NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...

(2)Autoritatea veterinara centrala a României va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...

(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa la norma veterinara ------------------- Partea A DETERMINAREA PRODUSULUI AMPROLIUM (Clorhidrat de clorura de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium) 1. Scop şi domeniu de aplicare Aceasta metoda permite determinarea produsului amprolium din furaje şi premixuri. Limita de detectie este de 1 mg/kg, iar limita de determinare este de 25 mg/kg. 2. Principiu Proba este extrasa cu un amestec de metanol şi apa. După diluare cu faza mobila şi filtrare prin membrana, conţinutul în amprolium este determinat prin cromatografie lichida de înaltă performanta (HPLC) cu schimbatori de cationi, utilizand un detector UV. 3. Reactivi 3.1. Metanol 3.2. Acetonitril, de grad HPLC 3.3. Apa, de grad HPLC 3.4. Solutie de fosfat dihidrogenat de sodiu, c = 0,1 mol/l Se dizolva în apa 13,80 g de fosfat dihidrogenat de sodiu monohidrat (3.3) într-un balon gradat de 1000 ml, se aduce la semn cu apa (3.3) şi se omogenizeaza. 3.5. Solutie de perclorat de sodiu, c = 1,6 mol/l Se dizolva 224,74 g de perclorat de sodiu monohidrat în apa (3.3) într-un balon gradat de 1000 ml, se aduce la semn cu apa (3.3) şi se omogenizeaza. 3.6. Faza mobila pentru HPLC (vezi punctul 9.1). Amestec de acetonitril (3.2), solutie de fosfat dihidrogenat de sodiu (3.4) şi solutie de perclorat de sodiu (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). Înainte de utilizare se filtreaza printr-un filtru cu membrana de 0,22 æm (4.3) şi se degazeaza solutia (de ex. în baia cu ultrasunete (4.4) timp de cel puţin 15 minute). 3.7. Substanţa etalon: amprolium pur, clorhidrat clorura de 1-[(4-amino-2-propil-5-pirimidin)metil]-2-metil-piridinium, E 750 (vezi 9.2). 3.7.1. Solutie etalon stoc de amprolium, 500 æg/ml Se cantaresc cu o precizie de 0,1 mg, 50 mg de amprolium (3.7) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolva în 80 ml de metanol (3.1) şi se plaseaza balonul timp de 10 min intr-o baie cu ultrasunete (4.4). După tratament cu ultrasunete, se aduce solutia la temperatura camerei, se aduce la semn cu apa şi se omogenizeaza. La o temperatura de 4°C, solutia este stabila timp de o luna. 3.7.2. Solutie etalon intermediara de amprolium, 50 æg/ml Se pipeteaza 5 ml din solutia etalon stoc (3.7.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu solvent de extractie (3.8) şi se omogenizeaza. La o temperatura de 4°C, solutia este stabila timp de o luna. 3.7.3. Solutii de etalonare Se transfera 0,5, 1 şi 2 ml din solutia etalon intermediara (3.7.2) intr-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se aduce la semn cu faza mobila (3.6) şi se omogenizeaza. Aceste solutii corespund la 0,5, 1 şi respectiv 2 æg de amprolium pe ml. Aceste solutii trebuie să fie proaspat preparate înainte de utilizare. 3.8. Solvent de extractie Amestec de metanol (3.1) şi apa 2 + 1 (v + v). 4. Aparatura 4.1. Echipament HPLC cu sistem de injectie, corespunzător injectarii de volume de 100 æl. 4.1.1. Coloana pentru cromatografie lichida de 125 mm x 4 mm cu schimbatori de cationi, umplere de Nucleosil 10 SA de 10 æm sau echivalenta. 4.1.2. Detector UV cu lungime de unda variabila sau detector cu grup de diode. 4.2. Filtru cu membrana, material PTFE, de 0,45 æm. 4.3. Filtru cu membrana de 0,22 æm. 4.4. Baie cu ultrasunete. 4.5. Agitator mecanic sau magnetic. 5. Procedura 5.1. Generalitati 5.1.1. Furaj martor Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica faptul că nu este prezent amprolium sau substante interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu cel al probei şi nu trebuie să fie detectate amprolium sau substante interferente. 5.1.2. Test de recuperare Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de amprolium, similara celei prezente în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 100 mg/kg, se transfera 10 ml din solutia etalon stoc (3.7.1) într-un pahar conic de 250 ml şi se evapora solutia până la aproximativ 0,5 ml. Se adauga 50 g de furaj martor, se amesteca cu grija şi se lasă timp de 10 minute, amestecand din nou de mai multe ori înainte de a continua cu faza de extractie (5.2). Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor de tip similar celui din proba (a se vedea 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a etalonului. În acest caz, proba de analizat este imbogatita cu o cantitate de amprolium similara celei deja prezente în proba. Aceasta proba este analizata împreună cu proba ne-imbogatita, iar recuperarea poate fi calculată prin diferenţa. 5.2. Extractie 5.2.1. Premixuri (continut de amprolium < 1%) şi furaje Se cantaresc cu o precizie de 0,01 g, între 5 şi 40 g de proba, în functie de conţinutul în amprolium, într-un pahar conic de 500 ml şi se adauga 200 ml de solvent de extractie (3.8). Se plaseaza balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasă timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agita timp de o ora cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se dilueaza o parte alicota a extractului cu faza mobila (3.6) pentru un continut în amprolium de 0,5-2 æg/ml şi se amesteca (vezi observatia 9.3). Se filtreaza 5-10 ml din aceasta solutie diluata printr-un filtru cu membrana (4.2). Se continua cu determinarea HPLC (5.3). 