Nariadenie vlády Slovenskej republiky, ktorým sa ustanovujú analytické metódy na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov

(2)§ 3 § 4 Prílohy Poznámky Otvoriť všetky Informácie o predpise Číslo predpisu: 348/2004 Z. z. Názov: Nariadenie vlády Slovenskej republiky, ktorým sa ustanovujú analytické metódy na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov Typ: Nariadenie vlády Dátum schválenia: 02.06.2004 Dátum vyhlásenia: 15.06.2004 Autor: Vláda Slovenskej republiky Právna oblasť: Právo EÚ Metrológia a skúšobníctvo Technické normy Nachádza sa v čiastke: 146/2004 Vzťahy predpisu Predpis vykonáva 19/2002 Z. z. Zákon, ktorým sa ustanovujú podmienky vydávania aproximačných nariadení vlády Slovenskej republiky Predpis je zrušený 355/2007 Z. z. Zákon o ochrane, podpore a rozvoji verejného zdravia a o zmene a doplnení niektorých zákonov 348 NARIADENIE VLÁDY Slovenskej republiky z 2. júna 2004, ktorým sa ustanovujú analytické metódy na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov Vláda Slovenskej republiky podľa § 2 ods. 1 písm. h) zákona č. 19/2002 Z. z., ktorým sa ustanovujú podmienky vydávania aproximačných nariadení vlády Slovenskej republiky nariaďuje: § 1 Toto nariadenie vlády ustanovuje zoznam analytických metód a podrobnosti o analytických metódach na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov na účely výkonu štátneho zdravotného dozoru.1) § 2

(1)Zoznam analytických metód na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov je uvedený v prílohe č. 1.

(2)Podrobnosti o analytických metódach na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov sú uvedené v prílohe č. 2. § 3 Týmto nariadením vlády sa preberajú právne akty Európskych spoločenstiev a Európskej únie uvedené v prílohe č. 3. § 4 Toto nariadenie vlády nadobúda účinnosť 15. júna 2004. v z. Pál Csáky v. r. Príloha č. 1 k nariadeniu vlády č. 348/2004 Z. z. ZOZNAM ANALYTICKÝCH METÓD NA KONTROLU ZLOŽENIA KOZMETICKÝCH VÝROBKOV 1. Odber vzoriek, 2. Laboratórna príprava skúšobných vzoriek, 3. Dôkaz a stanovenie voľného hydroxidu sodného a hydroxidu draselného, 4. Dôkaz a stanovenie kyseliny šťaveľovej a jej alkalických solí vo výrobkoch na starostlivosť o vlasy, 5. Stanovenie chloroformu v zubných pastách, 6. Stanovenie zinku, 7. Dôkaz a stanovenie kyseliny 4-hydroxybenzénsulfónovej, 8. Dôkaz oxidačných činidiel a stanovenie peroxidu vodíka vo výrobkoch vlasovej kozmetiky, 9. Dôkaz a semikvantitatívne stanovenie určitých oxidačných farbív vo farbách na vlasy, 10. Dôkaz a stanovenie dusitanov, 11. Dôkaz a stanovenie voľného formaldehydu, 12. Stanovenie rezorcinolu v šampónoch a vlasových lotionoch, 13. Stanovenie metanolu v pomere k etanolu alebo propán-2-olu, 14. Stanovenie dichlórmetánu a 1,1,1-trichlóretánu, 15. Dôkaz a stanovenie chinolín-8-olu a bis(8-hydroxychinolínium)-sulfátu, 16. Stanovenie amoniaku, 17. Dôkaz a stanovenie nitrometánu, 18. Dôkaz a stanovenie kyseliny merkaptooctovej vo výrobkoch na onduláciu vlasov, na narovnávanie vlasov a na depiláciu, 19. Dôkaz a stanovenie hexachlorofénu (INN), 20. Stanovenie tosylchlóramidu sodného (INN), 21. Stanovenie celkového obsahu fluóru v zubných pastách, 22. Dôkaz a stanovenie organoortuťnatých zlúčenín, 23. Stanovenie sulfidov alkalických kovov a kovov alkalických zemín, 24. Dôkaz a stanovenie (2,3-dihydroxypropyl)-4-aminobenzoátu, 25. Stanovenie chlórbutanolu (INN), 26. Dôkaz a stanovenie chinínu, 27. Dôkaz a stanovenie anorganických siričitanov a hydrogensiričitanov, 28. Dôkaz a stanovenie chlorečnanov alkalických kovov, 29. Dôkaz a stanovenie jodičnanu sodného, 30. Dôkaz a stanovenie dusičnanu strieborného, 31. Dôkaz a stanovenie sulfidu seleničitého v šampónoch proti lupinám, 32. Stanovenie rozpustného bária a rozpustného stroncia v pigmentoch vo forme solí alebo komplexov, 33. Dôkaz a stanovenie benzylalkoholu, 34. Dôkaz zirkónia a stanovenie zirkónia, hliníka a chlóru v neaerosólových antiperspirantoch, 35. Dôkaz a stanovenie hexamidínu, dibrómhexamidínu, dibrómpropamidínu a chlórhexidínu, 36. Dôkaz a stanovenie kyseliny benzoovej, kyseliny 4-hydroxybenzoovej, kyseliny sorbovej, kyseliny salicylovej a kyseliny propiónovej, 37. Dôkaz a stanovenie hydrochinónu, monometyléteru hydrochinónu, monoetyléteru hydrochinónu a monobenzyléteru hydrochinónu, 38. Dôkaz a stanovenie 2-fenoxyetanolu, 1-fenoxypropán-2-olu, metyl-, etyl-, propyl-, butyl- a benzyl- 4-hydroxybenzoátu. Príloha č. 2 k nariadeniu vlády č. 348/2004 Z. z. PODROBNOSTI O ANALYTICKÝCH METÓDACH NA KONTROLU ZLOŽENIA KOZMETICKÝCH VÝROBKOV 1. ODBER VZORIEK (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Ustanovuje postup na odber vzoriek kozmetických výrobkov na účel ich analýzy v rôznych laboratóriách. 2. DEFINÍCIE 2.1. Základná vzorka – jednotkové množstvo odobraté z výrobnej dávky, určené na predaj. 2.2. Celková vzorka – súhrn všetkých základných vzoriek odobratých z jednej výrobnej dávky. 2.3. Laboratórna vzorka – reprezentatívna časť celkovej vzorky určená na analýzu v laboratóriách. 2.4. Skúšobná vzorka – reprezentatívna časť laboratórnej vzorky potrebná na jednu analýzu. 2.5. Obal – predmet, v ktorom je výrobok zabalený a s ktorým je v priamom kontakte. 3. POSTUP ODBERU VZORIEK 3.1. Vzorky kozmetických výrobkov sa odoberajú v ich pôvodných spotrebiteľských obaloch a do laboratórií sa dopravujú v neporušenom stave. 3.2. Ak sa kozmetické výrobky uvádzajú do obehu vo veľkospotrebiteľskom balení alebo v inom obale, ako je pôvodné balenie od výrobcu, vzorka sa odoberie vhodne zvoleným vzorkovačom po predchádzajúcom premiešaní obsahu v obale. Ak obsah nemožno premiešať, vzorka sa odoberie vrstveným (stratifikovaným) odberom. 3.3. Počet základných vzoriek potrebných na prípravu laboratórnej vzorky závisí od analytickej metódy a od počtu analýz, ktoré je potrebné vykonať. 4. IDENTIFIKÁCIA VZORKY 4.1. Vzorky sa pri odbere zapečatia a označia štítkom pripevneným tak, aby obal nebolo možné otvoriť, štítok vymeniť alebo odstrániť bez porušenia pečate. Ak nemožno štítok pripevniť na obal, číslo protokolu o odbere vzorky sa vyznačí na obal. 4.2. Každá odobratá základná vzorka musí byť označená týmito údajmi: 4.2.1. Názov kozmetického výrobku 4.2.2. Dátum, čas a miesto odberu vzorky 4.2.3. Meno a priezvisko osoby, ktorá odobrala vzorku 4.2.4. Názov orgánu dozoru 4.3. Protokol o odbere vzorky musí obsahovať 4.3.1. Názov a špecifikáciu výrobku alebo suroviny 4.3.2. Názov a adresu výrobcu, spracovateľa, dovozcu, distribútora alebo predávajúceho 4.3.3. Údaj o veľkosti vzorkovanej dávky, jej objem alebo hmotnosť 4.3.4. Označenie výrobnej dávky 4.3.5. Dátum minimálnej trvanlivosti 4.3.6. Miesto, dátum a čas odberu vzorky 4.3.7. Spôsob odberu vzorky, údaje o postupe odberu vzorky s dôrazom na odchýlky od predpísaného štandardného alebo dohodnutého postupu 4.3.8. Počet, objem alebo hmotnosť odobratých vzoriek na laboratórne skúšanie 4.3.9. Meno, priezvisko a podpis osoby, ktorá odobrala vzorku 4.3.10. Miesto doručenia vzorky, ak je to potrebné. 5. USKLADNENIE VZORIEK 5.1. Základné vzorky sa musia uskladniť v súlade s pokynmi výrobcu uvedenými na etikete, ak sú tam uvedené. 5.2. Ak nie sú určené iné podmienky, laboratórne vzorky sa uskladnia v tme pri teplote od 10 do 25 oC. 5.3. Základné vzorky nesmú byť otvorené pred začiatkom analýzy. 2. LABORATÓRNA PRÍPRAVA SKÚŠOBNÝCH VZORIEK (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980) 1. VŠEOBECNE 1.1. Ak je to možné, analyzuje sa každá základná vzorka. Ak je základná vzorka príliš malá, použije sa minimálny počet základných vzoriek. Pred odobratím skúšobnej vzorky sa základné vzorky najskôr spolu dôkladne zmiešajú. 1.2. Obal sa otvorí v atmosfére inertného plynu, ak je to tak určené v analytickej metóde a čo najrýchlejšie sa odoberie požadovaný počet skúšobných vzoriek. Analýza sa vykoná v čo najkratšom čase. Ak sa vzorka ďalej uchováva, obal sa znova zapečatí v atmosfére inertného plynu. 1.3. Kozmetické výrobky môžu byť vyrobené v kvapalnom, tuhom alebo polotuhom stave. Ak sú pôvodne homogénne výrobky oddelené vo viacerých fázach, pred odberom skúšobnej vzorky sa znova zhomogenizujú. 1.4. Ak je kozmetický výrobok predávaný osobitným spôsobom, v dôsledku čoho sa nemôže postupovať v súlade s touto skúšobnou metódou a ak neboli prijaté žiadne ustanovenia o príslušných vhodných skúšobných metódach, môže byť použitý vlastný postup za predpokladu, že bude sformulovaný do písomnej podoby ako súčasť protokolu o skúške. 2. KVAPALINY 2.1. Môžu sa vyskytovať ako olejové, alkoholové a vodné roztoky, toaletné vody, lotiony alebo mlieka a môžu byť balené vo fľaštičkách, fľašiach, ampuliach alebo tubách. 2.2. Odber skúšobnej vzorky 2.2.1. Obal sa pred otvorením intenzívne pretrepe. 2.2.2. Obal sa otvorí. 2.2.3. Na vizuálne posúdenie vzorky sa odleje niekoľko mililitrov kvapaliny do skúmavky. 2.2.4. Odoberú sa požadované skúšobné vzorky. 2.2.5. Obal sa znova dôkladne uzavrie. 3. POLOTUHÉ LÁTKY 3.1. Môžu sa vyskytovať ako pasty, krémy, tuhé emulzie a gély a môžu byť balené v tubách, fľašiach alebo téglikoch. 3.2. Odber skúšobnej vzorky 3.2.1. Z obalov s úzkym hrdlom sa vytlačí aspoň jeden centimeter výrobku a až potom sa vytlačí skúšobná vzorka a obal sa ihneď znova uzavrie. 3.2.2. Z obalov so širokým hrdlom sa zľahka rovnomerne odstráni povrchová vrstva výrobku a po odbere skúšobnej vzorky sa obal ihneď uzavrie. 4. TUHÉ LÁTKY 4.1. Môžu sa vyskytovať ako sypké a kompaktné púdre, tyčinky a môžu byť balené v rôznych obaloch. 4.2. Odber skúšobnej vzorky 4.2.1. Obal sypkého púdru sa pred otvorením intenzívne pretrepe a následne sa odoberie skúšobná vzorka. 4.2.2. Z kompaktného púdru alebo z tyčinky sa rovnomerným zoškrabaním odstráni povrchová vrstva a spod nej sa odoberie skúšobná vzorka. 5. VÝROBKY V OBALOCH POD TLAKOM 5.1. Výrobkami v obaloch pod tlakom sú aerosólové rozprašovače podľa osobitného predpisu.1) 5.2. Odber skúšobnej vzorky Po intenzívnom pretrepaní sa reprezentatívne množstvo obsahu aerosólového rozprašovača prenesie pomocou vhodnej spojovacej súčiastky (obrázok č. 1; v špecifických prípadoch môže analytická metóda vyžadovať použitie iných spojovacích súčiastok) do plastom potiahnutej sklenenej fľaše (obrázok č. 4), vybavenej aerosólovým ventilom bez ponornej trubice. Počas prenosu sa fľaša drží ventilom smerom nadol. Takýto spôsob prenosu zabezpečí, aby bol obsah jasne viditeľný a zodpovedajúci jednému zo štyroch nasledujúcich prípadov: 5.2.1. Aerosólový výrobok vo forme homogénneho roztoku vhodného priamo na analýzu. 5.2.2. Aerosólový výrobok pozostávajúci z dvoch kvapalných fáz. Po oddelení spodnej fázy do druhej fľaše na prenášanie vzoriek môže byť analyzovaná každá fáza osobitne. V tomto prípade sa prvá fľaša na prenášanie vzoriek drží ventilom smerom nadol. Vtedy je zvyčajne spodná vrstva vodná a neobsahuje hnací plyn (napr. pri sústave bután/voda). 5.2.3. Aerosólový výrobok obsahujúci prášok v suspenzii. Kvapalná fáza sa analyzuje po odstránení prášku. 5.2.4. Výrobok v podobe peny alebo krému. Najprv sa do fľaše na prenášanie vzoriek presne naváži 5 až 10 g 2–metoxyetanolu. Táto látka potláča tvorbu peny počas odplyňovania, na základe čoho je možné odstrániť hnací plyn bez straty kvapalnej zložky. 5.3. Príslušenstvo Spojka je spojovacia súčiastka (obrázok č. 1) vyrobená z duralu alebo z mosadze, skonštruovaná tak, aby prostredníctvom polyetylénového adaptéra vyhovovala rozdielnym systémom ventilov. Podľa uvedeného príkladu môžu byť použité aj iné typy spojovacích súčiastok (obrázky č. 2 a 3). Vzorkovnica je fľaša na prenášanie vzoriek (obrázok č. 4) vyrobená z bieleho skla, z vonkajšej strany potiahnutá ochrannou vrstvou priehľadného plastu, s objemom 50 ml až 100 ml, vybavená aerosólovým ventilom bez ponornej trubice. 