 7,0 w sposób okreÊlony w ust. 3 pkt 1 i 2,
42. c)po∏ow´ osadu u˝ywa si´ do wykonania testu Grama i testu IF,
43. d)drugà po∏ow´ osadu u˝ywa si´ do przeprowadzenia dodatkowego testu ober˝ynowego, zgodnie z ust. 6, je˝eli uzyskano wyniki pozytywne testu Grama lub testu IF; stosuje si´ kontrol´ pozytywnà, którà stanowi zidentyfikowanà wczeÊniej kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, oraz kontrol´ negatywnà w postaci sterylnego 0,05 M buforu PBS; ——————— 3) Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus po- woduje wi´dni´cie liÊci ober˝yny, które mo˝e rozpoczynaç si´ wiotczeniem brzegów lub przestrzeni mi´dzy nerwami. Zwi´d∏e tkanki mogà byç poczàtkowo ciemnozielone lub plamiste, lecz jaÊniejà, zanim ulegnà nekrozie. Wi´dnàce tkanki mi´dzy nerwami cz´sto sprawiajà wra˝enie nat∏uszczonych i uwodnionych. Tkanki nekrotyczne majà cz´sto jasno˝ó∏ty brzeg. RoÊliny nie zawsze zamierajà; im d∏u˝szy okres poprzedzajàcy wystàpienie objawów, tym wi´ksza szansa na prze˝ycie. RoÊliny mogà pokonaç infekcj´. Podatne, m∏ode roÊliny ober˝yny sà bardziej wra˝liwe na ni˝sze koncentracje bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus ni˝ roÊliny starsze, stàd koniecznoÊç stosowania do badaƒ roÊlin w stadium trzeciego liÊcia lub nieco m∏odszych. Sprawcà wi´dni´cia mogà byç równie˝ populacje innych bakterii lub grzybów zasiedlajàcych tkanki bulwy. Do nich nale˝à Erwinia carotovora subsp. carotovora i E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var foveata, jak równie˝ du˝e populacje bakterii saprofitycznych. Tego typu wi´dni´cie mo˝na odró˝niç od wi´dni´cia powodowanego przez bakteri´ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, poniewa˝ w pierwszym przypadku gwa∏townie wi´dnà ca∏e liÊcie lub ca∏e roÊliny. Ostatecznà diagnoz´ stawia si´ wy∏àcznie po przeprowadzeniu identyfikacji wyizolowanych kultur bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, o której mowa w ust. 8. Bakteri´ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus mo˝na wyizolowaç z tkanek wykazujàcych objawy chorobowe. BezpoÊrednia izolacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z osadu uzyskanego z tkanki ziemniaka, o którym mowa w ust. 3 pkt 3, nie jest zalecana. RoÊliny ober˝yny stanowià swoiste pod∏o˝e umo˝liwiajàce namno˝enie si´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, jak równie˝ sà najlepszà testowà roÊlinà ˝ywicielskà. Bakteri´ izoluje si´ ze wszystkich bulw ziemniaka i roÊlin ober˝yny wykazujàcych objawy, o których mowa w ust. 4 i 6. Maceracj´ ∏odyg ober˝yny, o ile jest to konieczne, wykonuje si´ zgodnie z ust. 3 i 6 pkt 9: 1) zawiesin´ posiewa si´ na jedno z nast´pujàcych pod∏o˝y, okreÊlonych w cz´Êci II ust. 6: — Nutrient dextrose agar (agar od˝ywczy z glukozà) (tylko do przeszczepiania), — Yeast peptone glucose agar (agar dro˝d˝owo-peptonowo-glukozowy), — Nutrient yeast dextrose agar (agar od˝ywczy dro˝d˝owo-glukozowy), — Yeast extract mineral salts agar (agar z wyciàgiem dro˝d˝owym wzbogacony solami mineralnymi). Szalki inkubuje si´ w temperaturze 21 °C do 20 dni, a nast´pnie obserwuje si´, czy na pod∏o˝u obecne sà kolonie bakterii o morfologii typowej dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.4) Nast´pnie bakteri´ Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus przeszczepia si´ w celu uzyskania czystej kultury. 8. Identyfikacja wyizolowanych kultur bakterii Ze zdrowych lub pora˝onych ziemniaków i ober˝yny mo˝na wyizolowaç wiele Gram dodatnich, maczugowatych bakterii, wytwarzajàcych kolonie podobne do tych produkowanych przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Z tego wzgl´du dokonuje si´ identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w oparciu o nast´pujàce testy: 1) test IF; 2) test ober˝ynowy; ——————— 4) Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus jest organizmem wolnorosnàcym. Typowe kolonie sà kremowobia∏e lub barwy koÊci s∏oniowej, okràg∏e, g∏adkie, wzniesione, Êluzowato-p∏ynne, ca∏obrzegie i zwykle majà Êrednic´ 1 do 3 mm. Dziennik Ustaw Nr 75 — 4527 — 3) testy biochemiczne i fizjologiczne, o których mowa w cz´Êci II ust. 7:
44. a)test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F),
45. b)test na obecnoÊç oksydazy, Poz. 709 W ka˝dym teÊcie uwzgl´dnia si´ zidentyfikowanà wczeÊniej kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. W testach biochemicznych i fizjologicznych wykorzystuje si´ kultury wyhodowane na agarze od˝ywczym. Cechy morfologiczne bakterii ocenia si´ na podstawie kultur wyros∏ych na agarze z glukozà.