5.2.2. Premixuri (continut 1% amprolium) Se cantaresc cu o precizie de 0,001 g, 1-4 g de premix, în functie de conţinutul în amprolium, într-un pahar conic de 500 ml şi se adauga 200 ml de solvent de extractie (3.8). Se plaseaza balonul în baia cu ultrasunete (4.4) şi se lasă timp de 15 minute. Se scoate balonul din baia cu ultrasunete şi se agita timp de o ora cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.5). Se dilueaza o parte alicota a extractului cu faza mobila (3.6), pentru un continut în amprolium de 0,5-2 æg/ml şi se amesteca. Se filtreaza 5-10 ml din aceasta solutie diluata printr-un filtru cu membrana (4.2). Se continua cu determinarea HPLC (5.3). 5.3. Determinarea HPLC 5.3.1. Parametri: Sunt oferite pentru orientare urmatoarele condiţii; pot fi utilizate alte condiţii numai dacă acestea dau rezultate echivalente. Coloana cromatografica lichida (4.1.1.): 125 mm x 4 mm, cu schimbatori de cationi, umplere de Nucleosil 10 SA de 10 æm sau echivalenta. Faza mobila (3.6): Amestec de acetonitril (3.2), solutie de fosfat dihidrogenat de sodiu (3.4) şi solutie de perclorat de sodiu (3.5), 450 + 450 + 100 (v + v +

1. v)Debit: 0,7-1 ml/min. Lungimea undei de detectie: 264 nm. Volum de injectie: 100 æl. Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic injectand de mai multe ori solutia de etalonare (3.7.3) conţinând 1,0 æg/ml, până la obtinerea de inaltimi ale picului şi timpi de retentie constanti. 5.3.2. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare solutie de etalonare (3.7.3) de mai multe ori şi se determina inaltimile (ariile) medii ale picului pentru fiecare concentraţie. Se stabileste o curba de etalonare utilizand inaltimile (ariile) medii ale picului ale solutiilor de etalonare ca ordonate şi concentratiile corespondente, în æg/ml, ca abcise. 5.3.3. Solutia probei Se injecteaza extractul din proba (5.2) de mai multe ori, utilizand acelasi volum ca cel utilizat pentru solutiile de etalonare şi se determina înălţimea (aria) medie a picului pentru amprolium. 6. Calculul rezultatelor Plecand de la înălţimea (aria) medie a picurilor pentru amprolium a solutiei din proba, se determina concentraţia solutiei probei în æg/ml, prin referire la curba de etalonare (5.3.2). Conţinutul probei în amprolium w, în mg/kg, este dat de urmatoarea formula: V x (delta) x f w = --------------- [mg/kg] m în care: V = volumul solventului de extractie (3.8) în ml, conform 5.2 (adica 200 ml); (delta) = concentraţia de amprolium din extractul din proba (5.2) în æg/ml; f = factorul de dilutie conform 5.2; m = masa portiunii de test în g. 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea substantei de analizat poate fi confirmata prin co-cromatografie sau utilizand un detector cu grup de diode, prin intermediul caruia sunt comparate spectrele extractului probei (5.2) şi ale solutiei de etalonare (3.7.3) conţinând 2,0 æg/ml. 7.1.1. Co-cromatografie Un extract din proba (5.2) este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare din solutia de etalonare (3.7.3). Cantitatea de amprolium adăugată trebuie să fie similara cantităţii de amprolium constatata în extractul probei. Numai înălţimea picului de amprolium ar trebui sa creasca după luarea în considerare atât a cantităţii adaugate cat şi a dilutiei extractului. Largimea picului, la jumatatea inaltimii sale, trebuie să se situeze la ±10% din largimea initiala a picului pentru amprolium al extractului probei ne-imbogatite. 7.1.2. Detectie cu grupuri de diode Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmatoarele criterii:
2. a)Lungimea de unda a absorbtiei maxime a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrată la vârful picului pe cromatograma, trebuie să fie aceeasi intr-o marja determinata de puterea de rezolutie a sistemului de detectie. Pentru detectia cu grupuri de diode, aceasta este în general de ±2 nm. ...
3. b)Între 210 şi 320 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la vârful picului cromatogramei nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativa. Acest criteriu este indeplinit atunci când sunt prezente aceleasi maxime şi la nici un punct observat deviatia dintre doua spectre nu depăşeşte 15% din absorbanta etalonului substantei de analizat; ...
4. c)Între 210 şi 320 nm, spectrele portiunii ascendente, ale vârfului şi ale portiunii descendente a picului produse de extractul din proba, nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativa. Acest criteriu este indeplinit atunci când sunt prezente aceleasi maxime şi când la toate punctele observate deviatia dintre spectre nu depăşeşte 15% din absorbanta spectrului vârfului picului. Dacă unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu este confirmata. ... 7.2. Repetabilitate Diferenţa dintre rezultatele a doua determinari paralele efectuate pe aceeasi proba nu trebuie să depăşească:
5. a)15% din valoarea superioara, pentru un continut în amprolium între 25 mg/kg şi 500 mg/kg; ...
