NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...

(2)Autoritatea veterinara centrala va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii, orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...

(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa ----- la norma veterinara ------------------- Partea A DETERMINAREA AMINOACIZILOR

1. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea aminoacizilor liberi (de sinteza şi naturali) şi totali (peptide legate şi libere) din furaje, utilizand un analizor de aminoacizi. Aceasta se aplică urmatorilor aminoacizi: cist(e)ina, metionina, lizina, treonina, alanina, arginina, acid aspartic, glicina, histidina, izoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirozina şi valina. Metoda nu face distinctie între sarurile de aminoacizi şi nu permite diferentierea între formele D (dextrogire) şi L (levogire) de aminoacizi. Aceasta nu este valabila pentru determinarea triptofanului sau a aminoacizilor hidroxianalogi.
2. Principiu 2.
3. Aminoacizi liberi Aminoacizii liberi sunt extrasi cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele de azot coextrase sunt precipitate cu acid sulfosalicilic şi indepartate prin filtrare. Solutia filtrata este adusa la pH 2,
4. Aminoacizii sunt separati prin cromatografie prin schimb ionic şi se determina prin reactia cu ninhidrina şi detectare fotometrica la o lungime de unda de 570 nm. 2.
5. Aminoacizi totali Procedura aleasa depinde de aminoacizii examinati. Cist(e)ina şi metionina trebuie să fie oxidate până la acid cisteic şi respectiv metionin sulfona anterior hidrolizei. Tirozina trebuie să fie determinata în hidrolizate de probe neoxidate. Toţi ceilalti aminoacizi descrisi la punctului 1 pot fi determinati în oricare proba oxidata sau neoxidata. Oxidarea este efectuata la 0°C cu un amestec de acid performic/fenol. Excesul de reactiv de oxidare este descompus cu disulfit de sodiu. Proba oxidata sau neoxidata este hidrolizata cu acid clorhidric (c = 6 mol/l) timp de 23 de ore. Hidrolizatul este adus la pH 2,
6. Aminoacizii sunt separati prin cromatografie cu schimbatori de ioni şi determinati prin reactia cu ninhidrina utilizand detectarea fotometrica la lungimea de unda de 570 nm (440 nm pentru prolina).
7. Reactivi Trebuie să se utilizeze apa bidistilata sau apa de calitate echivalenta (conductivitate < 10 æS). 3.
8. Peroxid de hidrogen, w = 30% 3.
9. Acid formic, w = 98-100% 3.
10. Fenol 3.
11. Disulfit de sodiu 3.
12. Hidroxid de sodiu 3.
13. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat 3.
14. Acid clorhidric, densitate aproximativ 1,18 g/ml 3.
15. Citrat de trisodiu dihidrat 3.
16. 2,2'-Tiodietanol (tiodiglicol) 3.
17. Clorura de sodiu 3.
18. Ninhidrina 3.
19. Eter de petrol cu interval de fierbere 40-60°C 3.
20. Norleucina sau alt compus corespunzător pentru a fi utilizat ca standard intern. 3.
21. Azot gazos (< 10 ppm oxigen) 3.
22. 1-Octanol 3.
23. Aminoacizi 3.16.
24. Substante standard enumerate la punctul
25. Compusi puri ce nu conţin apa de cristalizare. Se usuca sub vid sub flux de P

(2)O

(5)sau H

(2)SO

(4)timp de o săptămâna înainte de utilizare. 3.16.2. Acid cisteic 3.16.3. Metionin sulfona 3.17. Solutie hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l: Se dizolva 300 g NaOH (3.5.) în apa şi se aduce la 1 litru. 3.18. Solutie hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l: Se dizolva 40 g NaOH (3.5.) în apa şi se aduce la 1 litru. 3.19. Solutie acid formic - fenol: Se amesteca 889 g acid formic (3.2) cu 111 g apa şi se adauga 4,73 g fenol (3.3). 3.20. Amestec de hidroliza, c = 6 mol HCl/l ce contine 1 g fenol/l: Se adauga 1 g fenol (3.3) la 492 ml HCl (3.7) şi se aduce la 1 litru cu apa. 3.21. Amestec de extractie, c = 0,1 mol HCl/l ce contine 2% tiodiglicol: Se iau 8,2 ml HCl (3.7), se dilueaza cu aproximativ 900 ml apa, se adauga 20 ml tiodiglicol (3.9) şi se aduce la 1 litru cu apa, (nu se amesteca direct 3.7 şi 3.9). 3.22. Acid 5-sulfosalicilic, beta = 6%: Se dizolva 60 g acid 5-sulfosalicilic (3.6) în apa şi se aduce la 1 litru cu apa. 3.23. Amestec de oxidare (Acid performic-fenol): Se amesteca 0,5 ml peroxid de hidrogen (3.1) cu 4,5 ml solutie de acid formic-fenol (3.19) într-un pahar mic. Se incubeaza la 20-30°C timp de 1 ora pentru obtinerea acidului performic, apoi se raceste pe o baie de apa cu gheata (15 min) înainte de adaugarea la proba. Atenţie: Se evita contactul cu pielea şi se poarta haine de protecţie. 