NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004

(1), trebuie să fie efectuate în conformitate cu metodele descrise în Anexa la prezenta norma veterinara. Articolul 2

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...

(2)Autoritatea veterinara centrala a României va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...

(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa ------ la norma veterinara -------------------- DETERMINAREA AFLATOXINEI B

(1)A. Metoda cromatografica monodimensionala în strat subtire 1. Domeniu şi scop Metoda face posibil să se determine nivelul aflatoxinei B

(1)din urmatoarele furaje: turte de arahide, copra, samanta de în, soia, susan, palmier de babassu şi germeni de porumb, cereale şi produse din cereale, faina de mazare, pulpa de cartof şi amidon. Limita inferioara a determinarii este 0,01 mg/kg (10 ppb). Dacă prezenta substanţelor de interferare împiedica determinarea aflatoxinei B

(1), este necesar să se refaca analiza utilizand metoda B (cromatografia bidimensionala în strat subtire). 2. Principiu Proba este supusă extractiei cu cloroform. Extractul este filtrat şi o portiune de alicota este preluata şi purificata pe coloana cromatografica pe silicagel. Eluatul este evaporat şi reziduul redizolvat într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen şi acetonitril. O portiune de alicota din aceasta solutie este supusă cromatografiei în strat subtire (CSS). Cantitatea de aflatoxina B

(1)este determinata, sub iradierea cu UV a cromatogramei, fie vizual fie prin fluorodensitometrie, prin comparare cu cantitati cunoscute de aflatoxina standard B

(1). Identitatea aflatoxinei B

(1)extrasa din furaj trebuie să fie confirmata prin procedura indicată. 3. Reactivi NB: Toţi reactivii trebuie să fie de calitatea "reactivului analitic" numai dacă nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetona 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,5 până la 1,0% de 96% etanol (v/v). 3.3. N-hexane. 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxid 3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2 (v/v). 3.7. Amestec de cloroform (3.2.) şi metanol (3.4.): 97/3 (v/

1. v)3.8. Silicagel, pentru coloana cromatografica, măsura particulei 0,05 până la 0,20 mm. 3.9. Vata de bumbac absorbanta, degresata anterior cu cloroform, sau vata de sticlă 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. nitrogen 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. acid sulfuric 50% (v/
2. v)3.14. Diatomit (hyflosupercel), spalat în acid 3.15. Silicagel G-HR sau echivalent, pentru CSS 3.16. Solutie standard cu aproximativ 0,1 æg de aflatoxina B

(1)per ml în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.), preparat şi verificat asa cum s-a indicat la Secţiunea

1. 3.
2. Solutie standard pentru scopuri de testare calitativa ce contine aproximativ 0,1 æg de aflatoxina B

(1)şi B

(2)per ml în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.). Aceste concentratii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie să fie ajustate astfel încât să se obtina aceeasi intensitate de fluorescenta pentru ambele aflatoxine. 3.

1. Solventi de developare: 3.18.
2. Cloroform (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), solutie mama nesaturata; 3.18.
3. Eter etilic (3.5.)/melanol (3.4.)/apa: 96/3/1 (v/v/v, solutie mama nesaturata); 3.18.
4. Eter etilic (3.5.)/metanol (3.4.)/apa: 94/4.5/1.5 (v/v/v), solutie mama nesaturata; 3.18.
5. Cloroform (3.2.)/metanol (3.4.): 94/6 (v/v), solutie mama saturata; 3.18.
6. Cloroform (3.2.)/metanol (3.4.): 97/3 (v/v), solutie mama saturata;
7. Aparatura. 4.
8. Rasnita-mixer 4.
9. Se scutura aparatul sau se agita magnetic 4.
10. Hartie de filtru canelata, Schleicher şi Schull nr. 588 sau echivalent, diametru: 24 cm 4.
11. Tub de sticlă pentru cromatografie (diametru intern: 22 mm, lungime: 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml. 4.
12. Evaporator rotativ în vacuum, cu un balon cu fund rotund de 500 ml 4.
13. balon conic de 500 ml, cu buson de sticlă rodat. 4.
14. Aparatura pentru CSS 4.
15. Placi de sticlă pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate după cum urmeaza (cantitatile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci placi). Se pun 30 g de silicagel G-HR (3.15.) într-un balon conic. Se adauga 60 ml apa, se astupa şi se agita timp de un minut. Se imprastie suspensia pe placi astfel încât să se obtina un strat uniform de grosime 0,25 mm. Se lasă să se usuce la aer şi apoi se depozitează într-un exicator ce contine silicagel. În momentul utilizarii, se activeaza placile prin tinerea acestora în cuptor la 110°C timp de o ora. Gata de utilizare, placile sunt corespunzătoare dacă acestea dau rezultate similare celor obtinute cu placi preparate asa cum s-a indicat mai sus. 4.
16. Lampa UV de lungime de unda (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie să faca posibil, pentru un spot de 1 ng de aflatoxina B

