NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...

(2)Autoritatea veterinara centrala va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...

(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa la norma veterinara ------------------- DETERMINAREA SPIRAMICINEI PRIN DIFUZIE IN MEDIU DE AGAR 1. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea spiramicinei din furaje şi premixuri. Limita minima a determinarii este de 1 mg/kg (1 ppm).

(1)-----------

(1)1 mg spiramicina baza este echivalent cu 3200 unităţi internationale (UI). ... 2. Principiu Proba este extrasa cu un amestec de metanol/bicarbonat - fosfat tampon la pH 8. Extractul este decantat sau centrifugat şi diluat. Activitatea antibiotica a acestuia este determinata prin masurarea difuziei spiramicinei într-un mediu de agar insamantat cu Micrococcus luteus. Difuzia este relevata prin formarea zonelor de inhibitie a microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proportional cu logaritmul concentratiei de antibiotic peste gama concentratiilor de antibiotic utilizate. 3. Microorganism: Micrococcus luteus ATTC 9341 (8340, NCIB 8553) 3.1. Întreţinerea culturii stoc Se insamanteaza mediul de cultura în tuburi inclinate (4.1), cu Micrococcus luteus şi se incubeaza timp de 24 ore la 30°C. Cultura se păstrează la frigider la 4°C. Se reinsamanteaza la fiecare doua saptamani. 3.2. Prepararea suspensiei bacteriene(^

1. a)----------- (^
2. a)Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să se fi stabilit ca acestea utilizeaza suspensii bacteriene similare. Se recolteaza o cultura crescuta pe agar inclinat preparat recent (3.1) cu 2-3 ml solutie clorura de sodiu (4.3). Aceasta suspensie se utilizeaza la insamantarea a 250 ml mediu de cultura (4.1) continut într-un flacon tip Roux şi se incubeaza timp de 18-20 ore la 30°C. Cultura se recolteaza în 25 ml solutie clorura de sodiu (4.3) şi se amesteca. Se dilueaza suspensia la dilutia de 1/10 cu clorura de sodiu (4.3). Transmisia luminoasa a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, masurata la o lungime de unda de 650 nm într-un cm de celule faţă de solutia de clorura de sodiu (4.3). Aceasta suspensie poate fi mentinuta timp de o săptămâna la aproximativ 4°C. 4. Mediu de cultura şi reactivi 4.1. Mediu de cultura (^
3. b)4.2. Mediul probei (^
4. b)---------- (^
5. b)Poate fi utilizat orice mediu comercial de cultura de compozitie similara ce ofera aceleasi rezultate. 4.3. Solutie de clorura de sodiu 0,8% (w/
6. v)Se dizolva 8 g clorura de sodiu în apa şi se dilueaza până la 1000 ml, se sterilizeaza. 4.4. Tampon fosfat - bicarbonat, pH 8,0 4.5. Amestec de metanol şi tampon fosfat - bicarbonat (4.4) (50/50 V/V). 4.6. Substanţa standard Spiramicina de activitate cunoscuta (în UI). 5. Solutii etalon Se dizolva o cantitate precis cantarita din substanţa de determinat şi de standard (4.6) în amestec (4.5) şi se dilueaza cu acelasi amestec pentru a se obtine solutia stoc ce contine 1000 UI spiramicina/ml. Se păstrează în flacoane închise la 4°C aceasta solutie este stabila timp de maxim cinci zile. Din aceasta solutie stoc se prepara prin dilutii succesive cu ajutorul amestecului, (4.5) urmatoarele solutii: 6. Prepararea solutiilor de extract şi de proba 6.1. Extractie Se cantareste o cantitate de proba de 20,0 g în cazul furajelor, de 1,0 până la 20,0 g pentru premixuri. Se adauga 100 ml de amestec (4.5) şi se agita timp de 30 minute. Se centrifugheaza sau se decanteaza şi se dilueaza solutia de supernatant cu amestecul (4.5) pentru a se obtine o concentraţie evaluata de spiramicina de 1 UI/ml [= U

(8)]. Pentru niveluri evaluate de spiramicina din furaje, inferioare valorii de 2,5 mg/kg, extractia trebuie să fie efectuata după cum urmeaza. Se cantareste o cantitate de proba de 20,0 g. Se adauga 100 ml de amestec (4.5) şi se agita timp de 30 minute. Se centrifugheaza timp de cateva minute, se preleveaza un volum de 50 ml din solutia de supernatant şi se evapora până timp de aproximativ 4 minute, la presiune redusa, în evaporatorul rotativ, la temperatura ce nu depăşeşte 40°C. Se dilueaza reziduul cu ajutorul amestecului (4.5), până se obtine o concentraţie dorita de spiramicina de 1 UI/ml [= U(8]). 6.2. Solutii proba Pentru solutia U

(8)se prepara solutiile U

(4)(continut evaluat: 0,5 UI/ml), U

(2)(continut evaluat: 0,25 UI/ml) şi U

(1)(continut evaluat: 0,125 UI/ml) prin dilutii succesive (1 + 1) cu ajutorul amestecului (4.5).

