Dziennik Ustaw Nr 83 — 5348 — Poz. 775 775 ROZPORZÑDZENIE MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI1) z dnia 13 kwietnia 2004 r. w sprawie szczegó∏owych sposobów post´powania przy zwalczaniu i zapobieganiu roz

§ 10, oraz przeprowadza badania co najmniej wszystkich rozmno˝eƒ klonalnych sadzeniaków ziemniaka, b) uznaje za pora˝one ro

Êliny, przesy∏k´ lub parti´ roÊlin ziemniaka lub pomidora, z których pobierane by∏y próby,

1. c)uznaje za ska˝one maszyny, urzàdzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich cz´Êci, materia∏y u˝ywane do pakowania i inne przedmioty, które mia∏y kontakt z pora˝onymi roÊlinami ziemniaka lub pomidora,
2. d)uznaje za pora˝one pola, miejsca uprawy pod os∏onami i miejsca produkcji, w których ros∏y lub odbywa∏y si´ zbiory pora˝onych roÊlin ziemniaka lub pomidora, je˝eli ma to zastosowanie,
3. e)ustala zasi´g prawdopodobnego pora˝enia,

§ 11, bioràc pod uwag´: kontakt z pora˝onymi ro

Êlinami ziemniaka lub pomidora przed zbiorami lub po zbiorach, kontakt ze ska˝onymi maszynami, urzàdzeniami, pojazdami, pojemnikami, magazynami lub ich cz´Êciami, materia∏ami u˝ywanymi do pakowania, o których mowa w lit. c, oraz kontakt z pora˝onym polem, miejscem uprawy pod os∏onami lub miejscem produkcji, o których mowa w lit. d, a tak˝e powiàzania produkcyjne, nawadnianie lub spryskiwanie, lub pokrewieƒstwo klonalne, f) ustala zasi´g mo˝liwego rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum,

§ 12, g) na podstawie stwierdzonego pora˝enia i ska˝enia, okre

Êlonego zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia i mo˝liwego rozprzestrzeniania si´ bakterii wyznacza stref´, w której podejmowane b´dà dzia∏ania w celu zwalczania i zapobiegania rozprzestrzenianiu si´ bakterii Ralstonia solanacearum, zwanà dalej „strefà zagro˝enia”; 2) w przypadku upraw innych roÊlin ˝ywicielskich, je˝eli uprawa roÊlin ziemniaka lub pomidora zosta∏a uznana za zagro˝onà:

1. a)ustala zasi´g i pierwotne êród∏a pora˝enia oraz przeprowadza testy na co najmniej wszystkich rozmno˝eniach klonalnych sadzeniaków ziemniaka,
2. b)okreÊla jako pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum te roÊliny ˝ywicielskie, z których pobrano próby,
3. c)okreÊla prawdopodobne pora˝enie i ska˝enie oraz wyznacza stref´ zagro˝enia, bioràc pod uwag´ powiàzania produkcyjne roÊlin ziemniaka lub pomidora; 3) w przypadku wód powierzchniowych lub p∏ynnych resztek powstajàcych w czasie procesów przemys∏owych lub w miejscach pakowania roÊlin ziemniaka lub pomidora oraz zwiàzanych z nimi dziko rosnàcych roÊlin ˝ywicielskich z rodziny psiankowatych, je˝eli istnieje zagro˝enie dla produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora w zwiàzku Poz. 775 z nawadnianiem, opryskiwaniem lub zalewaniem wodami powierzchniowymi:
4. a)ustala zasi´g pora˝enia po przeprowadzeniu urz´dowego badania prób tych wód, resztek p∏ynnych lub dziko rosnàcych roÊlin ˝ywicielskich z rodziny psiankowatych, je˝eli one wyst´pujà,
5. b)okreÊla jako ska˝one wody powierzchniowe, z których pobrano próby, na podstawie wyników badania, o którym mowa w lit. a,
6. c)okreÊla prawdopodobne pora˝enie i ska˝enie oraz wyznacza stref´ zagro˝enia. § 10. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu i pierwotnego êród∏a pora˝enia obejmujà: 1) miejsca produkcji, w których:
7. a)sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego, co roÊliny ziemniaka uznane za pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum,
8. b)sà lub by∏y uprawiane roÊliny pomidora pochodzàce z tego samego êród∏a, co roÊliny pomidora uznane za pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum,
9. c)sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka lub pomidora, które zosta∏y poddane urz´dowemu nadzorowi, ze wzgl´du na podejrzenie wystàpienia bakterii Ralstonia solanacearum,
10. d)sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego, co roÊliny ziemniaka uprawiane w miejscach produkcji uznanych za pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum,
11. e)sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka lub pomidora, a miejsce ich uprawy po∏o˝one jest lub by∏o w sàsiedztwie pora˝onych miejsc produkcji, wraz z miejscami produkcji, w których wspólnie u˝ytkowany jest lub by∏ sprz´t i urzàdzenia u˝ywane w produkcji,
12. f)do nawadniania lub opryskiwania u˝ywa si´ wód powierzchniowych pochodzàcych: — z jakiegokolwiek êród∏a, które zosta∏o uznane za ska˝one lub podejrzane o ska˝enie bakterià Ralstonia solanacearum, — ze êród∏a u˝ytkowanego tak˝e w miejscach produkcji uznanych za pora˝one lub podejrzane o pora˝enie bakterià Ralstonia solanacearum,
13. g)pola sà lub by∏y zalewane przez wody powierzchniowe uznane za ska˝one lub podejrzane o ska˝enie przez bakteri´ Ralstonia solanacearum; 2) wody powierzchniowe u˝ywane do nawadniania lub opryskiwania lub, które zalewajà pola lub miejsca produkcji, uznane za pora˝one albo podejrzane o pora˝enie bakterià Ralstonia solanacearum. Dziennik Ustaw Nr 83 — 5351 — § 11. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu prawdopodobnego pora˝enia obejmujà: 1) inne roÊliny ziemniaka lub pomidora, uprawiane w miejscu produkcji okreÊlonym jako pora˝one; 2) miejsca produkcji, które mia∏y jakikolwiek kontakt z roÊlinami ziemniaka lub pomidora okreÊlonymi jako pora˝one, wraz z miejscami produkcji, w których wspólnie u˝ytkowany jest lub by∏ sprz´t i urzàdzenia u˝ywane w cyklu produkcyjnym; 3) roÊliny ziemniaka lub pomidora produkowane w miejscach produkcji, o których mowa w pkt 2; 4) roÊliny ziemniaka lub pomidora znajdujàce si´ w miejscach produkcji, o których mowa w pkt 1 lub 2, w okresie, w którym roÊliny ziemniaka lub pomidora, uznane za pora˝one, znajdowa∏y si´ w miejscach produkcji okreÊlonych jako pora˝one; 5) miejsca przechowywania roÊlin ziemniaka lub pomidora pochodzàcych z miejsc produkcji wymienionych w pkt 1—4; 6) maszyny, urzàdzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich cz´Êci, materia∏y u˝ywane do pakowania i inne przedmioty, które mog∏y mieç kontakt z roÊlinami ziemniaka lub pomidora uznanymi za pora˝one; 7) roÊliny ziemniaka lub pomidora przechowywane lub majàce kontakt z jakimikolwiek obiektami lub przedmiotami, o których mowa w pkt 6, przed ich wyczyszczeniem i zdezynfekowaniem; 8) roÊliny, w tym bulwy ziemniaka, okreÊlone zgodnie § 9 pkt 1 lit. a, pochodzàce z tego samego rozmno˝enia klonalnego lub roÊliny pomidora pochodzàce z tego samego êród∏a, co roÊliny ziemniaka lub pomidora uznane za pora˝one, je˝eli istnieje prawdopodobieƒstwo pora˝enia ze wzgl´du na pokrewieƒstwo klonalne, pomimo uzyskania negatywnych wyników badaƒ; 9) miejsca produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora, o których mowa w pkt 8; 10) miejsca produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora, w których do nawadniania i opryskiwania u˝ywana by∏a woda uznana za ska˝onà; 11) roÊliny ziemniaka lub pomidora produkowane na polach zalewanych wodami powierzchniowymi uznanymi za ska˝one. § 12. Badania majàce na celu ustalenie zasi´gu mo˝liwego rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum obejmujà: 1) w przypadkach gdy roÊliny ziemniaka lub pomidora zosta∏y uznane za pora˝one — miejsca produkcji, w których:
14. a)sà lub by∏y uprawiane roÊliny ziemniaka lub pomidora, znajdujàce si´ w sàsiedztwie miejsc produkcji uznanych za pora˝one, Poz. 775
15. b)stosowana jest lub by∏a wspólna produkcja i u˝ywany jest lub by∏ ten sam materia∏ wyjÊciowy sadzeniaka ziemniaka,
16. c)do nawadniania lub opryskiwania roÊlin ziemniaka lub pomidora u˝ywa si´ wód powierzchniowych, które pochodzi∏y z miejsca produkcji uznanego za pora˝one, lub je˝eli istnieje ryzyko, ˝e wody te sp∏yn´∏y lub zalewa∏y te miejsca; 2) w przypadkach gdy wody powierzchniowe zosta∏y uznane za ska˝one:
17. a)miejsca produkcji roÊlin ziemniaka lub pomidora, znajdujàce si´ w sàsiedztwie zbiornika wód powierzchniowych uznanych za ska˝one lub zagro˝one zalaniem przez takie wody,
18. b)jakikolwiek odosobniony zbiornik irygacyjny po∏àczony z wodami powierzchniowymi uznanymi za ska˝one. § 13. 1. RoÊliny ziemniaka lub pomidora uznane za pora˝one nie mogà byç sadzone. 2. RoÊliny, o których mowa w ust. 1, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora powinny byç: 1) spalone lub 2) zu˝yte do skarmiania zwierzàt, po uprzednim przeprowadzeniu zabiegu termicznego, wykluczajàcego ryzyko prze˝ycia bakterii Ralstonia solanacearum, lub 3) g∏´boko zakopanie w miejscu, w którym nie istnieje ryzyko ich przenikania do obszarów rolniczych lub ryzyko kontaktu ze êród∏em wody, która mo˝e zostaç u˝yta do nawadniania obszarów rolniczych, lub 4) przeznaczone do przerobu przemys∏owego, po bezpoÊrednim i natychmiastowym dostarczeniu ich do zak∏adu przetwórczego, spe∏niajàcego warunki okreÊlone w § 15, lub 5) poddane innym dzia∏aniom, ni˝ wymienione w pkt 1—4, je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum. § 14. 1. RoÊliny ziemniaka lub pomidora uznane za prawdopodobnie pora˝one lub roÊliny ziemniaka oraz pomidora, dla których zosta∏o zidentyfikowane ryzyko pora˝enia, oraz produkowane w miejscach produkcji uznanych za prawdopodobnie pora˝one nie mogà byç sadzone. 2. RoÊliny, o których mowa w ust. 1, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora powinny byç: 1) w przypadku bulw ziemniaka:
19. a)przeznaczone do konsumpcji, pakowane w miejscach, w których istniejà odpowiednie warunki usuwania resztek, gotowe i przeznaczone do bezpoÊredniego dostarczenia i u˝ycia bez przepakowywania, lub Dziennik Ustaw Nr 83 — 5352 —
20. b)przeznaczone do przerobu przemys∏owego po bezpoÊrednim i natychmiastowym dostarczeniu ich do zak∏adu przetwórczego, o którym mowa w § 13 ust. 2 pkt 4, lub
21. c)zu˝yte lub usuni´te w sposób okreÊlony przez wojewódzkiego inspektora, je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum; 2) w przypadku innych cz´Êci roÊlin ziemniaka lub pomidora, wraz z resztkami ∏odyg i liÊci:
22. a)zniszczone lub
23. b)zu˝yte lub usuni´te w sposób okreÊlony przez wojewódzkiego inspektora, je˝eli nie istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum. § 15. W zak∏adach przetwórczych i w miejscach pakowania roÊlin ziemniaka lub pomidora: 1) resztki roÊlin ziemniaka lub pomidora oraz inne sta∏e resztki niszczy si´ przez:
24. a)g∏´bokie zakopanie w miejscu, w którym nie istnieje ryzyko ich przenikania do obszarów rolniczych lub ryzyko kontaktu ze êród∏em wody, która mo˝e zostaç u˝yta do nawadniania obszarów rolniczych; resztki powinny byç przewiezione bezpoÊrednio do tego miejsca w warunkach wykluczajàcych ryzyko ich rozniesienia si´, lub
25. b)spalenie; 2) resztki p∏ynne, zawierajàce zawieszone czàstki sta∏e, poddaje si´ filtrowaniu lub procesowi osiadania w celu usuni´cia tych czàstek, a czàstki niszczy si´ w sposób okreÊlony w pkt 1 lit. a; nast´pnie resztki p∏ynne:
26. a)podgrzewa si´ do temperatury minimum 70 °C przez co najmniej 30 minut lub
27. b)niszczy si´ w sposób zatwierdzony przez wojewódzkiego inspektora, tak aby nie istnia∏o ryzyko kontaktu tych resztek z obszarami rolniczymi lub ryzyko kontaktu ze êród∏em wody, która mo˝e zostaç u˝yta do nawadniania obszarów rolniczych. § 16. Ârodki transportu, maszyny, urzàdzenia, pojazdy, pojemniki, magazyny lub ich cz´Êci, materia∏y u˝ywane do pakowania i inne przedmioty, które zosta∏y uznane za ska˝one albo za prawdopodobnie ska˝one, pod nadzorem wojewódzkiego inspektora niszczy si´ albo odka˝a przez oczyszczenie lub dezynfekcj´ w taki sposób, aby: 1) uniemo˝liwiç rozprzestrzenienie si´ bakterii Ralstonia solanacearum; 2) po zabiegach mog∏y byç uznane za nieska˝one. Poz. 775
28. a)przez okres co najmniej czterech lat uprawy nast´pujàcych po stwierdzeniu pora˝enia: — niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych, — zakazuje si´ sadzenia: bulw lub roÊlin ziemniaka, roÊlin i nasion pomidora, innych roÊlin ˝ywicielskich, roÊlin rodzaju Brassica, dla których stwierdzono ryzyko prze˝ywania bakterii Ralstonia solanacearum, oraz innych roÊlin, w przypadku których stwierdzono ryzyko rozprzestrzeniania si´ tej bakterii,
29. b)dopuszcza si´ sadzenie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, z przeznaczeniem wy∏àcznie na ziemniaki inne ni˝ sadzeniaki, w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, nast´pujàcym po okresie czteroletnim, o którym mowa w lit. a, je˝eli przez co najmniej dwa kolejne ostatnie lata uprawy przed posadzeniem stwierdzano, ˝e pole jest wolne od samosiewów ziemniaka i pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach, w ramach przeprowadzanej kontroli, pobiera równie˝ próby bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych,
30. c)w sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora nast´pujàcym po sezonie, o którym mowa w lit. b, i po odpowiednim cyklu zmianowania, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach, w ramach przeprowadzanej kontroli, pobiera równie˝ próby bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych, albo 2) w miejscach produkcji uznanych za pora˝one, na polu lub w miejscu uprawy pod os∏onami uznanym za pora˝one:
31. a)przez okres pi´ciu lat uprawy nast´pujàcych po stwierdzeniu pora˝enia niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych,
32. b)przez pierwsze trzy lata uprawy pole nale˝y: — pozostawiç od∏ogiem lub obsiaç zbo˝em albo — przeznaczyç na sta∏e pastwisko z cz´stym niskim koszeniem lub pod intensywny wypas, albo — przeznaczyç na produkcj´ nasiennà traw, § 17. 1. W obr´bie wyznaczonej strefy zagro˝enia podejmuje si´ nast´pujàce dzia∏ania: 1) w miejscach produkcji okreÊlonych jako pora˝one, na polu lub w miejscu uprawy pod os∏onami uznanym za pora˝one: a przez nast´pne dwa lata przeznaczyç na upraw´ roÊlin nieb´dàcych ˝ywicielami bakterii Ralstonia solanacearum, dla których nie stwierdzono ryzyka jej prze˝ywania lub rozprzestrzeniania si´, Dziennik Ustaw Nr 83 — 5353 —
33. c)w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora nast´pujàcym po okresie pi´cioletnim, o którym mowa w lit. b, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera równie˝ próby bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych; 3) na innych polach:
34. a)w roku uprawy nast´pujàcym po stwierdzeniu pora˝enia: — nie sadzi si´ bulw lub roÊlin ziemniaka, jak równie˝ innych roÊlin ˝ywicielskich, — niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych, lub — dopuszcza si´ sadzenie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka z przeznaczeniem na ziemniaki konsumpcyjne lub przemys∏owe pod warunkiem, ˝e nie istnieje ryzyko wyst´powania samosiewów ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który pobiera równie˝ próby bulw ziemniaka i próby samosiewów ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych,
35. b)w pierwszym roku uprawy nast´pujàcym po roku, o którym mowa w lit. a, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka,
36. c)w co najmniej drugim roku uprawy nast´pujàcym po roku, o którym mowa w lit. a, do produkcji sadzeniaków ziemniaka i ziemniaków innych ni˝ sadzeniaki, u˝ywa si´ urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub sadzeniaków ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora z urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka,
37. d)w ka˝dym roku uprawy, o których mowa w lit. a—c, niszczy si´ samosiewy ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, z uwzgl´dnieniem chwastów z rodziny psiankowatych; uprawa przeznaczona na sadzeniaki ziemniaka podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera równie˝ próby bulw ziemniaka do badaƒ laboratoryjnych; 4) bezpoÊrednio po stwierdzeniu pora˝enia oraz w ka˝dym nast´pnym roku uprawy, a˝ do pierwszego sezonu w∏àcznie, w którym na polach uznanych za pora˝one dopuszcza si´ upraw´ ziemniaków lub pomidorów: Poz. 775
38. a)maszyny i miejsca przechowywania roÊlin, produktów roÊlinnych lub przedmiotów w miejscu produkcji, wykorzystywane do produkcji ziemniaka lub pomidora, czyÊci si´ i dezynfekuje w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenianie si´ bakterii Ralstonia solanacearum,
39. b)wojewódzki inspektor przeprowadza kontrol´ programów nawadniania i opryskiwania, je˝eli istnieje ryzyko rozprzestrzeniania si´ bakterii Ralstonia solanacearum; 5) w miejscu uprawy pod os∏onami uznanym za pora˝one, w którym mo˝liwa jest ca∏kowita wymiana gleby lub pod∏o˝a:
40. a)nie uprawia si´ bulw i roÊlin ziemniaka, roÊlin i nasion pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich bakterii Ralstonia solanacearum, do czasu stwierdzenia przez wojewódzkiego inspektora, ˝e w wyniku przeprowadzonych zabiegów, w tym co najmniej usuni´cia wszelkiego materia∏u roÊlin ˝ywicielskich, ca∏kowitej wymiany pod∏o˝a oraz oczyszczenia lub zdezynfekowania miejsca uprawy i ca∏ego wyposa˝enia, wyeliminowano t´ bakteri´,
41. b)dopuszcza si´ produkcj´ ziemniaka z urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, minibulw lub mikroroÊlin, uzyskanych pod urz´dowym nadzorem,
42. c)wojewódzki inspektor prowadzi kontrol´ programów nawadniania i opryskiwania, w celu zapobie˝enia rozprzestrzenianiu si´ bakterii Ralstonia solanacearum. 2. W obr´bie strefy zagro˝enia, oprócz wymagaƒ okreÊlonych w ust. 1: 1) w przypadku gdy strefa zagro˝enia zosta∏a wyznaczona

§ 9pkt 1 lit. g, bezpo

Êrednio po stwierdzeniu pora˝enia i przez okres co najmniej trzech lat uprawy po stwierdzeniu pora˝enia:

1. a)wojewódzki inspektor sprawuje nadzór nad miejscami uprawy, przechowywania i miejscami majàcymi kontakt z bulwami ziemniaka lub pomidorami, wraz z miejscami, w których wspólnie u˝ytkowane sà maszyny do produkcji ziemniaka lub pomidora,
2. b)prowadzi si´ czyszczenie lub dezynfekcj´ maszyn i miejsc przechowywania w sposób uniemo˝liwiajàcy rozprzestrzenianie si´ bakterii Ralstonia solanacearum,
3. c)w przypadku upraw ziemniaka, dopuszcza si´ sadzenie wy∏àcznie urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub sadzeniaków ziemniaka wyprodukowanych pod nadzorem wojewódzkiego inspektora z urz´dowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka; uprawa podlega kontroli przeprowadzanej przez wojewódzkiego inspektora, który po zbiorach pobiera do badaƒ laboratoryjnych próby bulw ziemniaka sadzeniaka z miejsc produkcji prawdopodobnie pora˝onych, Dziennik Ustaw Nr 83 — 5354 —
4. d)oddziela si´ czynnoÊci zwiàzane ze zbiorem, przechowywaniem, przemieszczaniem i pakowaniem zebranych sadzeniaków ziemniaka od takich czynnoÊci wykonywanych przy ziemniakach innych ni˝ sadzeniaki, na terenie wszystkich miejsc w obr´bie strefy zagro˝enia,
5. e)wojewódzki inspektor przeprowadza kontrole urz´dowe; 2) w przypadku gdy wody powierzchniowe zosta∏y uznane za ska˝one lub za drog´ mo˝liwego rozprzestrzenienia si´ bakterii Ralstonia solanacearum, wojewódzki inspektor, bezpoÊrednio po stwierdzeniu ska˝enia i przez okres co najmniej trzech lat uprawy po stwierdzeniu ska˝enia, przeprowadza:
6. a)coroczne kontrole obejmujàce pobieranie do badaƒ laboratoryjnych prób wód powierzchniowych i roÊlin ˝ywicielskich z rodziny psiankowatych, rosnàcych w sàsiedztwie tych wód, w terminach umo˝liwiajàcych wykrycie bakterii Ralstonia solanacearum,
7. b)kontrol´ programów nawadniania i opryskiwania, w tym w zakresie zakazu stosowania wody uznanej za ska˝onà do nawadniania lub opryskiwania roÊlin ziemniaka lub pomidora oraz innych roÊlin ˝ywicielskich,
8. c)kontrole usuwania resztek sta∏ych powstajàcych w czasie procesów przemys∏owych lub w miejscach pakowania, w których wykorzystywane sà roÊliny ziemniaka lub pomidora — w przypadku stwierdzenia ska˝enia resztek p∏ynnych; Poz. 775 3) wojewódzki inspektor podejmuje dzia∏ania zmierzajàce do wymiany sadzeniaków ziemniaka. § 18. 1. W przypadku stwierdzenia obecnoÊci bakterii Ralstonia solanacearum w ziemniakach wyprodukowanych na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej, wojewódzki inspektor przeprowadza badania: 1) dotyczàce wczeÊniejszych rozmno˝eƒ ziemniaka wraz z poczàtkowym rozmno˝eniem klonalnym i rozmno˝eƒ klonalnych materia∏ów bazowych sadzeniaków ziemniaka lub 2) wszystkich rozmno˝eƒ klonalnych materia∏ów bazowych lub wczeÊniejszych rozmno˝eƒ wraz z poczàtkowym rozmno˝eniem klonalnym, je˝eli nie stwierdzono ˝adnego pokrewieƒstwa klonów. 2. W przypadkach innych ni˝ okreÊlone w ust. 1, wojewódzki inspektor przeprowadza badania na ka˝dej roÊlinie pochodzàcej z poczàtkowego rozmno˝enia klonalnego wst´pnej selekcji lub na reprezentatywnej próbie pobranej z materia∏ów bazowych sadzeniaków ziemniaka lub z materia∏ów pochodzàcych z wczeÊniejszych rozmno˝eƒ. § 19. Rozporzàdzenie wchodzi w ˝ycie z dniem og∏oszenia. Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi: W. Olejniczak Dziennik Ustaw Nr 83 — 5355 — Poz. 775 Za∏àcznik do rozporzàdzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 kwietnia 2004 r. (poz. 775) METODYKA DIAGNOZOWANIA, WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI BAKTERII Ralstonia solanacearum I. Zakres stosowania metodyki Metodyka obejmuje: 1) diagnozowanie Êluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roÊlinach ziemniaka i pomidora; 2) wykrywanie i identyfikacj´ bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka. 1. Diagnozowanie Êluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roÊlinach ziemniaka i pomidora Metodyka ma zastosowanie do bulw ziemniaka oraz roÊlin ziemniaka i pomidora z charakterystycznymi objawami chorobowymi lub podejrzanych o pora˝enie przez bakteri´ Ralstonia solanacearum. Metodyka obejmuje szybkie badania umo˝liwiajàce postawienie wst´pnej diagnozy, zwane dalej „metodami wst´pnego badania”, izolacj´ patogena z pora˝onych wiàzek przewodzàcych na pod∏o˝a diagnostyczne, a w przypadku uzyskania wyników pozytywnych — identyfikacj´ kultury jako bakteria Ralstonia solanacearum. ObjaÊnienia do diagramu: 1) opis objawów zamieszczono w cz´Êci II ust. 1. 2) metodami wst´pnego badania sà: — test na obecnoÊç wycieków z wiàzek przewodzàcych ∏odygi (cz´Êç II ust. 2), — test na obecnoÊç granulek poly-β-hydroksymaÊlanu (cz´Êç II ust. 2), — test IF (cz´Êç III ust. 2), — test ELISA (cz´Êç III ust. 3), — test PCR (cz´Êç III ust. 4), 3) izolacja bakterii z materia∏u roÊlinnego z typowymi objawami metodà rozcieƒczeƒ p∏ytkowych jest prosta, jednak˝e w przypadku zaawansowanych stadiów infekcji hodowla mo˝e si´ nie udaç; bakterie saprofityczne wyst´pujàce w chorej tkance mogà przerastaç bakteri´ Ralstonia solanacearum lub hamowaç jej wzrost na pod∏o˝u hodowlanym; je˝eli wynik izolacji jest negatywny, a objawy chorobowe sà typowe, izolacj´ nale˝y powtórzyç; zalecanà jest metoda posiewu na pod∏o˝a selektywne, 4) wiarygodnà identyfikacj´ czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na przeprowadziç w oparciu o testy wymienione w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 w po∏àczeniu z testem patogenicznoÊci (cz´Êci II ust. 4 pkt 3); oznaczanie szczepu nie jest obowiàzkowe, lecz zalecane w ka˝dym nowym przypadku wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum. Dziennik Ustaw Nr 83 — 5356 — 2. Wykrywanie i identyfikacja bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka Metodyka ma zastosowanie do wykrywania infekcji latentnej w bulwach ziemniaka za pomocà jednej lub kilku metod szybkiego badania. Pozytywne wy- Poz. 775 niki badaƒ uzyskanych z zastosowaniem tych metod sà potwierdzane przez izolacj´ bakterii Ralstonia solanacearum, a nast´pnie, w przypadku izolacji typowych kolonii, identyfikacj´ czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum. ObjaÊnienia do diagramu: 1) standardowa próba sk∏ada si´ z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednak˝e bada- nie mo˝na równie˝ wykonaç dla mniejszych prób, 2) je˝eli pojedynczy test jest niewystarczajàco czu∏y lub zbyt ma∏o wiarygodny do wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum w próbie, zaleca si´ przeprowadzenie wi´cej ni˝ jednego testu. Testy powinny opieraç si´ na ró˝nych zasadach biologicznych, 3) test immunofluorescencji (IF) jest powszechnie przyj´tà metodà wst´pnego badania; w odniesieniu do parametrów okreÊlonych w tej metodzie jest to test czu∏y (zakres czu∏oÊci 103—104 komórek/ml osadu ekstraktu ziemniaka); czynnikiem krytycznym decydujàcym o wiarygodnoÊci wyniku testu jest jakoÊç przeciwcia∏; nale˝y u˝ywaç wy∏àcznie przeciwcia∏ o wysokim mianie (minimum 2000 dla przeciwcia∏ wyjÊciowych), a wszystkie testy muszà byç wykonywane z przeciwcia∏ami w zakresie miana lub z zastosowaniem pierwszego rozcieƒczenia poni˝ej miana; zalecana jest metoda poÊrednia; Dziennik Ustaw Nr 83 — 5357 — Poz. 775 metod´ bezpoÊrednià mo˝na stosowaç, jeÊli poziom wykrywalnoÊci i specyficznoÊci tej metody jest równowa˝ny z poziomem metody poÊredniej; test IF umo˝liwia dokonanie oceny morfologii zabarwionych komórek i intensywnoÊci fluorescencji; na tej podstawie okreÊla si´ specyficznoÊç reakcji; w teÊcie IF doÊç powszechne sà reakcje krzy˝owe z serologicznie spokrewnionymi bakteriami glebowymi lub bakteriami obecnymi w tkankach ziemniaka o morfologii komórki zbli˝onej do bakterii Ralstonia solanacearum; w przypadkach podejrzenia o wystàpienie reakcji krzy˝owych nale˝y przeprowadziç badanie dodatkowà metodà opartà na innej zasadzie biologicznej; w takich przypadkach zalecana jest izolacja na pod∏o˝e selektywne, 4) metoda izolacji bakterii Ralstonia solanacearum na pod∏o˝e selektywne SMSA jest metodà wst´pnego badania o wysokiej czu∏oÊci i selektywnoÊci; wyniki izolacji uzyskuje si´ w ciàgu 3—6 dni od przygotowania próby; wyhodowane bakterie mo˝na ∏atwo zidentyfikowaç; nale˝y ostro˝nie pobieraç tkank´ z cz´Êci przystolonowej bulwy w celu unikni´cia zanieczyszczenia próby obecnymi w bulwach ziemniaka bakteriami wtórnymi, które „rywalizujà” z bakterià Ralstonia solanacearum na pod∏o˝u i mogà niekorzystnie wp∏ywaç na rozwój tej bakterii; ze wzgl´du na niekorzystny wp∏yw sk∏adników pod∏o˝a na badany organizm niektóre szczepy mogà rosnàç s∏abo; metoda izolacji mo˝e byç stosowana jako pojedyncza metoda wst´pnego badania w przypadku, gdy uzyskano negatywny wynik badania i nie ma podejrzeƒ o zahamowanie wzrostu bakterii Ralstonia solanacearum przez inne bakterie; w przypadku negatywnego wyniku badania, ale gdy wyst´puje podejrzenie o zahamowanie wzrostu bakterii Ralstonia solanacearum przez inne bakterie, prób´ poddaje si´ dalszym badaniom z zastosowaniem innej metody, w celu potwierdzenia lub odrzucenia diagnozy; w takim przypadku zalecanà metodà jest test IF, 5) test ELISA ma zakres czu∏oÊci 104—105 komórek/ml osadu ekstraktu ziemniaka i cz´Êciej uzyskuje si´ w nim wyniki fa∏szywie pozytywne (reakcje krzy˝owe) i fa∏szywie negatywne (hamujàcy wp∏yw czàsteczek fenolowych pochodzàcych z ekstraktu ziemniaka), dlatego test ELISA nie mo˝e byç stosowany jako test pojedynczy, 6) test PCR jest bardzo czu∏ym testem; reakcja mo˝e byç jednak zak∏ócana przez sk∏adniki roÊlinne obecne w ekstrakcie z roÊlin czy bulw (inhibitory), co wp∏ywa na uzyskanie fa∏szywie negatywnych wyników; negatywny wp∏yw inhibitorów mo˝na zmniejszyç przez rozcieƒczenie próbki, majàc na uwadze, ˝e jednoczeÊnie ulega rozcieƒczeniu populacja bakterii Ralstonia solanacearum; wszystkie etapy przygotowania próby i badania nale˝y przeprowadzaç z du˝à ostro˝noÊcià w celu unikni´cia kontaminacji, która mo˝e przyczyniç si´ do uzyskania wyników fa∏szywie pozytywnych; wyniki fa∏szywie pozytywne mogà równie˝ wynikaç z homologii sekwencji innych organizmów; z tych powodów test PCR nie mo˝e byç stosowany jako test pojedynczy, 7) test wzbogacania polega na inkubacji prób ekstraktu ziemniaka w pó∏selektywnym bulionie od˝ywczym (np. zmodyfikowany bulion SMSA) i pozwala na namno˝enie bakterii Ralstonia solanacearum; obecnoÊç bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na stwierdziç za pomocà testów: IF, ELISA i PCR; nie zaleca si´ wykonywania bezpoÊredniego posiewu z bulionu od˝ywczego; test ten nie mo˝e byç wykorzystywany jako pojedyncza metoda wst´pnego badania, 8) test biologiczny mo˝e byç stosowany do izolacji bakterii Ralstonia solanacearum z ekstraktu ziemniaka drogà selektywnego wzbogacania w roÊlinie ˝ywicielskiej i mo˝na go wykonaç na roÊlinach pomidora lub ober˝yny; niezb´dne jest zapewnienie korzystnych dla rozwoju bakterii Ralstonia solanacearum warunków Êrodowiska, 9) identyfikacji czystej kultury bakterii Ralstonia solanacearum dokonuje si´ za pomocà co najmniej jednego z testów wskazanych w cz´Êci II ust. 4 pkt 1, w po∏àczeniu z testem patogenicznoÊci wskazanym w cz´Êci II ust. 4 pkt 3; oznaczanie szczepu nie jest obowiàzkowe, lecz zalecane w ka˝dym nowym przypadku wykrycia bakterii. II. Diagnozowanie Êluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roÊlinach ziemniaka i pomidora 1. Objawy Êluzaka 1.1. Objawy na ziemniaku Na roÊlinach ziemniaka we wczesnym stadium infekcji obserwuje si´ wi´dni´cie liÊci ku wierzcho∏kowi ∏odygi w ciàgu dnia, gdy panuje wysoka temperatura. Objawy te zanikajà nocà. Wi´dni´cie szybko staje si´ nieodwracalne i prowadzi do Êmierci roÊliny. Wiàzki przewodzàce wi´dnàcej roÊliny, widoczne na przekroju poprzecznym przez ∏odyg´, mogà przebarwiaç si´ na bràzowo, a z przeci´tej powierzchni wycieka samoistnie lub po ÊciÊni´ciu ∏odygi mleczny Êluz. Po umieszczeniu przeci´tej ∏odygi w wodzie w pozycji pionowej, z wiàzek przewodzàcych wydostajà si´ smu˝ki Êluzu. W bulwach ziemniaka, po poprzecznym ich przekrojeniu w pobli˝u cz´Êci przystolonowej, we wczesnym stadium infekcji wyst´pujà szklisto˝ó∏te do jasnobràzowych przebarwienia pierÊcienia wiàzek przewodzàcych, z których po kilku minutach wydostaje si´, samoistnie lub po lekkim ÊciÊni´ciu palcami, jasnokremowy Êluz widoczny na przeci´tej powierzchni. Na- st´pnie, bràzowe przebarwienia wiàzek stajà si´ wyraêniejsze, a nekroza mo˝e rozszerzaç si´ na tkank´ parenchymatycznà. W zaawansowanych stadiach infekcja rozprzestrzenia si´ z cz´Êci przystolonowej i oczek na zewnàtrz, wskutek czego na powierzchni bulwy mogà wyst´powaç czerwonobràzowe, lekko zapadni´te ranki, a na nich mogà pojawiaç si´ wycieki bakteryjne, do których przylegajà grudki ziemi. 1.2. Objawy na roÊlinach pomidora Pierwszym widocznym objawem jest zwiotcza∏y wyglàd najm∏odszych liÊci. W sprzyjajàcych rozwojowi bakterii Ralstonia solanacearum warunkach Êrodowiska (temperatura gleby oko∏o 25 °C, du˝a wilgotnoÊç) w ciàgu kilku dni dochodzi do epinastii i jednostronnego lub ca∏kowitego wi´dni´cia roÊliny, a nast´pnie jej zamierania. W mniej sprzyjajàcych warunkach (temperatura gleby poni˝ej 21 °C) na ∏odydze mo˝e rozwijaç si´ wiele korzeni przybyszowych. Czasami widoczne sà t∏uste smugi przebiegajàce wzd∏u˝ ∏odygi, które wskazujà na obecnoÊç nekroz w obr´bie wiàzek przewodzàcych. Po przekrojeniu ∏odygi w poprzek, ze zbràzowia∏ych wiàzek przewodzàcych wyciekajà krople Êluzu bakteryjnego barwy bia∏ej lub ˝ó∏tawej. Dziennik Ustaw Nr 83 — 5358 — 2. Metody wst´pnego badania W celu postawienia wst´pnej diagnozy stosuje si´ jeden lub kilka z ni˝ej wymienionych testów: 1) test na obecnoÊç wycieków z ∏odygi:
9. a)wi´dnàcà ∏odyg´ ziemniaka przecina si´ nieco powy˝ej poziomu gleby,
10. b)odci´ty fragment ∏odygi umieszcza si´ przeci´tà powierzchnià w zlewce z wodà,
11. c)po chwili z wiàzek przewodzàcych samoistnie wydostajà si´ smu˝ki Êluzu bakteryjnego; 2) test na wykrywanie granulek poly-β-hydroksymaÊlanu (PHB):
12. a)granulki PHB w komórkach bakterii Ralstonia solanacearum stajà si´ widoczne po zabarwieniu b∏´kitem nilu A albo sudanem czarnym B,
13. b)wykonuje si´ rozmaz ze Êluzu lub zawiesiny tkanki na szkie∏ku mikroskopowym albo przygotowuje si´ preparat z 48. godzinnej kultury bakterii Ralstonia solanacearum na pod∏o˝u YPGA lub SPA, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 1,
14. c)przygotowuje si´ kontrol´ pozytywnà w postaci rozmazu ze szczepu nale˝àcego do biowaru 2/rasa 3 oraz, w przypadku gdy to stosowne, kontrol´ negatywnà w postaci rozmazu z niespokrewnionego szczepu,
15. d)preparat suszy si´, a nast´pnie kilkakrotnie szybko przesuwa spodnià powierzchnià nad p∏omieniem palnika w celu utrwalenia rozmazu; 3) test z b∏´kitem nilu:
16. a)utrwalony rozmaz zalewa si´ 1 % wodnym roztworem b∏´kitu nilu A, a nast´pnie inkubuje si´ przez 10 minut w temperaturze 55 °C,
17. b)zlewa si´ roztwór barwnika, przep∏ukuje s∏abym strumieniem wody bie˝àcej, a nadmiar wody usuwa za pomocà bibu∏y,
18. c)preparat zalewa si´ 8 % wodnym roztworem kwasu octowego i inkubuje przez minut´ w temperaturze pokojowej,
19. d)preparat przep∏ukuje si´ s∏abym strumieniem wody bie˝àcej i osusza bibu∏à,
20. e)preparat zwil˝a si´ kroplà wody i nak∏ada szkie∏ko nakrywkowe;
21. f)zabarwiony rozmaz oglàda si´ w mikroskopie epifluorescencyjnym (450
22. nm)pod imersjà, stosujàc powi´kszenie 1000x; obserwacje preparatu prowadzi si´ w kierunku wykrycia jasnopomaraƒczowych, fluoryzujàcych granulek PHB,
23. g)preparat oglàda si´ równie˝ w Êwietle bia∏ym, aby upewniç si´, ˝e granulki znajdujà si´ wewnàtrz komórek bakterii, a morfologia komórki jest typowa dla bakterii Ralstonia solanacearum; Poz. 775 4) test z sudanem czarnym:
24. a)utrwalony rozmaz zalewa si´ 0,3 % roztworem sudanu czarnego B w 70 % alkoholu oraz inkubuje przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
25. b)zlewa si´ roztwór barwnika i przep∏ukuje wodà bie˝àcà; nadmiar wody zlewa si´, a preparat osusza za pomocà bibu∏y,
26. c)preparat zanurza si´ na krótko w ksylolu i osusza bibu∏à; z uwagi na szkodliwoÊç ksylolu prac´ wykonuje si´ pod digestorium,
27. d)preparat zalewa si´ 0,5 % wodnym roztworem safraniny i pozostawia na 10 sekund w temperaturze pokojowej; z uwagi na szkodliwoÊç safraniny prac´ wykonuje si´ pod digestorium,
28. e)delikatnie przep∏ukuje si´ preparat s∏abym strumieniem wody bie˝àcej, osusza bibu∏à i nak∏ada szkie∏ko nakrywkowe,
29. f)zabarwiony preparat oglàda si´ w mikroskopie Êwietlnym, w Êwietle przechodzàcym pod imersjà, stosujàc powi´kszenie 1000x, granulki PHB w komórkach bakterii Ralstonia solanacearum barwià si´ na niebieskoczarno, a Êciana komórkowa barwi si´ na ró˝owo; 5) inne testy:
30. a)test IF — przeprowadzany