3.24. Tampon citrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Se dizolva 19,61 g citrat de sodiu (3.8), 5 ml tiodiglicol (3.9), 1 g fenol (3.3) şi 16,50 ml HCl (3.7) în aproximativ 800 ml apa. Se aduce pH-ul la 2,20. Se aduce la 1 litru cu apa. 3.25. Tampoane de elutie preparate în conformitate cu condiţiile prevăzute pentru analizorul utilizat (4.9). 3.26. Reactiv ninhidrina preparat în conformitate cu condiţiile prevăzute pentru analizorul utilizat (4.9). 3.27. Solutii etalon de aminoacizi. Aceste solutii trebuie să fie pastrate la o temperatura mai mica de 5°C. 3.27.1. Solutie standard stoc de aminoacizi (3.16.1) c = 2,5 æmol/ml din fiecare în acid clorhidric. Poate fi obtinuta comercial. 3.27.2. Solutie standard stoc de acid cisteic şi metionin sulfona c = 1,25 æmol/ml. Se dizolva 0,2115 g acid cisteic (3.16.2) şi 0,2265 g metionin sulfona în tampon citrat (3.24), într-un balon cotat de 1 litru şi se aduce la semn cu tampon citrat. Se păstrează la o temperatura mai mica de 5°C maxim 12 luni. Aceasta solutie nu poate fi utilizata dacă solutia standard stoc (3.27.1) contine cisteic şi metionina sulfona. 3.27.3. Solutie standard stoc a standardului intern, ex. norleucina c = 20 æmol/ml. Se dizolva 0,6560 g norleucina (3.13) în tampon citrat (3.24), într-un balon cotat şi se aduce la 250 ml cu tampon citrat. Se păstrează la o temperatura mai mica de 5°C timp de maxim 6 luni. 3.27.4. Solutie de etalonare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c = 5 nmol/50 æl de acid cisteic şi metionin sulfona şi c = 10 nmol/50 æl a altor aminoacizi. Se dizolva 2,2 g clorura de sodiu (3.10) într-un pahar gradat de 100 ml cu 30 ml tampon citrat (3.24). Se adauga 4,00 ml solutie standard stoc de aminoacizi (3.27.1), 4,00 ml solutie standard stoc de acid cisteic şi metionina sulfona (3.27.2.) şi 0,50 ml solutie standard stoc de standard intern, (3.27.3) dacă este utilizat. Se aduce pH-ul la 2,20 cu hidroxid de sodiu (3.18). Se transfera cantitativ, într-un balon cotat de 50 ml şi se aduce la semn cu tampon citrat (3.24) şi se amesteca. Se păstrează la o temperatura mai scazuta de 5°C, timp de maxim 3 luni. Vezi de asemenea observatiile de la punctul 9.1. 3.27.5. Solutie de etalonare a aminoacizilor standard pentru utilizarea cu hidrolizate preparate în conformitate cu punctul 5.3.3.1. şi destinate a fi utilizate cu extracte (5.2). Solutia de etalonare este preparata în conformitate cu punctul 3.27.4, dar fără clorura de sodiu. Se păstrează la o temperatura mai scazuta de 5°C, timp de maxim 3 luni. 4. Aparatura 4.1. Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml prevăzut cu refrigerent de reflux. 4.2. Flacon de sticlă borosilicica, cu capac filetat, cu garnitura de cauciuc/teflon, (ex. Duran, Schott) pentru utilizare în etuva. 4.3. Etuva cu ventilatie fortata şi regulator de temperatura, cu o precizie mai mare de ±2°C. 4.4. pH - metru (gradatie de trei zecimale) 4.5. Filtru cu membrana (0,2 æm) 4.6. Centrifuga 4.7. Evaporator rotativ cu vid 4.8. Agitator mecanic sau magnetic 4.9. Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloana schimbatoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrina, derivatie post-coloana şi detector fotometric. Coloana este prevăzută cu rasini polistiren sulfonate, pentru separarea diferitilor aminoacizi unul de celalalt şi din alte materiale ninhidrin pozitive. Debitul de tampon şi ninhidrina este asigurat de pompe având un grad de stabilitate a fluxului de ±0,5% în perioada ce acopera ambele solutii standard de etalonare şi de analiza a probei. Cu aceleasi analizoare de aminoacizi se pot utiliza metode de hidroliza în care hidrolizatul are o concentraţie de sodiu de c = 0,8 mol/l şi contine tot acidul formic rezidual provenit din oxidare. Altele nu pot asigura o separare satisfăcătoare a unor aminoacizi, dacă hidrolizatul contine exces de acid formic şi/sau concentraţie crescuta a ionilor de sodiu. În acest caz volumul de acid este redus prin evaporare la aproximativ 5 ml, după hidroliza şi anterior de ajustarea pH-ului. Evaporarea trebuie să se faca sub vid, la maxim 40°C. 5. Metoda de lucru 5.1. Prepararea probei Proba este macinata pentru a trece printr-o sita de 0,5 mm. Probele cu umiditate ridicata trebuie, înainte de macinare, uscate fiecare la aer, la o temperatura ce maxim 50°C sau prin liofilizare. Probele cu un continut mare în grasimi trebuie extrase cu eter de petrol (3.12), înainte de macinare. 5.2. Determinarea aminoacizilor liberi din furaje şi premixuri Se cantareste, cu o precizie de 0,2 mg, o cantitate corespunzătoare (1-5