5.4. Postup Z fľaše na prenášanie vzoriek sa vytlačí vzduch. Na tento účel sa do fľaše cez spojovaciu súčiastku zavedie asi 10 ml difluórdichlórmetánu alebo butánu (v závislosti od toho, aký aerosólový výrobok sa bude analyzovať). Ďalej sa vykoná odplynenie až do odstránenia kvapalnej fázy, pričom vzorkovnica sa drží ventilom čo najvyššie. Spojovacia súčiastka sa odpojí. Fľaša na prenášanie vzoriek sa odváži (a v gramoch). Aerosólový rozprašovač, z ktorého sa bude odoberať vzorka, sa intenzívne pretrepe. Na ventil obalu aerosólovej vzorky (ventilom smerom nahor) sa pripojí spojovacia súčiastka, na ktorú sa nasadí fľaša na prenášanie vzoriek (hrdlom smerom nadol) a stlačí sa. Fľaša na prenášanie vzoriek sa naplní približne do dvoch tretín. Ak sa v dôsledku vyrovnania tlaku prečerpávanie predčasne preruší, obnoví sa ochladením fľaše na prenášanie vzoriek. Spojovacia súčiastka sa odpojí, naplnená fľaša sa odváži (b v gramoch) a určí sa hmotnosť prenesenej aerosólovej vzorky m1 (m1 = b – a). Takto získaná vzorka môže byť použitá – na bežnú chemickú analýzu, – na analýzu prchavých zložiek plynovou chromatografiou. 5.4.1. Chemická analýza Fľaša na prenášanie vzoriek sa pridrží ventilom smerom nahor. Odplyní sa. Ak odplyňovacia operácia spôsobí penenie, použije sa fľaša na prenášanie vzoriek, do ktorej sa injekčnou striekačkou cez spojovaciu súčiastku vopred prenieslo 5 g až 10 g 2-metoxyetanolu. Dokončí sa odstránenie prchavých súčastí bez strát, pretrepávaním vo vodnom kúpeli udržiavanom pri 40 oC. Spojovacia súčiastka sa odpojí a fľaša na prenášanie vzoriek sa znova odváži (c v gramoch), aby sa určila hmotnosť zvyšku m2 (m2 = c – a), pričom pri výpočte hmotnosti zvyšku sa odčíta hmotnosť použitého 2–metoxyetanolu. Fľaša na prenášanie vzoriek sa otvorí odstránením ventilu. Celý zvyšok sa rozpustí v známom množstve vhodného rozpúšťadla a s alikvotnou časťou sa uskutoční požadované stanovenie. Vzorce na výpočet: kde m1 je hmotnosť aerosólu preneseného do fľaše na prenášanie vzoriek, m2 je hmotnosť zvyšku po zahriatí na 40 oC, r je percentuálny podiel danej zložky v m2 (stanovený podľa príslušnej metódy), R je percentuálny podiel danej zložky v aerosóle (v takej podobe, ako bol prijatý), Q je celková hmotnosť danej zložky v aerosólovom rozprašovači, P je čistá hmotnosť pôvodného aerosólového rozprašovača (základná vzorka). 5.4.2. Analýza prchavých zložiek plynovou chromatografiou 5.4.2.1. Princíp Pomocou striekačky na plynovú chromatografiu sa z fľaše na prenášanie vzoriek odoberie potrebné množstvo vzorky. Potom sa obsah striekačky nastrekne do plynového chromatografu. 5.4.2.2. Príslušenstvo Injekčná striekačka na plynovú chromatografiu, série A2 na „presné dávkovanie vzoriek“, s objemom 25 ml alebo 50 ml (obrázok č. 5) alebo ekvivalent. Táto striekačka je na ihlovom konci vybavená posuvným ventilom. Striekačka sa pripája k vzorkovnici pomocou spojovacej súčiastky na fľaši a polyetylénovej hadičky (dĺžka 8 mm, vnútorný priemer 2,5

1. mm)na striekačke. 5.4.2.3. Postup Po odobratí príslušného množstva aerosólového výrobku do fľaše sa podľa 5.4.2.2 pripojí k prečerpávacej fľaši kužeľový koniec striekačky. Ventil sa otvorí a naberie sa potrebné množstvo kvapaliny. Niekoľkonásobným posúvaním piestu sa odstránia bublinky plynu (ak je to potrebné a striekačka sa ochladí). Keď striekačka obsahuje potrebné množstvo kvapaliny bez bubliniek, ventil sa uzavrie a striekačka sa odpojí od fľaše na prenášanie vzoriek. Nasadí sa ihla, striekačka sa vsunie do dávkovacieho ventilu plynového chromatografu, ventil sa otvorí a vzorka sa nastrekne. 5.4.2.4. Vnútorný štandard – ak sa vyžaduje vnútorný štandard, zavedie sa do fľaše na prenášanie vzoriek (obyčajnou sklenenou striekačkou s použitím spojovacej súčiastky). Obrázok č. 1: Spojka P1 Obrázok č. 2: Spojka M2 na prenos medzi vnútorným a vonkajším ventilom Obrázok č. 3: Spojka M1 na prenos medzi vnútornými ventilmi Obrázok č. 4: Vzorkovnica s objemom 50 až 100 ml Obrázok č. 5: Tlaková injekčná striekačka na plyn 3. DÔKAZ A STANOVENIE VOĽNÉHO HYDROXIDU SODNÉHO A HYDROXIDU DRASELNÉHO (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda určuje postup na dôkaz voľného hydroxidu sodného a/alebo hydroxidu draselného v kozmetických výrobkoch, ktoré ho obsahujú vo významnom množstve, a na stanovenie voľného hydroxidu sodného a/alebo draselného vo výrobkoch na narovnávanie vlasov a vo výrobkoch na odstraňovanie prínechtovej kože. 2. DEFINÍCIA Obsah voľného hydroxidu sodného a hydroxidu draselného je definovaný objemom štandardnej kyseliny potrebnej na neutralizáciu výrobku, za určených podmienok. Výsledné množstvo sa vyjadrí ako hmotnostné percento voľného hydroxidu sodného. 3. PRINCÍP Vzorka sa rozpustí alebo rozdisperguje vo vode a titruje sa štandardnou kyselinou. Súčasne s pridávaním kyseliny sa zaznamenáva hodnota pH. Pre jednoduchý roztok hydroxidu sodného alebo draselného je koncový bod titrácie jednoznačne bodom maximálnej zmeny zaznamenávanej hodnoty pH. Jednoduchá titračná krivka môže byť skreslená prítomnosťou
2. a)amoniaku alebo iných slabých organických zásad, ktoré majú samy osebe pomerne plochú titračnú krivku. Amoniak sa odstráni odparením za zníženého tlaku pri laboratórnej teplote,
3. b)soli slabých kyselín, ktoré môžu spôsobiť, že titračná krivka má niekoľko inflexných bodov. V takýchto prípadoch zodpovedá neutralizácii hydroxidového aniónu, pochádzajúceho z voľného hydroxidu sodného alebo draselného, len prvá časť krivky až do prvého inflexného bodu. Alternatívny postup pre titráciu v alkohole je uvedený pre prípad, keď je pozorovaná nadmerná interferencia soľami slabých anorganických kyselín. Existuje teoretická možnosť, že by mohli byť prítomné iné rozpustné silné zásady, napr. hydroxid lítny alebo hydroxidy kvartérnych amóniových solí, ktoré by mohli spôsobiť vysoké pH. Prítomnosť takýchto typov zásad v kozmetických výrobkoch je veľmi nepravdepodobná. 4. DÔKAZ 4.1. Činidlá 4.1.1. Štandardný alkalický tlmivý roztok, pH 9,18 pri 25 oC – 0,05 M roztok dekahydrátu tetraboritanu sodného 4.2. Prístroje a pomôcky 4.2.1. Bežné laboratórne sklo 4.2.2. pH-meter 4.2.3. Sklenená membránová elektróda 4.2.4. Štandardná kalomelová referenčná elektróda 4.3. Postup pH-meter s elektródami sa kalibruje s použitím štandardného tlmivého roztoku. Pripraví sa 10 % roztok vo vode alebo vodná disperzia výrobku, určeného na analýzu a prefiltruje sa. Odmeria sa pH. Ak je pH 12 alebo viac, musí sa uskutočniť kvantitatívne stanovenie. 5. STANOVENIE 5.1. Titrácia vo vodnom prostredí 5.1.1. Činidlo 5.1.1.1. Štandardná 0,1 N kyselina chlorovodíková 5.1.2. Prístroje a pomôcky 5.1.2.1. Bežné laboratórne sklo 5.1.2.2. pH-meter, pokiaľ možno so zapisovačom 5.1.2.3. Sklenená membránová elektróda 5.1.2.4. Štandardná kalomelová referenčná elektróda 5.1.3. Postup Do 150 ml kadičky sa presne naváži skúšobná vzorka v rozmedzí 0,5 až 1 g. Ak je prítomný amoniak, pridá sa niekoľko varných kamienkov, kadička sa umiestni do vákuového exsikátora, evakuuje sa pomocou vodnej vývevy dovtedy, kým nie je detekovateľný zápach amoniaku (asi 3 hodiny). Pridá sa 100 ml vody, odparok sa rozpustí alebo rozdisperguje a titruje 0,1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej (5.1.1.1.) pri súčasnom zaznamenávaní zmeny hodnoty pH (5.1.2.2.). 5.1.4. Výpočet Na titračných krivkách sa určia inflexné body. Ak sa prvý z inflexných bodov nachádza pri pH nižšom ako 7, vzorka neobsahuje hydroxid sodný alebo draselný. Ak sú na krivke dva alebo viac inflexných bodov, iba prvý z nich je relevantný. Zapíše sa spotreba titračného činidla po prvý inflexný bod, kde V je objem titračného činidla v ml, M je hmotnosť skúšobnej vzorky v g. Obsah hydroxidu sodného a/alebo draselného vo vzorke vyjadrený v hmotnostných percentách hydroxidu sodného sa vypočíta podľa vzorca Môže nastať situácia, keď napriek náznaku prítomnosti určitého množstva hydroxidu sodného a/alebo draselného titračná krivka neposkytuje jednoznačný inflexný bod. V takom prípade sa stanovenie zopakuje v izopropylalkohole. 5.2. Titrácia v izopropylalkohole 5.2.1. Činidlá 5.2.1.1. Izopropylalkohol (propán-2-
4. ol)5.2.1.2. Štandardný 1 N vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej 5.2.1.3. 0,1 N roztok kyseliny chlorovodíkovej v izopropylalkohole pripravený tesne pred použitím zriedením 1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej s izopropylalkoholom. 5.2.2. Prístroje a pomôcky 5.2.2.1. Bežné laboratórne sklo 5.2.2.2. pH-meter, pokiaľ možno so zapisovačom 5.2.2.3. Sklenená membránová elektróda 5.2.2.4. Štandardná kalomelová referenčná elektróda 5.2.3. Postup Do 150 ml kadičky sa presne naváži skúšobná vzorka v rozsahu 0,5 až 1 g. Ak je prítomný amoniak, pridá sa niekoľko varných kamienkov, kadička sa umiestni do vákuového exsikátora, evakuuje sa pomocou vodnej vývevy dovtedy, kým zápach amoniaku nie je detekovateľný (asi 3 hodiny). Pridá sa 100 ml izopropylalkoholu, odparok sa rozpustí alebo rozdisperguje a titruje sa 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou v izopropylalkohole (5.2.1.3.) pri súčasnom zaznamenávaní zmeny pH (5.1.2.2.). 5.2.4. Výpočet Podľa 5.1.4. Prvý inflexný bod je pri pH okolo 9. 5.3. Opakovateľnosť2) Pri obsahu asi 5 % (hmot.) hydroxidu sodného alebo draselného vyjadreného ako hydroxid sodný nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,25 %. 4. DÔKAZ A STANOVENIE KYSELINY ŠŤAVEĽOVEJ A JEJ ALKALICKÝCH SOLÍ VO VÝROBKOCH NA STAROSTLIVOSŤ O VLASY (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA alej opísaná metóda je vhodná na stanovenie a dôkaz kyseliny šťaveľovej a jej alkalických solí vo výrobkoch určených na starostlivosť o vlasy. Môže byť použitá pri bezfarebných vodných/alkoholických roztokoch a lotionoch, ktoré obsahujú približne 5 % kyseliny šťaveľovej alebo ekvivalentné množstvo alkalických šťaveľanov. 2. DEFINÍCIA Obsah kyseliny šťaveľovej a/alebo jej alkalických solí stanovený touto metódou sa vyjadrí ako hmotnostné percento voľnej kyseliny šťaveľovej vo vzorke. 3. PRINCÍP Po odstránení všetkých prítomných aniónových povrchovo aktívnych látok hydrochloridom p-toluidínu sa kyselina šťaveľová a/alebo šťaveľany vyzrážajú ako šťaveľan vápenatý, potom sa roztok prefiltruje. Zrazenina sa rozpustí v kyseline sírovej a titruje sa manganistanom draselným. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. 5 % (hmot.) roztok octanu amónneho 4.2. 10 % (hmot.) roztok chloridu vápenatého 4.3. 95 % (obj.) etanol 4.4. Chlorid uhličitý 4.5. Dietyléter 4.6. 6,8 % (hmot.) roztok dihydrochloridu p-toluidínu 4.7. 0,1 N roztok manganistanu draselného 4.8. 20 % (hmot.) kyselina sírová 4.9. 10 % (hmot.) kyselina chlorovodíková 4.10. Trihydrát octanu sodného 4.11. Ľadová kyselina octová 4.12. Kyselina sírová (1:1) 4.13. Nasýtený roztok hydroxidu bárnatého 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Oddeľovacie lieviky, 500 ml 5.2. Kadičky, 50 ml a 600 ml 5.3. Sklenené filtračné tégliky, G-4 5.4. Odmerné valce, 25 ml a 100 ml 5.5. Pipety, 10 ml 5.6. Odsávacie banky, 500 ml 5.7. Vodná výveva 5.8. Teplomer, delený od 0 do 100 oC 5.9. Magnetické miešadlo s vyhrievacím telesom 5.10. Magnetické miešadielka potiahnuté teflónom 5.11. Byreta, 25 ml 5.12. Kužeľovité banky, 250 ml 6. POSTUP 6.1. Do 50 ml kadičky sa naváži približne 6 až 7 g vzorky, pH sa upraví zriedenou kyselinou chlorovodíkovou (4.9.) na 3 a spláchne sa 100 ml destilovanej vody do oddeľovacieho lievika. Jeden po druhom sa pridá 25 ml etanolu (4.3.), 25 ml roztoku dihydrochloridu p–toluidínu (4.6.) a 25 až 30 ml chloridu uhličitého (4.4.) a zmes sa intenzívne pretrepe. 6.2. Po oddelení fáz sa odpustí dolná organická fáza, extrakcia sa zopakuje s použitím činidiel uvedených v 6.1. a organická fáza sa znova odpustí. 6.3. Vodný roztok sa zmyje do 600 ml kadičky a stále prítomný zvyšok chloridu uhličitého sa odstráni prevarením roztoku. 6.4. Pridá sa 50 ml roztoku octanu amónneho (4.1.), roztok sa zahreje do varu (5.9.) a za miešania sa do roztoku vo vare pridá 10 ml horúceho roztoku chloridu vápenatého (4.2.). Zrazenina sa nechá usadiť. 6.5. Pridaním niekoľkých kvapiek roztoku chloridu vápenatého (4.2.) sa overí, či je vyzrážanie úplné, nechá sa ochladiť na laboratórnu teplotu a potom sa za miešania (5.10.) pridá 200 ml etanolu (4.3.) a nechá sa stáť 30 minút. 6.6. Prefiltruje sa cez sklenený filtračný téglik (5.3.), zrazenina sa prenesie malým množstvom horúcej vody (50 až 60 oC) na filter téglika a premyje sa studenou vodou. 6.7. Zrazenina sa päťkrát premyje malým množstvom etanolu (4.3.), potom päťkrát malým množstvom dietyléteru (4.5.), rozpustí v 50 ml horúcej kyseliny sírovej (4.8.) presatím kyseliny cez filter téglika za zníženého tlaku. 6.8. Roztok sa kvantitatívne prenesie do kužeľovitej banky (5.11.) a titruje sa roztokom manganistanu draselného (4.7.), kým sa nesfarbí na bledoružovo. 