METODOLOGIE din 26 martie 2005

(50)- concentraţia substanţei care provoacă 50% reducere a creşterii celulare [E(b) C

(50)] sau ratei de creştere [E(f) C

(50)] faţă de celulele martor. NOEC - concentraţia cea mai mare la care nu se observă nici o inhibiţie semnificativă a creşterii algale faţă de martor. Unitate de măsură: greutate pe volum (mg/l) sau greutate pe greutate (mg. Kg^-

2. Substanţa de referinţă Substanţa de referinţă poate fi testată ca un mijloc de demonstraţie că în condiţiile de laborator sensibilitatea speciei test nu se modifică semnificativ. Dicromatul de K poate fi folosit ca substanţă de referinţă.
3. Principiul metodei O limită test poate fi realizată la 100 mg/l pentru a demonstra ca EC

(50)este mai mare decât aceasta concentraţie. Creşterea exponenţială a culturilor de alge verzi selectate expuse la diferite concentraţii ale substanţei test se obţine în condiţii bine determinate Soluţiile test sunt incubate pe o perioadă de 72 h timp în care densitatea celulelor din fiecare soluţie este măsurată la 24 h. Inhibiţia creşterii algale este determinată faţă de martor.

1. Criterii de calitate Densitatea celulară din cultura de control ar trebui să crească cu un factor de minim 16 în 3 zile. Concentraţiile substanţei test vor fi menţinute la 80% faţă de concentraţiile iniţiale tot timpul, corespunzător concentraţiei nominalizate. Pentru substanţele care: - sunt puţin solubile; - capabile să formeze emulsii sau dispersii; - nestabile; se vor face soluţii de fiecare dată.
2. Mod de lucru Reactivi Soluţii cu substanţele test. În funcţie de caracteristicile substanţei se vor face soluţii mamă. Mediul test Se foloseşte apă din reţea (trebuie cunoscută duritatea, pH), apă distilată sau apă deionizată. Aparatura Echipament normal de laborator; Sticle Winkler de 250 ml; Cameră de numărare: Temoluminostat; Agitator magnetic; Microscop. Organisme test Dintre speciile de alge verzi recomandă Selenastrum capricornutum L, Scenedesmus subspicatus, Scenedesmus quadricauda L. Procedura test Şirul concentraţiilor, în care apar efectele, este determinat pe baza rezultatelor obţinute de la mai multe serii experimentale. Două măsurători ale creşterii (biomasa, rata creşterii) rezultă în urma măsurătorilor larg dispersate ale inhibiţiei creşterii; ambele trebuie să fie utilizate în testul stabilirii de domeniu pentru ca progresia geometrică a concentraţiilor să permită estimarea atât a E(b) C

(50)cât şi E(r)E

(50). Densitatea celulară iniţială Densitatea celulară iniţială trebuie să fie de aproximativ 10^4 cel/ml Selenastrum capricornutum sau Scenedesmus subspicatus sau Scenedesmus quadricauda. Când sunt folosite alte specii biomasa trebuie să fie comparabilă. Concentraţiile substanţei test Pentru test se folosesc cel puţin 5 concentraţii în serie geometrică, la o rata a concentraţiei care să nu depăşească 2,

1. La concentraţiile cele mai mici trebuie să ne se observe mici un efect asupra cresterii algale; cele mai mari concentraţii trebuie să înhibe creşterea cu cel puţin 50% faţă de martor, în mod ideal trebuie să oprească complet creşterea. Serii şi control Testele trebuie să includă 3 serii pentru fiecare concentraţie, trei sticle de control fără substanţă şi dacă este necesar cu substanţele aditive. Performanţa testului Culturile test conţin concentraţii dorite de substanţe şi inoculul cu alge verzi. Sticlele sunt agitate şi luminate continuu. Temperatura trebuie să fie 21°-25° C +/-
2. Densitatea celulara se măsoară la cel puţin 24 h, 48 h şi 72 h de la începerea testului. pH -ul se măsoară la începutul şi sfârşitul testului. pH -ul de la testul de control nu trebuie să devieze mai mult de 1,5 unităţi în timpul testului. Test limită Folosind procedurile descrise în această metodă, o limită test poate fi executată la 100 mg/l pentru a demonstra că EC