1. g)de proba preparata (5.1), într-un pahar conic şi se adauga 100,0 ml amestec de extractie (3.21). Se agita amestecul timp de 60 minute utilizand un agitator mecanic sau un agitator magnetic (4.8). Sedimentul se lasă să se decanteze şi se pipeteaza 10 ml din solutia de supernatant într-un pahar de 100 ml. Se adauga 5 ml solutie de acid sulfosalicilic (3.22) agitandu-se şi se continua să se agite cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtreaza sau se centrifugheaza supernatantul pentru indepartarea oricărui precipitat. Se pun 10 ml din solutia ce rezultă într-un pahar de 100 ml şi se aduce pH-ul la 2,20, utilizandu-se solutie de hidroxid de sodiu (3.18). Se transfera într-un balon cotat de volum corespunzător, utilizandu-se tampon citrat (3.24) şi se aduce la semn cu solutie tampon (3.24). Dacă este utilizat un standard intern, se adauga 1,00 ml standardul intern (3.27.3) pentru fiecare 100 ml solutie finala şi se aduce la semn cu solutie tampon (3.24). Se trece la etapa de cromatografie în conformitate cu punctul 5.4. Dacă extractele existente nu sunt examinate în aceeasi zi, acestea trebuie să fie pastrate la o temperatura mai scazuta de 5°C. 5.3. Determinarea aminoacizilor totali 5.3.1. Oxidare Se cantareste cu o precizie de 0,2 mg, de la 0,1 la 1 g de proba preparata (5.1) într-un: (
2. i)balon cu fund rotund de 100 ml (4.1), pentru hidroliza deschisa (5.3.23) sau, (îi) balon cu fund rotund de 250 ml (4.1), dacă se cere o concentraţie scazuta de sodiu (5.3.3.1) sau, (iii) flacon de 100 ml prevăzut cu un capac filetat (4.2) (pentru hidroliza inchisa 5.3.2.4.) Partea de proba cantarita trebuie să aibă un continut în azot de aproximativ 10 mg şi un continut în umiditate de maxim 100 mg. Se pune balonul/flaconul pe o baie de apa cu gheata şi se raceste la 0°C, se adauga 5 ml amestec de oxidare (3.23) şi se amesteca utilizand o spatula de sticlă cu extremitatea indoita. Se inchide ermetic balonul/flaconul ce contine spatula cu ajutorul unui film etans (la aer), se pune baia de apa cu gheata ce contine recipientul inchis în frigider la 0°C şi se lasă timp de 16 ore. După 16 ore se scoate din frigider şi se descompune excesul de reactiv de oxidare prin adaugarea de 0,84 g disulfit de sodiu (3.4). Se continua ca la punctul 5.3.2.1. 5.3.2. Hidroliza 5.3.2.1. Hidroliza probelor oxidate La proba oxidata preparata în conformitate cu punctul 5.3.1, se adauga 25 ml amestec hidrolizat (3.20), avandu-se grija să se spele orice reziduu ce adera la suprafaţa vasului şi a spatulei. În functie de procedura de hidroliza utilizata se continua în conformitate cu punctele 5.3.2.3. sau 5.3.2.4. 5.3.2.2. Hidroliza probelor neoxidate Se cantareste în oricare balon cu fund rotund de 250 ml sau de 100 ml (4.1) sau într-un flacon de 100 ml prevăzut cu un capac filetat (4.2), cu o precizie de 0,2 mg de la 0,1 la 1 g de proba preparata (5.1). Partea de proba cantarita trebuie să aibă un continut de azot de aproximativ 10 mg. Se adauga cu atenţie 25 ml amestec de hidroliza (3.20) şi se amesteca cu proba. Se continua în conformitate cu punctele 5.3.2.3. sau 5.3.2.4. 5.3.2.3. Hidroliza deschisa Se adauga 3 bile de sticlă amestecului din balon (preparat în conformitate cu punctele 5.3.2.1 sau 5.3.2.2) şi se fierbe cu clocotire continua timp de 23 ore. În completarea hidrolizei se spala condensatorul cu 5 ml tampon citrat (3.24). Se deconecteaza balonul şi se raceste intr-o baie cu gheata. Se continua în conformitate cu punctul 5.3.3. 5.3.2.4. Hidroliza inchisa Se pune flaconul ce contine amestecul preparat în conformitate cu punctele 5.3.2.1 sau 5.3.2.2 intr-o etuva (4.3) la 110°C. În timpul primei ore, pentru a se preveni cresterea presiunii (datorita emanarii substanţelor gazoase) şi pentru a evita explozia, se pune capacul filetat la partea superioara a recipientului. Nu se inchide recipientul cu capac. După o ora se inchide recipientul cu capacul şi se lasă în etuva (4.3) timp de 23 de ore. În completarea hidrolizei se scoate flaconul din etuva, se scoate cu atenţie capacul flaconului şi acesta se pune pe o baie de apa cu gheata. Se lasă la rece. În functie de procedura adoptata, pentru ajustarea pH-ului (5.3.3) se transfera gradual conţinutul din flacon într-un pahar gradat de 250 ml sau într-un balon cu fund rotund de 250 ml, utilizandu-se tampon citrat (3.24). Se continua în conformitate cu punctul 5.3.3. 