(1)să fie distins cu claritate pe o placa CSS la o distanta de 10 cm de lampa. 4.

1. Tuburi gradate de 10 ml cu dopuri de polietilena. 4.
2. Spectrofotometru UV. 4.
3. Fluorodensitometru (optional)
4. Procedura. 5.
5. Prepararea probei (vezi "Observatii", Partea C, punctul 1). Se rasneste proba astfel încât întreaga cantitate sa treaca printr-o sita cu ochiuri de 1 mm (în concordanta cu recomandarea ISO R 565) 5.
6. Extractie Se pun 50 g de proba rasnita, omogenizata într-un tub conic de 500 ml. Se adauga 25 g de diatomit (3.14.), 25 ml de apa şi 250 ml de cloroform (3.2.). Se astupa balonul, se scutura sau se agita pentru 30 de minute cu aparatul (4.2.) şi se filtreaza printr-o hartie de filtru canelata (4.3.). Se inlatura primii 10 ml din filtrat şi apoi se colecteaza 50 ml. 5.
7. Curatarea coloanei Se insereaza în capatul inferior al unui tub de cromatografie (4.4.) un dop de vata de bumbac sau de sticlă (3.9.), se umple două treimi din tub cu cloroform (3.2.) şi se adauga 5 g de sulfat de sodiu (3.10.). Se verifica dacă suprafaţa superioara a stratului de sulfat de sodiu este neteda, apoi se adauga 10 g de silicagel (3.8.) în portiuni mici. Se agita cu atenţie după fiecare aditie, pentru a elimina bulele de aer. Se lasă în repaus timp de 15 minute şi apoi se adauga cu atenţie 15 g de sulfat de sodiu (3.10.). Se lasă lichidul sa cada până când acesta este tocmai deasupra suprafetei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se amesteca 50 ml de extract colectat la 5.
8. cu 100 ml de n-hexan (3.3.) şi se transfera cantitatea din amestecul coloanei. Se lasă lichidul sa cada până când acesta este tocmai deasupra suprafetei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se elimina aceasta spalare. Apoi se adauga 100 ml de eter etilic (3.5.) şi se lasă din nou sa cada până la suprafaţa superioara a stratului de sulfat de sodiu. În timpul acestor operaţiunii se observa ca debitul este 8 până la 12 ml per minut şi coloana nu devine uscata. Se elimina lichidul care iese. Se elueaza apoi cu 150 ml de amestec de cloroform/metanol (3.7.) şi se colecteaza intregul eluat. Se evapora cel din urma până aproape de uscare la o temperatura ce nu depăşeşte 50°C şi sub un jet de gaz inert (3.11.) cu evaporator rotativ (4.5.). Se transfera în mod cantitativ reziduul, utilizand cloroform (3.2.) sau amestec de benzen-acetonitril (3.6.), într-un tub gradat de 10 ml (4.10.). Se concentreaza solutia sub un jet de gaz inert (3.11.) şi apoi se ajusteaza volumul până la 2 ml cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.). 5.
9. Cromatografie în strat subtire Se efectueaza un spot pe o placa pentru cromatografie în strat subtire (4.8.), 2 cm de la marginea inferioara şi la distante de 2 cm, cu volume indicate mai jos din solutia standard şi din extract: - 10, 15, 20, 30 şi 40 æl din solutia standard de aflatoxina B

(1)(3.16.); - 10 æl din extractul obţinut la 5.3 şi, suprapus pe acelasi punct, - 20 æl de solutie standard (3.16.); - 10 şi 20 æl de extras obţinut la 5.3. Se developeaza cromatograma la intuneric cu unul din solventii de developare (3.18.). Alegerea solventului trebuie să fie efectuata în prealabil, prin depozitare de 25 æl de solutie standard calitativa (3.17.) pe placa şi verificand ca atunci când se developeaza, aflatoxinele B

(1)şi B

(2)sunt complet separate. Se lasă solventii să se evapore la intuneric şi apoi se iradiaza cu lumina UV, plasand placa la 10 cm de lampa (4.9.). Spoturile de aflatoxina B

(1)dau o fluorescenta albastra. 5.