(50)este mai mare decât această concentraţie. Dacă natura substanţei este de aşa fel încât o concentraţie de 100 mg/l în apă test nu poate fi atinsă, testul de limită trebuie să fie realizat la o concentraţie egală cu solubilitatea substanţei (sau concentraţia maximă care formează o dispersie stabilă) în mediul utilizat. Testul limită trebuie să fie realizat în cel puţin 3 serii experimentale cu acelaşi număr de control. Celelalte măsurători ale creşterii - biomasa, rata creşterii - trebuie să fie utilizate pentru testul limită. Dacă, într-un test limita se constată o scădere medie de 25% sau mai mult fie în biomasa fie în rata de creştere testul limită şi testul de control, atunci trebuie făcut un nou test. 7. Evaluare şi raportare Valorile densităţii celulare din cultura test sunt trecute în tabel alături de concentraţii şi timpul când s-au facut măsurătorile. Valorile medii ale densităţii celulare pentru fiecare concentraţie a substanţei test şi a martorului sunt reprezentate pe un sistem de coordinate în funcţie de timp; se obţine curba de creştere. Pentru determinarea relaţiei concentraţie/efect trebuie utilizate 2 abordări. Unele substanţe pot stimula creşterea la concentraţii mici, altele produc inhibiţii între 0 şi 100%. Spaţiul dintre curbele de creştere şi linia orizontală N=No se calculează cu formula: *Font9* N

(1)-N(o) N

(1)+N

(2)-2N(

1. o)N(o-1)+N(o)+2N(
2. o)A = ────────── X t

(1)+ ───────────────x(t

(2)-t

(1)+....+ ──────────────── x [t(o)-t(o-1)] 2 2 2 Unde: A = zona N(

1. o)= nr cel/ml la timpul t(
2. o)(începutul testului) N

(1)= nr de celule măsurate / ml la t

(1)N(

1. n)= nr de celule măsurate ml la t(
2. n)t

(1)= timpul primei măsurători după începutul testului t(

1. n)= timpul ultimei măsurători după începutul testului n - numărul de măsurători făcute după începutul testului Procentul inhibiţiei creşterii celulare pentru fiecare concentraţie a substanţei [I(A)] este calculat cu formula: A(
2. c)- A(
3. t)I(A) = ────────── x 100 A(
4. c)Unde: A(c)= zona dintre curba de creştere a martorului şi linia orizontală N = N(
5. o)A(
6. t)= zona dintre curba de creştere la concentraţia t şi linia orizontală N = N(
7. o)I(A) = valoarea probit care este valoarea estimată de la linia de regresie prin citirea concentraţiilor care este echivalentă cu 50% inhibiţie I(A) = 50%). Denotă că această valoare pentru această metodă de calcul este propusă ca să aibă simbolul E(
8. b)C