7. VÝPOČET Obsah vzorky vyjadrený ako hmotnostné percentá kyseliny šťaveľovej sa vypočíta podľa vzorca kde A je spotreba 0,1 N roztoku manganistanu draselného (6.8.), E je množstvo skúšobnej vzorky v gramoch (6.1.), 4,50179 je prepočítavací faktor pre kyselinu šťaveľovú. 8. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu asi 5 % kyseliny šťaveľovej nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,15 %. 9. DÔKAZ 9.1. Princíp Kyselina šťaveľová a/alebo šťaveľany sa vyzrážajú ako šťaveľan vápenatý a rozpustí sa v kyseline sírovej. Do roztoku sa pridá malé množstvo manganistanu draselného, ktorý sa odfarbuje a spôsobuje vznik oxidu uhličitého. Keď sa vznikajúci oxid uhličitý prepúšťa cez roztok hydroxidu bárnatého, vzniká biela zrazenina (mliečny zákal) uhličitanu bárnatého. 9.2. Postup 9.2.1. Skúšobná vzorka určená na analýzu sa spracuje podľa 6.1. až 6.3. Tým sa odstránia akékoľvek prítomné detergenty. 9.2.2. K približne 10 ml roztoku získaného podľa 9.2.1. sa pridá za špičku špachtle octanu sodného (4.10.) a roztok sa okyslí niekoľkými kvapkami ľadovej kyseliny otcovej (4.11.). 9.2.3. Pridá sa 10 % roztok chloridu vápenatého (4.2.) a prefiltruje sa. Šťaveľan vápenatý sa rozpustí v 2 ml kyseliny sírovej (1:1) (4.12.). 9.2.4. Roztok sa prenesie do skúmavky a po kvapkách sa pridá asi 0,5 ml 0,1 M roztoku manganistanu draselného (4.7.). Ak sú prítomné šťaveľany, roztok sa odfarbuje najskôr pomaly a potom rýchlo. 9.2.5. Ihneď po pridaní manganistanu draselného sa skúmavka uzavrie vhodnou zátkou so sklenenou trubičkou, obsah sa mierne zahreje a vznikajúci oxid uhličitý sa zachytí do nasýteného roztoku hydroxidu bárnatého (4.13.). Objavenie sa mliečneho zákalu uhličitanu bárnatého do 3 až 5 minút je dôkazom prítomnosti kyseliny šťaveľovej. 5. STANOVENIE CHLOROFORMU V ZUBNÝCH PASTÁCH (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda sa používa na stanovenie chloroformu v zubných pastách plynovou chromatografiou. Táto metóda je vhodná na stanovenie chloroformu s úrovňami obsahu 5 % a menej. 2. DEFINÍCIA Obsah chloroformu stanovený touto metódou sa vyjadrí v hmotnostných percentách výrobku. 3. PRINCÍP Zubná pasta sa suspenduje v zmesi dimetylformamid/metanol, do ktorej sa pridá známe množstvo acetonitrilu ako vnútorného štandardu. Po odstredení na centrifúge sa časť kvapalnej fázy podrobí plynovej chromatografii a vypočíta sa obsah chloroformu. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. Porapak Q, Chromosorb 101 alebo ekvivalent, 80 až 100 mesh 4.2. Acetonitril 4.3. Chloroform 4.4. Dimetylformamid 4.5. Metanol 4.6. Roztok vnútorného štandardu Do 50 ml odmernej banky sa napipetuje 5 ml dimetylformamidu (4.4.) a pridá sa asi 300 mg (M v miligramoch) acetonitrilu. Doplní sa po značku dimetylformamidom a premieša sa. 4.7. Roztok na stanovenie relatívneho odozvového faktora Do 10 ml odmernej banky sa napipetuje presne 5 ml roztoku vnútorného štandardu (4.6.) a pridá sa asi 300 mg (M1 v miligramoch) chloroformu. Doplní sa po značku dimetylformamidom a premieša sa. 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Analytické váhy 5.2. Plynový chromatograf s plameňovo-ionizačným detektorom 5.3. Mikrostriekačky, 5 až 10 µl, delené po 0,1 µl 5.4. Nedelené pipety, 1, 4 a 5 ml 5.5. Odmerné banky, 10 a 50 ml 5.6. Skúmavky, 20 ml so skrutkovacími uzávermi, Sovirel France č. 20 alebo ekvivalent. Skrutkovací uzáver má vnútornú tesniacu platničku pokrytú z jednej strany teflónom. 5.7. Centrifúga 6. POSTUP 6.1. Vhodné podmienky na plynovú chromatografiu 6.1.1. Materiál kolóny sklo Dĺžka 150 cm Vnútorný priemer 4 mm Vonkajší priemer 6 mm 6.1.2. Kolóna Naplní sa pomocou vibrátora Porapakom Q, Chromosorbom 101 alebo ekvivalentom, 80 až 100 mesh (4.1.), ktorý sa upraví kyselinou. 6.1.3. Citlivosť plameňovo-ionizačného detektora sa nastaví tak, aby po nastreknutí 3 µl roztoku (4.7.) siahala výška píku acetonitrilu asi do 3/4 maximálnej výchylky. 6.1.4. Plyny Nosný plyn – dusík, prietoková rýchlosť 65 ml/min. Pomocný plyn – vodík, vzduch alebo kyslík Prietok plynov do detektora sa nastaví tak, že prietok vzduchu alebo kyslíka je 5 až 10-krát väčší ako prietok vodíka. 6.1.5. Teplota Dávkovací ventil 210 oC Detektor 210 oC Kolónová pec 175 oC 6.1.6. Rýchlosť zapisovača približne 100 cm za hodinu. 6.2. Príprava vzorky Na analýzu sa použije neporušená uzatvorená tuba, odstráni sa jedna tretina obsahu, tuba sa uzavrie, obsah sa starostlivo premieša a potom sa odoberie skúšobná vzorka. 6.3. Stanovenie 6.3.1. Do skúmavky so skrutkovacím uzáverom (5.6.) sa s presnosťou na 10 mg naváži 6 až 7 g (Mo gramoch) zubnej pasty pripravenej podľa (6.2.) a pridajú sa tri malé sklenené guľôčky. 6.3.2. Do skúmavky sa napipetuje presne 5 ml roztoku vnútorného štandardu (4.6.), 4 ml dimetylformamidu (4.4.) a 1 ml metanolu (4.5.). Skúmavka sa uzavrie a premieša sa. 6.3.3. Pretrepáva sa pol hodiny na mechanickej trepačke. Uzavretá skúmavka sa odstreďuje 15 minút na centrifúge pri takej rýchlosti, ktorá spôsobí úplnú separáciu fáz. Poznámka: Niekedy sa môže stať, že kvapalná fáza aj po odstredení na centrifúge ostáva stále zakalená. Určité zlepšenie sa dosiahne pridaním 1 až 2 g chloridu sodného do kvapalnej fázy a novým odstredením po usadení. 6.3.4. Za podmienok podľa 6.1. sa nastreknú 3 µl roztoku (6.3.3.). Táto operácia sa zopakuje. Za opísaných podmienok môžu byť návodom tieto retenčné časy: metanol približne 1 minúta, acetonitril približne 2,5 minúty, chloroform približne 6 minút, dimetylformamid > 15 minút. 6.3.5. Stanovenie relatívneho odozvového faktora Na stanovenie tohto faktora sa nastreknú 3 µl roztoku (4.7.). Táto operácia sa zopakuje. Relatívny odozvový faktor sa stanovuje denne. 7. VÝPOČTY 7.1. Výpočet relatívnej odozvy 7.1.1. Zmeria sa výška a šírka v polovičnej výške pre píky acetonitrilu a chloroformu a vypočíta sa plocha oboch píkov podľa vzorca výška x šírka v polovičnej výške. 7.1.2. Stanoví sa plocha píkov acetonitrilu a chloroformu v chromatogramoch získaných v súlade s časťou (6.3.5.) a relatívna odozva fs sa vypočíta podľa vzorca kde fs je relatívny odozvový faktor pre chloroform, As je plocha píku chloroformu (6.3.5.), Ai je plocha píku acetonitrilu (6.3.5.), Ms je množstvo chloroformu v mg na 10 ml roztoku podľa 6.3.5. (M1), Mi je množstvo acetonitrilu v mg na 10 ml roztoku podľa 6.3.5. (1/10M). Z odčítaných hodnôt sa vypočíta priemerná hodnota. 7.2. Výpočet obsahu chloroformu 7.2.1. Postupom podľa 7.1.1. sa vypočíta plocha píku chloroformu a acetonitrilu z chromatogramu získaného podľa 6.3.4. 7.2.2. Obsah chloroformu v hmotnostných percentách v zubnej paste sa vypočíta podľa vzorca kde As je plocha píku chloroformu (6.3.4.), Ai je plocha píku acetonitrilu (6.3.4.), Msx je množstvo vzorky podľa 6.3.1. v mg (1 000 M0), Mi je množstvo acetonitrilu v mg na 10 ml roztoku podľa 6.3.2. (1/10 M). Zo zistených hladín úrovne obsahu sa vypočíta priemerná hodnota s presnosťou na 0,1 %. 8. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu asi 3 % chloroformu nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,3 %. 6. STANOVENIE ZINKU (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980 v znení smernice Komisie 87/143/EHS) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda je vhodná na stanovenie zinku prítomného ako chlorid, síran alebo 4-hydroxybenzénsulfonát alebo ako zmes niekoľkých týchto zinočnatých solí v kozmetických výrobkoch. 2. DEFINÍCIA Obsah zinku vo vzorke sa stanoví gravimetricky ako bis (2–metyl–8–chinolyloxid) a vyjadrí sa v hmotnostných percentách zinku vo vzorke. 3. PRINCÍP Zinok prítomný vo vzorke sa vyzráža v kyslom prostredí ako bis (2–metyl–8–chinolyloxid) zinočnatý. Po odfiltrovaní sa zrazenina vysuší a odváži. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. 25 % (hmot.) koncentrovaný roztok amoniaku,d204 = 0,91 4.2. Ľadová kyselina octová 4.3. Octan amónny 4.4. 2–Metylchinolín–8–ol 4.5. 6 % (m/V) roztok amoniaku 240 g koncentrovaného amoniaku (4.1.) sa prenesie do 1 000 ml odmernej banky, doplní sa destilovanou vodou po značku a premieša sa. 4.6. 0,2 M roztok octanu amónneho 15,4 g octanu amónneho (4.3.) sa rozpustí v destilovanej vode, doplní sa v 1 000 ml odmernej banke po značku a premieša sa. 4.7. Roztok 2–metylchinolín–8–olu 5 g 2-metylchinolín-8-olu sa rozpustí v 12 ml ľadovej kyseliny octovej a destilovanou vodou sa prenesie do 100 ml odmernej banky. Doplní sa destilovanou vodou po značku a premieša sa. 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Odmerné banky, 100 a 1 000 ml 5.2. Kadičky, 400 ml 5.3. Odmerné valce, 50 a 150 ml 5.4. Delené pipety, 10 ml 5.5. Sklenené filtračné tégliky, G-4 5.6. Vákuové banky, 500 ml 5.7. Vodná výveva 5.8. Teplomer, delený od 0 do 100 oC 5.9. Exsikátor s vhodným sušidlom a indikátorom vlhkosti, napr. silikagél alebo ekvivalent 5.10. Sušička s reguláciou teploty na 150 ± 2 oC 5.11. pH-meter 5.12. Vyhrievacia platňa 6. POSTUP 6.1. Do 400 ml kadičky sa naváži 5 až 10 g (M v gramoch) vzorky určenej na analýzu, obsahujúcej približne 50 až 100 mg zinku, pridá sa 50 ml destilovanej vody a premieša sa. 6.1.1 Zmes sa podľa potreby prefiltruje pomocou vývevy a filtrát sa zachytí. 6.1.2 Extrakcia sa opakuje s ďalšími 50 ml destilovanej vody, prefiltruje sa a filtráty sa zlúčia. 6.2. Na každých 10 mg zinku prítomného v roztoku (6.1.2.) sa pridá 2 ml roztoku 2–metylchinolín–8–olu (4.7.) a premieša sa. 6.3. Zmes sa zriedi 150 ml destilovanej vody, zahreje sa na teplotu 60 C (5.12.) a za stáleho miešania sa pridá 45 ml 0,2 M roztoku octanu amónneho (4.6.). 6.4. pH roztoku sa upraví za stáleho miešania 6 % (hmot.) roztokom amoniaku (4.5.) na 5,7 až 5,9. Na meranie pH roztoku sa použije pH meter. 6.5. Roztok sa nechá stáť 30 minút. Prefiltruje sa pomocou vodnej vývevy cez G-4 filter téglika, ktorý sa vopred vysuší (150 oC) a po ochladení odváži (M0 v gramoch). Zrazenina sa premyje 150 ml 95 oC destilovanej vody. 6.6. Téglik sa umiestni do sušičky nastavenej na 150 oC a suší sa jednu hodinu. 6.7. Téglik sa vyberie zo sušičky, umiestni sa do exsikátora (5.9.) a po ochladení na laboratórnu teplotu sa určí jej hmotnosť (M1 v gramoch). 7. VÝPOČTY Obsah zinku vo vzorke v hmotnostných percentách sa vypočíta podľa vzorca kde M je hmotnosť vzorky (6.1.) v gramoch, M0 je hmotnosť prázdneho a suchého téglika s filtrom (6.5.) v gramoch, M1 je hmotnosť téglika s filtrom a zrazeninou (6.7.) v gramoch. 8. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu asi 1 % (hmot.) zinku nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,1 %. 7. DÔKAZ A STANOVENIE KYSELINY 4-HYDROXYBENZÉNSULFÓNOVEJ (Podľa smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda je vhodná na dôkaz a stanovenie kyseliny 4-hydroxybenzénsulfónovej v kozmetických výrobkoch, ako sú aerosóly a pleťové lotiony. 2. DEFINÍCIA Obsah kyseliny 4-hydroxybenzénsulfónovej, stanovený v súlade s touto metódou, sa vyjadrí v hmotnostných percentách bezvodého zinkium-4-hydroxybenzénsulfonátu vo výrobku. 3. PRINCÍP Skúšobná vzorka sa zahustí za zníženého tlaku, rozpustí sa vo vode a prečistí sa extrakciou chloroformom. Stanovenie kyseliny 4-hydroxybenzénsulfónovej sa uskutoční jodometricky na alikvotnej časti prefiltrovaného vodného roztoku. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. 36 % (hmot.) koncentrovaná kyselina chlorovodíková (d204 = 1,18) 4.2. Chloroform 4.3. Bután-1-ol 4.4. Ľadová kyselina octová 4.5. Jodid draselný 4.6. Bromid draselný 4.7. Uhličitan sodný 4.8. Kyselina sulfanilová 4.9. Dusitan sodný 4.10. 0,1 N roztok bromičnanu draselného 4.11. 0,1 N roztok tiosíranu sodného 4.12. 1 % (m/V) vodný roztok škrobu 4.13. 2 % (m/V) vodný roztok uhličitanu sodného 4.14. 4,5 % (m/V) vodný roztok dusitanu sodného 4.15. 0,05 % (m/V) roztok ditizónu v chloroforme 4.16. Vyvíjacie rozpúšťadlo Bután-1-ol/ľadová kyselina octová/voda (4 : 1 : 5 v objemových dieloch). Po zmiešaní v oddeľovacom lieviku sa odstráni dolná fáza. 4.17. Paulyho činidlo 4,5 g kyseliny sulfanilovej (4.8.) sa za zahrievania rozpustí v 45 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (4.1.) a roztok sa zriedi vodou do 500 ml. 10 ml roztoku sa ochladí v nádobe s ľadovou vodou a za stáleho miešania sa pridá 10 ml ochladeného roztoku dusitanu sodného (4.14.). Roztok sa nechá stáť 15 minút pri 0 oC (pri tejto teplote ostáva roztok stabilný 1 – 3 dni) a tesne pred nanesením (7.5.) sa pridá 20 ml roztoku uhličitanu sodného (4.13.). 