e sposobem okreÊlonym w cz´Êci III ust. 2, b) test ELISA — przeprowadzany

e sposobem okreÊlonym w cz´Êci III ust. 3, c) test PCR — przeprowadzany

e sposobem okreÊlonym w cz´Êci III 4 ust. 4. 3. Metoda izolacji 1) pobiera si´ Êluz lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierÊcienia wiàzek przewodzàcych bulwy ziemniaka lub z wiàzek przewodzàcych ∏odygi ziemniaka lub pomidora; umieszcza si´ je w ma∏ej obj´toÊci sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego i pozostawia si´ na 5—10 minut; 2) wykonuje si´ serie dziesi´ciokrotnych rozcieƒczeƒ zawiesiny (1:10 i 1:100 lub wi´cej, jeÊli uzna si´ za stosowne); 3) przenosi si´ standardowà obj´toÊç zawiesiny i jej rozcieƒczeƒ na podstawowe pod∏o˝a od˝ywcze NA, YPGA i SPA, o których mowa w cz´Êci IV ust. 1, lub na pod∏o˝e Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 1, lub na pod∏o˝e selektywne SMSA, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 7; wykonuje si´ posiew za pomocà ezy lub g∏aszczki, stosujàc odpowiednià technik´ rozcieƒczeƒ p∏ytkowych; je˝eli uzna si´ za stosowne, wykonuje si´ kontrol´ pozytywnà drogà posiewu rozcieƒczonej zawiesiny patogenicznej kultury bakterii Ralstonia solanacearum, nale˝àcej do biowaru 2/rasy 3 bakterii Ralstonia Dziennik Ustaw Nr 83 — 5359 — solanacearum na oddzielnych p∏ytkach z ka˝dym z pod∏o˝y; 4) p∏ytki inkubuje si´ przez 3 dni w temperaturze 28 °C; je˝eli wzrost jest powolny, czas inkubacji mo˝na wyd∏u˝yç do 6 dni, majàc na uwadze, ˝e na pod∏o˝u SMSA kolonie bakterii cz´sto stajà si´ nietypowe i zamierajà:

1. a)na podstawowych pod∏o˝ach od˝ywczych patogeniczne izolaty bakterii Ralstonia solanacearum tworzà per∏owobia∏e, p∏askie, nieregularne i fluidalne kolonie, cz´sto z charakterystycznymi zag∏´bieniami,
2. b)na pod∏o˝u Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym typowe kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanacearum sà kremowe, p∏askie, nieregularne i fluidalne z krwistoczerwonym, zag∏´bionym Êrodkiem; niepatogeniczne formy tej bakterii produkujà ciemnoczerwone kolonie o mas∏owatej konsystencji,
3. c)na pod∏o˝u SMSA typowe kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanace- Poz. 775 arum sà mlecznobia∏e, p∏askie, nieregularne i fluidalne, z krwistoczerwonym Êrodkiem; niepatogeniczne formy tej bakterii produkujà mniej fluidalne kolonie, ca∏kowicie ró˝owe do czerwonych; 5) kolonie o charakterystycznej morfologii przeszczepia si´ na podstawowe pod∏o˝e od˝ywcze w celu uzyskania czystej kultury; nale˝y unikaç regularnego przeszczepiania, które mo˝e prowadziç do utraty patogenicznoÊci. 4. Testy potwierdzajàce 1) Czystà kultur´ bakterii Ralstonia solanacearum identyfikuje si´, stosujàc co najmniej jeden z nast´pujàcych testów:
4. a)testy biochemiczne i fizjologiczne przeprowadzane w celu okreÊlenia, czy wyizolowane bakterie posiadajà w∏aÊciwoÊci biochemiczne i fizjologiczne, typowe dla bakterii Ralstonia solanacearum; do ka˝dego testu do∏àcza si´ odpowiedni szczep kontrolny barwnik fluoryzujàcy – inkluzje PHB + test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F) O+/F– katalaza + test Kovacsa + redukcja azotanów + wykorzystanie cytrynianu + wzrost w temperaturze 40 °C – wzrost w 1 % NaCl + wzrost w 2 % NaCl – dihydrolaza argininy – hydroliza ˝elatyny – hydroliza skrobi – hydroliza eskuliny – produkcja lewanu –
5. b)test IF — przygotowuje si´ zawiesin´ 106 komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego oraz wykonuje si´ seri´ dwukrotnych rozcieƒczeƒ przeciwcia∏; test IF przeprowadza si´

e sposobem, o którym mowa w cz´Êci III ust. 2; miano dla badanej kultury musi byç równowa˝ne mianu dla kontroli pozytywnej, c) test ELISA — przygotowuje si´ zawiesin´ >106 komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; test ELISA przeprowadza si´

e sposobem, o którym mowa w cz´Êci III ust. 3; odczyty w teÊcie ELISA dla badanej kultury muszà byç równowa˝ne wartoÊciom uzyskanym dla kontroli pozytywnej, d) test PCR — przygotowuje si´ zawiesin´ 106 komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; test PCR przeprowadza si´

e sposobem, o którym mowa w cz´Êci III ust. 4; uzyskany produkt PCR dla badanej kultury musi mieç takà samà wielkoÊç i wzór uzyskany w analizie z u˝yciem enzymów restrykcyjnych (REA) jak kontrola pozytywna, Dziennik Ustaw Nr 83 — 5360 — Poz. 775

1. e)fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) — przygotowuje si´ zawiesin´ 106 komórek/ml badanej kultury i szczepu kontrolnego; stosuje si´ metod´ FISH z primerem PCR OLI-1; badana kultura musi wykazywaç takà samà reakcj´ jak kontrola pozytywna, stosuje metod´ FAP; profil badanej kultury musi byç identyczny z profilem kontroli pozytywnej; charakterystyka kwasów t∏uszczowych jest nast´pujàca: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH i 18:1 2OH;
2. f)profil bia∏kowy — zdenaturowane bia∏ka komórkowe sà rozdzielane drogà elektroforezy na ˝elu poliakrylamidowym — PAGE, 2) oznaczanie szczepu jest zalecane w ka˝dym nowym przypadku wykrycia bakterii Ralstonia solanacearum; stosuje si´ co najmniej jednà z nast´pujàcych metod:
3. g)analiza kwasów t∏uszczowych (FAP) — hoduje si´ badanà kultur´ i szczep bakterii kontroli pozytywnej przez 48 godzin, w temperaturze 28 °C, na agarze sojowo-tryptonowym oraz
4. a)okreÊlanie biowaru na podstawie zdolnoÊci do produkcji kwasu z trzech alkoholi szeÊciow´glowych i trzech cukrów Biowar wykorzystywanie 1 2 3 4 5 — maltozy – + + – + — laktozy – + + – + — celobiozy – + + – + — mannitolu – – + + + — sorbitolu – – + + – — dulcitolu – – + + – dodatkowe testy na rozró˝nienie w obr´bie biowaru 2 podfenotypów biowar 2 biowar 2-A biowar 2-T wykorzystywanie trehalozy – + + wykorzystywanie inozytolu + – + wykorzystywanie D-rybozy – – + aktywnoÊç pektolityczna niska niska wysoka
5. b)okreÊlanie rasy na podstawie testu patogenicznoÊci na roÊlinach pomidora lub ober˝yny i roÊlinach tytoniu oraz na podstawie reakcji nadwra˝liwoÊci (HR) na liÊciach tytoniu Reakcja Rasa*) 1 2 3 na roÊlinach pomidora/ober˝yny wi´dni´cie brak reakcji wi´dni´cie na roÊlinach tytoniu wi´dni´cie brak reakcji brak reakcji na liÊciach tytoniu nekroza (48
6. h)i wi´dni´cie (7—8 dni) HR (12—24
7. h)chloroza (2—8 dni) *) Nie uwzgl´dniono rasy 4 (patogeniczna dla imbiru i niektórych innych roÊlin ˝ywicielskich) i rasy 5 (patogeniczna wy∏àcz- nie dla morwy). Dziennik Ustaw Nr 83 — 5361 — OkreÊlenie rasy na podstawie testu patogenicznoÊci lub testu nadwra˝liwoÊci na roÊlinach tytoniu mo˝e byç niewystarczajàco wiarygodne; o rasie mo˝na wnioskowaç na podstawie biowaru i naturalnej roÊliny ˝ywicielskiej. Szczepy bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na rozró˝niç na poziomie molekularnym za pomocà: — analizy RFLP, — powtarzalnej sekwencji PCR (REP-, ERIC- i BOX-PCR); 3) test patogenicznoÊci stosuje si´ w celu potwierdzenia diagnozy oraz w celu okreÊlania patogenicznoÊci kultur zidentyfikowanych jako bakteria Ralstonia solanacearum, wykonujàc nast´pujàce czynnoÊci:
8. a)przygotowuje si´ inokulum 106 komórek/ml badanej kultury i szczepu kontroli pozytywnej,
9. b)inokuluje si´ 5—10 roÊlin pomidora lub ober˝yny, najlepiej w stadium trzeciego liÊcia w∏aÊciwego lub starszych,

metodà okreÊlonà w cz´Êci III ust. 6,

1. c)roÊliny inkubuje si´ do dwóch tygodni w temperaturze 22—28 °C i wzgl´dnie wysokiej wilgotnoÊci, codziennie podlewajàc,
2. d)prowadzi si´ obserwacje w celu stwierdzenia, czy na roÊlinach wyst´pujà objawy wi´dni´cia, epinastii, chlorozy i kar∏owatoÊci,
3. e)bakterie izoluje si´ z roÊlin z objawami choroby w nast´pujàcy sposób: — wycina si´ fragment tkanki ∏odygi dwa centymetry powy˝ej miejsca inokulacji, — tkank´ ∏odygi rozdrabnia si´ i zawiesza w niewielkiej obj´toÊci sterylnej wody destylowanej lub w 50 mM buforu fosforanowego, a nast´pnie posiewa si´ na pod∏o˝e, inkubuje i sprawdza wyst´powanie typowych kolonii bakterii Ralstonia solanacearum. III. Wykrywanie i identyfikacja bakterii Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka 1. Przygotowanie próby do badania Standardowa próba sk∏ada si´ z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednak˝e badanie mo˝na równie˝ wykonaç dla mniejszych prób. W celu stymulacji namna˝ania ma∏ych populacji bakterii Ralstonia solanacearum mo˝na, je˝eli uzna si´ to za stosowane, inkubowaç prób´ w temperaturze 25—30 °C do dwóch tygodni. Przed przystàpieniem do w∏aÊciwego badania, bulwy mo˝na umyç pod bie˝àcà wodà z u˝yciem odpowiednich dezynfektantów i detergentów, a nast´pnie osuszyç na powietrzu. Poz. 775 Sposób post´powania przy przygotowaniu ekstraktu: 1) za pomocà czystego i zdezynfekowanego skalpela lub no˝a do obierania warzyw usuwa si´ skórk´ z cz´Êci przystolonowej bulwy w taki sposób, aby uwidoczniç wiàzki przewodzàce; ostro˝nie wycina si´ z cz´Êci przystolonowej tkank´ przewodzàcà w postaci ma∏ego sto˝ka o Êrednicy 3—5 mm; iloÊç tkanki innej ni˝ przewodzàca nale˝y ograniczyç do minimum; w ten sam sposób post´puje si´ z ka˝dà bulwà wchodzàcà w sk∏ad próby; na tym etapie mo˝na dokonaç wizualnej oceny bulw; bulwy z objawami choroby lub gnijàce poddaje si´ odr´bnym badaniom okreÊlonym w cz´Êci II; 2) tkank´ pobranà z cz´Êci przystolonowej bulw umieszcza si´ w zamkni´tym pojemniku; je˝eli nie jest mo˝liwe bezpoÊrednie przeprowadzenie badania, materia∏ mo˝na przechowaç do 24 godzin, a w temperaturze 4 °C — nie d∏u˝ej ni˝ 72 godziny; 3) tkank´ pobranà z cz´Êci przystolonowej:
4. a)przenosi si´ do odpowiedniego pojemnika, a nast´pnie dodaje si´ odpowiednià obj´toÊç buforu do maceracji, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 2, w taki sposób, aby pokryç tkank´; rozdrabnia si´ w homogenizatorze, nie dopuszczajàc do nadmiernej homogenizacji; macerat pozostawia si´ na 15—30 minut lub
5. b)przenosi si´ do odpowiedniego pojemnika, a nast´pnie dodaje si´ odpowiednià obj´toÊç buforu do maceracji w taki sposób, aby pokryç tkank´; pojemnik z tkankà wytrzàsa si´ na wstrzàsarce obrotowej przy 50—100 obrotów/min przez 4 godziny w temperaturze 20—22 °C lub przez 16—24 godzin w temperaturze 4 °C, lub
6. c)przenosi si´ do mocnej jednorazowej torebki do maceracji, a nast´pnie mia˝d˝y si´ a˝ do uzyskania homogenatu; dodaje si´ odpowiednià obj´toÊç buforu do maceracji w taki sposób, aby pokryç tkank´; macerat pozostawia si´ na 15—30 minut; 4) bakterie ekstrahuje si´ ze zmacerowanej tkanki pobranej z cz´Êci przystolonowej w nast´pujàcy sposób:
7. a)macerat delikatnie dekantuje si´ do probówki wirówkowej, pozostawiajàc jego resztki w pojemniku lub torebce; je˝eli zdekantowany macerat jest m´tny, odwirowuje si´ go z zastosowaniem nast´pujàcych parametrów: 180 g/10 minut/<10 °C; zdekantowany macerat lub supernatant uzyskany podczas wirowania wst´pnego odwirowuje si´ z zastosowaniem nast´pujàcych parametrów: 7000 g/15 minut/<10 °C lub 10000 g/10 minut/<10 °C; supernatant zlewa si´ bez naruszania osadu lub
8. b)macerat przefiltrowuje si´ z u˝yciem filtra o wielkoÊci oczek 40—100 µm; filtrowanie mo˝na u∏atwiç, stosujàc pomp´ pró˝niowà; Dziennik Ustaw Nr 83 — 5362 — filtrat zbiera si´ do probówki wirówkowej, a filtr przep∏ukuje si´ buforem do maceracji; filtrat odwirowuje si´ z zastosowaniem nast´pujàcych parametrów: 7000 g/15 minut/<10 °C lub 10000 g/10 minut/<10 °C; supernatant zlewa si´ bez naruszania osadu; 5) osad zawiesza si´ w 1 ml buforu do zawieszania osadu, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 2, a nast´pnie dzieli na dwie równe porcje i przenosi do mikroprobówek; ekstrakt z jednej mikroprobówki wykorzystuje si´ do badaƒ, a jego pozosta∏oÊç przechowuje si´ na czas badania w temperaturze 4 °C; do drugiej probówki dodaje si´ kropl´ sterylnego glicerolu i miesza si´ na wstrzàsarce typu worteks, a nast´pnie przechowuje si´ w temperaturze –18 °C przez kilka tygodni lub w temperaturze –70 °C przez kilka miesi´cy. 2. Test IF W teÊcie IF u˝ywa si´ przeciwcia∏ na bakteri´ Ralstonia solanacearum (najlepiej rasa 3/biowar 2). Miano przeciwcia∏ okreÊla si´ z u˝yciem zawiesiny 106 komórek/ml homologicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum i koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) w odpowiednim rozcieƒczeniu,

