NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...

(2)Autoritatea veterinara centrala va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...

(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa ----- la norma veterinara --------------------

1. Determinarea avoparcinei prin difuzie în mediu de agar
2. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea avoparcinei din furaje şi premixuri. Limita minima a determinarii este de 2 mg/kg (2 ppm). Prezenta antibioticelor polieter poate interfera în determinare.
3. Principiu Proba este extrasa cu un amestec de acetona/apa/acid clorhidric. Activitatea antibiotica a extractului este determinata prin masurarea difuziei avoparcinei într-un mediu de agar insamantat cu Bacillus subtilis. Difuzia este relevata prin formarea zonelor de inhibitie a microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proportional cu logaritmul concentratiei de antibiotic, peste gama concentratiilor de antibiotic utilizate.
4. Microorganism: Bacillus subtilis atcc 6633 (ncib 8054) 3.
5. Întreţinerea culturii stoc Se insamanteaza mediul de cultura în tuburi inclinate (4.1) cu Bacillus subtilis şi se incubeaza peste noapte la 30°C. Cultura se păstrează la frigider la 4°C. Se reinsamanteaza lunar. 3.
6. Prepararea suspensiei de spori

(1)Se recolteaza o cultura crescuta pe agar inclinat preparat recent, (3.1) cu 2-3 ml solutie apa sterila (4.3). Aceasta suspensie se utilizeaza la insamantarea a 300 ml mediu de cultura (4.1) continut într-un flacon tip Roux şi se incubeaza timp de 3-5 zile la 30°C. Cultura se recolteaza în 15 ml solutie etanol (4.2) după care se controlează sporularea la microscop şi se omogenizeaza. Aceasta suspensie poate fi mentinuta timp de minim 5 luni, la aproximativ 4°C. 4. Mediu de cultura şi reactivi 4.1. Mediu de cultura

(2)Peptona: 6,0 g Triptona: 4,0 g Extract de drojdie de bere: 3,0 g Extract de carne: 1,5 g Glucoza: 1,0 g Agar: 15,0 g Apa: 1000 ml pH: 6,5 (după sterilizare). 4.

1. Etanol 20% (v/v): se dilueaza 200 ml etanol cu 800 ml apa. 4.
2. Acid clorhidric, d: 1,18-1,
3. 4.
4. Hidroxid de sodiu, solutie 2 M 4.
5. Tampon fosfat, 0,1 M: Fosfat dihidrogenat de potasiu, KH

(2)PO

(4): 13,6 g, Apa până la 1000 ml. Se aduce pH-ul la 4,

1. 4.
2. Amestec de acetona/apa/acid clorhidric (4.3): 65/32,5/2,5 (v/v/v). 4.
3. Substanţa standard: avoparcina de activitate cunoscuta.
4. Solutii etalon Se dizolva o cantitate precis cantarita de 10 mg din substanţa standard (4.7) în tampon fosfat (4.5) şi se dilueaza cu acest tampon pentru a se obtine solutia stoc ce contine 100 æg avoparicina/ml. Se păstrează în flacoane închise la 4°C, aceasta solutie este stabila timp de maxim sapte zile. 5.
5. Pentru premixuri Din aceasta solutie stoc se prepara prin dilutie succesiva cu ajutorul tamponului, (4.5) urmatoarele solutii: S

(8)4,0 æg/ml S

(4)2,0 æg/ml S

(2)1,0 æg/ml S

(1)0,5 æg/ml 5.2. Pentru furaje Din solutia stoc se prepara prin dilutie succesiva cu ajutorul tamponului, (4.5) urmatoarele solutii S

(8)2,0 æg/ml S

(4)1,0 æg/ml S

(2)0,5 æg/ml S

(1)0,25 æg/ml

1. Prepararea solutiilor de extract şi de proba 6.
2. Premixuri Se cantareste cu o precizie de 10 mg, o cantitate suficienta de proba ce contine 10,0 până la 100 mg avoparcina. Se transfera într-un balon cotat de 100 ml cu 60 ml amestec (4.6) şi se agita timp de 15 minute pe agitatorul mecanic. Se controlează pH-ul şi se aduce la pH 2 cu acid clorhidric, dacă este necesar (4.3). Se aduce la volum cu amestecul (4.6) şi se omogenizeaza. O parte se filtreaza printr-o hartie de filtru potrivita (ex. Whatman nr. 1), se elimina primii 5 ml de filtrat. Se ia o parte alicota şi se aduce pH-ul la 5,4 cu solutie de hidroxid de sodiu (4.4). Se dilueaza aceasta solutie cu tampon (4.5) pentru a se obtine o concentraţie dorita de avoparicina de 4,0 æg/ml [= U