1. Determinari cantitative Se determina fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, asa cum s-a indicat mai jos. 5.5.
2. Masurari vizuale Se determina cantitatea de aflatoxina B

(1)din extract, prin compararea intensitatii fluorescentei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile solutiei standard. Se interpoleaza dacă este necesar. Fluorescenta obtinuta prin suprapunerea extractului din solutia standard trebuie să fie mai intensa decat cea a cantităţii de 10 æl de extract şi nu trebuie să fie mai mare decat un spot vizibil. Dacă intensitatea fluorescentei data de cantitatea de 10 æl de extras este mai mare decat cea de 40 æl din solutia standard, se dilueaza extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) înainte să fie supus din nou cromatografiei în strat subtire. 5.5.2. Masurari prin fluorodensitometrie Se masoara intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxina B

(1)cu fluorodensitometru (4.12.) la o excitatie a lungimii de unda de 365 nm şi o emisie a lungimii de unda de 443 nm. Se determina cantitatea de aflatoxina B

(1)din spoturile de extract, prin compararea intensitatilor fluorescentei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxina B

(1)standard. 5.6. Confirmarea identităţii aflatoxinei B

(1)Confirmarea identităţii aflatoxinei B

(1)din extract se efectueaza prin procesele indicate mai jos. 5.6.

1. Tratare cu acid sulfuric Se pulverizeaza acid sulfuric (3.13.) pe cromatograma obtinuta la 5.
2. Fluorescenta spoturilor de aflatoxina B

(1)trebuie să devina, sub iradierea UV din albastra, galbena. 5.6.2. Cromatografie bidimensionala implicand formarea de aflatoxina B

(1)-hemiacetat (aflatoxina B

(2)a) NB: Operaţiunile descrise mai jos trebuie să fie efectuate urmand cu atenţie diagrama din figura

1. NOTA(CTCE) Figura 3, se găseşte în Monitorul Oficial al Romanie, Partea I, nr. 1020 bis din 4 noiembrie
2. 5.6.2.
3. Aplicarea solutiilor Se traseaza pe o placa (4.8.) doua linii drepte paralele la doua părţi marginale (6 cm de fiecare parte) până la limita migratiei fronturilor de solvent. Se marcheaza solutiile urmatoare pe placa utilizandu-se pipete capilare sau microseringi: - în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obtinuta la 5.3, conţinând aproximativ 2,5 ng de aflatoxina B

(1); - în punctele B şi C: solutie standard de 25 æl 5.6.2.

1. Developare Se developeaza cromatograma în directia I, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.18.1.) (un strat de 1 cm dintr-o solutie mama nesaturata) până când frontul de solvent atinge linia limita a solventului. Se indeparteaza solutia mama de pe placa şi se lasă să se usuce la intuneric, la temperatura ambianta, timp de cinci minute. Se pulverizeaza apoi cu acid clorhidric (3.12.) de-a lungul unei bande de 2,5 cm înălţime ce acopera punctele A şi B (indicată prin zona hasurata în figura 3) până când se intuneca, protejand restul placii cu o foaie de sticlă. Se lasă sa reactioneze timp de 10 minute la intuneric şi se usuca cu un curent de aer la temperatura ambianta. Se developeaza apoi cromatograma în directia II, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.18.1.) (un strat de 1 cm dintr-o solutie mama nesaturata) până când frontul de solvent ajunge la linia limita a solventului. Se indeparteaza solutia mama de pe placa şi se lasă să se usuce la temperatura ambianta. 5.6.2.
2. Interpretarea cromatogramei. Se examineaza cromatograma sub lumina UV (4.9.) şi se verifica urmatoarele caracteristici: (a) Aparitia unui spot albastru de aflatoxina B