6. b)75 mg/kg pentru un continut în amprolium între 500 mg/kg şi 1000 mg/kg; ...
7. c)7,5% din valoarea superioara, pentru un continut în amprolium mai mare de 1000 mg/kg. ... 7.3. Recuperare Pentru o proba (martor) imbogatita, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 90%. 8. Rezultatele unui studiu de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare, în cursul caruia au fost analizate trei furaje pentru păsări (probe 1-3), un furaj mineral (proba 4) şi un premix (proba 5). Rezultatele sunt prezentate în urmatorul tabel: 9. Observatii 9.1. Dacă proba contine tiamina, picul tiaminei din cromatograma apare puţin înainte de picul amprolium-ului. Potrivit acestei metode, amprolium-ul şi tiamina trebuie să fie separate. Dacă amprolium-ul şi tiamina nu sunt separate de coloana (4.1.1) utilizata în aceasta metoda, se inlocuieste cu metanol până la 50% din partea de acetonitril a fazei mobile (3.6). 9.2. Conform Farmacopeii Britanice, spectrul solutiei de amprolium (c = 0,02 mol/
8. l)în acid clorhidric (c = 0,1 mol/
9. l)prezinta maxime la 246 nm şi 262 nm. Absorbanta va fi de 0,84 la 246 nm şi de 0,80 la 262 nm. Partea B DETERMINAREA DICLAZURILULUI 2,6-diclor-(4-clorofenil)-4-[2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl]fenil-acetonitril 1. Scop şi domeniu de aplicare Metoda permite determinarea diclazurilului din furaje şi premixuri. Limita de detectie este de 0,1 mg/kg iar limita de determinare este de 0,5 mg/kg. 2. Principiu După aditia unui etalon intern, proba este extrasa cu metanol acidifiat. Pentru furaje, o parte alicota a extractului este purificata pe un cartus C18 pentru extractie în faza solida. Diclazurilul este eluat din cartus cu un amestec de metanol acidifiat şi apa. După evaporare, reziduul este dizolvat în DMF/apa. Pentru premixuri, extractul este evaporat iar reziduul este dizolvat în DMF/apa. Conţinutul în diclazuril este determinat prin cromatografie în faza lichida de înaltă performanta (HPLC) cu gradient ternar şi în faza inversa, utilizand un detector UV. 3. Reactivi 3.1. Apa, de grad HPLC. 3.2. Acetat de amoniu. 3.3. Hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu (TBHS). 3.4. Acetonitril, de grad HPLC. 3.5. Metanol, de grad HPLC. 3.6. N,N-dimetilformamida (DMF). 3.7. Acid clorhidric, d

(20)= 1,19 g/ml. 3.8. Substanţa etalon: diclazuril 11-24: [2,6 dicloro-(4-clorofenil)-4-(2,3, 4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenil]-acetonitril, cu puritate garantata, E771. 3.8.1. Solutie etalon stoc de diclazuril, 500 æg/ml. Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 mg, 25 mg de substanţa etalon de diclazuril (3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolva în DMF (3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza balonul intr-o foaie de aluminiu sau se utilizeaza un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatura de 4°C, solutia este stabila timp de o luna. 3.8.2. Solutie etalon de diclazuril, 50 æg/ml. Se transfera 5,00 ml din solutia etalon stoc (3.8.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza balonul intr-o folie de aluminiu sau se utilizeaza un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatura de 4°C, solutia este stabila timp de o luna. 3.9. Substanţa etalon interna: 2,6 dicloro-a-(4-chlorofenil)-4-(4,5 dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazina-2 (3H)-

1. yl)a-metilbenzen-acetonitril. 3.9.1. Solutie etalon stoc interna, 500 æg/ml. Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 ml, 25 mg de substanţa etalon interna (3.9) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolva în DMF (3.6), se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza balonul intr-o folie de aluminiu sau se utilizeaza un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatura de 4°C, solutia este stabila timp de o luna. 3.9.2. Solutie etalon interna, 50 æg/ml. Se transfera 5,00 ml din solutia etalon stoc interna (3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se aduce la semn cu DMF (3.6) şi se omogenizeaza. Se impacheteaza flaconul intr-o folie de aluminiu sau se utilizeaza un balon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatura de 4°C, la solutia este stabila timp de o luna. 3.9.3. Solutie etalon interna pentru premixuri, p/1000 mg/ml (p = continut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg). Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 mg, 10 mg de substanţa etalon interna într-un balon gradat de 100 ml, se dizolva în DMF (3.6) intr-o baie cu ultrasunete (4.6), se aduce la semn cu DMF şi se omogenizeaza. Se impacheteaza flaconul intr-o folie de aluminiu sau se utilizeaza un flacon de culoare bruna şi se depozitează în frigider. La o temperatura de 4°C, solutia este stabila timp de o luna. 3.10. Solutie de etalonare, 2 æg/ml. Se pipeteaza 2,00 ml de solutie etalon de diclazuril (3.8.2) şi 2,00 ml de solutie etalon interna, (3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adauga 16 ml de DMF (3.6), se aduce la semn cu apa şi se omogenizeaza. Aceasta solutie trebuie să fie proaspat preparata înainte de utilizare. 