5.3.3. Ajustarea pH-ului În functie de toleranta analizorului de aminoacid la sodiu, (4.9) se continua în conformitate cu punctele 5.3.3.1 sau 5.3.3.2., pentru ajustarea pH-ului 5.3.3.1. Pentru sistemele cromatografice (4.9) ce necesita o concentraţie mica de sodiu: Se recomanda să se utilizeze o solutie standard stoc interna (3.27.3) atunci când sunt folosite analizoare de aminoacizi ce necesita o concentraţie mica de sodiu (când volumul acidului trebuie să fie redus). În acest caz se adauga hidrolizatului inaintea evaporarii 2,00 ml solutie standard stoc interna (3.27.3). Se adauga 2 picaturi de 1-octanol (3.15) hidrolizatului obţinut în conformitate cu punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4. Utilizandu-se un evaporator rotativ (4.7) se reduce volumul la 5-10 ml, sub vacuum, la 40°C. Dacă volumul este redus accidental la mai puţin de 5 ml, hidrolizatul trebuie eliminat şi analiza reluata. Se aduce pH-ul la 2,20 cu solutie de hidroxid de sodiu (3.18) şi se continua cu punctul 5.3.4. 5.3.3.2. Pentru toţi ceilalti analizori de aminoacizi (4.9) Se iau hidrolizatele obtinute în conformitate cu punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4 şi se neutralizeaza parţial cu atenţie, adaugandu-se şi agitandu-se, 17 ml solutie hidroxid de sodiu (3.17) asigurandu-se ca temperatura este mentinuta sub 40°C. Se aduce pH-ul la 2,20, la temperatura camerei, utilizandu-se solutie de hidroxid de sodiu (3.17) şi în final solutie de hidroxid de sodiu (3.18). Se continua la punctul 5.3.4. 5.3.4. Solutia din proba pentru cromatografie Se transfera gradual hidrolizatul adus la pH (5.3.3.1 sau 5.3.3.2) cu solutie tampon citrat (3.24) într-un balon gradat de 200 ml şi se aduce la semn cu tampon (3.24). Dacă intern nu a fost inca utilizat un standard se adauga 2,00 ml standard intern (3.27.3) şi se aduce la semn cu tampon citrat (3.24). Se amesteca în intregime. Se procedeaza la etapa de cromatografie (5.4). Dacă solutiile probei existente nu sunt examinate în aceeasi zi, acestea trebuie să fie pastrate la o temperatura mai scazuta de 5°C. 5.4. Cromatografie Înainte de cromatografie se aduce extractul (5.2) sau hidrolizatul (5.3.4) la temperatura camerei. Se agita amestecul şi se filtreaza o cantitate potrivita printr-un filtru cu membrana de 0,2 æm (4.5). Solutia clara obtinuta este supusă cromatografiei cu schimbatori de ioni, utilizandu-se un analizor de aminoacizi (4.9). Injectia poate fi executata manual sau mecanic. Este important ca aceeasi cantitate de solutie ±0,5% să fie adăugată la coloana, pentru ca analiza de standarde şi probe, cu excepţia cazului în care se utilizeaza un standard intern şi rapoartele sodiu/aminoacid din solutiile standard şi proba să fie, pe cat posibil, similare. În general frecventa injectiilor depinde de stabilitatea reactivului ninhidrina şi a sistemului de analiza. Standardul sau proba este diluata cu tampon citrat (3.24) pentru a realiza o arie a picului standardului de 30-200% din aria picului probei de aminoacid. Cromatografia aminoacizilor se modifica usor în conformitate cu tipul de analizor intrebuintat şi rasina utilizata. Sistemul ales trebuie să permită separarea aminoacizilor unii de altii şi din materiile pozitive la ninhidrina. În cursul operaţiunii, sistemul cromatografie trebuie să dea un răspuns linear la schimbările privind cantitatile de aminoacizi adaugati la coloana. În timpul etapei de cromatografie raportul dintre partea superioara şi partea inferioara a curbei menţionate mai jos, se aplică atunci când este analizata o solutie echimolară (a aminoacizilor existenti determinati). Aceasta solutie echimolară trebuie să conţină cel puţin 30% din sarcina maxima a fiecarui aminoacid ce poate fi masurat cu precizie cu ajutorul sistemului analizorului de aminoacizi (4.9). Pentru separarea treoninei de serina, raportul dintre partea inferioara şi picul curbei a celor mai de jos 2 aminoacizi de pe cromatograma, suprapusi parţial, nu trebuie să depăşească raportul 2:10 (dacă sunt determinate numai cist(e)ina, metionina, treonina şi lizina). Separarea insuficienta de picurile vecine influenţează nefavorabil determinarea. Pentru toţi ceilalti aminoacizii separarea trebuie să fie mai buna de 1:10. Sistemul trebuie să asigure ca lizina este separata de artefactele de lizina şi ornitina. 6. Calcularea rezultatelor Aria picurilor probei şi a standardului este masurata pentru fiecare aminoacid individual şi este calculată cantitatea în g aminoacid/kg proba: A x E x MW x F -------------- = g aminoacid/kg proba B x W x 1000 Dacă este utilizat un standard intern se multiplica cu: D/C A = aria picului de hidrolizat sau extract B = aria picului solutiei standard de etalonare C = aria picului standardului intern în hidrolizat sau extract D = aria picului standardului intern sau a solutiei standard de etalonare MW = greutatea moleculara a aminoacidului ce este determinat E = concentraţia standardului în æmol/ml W = greutatea probei (