(1)ce provine de la solutia standard aplicata în punctul C (migrare în directia I). (b) Aparitia unui spot fluorescent albastru de aflatoxina B

(1)(nu reactioneaza cu acid clorhidric) şi un spot fluorescent albastru mai intens de aflatoxina B

(1)-hemiacetat, ambele originare din solutia standard aplicata în punctul B (migrarea în directia II). (

1. c)Aparitia de spoturi asemanatoare celor descrise la (
2. b)ce provin din proba extract aplicata în punctul A. Pozitia acestor spoturi este definita mai întâi prin distanta de migrare a aflatoxinei B

(1)de la punctul A în directia I (aceeasi ca cea lucrata prin standardul aplicat la C) şi apoi prin distantele de migrare de acolo în directia II a aflatoxinei B

(1)-hemiacetat (aceeasi ca cele lucrate prin standardul aplicat la B). Trebuie comparate intensitatile fluorescentei spoturilor hemiacetate ce provin din extract şi din standardul aplicat în punctul B. 6. Calcularea rezultatelor 6.1. De la masurarile vizuale Conţinutul în micrograme de aflatoxina B

(1)per kg de proba (ppb) este dat prin formula: S x Y x V --------- W x X în care: Y şi X sunt volumele în microlitri ale solutiei standard de aflatoxina B

(1)(3.16.) şi ale extractului având o intensitate a fluorescentei similara S = concentraţia în micrograme de aflatoxina B

(1)per ml în solutia standard (3.16.); V = volumul final al extractului în microlitri, permitand orice dilutie ce a fost necesară; W = greutatea în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curatarea coloanei 6.2. De la masurarile fluorodensitometrice Conţinutul în micrograme de aflatoxina B

(1)per kg de proba este data prin formula: S x V ----- W x Y în care: Y = volumul în microlitri de extract depus pe placa (10 sau 20 æl); S = cantitatea în nanograme de aflatoxina B

(1)din spotul de extras (proportional valorii Y luate) dedusa din masuratori; V = volumul final al extractului în microlitri, permitand orice dilutie ce a fost necesară; W = greutatea în grame a probei corespondente volumului din extractul supus la curatarea coloanei. 7. Prepararea şi testarea solutiei standard (3.16.) 7.1. Determinarea concentratiei de aflatoxina B

(1)Se prepara o solutie standard de aflatoxina B

(1)în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) cu o concentraţie de 8 la 10 æg/ml. Se determina spectrul de absorbtie între lungimile de unda de 330 şi 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (4.11.). Se masoara densitatea optica (A) la lungimea de unda de 363 nm, în cazul solutiei de cloroform; sau la lungimea de unda de 348 nm, în cazul solutiei de amestec de benzen/acetonitril. Se calculeaza concentraţia în micrograme de aflatoxina B

(1)per ml de solutie prin formula de mai jos: 312 x A x 1000 -------------- pentru solutia de cloroform; 20600 312 x A x 1000 -------------- pentru solutia din amestecul benzen/acetonitril 19800 Se dilueaza după cum este corespunzător, departe de lumina zilei, pentru a obtine o solutie de lucru standard cu o concentraţie de aflatoxina B

(1)de aproximativ 0,1 æg/ml. Dacă se păstrează într-un refrigerator la 4°C aceasta solutie este stabila timp de doua saptamani. 7.2. Testarea puritatii cromatografice Se depune pe o placa (4.8.) 5 æl de solutie standard de aflatoxina B

(1)ce contine 8 până la 10 æg/ml (7.1.). Se developeaza cromatograma asa cum s-a indicat la 5.

