NORMĂ VETERINARĂ din 10 iunie 2004

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...

(2)Autoritatea veterinara centrala va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...

(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa ------ la norma veterinara ------------------- 1. DETERMINAREA ROBENIDINEI 1,3-bis [(4-clorobenzidin)amino] hidroclorid - guanidina 1. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea robenidinei din furaje. Limita minima a determinarii este de 5 mg/kg. 2. Principiu Proba este extrasa cu metanol acidifiat. Extractul este uscat şi o parte alicota este supusă purificarii prin trecere printr-o coloana de oxid de aluminiu. Robenidina este eluata din coloana cu ajutorul metanolului, concentrata şi adusa la un volum corespunzător cu faza mobila. Conţinutul în robenidina este determinat prin cromatografie lichida de înaltă performanta în faza inversa -RP (HPLC) ce utilizeaza un detector UV. 3. Reactivi 3.1. Metanol 3.2. Metanol acidifiat Intr-un balon cotat de 500 ml se transfera 4,0 ml acid clorhidric (d = 1,18 g/ml), se completeaza până la semn cu metanol (3.1) şi se amesteca. Aceasta solutie trebuie să fie proaspat preparata, înainte de utilizare. 3.3. Acetonitril, grad HPLC 3.4. Sita moleculara Tip 3A, de la 8 la 12 ochiuri (dimensiuni 1,6 - 2,5 mm, alumino-silicat cristalin, diametrul porilor de 0,3 mm). 3.5. Oxid de aluminiu: activitate gradul I, pentru cromatografie pe coloana 100 g oxid de aluminiu se transfera într-un recipient corespunzător şi se adauga 2,0 ml apa. Se acopera şi se agita aproximativ 20 minute. Se păstrează într-un recipient bine inchis. 3.6. Solutie de fosfat dihidrogenat de potasiu, c = 0,025 mol/l. Se dizolva 3,40 g fosfat dihidrogenat de potasiu în apa (grad HPLC) într-un balon cotat de 1000 ml, se aduce la semn şi se amesteca. 3.7. Solutie de fosfat monohidrogenat de sodiu, c = 0,025 mol/l. Se dizolva 3,55 g difosfat monohidrogenat anhidru (sau 4,45 g dihidrat sau 8,95 g dodecahidrat) în apa (grade HPLC) într-un balon cotat de 1000 ml, se aduce la semn şi se amesteca. 3.8. Faza mobila HPLC Se amesteca urmatorii reactivi: 650 ml acetonitril (3.3), 250 ml apa (grad - HPLC), 50 ml solutie de fosfat dihidrogenat de potasiu (3.6), 50 ml solutie de fosfat monohidrogenat disodic (3.7). Se filtreaza prin filtre de 0,22 [ ] m (4.6) şi se degazeaza solutia, (ex. prin tratament cu ultrasunete timp de 10 minute). 3.9. Substanţa standard (de titrare) Robedinidina pura: 1.3-bis[(4-clorbenzidina)amino] guanidin hidroclorid, E 750. 3.9.1. Solutie standard stoc de robenidina: 300 mg/ml Se cantaresc cu aproximatie de 0,1 mg, 30 mg din substanţa standard (de titrare) de robenidina (3.9). Se dizolva în metanol acidifiat (3.2) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn şi se amesteca. Balonul cotat se inveleste intr-o folie de aluminiu şi se păstrează la loc intunecos. 3.9.2. Solutie standard intermediara de robenidina: 12 mg/ml. Se pun 10,0 ml din solutia standard stoc (3.9.1) într-un balon cotat de 250 ml, se aduce la semn cu faza mobila (3.8) şi se amesteca. Balonul cotat se inveleste intr-o folie de aluminiu şi se păstrează la loc intunecos. 3.9.3. Calibrarea (etalonarea) solutiilor Intr-o serie de baloane cotate de 50 ml se transfera 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 şi 25,0 ml din solutia standard intermediara (3.9.2). Se aduce la semn cu faza mobila (3.8) şi se amesteca. Aceste solutii corespund concentratiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8, şi 6,0 mg/ml de robenidina. Aceste solutii trebuie să fie proaspat preparate, înainte de utilizare. 4. Aparat 4.1. Coloana de sticlă Construita din sticlă bruna prevăzută cu robinet şi un rezervor de aproximativ 150 ml capacitate, diametrul interior de la 10 la 15 mm, lungime 250 mm. 4.2. Agitator manual de laborator 4.3. Evaporator cu film rotativ 4.4. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode în linie cu lungimi de unda cuprinse între 250 şi 400 nm. 4.4.1. Coloana de cromatografie lichida: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 mm sau o coloana echivalenta. 4.5. Filtru cu hartie din fibre de sticlă (Whatman GF/A sau filtre echivalente) 4.6. Filtru cu membrana de 0,22 mm 4.7. Filtru cu membrana de 0,45 mm 5. Metoda de lucru Notă: Robenidina este sensibila la lumina. Sticla bruna trebuie utilizata la toate operaţiunile. 5.1. Generalitati 5.1.1. Trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenta robenidinei şi interferenta substanţelor. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizeaza un furaj martor ce este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de robenidina identica cu cea prezenta în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 60 mg/kg, se adauga 3,0 ml solutie etalon stoc (3.9.1) într-un pahar conic de 250 ml. Solutia se evapora la c. 0,5 ml în curent de azot. Se adauga 15 g din furajul martor, se amesteca şi se asteapta 10 minute înainte de procedura de extractie. (5.2) Notă: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie similar, ca tip, cu cel al probelor de cercetat şi cu privire la analiza, nu trebuie să fie detectata robenidina. 5.2. Extractia Se cantaresc cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 15 g din proba preparata. Se transfera într-un pahar conic de 250 ml şi se adauga 100,0 ml metanol acidifiat (3.2). Se acopera şi se agita timp de o ora la agitator (4.2). Solutia se filtreaza prin hartia de filtru din fibra de sticlă (4.5) şi se colecteaza integral filtratul într-un pahar conic de 150 ml. Se adauga 7,5 g de sita moleculara (3.4), se acopera şi se agita timp de 5 minute. Se filtreaza imediat printr-un filtru din fibre de sticlă. Aceasta solutie se păstrează pentru etapa de purificare (5.3). 5.3. Purificarea 5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu Extremitatea inferioara a coloanei de sticlă se obtureaza cu un mic tampon de vata de sticlă (4.1) şi se taseaza utilizand o bagheta de sticlă. Se cantaresc 11,0 g din oxidul de aluminiu preparat (3.5) şi se transfera în coloana. Trebuie să se aiba grija să se minimizeze expunerea la aer în timpul acestei etape. Se loveste usor extremitatea inferioara a coloanei umplute pentru a se decanta oxidul de aluminiu. 5.3.2. Purificarea probei Cu ajutorul unei pipete, se transfera în coloana 5,0 ml din extractul de proba preparat la (5.2). Se lasă vârful pipetei inchis până la peretele coloanei şi se permite solutiei să fie absorbita pe oxidul de aluminiu. Se elueaza robenidina din coloana utilizand 100 ml metanol (3.1), la un debit de 2 până la 3 ml/minut şi se colecteaza eluantul într-un balon cu fund rotund de 250 ml. Se evapora solutia de metanol până la uscare la 40°C, la presiune redusa, cu ajutorul evaporatorului rotativ (4.3). Se redizolva reziduul în 3 până la 4 ml de faza mobila (3.8) şi se transfera cantitativ într-un balon cotat de 10 ml. Se clateste balonul cu mai multe părţi de 1-2 ml faza mobila şi se transfera aceste lichide de spalare în balonul cotat. Se aduce la semn cu acelasi solvent şi se amesteca. O parte alicota este filtrata prin membrana filtrului de 0,45 mm (4.7). Aceasta solutie se stocheaza pentru determinare HPLC (5.4). 5.4. Determinare HPLC 5.4.1. Parametri Urmatoarele condiţii sunt oferite pentru indrumare, putand fi utilizate cu condiţia să ofere rezultate echivalente: Coloana de cromatografie lichida (4.4.1), faza mobila HPLC (3.8), Debit: 1,5 - 2 ml/minut, Lungime de unda: 317 nm, Volum injectat: 20 - 50 ml Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, se injecteaza solutia de etalonare (3.9.3) ce contine 3,6 mg/ml, de cate ori este nevoie, până se realizează cel mai înalt pic şi timpii de retentie sunt constanti. 5.4.2. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare solutie de etalonare (3.9.3.) de cate ori este nevoie şi se masoara inaltimile picurilor (ariilor) pentru fiecare concentraţie. Se reprezinta grafic o curba de etalonare utilizand mediile picurilor sau ariilor principale ale solutiilor de etalonare ca ordonate şi concentratiile corespunzătoare în mg/ml ca abscise. 5.4.3. Solutia proba Se injecteaza extractul de proba (5.3.2) de cate ori este necesar, utilizand aceleasi volume luate drept solutii de etalonare şi se determina media inaltimilor picurilor (ariilor) de robenidina. 6. Calcularea rezultatelor Din media inaltimilor (ariilor) picurilor de robenidina a probelor se determina concentraţia probelor în mg/ml prin referire la curba de etalonare (5.4.2). Conţinutul probei în robenidina w (mg/

1. ml)este dat de urmatoarea formula: c x 200 w = ------- m în care: c = concentraţia probei în robenidina, în mg/ml, m = masa probei exprimata în g. 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea produsului analizat poate fi confirmata prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode prin care sunt comparate spectrul extractului de proba şi solutia de calibrare (3.9.3) ce contine 6 mg/ml. 7.1.1. Co-cromatografia Un extract de proba este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare din solutia etalon (3.9.3). Cantitatea de robenidina adăugată trebuie să fie similara cantităţii estimate de robenidina gasita în extractul de proba. Numai înălţimea picurilor de robenidina trebuie să creasca după luarea în calcul a ambelor cantitati adaugate şi diluarea extractului. Largimea picului, la jumătate din înălţimea maxima, trebuie să se incadreze în maxim 10% din largimea initiala. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmatoarele criterii: (
2. a)lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei şi a spectrelor standardului, înregistrate la vârful picului, pe cromatograma, trebuie să fie aceeasi, cu o limita de siguranţă determinata prin puterea de rezolutie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica până la aproximativ 2 nm. (
3. b)între 250 şi 400 nm, spectrele standard şi a probei, înregistrate la vârful picului pe cromatograma, trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este indeplinit când sunt prezente aceleasi maxime şi când nu se observa vreo deviatie între cele doua puncte ale spectrului ce depăşeşte 15% din proba de analizat standard. (
4. c)între 250 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente, vârfului şi curbei descendente a picului, produse de extractul de proba nu trebuie să fie diferite unele de celelalte pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbtie relativa. Acest criteriu este indeplinit când sunt prezente aceleasi maxime şi când la toate punctele observate deviatia între spectre nu depăşeşte 15% din absorbtia spectrului vârfului. Dacă unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu este confirmata 7.2. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a 2 determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, nu trebuie să depăşească 10% din cel mai mare rezultat al continutului în robenidina, mai mare de 15 mg/kg. 7.3. Randament Pentru proba martor imbogatita, randamentul trebuie să fie de minim 85%. 8. Rezultatele unui studiu de colaborare A fost realizat, de către comunitate, un studiu de colaborare în 12 laboratoare, în care au fost analizate 4 probe de furaj pentru păsări şi iepuri, sub forma de faina sau pelete. Au fost efectuate analize duble pentru fiecare proba. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor: Rezultate Sr = deviatia standard a repetabilitatii CVr = coeficientul de deviatie a repetabilitatii SR = deviatia standard a reproductibilitatii CVR = coeficient de variatie a reproductibilitatii 2. DETERMINAREA METIL BENZOATULUI 7-benziloxi-6-butil-3-metoxicarbonil-4-quinolona 1. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea metil benzoatului din furaje. Limita minima a determinarii este de 1 mg/kg. 2. Principiu Metil benzoatul este extras din proba cu solutie metanolica de acid metansulfonic. Extractul este purificat cu diclormetan prin cromatografie de schimb ionic şi apoi din nou cu diclormetan. Conţinutul în benzoat de metil este determinat prin cromatografie lichida de înaltă performanta în faza inversa (HPLC) ce utilizeaza un detector UV. 3. Reactivi 3.1. Diclormetan 3.2. Metanol, grade HPLC 3.3. faza mobila HPLC: amestec de metanol (3.2) şi apa (grade HPLC) 75 + 25 (v +
5. v)filtrarea prin filtre de 0,22 mm (4.6) şi degazarea solutiei, (ex. prin tratament cu ultrasunete timp de 10 minute) 3.4. Solutie de acid metansulfonic, s = 2% Se dilueaza 20 ml acid metansulfonic până la 1000 ml cu metanol (3.2). 3.5. Solutie de acid clorhidric, s = 10% Se dilueaza 100 ml acid clorhidric (P 20 c. 1,18 g/
6. ml)cu apa până la 1000 ml. 3.6. Amberlite CG-120 (Na), rasina schimbatoare de cationi, diametrul granulelor de la 100 la 200 mesh (0,074 - 0,038
7. mm)Rasina este retratata inaintea utilizarii: se amesteca 100 g rasina cu 500 ml solutie acid clorhidric (3.5) şi se incalzeste pe o placa fierbinte, agitandu-se continuu. Se lasă la rece pentru a se decanta acidul. Se filtreaza prin hartia de filtru sub vacuum. Se spala rasina de doua ori cu 500 ml părţi apa şi apoi cu 250 ml etanol (3.2). Se spala rasina cu cele 250 ml părţi de metanol (3.2) şi se usuca prin trecerea aerului prin filtru. Rasina uscata se păstrează intr-o sticlă inchisa. 3.7. Substanţa standard: metil benzoat pur (7-benziloxi-6-butil-3- metoxicarbonil-4-quinolona) 3.7.1. Solutie stoc de metil benzoat, 500 mg/ml Se cantaresc cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg din substanţa standard (3.7) se dizolva în solutie de acid metansulfonic (3.4), într-un balon cotat de 100 ml se completeaza până la semn şi se amesteca. 3.7.2. Solutie standard intermediara de metil benzoat, 50 mg/ml Se transfera 5,0 ml solutie stoc de metil benzoat (3.7.1) într-un balon cotat de 50 ml, se aduce la semn cu metanol (3.2) şi se amesteca. 3.7.3. Etalonarea solutiilor Intr-o serie de baloane cotate de 25 ml se transfera 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, şi 5,0, ml de solutie standard (etalon) intermediara de metil benzoat (3.7.2). Se aduce la semn cu faza mobila (3.3) şi se amesteca. Aceste solutii corespund concentratiilor de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 mg/ml metil benzoat. Aceste solutii trebuie să fie proaspat preparate înainte de utilizare. 4. Aparat 4.1. Agitator de laborator 4.2. Evaporator rotativ 4.3. Coloana de sticlă (250 mm x 15
8. mm)prevăzută cu robinet şi rezervor de aproximativ 200 ml capacitate. 4.4. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode 4.4.1. Coloana cromatografica cu lichid: 300 mm x 4 mm, C - 18, 10 mm 4.5. Filtru cu membrana de 0,22 mm 4.6. Filtru cu membrana de 0,45 mm 5. Metoda de lucru 5.1. Generalitati 5.1.1. Un furaj martor trebuie analizat pentru a se verifica absenta metil benzenului sau a altor substante interferente. 5.1.2. Trebuie efectuat un test de randament prin care se analizeaza un furaj martor ce este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de metil benzoat, identica cu cea prezenta în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 15 mg/kg, se adauga 600 ml solutie stoc (3.7.1) la 20 g furaj martor, se amesteca şi se asteapta 10 minute înainte de procedura de extractie (5.2). Notă: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie ca tip, similar cu cel al probei, iar cu privire la analiza, nu trebuie să fie detectat metil benzoat. 