3. g)(corectata faţă de greutatea initiala, dacă produsul este uscat sau degresat) F = ml de hidrolizat total (5.3.4) sau ml calculati la volumul total diluat de extract (6.1) Cistina sau cisteina sunt ambele determinate ca acid cisteic în hidrolizate ale probelor oxidate, dar calculate ca cistina [C

(6)H

(12)N

(2)O

(4)S

(2)MW 240,30 prin utilizarea MW 120,15 (= 0,5 x 240,30)]. Metionina este determinata în hidrolizate de probe oxidate ca metionin sulfona, dar calculată ca metionina prin utilizarea MW de metionina: 149,21. Metionina libera adăugată este determinata după extractia ca metionina, pentru calculare se aplică aceeasi MW. 6.1. Volumul dilutiei totale a extractelor (F) pentru determinarea de aminoacizi liberi (5.2) se calculeaza în modul următor: (10 ml + 5

1. ml)V ml F = 100 ml x -------------- x ----- 10 ml 10 ml V = volumul extractului final 7. Evaluarea metodei Metoda a fost testata printr-o comparatie efectuata la nivel international în 1990 utilizandu-se patru furaje diferite (furaj combinat pentru porcine, furaj combinat pentru broileri, concentrat proteic, premix). Rezultatele după eliminarea deviatiilor, a mediei şi a deviatiei standard sunt redate în tabelul de mai jos: Medii în g/kg ┌────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────────────┐ │ │ Aminoacid │ │ Substanţa de referinţa ├───────────┬────────────┬───────────┬────────┤ │ │ Treonina │ Cist(e)ina │ Metionina │ Lizina │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru porcine │ 6,94 │ 3,01 │ 3,27 │ 9,55 │ │ │ n = 15 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 13 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru broileri │ 9,31 │ 3,92 │ 5,08 │ 13,93 │ │ │ n = 16 │ n = 18 │ n = 18 │ n = 16 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Concentrat proteic │ 22,32 │ 5,06 │ 12,01 │ 47,74 │ │ │ n = 16 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 15 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Premix │ 58,42 │ - │ 90,21 │ 98,03 │ │ │ n = 16 │ │ n = 16 │ n = 16 │ └────────────────────────────────┴───────────┴────────────┴───────────┴────────┘ n = numar de laboratoare participante 7.1. Repetabilitate Repetabilitatea exprimata ca "deviatie standard în cadrul laboratorului" a compararilor menţionate mai sus este redata de tabelele urmatoare: Deviatia standard (S1) în cadrul laboratorului în g/kq ┌────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────────────┐ │ │ Aminoacid │ │ Substanţa de referinţa ├───────────┬────────────┬───────────┬────────┤ │ │ Treonina │ Cist(e)ina │ Metionina │ Lizina │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru porcine │ 0,13 │ 0,10 │ 0,11 │ 0,26 │ │ │ n = 15 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 13 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru broileri │ 0,20 │ 0,11 │ 0,16 │ 0,28 │ │ │ n = 16 │ n = 18 │ n = 18 │ n = 16 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Concentrat proteic │ 0,48 │ 0,13 │ 0,27 │ 0,99 │ │ │ n = 16 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 15 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Premix │ 1,30 │ - │ 2,19 │ 2,06 │ │ │ n = 16 │ │ n = 16 │ n = 16 │ └────────────────────────────────┴───────────┴────────────┴───────────┴────────┘ n = numar de laboratoare participante Coeficient de variatie (%) pentru deviatia standard în cadrul laboratorului (St) ┌────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────────────┐ │ │ Aminoacid │ │ Substanţa de referinţa ├───────────┬────────────┬───────────┬────────┤ │ │ Treonina │ Cist(e)ina │ Metionina │ Lizina │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru porcine │ 1,9 │ 3,3 │ 3,4 │ 2,8 │ │ │ n = 15 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 13 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru broileri │ 2,1 │ 2,8 │ 3,1 │ 2,1 │ │ │ n = 16 │ n = 18 │ n = 18 │ n = 16 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Concentrat proteic │ 2,7 │ 2,6 │ 2,2 │ 2,4 │ │ │ n = 16 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 15 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Premix │ 2,2 │ - │ 2,4 │ 2,1 │ │ │ n = 16 │ │ n = 16 │ n = 16 │ └────────────────────────────────┴───────────┴────────────┴───────────┴────────┘ n = numar de laboratoare participante 7.2. Reproductibilitate Rezultatele pentru deviatia standard între laboratoare, menţionate mai sus, sunt redate comparativ de tabelul de mai jos. ┌────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────────────┐ │ │ Aminoacid │ │ Substanţa de referinţa ├───────────┬────────────┬───────────┬────────┤ │ │ Treonina │ Cist(e)ina │ Metionina │ Lizina │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru porcine │ 0,28 │ 0,30 │ 0,23 │ 0,30 │ │ │ n = 15 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 13 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru broileri │ 0,48 │ 0,34 │ 0,55 │ 0,75 │ │ │ n = 16 │ n = 18 │ n = 18 │ n = 16 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Concentrat proteic │ 0,85 │ 0,62 │ 1,57 │ 1,24 │ │ │ n = 16 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 15 │ ├────────────────────────────────┼───────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Premix │ 2,49 │ - │ 6,20 │ 6,62 │ │ │ n = 16 │ │ n = 16 │ n = 16 │ └────────────────────────────────┴───────────┴────────────┴───────────┴────────┘ n = numar de laboratoare participante Coeficient de variatie (%) pentru deviatia standard între laboratoare (St) ┌────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────┐ │ │ Aminoacid │ │ Substanţa de referinţa ├──────────┬────────────┬───────────┬────────┤ │ │ Treonina │ Cist(e)ina │ Metionina │ Lizina │ ├────────────────────────────────┼──────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru porcine │ 4,1 │ 9,9 │ 7,00 │ 3,2 │ │ │ n = 15 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 13 │ ├────────────────────────────────┼──────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Furaj combinat pentru broileri │ 5,2 │ 8,8 │ 10,9 │ 5,4 │ │ │ n = 16 │ n = 18 │ n = 18 │ n = 16 │ ├────────────────────────────────┼──────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Concentrat proteic │ 3,8 │ 12,3 │ 13,0 │ 3,0 │ │ │ n = 16 │ n = 17 │ n = 17 │ n = 15 │ ├────────────────────────────────┼──────────┼────────────┼───────────┼────────┤ │Premix │ 4,3 │ - │ 6,9 │ 6,7 │ │ │ n = 16 │ │ n = 16 │ n = 16 │ └────────────────────────────────┴──────────┴────────────┴───────────┴────────┘ n = numar de laboratoare participante 8. Utilizarea materialelor de referinţa Aplicarea corecta a metodei trebuie să fie verificata prin efectuarea de masuratori repetate a materialelor de referinţa certificate, atunci când acestea sunt disponibile. Este recomandata etalonarea cu solutie de etalonare certificata de aminoacizi. 9. Observatii 9.1. Din cauza diferentelor între analizorii de aminoacizi, trebuie luate ca indicator concentratiile finale ale solutiilor de etalonare (vezi 3.27.4 şi 3.27.5) şi ale hidrolizatului (vezi 5.3.4). Limitele raspunsului linear al aparatului trebuie verificate pentru toţi aminoacizii. Solutia etalon este diluata cu tampon citrat, pentru a se realiza picul ariilor din mijlocul campului. 9.2. Atunci când este utilizat pentru analizarea hidrolizatelor, echipamentul de cromatografie lichida de înaltă performanta, condiţiile experimentale trebuie să fie optimizate în conformitate cu recomandarile fabricantului. 9.3. Prin aplicarea metodei pentru furaje ce conţin mai mult de 1% clorura (concentrate, furaje minerale, furaje suplimentare) poate apare o subevaluare a metioninei şi deci trebuie realizate tratamente speciale ce au fost facute. Partea B DETERMINAREA ULEIURILOR ŞI GRASIMILOR BRUTE Determinarea uleiurilor şi grasimilor brute se va face în conformitate cu metodele stabilite prin "Norma veterinara ce stabileste metode de analiza pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total şi uleiurile şi grasimile brute". Partea C DETERMINAREA OLAQUINDOXULUI (2-[N-2'-(hidroxieti