3.11. Cartus C 18 pentru extractie în faza solida, de exemplu, Bond Elut, marime: 1 cc, masa de sorbtie: 100 mg. 3.12. Solvent de extractie: metanol acidifiat. Se pipeteaza 5,0 ml de acid clorhidric (3.7) în 1000 ml de metanol (3.5) şi se omogenizeaza. 3.13. Faza mobila pentru HPLC. Solvent A: acetat de amoniu - solutie de hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu. 3.13.1. Se dizolva 5 g de acetat de amoniu (3.2) şi 3,4 g de TBHS (3.3) în 1000 ml de apa (3.1) şi se omogenizeaza. 3.13.2. Solvent B: acetonitril (3.4). 3.13.3. Solvent C: metanol (3.5). 4. Aparatura 4.1. Agitator mecanic. 4.2. Echipament pentru HPLC cu gradient ternar. 4.2.1. Coloana pentru cromatografie lichida, umplere de Hypersil ODS de 3 æm, 100 mm x 4,6 mm, sau echivalent. 4.2.2. Detector UV cu lungime de unda variabila sau detector cu grup de diode. 4.3. Evaporator rotativ în vid. 4.4. Filtru cu membrana de 0,45 æm. 4.5. Distribuitor în vid. 4.6. Baie cu ultrasunete. 5. Procedura 5.1. Generalitati 5.1.1. Furaj martor Un furaj martor trebuie să fie analizat pentru a se controla faptul că nu sunt prezente nici diclazuril şi nici substante interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu proba şi la analiza nu trebuie să fie detectate diclazuril sau substante interferente. 5.1.2. Test de recuperare Trebuie să fie efectuat un test de recuperare, prin analizarea furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de diclazuril similara celei prezente în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 1 mg/kg, se adauga 0,1 ml din solutia etalon stoc (3.8.1) la 50 g dintr-un furaj martor, se amesteca cu grija şi se lasă timp de 10 minute, amestecand din nou de mai multe ori înainte de procedeu (5.2). Alternativ, dacă un furaj martor de tip similar probei nu este disponibil (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a etalonului. În acest caz, proba ce urmeaza să fie analizata este imbogatita cu o cantitate de diclazuril similara celei deja prezente în proba. Aceasta proba este analizata alaturi de proba ne-imbogatita, iar recuperarea poate fi calculată prin diferenţa. 5.2. Extractie 5.2.1. Furaje Se cantaresc, cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 50 g din proba. Se transfera într-un pahar conic de 500 ml, se adauga 1,00 ml din solutia etalon interna (3.9.2), 200 ml solvent de extractie (3.12) şi se astupa paharul. Se agita amestecul cu agitatorul (4.1) pe parcursul noptii. Se lasă să se depuna timp de 10 minute. Se transfera o parte alicota de 20 ml din supernatant într-un recipient de sticlă corespunzător şi se dilueaza cu 20 ml de apa. Se transfera aceasta solutie într-un cartus de extractie (3.11) şi se trece prin vid (4.5). Se spala cartusul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extractie (3.12) şi apa, 65 + 35 (V + V). Se elimina fractiunile colectate şi se elueaza compusii cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extractie (3.12) şi apa, 80 + 20 (V + V). Se evapora aceasta fractiune până când aceasta ajunge la sec, prin intermediul evaporatorului rotativ (4.3) la 60°C. Se dizolva reziduul în 1,0 ml de DMF (3.6), se adauga 1,5 ml de apa (3.1) şi se amesteca. Se filtreaza printr-un filtru cu membrana (4.4). Se continua cu determinarea HPLC (5.3). 5.2.2. Premixuri Se cantareste, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 1 g din proba. Se transfera într-un pahar conic de 500 ml, se adauga 1,00 ml din solutia etalon interna (3.9.3), 200 ml de solvent de extractie (3.2), şi se astupa paharul. Se agita amestecul pe parcursul noptii cu agitatorul (4.1). Se lasă să se depuna timp de 10 minute. Se transfera o parte alicota de 10.000/p ml (p = continut nominal în diclazuril al premixului în mg/
2. kg)din supernatant într-un balon cu fundul rotund de marime adecvata. Se evapora până când acesta ajunge la sec, sub presiune redusa la 60°C, prin intermediul evaporatorului rotativ (4.3). Se redizolva reziduul în 10,0 ml de DMF (3.6), se adauga 15,0 ml de apa (3.1) şi se omogenizeaza. Se continua cu determinarea HPLC (5.3). 5.3. Determinarea HPLC. 5.3.1. Parametri Sunt oferite spre orientare urmatoarele condiţii; pot fi utilizate alte condiţii numai dacă acestea dau rezultate echivalente. - Coloana cromatografica 100 mm x 4,6 mm, umplere de Hypersil ODS de 3 æm sau lichida (4.2.1): echivalent - Faza mobila: Solvent A (3.13.1): Solutie apoasa de acetat de amoniu şi hidrogenosulfat de tetrabutilamoniu Solvent B (3.13.2): acetonitril Solvent C (3.13.3): metanol - Mod de elutie: - gradient linear - condiţii initiale: A + B + C = 60 + 20 + 20 (v + v +