1. În lumina UV cromatograma trebuie să indice numai un spot şi nu trebuie să fie perceptibila nici o fluorescenta în zona de depozitare originala.
2. Repetabilitate Diferenţa dintre rezultatele celor două determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, prin aceeasi analiza, nu trebuie să depăşească: - 25% corelata cu rezultatul cel mai mare pentru un continut de aflatoxina B

(1)de la 10 şi până la 20 æg/kg - 5 æg, în valoare absoluta, pentru un continut mai mare de 20 şi până la 50 æg/kg - 10% corelata cu valoarea cea mai mare pentru un continut de aproximativ 50 æg/kg

1. Reproductibilitate A se vedea "Observatii", Partea C, punctul 2 B. Metoda cromatografica bidimensionala în strat subtire
2. Domeniu şi scop Metoda face posibil să se determine nivelul de aflatoxina B

(1)din furaje ce nu sunt în domeniul de aplicare al metodei A. Limita inferioara a determinarii este 0,01 mg/kg (10 ppb). Metoda nu este aplicabila furajelor ce conţin pulpa de fructe citrice. 2. Principiu Proba este supusă extractiei cu cloroform. Extractul este filtrat şi o portiune alicota este prelevata şi purificata prin cromatografie în coloana pe silicagel. Eluatul este evaporat şi reziduul redizolvat într-un volum specific de cloroform sau într-un amestec de benzen cu acetonitril. O portiune alicota din aceasta solutie este supusă cromatografiei bidimensionale în strat subtire (CSS). Cantitatea de aflatoxina B

(1)este determinata în baza iradierii cu radiatie UV a cromatogramei, fie vizual fie prin fluorodensitometrie, prin comparare cu cantitati cunoscute de aflatoxina standard B

(1). Identitatea aflatoxinei B

(1)extrasa din furaj trebuie să fie confirmata prin procedura indicată. 3. Reactivi NB: Toţi reactivii trebuie să fie de calitate "reactivi analitici" numai dacă nu s-a stabilit altfel. 3.1. Acetona 3.2. Cloroform, stabilizat cu 0,75 până la 1% la 96% etanol (v/v). 3.3. N-hexan 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxidaze 3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2 (v/

1. v)3.7. Amestec de cloroform (3.2.) şi metanol (3.4.): 97/3 (v/
2. v)3.8. Silicagel pentru cromatografie în coloana, particule de marime 0,705 până la 0,720 mm. 3.9. Vata de bumbac absorbanta, anterior degresata cu cloroform, sau vata de sticlă 3.10. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. azot 3.12. Acid clorhidric 1 N 3.13. Diatomit, (hyflosupercel), spalat în acid. 3.14. Silicagel G-HR sau echivalent pentru CSS 3.15. Solventi de developare 3.15.1. Eter etilic (3.5.)/metanol (3.4.)/apa: 94/4.5/1.5 (v/v/v), solutie mama nesaturata 3.15.2. Cloroform (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), solutie mama nesaturata 3.16. Solutie standard cu aproximativ 0,1 æg aflatoxina B

(1)per ml în cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.), preparata şi verificata asa cum este descris la punctul 7 al metodei A.

1. Aparatura A se vedea punctul 4 al metodei A
2. Procedura 5.
3. Prepararea probei 5.
4. Extractie vezi punctele 5.1., 5.
5. şi 5.
6. ale metodei A 5.
7. Curatarea coloanei 5.
8. CCS bidimensionala 5.4.
9. Aplicarea solutiilor (urmariti diagrama din figura 1) Se traseaza pe o placa (4.8.) doua linii drepte paralele cu cele doua margini drepte (respectiv 5 şi 6 cm de fiecare parte), pentru a se limita migrarea fronturilor de solvent. Se depun urmatoarele solutii pe placa utilizand pipete capilare sau microseringi: - în punctul A, 20 æl de extract de proba purificat obţinut la 5.3; - în punctul B, 20 æl de solutie standard (3.16.); - în punctul C, 10 æl de solutie standard (3.16.); - în punctul D, 20 æl de solutie standard (3.16.); - în punctul E, 40 æl de solutie standard (3.16.); Se usuca sub jet usor de aer sau gaz inert (3.11.). Spoturile obtinute trebuie să aibă un diametru de aproximativ 5 mm. 5.4.
10. Developare (se urmareste diagrama din figura 1) Se developeaza cromatograma în directia I, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.15.1.) (strat de 1 cm intr-o solutie mama nesaturata) până când frontul de solvent atinge linia limita a solventului. Se indeparteaza solutia mama de pe placa şi se lasă să se usuce la intuneric, la temperatura ambianta, timp de cincisprezece minute. Se developeaza apoi cromatograma în directia II, la intuneric, utilizand solvent de developare (3.15.2.) (un strat de 1 cm intr-o solutie mama nesaturata) până când frontul de solvent ajunge la linia limita a solventului. Se muta placa de la recipient şi se lasă să se usuce la intuneric, la temperatura ambianta. 5.4.
11. Interpretarea cromatogramei (se urmareste diagrama din figura 2) Se iradiaza cromatograma cu lumina UV, prin plasarea placii la 10 cm de (4.9.). Se localizeaza pozitia spoturilor albastre fluorescente din punctele B, C, D şi E ale aflatoxinei B