1. Procedura de testare 7.
2. Insamantarea mediului de testare Se insamanteaza mediul de testare (4.2) cu suspensie bacteriana (3.2) la aproximativ 50°C. Prin experimente preliminare pe placi cu mediu de testare (4.2). se determina cantitatea de suspensie bacteriana necesară pentru a se determina cele mai intinse şi mai clare zone de inhibitie cu diferite concentratii în spiramicina. 7.
3. Prepararea placilor de însămânţare Difuzia pe agar este efectuata în placi utilizandu-se patru concentratii din solutia etalon [S

(8), S

(4), S

(2), S

(1)] şi patru concentratii din solutia probei [U

(8), U

(4), U

(2), U

(1)]. Aceste patru concentratii ale extractului şi etalonului trebuie, în mod necesar să fie plasate în fiecare placa. În acest scop, se aleg placi destul de mari pentru a permite să fie realizate în mediu de agar cel puţin opt godeuri cu un diametru de 10 până la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe placi formate dintr-o placa de sticlă cu o faţa din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înălţime. Se toarna în placi o cantitate din mediul (4.2), insamantat cum este indicat la punctul 7.1., pentru a se obtine un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placa de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri şi se pun în acestea volume de proba exact masurate şi solutii standard (între 0,10 şi 0,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizeaza fiecare concentraţie de cel puţin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluari a 32 zone de inhibitie. 7.3. Incubaţie Se incubeaza placile timp de 16 până la 18 ore, la 30 ± 2°C. 8. Evaluare Se masoara diametrul zonelor de inhibitie cu o aproximatie de 0,1 mm. Se înregistrează valorile medii pentru fiecare concentraţie pe hartie grafica semi-logaritmic ce indica logaritmul concentratiilor în raport cu diametrul zonelor de inhibitie. Se traseaza liniile cele mai potrivite atât pentru solutia etalon cat şi pentru extract, ca în exemplul de mai jos. Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel (SL) utilizand formula: 7S

(1)+ 4S

(2)+ S

(4)- 2S

(8)a) SL = ---------------------------- 10 Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizand formula: 7S

(8)+ 4S

(4)+ S

(2)- 2S

(1)b) SH = ----------------------------- 10 Se calculeaza în mod similar punctele "cele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea u

(1), u

(4)şi u

(8)cu s

(1), s

(2)şi s

(8)din formula mentionata mai sus

(1). ----------

(1)1 mg spiramicina baza este echivalent cu 3200 unităţi internationale (UI). ... Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH, pe aceeasi hartie grafica şi se unesc pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru solutia etalon. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru extract. În absenta oricarei interferente liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu difera mai mult de 10%, ca valoare medie a acestora. Dacă liniile nu sunt paralele fie u

(1)şi s

(1)fie u

(8)şi s

(8)pot fi eliminate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizand formula alternativa, pentru a da liniile alternative "cele mai potrivite". 5S

(1)+ 2S

(2)- 2S

(4)5S

(2)+ 2S

(4)- S

(8)(a') SL = --------------------- sau -------------------- 6 6 5S

(4)+ 2S

(2)- S

(1)5S

(8)+ 2S

(4)- S

(2)(b') SH = ------------------- sau --------------------- 6 6 şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie respectate aceleasi criterii de paralelism. Faptul ca rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final. Literele mici s şi v se referă la diametrele zonelor de inhibitie. Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculeaza logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din urmatoarele formule, depinzand de faptul dacă au fost utilizate trei sau patru nivele pentru evaluarea paralelismului. Pentru patru nivele [U

(1)+ U

(2)+ U

(4)+ U

(8)- S

(1)- S

(2)- S

(4)- S

(8)] x 0,602 (c) Log A = -------------------------------------------------------------- U

(4)+ U

(8)+ S

(4)+ S

(8)- U

(1)- U

(2)- S

(1)- S

(2)Pentru trei nivele [U

(1)+ U

(2)+ U

(4)- S

(1)- S

(2)- S

(4)] x 0,401 (d) Log A = -------------------------------------------------- U

(4)+ S

(4)- U

(1)- S

(1)sau [U

(2)+ U

(4)+ U

(8)- S

(2)- S

(4)- S

(8)] x 0,401 (d') Log A = ------------------------------------------------- U

(8)+ S

(8)- U

(2)- S

(2)Activitatea extractului probei - activitatea standardului corespondent x A [U

(8)= S

(8)x A) Dacă activitatea relativa este în afara gamei de valori cuprinse între 0,5 şi 2,0, atunci se repeta proba facand ajustari corespunzatore ale concentratiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale solutiilor etalon. Atunci când activitatea relativa nu poate fi adusa în gama de valori solicitata, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final. Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repeta determinarea. Dacă paralelismul nu este totusi realizat, înseamnă că nu a fost obtinuta o determinare satisfăcătoare. Se exprima rezultatul în miligrame de spiramicina baza pe kilogram de furaj. 9. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele celor două determinari paralele efectuate pe aceeasi proba prin aceeasi analiza nu trebuie să depăşească - 2 mg/kg, în valoare absoluta, pentru niveluri în spiramicina baza până la 10 g/kg, - 20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 10 până la 25 mg/kg, - 5 mg/kg, în valoare absoluta, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg, - 10% raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg. -----------