5.2. Extractia Se cantareste cu precizie de 0,01 g, aproximativ 20 g din proba preparata şi se transfera într-un pahar conic de 250 ml. Se adauga 100,0 ml solutie de acid metansulfonic (3.4) şi se agita mecanic (4.1) timp de 30 minute. Solutia se filtreaza prin hartia de filtru (4.1) şi se păstrează filtratul pentru etapa de separare lichid-lichid. 5.3. Separarea lichid-lichid Se transfera 25 ml filtrat obţinut, (5.2) intr-o palnie de separare de 500 ml ce contine 100 ml solutie de acid clorhidric. Se adauga 100 ml diclormetan (3.1), în palnie şi se agita un minut. Se lasă să se separe fazele şi se preia stratul inferior (diclormetan) într-un balon cu fund rotund de 500 ml. Se repeta extractia fazei apoase cu celelalte doua portiuni de diclormetan a 40 ml şi se combina acestea cu primul extract din balonul cu fund rotund. Se evapora extractul de diclormetan până la uscare la evaporatorul rotativ (4.2), ce funcţionează la presiune scazuta la 40°C. Reziduul se dizolva în 20 până la 25 ml metanol (3.2), se pune dopul şi se conserva extractul total pentru cromatografie prin schimb ionic (5.4). 5.4. Cromatografie prin schimb ionic 5.4.1. Prepararea coloanei cu schimbatori de cationi Se introduce un mic tampon de vata de sticlă la extremitatea inferioara a coloanei de sticlă. Se prepara o suspensie de 5 g de rasina schimbatoare de cationi (3.6) cu 50 ml acid clorhidric (3.5), se toarna în coloana de sticlă şi se lasă să se stabilizeze. Se indeparteaza excesul de acid lasandu-l să se scurga chiar deasupra suprafetei rasinii şi se spala coloana cu apa până când este neutralizat cu turnesol. Se transfera 50 ml metanol (3.2) în coloana şi permite scurgerea de pe suprafaţa rasinii. 5.4.2. Cromatografie pe coloana Cu ajutorul unei pipete, se transfera cu grija extractul obţinut în (5.3) coloana. Se clateste balonul cu fund rotund cu doua părţi de 5 şi 10 ml metanol (3.2) şi se transfera aceste lichide de spalare în coloana. Se lasă extractul să se scurga pe suprafaţa rasinii, se spala coloana cu 50 ml metanol şi se asigura ca debitul nu este mai mare de 5 ml/min. Se inlatura eluantul. Se elueaza metil benzoatul din coloana utilizand 150 ml solutie de acid metansulfonic (3.4) şi se colecteaza eluantul din coloana într-un pahar conic de 250 ml. 5.5. Separarea lichid-lichid Se transfera eluantul obţinut (5.4.2) intr-o palnie de decantare de 1 litru. Se clateste paharul conic cu 5 până la 10 ml metanol (3.2) şi se combina lichidul de spalare cu conţinutul palniei de separare. Se adauga 300 ml solutie acid clorhidric (3.5) şi 130 ml diclormetan (3.1). Se agita timp de 1 minut şi se lasă să se separe fazele. Se lasă să se scurga faza inferioara (diclormetan) într-un balon cu fundul rotund de 500 ml. Se repeta extractia fazei apoase cu alte doua părţi de 70 ml de diclormetan şi se combina aceste extracte cu primul într-un balon cu fundul rotund. Se evapora extractul de diclormetan până la uscare cu evaporatorul rotativ (4.2) ce funcţionează la presiune redusa şi la temperatura de 40°C. Se dizolva reziduul într-un balon cu aproximativ 5 ml metanol (3.2) şi se transfera întreaga cantitate din aceasta solutie într-un balon cotat de 10 ml. Se clateste balonul cu fund rotund cu doua noi părţi de 1 până la 2 ml metanol şi acestea se transfera într-un balon cotat. Se aduce la semn cu metanol şi se amesteca. O portiune alicota este filtrata printr-un filtru cu membrana (4.6). Aceasta solutie se păstrează pentru analiza HPLC (5.6). 5.6. Determinarea HPLC 5.6.1. Parametri Urmatoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putand fi utilizate cu condiţia să ofere rezultate echivalente: - coloana cromatografica cu lichid (4.4.1). - faza mobila HPLC: amestec apa - metanol (3.3), - debit: de la 1 la 1,5 ml/minut. - lungime de unda de detectie: 265 nm, - Volum injectat de la 20 la 50 ml. Se controlează stabilitatea sistemului cromatografie, injectandu-se solutia de etalonare (3.7.3) ce contine 4 mg/ml, de mai multe ori, până când se realizează inaltimile sau ariile picului şi timpii de retentie fixati. 