(50)Este esenţial ca E(b) C

(50)este fixată cu perioada de expunere adecvata de exemplu E(b) C

(50)(0-72 h) A. 2 Determinarea toxicităţii substanţelor faţă de algele verzi

1. Caracteristici ale metodei - stabileşte influenţa toxicităţii substanţelor prioritare/prioritar periculoase asupra procesului de fotosinteză al algelor verzi de tip Scenedesmus quadricauda L. şi Chlorella vulgaris L; - exclude erorile la citire. Metoda a fost pusă la punct de către ICIM şi apoi a fost standardizată. - testul se efectuează în două etape:
2. testul preliminar - în care se stabileşte domeniul de concentraţii necesar a fi experimentat;
3. testul final - ale cărui rezultat sunt înregistrate prelucrate şi interpretate. - se stabileşte potenţialul toxic al unor substanţe individuale sau în amestec faţă de reprezentanţi ai producătorilor primari, alge verzi; - rezultatele sunt folosite la stabilirea limitei maxime admisibile ale substanţelor în sistemele ecologice acvatice.
4. Principiul metodei Se urmăreşte influenţa substanţelor asupra, intensităţii procesului de fotosinteză al algelor verzi, evidenţiate prin reducerea producţiei de oxigen; producţia de oxigen este determinată după 24 h, perioadă de timp în care probele an fost ţinute în condiţii constante de temperaturii şi iluminare. Procentele de modificare a producţiei de oxigen permit evaluarea gradului de toxicitate a substanţei supusă testării, asupra organismului test. Specii test: algele verzi - Scenedesmus quadricauda L şi Chlorella vulgaris L provenite din cultura de laborator; acestea sunt specii comune sistemelor ecologice acvatice din ţara noastră, răspund bine la presiunea exercitată de substanţă şi se întreţin relativ uşor în condiţii de laborator.
5. Reactivi, sticlărie de laborator şi materiale Reactivii pentru determinarea oxigenului dizolvat în apă; metoda recomandată este STAS
6. Reactivii de precipitare: clorura de mangan sau sulfat de mangan, hidroxid de sodiu sau hidroxid de potasiu şi ioduri de potasiu. Reactivii de dizolvare şi titrate: acid sulfuric, tiosulfat de potasiu şi amidon. Apa pentru diluţii: apă aerată provenită din reţeaua de alimentare cu grad mijlociu de duritate (7°G - 8°G) şi mineralizare redusă spre medie, de aproximativ 300 mg/l reziduu fix Sticle pentru oxigen, tip Winkler, cu dop şlefuit şi etanş, cu capacitate de 200...300 ml, etalonate cu precizie până la 0,1 ml; Pipete de 1 ml şi 2 ml cu diviziuni de câte 0,1 ml; Biuretă de 50 ml şi 100 ml; Termoluminostat
7. Mod de lucru Din cultura de alge se pregăteşte o suspensie de alge verzi, cu un conţinut de aproximativ 5000 celule/ml şi se repartizează câte 50 ml din acestea la 1000 ml soluţie de testat. Se montează în sticle pentru oxigen, serii duble de probe, astfel: - prima serie de probe conţine apă de diluţie + suspensie de alge + substanţă toxică în diverse concentraţii; - a doua serie de probe conţine apă de diluţie + substanţă toxică (în concentraţii identice cu prima serie; - se montează şi 2 probe martor care conţin: apa de diluţie, iar cealaltă apă de diluţie + suspensie de alge Se introduc toate probele în termoluminostat, menţinându-se timp de 24 h la temperatura constantă de 20°C şi iluminare permanentă de 4500 - 5000 lucsi. După perioada de incubaţie se determină oxigenul dizolvat; metoda recomandată este STAS
9. Evaluarea toxicităţii substanţei investigate şi raportare Se foloseşte următoarea formulă: (OX + Ox) - (OB-Ob) Delta x = 100 x ─────────────────── (OB-Ob) unde : Delta x = modificarea producţiei de O

(2)prin fotosinteză exprimată în % la concentraţia dată; OB = concentraţia O

(2)din proba oarbă cu alge, după incubare; Ob = concentraţia O

(2)din proba oarbă, fără alge, după incubare OX = concentraţia O

(2)din proba conţinând substanţa toxică sau amestecul de substanţe şi alge, după incubare; Ox = concentraţia O

(2)din proba conţinând substanţa toxică sau amestecul de substanţe, fără alge, după incubare. Valorile Delta x negative - indică o acţiune toxică a substanţei date iar valorile Delta x pozitive - indică lipsa unei acţiuni toxice sau, în unele cazuri, ca substanţa respectivă are rol nutritiv şi compensează până la o anumita limita efectul toxic, conform figurii

1. Fig. I. Caracteristicile producţiei de oxigen în cazul unei acţiuni toxice (curba III, IV), indiferente (curba I) şi stimulatoare (curba II) a unei substanţe B. Metodologie de determinare a toxicităţii acute asupra Dafniilor Testul de toxicitate acută pentru Daphnia
2. Caracteristici ale metodei - din modulul trofodinamic reprezentat de grupul mare al consumatorilor, metodologia utilizează dafniile şi peştii; - dafniile şi peştii sunt bune indicatoare ale efectelor substanţelor prioritare/prioritar periculoase pentru poluarea acvatică; - dafniile şi peştii sunt componente ale sectorului de ciclare al substanţelor prioritare/prioritar periculoase din sistemele ecologice acvatice.
3. Definitii EC

(50)- LC

(50)pentru dafnia. Toxicitatea acută - concentraţia medie efectivă [EC

(50)] pentru imobilizare; acea concentraţie care imobilizează 50% din organismele test în timpul perioadei test. Imobilizare - numărul de animale care nu sunt capabile să înoate 15 secunde după o uşoară agitaţie în vasul test. Unităţi de măsură: greutate/volum (mg/l) sau ca greutate/greutate (mg kg^-1). Substantă de referinţă - o substanţă de referinţă poate fi testată ca o metodă de a demonstra că în condiţii de laborator sensibilitatea organismelor test nu este modificată semnificativ. 3. Principiul metodei O limită test poate fi realizată la 100 mg/l pentru a demonstra că EC

(50)este mai mare decât această concentraţie. Dafniile sunt expuse timp de 48 h la substanţa adăugată în diferite concentraţii în apă. Dacă timpul este mai scurt, trebuie să se precizeze în raport. În condiţii identice de test şi concentraţii de substanţă adecvate, la diferite concentraţii se vor obţine diferite efecte asupra capacităţii de înot a dafniei. La concentraţiile care produc 0 sau 100% imobilizare în timp de 48 h se calculează EC