4.18. Hotové celulózové platne pre tenkovrstvovú chromatografiu, rozmery 20 x 20 cm, hrúbka vrstvy adsorbentu 0,25 mm 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Banky s guľatým dnom a zábrusovou sklenenou zátkou, 100 ml 5.2. Oddeľovací lievik, 100 ml 5.3. Kužeľovitá banka so zábrusovou sklenenou zátkou, 250 ml 5.4. Byreta, 25 ml 5.5. Nedelené pipety, 1, 2 a 10 ml 5.6. Delená pipeta, 5 ml 5.7. Mikrostriekačka, 10 µl, delená po 0,1 µl 5.8. Teplomer, delený od 0 oC do 100 oC 5.9. Vodný kúpeľ vybavený vyhrievacím telesom 5.10. Sušička s dobrým vetraním nastaviteľná na 80 oC 5.11. Bežná aparatúra na uskutočnenie tenkovrstvovej chromatografie 6. PRÍPRAVA VZORKY Pri nižšie opísanej metóde na dôkaz a stanovenie kyseliny 4-hydroxybenzénsulfónovej v aerosóloch sa použije zvyšok získaný uvoľnením tých rozpúšťadiel a hnacích plynov z aerosólu, ktoré sa môžu odpariť za normálneho tlaku. 7. DÔKAZ 7.1. S pomocou mikrostriekačky (5.7.) sa na každý zo šiestich bodov na čiare štartu, vo vzdialenosti 1 cm od spodného okraja tenkovrstvovej platne (4.18.), nanesie po 5 µl odparku (6.) alebo vzorky. 7.2. Platňa sa umiestni do vyvíjacej komory, ktorá už obsahuje vyvíjacie rozpúšťadlo (4.16.), a vyvíja sa, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne 15 cm od čiary štartu. 7.3. Platňa sa vyberie z kúpeľa a vysuší sa pri 80 oC dovtedy, kým už nie sú vnímateľné pary kyseliny octovej. Platňa sa postrieka roztokom uhličitanu sodného (4.13.) a vysuší sa na vzduchu. 7.4. Jedna polovica platne sa prikryje sklenenou platňou a neprikrytá časť sa postrieka 0,05 % roztokom ditizónu (4.15.). Objavenie sa fialovočervených škvŕn na chromatograme je dôkazom prítomnosti zinočnatých iónov. 7.5. Postriekaná polovica platne sa prikryje sklenenou platňou a druhá polovica sa postrieka Paulyho činidlom (4.17.). Dôkazom prítomnosti kyseliny 4-hydroxybenzénsulfónovej je objavenie sa žltohnedých škvŕn s Rf hodnotou okolo 0,26. Žlté škvrny s Rf hodnotou okolo 0,45 na chromatograme sú dôkazom prítomnosti kyseliny 3-hydroxybenzénsulfónovej. 8. STANOVENIE 8.1. Do 100 ml banky s guľatým dnom sa naváži 10 g vzorky alebo zvyšku (6.) a odparí sa vo vodnom kúpeli vyhriatom na 40 oC v rotačnej vákuovej odparke za vákua takmer dosucha. 8.2. Do banky sa napipetuje 10 ml (V1 v mililitroch) vody a zvyšok po odparení (8.1.) sa za zahrievania rozpustí. 8.3. Roztok sa kvantitatívne prenesie do oddeľovacieho lievika (5.2.) a vodný roztok sa extrahuje dvakrát 20 ml dávkami chloroformu (4.2.). Chloroformová fáza sa po každej extrakcii odstráni. 8.4. Vodný roztok sa prefiltruje cez skladaný filter. V závislosti od očakávaného obsahu kyseliny hydroxybenzénsulfónovej sa do 250 ml kužeľovitej banky (5.3.) napipetuje 1 až 2 ml (V2 v mililitroch) filtrátu a zriedi sa do 75 ml vodou. 8.5. Pridá sa 2,5 ml 36 % kyseliny chlorovodíkovej (4.1.) a 2,5 g bromidu draselného (4.6.), premieša sa a roztok sa vo vodnom kúpeli zahreje na teplotu 50 oC. 8.6. Z byrety sa pridáva 0,02 N roztok bromičnanu draselného (4.10.), kým sa roztok zahriaty na 50 oC nesfarbí nažlto. 8.7. Pridajú sa ďalšie 3 ml roztoku bromičnanu draselného (4.10.), banka sa zazátkuje a nechá sa stáť 10 minút vo vodnom kúpeli pri 50 oC. Ak roztok po 10 minútach stratí sfarbenie, pridajú sa ďalšie 2 ml roztoku bromičnanu draselného (4.10.), banka sa zazátkuje a zahrieva sa 10 minút vo vodnom kúpeli zahriatom na 50 oC. Zaznamená sa celkové množstvo pridaného roztoku bromičnanu draselného (a). 8.8. Roztok sa ochladí na laboratórnu teplotu, pridajú sa 2 g jodidu draselného (4.5.) a premieša sa. 8.9. Vzniknutý jód sa titruje 0,1 N roztokom tiosíranu sodného (4.11.). Pred koncom titrácie sa pridá niekoľko kvapiek roztoku škrobu (4.12.) ako indikátora. Zaznamená sa spotrebované množstvo roztoku tiosíranu sodného (b). 9. VÝPOČET Obsah zinkium-hydroxybenzénsulfonátu vo vzorke alebo vo zvyšku (6.) v hmotnostných percentách sa vypočíta podľa vzorca kde a je celkové množstvo pridaného 0,02 N roztoku bromičnanu draselného v mililitroch (8.7.), b je množstvo 0,1 N roztoku tiosíranu sodného, spotrebovaného na spätnú titráciu (8.9.) v mililitroch, m je množstvo analyzovaného výrobku alebo odparku (8.1.) v miligramoch, V1 je objem roztoku podľa 8.2. v mililitroch, V2 je objem rozpusteného zvyšku po odparení, použitého na analýzu (8.4.) v mililitroch. V prípade aerosólov sa výsledok hmotnostných percent odparku (6.) musí vyjadriť prepočtom na pôvodný výrobok. Na účel tohto prepočtu sa uvedie odkaz na odber vzoriek z aerosólov. 10. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu asi 5 % zinkium-hydroxybenzénsulfonátu nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť absolútnu hodnotu 0,5 %. 11. INTERPRETÁCIA VÝSLEDKOV Podľa osobitného predpisu3) je najvyššie povolený obsah zinkium-4-hydroxybenzénsulfonátu v pleťových lotionoch a dezodorantoch 6 % (hmot.). To znamená, že popri obsahu kyseliny hydroxybenzénsulfónovej sa musí stanoviť aj obsah zinku. Vynásobením vypočítaného obsahu zinkium-hydroxybenzénsulfonátu

(9)faktorom 0,1588 sa získa minimálny obsah zinku v hmotnostných percentách, ktorý musí byť teoreticky prítomný vo výrobku vzhľadom na stanovený obsah kyseliny hydroxybenzénsulfónovej. Skutočný obsah zinku, stanovený gravimetricky, však môže byť vyšší, pretože v kozmetických výrobkoch možno použiť aj chlorid zinočnatý a síran zinočnatý. 8. DÔKAZ OXIDAČNÝCH ČINIDIEL A STANOVENIE PEROXIDU VODÍKA VO VÝROBKOCH VLASOVEJ KOZMETIKY (Podľa smernice Komisie 82/434/EHS zo 14. mája 1982) ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Jodometrické stanovenie peroxidu vodíka v kozmetike je možné len v neprítomnosti ostatných oxidačných činidiel, ktoré vytvárajú jód z jodidov. V dôsledku toho je pred jodometrickým stanovením peroxidu vodíka potrebné detekovať a identifikovať každé iné prítomné oxidačné činidlo. Tento dôkaz pozostáva z dvoch fáz, kde prvá zahŕňa peroxosírany, bromičnany a peroxid vodíka a druhá peroxid bárnatý. A. DÔKAZ PEROXOSÍRANOV, BROMIČNANOV A PEROXIDU VODÍKA 1. PRINCÍP Peroxosíran sodný, peroxosíran draselný a peroxosíran amónny; bromičnan draselný, bromičnan sodný a peroxid vodíka, aj ten, ktorý pochádza z peroxidu bárnatého, sa dokazujú zostupnou papierovou chromatografiou s použitím dvoch vyvíjacích rozpúšťadiel. 2. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 2.1. 0,5 % (m/V) vodné referenčné roztoky: 2.1.1. peroxosíranu sodného 2.1.2. peroxosíranu draselného 2.1.3. peroxosíranu amónneho 2.1.4. bromičnanu draselného 2.1.5. bromičnanu sodného 2.1.6. peroxidu vodíka 2.2. Vyvíjacie rozpúšťadlo A: 80 % (obj.) etanol 2.3. Vyvíjacie rozpúšťadlo B benzén/metanol/3-metylbután-1-ol/voda (v objemových dieloch 34 : 38 : 18 : 10) 2.4. Detekčné činidlo A 10 % (m/V) vodný roztok jodidu draselného 2.5. Detekčné činidlo B 1 % (m/V) vodný roztok škrobu 2.6. Detekčné činidlo C 10 % (hmot.) roztok kyseliny chlorovodíkovej 2.7. 4 N roztok kyseliny chlorovodíkovej 3. PRÍSTROJE A POMÔCKY 3.1. Chromatografický papier (Whatman č. 3 a č. 4 alebo ich ekvivalent) 3.2. Mikropipeta, 1 µl 3.3. Odmerné banky, 100 ml 3.4. Skladané filtre 3.5. Vyvíjacia komora na zostupnú papierovú chromatografiu 4. PRÍPRAVA VZORKY 4.1. Výrobky rozpustné vo vode Z každej vzorky sa pripravia dva roztoky rozpustením 1 g a 5 g výrobku v 100 ml vody. 1 µl každého z týchto roztokov sa použije na papierovú chromatografiu (5.). 4.2. Výrobky málo rozpustné vo vode 4.2.1. 1 g a 5 g vzorky sa disperguje v 50 ml vody, obidve disperzie sa doplnia vodou do 100 ml, premiešajú sa a prefiltrujú sa cez skladaný filter (3.4.). Na uskutočnenie papierovej chromatografie (5.) sa použije 1 µl každého z filtrátov. 4.2.2. Ešte raz sa pripravia dve disperzie z každej vzorky, dispergovaním 1 g a 5 g v 50 ml vody. Okyslia sa zriedenou kyselinou chlorovodíkovou (2.7.), doplnia sa vodou do 100 ml a premiešajú sa. Disperzie sa prefiltrujú cez skladaný filter (3.4.) a na uskutočnenie papierovej chromatografie (5.) sa použije po 1 µl každého z filtrátov. 4.3. Krémy V 100 ml vody sa disperguje 5 g a 20 g každého výrobku a tieto disperzie sa použijú na uskutočnenie papierovej chromatografie (5.). 5. METÓDA 5.1. Na uskutočnenie zostupnej papierovej chromatografie sa použije primerané množstvo rozpúšťadiel A (2.2.) a B (2.3.) do dvoch samostatných chromatografických vyvíjacích komôr. 5.2. Na štartovaciu čiaru pásu chromatografického papiera (Whatman č. 3 alebo jeho ekvivalent) dlhého 40 cm a širokého 20 cm (3.1.) alebo inej vhodnej veľkosti sa nanesie 1 µl jedného roztoku vzorky a jedného referenčného roztoku. 5.3. Tento pás chromatografického papiera (5.2.) sa umiestni do chromatografickej vyvíjacej komory naplnenej rozpúšťadlom A (5.1.) a nechá sa vyvíjať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne 35 cm (asi 15 hodín). 5.4. S použitím ďalšieho pásu chromatografického papiera (Whatman č. 4 alebo jeho ekvivalent) (3.1.) a vyvíjacieho rozpúšťadla B sa zopakuje postup opísaný v častiach (5.2. a 5.3.). Chromatogram sa nechá vyvíjať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne 35 cm (asi 5 hodín). 5.5. Po vyvíjaní sa chromatogramy vyberú a vysušia na vzduchu. 5.6. Škvrny na chromatograme sa zviditeľnia ich postriekaním: 5.6.1. detekčným činidlom A (2.4.) a krátko nato detekčným činidlom B (2.5.). Prvé sa na chromatograme objavia škvrny peroxosíranov nasledované škvrnami peroxidu vodíka. Škvrny sa označia ceruzkou; 5.6.2. detekčným činidlom C (2.6.) na chromatogram podľa 5.6.1. Prítomnosť bromičnanov sa preukáže sivo- modrými škvrnami. 5.7. Za vyššie uvedených podmienok, vzťahujúcich sa na vyvíjacie rozpúšťadlá A (2.2.) a B (2.3.), sú Rf hodnoty referenčných látok (2.1.) približne takéto: Vyvíjacie činidlo A (2.2.) Vyvíjacie činidlo B (2.3.) Peroxosíran sodný Peroxosíran draselný Peroxosíran amónny Bromičnan draselný Bromičnan sodný Peroxid vodíka 0,40 0,40 0,50 0,40 0,40 0,80 0,10 0,02 + 0,05 0,10 + 0,20 0,20 0,10 + 0,20 0,80 B. DÔKAZ PEROXIDU BÁRNATÉHO 1. PRINCÍP Peroxid bárnatý sa dokáže na základe vzniku peroxidu vodíka po okyslení vzorky (A.4.2.) a na základe prítomnosti bárnatého iónu:

1. a)v neprítomnosti peroxosíranov (A), pridaním zriedenej kyseliny sírovej k časti kyslého roztoku vzorky (B.4.1.), v dôsledku čoho sa vytvorí biela zrazenina síranu bárnatého. Prítomnosť bárnatých iónov vo vzorke (B.4.1.) sa opäť potvrdí papierovou chromatografiou nižšie opísaným spôsobom podľa B.5.,