instrukcjà stosowania. Przeciwcia∏a wyjÊciowe powinny posiadaç miano co najmniej 1:

1. W teÊcie u˝ywa si´ szkie∏ek mikroskopowych wielopunktowych; zalecane sà szkie∏ka
2. punktowe o Êrednicy 6 mm. Na ka˝dym szkie∏ku mikroskopowym umieszcza si´ kontrol´ negatywnà, w celu sprawdzenia, czy koniugat (FITC) nie wià˝e si´ niespecyficznie z antygenem bakteryjnym. Badanie powtarza si´, jeÊli w okienku z kontrolà negatywnà obecne sà fluoryzujàce komórki bakterii. Poz. 775 Preparaty z kontrolà pozytywnà wykonuje si´ oddzielne, z u˝yciem zawiesiny 106 komórek/ml szczepu nale˝àcego do odpowiedniej rasy/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum. Dla ka˝dego zestawu testów wykonuje si´ jeden preparat kontrolny. Sposób wykonania badania: 1) preparaty z badanych prób wykonuje si´ w nast´pujàcy sposób: a) w przypadku osadu z niewielkà zawartoÊcià skrobi — za pomocà pipety nanosi si´ na okienka, w jednym rz´dzie, standardowà obj´toÊç zawieszonego w buforze osadu; standardowà obj´toÊcià dla okienek o Êrednicy 6 mm jest 15 µl; dla okienek o wi´kszej Êrednicy nale˝y dokonaç proporcjonalnych przeliczeƒ; drugi rzàd okienek mo˝e byç u˝yty jako powtórzenie próby lub dla kolejnej próby,

e schematem 1, b) w przypadku pozosta∏ych ekstraktów — wykonuje si´ dziesi´ciokrotne rozcieƒczenia ekstraktu (1:10, 1:100 i 1:1000) w buforze do zawieszania osadu; za pomocà pipety nanosi si´ na okienka, w jednym rz´dzie, standardowà obj´toÊç zawieszonego w buforze osadu i jego rozcieƒczenia; standardowà obj´toÊcià dla okienek o Êrednicy 6 mm jest 15 µl; dla okienek o wi´kszej Êrednicy nale˝y dokonaç proporcjonalnych przeliczeƒ; drugi rzàd okienek mo˝e byç u˝yty jako powtórzenie próby lub dla kolejnej próby,

e schematem 2; Dziennik Ustaw Nr 83 — 5363 — 2) krople pozostawia si´ do wyschni´cia, a nast´pnie preparat utrwala si´ przez ogrzanie, opalenie lub z u˝yciem 95 % etanolu; 3) w przypadku gdy preparaty wykonuje si´

e sposobem okreÊlonym w pkt 1 lit. a, sporzàdza si´ zestaw dwukrotnych rozcieƒczeƒ [1/4 miana (M/4), 1/2 miana (M/2), miano (M) i podwojone miano (2M)] przeciwcia∏ w buforze IF, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 3; w przypadku sposobu okreÊlonego w pkt 1 lit. b — sporzàdza si´ rozcieƒczenie robocze (RR) przeciwcia∏ w buforze IF; rozcieƒczenie robocze jest rozcieƒczeniem przeciwcia∏ o optymalnej specyficznoÊci i stanowi ono zwykle po∏ow´ miana:

1. a)preparaty umieszcza si´ na wilgotnej bibule; okienka z badanymi próbami pokrywa si´ przeciwcia∏ami, a w okienku z kontrolà negatywnà FITC umieszcza si´ bufor PBS; naniesiona na okienka obj´toÊç przeciwcia∏ musi byç równowa˝na obj´toÊci naniesionego ekstraktu,
2. b)preparaty inkubuje si´ pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia,
3. c)krople przeciwcia∏ usuwa si´ z preparatów, a nast´pnie preparaty ostro˝nie sp∏ukuje si´ buforem IF; moczy si´ przez pi´ç minut w buforze IF-Tween, a nast´pnie pi´ç minut w buforze IF i ostro˝nie usuwa si´ nadmiar wilgoci,
4. d)preparaty umieszcza si´ na wilgotnej bibule; okienka z badanymi próbami oraz okienko z kontrolà negatywnà FITC pokrywa si´ koniugatem FITC w rozcieƒczeniu u˝ytym przy okreÊlaniu miana; naniesiona na okienka obj´toÊç koniugatu (FITC) musi byç identyczna jak obj´toÊç naniesionych przeciwcia∏,
5. e)preparaty inkubuje si´ pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia, Poz. 775
6. f)krople koniugatu usuwa si´ z preparatu, preparat p∏ucze si´, a nast´pnie moczy w sposób okreÊlony w lit. c i ostro˝nie usuwa si´ nadmiar wilgoci,
7. g)na ka˝de okienko nanosi si´ za pomocà pipety 5—10 µl 0,1 M buforu fosforanowego z glicerolem, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 3, lub podobnego utrwalacza i nak∏ada si´ szkie∏ko nakrywkowe; 4) odczyt testu IF — preparaty oglàda si´ w mikroskopie epifluorescencyjnym z filtrami odpowiednimi dla wzbudzenia FITC pod imersjà, stosujàc powi´kszenie 500—1000x; okienka przeglàda si´ w poprzek dwóch Êrednic przeci´tych pod kàtem prostym oraz wokó∏ obwodu okienka; najpierw sprawdza si´ preparat z kontrolà pozytywnà; komórki muszà byç wyraênie zabarwione i wykazywaç jasnà fluorescencj´; test nale˝y powtórzyç, jeÊli zabarwienie jest niew∏aÊciwe; przeglàdajàc preparaty z badanà próbà, najpierw sprawdza si´, czy w kontroli FITC nie wyst´pujà fluoryzujàce komórki; obecnoÊç fluoryzujàcych komórek w kontroli FITC wskazuje na niespecyficzne wiàzanie koniugatu FITC, autofluorescencj´ lub kontaminacj´; test nale˝y powtórzyç, je˝eli takie zjawisko wyst´puje; okienka z badanymi próbami przeglàda si´, poszukujàc jasno fluoryzujàcych komórek o charakterystycznej dla bakterii Ralstonia solanacearum morfologii; intensywnoÊç fluorescencji musi byç równowa˝na z intensywnoÊcià fluorescencji w preparacie z kontrolà pozytywnà z u˝yciem tego samego rozcieƒczenia przeciwcia∏; komórki nieca∏kowicie zabarwione lub s∏abo fluoryzujàce muszà byç pomini´te, chyba ˝e wyst´puje wiele takich komórek. Interpretacja wyników testu IF: 1) je˝eli nie stwierdzono obecnoÊci jasno fluoryzujàcych komórek o charakterystycznej morfologii, wynik testu jest negatywny; Dziennik Ustaw Nr 83 — 5364 — 2) je˝eli stwierdzono obecnoÊç jasno fluoryzujàcych komórek o charakterystycznej morfologii, okreÊla si´ Êrednià iloÊç komórek w polu widzenia i oblicza si´ iloÊç komórek (N) w ml zawieszonego osadu wed∏ug wzoru okreÊlonego w cz´Êci IV ust. 4; populacja stanowiàca oko∏o 103 komórek/ml zawieszonego osadu jest uznawana za granic´ wykrywalnoÊci w teÊcie IF, a wi´c w przypadku prób o:
8. a)N > 103 komórek/ml zawieszonego osadu — wynik testu jest uznawany za pozytywny,
9. b)N < 103 komórek/ml zawieszonego osadu — wynik testu mo˝e byç uznawany za pozytywny; 3) je˝eli w zakresie miana przeciwcia∏ widoczna jest du˝a iloÊç (>105 komórek/
10. ml)cz´Êciowo lub s∏abo fluoryzujàcych komórek, wykonuje si´ drugi test:
11. a)oparty na innej zasadzie biologicznej lub
12. b)powtórny test IF z u˝yciem innych przeciwcia∏ albo z u˝yciem dziesi´ciokrotnie rozcieƒczonego osadu. Poz. 775 5) sporzàdza si´ odpowiednie rozcieƒczenie przeciwcia∏ na bakteri´ Ralstonia solanacearum w buforze blokujàcym, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 5; do studzienek nanosi si´ po 100 µl rozcieƒczonych przeciwcia∏ oraz inkubuje przez godzin´ w temperaturze 37 °C; 6) przeciwcia∏a usuwa si´ ze studzienek, a studzienki wyp∏ukuje si´ w sposób okreÊlony w pkt 4; 7) sporzàdza si´ odpowiednie rozcieƒczenie koniugatu z alkalicznà fosfatazà w buforze blokujàcym i nanosi si´ po 100 µl rozcieƒczonego koniugatu do studzienek; p∏ytki inkubuje si´ przez 1 godzin´ w temperaturze 37 °C; 8) koniugat, o którym mowa w pkt 7, usuwa si´ ze studzienek, a studzienki wyp∏ukuje si´ w sposób okreÊlony w pkt 4; 9) sporzàdza si´ roztwór substratu alkalicznej fosfatazy, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 5, nanosi si´ po 100 µl do studzienek oraz inkubuje przez 30 minut do jednej godziny w ciemnoÊci, w temperaturze otoczenia; 10) absorbancj´ odczytuje si´ przy d∏ugoÊci fali 409 nm. 3. Test ELISA W teÊcie ELISA u˝ywa si´ przeciwcia∏ na bakteri´ Ralstonia solanacearum (najlepiej ras´ 3/biowar 2). Miano okreÊla si´ z u˝yciem zawiesiny 106 komórek/ml homologicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum. U˝ywa si´ p∏ytek titracyjnych. Sporzàdza si´ kontrol´ negatywnà z u˝yciem ekstraktu ze zdrowych ziemniaków i kontrol´ buforu fosforanowego (PBS); jako kontroli pozytywnej u˝ywa si´ zawiesiny o st´˝eniu >106 komórek/ml szczepu nale˝àcego do odpowiedniej rasy/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum. Z kontrolà pozytywnà post´puje si´ w taki sam sposób jak z badanymi próbami, przy czym kontrol´ pozytywnà wyraênie oddziela si´ od badanej próby na p∏ytce titracyjnej. Sposób wykonania badania: 1) wprowadza si´ 100—200 µl zawieszonego osadu za pomocà pipety do mikroprobówki, którà podgrzewa si´ przez 4 minuty w temperaturze 100 °C, a nast´pnie pozostawia w lodzie; 2) dodaje si´ równowa˝nà obj´toÊç podwójnie st´˝onego buforu op∏aszczajàcego, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 5, oraz miesza si´ na wstrzàsarce typu worteks; 3) nanosi si´ po 100 µl ekstraktu do co najmniej dwóch studzienek w p∏ytce titracyjnej, a nast´pnie inkubuje si´ przez jednà godzin´ w temperaturze 37 °C lub pozostawia do nast´pnego dnia w temperaturze 4 °C; 4) ekstrakt usuwa si´ ze studzienek, a studzienki wyp∏ukuje si´ trzykrotnie buforem PBS-Tween, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 5, pozostawiajàc bufor w studzienkach przy ostatnim p∏ukaniu na co najmniej 5 minut; Interpretacja wyników testu ELISA: 1) je˝eli g´stoÊç optyczna (GO) próby jest <2 x GO kontroli negatywnej — wynik testu ELISA jest negatywny; 2) je˝eli g´stoÊç optyczna (GO) próby jest >2 x GO kontroli negatywnej — wynik testu ELISA jest pozytywny. 4. Test PCR Na wszystkich etapach przygotowania próby i podczas innych czynnoÊci zwiàzanych z przeprowadzaniem testu PCR u˝ywa si´ koƒcówek do pipet z filtrem. Sporzàdza si´ zawiesin´ 106 komórek/ml szczepu nale˝àcego do rasy 3/biowaru bakterii Ralstonia solanacearum jako kontrol´ pozytywnà. Z kontrolà pozytywnà post´puje si´ w taki sam sposób jak z badanymi próbami. Sposób wykonania badania: 1) wprowadza si´ 100 µl zawieszonego osadu za pomocà pipety do mikroprobówki albo przenosi si´ 90 µl zawieszonego osadu do mikroprobówki zawierajàcej 10 µl 0,5M NaOH; miesza si´ przez kilkakrotne odwrócenie probówki; 2) probówk´ ogrzewa si´ przez 4 minuty w temperaturze 100 °C, a nast´pnie pozostawia w lodzie; 3) sporzàdza si´ co najmniej dwa dziesi´ciokrotne rozcieƒczenia (1:10 i 1:100) lub wi´cej, je˝eli uzna si´ za stosowne, w sterylnej wodzie destylowanej lub w wodzie ultraczystej (UPW); 4) przygotowuje si´ mieszanin´ reakcyjnà do testu PCR, o której mowa w cz´Êci IV ust. 6, w sterylnej mikroprobówce i dodaje si´ sk∏adniki w nast´pujàcej kolejnoÊci: Dziennik Ustaw Nr 83 — 5365 — Poz. 775
13. a)dla obj´toÊci 50 µl: sk∏adnik woda sterylna destylowana lub UPW 10 x bufor PCR d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP primer OLI-1 (20 µM) primer Y-2 (20 µM) Tag polimeraza (5 U/µl) iloÊç st´˝enie koƒcowe 30,8 µl—33,8 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,2 µl obj´toÊç ca∏kowita 45 µl—48 µl 1x 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 mM 1 mM 1,0 U
14. b)dla wi´kszej liczby reakcji — przelicza si´ iloÊç ka˝dego sk∏adnika na wymaganà liczb´ reakcji, a nast´pnie miesza si´ sk∏adniki i przenosi 45 µl—48 µl mieszaniny do sterylnych probówek PCR; probówki z mieszaninà reakcyjnà do PCR przetrzymuje si´ w lodzie,
15. c)dla obj´toÊci 25 µl — sk∏adniki przelicza si´ proporcjonalnie; 5) amplifikacja PCR:
16. a)probówki z zagotowanà próbà i kontrolà pozytywnà mo˝na odwirowaç; do poszczególnych probówek z mieszaninà reakcyjnà PCR dodaje si´ w nast´pujàcej kolejnoÊci: 2—5 µl próby albo kontrol´ negatywnà (woda), albo kontrol´ pozytywnà; probówki umieszcza si´ w bloku grzejnym amplifikatora DNA,
17. b)przeprowadza si´ program, obejmujàcy nast´pujàce etapy:1) — jeden cykl: 2 minuty w temperaturze 96 °C (denaturacja), — 50 cykli: 20 sekund w temperaturze 94 °C (denaturacja), 20 sekund w temperaturze 68 °C (przy∏àczanie primerów), 30 sekund w temperaturze 72 °C (wyd∏u˝anie kopii), — jeden cykl: 10 minut w temperaturze 72 °C (dalsze wyd∏u˝anie), — jeden cykl: utrzymywanie w temperaturze 4 °C,
18. c)probówki wyjmuje si´ z amplifikatora i analizuje produkt PCR; je˝eli analiza nie b´dzie wykonywana bezpoÊrednio, probówki przechowuje si´ w temperaturze 4 °C w celu u˝ycia jeszcze tego samego dnia, lub w temperaturze –18 °C, je˝eli analiza b´dzie przeprowadzana w póêniejszym terminie; 6) analiza produktu PCR drogà elektroforezy agarozowej i barwienia bromkiem etydyny: ———————— 1) Podane parametry przewidziane sà dla amplifikatora Perkin Elmer 9600; w przypadku innych amplifikatorów konieczne mo˝e byç dodanie do probówki reakcyjnej PCR oleju mineralnego lub modyfikacja czasu w etapie obejmujàcym 50 cykli.
19. a)sporzàdza si´ odpowiedni ˝el agarozowy, doprowadzajàc stopniowo do wrzenia agaroz´ w buforze do elektroforezy (TAE),
20. b)p∏ynnà agaroz´ sch∏adza si´ do temperatury 50—60 °C, a nast´pnie wlewa pomi´dzy dwie p∏yty w celu uformowania ˝elu i montuje grzebieƒ; pozostawia si´ do zestalenia,
21. c)usuwa si´ grzebieƒ; ˝el zanurza si´ w buforze TAE w taki sposób, aby by∏ pokryty 2—3 mm warstwà buforu,
22. d)na parafilmie umieszcza si´ 3 µl kropl´ buforu obcià˝ajàcego; dodaje si´ 12 µl produktu PCR z próby, z kontroli pozytywnej lub z kontroli negatywnej (woda), po czym miesza si´ kilkakrotnie nabierajàc i wypuszczajàc mieszanin´ z koƒcówki pipety; podane obj´toÊci mogà byç modyfikowane w taki sposób, aby odpowiada∏y rozmiarowi kieszonki w ˝elu agarozowym,
23. e)ostro˝nie nape∏nia si´ kieszonki w ˝elu; w co najmniej jednej kieszonce umieszcza si´ odpowiedni wzorzec DNA jako odniesienie,
24. f)prowadzi si´ elektroforez´ przy parametrach 5—8 V/cm do chwili, a˝ wskaênik osiàgnie poziom 1 cm od koƒcowego brzegu ˝elu,