3. v)- după 10 minute, elutia prin gradient timp de 30 min la A + B + C = 45 + 20 + 35 (v + v +
4. v)Se clateste cu B timp de 10 minute. - Debit: 1,5-2 ml/min - Volum de injectie: 20 æl - Lungimea undei de detectie: 280 æl Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, injectand de mai multe ori solutia de etalonare (3.10), conţinând 2 æg/ml, până când sunt obtinute inaltimi ale picului şi timpi de retentie constanti. 5.3.2. Solutie de etalonare Se injecteaza 20 æl din solutia de etalonare (3.10) de mai multe ori şi se determina înălţimea (zona) medie a picului de diclazuril şi picurile etalonului intern. 5.3.3. Solutia din proba Se injecteaza 20 æl din solutia din proba (5.2.1. sau 5.2.2.) de mai multe ori şi se determina înălţimea (aria) medie a picului de diclazuril şi picurile etalonului intern. 6. Calculul rezultatelor 6.1. Furaje Conţinutul probei în diclazuril w(mg/
5. kg)este dat de urmatoarea formula: h(d,
6. s)x h(i,
7. c)(delta)(d,
8. c)x 10V w = --------------- x ------------------ [mg/kg] h(i,
9. s)x h(d,
10. c)m unde: h(d,
11. s)= înălţimea (aria) picului de diclazuril în solutia de proba (5.2.1.); h(i,
12. s)= înălţimea (aria) picului etalonului intern în solutia de proba (5.2.1.); h(d,
13. c)= înălţimea (aria) picului de diclazuril în solutia de etalonare (3.10); h(i,
14. c)= înălţimea (aria) picului etalonului intern în solutia de etalonare (3.10); (delta)(d,
15. c)= concentraţia diclazurilului în solutia de etalonare în æg/ml (3.10); m = masa portiunii de test în g; V = volumul extractului probei conform 5.2.1 (de ex. 2,5 ml). 6.2. Premixuri Conţinutul în diclazuril w(mg/
16. kg)din proba este dat de formula: h(d,
17. s)x h(i,
18. c)(delta)(d,
19. c)x 0,02V x p w = --------------- x ------------------------ [mg/kg] h(i,
20. s)x h(d,
21. c)m unde: h(d,
22. c)= înălţimea (aria) picului de diclazuril în solutia de etalonare (3.10); h(i,
23. c)= înălţimea (aria) picului etalonului intern în solutia de etalonare (3.10); h(d,
24. s)= înălţimea (aria) picului de diclazuril în solutia probei (5.2.2); h(i,
25. s)= înălţimea (aria) picului etalonului intern în solutia probei (5.2.2.); (delta)(d,
26. c)= concentraţia diclazurilului în solutia de etalonare (3.10); m = masa portiunii de test în g; V = volumul extractului probei conform 5.2.2 (de ex. 25 ml); p = conţinutul nominal de diclazuril în mg/kg din premix. 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea substantei de analizat poate fi confirmata prin co-cromatografie sau utilizand un detector cu grup de diode prin care sunt comparate spectrele extractului din proba (5.2.1. sau 5.2.2.) şi ale solutiei de etalonare (3.10). 7.1.1. Co-cromatografie Un extract din proba (5.2.1 sau 5.2.2.) este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare din solutia de etalonare (3.10). Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similara cu cantitatea de diclazuril constatata în extractul din proba. Numai înălţimea picului de diclazuril şi a picului etalonului intern ar trebui sa creasca după luarea în considerare atât a cantităţii adaugate cat şi a dilutiei extractului. Largimea picului, la jumatatea inaltimii sale, trebuie să se situeze la ±10% din largimea initiala a picului de diclazuril sau a picului etalonului intern al extractului din proba neimbogatita. 7.1.2. Detectare cu grup de diode Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmatoarele criterii:
27. a)Lungimea de unda de absorbtie maxima a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrate la vârful picului pe cromatograma, trebuie să fie aceeasi, cu o marja stabilita de puterea de rezolutie a sistemului de detectie. Pentru detectia cu grup de diode, aceasta este în general de ±2 nm. ...
28. b)Între 230 şi 320 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la vârful picului cromatogramei, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativa. Acest criteriu este indeplinit atunci când aceleasi maxime sunt prezente şi când la nici un punct observat deviatia între cele doua spectre nu depăşeşte 15% din absorbanta etalonului substantei de analizat. ...
29. c)Între 230 şi 320 nm, spectrele portiunii ascendente, ale vârfului şi ale portiunii descendente ale picului produse de extractul probei nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanta relativa. Acest criteriu este indeplinit atunci când sunt prezente aceleasi maxime şi când la toate punctele observate deviatia între spectre nu depăşeşte 15% din absorbanta spectrului vârful picului. ... Dacă unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu a fost confirmata. 7.2. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a doua determinari paralele efectuate pe aceeasi proba nu trebuie să depăşească:
30. a)30% din valoarea superioara, pentru un continut în diclazuril situat între 0,5 şi 2,5 mg/kg; ...
31. b)0,75 mg/kg pentru un continut în diclazuril situat între 2,5 şi 5 mg/kg; ...
