← România

NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004

NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004 ce stabileste o metoda naţionala de analiza pentru determinarea lasalocidului de sodiu din furaje*) Publicat în MONITORUL OFICIAL nr. 1.020 bis din 4 noiembrie 2004 ________ Notă ... *) Aprobata prin Ordinul nr. 24 din 10 iunie 2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1020 din 4 noiembrie 2004. Articolul 1 Analizele efectuate în vederea controalelor oficiale ale continutului în lasalocid al furajelor şi premixurilor trebuie să fie realizate utilizand metoda stabilita de anexa la prezenta norma sanitara veterinara. Articolul 2

(1)Autoritatea veterinara centrala a României poate adopta, acte normative sau prevederi administrative suplimentare prezentei norme veterinare, pentru a dispune implementarea şi respectarea prevederilor acesteia. ...
(2)Autoritatea veterinara centrala a României va lua masurile necesare şi va sanctiona, potrivit legii orice încălcare a prevederilor prezentei norme veterinare. ...
(3)Atunci când autoritatea veterinara centrala a României adopta cele menţionate la alineatele precedente, trebuie să se faca o referire expresa la prezenta norma veterinara. ... Anexa ----- la norma veterinara ------------------- DETERMINAREA LASALOCIDULUI DE SODIU (E 763) Sare sodica a unui polieter al acidului monocarboxilic produsa de Streptomyces lasaliensis
  1. Scop şi domeniu de aplicare Metoda permite determinarea lasalocidului de sodiu din furaje şi premixuri. Limita de detectie este de 5 mg/kg iar limita de determinare este de 30 mg/kg.
  2. Principiul Lasalocidul de sodiu este extras din proba cu metanol acidifiat şi determinat prin cromatografie lichida de înaltă performanta în faza inversa (HPLC), utilizand un detector spectrofluorimetric.
  3. Reactivi 3.
  4. Fosfat dihidrogenat de potasiu [KH
(2)PO
(4)] 3.
  1. Acid ortofosforic, w = 85% 3.
  2. Solutie de acid ortofosforic, sigma = 20% Se dilueaza 23,5 ml de acid ortofosforic (3.2) în apa şi se aduce la 100 ml. 3.
  3. 6-metil-2-heptilamina (1,5-dimetilhexilamina), w = 99% 3.
  4. Metanol, de grad HPLC 3.
  5. Acid clorhidric, p20 1,19 g/ml 3.
  6. Solutie tampon de fosfat, c = 0,01 mol/l Se dizolva 1,36 g de KH
(2)PO
(4)(3.1) în 500 ml de apa (3.11), se adauga 3,5 ml de acid orthofosforic (3.2) şi 10,0 ml de 6-metil-2-heptilamina (3.4). Se ajusteaza pH-ul la 4,0 cu solutie de acid ortofosforic (3.3), se dilueaza cu apa şi se aduce la 1000 ml (3.11). 3.
  1. Metanol acidifiat Se transfera 5,0 ml de acid clorhidric (3.6) într-un balon gradat de 1000 ml, se aduce la semn cu metanol (3.5) şi se amesteca. Aceasta solutie trebuie să fie proaspat preparata înainte de utilizare. 3.
  2. Faza mobila pentru HPLC, solutie tampon de fosfat şi metanol 5 + 95 (V + V) Se amesteca 5 ml de solutie tampon de fosfat (3.7) cu 95 ml de metanol (3.5). 3.
  3. Substanţa etalon lasalocid de sodiu cu puritate garantata, C
(34)H
(53)O
(8)Na (sare sodica de polieter a acidului monocarboxilic, produs de Streptomyces lasaliensis), E
  1. 3.10.
  2. Solutie mama din etalon de lasalocid de sodiu, 500 æg/ml Se cantaresc cu o precizie de 0,1 mg, 50 mg de lasalocid de sodiu (3.10) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolva în metanol acidifiat (3.8), se aduce la semn cu acelasi solvent şi se amesteca. Aceasta solutie trebuie să fie proaspat preparata înainte de utilizare. 3.10.
  3. Solutie etalon intermediara de lasalocid de sodiu, 50 æg/ml Se pipeteaza 10,0 ml de solutie mama din etalon (3.10.1) într-un balon gradat de 100 ml, se aduce la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amesteca. Solutia trebuie să fie proaspat preparata înainte de utilizare. 3.10.