2. b)ak sú súčasne prítomné peroxid bárnatý a peroxosírany (B.4.2.), upravením zvyšku roztoku (B.4.2.) na alkalický. Po rozpustení v kyseline chlorovodíkovej sa prítomnosť bárnatých iónov potvrdí v roztoku taveniny (B.4.2.3.) papierovou chromatografiou a/alebo vyzrážaním síranu bárnatého. 2. ČINIDLÁ 2.1. Metanol 2.2. 36 % (hmot.) koncentrovaná kyselina chlorovodíková 2.3. 6 N kyselina chlorovodíková 2.4. 4 N kyselina chlorovodíková 2.5. Disodná soľ kyseliny rodizónovej 2.6. Chlorid bárnatý (BaCl2 . 2H2O) 2.7. Bezvodý uhličitan sodný 2.8. 1 % (m/V) vodný roztok chloridu bárnatého 2.9. Vyvíjacie rozpúšťadlo, pozostávajúce z metanolu, koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej 36 % a z vody (80 : 10 : 10 v objemových dieloch) 2.10. Detekčné činidlo 0,1 % (m/V) vodný roztok disodnej soli kyseliny rodizónovej čerstvo pripravený pred použitím 3. PRÍSTROJE A POMÔCKY 3.1. Mikropipeta, 5 µl 3.2. Platinové tégliky 3.3. Odmerné banky, 100 ml 3.4. Chromatografický papier Schleicher and Schull 2043 b alebo jeho ekvivalent. Papier sa prečistí vyvíjaním cez noc vo vyvíjacej zostupnej chromatografickej komore (A.3.5.), obsahujúcej vyvíjacie rozpúšťadlo (B.2.9.), a potom sa vysuší. 3.5. Skladaný filtračný papier 3.6. Bežné zariadenie na uskutočnenie vzostupnej papierovej chromatografie 4. PRÍPRAVA VZORKY 4.1. Výrobky bez prítomnosti peroxosíranu 4.1.1. 2 g výrobku sa dispergujú v 50 ml vody a pH disperzie sa upraví kyselinou chlorovodíkovou (B.2.3.) na približne 1. 4.1.2. Vodná disperzia sa prenesie do 100 ml odmernej banky, doplní sa vodou po značku a premieša sa. Táto disperzia sa použije na papierovú chromatografickú analýzu, podľa 5. a na dôkaz bária vyzrážaním síranu. 4.2. Výrobky obsahujúce peroxosírany 4.2.1. 2 g výrobku sa dispergujú v 100 ml vody a prefiltrujú sa. 4.2.2. K vysušenému zvyšku sa pridá 7 až 10-násobok jeho hmotnosti uhličitanu sodného (B.2.7.), premieša sa a zmes sa taví 1/2 hodiny v platinovom tégliku (B.3.2.) 4.2.3. Tavenina sa ochladí na laboratórnu teplotu, rozpustí sa v 50 ml vody a prefiltruje sa (B.3.5.). 4.2.4. Zvyšok sa znova rozpustí v kyseline chlorovodíkovej (B.2.3.) a doplní sa vodou do 100 ml. Tento roztok sa použije na papierovú chromatografickú analýzu podľa 5. a na dôkaz bária vyzrážaním síranu. 5. METÓDA 5.1. Primerané množstvo vyvíjacieho rozpúšťadla (B.2.9.) sa umiestni do vyvíjacej komory pre vzostupnú papierovú chromatografiu a nádoba sa nechá nasýtiť aspoň 15 hodín parami rozpúšťadla. 5.2. Na kus vopred upraveného chromatografického papiera podľa B.3.4. sa nanesie na tri body na štartovacej čiare po 5 µl každého z roztokov pripravených podľa B.4.1.2. a B.4.2.4. a referenčný roztok B.2.8. 5.3. Škvrny vzorky a štandardu sa vysušia na vzduchu. Chromatogram sa vyvíja, kým čelo rozpúšťadla nevystúpi o 30 cm. 5.4. Chromatogram sa vyberie z vyvíjacej nádoby a vysuší sa na vzduchu. 5.5. Škvrny na chromatograme sa zviditeľnia postriekaním papiera detekčným činidlom B.2.10. V prítomnosti bária sa na chromatograme objavia červené škvrny s Rf hodnotou okolo 0,10. C. STANOVENIE PEROXIDU VODÍKA 1. PRINCÍP Jodometrické stanovenie peroxidu vodíka je založené na tejto reakcii: Konverzia prebieha pomaly, ale môže byť urýchlená pridaním molybdénanu amónneho. Vzniknutý jód sa stanoví titráciou tiosíranom sodným a zodpovedá obsahu peroxidu vodíka. 2. DEFINÍCIA Obsah peroxidu vodíka, stanovený nižšie opísaným spôsobom, sa vyjadrí ako hmotnostné percento (% hmotn.) výrobku. 3. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 3.1. 2 N kyselina sírová 3.2. Jodid draselný 3.3. Molybdénan amónny 3.4. 0,1 N roztok tiosíranu sodného 3.5. 10 % (m/V) roztok jodidu draselného pripravený tesne pred použitím 3.6. 20 % (m/V) roztok molybdénanu amónneho 3.7. 1 % (m/V) roztok škrobu 4. PRÍSTROJE A POMÔCKY 4.1. Kadičky, 100 ml 4.2. Byreta, 50 ml 4.3. Odmerné banky, 250 ml 4.4. Odmerné valce, 25 ml a 100 ml 4.5. Nedelené pipety, 10 ml 4.6. Kužeľovité banky, 250 ml 5. METÓDA 5.1. Do 100 ml kadičky sa naváži 10 g (m v gramoch) výrobku, obsahujúceho približne 0,6 g peroxidu vodíka. Obsah sa s vodou prenesie do 250 ml odmernej banky, doplní sa vodou po značku a premieša sa. 5.2. Do 250 ml kužeľovitej banky (4.6.) sa napipetuje 10 ml roztoku vzorky (5.1.) a jeden po druhom sa pridá 100 ml 2 N kyseliny sírovej (3.1.), 20 ml roztoku jodidu draselného (3.5.) a 3 kvapky roztoku molybdénanu amónneho (3.6.). 5.3. Vzniknutý jód sa ihneď titruje 0,1 N roztokom tiosíranu sodného (3.4.) a tesne pred dosiahnutím koncového bodu titrácie sa pridá niekoľko mililitrov roztoku škrobu (3.7.) ako indikátora. Zaznamená sa spotreba 0,1 N roztoku tiosíranu sodného (3.4.) v mililitroch (V). 5.4. Spôsobom podľa (5.2. a 5.3.) sa uskutoční slepý pokus, kde sa 10 ml roztoku vzorky nahradí 10 ml vody. Zaznamená sa spotreba 0,1 N roztoku tiosíranu sodného na slepú titráciu (V0 v mililitroch). 6. VÝPOČET Výpočet obsahu peroxidu vodíka vo výrobku v hmotnostných percentách % (hmot.) sa vypočíta podľa vzorca kde m je množstvo analyzovaného výrobku v gramoch (5.1.), V0 je spotreba 0,1 N roztoku tiosíranu sodného pri slepom pokuse v ml (5.4.), V je spotreba 0,1 N roztoku tiosíranu sodného pri titrácii roztoku vzorky v ml (5.3.). 7. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu asi 6 % hmot. peroxidu vodíka nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,2 %. 9. DÔKAZ A SEMIKVANTITATÍVNE STANOVENIE URČITÝCH OXIDAČNÝCH FARBÍV VO FARBÁCH NA VLASY (Podľa smernice Komisie 82/434/EHS zo 14. mája 1982) 1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda je vhodná na dôkaz a semikvantitatívne stanovenie týchto látok vo farbách na vlasy vo forme krému alebo kvapaliny: Látky Symbol Fenyléndiamíny o-fenyléndiamín (OPD) m-fenyléndiamín (MPD) p-fenyléndiamín (PPD) Metylfenyléndiamíny 4-metyl-1,2-fenyléndiamín (toluén-3,4-diamín) (OTD) 4-metyl-1,3-fenyléndiamín (toluén-2,4-diamín) (MTD) 2-metyl-1,4-fenyléndiamín (toluén-2,5-diamín) (PTD) Diaminofenoly 2,4-diaminofenol (DAP) Hydrochinón Benzén-1,4-diol (H) α-naftol (α-N) Pyrogalol Benzén-1,2,3-triol (P) Rezorcinol Benzén-1,3-diol (R) 2. PRINCÍP Oxidačné farbivá sa extrahujú z farieb vo forme krému alebo kvapaliny s 96 % etanolom pri pH 10 a dokazujú sa tenkovrstvovou chromatografiou, jedno alebo dvojrozmernou. Na semikvantitatívne stanovenie týchto látok sa chromatogramy vzoriek porovnávajú prostredníctvom štyroch vyvíjacích sústav, v ktorých sa vyvíjali chromatogramy referenčných látok, v tom istom čase a za čo najpodobnejších podmienok. 3. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 3.1. Etanol bezvodý 3.2. Acetón 3.3. Etanol 96 % obj. 3.4. Roztok amoniaku, 25 % (d204 = 0,91 g/
3. ml)3.5. Kyselina L-(+)-askorbová 3.6. Chloroform 3.7. Cyklohexán 3.8. Dusík, technický 3.9. Toluén 3.10. Benzén 3.11. Bután-1-ol 3.12. Bután-2-ol 3.13. Kyselina fosforná, 50 % obj. roztok 3.14. Diazóniové činidlo:
4. a)3-nitrobenzéndiazónium-chlórbenzénsulfonát (vo forme stabilizovanej soli) ako v Červenej 2 JN – Francolor alebo
5. b)2-chlór-3-nitrobenzéndiazónium-naftalénbenzoát (vo forme stabilizovanej soli) ako v činidle NNCD – katalógové číslo 74 150 FLUKA, alebo ich ekvivalent 3.15. Dusičnan strieborný 3.16. 4-(dimetylamino)benzaldehyd 3.17. 2,5-dimetylfenol 3.18. Hexahydrát chloridu železitého 3.19. Kyselina chlorovodíková, 10 % (m/V) roztok 3.20. Referenčné látky: sú látky podľa 1. V prípade aminozlúčenín musia byť referenčné látky vo forme ich hydrochloridu (mono- alebo di- ) alebo ako voľné zásady. 3.21. Referenčné roztoky Pripravia sa roztoky referenčných látok podľa (3.20.). Do 10 ml odmernej banky sa naváži 50 mg ± 1 mg referenčnej látky. Pridá sa 5 ml 96 % etanolu (3.3.) a 250 mg kyseliny askorbovej (3.5.). Roztok sa pridaním roztoku amoniaku (3.4.) upraví na alkalický s pH 10 (overí sa indikátorovým papierikom), pridá sa 10 ml 96 % etanolu (3.3.) a premieša sa. Roztoky môžu byť uchovávané jeden týždeň v chlade a bez prístupu svetla. Ak po pridaní kyseliny askorbovej a amoniaku vznikne zrazenina, musí sa pred pokračovaním nechať usadiť. 3.22. Vyvíjacie rozpúšťadlá 3.22.1. Acetón/chloroform/toluén (obj. diely 35 : 25 : 40) 3.22.2. Chloroform/cyklohexán/absolútny etanol/25 % amoniak (obj. diely 80 : 10 : 10 : 1) 3.22.3. Benzén/bután-2-ol/voda (obj. diely 50 : 25 : 25) Poriadne sa premieša a po oddelení pri laboratórnej teplote (20 až 25 oC) sa použije vrchná fáza. 3.22.4. Bután-1-ol/chloroform/činidlo M (obj. diely 7 : 70 : 23). Opatrne sa oddelí pri laboratórnej teplote (20 až 25 oC) a použije sa spodná fáza. Príprava činidla M Roztok amoniaku, 25 % (obj.) 24 obj. dielov Kyselina fosforná, 50 % (3.13.) 1 obj. diel Voda 75 obj. dielov Poznámka – Vyvíjacie rozpúšťadlá, obsahujúce amoniak, sa tesne pred použitím riadne premiešajú. 3.23. Detekčné činidlá 3.23.1. Diazóniové činidlo Pripraví sa 5 % (m/V) vodný roztok vybraného činidla (3.16.) v 100 ml 10 % (m/V) vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.19.). Tento roztok sa musí vždy čerstvo pripraviť tesne pred jeho použitím. 3.23.2. Ehrlichovo činidlo 2 g p-(dimetylamino)benzaldehydu (3.16.) sa rozpustia v 100 ml 10 % (m/V) vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej (3.19.). 3.23.3. 2,5-dimetylfenol, hexahydrát chloridu železitého:
6. a)roztok 1 1 g 2,5-dimetylfenolu (3.17.) v 100 ml 96 % etanolu (3.3.),
7. b)roztok 2 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18.) sa rozpustia v 100 ml 96 % etanolu (3.3.) Na zviditeľnenie škvŕn sa týmito roztokmi vykoná postrek najprv roztokom 1, potom roztokom 2. 3.23.4. Amoniakálny dusičnan strieborný 25 % amoniak (3.4.) sa pridá do 5 % (m/V) vodného roztoku dusičnanu strieborného (3.15.), kým sa zrazenina nerozpustí. Toto činidlo sa musí pripraviť tesne pred použitím. Neuchováva sa. 4. PRÍSTROJE A POMÔCKY 4.1. Bežné laboratórne vybavenie pre tenkovrstvovú chromatografiu 4.1.1. Plastový alebo sklený kryt zostrojený tak, že chromatografická platňa je počas vyvíjania škvŕn a sušenia obklopená dusíkom. Toto opatrenie je nevyhnutné z dôvodu náchylnosti určitých farbív na oxidáciu. 4.1.2. Mikrostriekačka, 10 µl, delená na 0,2 µl dieliky s kolmo zrezanou ihlou, alebo 50 µl viacnásobný dávkovač pripevnený svorkou na stojan tak, aby platňa mohla byť udržiavaná pod dusíkom. 4.1.3. Silikagélové tenkovrstvové platne pripravené na použitie, 0,25 mm hrubé, s rozmermi 20 x 20 cm (Macherey and Nagel, silikagél G-HR na plastovej podložke alebo ich ekvivalent). 4.2. Centrifúga, 4 000 otáčok/min. 4.3. Centrifugačné kyvety, 10 ml s PTFE, vyloženými skrutkovacími uzávermi, alebo ich ekvivalenty. 5. POSTUP 5.1. Spracovanie skúšobných vzoriek Prvé 2 až 3 cm krému vytlačeného z tuby sa vyhodia. Do centrifugačnej kyvety (4.3.), dopredu prefúknutej dusíkom, sa vloží 300 mg kyseliny askorbovej s 3 g krému alebo 3 g homogenizovanej kvapaliny. Po kvapkách sa pridá 25 % amoniak (3.4.), kým pH nie je 10, a doplní sa 96 % etanolom (3.3.) do 10 ml. Zhomogenizuje sa pod dusíkovou atmosférou (3.8.), zazátkuje sa a 10 minút sa odstreďuje na centrifúge pri 4 000 otáčkach/min. Použije sa kvapalný supernatant. 5.2. Chromatografia 5.2.1. Nanesenie škvŕn na platne – Na chromatografickú platňu (4.1.3.) sa pod dusíkovou atmosférou (3.8.) nanesie na 9 bodov vzdialených 1,5 cm od seba na čiare približne 1,5 cm od okraja platne 1 µl každého z vyššie opísaných referenčných roztokov. Tieto škvrny referenčných roztokov sa usporiadajú takto: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD MTD α-N Ďalej sa na body 10 a 11 nanesie po 2 µl testovaných roztokov vzoriek získaných podľa 5.1. Platňa sa uchováva pod dusíkovou atmosférou (3.8.) až do chvíle, kým sa začne vyvíjať. 5.2.2. Vyvíjanie – Platňa sa umiestni do vyvíjacej komory prefúknutej dusíkom (3.8.), nasýtenej jedným zo štyroch vyvíjacích rozpúšťadiel (3.22.) a nechá sa vyvíjať pri laboratórnej teplote (20 až 25 oC) v tme, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne 15 cm od štartovacej čiary. Platňa sa vyberie a vysuší pod dusíkom (3.8.) pri laboratórnej teplote. 5.2.3. Postriekanie – Platňa sa ihneď postrieka jedným zo 4 roztokov, špecifikovaných v 3.23. 5.2.4. Dôkaz – Porovnajú sa Rf hodnoty a farba škvŕn získaných zo vzorky, so škvrnami chromatografovaných referenčných látok. Tabuľka č. 1 udáva príklady Rf hodnôt a farieb pre každú látku v závislosti od použitého rozpúšťadla a detekčného činidla. Potvrdenie nejednoznačnej identifikácie sa môže niekedy dosiahnuť klinovou metódou – pridaním príslušnej referenčnej látky do extraktu vzorky. 5.2.5. Semikvantitatívny odhad – Vizuálne sa porovná intenzita škvŕn pre každú látku identifikovanú v 5.2.4., v príslušnom rozsahu koncentrácií referenčných látok. Ak sa zistí, že koncentrácia jednej alebo viacerých látok je nadmerná, extrakt vzorky sa zriedi a stanovenie sa zopakuje. Rf hodnoty a farby škvŕn získaných ihneď po postriekaní Tabuľka č. 1 Referenčná látka (3.20.) Vyvíjacie rozpúšťadlo Detekčné činidlá Rf hodnoty Výsledné farby (3.22.1.) (3.22.2.) (3.22.3.) (3.22.4.) Diazóniové (3.23.1.) Ehrlichove(3.23.2.) Dimetylfenol (3.23.3.) AgNO3 (3.23.4.) OPD 0,62 0,60 0,30 0,57 svetlohnedá - - svetlohnedá MPD 0,40 0,60 0,47 0,48 fialovo- hnedá *) žltá svetlohnedá svetlohnedá PPD 0,20 0,50 0,30 0,48 hnedá jasnočervená *) fialová sivá OTD 0,60 0,60 0,53 0,60 hnedá *) svetlo- oranžová svetlohnedá sivasto- hnedá MTD 0,40 0,67 0,45 0,60 červeno- hnedá *) žltá hnedá čierna PTD 0,33 0,65 0,37 0,70 hnedá oranžová fialová *) sivá DAP 0,07 - 0 0,05 hnedá *) oranžová fialová hnedá H 0,50 0,35 0,80 0,20 - oranžová fialová čierna *) a-N 0,90 0,80 0,90 0,75 oranžovo- hnedá - fialová *) čierna P 0,37 - 0,67 0,05 hnedá fialovkastá nahnedlá hnedá *) R 0,50 0,37 0,80 0,17 oranžová *) svetlofialová nahnedlá svetlohnedá Poznámka 1: OPD sa málo výrazne prejavuje; musí sa použiť rozpúšťadlo (3.22.3.), aby sa jasne oddelil od OTD. Poznámka 2: *) označuje najlepšie vyvinutú farbu. 6. PRESKÚMANIE DVOJROZMERNOU TENKOVRSTVOVOU CHROMATOGRAFIOU Pre tento postup sú potrebné prídavné štandardy a činidlá. 6.1. Prídavné referenčné roztoky a látky 6.1.1. Naftalén-2-ol (b-N) 6.1.2. 2-aminofenol (OAP) 6.1.3. 3-aminofenol (MAP) 6.1.4. 