32. c)15% din valoarea superioara, pentru un continut în diclazuril mai mare de 5 mg/kg. ... 7.3. Recuperare Pentru o proba (martor) imbogatita, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 80%. 8. Rezultatele unui studiu de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare în care au fost analizate cinci probe de către 11 laboratoare. Aceste probe au constat în doua premixuri; unul a fost amestecat cu o matrice organica (O 100) şi celalalt cu o matrice anorganica (A 100). Conţinutul teoretic este de 100 mg de diclazuril pe kg. Cele trei furaje amestecate pentru păsări au fost fabricate de trei producători diferiti (NL) (LI/ZI/KI). Conţinutul teoretic este de 1 mg de diclazuril pe kg. Laboratoarele au fost instruite sa analizeze fiecare din probe o singură dată sau în dublu. (Informaţii mai detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi gasite în Jurnalul AOAC International, Volumul 77, nr. 6, 1994, pp. 1359-1361.) Rezultatele sunt date în tabelul următor: 9. Observatii Răspunsul diclazurilului trebuie să fi fost demonstrat în prealabil ca fiind linear peste gama de concentratii ce sunt masurate. Partea C DETERMINAREA CARBADOXULUI Metil 3-(2-quinoxalinilmetilena)carbazat N1,N4-dioxid 1. Scop şi domeniu de aplicare Prezenta metoda este destinata determinarii carbadoxului din furaje, premixuri şi preparate. Limita de detectie este de 1 mg/kg. Limita de determinare este de 10 mg/kg. 2. Principiu Proba este echilibrata cu apa şi extrasa cu metanol-acetonitril. Pentru furaje, o portiune alicota a extractului filtrat este supusă purificarii pe o coloana de oxid de aluminiu. Pentru premixuri şi preparate, o portiune alicota a extractului filtrat este diluata la o concentraţie corespunzătoare cu apa, metanol şi acetonitril. Conţinutul în carbadox este determinat prin cromatografie lichida de înaltă performanta (HPLC) în faza inversa, utilizand un detector UV. 3. Reactivi 3.1. Metanol. 3.2. Acetonitril, de grad HPLC. 3.3. Acid acetic, w = 100%. 3.4. Oxid de aluminiu: neutru, grad de activitate I. 3.5. Metanol-acetonitril 1 + 1 (v +
33. v)Se amesteca 500 ml de metanol (3.1) cu 500 ml de acetonitril (3.2). 3.6. Acid acetic 10%. Se dilueaza 10 ml de acid acetic (3.3) cu apa până la 100 ml. 3.7. Acetat de sodiu, CH

(3)COONa. 3.8. Apa, de grad HPLC. 3.9. Solutie tampon de acetat, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0 Se dizolva 0,82 g de acetat de sodiu (3.7) în 700 ml de apa (3.8) şi se ajusteaza pH-ul la 6,0 cu acid acetic (3.6). Se transfera într-un balon gradat de 1000 ml, se aduce la semn cu apa (3.8) şi se omogenizeaza. 3.10. Faza mobila pentru HPLC Se amesteca 825 ml de solutie tampon de acetat (3.9) cu 175 ml de acetonitril (3.2). Se filtreaza printr-un filtru de 0,22 æm (4.5) şi se degazeaza solutia (de exemplu prin tratare cu ultrasunete timp de 10 minute. 3.11. Substanţa etalon Carbadox pur: metil (3,4,2-quinoxalinilmetilena)carbazat N^1,N^4-dioxid - E850. 3.11.1. Solutie etalon stoc de carbadox, 100 æg/ml (vezi punctul 5 Procedura): Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 mg, 25 mg de substanţa etalon de carbadox (3.11) într-un balon gradat de 250 ml. Se dizolva în metanol-acetonitril (3.5) prin tratare cu ultrasunete (4.7). După tratamentul cu ultrasunete, se aduce solutia la temperatura camerei, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeaza. Se ambaleaza balonul intr-o folie de aluminiu sau se utilizeaza sticlarie de culoare bruna şi se depozitează într-un frigider. La o temperatura de 4°C solutia este stabila timp de o luna. 3.11.2. Solutii de etalonare Se transfera 2,0, 5,0, 10,0 şi 20,0 ml din solutia etalon stoc (3.11.1) intr-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se adauga 30 ml de apa, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeaza. Se ambaleaza baloanele în folii de aluminiu. Aceste solutii corespund la 2,0, 5,0, 10,0 şi respectiv 20,0 æg/ml de carbadox. Solutiile de etalonare trebuie să fie proaspat preparate înainte de utilizare. Notă: Pentru determinarea carbadoxului din furaje ce conţin mai puţin de 10 mg/kg, trebuie să se prepare solutii de etalonare cu o concentraţie inferioara valorii de 2,0 æg/ml. 3.12. Amestec de apa-[metanol-acetonitril] (3.5), 300 + 700 (v +