  4. Solutii de etalonare Se transfera 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 şi 10,0 ml din solutia etalon intermediara (3.10.2) intr-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se aduce la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amesteca. Aceste solutii corespund respectiv la 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 şi 10,0 æg de lasalocid de sodiu pe ml. Aceste solutii trebuie să fie proaspat preparate înainte de utilizare. 3.
  5. Apa, de calitate HPLC
  6. Aparatura 4.
  7. Baie cu ultrasunete (sau baie de apa cu agitator) cu reglaj de temperatura 4.
  8. Filtre cu membrana de 0,45 æm 4.
  9. Echipament HPLC cu sistem de injectie, corespunzător pentru injectarea de volume de 20 de æl 4.3.
  10. Coloana pentru cromatografie lichida de 125 mm x 4 mm, în faza inversa C18, umplere de 5 æm sau echivalenta 4.3.
  11. Spectrofluorimetru cu ajustarea lungimilor de unda variabile a lungimilor de unda de excitatie şi emisie
  12. Procedura 5.
  13. Generalitati 5.1.
  14. Furaj martor Pentru efectuarea testului de recuperare (5.1.2), trebuie analizat un furaj martor pentru a se verifica faptul că nu este prezent lasalocid de sodiu sau substante interferente. Furajul martor trebuie să fie de tip similar cu cel al probei şi nu trebuie să fie detectate lasalocidul de sodiu sau substantele interferente . 5.1.
  15. Test de recuperare Trebuie efectuat un test de recuperare prin analizarea furajului martor ce a fost îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati de lasalocid de sodiu, similara celei prezente în proba. Pentru a se fortifica la un nivel de 100 mg/kg, se transfera 10,0 ml din solutia mama din etalon (3.10.1) într-un balon conic de 250 ml şi se evapora solutia până la aproximativ 0,5 ml. Se adauga 50 g de furaj martor, se amesteca cu grija şi se lasă timp de 10 minute, amestecand din nou de mai multe ori înainte de a se continua cu faza de extractie (5.2). Alternativ, dacă un furaj martor de tip similar cu cel al probei nu este disponibil (vezi 5.1.1), poate fi efectuat un test de recuperare prin intermediul metodei de adaugare de etalon. În acest caz, proba ce trebuie analizata este imbogatita cu o cantitate de lasalocid de sodiu, similara celei deja prezente în proba. Aceasta proba este analizata împreună cu proba neimbogatita iar recuperarea calculată prin diferenţa. 5.
  16. Extractia 5.2.
  17. Furaje Se cantaresc cu precizie de 0,01 g, între 5 g şi 10 g de proba într-un balon conic de 250 ml cu dop. Se adauga prin pipetare 100,0 ml de metanol acidifiat (3.8). Se astupa lejer şi se agita pentru a se dispersa. Se plaseaza balonul intr-o baie cu ultrasunete (4.1) la aproximativ 40°C timp de 20 de minute, apoi se scoate şi se raceste la temperatura camerei. Se lasă sa stea aproximativ 1 ora până ce s-au decantat materiile în suspensie, apoi se filtreaza o parte alicota printr-un filtru cu membrana de 0,45 æm (4.2) într-un vas corespunzător. Se continua cu determinarea HPLC (5.3). 5.2.
  18. Premixuri Se cantaresc cu precizie de 0,001 g aproximativ 2 g de premix nemaruntit într-un balon gradat de 250 ml. Se adauga 100,0 ml de metanol acidifiat (3.8) şi se agita pentru a se dispersa. Se plaseaza balonul şi conţinutul intr-o baie cu ultrasunete (4.1), la aproximativ 40°C, timp de 20 de minute, apoi se scoate şi se raceste la temperatura camerei. Se dilueaza până la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amesteca cu grija. Se lasă sa stea timp de o ora până se decanteaza materiile în suspensie, apoi se filtreaza o parte alicota printr-un filtru cu membrana de 0,45 æm (4.2). Se dilueaza un volum corespunzător de filtrat clar cu metanol acidifiat (3.8), pentru a se obtine o solutie de testare finala ce contine aproximativ 4 æg/ml de lasalocid de sodiu. Se continua cu determinarea HPLC (5.3). 5.