4-aminofenol (PAP) 6.1.5. 2-nitro-1,4-fenyléndiamín (2-NPPD) 6.1.6. 4-nitro-1,2-fenyléndiamín (4-NOPD) – Pripravia sa 0,5 % (m/V) roztoky každej z prídavných referenčných látok podľa 3.21. 6.2. Prídavné vyvíjacie rozpúšťadlo 6.2.1. Etyl/acetát/cyklohexán/ 25 % roztok amoniaku (obj. diely 65 : 30 : 0,5) 6.3. Prídavná detekčná sústava – Do vyvíjacej komory pre tenkovrstvovú chromatografiu sa umiestni sklená nádoba, do nej sa vložia asi 2 g kryštalického jódu a vyvíjacia komora sa uzavrie primeraným uzáverom. 6.4. Chromatografia 6.4.1. Na povrch adsorbentu tenkovrstvovej platne (4.1.3.) sa nakreslia dve čiary podľa obrázku č. 1. 6.4.2. Pod dusíkovou atmosférou (4.1.1.) sa na základný bod 1 (obrázok č. 1), asi 2 cm od oboch okrajov, nanesie 1 až 4 ml extraktu (5.1.), množstvo ktorého závisí od intenzity škvŕn na chromatogramoch 5.2. 6.4.3. Medzi body 2 a 3 (obrázok č. 1) sa nanesú oxidačné farbivá, indentifikované alebo predpokladané za identifikované podľa 5.2. (so vzdialenosťou medzi bodmi 1,5 cm). Nanesú sa 2 µl príslušných referenčných roztokov – okrem DAP, ktorého sa musí naniesť 6 µl. Táto operácia sa robí pod dusíkovou atmosférou (6.4.2.). 6.4.4. Operácia v 6.4.3. sa zopakuje na základných bodoch 4 a 5 (obrázok č. 1) a platňa sa uchováva pod dusíkovou atmosférou až do chvíle, kým sa bude vyvíjať (vzdialenosť medzi bodmi 1,5 cm). 6.4.5. Chromatografická vyvíjacia komora sa prefúkne dusíkom (3.8.) a naleje sa do nej primerané množstvo vyvíjacieho rozpúšťadla (3.22.2.). Platňa (6.4.4.) sa umiestni do vyvíjacej komory a nechá sa vyvíjať v tme v prvom elučnom smere (obrázok č. 1). Eluuje sa, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne čiaru vyznačenú na platni (približne 13 cm). 6.4.6. Platňa sa vyberie z vyvíjacej komory a umiestni sa aspoň na 60 minút do chromatografickej vyvíjacej komory, vopred prefúknutej dusíkom, aby sa odparilo rozpúšťadlo. 6.4.7. Pomocou delenej skúmavky sa do vyvíjacej komory, prefúknutej dusíkom (3.8.), umiestni primerané množstvo elučného rozpúšťadla (6.2.). alej sa do vyvíjacej komory (6.4.6.) umiestni platňa pootočená o 90 a nechá sa vyvíjať druhým elučným smerom (tiež v tme), kým čelo rozpúšťadla nedosiahne čiaru nakreslenú na povrchu adsorbentu. Platňa sa vyberie z vyvíjacej komory a elučné rozpúšťadlo sa nechá odpariť na vzduchu. 6.4.8. Platnička sa na 10 minút umiestni do chromatografickej vyvíjacej komory s parami jódu (6.3.). Dvojrozmerný chromatogram sa interpretuje na základe Rf hodnôt a farby škvŕn súčasne chromatografovaných referenčných látok (tabuľka č. 2 udáva prehľad Rf hodnôt a farieb). Poznámka – Na získanie maximálneho vyfarbenia škvŕn sa chromatogram nechá na vzduchu 1/2 hodiny po vyvolaní. 6.4.9. Prítomnosť oxidačných farbív, zistených v 6.4.8., môže byť definitívne potvrdená zopakovaním operácií opísaných v 6.4.1. až 6.4.8. a pridaním na škvrnu na základný bod 1 množstva extraktu, uvedeného v 6.4.2., ešte 1 µl referenčnej látky, identifikovanej v 6.4.8. Ak sa pri porovnaní s chromatogramom, získaným v 6.4.8., nenájde žiadna ďalšia škvrna, interpretácia chromatogramu 6.4.8. je správna. Farby škvŕn referenčných látok po chromatografii a vyvolaní v parách jódu Tabuľka č. 2 Referenčná látka Farba po vyvolaní v parách jódu R béžová P hnedá α-N fialová β-N svetlohnedá H fialovohnedá MPD žltohnedá PPD fialovohnedá MTD tmavohnedá PTD žltohnedá DAP tmavohnedá OAP oranžová MAP žltohnedá PAP fialovohnedá 2-NPPD hnedá 4-NOPD oranžová 10. DÔKAZ A STANOVENIE DUSITANOV (Podľa smernice Komisie 82/434/EHS zo 14. mája 1982) A. DÔKAZ 1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda je vhodná na dôkaz dusitanov v kozmetických výrobkoch, predovšetkým v krémoch a pastách. 2. PRINCÍP Prítomnosť dusitanov sa indikuje vznikom farebných derivátov reakciou s 2-aminobenzaldehyd-fenylhydrazónom (Nitrin ®). 3. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 3.1. Zriedená kyselina sírová 2 ml koncentrovanej kyseliny sírovej (d204 = 1,84 g/
8. ml)sa zriedi 11 ml destilovanej vody. 3.2. Zriedená kyselina chlorovodíková 1 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej ( d204= 1,19 g/
9. ml)sa zriedi 11 ml destilovanej vody. 3.3. Metanol 3.4. Roztok 2-aminobenzaldehyd-fenylhydrazónu (činidla Nitrin ®) v metanole Naváži sa 2 g Nitrinu ® a kvantitatívne sa prenesie do 100 ml odmernej banky. Po kvapkách sa pridajú 4 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (3.2.) a premiešajú sa. Doplní sa metanolom po značku a mieša sa, kým sa roztok úplne nevyčíri. Roztok sa uchováva vo fľaši z tmavého skla. 4. PRÍSTROJE A POMÔCKY 4.1. Kadičky, 50 ml 4.2. Odmerná banka, 100 ml 4.3. Fľaša z tmavého skla, 125 ml 4.4. Sklenená platnička, 10 x 10 cm 4.5. Plastová špachtľa 4.6. Filtračný papier, 10 x 10 cm 5. POSTUP 5.1. Časť vzorky, určená na analýzu, sa rovnomerne rozmiestni na povrchu sklenenej platničky (4.4.) tak, aby pokryla plochu vrstvou s hrúbkou nepresahujúcou 1 cm. 5.2. Filtračný papier (4.6.) sa namočí destilovanou vodou. Položí sa na vzorku a filtračný papier sa popritláča plastovou špachtľou (4.5.). 5.3. Po 1 minúte sa do stredu filtračného papiera nanesú 2 kvapky zriedenej kyseliny sírovej (3.1.) nasledované 2 kvapkami roztoku Nitrin-u ® (3.4.). 5.4. Po 5 až 10 sekundách sa filtračný papier sníme a preskúma sa na dennom svetle. Prítomnosť dusitanov sa prejaví červenopurpurovým sfarbením. V prípade nízkeho obsahu dusitanov sa červenopurpurové sfarbenie zmení po 5 až 15 sekundách na žlté. K tejto farebnej zmene dôjde až po 1 až 2 minútach, ak bol obsah dusitanov vysoký. 6. POZNÁMKA Intenzita červenopurpurového sfarbenia a čas, ktorý uplynie do jeho zmeny na žlté, môže poskytnúť informáciu o obsahu dusitanov vo vzorke. B. STANOVENIE 1. ÚČEL Táto metóda opisuje stanovenie dusitanov v kozmetických výrobkoch. 2. DEFINÍCIA Obsah dusitanov vo vzorke, stanovený touto metódou, sa vyjadrí v hmotnostných percentách dusitanu sodného. 3. PRINCÍP Po zriedení vzorky vodou a jej vyčírení prítomné dusitany reagujú so sulfanilamidom a N-(1-naftyl)etyléndiamínom a intenzita získaného sfarbenia sa meria pri 538 nm. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. Číriace činidlá Tieto činidlá sa nemôžu použiť neskôr ako jeden týždeň po ich príprave. 4.1.1. Carrezovo činidlo I 106 g hexakyanoželeznatanu draselného, K4Fe(CN)6 . 3H2O sa rozpustí v destilovanej vode a doplní sa vodou do 1 000 ml. 4.1.2. Carrezovo činidlo II 219,5 g octanu zinočnatého, Zn(CH3COO)2 . 2H2O, 30 ml ľadovej kyseliny octovej sa rozpustí v destilovanej vode a zriedi sa vodou do 1 000 ml. 4.2. Roztok dusitanu sodného V 1 000 ml odmernej banke sa v destilovanej vode rozpustí 0,5 g dusitanu sodného a zriedi sa vodou po značku. 10 ml tohto zásobného štandardného roztoku sa zriedi do 500 ml; 1 ml takéhoto roztoku = 10 µg NaNO2. 4.3. 1 N roztok hydroxidu sodného 4.4. 0,2 % roztok hydrochloridu sulfanilamidu Za tepla sa rozpustí 2 g sulfanilamidu v 800 ml vody. Ochladí sa a za miešania sa pridá 100 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Zriedi sa vodou do 1 000 ml. 4.5. 5 N kyselina chlorovodíková 4.6. N-1-naftylové činidlo Tento roztok musí byť pripravený v deň jeho použitia. 0,1 g dihydrochloridu N-(1-naftyl)etyléndiamínu sa rozpustí vo vode a zriedi sa vodou do 100 ml. 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Analytické váhy 5.2. Odmerné banky, 100, 250, 500 a 1 000 ml 5.3. Nedelené alebo delené pipety 5.4. Odmerné valce, 100 ml 5.5. Skladané filtračné papiere bez dusitanov, priemer 15 cm 5.6. Vodný kúpeľ 5.7. Spektrofotometer s kyvetami s optickou dráhou dlhou 1 cm 5.8. pH meter 5.9. Mikrobyreta, 10 ml 5.10. Kadičky, 250 ml 6. POSTUP 6.1. S presnosťou na 0,1 mg sa naváži približne 0,5 g (m v gramoch) homogenizovanej vzorky, horúcou destilovanou vodou sa kvantitatívne prenesie do 250 ml kadičky (5.10.) a objem sa doplní horúcou destilovanou vodou približne na 150 ml. Kadička (5.10.) sa na 1/2 hodiny umiestni do vodného kúpeľa (5.6.) pri 80 oC. Počas zahrievania sa občas pretrepe. 6.2. Ochladí sa na laboratórnu teplotu a jeden po druhom sa za miešania pridajú 2 ml Carrezovho činidla I (4.1.1.) a 2 ml Carrezovho činidla II (4.1.2.). 6.3. Na úpravu pH na 8,3 sa pridá s použitím pH metra (5.8.)1 N roztok hydroxidu sodného (4.3.). Obsah sa kvantitatívne prenesie do 250 ml odmernej banky a doplní sa po značku destilovanou vodou. 6.4. Obsah sa premieša a prefiltruje cez skladaný filtračný papier (5.5.). 6.5. Do 100 ml odmernej banky (5.2.) sa pipetou (5.3.) prenesie primeraný podiel (V v mililitroch) číreho filtrátu, ale nie viac ako 25 ml, a pridá sa destilovaná voda do objemu 60 ml. 6.6. Po premiešaní sa pridá 10 ml roztoku hydrochloridu sulfanilamidu (4.4.) a potom 6 ml 5 N kyseliny chlorovodíkovej (4.5.). Premieša sa a nechá sa stáť 5 minút. Pridajú sa 2 ml N-1-naftylového činidla (4.6.), premieša sa a nechá stáť 3 minúty. Zriedi sa vodou po značku a premieša sa. 6.7. Zopakovaním operácií 6.5. a 6.6. bez pridania N-1-naftylového činidla (4.6.) sa pripraví slepý pokus. 6.8. Pri 538 nm sa zmeria (5.7.) absorbancia roztoku získaného podľa 6.6. s použitím slepého pokusu (6.7.) ako štandardu. 6.9. Z kalibračného grafu (6.10.) sa odčíta obsah dusitanu sodného v mg na 100 ml roztoku (m1 v mikrogramoch), ktorý zodpovedá absorbancii nameranej v 6.8. 6.10. S použitím roztoku obsahujúceho 10 µg dusitanu sodného na 100 ml (4.2.) sa pripraví kalibračný graf s koncentráciami 0, 20, 40, 60, 80 a 100 µg dusitanu sodného na 100 ml. 7. VÝPOČET Obsah dusitanu sodného vo vzorke v hmotnostných percentách sa vypočíta podľa vzorca kde m je hmotnosť vzorky v gramoch vzatej na analýzu (6.1.), m1 je obsah dusitanu sodného v mikrogramoch zisteného podľa 6.9., V je objem filtrátu v mililitroch použitého na meranie (6.5.). 8. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu asi 0,2 % hmot. dusitanu sodného nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,005 %. 11. DÔKAZ A STANOVENIE VOĽNÉHO FORMALDEHYDU (Podľa smernice Komisie 82/434/EHS zo 14. mája 1982 v znení smernice Komisie 90/207/EHS) 1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda opisuje dôkaz a dve stanovenia podľa toho, či sú prítomné donory formaldehydu (zlúčeniny uvoľňujúce formaldehyd). Je použiteľná na všetky kozmetické výrobky. 1.1. Dôkaz 1.2. Všeobecné kolorimetrické stanovenie s pentán-2,4-diónom Táto metóda sa použije, ak sa formaldehyd používa sám alebo spolu s inými konzervačnými látkami, ktoré nie sú donormi formaldehydu. V ostatných prípadoch, a keď výsledok prevyšuje najvyššiu prípustnú koncentráciu, musí sa použiť na potvrdenie nasledujúca metóda. 1.3. Stanovenie v prítomnosti donorov formaldehydu Pri vyššie opísanej metóde (1.2.) sa počas derivácie štiepia donory formaldehydu, čo vedie k príliš vysokým výsledkom (polymerizovaný formaldehyd a formaldehyd viazaný v zlúčeninách). Voľný formaldehyd je potrebné oddeliť kvapalinovou chromatografiou. 2. DEFINÍCIA Obsah voľného formaldehydu vo vzorke sa stanoví podľa tejto metódy a vyjadrí sa v hmotnostných percentách. 3. DÔKAZ 3.1. Princíp Voľný alebo viazaný formaldehyd v prostredí kyseliny sírovej zmení farbu Schiffovho činidla na ružovú alebo svetlofialovú. 3.2. Činidlá Všetky činidlá musia byť analyticky čisté a voda musí byť demineralizovaná. 3.2.1. Fuchsín 3.2.2 Heptahydrát siričitanu sodného 3.2.3. Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (d204= 1,19g/
10. ml)3.2.4. Kyselina sírová, približne 1 M 3.2.5. Schiffovo činidlo Do kadičky sa naváži 100 mg fuchsínu (3.2.1.) a rozpustí sa v 75 ml vody pri 80 oC. Po ochladení sa pridá 2,5 g siričitanu sodného (3.2.2.) a doplní sa do 100 ml. Používa sa do dvoch týždňov odo dňa prípravy. 3.3. Postup 3.3.1. Do 10 ml kadičky sa navážia 2 g vzorky. 3.3.2. Pridajú sa dve kvapky kyseliny sírovej (3.2.4.) a 2 ml Schiffovho činidla (3.2.5.). Toto činidlo musí byť pred pridaním úplne bezfarebné, pretrepe sa a nechá sa stáť 5 minút. 3.3.3. Ak sa do 5 minút pozoruje ružové alebo svetlofialové sfarbenie, obsah formaldehydu je vyšší ako 0,01 % a stanoví sa všeobecnou metódou (4.), ak je to potrebné, podľa (5.). 4. VŠEOBECNÉ KOLORIMETRICKÉ STANOVENIE S PENTÁN-2,4-DIÓNOM 4.1. Princíp Formaldehyd reaguje s pentán-2,4-diónom v prítomnosti octanu amónneho za vzniku 3,5-diacetyl-1,4-dihydrolutidínu. Tento sa extrahuje bután-1-olom a meria sa absorbancia extraktu pri 410 nm. 4.2. Činidlá Všetky činidlá musia byť analyticky čisté a voda musí byť demineralizovaná. 4.2.1. Bezvodý octan amónny 4.2.2. Koncentrovaná kyselina octová (d204 = 1,05 g/