25. g)po wy∏àczeniu aparatu do elektroforezy, ostro˝nie wyjmuje si´ ˝el i zanurza si´ w roztworze bromku etydyny na 30—45 minut, u˝ywajàc r´kawic jednorazowych,
26. h)˝el odbarwia si´ w wodzie destylowanej przez 10—15 minut,
27. i)zamplifikowany fragment oglàda si´ w transiluminatorze UV; produkt PCR dla bakterii Ralstonia solanacearum z zestawem primerów OLI-1 i Y-2 ma wielkoÊç 288 bp; porównuje si´ go z markerem DNA i kontrolà pozytywnà; kontrola negatywna (woda) w ka˝dym przypadku musi byç negatywna, w przeciwnym przypadku test nale˝y powtórzyç,
28. j)wykonuje si´ fotografi´ ˝elu w celu udokumentowania wyników, je˝eli jest to wymagane,
29. k)potwierdza si´ autentycznoÊç zamplifikownego fragmentu drogà analizy z u˝yciem enzymów restrykcyjnych (REA); Dziennik Ustaw Nr 83 — 5366 — 7) analiza z u˝yciem enzymów restrykcyjnych (REA):
30. a)przenosi si´ 8,5 µl produktu PCR do nowej mikroprobówki i dodaje si´ 1 µl st´˝onego 10 x buforu do enzymu i 0,5 µl enzymu restrykcyjnego Ava II,
31. b)zawartoÊç probówki miesza si´ kilkakrotnie nabierajàc i wypuszczajàc mieszanin´ z koƒcówki pipety; je˝eli na Êciankach mikroprobówki pozostanà krople, krótko wiruje si´ w mikrowirówce oraz inkubuje si´ przez godzin´ w temperaturze 37 °C,
32. c)analizuje si´ strawiony przez enzymy restrykcyjne fragment PCR drogà elektroforezy agarozowej w sposób okreÊlony ust. 4 pkt 6. Interpretacja wyników testu PCR: 1) je˝eli nie wykryto charakterystycznego fragmentu 288 bp, a fragment ten zosta∏ wykryty w kontroli pozytywnej Ralstonia solanacearum — wynik testu PCR jest negatywny; 2) je˝eli wykryto charakterystyczny fragment 288 bp, a analiza REA zamplifikowanego fragmentu jest identyczna jak w przypadku kontroli pozytywnej bakterii Ralstonia solanacearum — wynik testu PCR jest pozytywny. 5. Izolacja na pod∏o˝a selektywne 1) izolacj´ przeprowadza si´ z zastosowaniem techniki rozcieƒczeƒ p∏ytkowych, np.:
33. a)sporzàdza si´ co najmniej dwa 10. rozcieƒczenia osadu zawieszonego w buforze do osadu (1:10 i 1:100) lub wi´cej, jeÊli uzna si´ za stosowne; nanosi si´ za pomocà pipety odmierzonà standardowà obj´toÊç (50—100 µl) zawieszonego w buforze osadu i ka˝de jego rozcieƒczenie na zmodyfikowane pod∏o˝e selektywne SMSA, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 7, po czym rozprowadza si´ na powierzchni pod∏o˝a za pomocà szklanej g∏aszczki; je˝eli uzna si´ za stosowne, wykonuje si´ posiew zawieszonego osadu za pomocà ezy z oczkiem o obj´toÊci 10 µl; po ka˝dym etapie ez´ opala si´ lub
34. b)przenosi si´ odmierzonà standardowà obj´toÊç (50—100 µl) zawieszonego w buforze osadu na zmodyfikowane pod∏o˝e selektywne SMSA i rozprowadza na ca∏ej powierzchni pod∏o˝a za pomocà szklanej g∏aszczki; wykonuje si´ posiew bez opalania g∏aszczki, na co najmniej dwóch innych szalkach ze zmodyfikowanym pod∏o˝em SMSA; 2) przygotowuje si´ kontrol´ pozytywnà, stosujàc t´ samà metod´ rozcieƒczeƒ p∏ytkowych w odniesieniu do zawiesiny 106 komórek/ml patogenicznej rasy 3/biowaru 2 bakterii Ralstonia solanacearum na oddzielnym zestawie p∏ytek ze zmodyfikowanym pod∏o˝em SMSA; Poz. 775 3) p∏ytki inkubuje si´ w temperaturze 28 °C, a odczyt wyniku rozpoczyna si´ po trzech dniach; w przypadku wyniku negatywnego p∏ytk´ inkubuje si´ dalej, do szeÊciu dni; kolonie patogenicznych izolatów bakterii Ralstonia solanacearum sà mlecznobia∏e, p∏askie, nieregularne i fluidalne, z krwistoczerwonym zag∏´bionym Êrodkiem, wykazujàce wewn´trzne bruzdki; 4) kolonie bakterii o charakterystycznej morfologii, w celu uzyskania czystej kultury, przeszczepienia si´ na podstawowe pod∏o˝e od˝ywcze, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 1; 5) identyfikuje si´ czystà kultur´ w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 i potwierdza identyfikacj´ bakterii Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogenicznoÊci, o którym mowa w cz´Êci II ust. 4 pkt 3. Interpretacja wyników uzyskanych w metodzie izolacji na pod∏o˝a selektywne: 1) je˝eli w ciàgu szeÊciu dni nie wyrosnà ˝adne kolonie lub nie zostanà wyizolowane kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum, pod warunkiem ˝e nie podejrzewa si´ hamujàcego wp∏ywu innych kolonii bakterii, oraz je˝eli w kontroli pozytywnej obecne sà kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum — wynik izolacji na pod∏o˝a selektywne uznaje si´ za negatywny; 2) je˝eli obecne sà kolonie charakterystyczne dla bakterii Ralstonia solanacearum — wynik izolacji na pod∏o˝a selektywne uznaje si´ za pozytywny. 6. Test biologiczny 1) dla ka˝dej badanej próby u˝ywa si´ 10 sadzonek roÊlin testowych podatnej odmiany pomidora lub ober˝yny w stadium trzeciego liÊcia w∏aÊciwego; nie podlewa si´ roÊlin 24 godziny przed inokulacjà; 2) 100. µl zawieszonego osadu inokuluje si´ roÊliny testowe, wk∏uwajàc ig∏´ w ∏odyg´ pomi´dzy liÊcieniami oraz w jedno lub kilka innych miejsc; 3) przygotowuje si´ kontrol´ pozytywnà; stosujàc t´ samà technik´ inokuluje si´ 10 sadzonek zawiesinà 106 komórek/ml patogenicznego szczepu bakterii Ralstonia solanacearum biowar 2/rasa 3 jako kontrol´ pozytywnà oraz kontrol´ negatywnà, inokulujàc roÊliny buforem do zawieszenia osadu; roÊliny stanowiàce kontrol´ pozytywnà oddziela si´ od pozosta∏ych roÊlin w celu unikni´cia kontaminacji; 4) roÊliny testowe hoduje si´ dalej, do czterech tygodni, w temperaturze 22—28 °C i w warunkach wysokiej wilgotnoÊci wzgl´dnej, codziennie podlewajàc; prowadzi si´ obserwacje w celu stwierdzenia, czy na roÊlinach wystàpià objawy wi´dni´cia, epinastii, chlorozy lub kar∏owatoÊci; 5) izoluje si´ bakterie z zainokulowanych roÊlin i dokonuje si´ identyfikacji czystej kultury o cha- Dziennik Ustaw Nr 83 — 5367 — rakterystycznej morfologii w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 oraz potwierdza si´ identyfikacj´ kultury jako bakteri´ Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogenicznoÊci, o którym mowa w cz´Êci II ust. 4 pkt 3; 6) w przypadku zestawu roÊlin z badanej próby niewykazujàcych objawów choroby, je˝eli uzna si´ za stosowne, sprawdza si´, czy nie wyst´puje infekcja latentna: z ka˝dej roÊliny testowej wycina si´ 1. cm fragment ∏odygi w odleg∏oÊci 2 cm od miejsca inokulacji; pobranà tkank´ homogenizuje si´ w buforze do maceracji, a nast´pnie wykonuje si´ posiew metodà rozcieƒczeƒ, o której mowa w cz´Êci III ust. 5 pkt 1; je˝eli wynik jest pozytywny, dokonuje si´ identyfikacji czystych kultur o charakterystycznej morfologii w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 1 oraz potwierdza si´ identyfikacj´ kultury jako bakteria Ralstonia solanacearum na podstawie testu patogenicznoÊci, o którym mowa w cz´Êci II ust. 4 pkt 3. Interpretacja wyniku testu biologicznego: 1) je˝eli roÊliny testowe nie sà pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum, a bakteria Ralstonia solanacearum zosta∏a wykryta w kontroli pozytywnej — wynik testu biologicznego uznaje si´ za negatywny; 2) je˝eli roÊliny testowe sà pora˝one przez bakteri´ Ralstonia solanacearum — wynik testu biologicznego uznaje si´ za pozytywny. 7. Testy wzbogacania 1) przenosi si´ 100 µl zawieszonego osadu do 3 ml zmodyfikowanego bulionu SMSA, o którym mowa w cz´Êci IV ust. 7; 2) mieszanin´ inkubuje si´ 48 godzin, ale nie d∏u˝ej ni˝ 72 godziny, w temperaturze 28 °C, z luêno umocowanym korkiem probówki w celu zapewnienia dost´pu powietrza; 3) wciska si´ korek i miesza si´ na wstrzàsarce typu worteks; rozdziela si´ go do celów testu IF, testu ELISA lub testu PCR. 8. Test patogenicznoÊci Test patogenicznoÊci przeprowadza si´ w sposób okreÊlony w cz´Êci II ust. 4 pkt 3. IV. Odczynniki, pod∏o˝a i testy stosowane przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii Ralstonia solanacearum 1. Pod∏o˝a do izolacji i hodowli Ralstonia solanacearum 1) Nutrient Agar (NA) — agar od˝ywczy Nutrient Agar (Difco) 23 g Woda destylowana 1 litr przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki i sterylizuje w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C, a nast´pnie rozlewa na p∏ytki; Poz. 775 2) Yeast-Peptone-Glucose-Agar (YPGA) — agar dro˝d˝owo-peptonowo-glukozowy Yeast Extract (Difco) 5g Bacto Peptone (Difco) 5g D(+) glukoza (jednowodna) 10 g Bacto Agar (Difco) 15 g Woda destylowana 1 litr przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki i sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C, a nast´pnie rozlewa si´ na p∏ytki; 3) Sucrose Peptone Agar (SPA) — agar z sacharozà i peptonem Sacharoza 20 g Pepton 5g K2HPO4 0,5 g MgSO4 x 7 H2O 0,25 g Bacto Agar (Difco) 15 g Woda destylowana 1 litr przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki; ustala si´ pH 7,2—7,4, je˝eli jest to konieczne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C, a nast´pnie rozlewa si´ na p∏ytki; 4) Pod∏o˝e Kelmana z chlorkiem tetrazoliowym Casamino acids (Difco) 1g Bacto Peptone (Difco) 10 g Glukoza 5g Bacto Agar (Difco) 15 g Woda destylowana 1 litr przygotowuje si´ pó∏litrowe porcje po˝ywki w jednolitrowych kolbach; rozpuszcza si´ sk∏adniki; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; sch∏adza si´ do temperatury 50 °C; dodaje si´ wodny roztwór triphenylu tetrazolium chloride (Sigma) sterylizowany drogà filtrowania tak, aby uzyskaç ostateczne st´˝enie 50 mg na litr; rozlewa si´ na p∏ytki. 2. Materia∏y do przygotowania próby 1) bufor do maceracji: 50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0 Na2HPO4 4,26 g KH2PO4 2,72 g Woda destylowana 1 litr bufor ten jest stosowany do maceracji tkanek; rozpuszcza si´ sk∏adniki i ustala si´ pH; dzieli si´ na Dziennik Ustaw Nr 83 — 5368 — mniejsze porcje, je˝eli uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut; w przypadku wykonywania testu PCR zaleca si´ dodanie 5 % polyvinylpyrrolidone-40000 MWT (PVP-40) w celu zmniejszenia inhibicji amplifikacji przez czàsteczki zwiàzków aromatycznych obecnych w ekstrakcie; w przypadku przeprowadzenia homogenizowania tkanek ziemniaka zaleca si´ dodanie Êrodka zapobiegajàcego powstawaniu k∏aczkowatoÊci, Êrodka przeciwpieniàcego lub Êrodka antyoksydacyjnego, w iloÊciach niezb´dnych do uzyskania wymaganego st´˝enia; Lubrol w p∏atkach 0,5 g /litr DC Silicone antifoam 1,0 ml/litr tetrasodium pyrophosphate 1,0 g/litr. autoklawuje si´ oddzielnie; dodaje si´ do uzyskania wymaganego st´˝enia; 2) bufor do zawieszania osadu: 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,2 Na2HPO4 x 12 H2O 2,7 g NaH2PO4 x 2 H2O 0,4 g Woda destylowana 1 litr bufor ten jest stosowany do zawieszania tkanki przystolonowej bulwy i osadu; rozpuszcza si´ sk∏adniki i ustala pH; dzieli na mniejsze porcje, je˝eli uzna si´ za stosowne; sterylizuje si´ w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Poz. 775 4. OkreÊlanie poziomu infekcji w teÊcie IF Powierzchnia (S) okienka na szkie∏ku wielopunktowym wzór