  19. Determinarea HPLC 5.3.
  20. Parametri Urmatoarele condiţii sunt oferite spre orientare; pot fi utilizate alte condiţii cu condiţia ca acestea sa dea rezultate echivalente: Coloana cromatografica lichida (4.3.1): 125 mm x 4 mm, în faza inversa C18, umplere de 5 æm sau echivalenta Faza mobila (3.9): Amestec de solutie tampon de fosfat (3.7) şi metanol (3.5), 5 + 95 (V + V) Debit: 1,2 ml/min Lungimea undei de detectie: - Excitatie: 310 nm - Emisie: 419 nm Volum de injectie: 20 æl Se verifica stabilitatea sistemului cromatografic, injectandu-se de mai multe ori solutia de etalonare (3.10.3) ce contine 4,0 æg/ml, până când sunt obtinute inaltimi (sau arii) ale picului şi timpi de retentie constanti. 5.3.
  21. Curba de etalonare Se injecteaza fiecare solutie de etalonare (3.10.3) de mai multe ori şi se determina inaltimile (ariile) medii ale picului, pentru fiecare concentraţie. Se stabileste o curba de etalonare utilizand inaltimile (ariile) medii ale picului ca ordonate şi concentratiile corespondente în æg/ml ca abscise. 5.3.
  22. Solutia probei Se injecteaza extractul probei (5.2.1 sau 5.2.2) de mai multe ori, utilizand acelasi volum ca cel retinut pentru solutia de etalonare şi se determina inaltimile (ariile) medii ale picului lasalocidului de sodiu.
  23. Calcularea rezultatelor Plecand de la înălţimea (aria) medie a picului produsa prin injectarea solutiei probei (5.3.3), se determina concentraţia de lasalocid de sodiu (æg/ml) prin raportare la curba de etalonare. 6.
  24. Furaje Conţinutul în lasalocid de sodiu, w (mg/kg) din proba este dat de urmatoarea formula: beta ● V
(1)w = --------- [mg/kg] m unde: beta = conţinutul în lasalocid de sodiu al solutiei probei (5.2.1) în æg/ml; V
(1)= volumul extractului probei, în conformitate cu 5.2.1 în ml (de ex. 100); m = masa părţii de test, în g. 6.2. Premixuri Conţinutul în lasalocid de sodiu, w (mg/kg) din proba este dat de urmatoarea formula: beta ● V
(2)● f w = --------------- [mg/kg] m unde: beta = concentraţia de lasalocid de sodiu a solutiei probei (5.2.2) în æ/ml; V
(2)= volumul extractului probei, în conformitate cu 5.2.2 în ml (de ex. 250); f = factor de dilutie, în conformitate cu 5.2.2; m = masa părţii de test în g.
  1. Validarea rezultatelor 7.
  2. Identitate Metodele bazate pe spectrofluorimetrie sunt mai puţin supuse interferentei decat cele la care este utilizata detectia UV. Identitatea substantei de analizat poate fi confirmata prin co-cromatografie. 7.1.
  3. Co-cromatografie Un extract al probei (5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogăţit prin adaugarea unei cantitati corespunzătoare din solutia de etalonare (3.10.3). Cantitatea de lasalocid de sodiu adăugată trebuie să fie similara cu cantitatea de lasalocid de sodiu constatata în extractul probei. Numai înălţimea picului lasalocidului de sodiu trebuie să fie mai mare intr-o măsura ce este corelata cu cantitatea de lasalocid de sodiu adăugată şi dilutia extractului. Largimea picului la jumatatea inaltimii trebuie să se situeze la ±10% de largimea initiala a picului produsa de extractul probei neimbogatite. 7.
  4. Repetabilitate Diferenţa dintre rezultatele a doua determinari paralele efectuate pe aceeasi proba nu trebuie să depăşească: - 15% cu referire la valoarea maxima pentru conţinutul în lasalocid de sodiu de la 30 mg/kg la 100 mg/kg, - 15 mg/kg pentru conţinutul în lasalocid de sodiu de la 100 mg/kg la 200 mg/kg, - 7,5% cu referire la valoarea maxima pentru un continut în lasalocid de sodiu mai mare de 200 mg/kg. 7.
  5. Recuperare Pentru proba de furaj (martor) imbogatita, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 80%. Pentru probele de premix imbogatite, recuperarea trebuie să fie de cel puţin 90%.
  6. Rezultatele unui studiu de colaborare A fost organizat un studiu de colaborare în care 2 probe de premixuri (probele 1 şi 2) şi 5 probe de furaje (probele 3-7) au fost analizate de 12 laboratoare. Pentru fiecare proba au fost efectuate analize duble. Rezultatele sunt date în urmatorul tabel: -------------

Explicație AI pe baza textului oficial al legii. Orientativă, nu înlocuiește consilierea juridică.