1. v)Se amesteca 300 ml de apa cu 700 ml din amestecul de metanol-acetonitril (3.5). 4. Aparatura 4.1. Agitator de laborator sau magnetic. 4.2. Hartie de filtru din fibra de sticlă (Whatman GF/A sau echivalent). 4.3. Coloana de sticlă (lungime de 300 - 400 mm, diametru intern de aproximativ 10 mm), cu frita de sticlă sinterizata şi valva de evacuare. Notă: poate fi utilizata, de asemenea, o coloana de sticlă prevăzută cu un robinet sau o coloana de sticlă cu o extremitate efilata; în acest caz, un tampon mic de vata de sticlă este inserat la extremitatea inferioara şi se impinge utilizand o bagheta de sticlă. 4.4. Echipament HPLC cu sistem de injectie, adecvat pentru injectarea de volume de 20 æl. 4.4.1. Coloana pentru cromatografie lichida: 300 mm x 4 mm, C18, umplere de 10 æm sau echivalenta. 4.4.2. Detector UV cu lungime de unda variabila sau detector cu grup de diode ce funcţionează între 225 şi 400 nm. 4.5. Filtru cu membrana de 0,22 æm. 4.6. Filtru cu membrana de 0,45 æm. 4.7. Baie cu ultrasunete. 5. Procedura Notă: Carbadoxul este fotosensibil. Efectuati toate procedurile în lumina estompata sau utilizati sticlarie de culoare bruna sau sticlarie ambalata în folie de aluminiu. 5.1. Generalitati 5.1.1. Furaj martor Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), trebuie să fie analizat un furaj martor, pentru a se verifica faptul că nu sunt prezente nici carbadox şi nici substante interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu proba şi la analiza nu trebuie detectate nici carbadox şi nici substante interferente. 5.1.2. Test de recuperare Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor (5.1.1) ce a fost îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de carbadox, similara celei prezente în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 50 mg/kg, se transfera 5,0 ml din solutia etalon stoc (3.11.1) într-un pahar conic de 200 ml. Se evapora solutia la aproximativ 0,5 ml într-un curent de azot. Se adauga 10 g din furajul martor, se amesteca şi se asteapta timp de 10 minute înainte de a continua cu faza de extractie (5.2). Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor de tip similar probei (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de aditie a etalonului. În acest caz, proba este imbogatita cu o cantitate de carbadox similara celei deja prezente în proba. Aceasta proba este analizata împreună cu proba neimbogatita şi recuperarea poate fi calculată prin diferenţa. 5.2. Extractia 5.2.1. Furaje Se cantaresc, cu o precizie de 0,01 g, aproximativ 10 g din proba şi se transfera într-un pahar conic de 200 ml. Se adauga 15,0 ml de apa, se amesteca şi se echilibreaza timp de 5 minute. Se adauga 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupa şi se agita timp de 30 de minute cu agitatorul mecanic sau cu agitatorul magnetic (4.1). Se filtreaza solutia printr-o hartie de filtru din fibra de sticlă (4.2). Se retine aceasta solutie pentru faza de purificare (5.3). 5.2.2. Premixuri (0,1-2,0%) Se cantareste, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 1 g din proba nemacinata şi se transfera într-un pahar conic de 200 ml. Se adauga 15,0 ml de apa, se amesteca şi se echilibreaza timp de 5 minute. Se adauga 35,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupa şi se agita timp de 30 de minute cu un agitator mecanic sau cu un agitator magnetic (4.1). Se filtreaza solutia printr-o hartie de filtru cu fibra de sticlă (4.2). Se pipeteaza o parte alicota a filtratului într-un balon gradat de 50 ml. Se adauga 15,0 ml de apa, se aduce la semn cu metanol-acetonitril (3.5) şi se omogenizeaza. Concentraţia de carbadox a solutiei finale trebuie să fie de aproximativ 10 æg/ml. O parte alicota este filtrata printr-un filtru de 0,45 æm (4.6). Se continua cu dozarea HPLC (5.4). 5.2.3. Preparate (> 2%) Se cantaresc, cu o precizie de 0,001 g, aproximativ 0,2 g din proba nemacinata şi se transfera într-un pahar conic de 250 ml. Se adauga 45,0 ml de apa, se amesteca şi se echilibreaza timp de 5 minute. Se adauga 105,0 ml de metanol-acetonitril (3.5), se astupa şi se omogenizeaza. Proba se supune ultrasunetelor (4.7) timp de 15 minute, urmate de agitare mecanica sau magnetica timp de 15 minute (4.1). Se filtreaza solutia printr-o hartie de filtru din fibra de sticlă (4.2). Se dilueaza o parte alicota a filtratului cu amestecul de apa-metanol-acetonitril (3.12) până la o concentraţie finala în carbadox de 10-15 æg/ml (pentru o preparare la 10%, factorul de dilutie este de 10). O parte alicota este filtrata printr-un filtru de 0,45 æm (4.6). Se continua cu determinarea HPLC (5.4). 5.3. Purificare 5.3.1. Prepararea coloanei de oxid de aluminiu. Se cantaresc 4 g de oxid de aluminiu (3.4) şi se transfera în coloana de sticlă (4.3). 5.3.2. Purificarea probei Se aplica 15 ml din extractul filtrat (5.2.1) în coloana de oxid de aluminiu şi se elimina primii 2 ml de eluant. Se colecteaza urmatorii 5 ml şi se filtreaza o parte alicota printr-un filtru de 0,45 æm (4.6). Se continua cu determinarea HPLC (5.4). 5.4. Determinarea HPLC. 5.4.1. Parametri Urmatoarele condiţii sunt oferite pentru orientare; pot fi utilizate alte condiţii numai dacă acestea dau rezultate echivalente: Coloana cromatografica 300 mm x 4 mm, C18, umplere de 10 æm sau lichida (4.1.1): echivalenta Faza mobila (3.10): Amestec de solutie tampon de acetat (3.9) şi acetonitril (3.2), 825 + 175 (v + v). Debit: 1,5-2 ml/min Lungimea undei de detectie: 365 nm Volum de injectie: 20 æl Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, injectand de mai multe ori solutia de etalonare (3.11.2) conţinând 5,0 æg/ml, până când sunt obtinute inaltimi (arii) ale picurilor şi timpi de retentie constanti. 