(1)din solutia standard. Se proiecteaza doua linii imaginare ce trec prin aceste spoturi şi perpendiculare pe directiile de developare. Intersectia P a acestor linii este locul în care se asteapta să se gaseasca spotul aflatoxinei B

(1)ce provine din extractul proba aplicat în punctul A (figura 1). Totusi, locatia actuala a spotului de aflatoxina poate fi la un punct Q la intersectia celor două linii imaginare drepte ce formeaza un unghi de aproximativ 100°C între ele ce trec pin spoturile B şi respectiv C. Se determina cantitatea de aflatoxina B

(1)din extractul proba asa cum s-a indicat la 5.

1. 5.4.
2. Cromatografie suplimentara Se traseaza pe o placa noua (4.8.) doua linii drepte paralele cu cele doua margini drepte, asa cum s-a indicat în diagrama din figura 1, şi se aplică la punctul A (vezi figura 1) 20 æl de extract de proba purificat obţinut la 5.3 şi superpozitionata pe aceasta, 20 æl de solutie standard (3.16.). Se developeaza asa cum s-a indicat la 5.4.
3. Se iradiaza cromatograma cu lumina UV (4.9.) şi se verifica dacă: - spoturile de aflatoxina B

(1)din extract şi din solutia standard se suprapun, - fluorescenta acestui spot este mult mai intensa decat cea a aflatoxinei B

(1), spot developat la Q pe prima placa. 5.

1. Determinari cantitative Se determina fie vizual fie prin fluorodensitometru asa cum s-a indicat mai jos. 5.5.
2. Masurari vizuale Se determina cantitatea de aflatoxina B

(1)din extract prin compararea intensitatii fluorescentei din spotul extract cu cea a spoturilor din punctele C, D şi E din solutia standard. Se interpoleaza dacă este necesar. Dacă intensitatea fluorescentei obtinuta prin intermediul a 20 æl de extract este mai mare decat cea obtinuta cu 40 æl de solutie standard, se dilueaza extractul de 10 sau 100 de ori cu cloroform (3.2.) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6.) înainte să fie supus din nou cromatografiei în strat subtire. 5.5.2. Masurari prin fluorodensitometru Se masoara intensitatea fluorescentei spoturilor de aflatoxina B

(1)cu fluorodensitometru (4.12.), utilizand o excitatie a lungimii de unda de 365 nm şi o emisiune a lungimii de unda de 443 nm. Se determina cantitatea de aflatoxina B

(1)din spotul extract, prin compararea intensitatii fluorescente cu cea din spoturile din punctele C, D şi E din solutia standard. 5.6. Confirmarea identităţii aflatoxinei B

(1)A se vedea punctul 5.6 al metodei A.

1. Calcularea rezultatelor A se vedea punctul 6 al metodei A.
2. Repetabilitate A se vedea punctul 8 al metodei A
3. Reproductibilitate A se vedea "Observatii", Partea C, punctul 2 C. Observatii privind metodele A şi B.
4. Degresare Probele ce conţin mai mult de 5% grasimi trebuie să fie degresate cu eter de petrol (bp 40 până la 60°C) după prepararile indicate la 5.
5. În astfel de cazuri, rezultatele analitice trebuie să fie exprimate în functie de greutatea probei nedegresate.
6. Reproductibilitatea rezultatelor pentru metoda A Reproductibilitatea rezultatelor, de ex. variatia dintre rezultatele obtinute în doua sau mai multe laboratoare privind aceeasi proba a fost estimată la: ± 50% din valoarea medie pentru valorile medii ale aflatoxinei B

(1)de la 10 şi până la 20 mg/kg; ± 10 mg/kg din valoarea medie pentru valori medii mai mari de 20 şi până la 50 mg/kg; ± 20% din valoarea medie pentru valori medii peste 50 mg/kg. ------------