5.6.2. Curba etalon Se injecteaza fiecare solutie de calibrare (etalonare) (3.7.3) la diferite intervale de timp şi se masoara inaltimile (ariile) picurilor pentru fiecare concentraţie. Se reprezinta grafic o curba de calibrare utilizandu-se media inaltimilor picului sau ariile solutiilor de calibrare (etalonare) ca ordonate şi concentratiile corespondente în mg/ml, ca abscise. 5.6.3. Solutia proba Se injecteaza extractul de proba (5.3.2) de mai multe ori, utilizandu-se acelasi volum folosit pentru solutiile de calibrare (etalonare) şi se determina media inaltimilor picurilor (ariilor) de metil benzoat. 6. Calcularea rezultatelor Se determina concentraţia solutiei din proba în mg/ml pornindu-se de la media inaltimii (ariei) picurilor de metil benzoat a solutiei din proba în raport cu curba de etalonare (5.4.2). Conţinutul în metil benzoat al probei w (mg/
9. ml)este dat de urmatoarea formula: c x 40 w = ------ m în care: c = concentraţia în metil benzoat a probei, în mg/ml, m = masa probei de testat exprimata în g. 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea produsului analizat poate fi confirmata prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode prin care sunt comparate spectrul extractului probei şi solutia de etalonare (3.7.2) ce contine 6 mg/ml. 7.1.1. Co-cromatografia Un extract de proba este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare din solutia de etalonare (3.9.3). Cantitatea de metil benzoat adăugată trebuie să fie similara cu cantitatea estimată de metil benzoat în extractul de proba. Numai înălţimea picului de metil benzoat trebuie să creasca după luarea în calcul a ambelor cantitati adaugate şi diluarea extractului. Largimea picului, la jumătate din înălţimea maxima, trebuie să se incadreze în maxim 10% din largimea initiala. 7.1.2. Detectare prin sistemul de diode Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmatoarele criterii: (
10. a)lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei şi a spectrelor standardului (etalonului), înregistrate pe cromatograma la vârful picului, trebuie să fie aceeasi, cu o zona de siguranţă determinata prin puterea de rezolutie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica până la aproximativ 2 nm. (
11. b)între 220 şi 350 nm, spectrele probei şi a etalonului, înregistrate pe cromatograma la vârful picului, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este indeplinit când sunt prezente aceleasi maxime şi când nu se observa vreo deviatie între cele doua puncte ale spectrului ce depăşeşte 15% din proba de analizat standard. (
12. c)între 220 şi 350 nm, spectrul curbei ascendente, a vârfului şi a curbei descendente a picului produs de extractul de proba, nu trebuie să fie diferita unele de celelalte, pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbtie relativa. Acest criteriu este indeplinit când sunt prezente aceleasi maxime şi când la toate punctele observate deviatia dintre spectre nu depăşeşte 15% din absorbtia spectrului vârfului. Dacă unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu este confirmata. 7.2. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a 2 determinari paralele efectuate pe aceleasi probe nu trebuie să depăşească 10% din cel mai mare rezultat al continutului în metil benzoat, între 4 şi 20 mg/kg. 7.3. Randament Pentru o proba martor imbogatita, randamentul trebuie să fie de minim 90%. 8. Rezultate ale unui studiu de colaborare Cinci probe au fost analizate de către 10 laboratoare. Au fost efectuate analize duble pentru fiecare proba. Rezultate n.d. = nedetectat Sr = deviatia standard a repetabilitatii CVr = coeficientul de deviatie a repetabilitatii SR = deviatia standard a reproductibilitatii CVR = coeficient de variatie a reproductibilitatii ------------