(50)dacă este posibil. Se foloseşte testul static. 4. Criterii de calitate Imobilizarea organismelor martor nu trebuie să depăşească 10% la sfârşitul testului. Organismele test nu trebuie să fie la suprafaţa apei. Se recomandă ca O

(2)dizolvat din vasele test să fie peste 3 mgl^-1 şi nu mai mic de 2 mgl^-

1. Concentraţiile substanţei test vor fi menţinute în vase la 80% din concentraţiile iniţiale pe toată durata testului. Pentru substanţele care: - sunt puţin solubile; - capabile să formeze emulsii sau dispersii; - nestabile. se vor face soluţii de fiecare dată. pH -ui nu trebuie să varieze mai mult de 1 unitate.
2. Mod de lucru Reactivi Soluţiile substanţei test - se prepară în apa cunoscută sau apa distilată sau apa deionizată; se prepară soluţia stoc, din care se fac concentraţii diferite. Aparatura Vase de sticlă; Oxigenometru; Aparat pentru măsurarea temperaturii; pH-metru; Echipament pentru măsurarea duritaţii apei. Organisme test Se recomanda utilizarea Daphnia magna Straus. Se poate folosi şi Daphnia pulex De Geer. Organismele test trebuie să fie mai tinere de 24 h, la începutul testului Procedura test Se face un test preliminar pentru a alege scara de concentraţii. Expunerea dafniei se face astfel: - durata: preferabil 48 h; - număr de animale: mai puţin de 20 animale, de preferat 10; - încărcare: cel puţin 2 ml de soluţie test - concentraţia test; soluţia test trebuie preparata înainte de introducerea dafniilor, preferabil fară introducerea altui solvent decât apa; concentraţiile se fac geometric, la o rată a concentraţiei ce nu depăşeşte 2,
3. Concentraţiile care dau 0% şi 100% imobilizare după 48 h şi un domeniu de grade de imobilizare intermediare care să permită calcularea EC

(50)la 48 h trebuie să fie testate împreună cu martorul. Apa Lumina - ciclul lumina - întuneric opţional; Temperatura - temperatura test trebuie să fie 18 - 22°C ± 1°C; Aerate - nu este necesară; Hrănire - pe durata testului nu se hrănesc. pH -ul şi O

(2)se măsoară la începutul şi sfârşitul testului; Compuşii volatili trebuie testaţi în vase închise, destul de largi pentru a preveni lipsa de O

(2). Dafniile sunt urmărite cel puţin 24 h şi încă 48 h. Test limită Folosind procedurile descrise în această metodă, un test limită poate fi realizat la 100 mg/l pentru a demonstra că EC

(50)este mai mare decât acea concentraţie. Dacă natura substanţei este de aşa fel încât o concentraţie de 100 mg/l în apa test nu poate fi obţinută, testul limită trebuie să fie executat la o concentraţie egală cu solubilitatea substanţei sau concentraţia maximă care formează o dispersie stabilă în mediul utilizat. Testul limită trebuie să folosească 20 dafnii, împărţite în 2 sau 4 grupe, cu acelaşi număr de martori; dacă apare imobilizarea trebuie repetat testul. 6. Evaluare şi raportare Pentru fiecare perioadă când se înregistrează observaţiile, respectiv 24 şi 48 h procentajul de mortalitate este punctat în dreptul concentraţiei pe hârtie milimetrică. Pentru fiecare observaţie de timp, EC

(50)şi limită de confidenţă (p = 0,05) trebuie să fie estimate folosind procedurile standard; aceste valori trebuie rotunjite. În acele cazuri când panta curbei concentraţiei răspuns este prea abruptă să permită calcularea EC

(50), o estimare grafică a acestei valori este suficientă. Când la 2 concentraţii consecutive apropiate de rata 2,2, rata de imobilizare este numai de 0 şi 100%, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica domeniul în care cade EC

(50). Dacă se observă că stabilitatea sau omogenitatea substanţei test nu poate fi menţinută, aceasta trebuie înregistrată şi luată în considerare în momentul interpretării rezultatelor. Raportul va cuprinde următoarele informaţii: - Informaţii despre organismele test - nume ştiinţific, tulpină, sursă, hrănire; - Apa de diluţie şi caracteristicile importante - pH, temperatură, duritate; - Metoda de preparare a stocului şi soluţiilor test, pentru substanţele cu solubilitate mică în apă; - Concentraţiile oricăror substanţe auxiliare; - Lista concentraţiilor utilizate; - Metode folosite şi rezultatele obţinute, dacă s-a efectuat analiza chimică; - Rezultatele testului limită, dacă s-a făcut; - Descrierea echipamentului test; - Regimul de iluminare; - Dacă au fost îndeplinite criteriile de calitate; - Un tabel care să conţină numărul de dafnii imobilizate, concentraţia, timpul; - Graficul care reprezintă curba relaţiei concentraţie/răspuns la sfârşitul testului; - Procedura statistică de determinare a valorii EC