11. ml)4.2.3. Pentán-2,4-dión, čerstvo predestilovaný za zníženého tlaku 25 mm, Hg 25o – nesmie vykazovať akúkoľvek absorbanciu pri 410 nm 4.2.4. Bután-1-ol 4.2.5. Kyselina chlorovodíková, 1 M 4.2.6. Kyselina chlorovodíková, približne 0,1 M 4.2.7. Hydroxid sodný, 1 M 4.2.8. Roztok škrobu, čerstvo pripravený (1 g/50 ml vody) podľa European Pharmacopoeia, 2. vydanie, 1980, časť I–VII–1–1 4.2.9. 37 až 40 % (m/V) formaldehyd 4.2.10. Štandardný roztok jódu, 0,05 M 4.2.11. Štandardný roztok tiosíranu sodného, 0,1 M 4.2.12. Pentán-2,4-diónové činidlo V 1 000 ml odmernej banke sa rozpustí – 150 g octanu amónneho (4.2.1.), – 2 ml pentán-2,4-diónu (4.2.3.), – 3 ml kyseliny octovej (4.2.2.). Doplní sa vodou do 1 000 ml (pH roztoku okolo 6,4). Toto činidlo sa musí pripravovať čerstvé. 4.2.13. Činidlo (4.2.12.) bez pentán-2,4-diónu 4.2.14. Štandard formaldehydu – zásobný roztok 5 g formaldehydu (4.2.9.) sa vleje do 1 000 ml odmernej banky a doplní sa vodou do 1 000 ml. Obsah formaldehydu v tomto roztoku sa stanoví nasledovne. Odoberie sa 10 ml, pridá sa 25 ml štandardného roztoku jódu (4.2.10.) a 10 ml roztoku hydroxidu sodného (4.2.7.) a nechá sa stáť 5 minút. Okyslí sa 11 ml HCl (4.2.5.) a nadbytok jódu sa stanoví štandardným roztokom tiosíranu sodného (4.2.11.) s použitím roztoku škrobu (4.2.8.) ako indikátora. 1 ml spotrebovaného 0,05 M roztoku jódu (4.2.10.) zodpovedá 1,5 mg formaldehydu. 4.2.15. Štandard formaldehydu – zriedený roztok Zásobný roztok formaldehydu sa postupne zriedi vodou najprv v pomere 1 : 20 a potom 1:100. 1 ml tohto roztoku obsahuje približne 1 µg formaldehydu. Vypočíta sa presný obsah formaldehydu. 4.3. Prístroje a pomôcky 4.3.1. Bežné laboratórne vybavenie 4.3.2. Filtračný papier na oddelenie fáz Whatman 1 PS alebo jeho ekvivalent 4.3.3. Centrifúga 4.3.4. Vodný kúpeľ nastavený na 60 oC 4.3.5. Spektrofotometer 4.3.6. Sklené kyvety s optickou dráhou dlhou 1 cm. 4.4. Postup 4.4.1. Roztok vzorky Do 100 ml odmernej banky sa s presnosťou na 0,001 g naváži také množstvo analyzovanej vzorky (m v gramoch), aby odhadovaný obsah formaldehydu bol asi 150 mg. Doplní sa vodou do 100 ml a premieša sa (roztok S). Overí sa, či pH je blízke 6. Ak nie je, zriedi sa v roztoku kyseliny chlorovodíkovej (4.2.6.). Do 50 ml Erlenmeyerovej banky sa pridá 10 ml roztoku S, 5 ml pentán-2,4-diónového činidla (4.2.12.) a demineralizovaná voda do celkového objemu 30 ml. 4.4.2. Referenčný roztok Použitím tohto referenčného roztoku sa vylúčia možné rušivé vplyvy spôsobené sfarbením pozadia skúšobnej vzorky. Do 50 ml Erlenmeyerovej banky sa pridá 10 ml roztoku S, 5 ml činidla (4.2.13.) a demineralizovaná voda do celkového objemu 30 ml. 4.4.3. Roztok na slepý pokus Do 50 ml Erlenmeyerovej banky sa pridá 5 ml pentán-2,4-diónového činidla (4.2.12.) a demineralizovaná voda do celkového objemu 30 ml. 4.4.4. Stanovenie 4.4.4.1. Zmesi zo 4.4.1., 4.4.2. a 4.4.3. sa pretrepú. Erlenmeyerove banky sa ponoria do vodného kúpeľa zahriateho na 60 oC presne na 10 minút. Počas 2 minút sa nechajú ochladiť v kúpeli z ľadovej vody. 4.4.4.2. Ich obsah sa prenesie do 50 ml oddeľovacích lievikov obsahujúcich 10 ml bután-1-olu (4.2.4.). Každá banka sa opláchne 3 až 5 ml vody. Zmesi sa presne 30 sekúnd intenzívne pretrepú a nechajú oddeliť. 4.4.4.3. Cez filtračný papier na oddelenie fáz sa bután-1-olové fázy prefiltrujú do meracích kyviet (4.3.2.). Tiež sa môže použiť odstreďovanie na centrifúge (3 000 gn na 5 minút). 4.4.4.4. Pri 410 nm sa zmeria absorbancia A1 extraktu roztoku vzorky zo 4.4.1. oproti extraktu referenčného roztoku 4.4.2. 4.4.4.5. Podobne sa zmeria absorbancia A2 extraktu slepého pokusu z 4.4.3. oproti bután-1-olu. Poznámka – Všetky tieto operácie sa musia uskutočniť do 25 minút od momentu umiestnenia Erlenmeyerových baniek do vodného kúpeľa pri 60 oC. 4.4.5. Kalibračná krivka 4.4.5.1. Do 50 ml Erlenmeyerovej banky sa pridá 5 ml zriedeného štandardného roztoku podľa 4.2.15., 5 ml pentán-2,4-diónového činidla (4.2.12.) a demineralizovaná voda do celkového objemu 30 ml. 4.4.5.2. Pokračuje sa podľa 4.4.4. a zmeria sa absorbancia oproti bután-1-olu (4.2.4.). 4.4.5.3. Postup sa zopakuje s 10, 15, 20 a 25 ml zriedeného štandardného roztoku (4.2.15.). 4.4.5.4. Na získanie nulovej hodnoty zodpovedajúcej sfarbeniu činidiel sa postupuje ako v 4.4.4.5. 4.4.5.5. Po odčítaní nulovej hodnoty od každej z absorbancií získaných v 4.4.5.1. a 4.4.5.3. sa zostrojí kalibračná krivka. Beerov zákon platí do 30 mg formaldehydu. 4.5. Výpočty 4.5.1. Od A1 sa odpočíta A2 a z kalibračnej krivky (4.4.5.5.) sa odčíta množstvo C formaldehydu v roztoku vzorky (4.4.1.) v mikrogramoch. 4.5.2. Obsah formaldehydu vo vzorke v hmotnostných percentách sa vypočíta podľa vzorca kde m je hmotnosť skúšobnej vzorky (4.4.1.) v gramoch. 4.6. Opakovateľnosť2) Pri obsahu formaldehydu 0,2 % pre kolorimetrické stanovenie s pentán-2,4-diónom nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť 0,005 %. Ak stanovenie voľného formaldehydu poskytne výsledky väčšie, ako je maximálny obsah podľa osobitného predpisu,3) a to (
12. a)medzi 0,05 % a 0,2 % v neoznačených výrobkoch, (
13. b)väčšie ako 0,2 % vo výrobkoch označených aj neoznačených, musí sa použiť nižšie opísaný postup podľa 5. 5. STANOVENIE V PRÍTOMNOSTI DONOROV FORMALDEHYDU 5.1. Princíp Oddelený formaldehyd sa reakciou s pentán-2,4-diónom v reaktore zaradenom za kolónou prevedie na žltý lutidínový derivát a získaný derivát sa detekuje absorbanciou pri 420 nm. 5.2. Činidlá Všetky činidlá musia byť analyticky čisté a voda musí byť demineralizovaná. 5.2.1. Voda čistoty pre HPLC alebo rovnocennej kvality 5.2.2. Bezvodý octan amónny 5.2.3. Koncentrovaná kyselina octová 5.2.4. Pentán-2,4-dión (uskladnený pri 4 oC) 5.2.5. Bezvodý hydrogenfosforečnan sodný 5.2.6. 85 % kyselina trihydrogenfosforečná, (d204 = 1,7 g/
14. ml)5.2.7. Metanol čistoty pre HPLC 5.2.8. Dichlórmetán 5.2.9. 37 až 40 % (m/V) formaldehyd 5.2.10. Hydroxid sodný, 1 M 5.2.11. Kyselina chlorovodíková, 1 M 5.2.12. Kyselina chlorovodíková, 0,002 M 5.2.13. Roztok škrobu čerstvo pripravený podľa European Pharmacopoeia (4.2.8.) 5.2.14. Štandardný roztok jódu, 0,05 M 5.2.15. Štandardný roztok tiosíranu sodného, 0,1 M 5.2.16. Mobilná fáza 0,006 M vodný roztok hydrogenfosforečnanu sodného (5.2.5.) upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6.) 5.2.17. Činidlo na reakciu po chromatografii V 1 000 ml odmernej banke sa rozpustí 62,5 g octanu amónneho (5.2.2.), 7,5 ml kyseliny octovej (5.2.3.), 5 ml pentán-2,4-diónu (5.2.4.). Doplní sa vodou (5.2.1.) do 1 000 ml. Toto činidlo sa uschová v tme. Doba skladovania je maximálne tri dni pri 25 oC. Nesmie byť pozorovaná zmena sfarbenia. 5.2.18. Štandard formaldehydu – zásobný roztok 10 g formaldehydu (5.2.9.) sa vleje do 1 000 ml odmernej banky a doplní sa vodou do 1 000 ml. Stanovenie obsahu formaldehydu Odoberie sa 5 ml, pridá sa 25 ml štandardného roztoku jódu (5.2.14.) a 10 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10.) a nechá sa stáť 5 minút. Okyslí sa 11 ml HCl (5.2.11.) a nadbytok štandardného roztoku jódu (5.2.14.) sa titruje štandardným roztokom tiosíranu sodného (5.2.15.) s použitím roztoku škrobu (5.2.13.) ako indikátora. 1 ml roztoku jódu (5.2.14.) zodpovedá 1,5 mg formaldehydu. 5.2.19. Štandard formaldehydu – zriedený roztok Zásobný roztok sa zriedi mobilnou fázou (5.2.16.) na 1/100 jeho pôvodnej koncentrácie. 1 ml tohto roztoku obsahuje približne 37 mg formaldehydu. Vypočíta sa jeho presný obsah. 5.3 Prístroje a pomôcky 5.3.1. Bežné laboratórne vybavenie 5.3.2. HPLC bezpulzná pumpa 5.3.3. Nízkotlaková bezpulzná pumpa pre činidlo (alebo druhá HPLC pumpa) 5.3.4. Dávkovací ventil s 10 ml slučkou 5.3.5. Reaktor na zaradenie za kolónu z nasledujúcich súčastí (obrázok č. 1) – jedna 1-litrová trojhrdlová banka, – vyhrievacie hniezdo pre 1-litrovú banku, – dve Vigreuxove kolóny minimálne s 10 etážami, dve vzduchom chladené, – rúrka z nehrdzavejúcej ocele (na výmenu tepla) 1,6 mm – vnútorný priemer 0,23 mm, dĺžka 400 mm, – teflónová hadica 1,6 mm – vnútorný priemer 0,30 mm, dĺžka 5 m („francúzske háčkovanie“, pozri bod 6), – jedna spojka T bez akéhokoľvek mŕtveho objemu (Valco alebo ekvivalent), – tri spojky bez akéhokoľvek mŕtveho objemu alebo – jedna súprava Applied Biosystems PCRS 520 na zaradenie za kolónu alebo ekvivalent vybavená 1 ml reaktorom. 5.3.6. Membránový filter, veľkosť pórov 0,45 mm (pozri obrázok č. 2). 5.3.7. Náplň SEP-PAK ® C18 alebo ekvivalent 5.3.8. Hotové komerčné kolóny – Bischoff hypersil RP 18 (typ NC, katalógové číslo C 25.46 1805) (5 mm, dĺžka 250 mm, vnútorný priemer 4,6
15. mm)alebo – Dupont, Zorbax ODS (5 mm, dĺžka 250 mm, vnútorný priemer 4,6 mm), alebo – Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 mm, dĺžka 250 mm, vnútorný priemer 4,6 mm). 5.3.9. Predkolóna Bischoff K1 hypersil RP 18 (katalógové číslo K1 G 6301 1805) 5 mm, dĺžka 10 mm alebo ekvivalent. 5.3.10. Kolóna a predkolóna sa spoja prostredníctvom systému Ecotube (katalógové číslo A 15020508 Bischoff) alebo ekvivalentu. 5.3.11. Aparatúra (5.3.5.) sa zostaví podľa blokovej schémy (pozri obrázok č. 1 a 2). Prepojenia za dávkovacím ventilom musia byť čo najkratšie. V tomto prípade je rúrka z nehrdzavejúcej ocele medzi výstupom z reaktora a vstupom detektora určená na ochladenie zmesi pred detekciou a teplota detektora nie je známa, ale je konštantná. 5.3.12. UV-VIS detektor 5.3.13. Zapisovač 5.3.14. Centrifúga 5.3.15. Ultrazvukový kúpeľ 5.3.16. Vibračné miešadlo (vortex alebo ekvivalent) Obrázok č. 1: Reaktor za kolónou (pozri vysvetlivky) Obrázok č. 2: Membránový filter (pozri vysvetlivky) Vysvetlivky: 1 HPLC pumpa 2 Dávkovací ventil 3 Kolóna s predkolónou 4 Pumpa na činidlo 5 T spojka bez mŕtveho objemu 5 T spojka (Vortex) 6,6 Spojka bez mŕtveho objemu 7 „Francúzske háčkovanie“ 7 Reaktor 8 Trojhrdlová banka s vriacou vodou 9 Vyhrievacie hniezdo 10 Chladivo 11 Rúrka z nehrdzavejúcej ocele na výmenu tepla 11 Výmenník tepla 12 UV-VIS detektor 13 Jedna súprava PCRS 520 na zaradenie za kolónu 5.4. Postup 5.4.1. Kalibračná krivka sa zostrojí nanesením plôch píkov ako funkcie koncentrácie roztokov zriedeného štandardu formaldehydu. Zriedením referenčného roztoku formaldehydu (5.2.19.) mobilnou fázou (5.2.16.) sa pripravia štandardné roztoky – 1 ml roztoku (5.2.19.) sa zriedi do 20 ml (približne 185 µg/100 ml), – 2 ml roztoku (5.2.19.) sa zriedi do 20 ml (približne 370 µg/100 ml), – 5 ml roztoku (5.2.19.) sa zriedi do 25 ml (približne 740 µg/100 ml), – 5 ml roztoku (5.2.19.) sa zriedi do 20 ml (približne 925 µg/100 ml). Štandardné roztoky sa uchovávajú jednu hodinu pri laboratórnej teplote a musia byť čerstvo pripravené. Linearita kalibračnej krivky je dobrá pre koncentrácie medzi 1 a 15 µg/ml. 5.4.2. Príprava vzorky 5.4.2.1. Emulzie (krémy, základy pre make-up, očné linky) Do zazátkovanej 100 ml banky sa s presnosťou na 0,001 g naváži množstvo skúšobnej vzorky (m v gramoch) zodpovedajúce odhadovanému obsahu 100 µg formaldehydu. Pridá sa presne odmeraných 20 ml dichlórmetánu (5.2.8.) a 20 ml kyseliny chlorovodíkovej (5.2.12.). Fázy sa oddelia odstredením na centrifúge (3 000 gn na 2 minúty). Zatiaľ sa kolóna (5.3.7.) premyje 2 ml metanolu (5.2.7.), potom sa upraví 5 ml vody (5.2.1.). Cez upravenú náplň sa nechajú pretiecť 4 ml vodnej fázy obsahujúcej extrakt. Prvé 2 ml sa vylejú a zachytí sa nasledujúca frakcia. 5.4.2.2. Lotiony, šampóny Do zazátkovanej 100 ml banky sa s presnosťou na 0,001 g naváži množstvo skúšobnej vzorky (m v gramoch) zodpovedajúce odhadovanému obsahu okolo 500 µg formaldehydu. Doplní sa mobilnou fázou (5.2.16.) do 100 ml. Prefiltruje sa cez filter (5.3.6.) a nadávkuje sa alebo sa nechá pretiecť náplňou (5.3.7.) upravenou ako v predchádzajúcom prípade (5.4.2.1.). Všetky roztoky sa musia nadávkovať hneď po príprave. 5.4.3. Podmienky pre chromatografiu – prietoková rýchlosť mobilnej fázy 1 ml/min, – prietoková rýchlosť činidla 0,5 ml/min, – celková prietoková rýchlosť cez výstup detektora 1,5 ml/min, – dávkovaný objem 10 µl, – elučná teplota – v prípade komplikácie pri separácii sa kolóna ponorí do kúpeľa z topiaceho sa ľadu a počká sa, kým sa teplota ustáli (15 – 20 min), – teplota reaktora zaradeného za kolónu: 100 oC, – detekcia 420 nm. Celá sústava na chromatografiu a následnú reakciu sa po použití musí prepláchnuť vodou (5.2.1.). Ak sa sústava nepoužije dlhšie ako dva dni, po premytí vodou musí nasledovať premytie metanolom (5.2.7.). Pred opätovným pripravením na použitie sa cez sústavu nechá pretiecť voda, aby sa zabránilo kryštalizácii. 5.5. Výpočet obsahu formaldehydu v % (hmot.) podľa vzorca pre Emulzie (5.4.2.1.) Lotiony, šampóny kde m je hmotnosť analyzovanej vzorky v g (5.4.2.1.), C je koncentrácia formaldehydu odčítaná z kalibračnej krivky (5.4.1.) v µg/100 ml. 5.6. Opakovateľnosť 2) Pri obsahu formaldehydu 0,05 % nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť 0,001 %. Pri obsahu formaldehydu 0,2 % nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť 0,005 %. 6. NÁVOD NA „FRANCÚZSKE HÁČKOVANIE“ 6.1. Pomôcky