5.4.2. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare solutie de etalonare (3.11.2) de mai multe ori şi se masoara inaltimile (ariile) picurilor pentru fiecare concentraţie. Se stabileste o curba de etalonare utilizand inaltimile sau ariile medii ale picurilor solutiilor de etalonare ca ordonate şi concentratiile corespondente în æg/ml ca abcise. 5.4.3. Solutia probei Se injecteaza de mai multe ori extractul probei [(5.3.2) pentru furaje, (5.2.2) pentru premixuri şi (5.2.3) pentru preparate] şi se determina înălţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului. 6. Calculul rezultatelor Plecand de la înălţimea (aria) medie a picurilor carbadoxului solutiei din proba, se determina concentraţia solutiei din proba în æg/ml prin referire la curba de etalonare (5.4.2). 6.1. Furaje: Conţinutul w în carbadox (mg/
2. kg)din proba este dat de urmatoarea formula: (delta) x V

(1)w = -------------- [mg/kg] m în care: (delta) = concentraţia de carbadox a extractului din proba (5.3.2) în æg/ml. V

(1)= volumul de extractie în ml (adica 50 ml). m = masa portiunii de test în g. 6.2. Premixuri şi preparate Conţinutul w al probei în carbadox (mg/kg) este dat de urmatoarea formula: (delta) x V

(2)x f w = ------------------ [mg/kg] m în care: (delta) = concentraţia de carbadox a extractului din proba (5.2.2 sau 5.2.3) în æg/ml. V

(2)= volumul de extractie în ml (adica 50 ml pentru premixuri; 150 pentru preparate). f = factor de dilutie conform 5.2.2 (premixuri) sau 5.2.3 (preparate). m = masa portiunii de test în g. 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea substantei de analizat poate fi confirmata prin co-cromatografie sau utilizand un detector cu grup de diode prin care sunt comparate spectrele extractului din proba şi ale solutiei de etalonare (3.11.2) conţinând 10,0 æg/ml. 7.1.1. Co-cromatografie Un extract al probei este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare de solutie de etalonare (3.11.2). Cantitatea de carbadox adaugat trebuie să fie similara cantităţii estimate de carbadox constatata în extractul din proba. Numai înălţimea picului carbadoxului ar trebui să fie marita după luarea în considerare atât a cantităţii adaugate cat şi a dilutiei extractului. Largimea picului, la jumatatea inaltimii sale maxime, trebuie să se situeze la ±10% din largimea initiala. 7.1.2. Detectare cu grup de diode Rezultatele sunt evaluate conform urmatoarelor criterii:

1. a)lungimea de unda de absorbtie maxima a spectrelor probei şi a etalonului, înregistrată la vârful picului pe cromatograma, trebuie să fie aceeasi intr-o marja determinata de puterea de rezolutie a sistemului de detectie. Pentru detectia prin grup de diode, aceasta este de obicei de ±2 nm; ...
2. b)între 225 şi 400 nm, spectrele probei şi ale etalonului, înregistrate la vârful picului pe cromatograma, nu trebuie să fie diferite pentru aceste părţi ale spectrului într-un interval de 10-100% al absorbantei relative. Acest criteriu este indeplinit atunci când sunt prezente aceleasi maxime şi când la nici un punct observat deviatia între cele doua spectre nu depăşeşte 15% din absorbanta substantei de analizat etalon; ...
3. c)între 225 şi 400 nm, spectrele portiunii ascendente, ale vârfului şi ale portiunii descendente a picului, produse de extractul din proba, nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului într-un interval de 10-100% al absorbantei relative. Acest criteriu este indeplinit atunci când sunt prezente aceleasi maxime şi când la toate punctele observate, deviatia dintre spectre nu depăşeşte 15% din absorbanta spectrului vârfului. ... Dacă unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu a fost confirmata. 7.2. Repetabilitate Pentru un continut de 10 mg/kg şi mai mare, diferenţa dintre rezultatele a doua determinari paralele efectuate pe aceeasi proba nu trebuie să depăşească 15% din rezultatul superior. 7.3. Recuperare Pentru o proba (martor) imbogatita, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 90%. 8. Rezultate ale unui test de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare în care şase furaje, patru premixuri şi trei preparate au fost analizate de opt laboratoare. Au fost efectuate analize în dublu pentru fiecare proba. (Mai multe informaţii detaliate cu privire la acest studiu de colaborare pot fi gasite în Jurnalul AOAC, Volumul 71, 1988, pag. 484-490.) Rezultatele studiului (cu excepţia valorilor aberante) sunt indicate mai jos: Tabelul 1. Rezultatele studiului de colaborare pentru furaje Tabel 2. Rezultatele unui studiu de colaborare pentru premixuri şi preparate -----------