(50); - Substanţa de referinţă utilizată; - Cea mai mare concentraţie care nu a indus imobilizare în timpul perioadei test; - Cea mai mica concentraţie test care a provocat 100% imobilizare în perioada test C. Metodologia de determinare a toxicităţii acute asupra peştilor

1. Caracteristici ale metodei - determină toxicitatea acută letală a substanţelor pentru peştii din apele de suprafaţă; - necesită cunoaşterea proprietăţilor fizico-chimice ale substanţelor investigate: solubilitatea în apă, presiunea vaporilor, stabilitatea chimică, biodegradabilitatea, pentru selectarea celei mai adecvate metode test - statică, semi-statică sau curgere continuă - în scopul asigurării concentraţiilor constante de substanţă pe toată durata testului; - oferă informaţii referitoare la formula chimică, gradul de puritate, natura şi procentele semnificative de impurităţi, prezenţa şi cantităţile aditivilor, coeficientul de partiţie n- octanol / apa, trebuie luate în considerare pentru organizarea testului şi interpretarea rezultatelor.
2. Definiţii Toxicitate acută - decelarea efectelor negative asupra organismelor într-un timp scurt (96 h) în prezenţa substanţei testate; se exprimă prin concentraţia medie letală. [CL

(50)] - concentraţia substanţei din apa care omoară 50 % din peştii test într-o perioadă de expunere continuă. Unităţi de măsură: exprimate în greutate / volum ( mg/l) sau greutate / greutate (mg/kg). 3. Principiul metodei O limită test poate fi efectuată la 100 mg/l substanţă pentru a demonstra că CL

(50)este concentraţia mai mare decât această concentraţie. Peştii sunt expuşi la substanţa test dizolvată în apă într-un şir convenabil de concentraţii pentru o perioadă de 96 h; mortalităţile sunt înregistrate la intervale de cel puţin 24 h, iar concentraţiile ce omoară 50 % din peşti [CL

(50)] sunt necesare pentru fiecare observaţie. 4. Criterii de calitate Mortalităţile la lotul de control nu trebuie să depăşească 10 % (sau un peşte dacă sunt folosiţi mai puţin de 10) ta sfârşitul testului. Saturaţia O