2. l)carbamoil]-3-metilquinoxaline-N^1,N^4-dioxid) 1. Scop şi aplicabilitate Aceasta metoda are ca scop determinarea olaquindoxului din furaje. Limita minima a determinarii este de 5 mg/kg. 2. Principiu Proba este extrasa cu ajutorul amestecului de apa-metanol. Conţinutul în olaquindox este determinat prin cromatografie lichida de înaltă performanta în faza inversa (HPLC) ce utilizeaza un detector cu UV. Atunci când uleiul sau grasimea face obiectul unei testari calitative ulterioare se inlocuiesc fragmentele de piatra ponce cu bile de sticlă. 3. Reactivi 3.1. Metanol 3.2. Metanol grade HPLC 3.3. Apa, grade HPLC 3.4. Faza mobila pentru HPLC: Apa (3.3) - metanol (3.2) amestec, 900 + 100 (V + V) 3.5. Substanţa standard: olaquindox pur (2-[N-2'-(hidroxietil) carbamoil]-3-metilquinoxaline-N^1,N^4-dioxid), E 851 3.5.1. Solutie standard (etalon) stoc de olaquindox, 250 æg/ml Se cantaresc, cu aproximatie de 0,1 mg, 50 mg olaquindox (3.5), într-un balon cotat de 200 ml şi se adauga aproximativ 190 ml apa. Se pune apoi balonul timp de 20 minute intr-o baie de ultrasunete (4.1). După tratament ultrasonic, se aduce solutia la temperatura camerei, se aduce la semn cu apa şi se amesteca. Balonul cotat se inveleste intr-o folie de aluminiu şi se păstrează la frigider. Aceasta solutie trebuie să fie proaspat preparata în fiecare luna. 3.5.2. Solutie standard intermediara stoc de olaquindox, 25 æg/ml Se transfera 10 ml solutie standard (etalon) stoc (3.5.1) într-un balon cotat de 100 ml, se aduce la semn cu faza mobila (3.4) şi se amesteca. Balonul se inveleste intr-o folie de aluminiu şi se păstrează la frigider. Aceasta solutie trebuie să fie proaspat preparata în fiecare zi. 3.5.3 Calibrarea (etalonarea) solutiilor: Intr-o serie de baloane cotate de 50 ml se transfera 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 şi 20,0 ml din solutia standard intermediara (3.5.2). Se aduce la semn cu faza mobila (3.4) şi se amesteca. Balonul se inveleste intr-o folie de aluminiu. Aceste solutii corespund concentratiilor de 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 7,5 şi 10,0 æg/ml de olaquindox. Aceste solutii trebuie să fie proaspat preparate, în fiecare zi. 4. Aparatura 4.1. Baie de ultrasunete 4.2. Agitator mecanic 4.3. Echipament HPLC cu detector cu ultraviolete, cu lungimi de unda variabile sau detector cu sistem de diode 4.3.1. Coloana de cromatografie lichida: 350 mm x 4 mm, C 18, 10 æm sau o coloana echivalenta. 4.4. Filtre cu membrana de 0,45 æm 5. Metoda de lucru Notă: Olaquindoxul este sensibil la lumina. Toate procedurile se efectueaza sub lumina difuza sau se utilizeaza sticlarie de chihlimbar. 5.1. Generalitati 5.1.1. Trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica absenta olaquindoxului şi interferenta substanţelor. 5.1.2. Trebuie efectuat o testare de randament, prin care se analizeaza un furaj martor ce a fost îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de olaquindox identica cu cea prezenta în proba. Pentru a se imbogati la un nivel de 50 mg/kg, se transfera 10,0 ml solutie standard (etalon) stoc (3.5.1) într-un pahar conic de 250 ml şi se evapora solutia până la aproximativ 0,5 ml. Se adauga 50 g din furajul martor, se amesteca în intregime şi se lasă timp de 10 minute, înainte de procedura de extractie (5.2). Notă: În cadrul acestei metode, furajul martor trebuie să fie similar, ca tip, cu cel al probei de cercetat, iar cu privire la analiza, nu trebuie să fie detectat olaquindoxul. 5.2. Extractie Se cantaresc, cu o precizie de 0,1 g, aproximativ 50 g din proba. Se transfera într-un pahar conic de 1000 ml, se adauga 100,0 ml metanol (3.1) şi se introduce paharul timp de 5 minute intr-o baie de ultrasunete (4.1). Se adauga 410 ml apa şi se lasă în baia de ultrasunete timp de alte 15 minute. Se indeparteaza paharul din baia de ultrasunete, se agita timp de 30 minute pe un agitator (4.2) şi se filtreaza printr-un filtru pliat. Se transfera 10,0 ml filtrat într-un balon cotat de 20 ml, se aduce la semn cu apa şi se amesteca. O parte alicota se filtreaza prin filtru cu membrana (4.4) (vezi punctul 9 Observatie). Se procedeaza la determinarea HPLC (5.3). 5.3. Determinare HPLC 5.3.1. Parametri Urmatoarele condiţii sunt oferite pentru orientare, putand fi utilizate, cu condiţia să ofere rezultate echivalente: Coloana analitica (4.3.1), Faza mobila (3.4): apa (3.3) - metanol (3.2) amestec, 900 + 100 (V + V) Debit: 1,5 - 2 ml/minut, Lungime de unda: 380 nm, Volum injectat: 20-100 æl Se verifica stabilitatea sistemului cromatografie, se injecteaza solutia de etalonare (3.5.3) ce contine 2,5 æg/ml, de cate ori este nevoie, până când sunt obtinute inaltimi ale picului şi timpi de retentie constanti. 