(8)] Pentru aceasta solutie se prepara solutiile U

(4)(continut evaluat: 2,0 æg/ml), U

(2)(continut evaluat: 1,0 æg/ml) şi U

(1)(continut evaluat: 0,5 æg/ml) prin dilutie succesiva (1 + 1) cu tampon (4.5). 6.2. Furaje Se cantareste o cantitate de proba de 50 g şi se agita 100 ml din amestec (4.6) timp de 30 minute pe agitatorul mecanic. Se clarifica extractul prin centrifugare (utilizand tuburi de centrifuga acoperite cu dopuri), se ia o parte alicota de extract clarificat (vezi tabelul de mai jos) şi se aduce pH-ul la 4,5 cu solutie de hidroxid de sodiu (4.4). Se dilueaza aceasta parte alicota cu tampon (4.5) pentru a se obtine U

(8)(vezi tabelul de mai jos). Pentru aceasta solutie se prepara solutiile U

(4)(continut evaluat: 1 æg/ml), U

(2)(continut evaluat: 0,5 æg/ml) şi U

(1)(continut evaluat: 0,25 æg/ml) prin dilutie succesiva (1 + 1) cu tampon (4.5).

1. Procedura de testare 7.
2. Insamantarea mediului de testare Se insamanteaza mediul de testare (4.1) cu suspensie de spori (3.2) la 50-60°C. Prin experimente preliminare pe placi cu mediu de testare (4.1) se determina cantitatea de suspensie de spori necesară pentru a se determina cele mai intinse şi mai clare zone de inhibitie cu diferite concentratii de avoparcina. 7.
3. Prepararea placilor de însămânţare Difuzia pe agar este efectuata în placi utilizandu-se patru concentratii din solutia etalon [S

(8), S

(4), S

(2), S

(1)] şi patru concentratii din solutia probei [U

(8), U

(4), U

(2), U

(1)]. Aceste patru concentratii ale extractului şi ale etalonului trebuie, în mod necesar, să fie plasate în fiecare placa. În acest scop, se aleg placi destul de mari pentru a se permite să fie realizate în mediu de agar cel puţin opt godeuri cu un diametru de 10 până la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe placi formate dintr-o placa de sticlă cu o faţa din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înălţime. Se toarna în placi o cantitate din mediul (4.1) insamantat cum este indicat la punctul 7.1., pentru a se obtine un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placa de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri şi se pun în acestea volume de proba exact masurate şi solutii standard (între 0,10 şi 0,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizeaza fiecare concentraţie de cel puţin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluari a 32 zone de inhibitie. 7.3. Incubaţie Se incubeaza placile timp de 16-18 ore, la 30°C. 8. Evaluare 7S

(1)+ 4S

(2)+ S

(4)- 2S

(8)a) SL = ----------------------------- 10 Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizand formula: Se calculeaza în mod similar punctele "cele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea U

(1), U

(4)şi U

(8)cu S

(1), S

(2)şi S

(8)din formula mentionata mai sus. Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH, pe aceeasi hartie grafica şi se unesc pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru solutia etalon. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru extract. În absenta oricarei interferente liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu difera mai mult de 10% ca valoare medie a acestora. Dacă liniile nu sunt paralele fie U

(1)şi S

(1)fie U

(8)şi S

(8)pot fi eliminate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizand formula alternativa, pentru a da liniile alternative "cele mai potrivite". 5S

(1)+ 2S

(2)- 2S

(4)5S

(2)+ 2S

(4)- S

(8)(a') SL = --------------------- sau --------------------- 6 6 5S

(4)+ 2S

(2)- S

(1)5S

(8)+ 2S

(4)- S

(2)(b') SH = -------------------- sau -------------------- 6 6 şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie respectate aceleasi criterii de paralelism. Faptul ca rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final. Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculeaza logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din urmatoarele formule: Pentru patru nivele [U

(1)+ U

(2)+ U

(4)+ U

(8)- S

(1)- S

(2)- S

(4)- S

(8)] x 0,602 (c) Log A = -------------------------------------------------------------- U

(4)+ U

(8)+ S

(4)+ S

(8)- U

(1)- U

(2)- S

(1)- S

(2)Pentru patru nivele*) [U

(1)+ U

(2)+ U

(4)- S

(1)- S

(2)- S

(4)] x 0,401 (d) Log A = -------------------------------------------------- U

(4)+ S

(4)- U

(1)- S

(1)sau [U

(2)+ U

(4)+ U

(8)- S

(2)- S

(4)- S

(8)] x 0,401 (d') Log A = --------------------------------------------------- U

(8)+ S

(8)- U

(2)- S

(2)--------- Notă ... *) Notă: Consideram ca trebuie scris "Pentru trei nivele". Activitate reala - activitate presupusa x activitate relativa Dacă activitatea relativa este în afara gamei de valori cuprinse între 0,5 şi 2,0, atunci se repeta proba facand ajustari corespunzatore ale concentratiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale solutiilor etalon. Atunci când activitatea relativa nu poate fi adusa în gama de valori solicitata, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final. Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repeta determinarea. Dacă paralelismul nu este totusi realizat, înseamnă că nu a fost obtinuta o determinare satisfăcătoare.

1. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele celor două determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba prin aceeasi analiza, nu trebuie să depăşească - 2 mg/kg, în valoare absoluta, pentru niveluri de avoparcina până la 10 mg/kg, - 20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 10 până la 25 mg/kg, - 5 mg/kg, în valoare absoluta, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg, - 10% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg.
2. Determinarea monenzinului de sodiu prin difuzie în mediu de agar
3. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea monenzinului de sodiu din furaje şi premixuri. Limita minima a determinarii este de 10 mg/kg (10 ppm).

(3)--------

(3)1 mg monenzin de sodiu este echivalent cu 1000 unităţi UK. ...

1. Principiu Proba este extrasa cu 90% metanol. Extractul este supus procedurilor corespunzătoare conform cu conţinutul probei în monenzin de sodiu. Activitatea antibiotica a acestuia este determinata prin masurarea difuziei monenzinului de sodiu într-un mediu de agar insamantat cu Bacillus subtilis. Difuzia este relevata prin formarea zonelor de inhibitie a microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proportional cu logaritmul concentratiei de antibiotic peste gama concentratiilor de antibiotic utilizate. Sensibilitatea acestui sistem de testare este redusa în prezenta sodiului.
2. Microorganism: Bacillus subtilis atcc 6633 (ncib 8054) 3.
3. Întreţinerea culturii stoc Se insamanteaza mediul de cultura în tuburi inclinate (4.1), cu Bacillus subtilis şi se incubeaza peste noapte la 30°C. Cultura se păstrează la frigider la 4°C. Se reinsamanteaza lunar. 3.
4. Prepararea suspensiei de spori

(1)----------

(1)Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să se fi stabilit ca acestea utilizeaza suspensii de spori similare. ... Se recolteaza o cultura crescuta pe agar inclinat preparat recent, (3.1) cu 2-3 ml apa sterila. Aceasta suspensie se utilizeaza la insamantarea a 300 ml mediu de cultura (4.1) continut într-un flacon tip Roux şi se incubeaza timp de 3 - 5 zile la 30°C. Cultura se recolteaza în 15 ml etanol 20% (4.3), după ce se controlează sporularea la microscop şi se omogenizeaza. Aceasta suspensie poate fi mentinuta timp de cel puţin 5 luni, la aproximativ la 4°C. 4. Mediu de cultura şi reactivi 4.1. Mediu de cultura

(2)Triptona 10,0 g Extract de drojdie de bere 3,0 g Extract de carne 1,5 g Glucoza 1,0 g Agar (conform cu calitatea) 10,0 - 20,0 g Apa 1000 ml pH 6,5 (după sterilizare). --------

(2)Poate fi utilizat orice mediu comercial de cultura de compozitie similara ce ofera aceleasi rezultate. ... 4.2. Mediul probei Glucoza 10,0 g Extract de drojdie de bere 2,5 g Fosfat hidrogenat de potasiu, K

(2)HPO

(4)0,69 g Fosfat dihidrogenat de potasiu, KH

(2)PO

(4)0,45 g Agar (conform cu calitatea) 10,0 - 20,0 g Apa 1000 ml pH 6 (după sterilizare). 4.

1. Etanol 20% (v/v): se dilueaza 200 ml etanol cu 800 ml apa 4.
2. Metanol anhidru 4.
3. Metanol 90% (v/v): se dilueaza 900 ml metanol (4.4) cu 100 ml apa 4.
4. Metanol 50% (v/v): se dilueaza 500 ml metanol (4.4) cu 500 ml apa 4.
5. Oxid de aluminiu granulat (Alcoa F, 20 mesh Alumina activata UG 1) 4.
6. Substanţa standard Monenzin de sodiu de activitate cunoscuta
7. Aparatura 5.
8. Evaporator rotativ în vid, cu balon cu fund rotund de 250 ml. 5.
9. Coloana de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 25 mm, lungime: aproximativ 400 mm cu deschidere efilata de 2 mm diametru la o extremitate. 5.
10. Coloana de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 11 mm, lungime: aproximativ 300 mm deschidere efilata de 2 mm diametru la o extremitate.
11. Solutii etalon Se dizolva o cantitate precis cantarita din substanţa standard (4.8) în metanol (4.4) şi se dilueaza pentru a se obtine solutia stoc ce contine 800 æg/ml monenzin de sodiu. Se păstrează în flacoane închise la 4°C. Aceasta solutie este stabila timp de maxim doua saptamani. Din aceasta solutie stoc se prepara, prin dilutie succesiva cu 50% metanol, (4.6) urmatoarele solutii: S