(2)dizolvat trebuie să fie > 60 %. Concentraţiile substanţelor test vor fi menţinute până la 80 % din concentraţia iniţială pe toată durata testului. Pentru substanţele care se dizolvă uşor în mediu sau sunt stabile, concentraţia iniţială este considerată fiind echivalentul concentraţiei nominale. Se vor preciza concentraţiile folosite pe toata durata testului şi ce condiţii experimentale au fost îndeplinite. Pentru substanţe care: - au solubilitate redusă în mediu test; - sunt capabile să formeze emulsii sau dispersii stabile; - sunt nestabile în soluţii apoase, concentraţia iniţială va fi luată ca concentraţie măsurată în soluţie la începutul testului. Concentraţia va fi determinată după o perioadă de stabilizare, dar înainte de a introduce peştii. În toate cazurile măsurătorile ce se fac, pe toată durata testului, trebuie să confirme că, la concentraţia reală de expunere, pH -ul nu variază cu mai mult de o unitate. 5. Mod de lucru Metoda test poate fi de 3 tipuri: * test static - Este testul de toxicitate în care soluţia test nu se schimbă (Soluţiile rămân neschimbate pe toata durata testului); * test semi-static - Este testul de toxicitate, în care soluţiile test sunt înnoite în mod regulat (de ex. la 24 h); * test cu curgere continuă - Testul de toxicitate în care apa este înnoită permanent în acvariile test. Reactivi Soluţiile substanţei test: Soluţia stoc - se prepară prin dizolvarea substanţei în apa deionizată; Concentraţiile alese - se prepară din soluţia stoc prin diluare; dacă se lucrează cu concentratii mari, substanţa poate fi dizolvată direct în apa de diluţie. Pentru obţinerea acestor concentraţii trebuie să se cunoască gradul de solubilitate. Substanţele trebuie să fie testate până la limita de solubilitate. Pentru unele substanţe, precum substanţele cu solubilitate scăzută sau cele care formează dispersie stabilă, se prepară o concentraţie deasupra limitei de solubilitate a substanţei pentru a se asigura că se obţine acea concentraţie maxima solubilă / stabilă, fară ca această, concentraţie să perturbe altfel sistemul (ex. filmul de substanţă de la suprafaţa apei împiedică oxigenarea apei). Dispersia ultrasonică poate fi utilizată, în cazul substanţelor cu solubilitate mică în apă, la prepararea soluţiilor stoc. Când sunt folosite substanţe auxiliare, toate concentraţiile test trebuie să conţină aceiaşi cantitate de substanţă auxiliară. Martorii trebuie expuşi la aceiaşi concentraţie de substanţe auxiliare asemănătoare celor utilizate în seriile test. Concentraţia substanţelor auxiliare trebuie să fie minimă, fără a depăşi 100 mg /l în mediul test. Testul trebuie realizat fără ajustarea pH -ului. Dacă există o schimbare evidentă a pH-ului este necesar ca testul să se repete cu un pH ajustat, iar rezultatele să fie înregistrate. În acest caz valoarea pH-ului soluţiei stoc trebuie să se ajusteze la valoarea pH-ului din apa de diluţie. Pentru acest scop se prefera HCl şi NaOH. Ajustarea pH-ului trebuie să fie făcută astfel încât concentraţia substanţei test din soluţia stoc să nu fie modificată semnificativ. Trebuie, de asemenea, înregistrată orice reacţie chimică sau precipitare fizică a compusului test, datorate ajustării pH-ului. Apa de diluţie Se foloseşte apa potabilă, necontaminată cu concentraţii cu potenţial de risc clor, metale grele sau alte substanţe, apa naturală de bună calitate sau apa reconstituită. Apa trebuie să aibă duritatea cuprinsă între 10 şi 250 mg /l [CaCO

(3)] şi pH-ul cuprins între 6,0 şi 8,5. Aparatura - Toată aparatura să fie din material inert chimic. - Sistem automatic de diluţie - Dozator de O

(2)- Echipament pentru determinarea durităţii apei - Echipament adecvat pentru menţinerea temperaturii - pH- metru Peştii - test Peştii trebuie să fie sănătoşi, fără malformaţii, selecţionaţi după criterii de vârstă, posibilitate de întreţinere, sensibilitate relativă la substanţele chimice, comoditate pentru testare, factori economici, factori biologici, posibilitatea de comparare a datelor obţinute cu cele existente pe plan internaţional. Pregătirea materialului de experimentare Trebuie ca peştii să provină dintr-un singur stoc, să aibă aproximativ aceiaşi lungime şi vârstă, să fie ţinuţi cel puţin 12 zile în condiţiile următoare: - de recirculare sau curgere continuă, potrivit sistemului; - apa; - lumina - 12 până la 16 ore iluminare zilnică; - concentraţia O

(2)dizolvat: cel puţin 80 % saturaţie; - hrănire de 3 ori pe săptămână, încetând hrănirea lor cu 24 h înainte de începerea testului. Mortalitate În intervalul de 48 h de la introducerea în acvarii de acomodare se înregistrează mortalităţile şi se aplică următoarele criterii:

1. mortalităţi mai mari de 10 % din populaţie în 7 zile conduce la eliminarea întregului lot;
2. mortalităţi între 5 şi 10 % din populaţie conduce la continuarea perioadei de acomodare încă 7 zile; dacă nu se mai înregistrează mortalităţi, lotul este acceptat, altfel este eliminat întregul lot.
3. mortalităţi mai mici de 5 % din populaţie conduce la acceptarea întregului lot. Adaptare Toţi peştii trebuie menţinuţi în apă de calitate şi temperatură constantă timp de 7 zile, înainte de începerea testului. Procedura test Se face un test preliminar cu scopul de a obţine informaţii despre şirul de concentraţii ce trebuie utilizat în testul principal. În cazul în care sunt folosite substanţe auxiliare pentru mărirea gradului de solubilitate a substanţelor greu solubile se montează o probă martor (test de control). În funcţie de proprietăţile fizico - chimice ale substanţei test trebuie selectată cea mai adecvată dintre metodele enunţate mai sus. Peştii sunt expuşi la acţiunea substanţelor după cum urmează: * durata - 96 h; * număr peşti: cel puţin 7 pentru fiecare concentraţie; * acvarii de capacitate convenabilă în relaţie cu încărcarea cu animale de experimentare; * încărcare: maxim 1 g /l pentru teste statice şi semi-statice, iar pentru cele cu curgere continuă încărcarea poate fi mai mare; * concentraţia test: cel puţin 5 concentraţii care diferenţiate printr-un factor de maxim 2,2 şi pe cât posibil extinse pe domeniul care să acopere de la 0 la 100 % mortalitate; * apa; vezi pct 7; * lumina: 12 până la 16 h zilnic; * temperatura: conform speciei, dar ± 1°C în orice test; * concentraţia O