5.3.2. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare solutie de etalonare (3.5.3.) de cate ori este nevoie şi se masoara media inaltimilor picurilor (ariilor) pentru fiecare concentraţie. Se reprezinta grafic o curba de etalonare, utilizandu-se mediile picurilor sau ariilor principale ale solutiilor de etalonare, ca ordonate şi concentratiile corespunzătoare în æg/ml, ca abscise. 5.3.3. Solutia probei Se injecteaza extractul din proba (5.2) de cate ori este necesar, utilizandu-se acelasi volum luat pentru solutiile de etalonare şi se determina înălţimea (aria) medie a picului de olaquindox. 6. Calcularea rezultatelor Se determina concentraţia probelor în mg/ml din media inaltimilor (ariilor) picurilor de olaquindox a probelor, prin referire la curba de etalonare (5.3.2). Conţinutul probei în olaquindox w (æg/
3. ml)este dat de urmatoarea formula: c x 1000 w = -------- m în care: c = concentraţia extractului din proba în olaquindox, în æg/ml, m = masa părţii testate exprimata în g (5.2). 7. Validarea rezultatelor 7.1. Identitate Identitatea produsului analizat poate fi confirmata prin cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu sistem de diode, prin care sunt comparate spectrul extractul din proba (5.2) şi al solutiei de calibrare (3.5.3) ce contine 5,0 æg/ml. 7.1.1. Co-cromatografia Un extract din proba (5.2) este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare din solutia etalon (3.5.3). Cantitatea de olaquindox adăugată trebuie să fie similara cantităţii estimate de olaquindox detectata în extractul din proba. Numai înălţimea picurilor de olaquindox trebuie să creasca după luarea în calcul a ambelor cantitati adaugate şi diluarea extractului. Largimea picului, la jumătate din înălţimea maxima, trebuie să se incadreze în ±10% din largimea originala a picului de olaquindox al extractului din proba neimbogatita. 7.1.2. Detectarea prin sistemul de diode Rezultatele sunt evaluate în conformitate cu urmatoarele criterii:
4. a)Lungimea de unda a absorbtiei maxime a probei şi a spectrelor standard, înregistrate pe cromatograma la vârful picului, trebuie să fie aceeasi, cu o limita de siguranţă determinata de puterea de rezolutie a sistemului de detectare. Pentru detectare prin sistemul de diode, aceasta este tipica în cadrul a ± 2 nm. ...
5. b)între 220 şi 400 nm, spectrul standard şi al probei, înregistrate pe cromatograma, la vârful picului, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului cuprinse între 10 şi 100% ale absorbtiei relative. Acest criteriu este indeplinit când sunt prezente aceleasi maxime şi când, la nici un punct observat, deviatia între cele doua spectre nu depăşeşte 15% din absorbtia probei de analizat standard. ...
6. c)între 220 şi 400 nm, spectrul curbei ascendente, al vârfului şi al curbei descendente a picului, produse de extractul probei nu trebuie să fie diferit unul de celalalt pentru acele părţi ale spectrului în interiorul gamei de la 10 la 100% de absorbtie relativa. Acest criteriu este indeplinit când sunt prezente aceleasi maxime şi când, la toate punctele observate, deviatia între spectre nu depăşeşte 15% din absorbtia spectrului vârfului. ... Dacă unul din aceste criterii nu este indeplinit, prezenta substantei de analizat nu este confirmata. 7.2. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a 2 determinari paralele, efectuate pe aceeasi proba, nu trebuie să depăşească 10% din cel mai mare rezultat al continutului în olaquindox, între 10 şi 200 mg/kg. 7.3. Randament Pentru proba martor imbogatita, randamentul trebuie să fie de minim 90%. 8. Rezultate ale unui studiu de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare în care patru probe de furaje pentru purcei ce includ un furaj martor, au fost analizate în 13 laboratoare. Rezultatele sunt date mai jos. L: numar de laboratoare N: numar de valori individuale S(t): deviatia standard a repetabilitatii S(R): deviatia standard a reproductibilitatii CV(t): coeficient de variatie a repetabilitatii CV(R): coeficient de variatie a reproductibilitatii 9. Observatie Cu toate ca metoda nu a fost validata pentru furaje ce conţin mai mult de 100 mg/kg de olaquindox, se pot obtine rezultate satisfăcătoare prin utilizarea unei cantitati mai mici de proba şi/sau diluand extractul (5.2), pentru a atinge o concentraţie situata în zona curbei de etalonare (5.3.2). -----------