46. c)wzrost w temperaturze 37 °C, Test IF wykonuje si´ z wykorzystaniem zawiesiny bakterii o st´˝eniu 106 komórek/ml. WartoÊç miana przeciwcia∏ powinna byç zbli˝one do miana okreÊlonego w badaniu i u˝yciem zidentyfikowanej kultury bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Test ober˝ynowy wykonuje si´ z wykorzystaniem zawiesiny bakterii o st´˝eniu 107 komórek/ml. Do testu u˝ywa si´ 10 roÊlin dla ka˝dej próby, stosujàc znanà kultur´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus oraz wod´ sterylnà jako kontrole pozytywnà i negatywnà.
47. d)produkcja ureazy,
48. e)hydroliza eskuliny,
49. f)hydroliza skrobi,
50. g)tolerancja w stosunku do 7 % NaCl,
51. h)produkcja indolu,
52. i)test na obecnoÊç katalazy,
53. j)produkcja H2S,
54. k)wykorzystanie cytrynianu,
55. l)hydroliza ˝elatyny,
56. m)wytwarzanie kwasu z: glicerolu, laktozy, ramnozy i salicyny,
57. n)barwienie Grama. W przypadku czystych kultur typowe objawy wi´dni´cia uzyskuje si´ w ciàgu 20 dni, lecz roÊliny niewykazujàce objawów po up∏ywie tego czasu inkubuje si´ do koƒca 30-dniowego okresu w temperaturze optymalnej dla uprawy ober˝yny, lecz nieprzekraczajàcej 30 °C. Je˝eli po 30 dniach objawy nie wystàpià, kultura nie mo˝e byç uznana za patogenicznà form´ bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus Test O/F oksydaza katalaza redukcja azotanów aktywnoÊç ureazy produkcja H2S produkcja indolu wykorzystanie cytrynianu hydroliza skrobi wzrost w temperaturze 37 °C wzrost w obecnoÊci 7 % NaCl hydroliza ˝elatyny hydroliza eskuliny produkcja kwasu z: — glicerolu — laktozy — ramnozy — salicyny oboj´tna lub s∏abo utleniajàca — + — — — — — — lub s∏aba — — — + — — lub s∏aba — — II. Odczynniki, pod∏o˝a i testy stosowane przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 1. Sk∏ad p∏ynu do maceracji D C silicone antifoam MS A compound (Hopkins & Williams Ltd, nr kat. 9964 — 25, Chadwell Heath, Essex, England) — Êrodek przeciwpieniàcy Lubrol W w p∏atkach (ICI Ltd) pirofosforan czterosodowy 0,05 M bufor fosforanowy, pH 7,0 10 ml 0,5 g 1g 1 litr 2. Bufory 1) 0,05 M bufor fosforanowy o pH 7,0 stosowany do maceracji tkanek ziemniaka, o której mowa w cz´Êci I ust. 3 pkt 1 Na2HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g NaCl 8,00 g woda destylowana — uzupe∏nia si´ do 1 litra Dziennik Ustaw Nr 75 — 4528 — 2) 0,01 M bufor fosforanowy o pH 7,2 stosowany do rozcieƒczania przeciwcia∏ i p∏ukania preparatów w metodzie IF Poz. 709 przestanie uwalniaç barwnik, lub zanurza si´ w alkoholu na 30 sekund lekko poruszajàc preparatem, Na2HPO4 x 12 H2O 2,70 g
58. g)przep∏ukuje si´ wodà z kranu i osusza bibu∏à, NaH2PO4 x 2 H2O 0,40 g
59. h)zalewa si´ roztworem safraniny na 10 sekund, NaCl 8,00 g woda destylowana uzupe∏nia si´ do 1 litra
60. i)preparat przep∏ukuje si´ wodà z kranu i osusza bibu∏à. 3) 0,1 M bufor fosforanowy z glicerynà o pH 7,6 stosowany do zamykania preparatów, utrwala efekt fluorescencji Na2HPO4 x 12 H2O 3,20 g NaH2PO4 x 2 H2O 0,15 g glicerol 50 ml woda destylowana 100 ml Bakterie Gram dodatnie barwià si´ na kolor niebieskofioletowy, bakterie Gram ujemne na ró˝owoczerwony. 4. OkreÊlanie populacji komórek pozytywnych w teÊcie immunofluorescencji Powierzchnia (S) okienka na szkie∏ku wielopunktowym πD2 S = —— 4 3. Test Grama (modyfikacja Huckera) 1) Roztwór fioletu krystalicznego 2 g fioletu krystalicznego rozpuszcza si´ w 20 ml 95 % etanolu gdzie: D = Êrednica okienka. Powierzchnia (
61. s)pola widzenia obiektywu 0,8 g kwaÊnego w´glanu sodu rozpuszcza si´ w 80 ml wody destylowanej πd2 S = —— 4 Miesza si´ obydwa roztwory. 2) P∏yn Lugola