(8)- 8,0 æg/ml S

(4)- 4,0 æg/ml S

(2)- 2,0 æg/ml S

(1)- 1,0 æg/ml

1. Prepararea extractului 7.
2. Extractie 7.1.
3. Premixuri Se cantareste o cantitate de proba de 2 g, se adauga 100 ml metanol 90% (4.5), se omogenizeaza şi se centrifugheaza timp de cateva minute. Se dilueaza solutia de supernatant cu metanol 50% (4.6) pentru a se obtine un continut dorit de monenzin de sodiu de 8 æg/ml [= U

(8)]. 7.1.2. Furaje cu un nivel de monenzin de sodiu maxim de 50 pmm Se cantareste o cantitate de proba de 10-20 g, se adauga 100 ml metanol 90% (4.5), se omogenizeaza timp de 15 minute şi se lasă să se limpezeasca. Se introduce un tampon de vata în deschiderea efilata a tubului de sticlă (5.2) şi se adauga oxid de aluminiu (4.7) şi se scutura usor tubul până când coloana ajunge de la 75 la 80 mm înălţime. Se decanteaza extractul pe coloana de oxid de aluminiu şi se colecteaza filtratul, se dilueaza 30 ml până la 50 ml filtrat cu apa. Se fac urmatoarele dilutii cu metanol 50% (4.6) până se obtine un continut dorit de monenzin de sodiu de 8 æg/ml [= U

(8)]. 7.1.3. Furaje cu un nivel de monenzin de sodiu mai mic de 50 pmm (până la limita de 10 ppm) Se cantareste o cantitate de proba de 10-20 g, se adauga 100 ml metanol 90% (4.5) şi se omogenizeaza timp de 15 minute. Se centrifugheaza până devine limpede. Se preleveaza 40 ml lichid supernatant pentru o proba ce contine 20 ppm monenzin de sodiu. Se preleveaza 80 ml pentru o proba ce contine 10 ppm şi se evapora până la uscare sub vid la un evaporator rotativ (5.1) la maxim 40°C, se dizolva reziduul în 10 ml metanol 90% (4.5). Se introduce un tampon de vata în deschiderea efilata a tubului de sticlă (5.3) şi se adauga oxid de aluminiu (4.7) şi scutura usor tubul până când coloana ajunge de la 75 la 80 mm înălţime. Se decanteaza solutia metanoica de reziduu de pe coloana de oxid de aluminiu şi se colecteaza filtratul. Se spala coloana cu 10 ml metanol 90% (4.5) şi se combina lichidele de spalare cu filtratul. Se evapora solutia până la uscare sub vid la un evaporator rotativ (5.1), la maxim 40°C. Se dizolva reziduul în 10 ml metanol anhidru (4.4) şi se aduce la semn cu 20 ml apa. Se centrifugheaza solutia la minim 4000 r/min, timp de cel puţin cinci minute. Se fac urmatoarele dilutii cu metanol 50% (4.6) până se obtine un continut dorit de monenzin de sodiu de 8 æg/ml [= U

(8)]. 7.2. Solutii proba Pentru solutia U

(8)se prepara solutiile U

(4)(continut evaluat: 4 æg/ml), U

(2)(continut evaluat: 2 æg/ml) şi U

(1)(continut evaluat: 1 æg/ml) prin dilutii succesive (1 + 1) cu metanol 50% (4.6).