(2)dizolvat: numai puţin de 60 % saturaţie O

(2); * hrănire: nu, Peştii sunt urmăriţi după primele 2 - 4 ore şi cel puţin la intervale de 24 ore. Peştii sunt consideraţi morţi, dacă la atingerea înotătoarei codale nu apare nici o reacţie şi nu sunt vizibile mişcările respiratorii. Se notează peştii morţi şi sunt îndepărtaţi din acvarii. Se notează şi anomaliile vizibile - pierderea echilibrului, înotul, funcţia respiratorie, pigmentaţia Zilnic se măsoară pH, O

(2)dizolvat, temperatura. Test limita Folosind procedurile descrise, o limită test poate fi stabilită la 100 mg/l pentru a demonstra că CL

(50)este mai mare decât această concentraţie. Dacă natura substanţei este astfel încât o concentraţie 100 mg /l în apa test nu poate fi atinsă, limita test trebuie stabilită la o concentraţie egală cu solubilitatea substanţei sau maxim de concentraţie ce formează o dispersie stabilită în mediul folosit. Pentru testul limită se foloseşte acelaşi număr de peşti - 7-10 peşti - ca şi pentru testul martor; teoria distribuţiei binomiale stabileşte ca în cazul când se folosesc 10 peşti cu zero mortalitate există un grad de încredere de 99,9 % ca CL

(50)este mai mare decât concentraţia folosită în testul limită. Dacă se folosesc 7-8-9 peşti, absenţa mortalităţii asigură un grad de încredere de cel puţin 99 % însemnând că CL

(50)este mai mare decât concentraţia folosită. Dacă se instalează letalităţi, trebuie dezvoltat un studiu complex. Dacă sunt observate efecte subletale acestea trebuie notate. 6. Evaluare şi raportare Pentru fiecare perioadă pentru care s-au făcut observaţii se reprezintă grafic procentul de mortalitate (24, 48, 72 şi 96 h ) pentru fiecare perioadă de expunere faţă de concentraţie în scara logaritmică. Când este posibil şi pentru fiecare timp de observaţie, CL

(50)şi limitele de confidenţă (p - 0,05) trebuie estimate prin folosirea procedurilor standard; aceste valori trebuie rotunjite la unitate sau la mai mult de 2 cifre semnificative. În acele cazuri în care panta curbei concentraţie / mortalitate este prea înclinată pentru a permite calculul lui CL

(50), o estimare grafică a acestei valori este suficientă. Când 2 concentraţii consecutive într-un raport de 2,2 dau numai 0% şi 100 % mortalitate, aceste 2 valori sunt suficiente pentru a indica intervalul în care se situează CL

(50). Dacă s-a observat că stabilitatea şi omogenitatea substanţei test nu poate fi menţinută, aceasta trebuie notată şi avută în vedere la interpretarea rezultatelor. Raportul trebuie să includă următoarele informaţii: * informaţii privitoare la organismele test - nume ştiinţific, specie, gen, mărime, numărul folosit pentru fiecare concentraţie; * sursa pentru apa de diluţie şi caracteristicile chimice principale - pH, duritate, temperatura; * în cazul substanţelor cu solubilitate scăzută în apa, se trece metoda de preparare a soluţiei stoc şi a soluţiilor test; * concentraţia oricărei substanţe auxiliare; * lista de concentraţii folosite şi orice alte informaţii utilizabile privitoare la stabilitatea concentraţiilor substanţelor chimice testate în soluţia test; * dacă se fac analize chimice sunt date metodele utilizate şi rezultatele obţinute; * rezultatul testului limită dacă s-a efectuat; * motivaţia alegerii şi detaliile procedurii test utilizate (static, semi-static, cu curgere continuă, doza - rata, viteza curgerii, încărcarea cu peşti, dacă apa este aerată); * descrierea echipamentului; * regimul de iluminare; * concentraţia O