1. Procedura de testare 8.
2. Insamantarea mediului de testare Se insamanteaza mediul de testare (4.2) cu suspensie de spori (3.2) la 50-60°C. Prin experimente preliminare pe placi cu mediu de testare (4.2), se determina cantitatea de suspensie de spori necesară pentru a determina cele mai intinse şi mai clare zone de inhibitie cu diferite concentratii în monenzin de sodiu. 8.
3. Prepararea placilor de însămânţare Difuzia pe agar este efectuata în placi, utilizandu-se patru concentratii din solutia etalon [S

(8), S

(4), S

(2), S

(1)] şi patru concentratii din solutia probei [U

(8), U

(4), U

(2), U

(1)]. Aceste patru concentratii ale extractului şi etalonului trebuie, în mod necesar, să fie plasate în fiecare placa. În acest scop, se aleg placi destul de mari pentru a permite să fie realizate în mediu de agar cel puţin opt godeuri cu un diametru de 10 până la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm între centre. Testul poate fi efectuat pe placi formate dintr-o placa de sticlă cu o faţa din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înălţime. Se toarna în placi o cantitate din mediul (4.2), insamantat cum este indicat la punctul 8.1., pentru a se obtine un strat de aproximativ 2 mm grosime (60 ml pentru o placa de 200 mm diametru). Se lasă să se solidifice, se realizează godeuri şi se pun în acestea volume de proba exact masurate şi solutii standard (între 0,10 şi 0,15 ml/godeu, conform diametrului). Se utilizeaza fiecare concentraţie de cel puţin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluari a 32 zone de inhibitie. 8.3. Incubaţie Se incubeaza placile timp de aproximativ 18 ore, la 35-37°C. 9. Evaluare Se masoara diametrul zonelor de inhibitie cu o aproximatie de 0,1 mm. Se înregistrează valorile medii pentru fiecare concentraţie pe hartie grafica semi-logaritmic ce indica logaritmul concentratiilor în raport cu diametrul zonelor de inhibitie. Se traseaza liniile cele mai potrivite atât pentru solutia etalon cat şi pentru extract ca în exemplul de mai jos. Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel (SL) utilizand formula: 7S

(1)+ 4S

(2)+ S

(4)- 2S

(8)a) SL = ----------------------------- 10 Se determina punctul "cel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizand formula: 7S

(8)+ 4S

(4)+ S

(2)- 2S

(1)b) SH = ---------------------------- 10 Se calculeaza în mod similar punctele "cele mai potrivite" pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH) prin substituirea U

(1), U

(2)şi U

(4)cu S

(1), S

(2)şi S

(4)şi S

(8)din formula mentionata mai sus. Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH, pe aceeasi hartie grafica şi se unesc pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru solutia etalon. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia "cea mai potrivita" pentru extract. În absenta oricarei interferente liniile trebuie să fie paralele. Pentru scopuri practice liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu difera mai mult de 10% ca valoare medie a acestora. Dacă liniile nu sunt paralele fie U

(1)şi S

(1)fie U

(8)şi S

(8)pot fi eliminate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizand formula alternativa, pentru a da liniile alternative "cele mai potrivite". 5S

(1)+ 2S

(2)- 2S

(4)5S

(2)+ 2S

(4)- S

(8)(a') SL = ---------------------- sau -------------------- 6 6 5S

(4)+ 2S

(2)- S

(1)5S

(8)+ 2S

(4)- S

(2)(b') SH = --------------------- sau --------------------- 6 6 şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie respectate aceleasi criterii de paralelism. Faptul ca rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final. Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculeaza logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din urmatoarele formule: Pentru patru nivele [U

(1)+ U

(2)+ U

(4)+ U

(8)- S

(1)- S

(2)- S

(4)- S

(8)] x 0,602 (c) Log A = -------------------------------------------------------------- U

(4)+ U

(8)+ S

(4)+ S

(8)- U

(1)- U

(2)- S

(1)- S

(2)Pentru trei nivele [U

(1)+ U

(2)+ U

(4)- S

(1)- S

(2)- S

(4)] x 0,401 (d) Log A = -------------------------------------------------- U

(4)+ S

(4)- U

(1)- S

(1)sau [U

(2)+ U

(4)+ U

(8)- S

(2)- S

(4)- S

(8)] x 0,401 (d') Log A = --------------------------------------------------- U

(8)+ S

(8)- U

(2)- S

(2)Activitatea reala - activitatea presupusa x activitatea reala Dacă activitatea relativa este în afara gamei de valori cuprinse între 0,5 şi 2,0, atunci se repeta proba facand ajustari corespunzatore ale concentratiilor extractului sau dacă aceasta nu este posibil, ale solutiilor etalon. Atunci când activitatea relativa nu poate fi adusa în gama de valori solicitata, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final. Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repeta determinarea. Dacă paralelismul nu este totusi realizat, înseamnă că nu a fost obtinuta o determinare satisfăcătoare. 10. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele celor două determinari paralele efectuate pe aceleasi proba prin aceeasi analiza nu trebuie să depăşească - 20% în raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 10 până la 25 mg/kg, - 5 mg/kg, în valoare absoluta, pentru niveluri de la 25 până la 50 mg/kg, - 10% raport cu valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg. -------------