(2)dizolvat, valorile pH şi temperatura la fiecare 24 h; * evidenţa că criteriile de calitate au fost îndeplinite; * un tabel ce indică mortalitatea cumulativă la fiecare concentraţie şi la martor (şi martor pentru substanţa auxiliară folosită, dacă se cere) la fiecare timp de observaţie recomandat; * graficul curbei concentraţie / procentaj răspuns la sfârşitul testului; * valorile CL

(50)la fiecare timp de observaţie recomandat (cu 95 % limită de confidenţă); * procedurile statistice utilizate pentru determinarea LC

(50); * dacă este folosită o recomandare privitoare la substanţă, trebuie menţionat rezultatul obţinut; * concentraţia cea mai mare a testului, care nu provoacă mortalitate pe toată durata testului; * cea mai mică concentraţie ce provoacă 100% mortalitate pe perioada testului. D. Metodologia de determinare a toxicităţii cronice asupra peştilor - metoda de colorare hematoxitina eozină

1. Principiul metodei Pentru evidenţierea efectelor cronice ale substanţelor prioritare/prioritar periculoase s-a ales metoda de colorare hematoxilină - eozină, fiind o metodă accesibilă, permiţând decelarea efectelor structurale la nivelul mai multor organe vitale - branhie, intestin subţire, ficat, rinichi, musculatură. Utilizarea acestei metode necesită personal special calificat, deoarece nu este o metodă de rutină.
2. Mod de lucru Reactivi alcool etilic absolut formol acetonă benzen hematoxilină eozină albumină parafină Aparatura Microtom; termostat cu includere în parafină plita pentru întinderea secţiunilor microscop aparat de fotografiat Sticlărie vase Borel lame lamele Specia test - Cyprinus carpio L (crap), Metodologia de intoxicare Lotul de peşti supus experimentării a fost introdus în acvarii cu capacitatea de 30 l; în fiecare acvariu s-au introdus câte 20 de organisme. Concentraţiile utilizate sunt subletale; alegerea concentraţiilor depinde de caracteristicile substanţei investigate. Testele cronice se desfăşoară în regim static. Metoda de prelevare Prelevarea peştilor intoxicaţi pentru investigaţiile histopatologice se face la intervale de 30 zile. Procedura test Recoltarea peştilor pentru analiza histopatologică se face la 30, 60, 90, 120 şi respectiv 150 zile minim până la maxim un an. Obţinerea preparatelor histologice - impune recoltarea fragmentelor de organe şi prelucrarea lor după o tehnică de prelucrare histopatologică. După disecţia peştelui se prelevează fragmente de branhii, ficat, intestin subţire, rinichi, musculatură, deoarece sunt organe vitale şi totodată organe ţintă pentru orice substanţă care se acumulează sau are efect toxic. Fixare Fragmentele de organe obţinute în urma disecţiei sunt fixate în formol 10 %, pentru oprirea proceselor de degradare ce survin după moarte. Deshidratare şi clarificare După fixare, piesele sunt deshidratate în baie de alcool etilic, de concentraţii crescătoare (70°, 90°, 100°); după deshidratare fragmentele de organe sunt clarificate în acetonă şi benzen. Piesele deshidratate şi clarificate sunt incluse în parafină şi menţinute la temperatură constantă de 57°C. Blocurile de parafină, ce conţin fragmentele de organe, sunt secţionate la microtom; grosimea secţiunilor este cuprinsă între 5 - 6 æ. Colorare cu hematoxilină eozină Secţiunile sunt întinse pe lame unse cu albumină Mayer şi sunt ţinute la termostat cu includere în parafină 5 - 24 h, la o temperatură constantă de 37°C. Pentru decelarea efectelor produse de substanţele investigate este necesară colorarea secţiunilor şi obţinerea preparatelor fixe. În acest sens, lamele cu secţiunile de organe sunt deparafinate în benzen. Apoi sunt trecute prin băi succesive de alcool etilic de concentraţii descrescătoare (100°, 90°, 70°), cu scopul de a elimina solventul parafinei, ultima baie fiind cu apă distilată. Secţiunile sunt colorate cu hematoxilină şi eozină. Aceşti coloranţi evidenţiază componentele celulare, ca nucleul şi citoplasma. După colorare, secţiunile sunt deshidratate în alcool etilic de concentraţii crescătoare (70°, 90°, 100°) şi, clarificate în benzen. Preparatele microscopice sunt montate în balsam de Canada devenind preparate fixe.
3. Examinare şi raportare Se realizează examinarea la microscopul optic şi se compara cu martorul. Modificările celulare se descriu detaliat şi se fotografiază. -------------