16. a)drevená navíjacia cievka s vonkajším priemerom 5 cm, s kruhovým otvorom s priemerom 1,5 cm v strede cievky, vybavená 4 oceľovými klincami (podľa zobrazenia na obrázkoch č. 3 a 4). Vzdialenosť medzi dvoma klincami musí byť 1,8 cm a musia byť vzdialené 0,5 cm od kruhového otvoru,
17. b)jedna neohybná ihla (háčkovacieho typu) do slučky teflónovej hadice,
18. c)5 m teflónovej hadice s vonkajším priemerom 1,6 mm a vnútorným priemerom 0,3 mm. 6.2. Postup Pri „francúzskom háčkovaní“ sa teflónová hadica najprv prevlečie cez kruhový otvor v strede cievky zvrchu nadol (asi 10 cm hadice sa nechá vyčnievať z dolného otvoru cievky, aby bolo možné naň prichytiť reťaz počas procesu háčkovania). Potom sa hadica striedavo ovinie okolo 4 klincov podľa zobrazenia na obrázku č. 5. Vrch a spodok francúzskeho háčkovania sa ochráni kovovými krúžkami a prítlačnými skrutkami. Je potrebné dať pozor, aby sa pri uťahovaní neprerazil teflón. Hadica sa ovinie okolo každého klinca po druhý raz a podľa nasledujúceho postupu sa spravia „očká“. Dolná hadica sa háčikom preloží ponad hornú hadicu (obrázok č. 6). Tento proces sa zopakuje postupne na každom klinci (1, 2, 3, 4 proti smeru hodinových ručičiek), kým sa nevytvorí 5 m alebo iná požadovaná dĺžka háčkovania. Asi 10 cm hadice sa nechá na ukončenie háčkovania. Na ukončenie reťaze sa hadica prevlečie cez každú zo štyroch slučiek a jemne sa pritiahne. Poznámka: Vyrábané francúzske háčkovanie pre reaktory na zaradenie za kolónu je dostupné na trhu (Supelco). Obrázok č. 3: Schematické zobrazenie cievky Obrázok č. 4: Schematické zobrazenie cievky Obrázok č. 5: Prvá hadica Obrázok č. 6: Druhá hadica. Na vytvorenie „očka“ sa dolná hadica (plná čiara) preloží ponad hornú hadicu (prerušovaná čiara) Obrázok č. 7 12. STANOVENIE REZORCINOLU V ŠAMPÓNOCH A VLASOVÝCH LOTIONOCH (Podľa smernice Komisie 82/434/EHS zo 14. mája 1982) 1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda presne určuje stanovenie rezorcinolu v šampónoch a vlasových lotionoch pomocou plynovej chromatografie. Táto metóda je vhodná pri jeho obsahu vo vzorke od 0,1 do 2 % hmotnosti. 2. DEFINÍCIA Obsah rezorcinolu vo vzorke stanovený touto metódou sa vyjadrí v hmotnostných percentách. 3. PRINCÍP Rezorcinol a 3,5-dihydroxytoluén (5-metylbenzén-1,3-diol) pridané do vzorky ako vnútorný štandard sa oddelia od vzorky tenkovrstvovou chromatografiou. Obe zlúčeniny sa izolujú zoškrabaním ich škvŕn z tenkovrstvovej platne a extrakciou metanolom. Nakoniec sa extrahované zlúčeniny vysušia, nasilylujú a stanovia sa plynovou chromatografiou. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. 25 % (hmot.) kyselina chlorovodíková 4.2. Metanol 4.3. 96 % (obj.) etanol 4.4. Hotové komerčné silikagélové TLC platne (na plastovom alebo hliníkovom podklade) s fluorescenčným indikátorom Deaktivujú sa takto: platne potiahnuté silikagélom sa postriekajú vodou do lesklého vzhľadu a nechajú sa 1 až 3 hodiny vysušiť na vzduchu pri laboratórnej teplote. Poznámka: Ak platne nie sú deaktivované, môže dochádzať k ireverzibilnej adsorpcii rezorcinolu na silikagél. 4.5. Vyvíjacie rozpúšťadlo Acetón/chloroform/kyselina octová (obj. diely 20 : 75 : 5) 4.6. Referenčný roztok rezorcinolu 400 mg rezorcinolu sa rozpustí v 100 ml 96 % etanolu (4.3.), 1 ml zodpovedá 4 000 µg rezorcinolu. 4.7. Roztok vnútorného štandardu 400 mg 3,5-dihydroxytoluénu (DHT) sa rozpustí v 100 ml 96 % etanolu (4.3.). 1 ml zodpovedá 4 000 mg DHT. 4.8. Štandardná zmes – v 100 ml odmernej banke sa zmieša 10 ml roztoku (4.6.) a 10 ml roztoku (4.7.), doplní sa po značku 96 % etanolom (4.3.) a premieša sa. 1 ml zodpovedá 400 mg rezorcinolu a 400 µg DHT. 4.9. Silylačné činidlá 4.9.1. N,O-bis(trimetylsilyl)trifluóracetamid (BSTFA) 4.9.2. Hexametyldisilazán (HMDS) 4.9.3. Trimetylchlórsilán (TMCS) 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Bežné zariadenie na tenkovrstvovú a plynovú chromatografiu 5.2. Laboratórne sklo 6. POSTUP 6.1. Príprava vzorky 6.1.1. Do 150 ml kadičky sa naváži (m v gramoch) približne 20 až 50 mg rezorcinolu. 6.1.2. Okyslí sa kyselinou chlorovodíkovou (4.1.), kým zmes nie je kyslá (potrebné sú približne 2 až 4 ml), pridá sa 10 ml (40 mg DHT) roztoku vnútorného štandardu (4.7.) a premieša sa. S etanolom (4.3.) sa prenesie do 100 ml odmernej banky, doplní sa etanolom po značku a premieša sa. 6.1.3. 250 ml roztoku (6.1.2.) sa nanesie na deaktivovanú silikagélovú platňu (4.4.) vo forme súvislej čiary, dlhej približne 8 cm. Treba si dať pozor, aby bola čiara čo najtenšia. 6.1.4. Na tú istú platňu sa rovnakým spôsobom (6.1.3.) nanesie 250 µl referenčného roztoku (4.8.). 6.1.5. Na dva body štartovacej čiary sa nanesie po 5 µl z každého z roztokov 4.6. a 4.7. na uľahčenie lokalizácie škvŕn po vyvinutí platne. 6.1.6. Platňa sa nechá vyvinúť v parami nenasýtenej vyvíjacej komore naplnenej vyvíjacím rozpúšťadlom 4.5., kým čelo rozpúšťadla nedosiahne úroveň 12 cm od štartovacej čiary, čo zvyčajne trvá 45 minút. Platňa sa vysuší na vzduchu a oblasť rezorcinolu/DHT sa lokalizuje pod krátkovlnným UV žiarením (254 nm). Tieto dve zlúčeniny majú približne rovnaké Rf hodnoty. Škvrny sa označia ceruzkou vo vzdialenosti 2 mm od vonkajšej tmavej línie ohraničujúcej škvrny. Označené oblasti sa zoškrabú a adsorbent z každej škvrny sa zozbiera do 10 ml fľaše. 6.1.7. Adsorbent obsahujúci vzorku a adsorbent obsahujúci referenčnú zmes sa extrahujú nasledujúcim spôsobom: pridajú sa 2 ml metanolu (4.2.) a extrahuje sa za stáleho miešania 1 hodinu. Prefiltruje sa a extrakcia sa opakuje s 2 ml metanolu ďalších 15 minút. 6.1.8. Extrakty sa spoja a rozpúšťadlo sa odparí cez noc do sucha vo vákuovom exsikátore naplnenom vhodným sušidlom. Nesmie sa použiť žiaden zdroj tepla. 6.1.9. Zvyšok (6.1.8.) sa silyluje spôsobom uvedeným v 6.1.9.1. a 6.1.9.2. 6.1.9.1. Mikrostriekačkou sa pridá 200 µl BSTFA (4.9.1.) a zmes sa nechá v uzavretej nádobe počas 12 hodín pri laboratórnej teplote. 6.1.9.2. Jeden po druhom sa mikrostriekačkou pridá 200 µl HMDS (4.9.2.) a 100 µl TMCS (4.9.3.) a zmes sa v uzavretej nádobe zahrieva 30 minút na 60 oC. Zmes sa ochladí. 6.2. Plynová chromatografia 6.2.1. Chromatografické podmienky Kolóna musí poskytovať rozlíšenie R minimálne 1,5 podľa vzorca kde r1a r2 sú retenčné časy dvoch píkov v minútach, r1a r2 je šírka tých istých píkov v polovičnej výške v mm, d’ je rýchlosť zapisovača v mm za minútu. Zistilo sa, že nasledujúca kolóna a podmienky pre plynovú chromatografiu sú vhodné Kolóna Materiál nehrdzavejúca oceľ Dĺžka 200 cm Vnútorný priemer ~ 3 mm Náplň 10 % OV – 17 na Chromosorb WAW, 100 až 120 mesh Plameňovo-ionizačný detektor Teploty Kolóna 185 oC (izotermicky) Detektor 250 oC Vstrekovací ventil 250 oC Nosný plyn dusík Prietok 45 ml/min Prietok vodíka a vzduchu treba nastaviť podľa pokynov výrobcu. 6.2.2. Do plynového chromatografu sa vstrekne 1 až 3 µl roztoku pripraveného podľa 6.1.9. Pre každý roztok (6.1.9.) sa uskutoční 5 nástrekov; meria sa plocha píkov, vypočíta sa priemerná hodnota a pomer plochy píkov S = plocha píku rezorcinolu/plocha píku DHT. 7. VÝPOČET Obsah rezorcinolu vo vzorke vyjadrený v hmotnostných percentách je daný vzťahom: kde M je množstvo skúšobnej vzorky v gramoch (6.1.1.), Svzorky je priemerný pomer plochy píkov podľa 6.2.2. pre roztok vzorky, Sštandardnej zmesi je priemerný pomer plochy píkov podľa 6.2.2. pre štandardnú zmes. 8. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu rezorcinolu okolo 0,5 % nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť v absolútnej hodnote 0,025 %. 13. STANOVENIE METANOLU V POMERE K ETANOLU ALEBO PROPÁN-2-OLU (Podľa smernice Komisie 82/434/EHS zo 14. mája 1982) 1. ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda opisuje analýzu metanolu plynovou chromatografiou vo všetkých druhoch kozmetických výrobkov vrátane aerosólov. Môže byť stanovený relatívny obsah 0 až 10 %. 2. DEFINÍCIA Obsah metanolu stanovený touto metódou sa vyjadrí v hmotnostných percentách metanolu v pomere k etanolu a propán-2-olu. 3. PRINCÍP Stanovenie sa uskutoční plynovou chromatografiou. 4. ČINIDLÁ Použijú sa iba analyticky čisté činidlá. 4.1. Metanol 4.2. Absolútny etanol 4.3. Propán-2-ol 4.4. Chloroform zbavený alkoholov premytím vodou 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Plynový chromatograf s tepelnovodivým detektorom (katarometrom) pre aerosólové vzorky Plynový chromatograf s plameňovo-ionizačným detektorom pre neaerosólové vzorky 5.2. Odmerné banky, 100 ml 5.3. Pipety, 2 ml, 20 ml a 0 až 1 ml 5.4. Mikrostriekačky, 0 až 100 µl a 0 až 5 µl a (iba pre aerosólové vzorky) – špeciálna vzduchotesná striekačka so zasúvacím ventilom (obrázok č. 5 – Laboratórna príprava skúšobných vzoriek) 6. POSTUP 6.1. Príprava vzorky Z aerosólových vzoriek sa pripravujú vzorky podľa časti 2 tejto prílohy a potom sa analyzujú plynovou chromatografiou za podmienok v 6.2.1. Z neaerosólových vzoriek sa pripravujú vzorky podľa uvedenej časti 2, zriedia sa vodou na hladinu 1 až 2 % etanolu alebo propán-2-olu a potom sa analyzujú plynovou chromatografiou za podmienok uvedených v 6.2.2. 6.2. Plynová chromatografia 6.2.1. Pre aerosólové vzorky sa používa tepelnovodivý detektor (katarometer). 6.2.1.1. Použije sa kolóna naplnená 10 % Hallcomidom M18 na Chromosorb WAW, 100 až 200 mesh. 6.2.1.2. Kolóna musí poskytovať rozlíšenie R rovné alebo väčššie ako 1,5 podľa vzorca kde r1 a r2 sú retenčné časy dvoch píkov v minútach, W1 a W2 je šírka tých istých píkov v polovičnej výške v mm, d’ je rýchlosť zapisovača v mm za minútu. 6.2.1.3. Nasledujúce podmienky umožňujú dosiahnuť uvedené rozlíšenie Kolóna Materiál nehrdzavejúca oceľ Dĺžka 3,5 m Priemer 3 mm Prúd cez mostík katarometra 150 mA Nosný plyn hélium Tlak 2,5 bar Prietok 45 ml/min Teploty Vstrekovací ventil 150 oC Detektor 150 oC Ohrev kolóny 65 oC 6.2.2. Pre neaerosólové vzorky 6.2.2.1. Použije sa kolóna naplnená Chromosorbom 105 alebo Porapakom QS a detektor plameňovo-ionizačný. 6.2.2.2. Kolóna musí poskytovať rozlíšenie R rovné alebo väčšie ako 1,5 podľa vzorca kde r1 a r2 sú retenčné časy dvoch píkov v minútach, W1 a W2 je šírka tých istých píkov v polovičnej výške v mm, d’ je rýchlosť zapisovača v mm za minútu. 6.2.2.3. Nasledujúce podmienky umožňujú dosiahnuť uvedené rozlíšenie Kolóna Materiál nehrdzavejúca oceľ Dĺžka 2 metre Priemer 3 mm Citlivosť elektrometra 8 x 10-10 A Plyny Nosný dusík Tlak 2,1 bar Prietok 40 ml/min. Pomocný plyn vodík Tlak 1,5 bar Prietok 20 ml/min Teploty Vstrekovací ventil 150 oC Detektor 230 oC Ohrev kolóny 120 až 130 oC 7. KALIBRAČNÝ GRAF 7.1. Pri postupe pre plynovú chromatografiu 6.2.1. (kolóna Hallcomid M18) sa použijú nasledujúce referenčné zmesi. Tieto zmesi sa pripravia meraním pipetami. Presné množstvo sa zistí okamžitým vážením pipety alebo banky po každom pridaní. Relatívny obsah (% hmotn.) Metanol (
19. ml)Etanol alebo propán-2-ol (
20. ml)Chloroform pridaný do objemu (
21. ml)Približne 2,5 0,5 20 100 Približne 5,0 1,0 20 100 Približne 7,5 1,5 20 100 Približne 10 2,0 20 100 Do chromatografu sa nastreknú 2 až 3 µl podľa 6.2.1. Vypočíta sa pomer plôch píkov (metanol/etanol alebo metanol/propán-2-
22. ol)pre každú zmes. Zostrojí sa kalibračný graf, kde sa vynesie na os X % metanolu v pomere k etanolu alebo propán-2-olu, os Y pomer plochy píkov (metanol / etanol alebo metanol / propán-2-ol). 7.2. Pri postupe pre plynovú chromatografiu 6.2.2. (Porapak QS alebo Chromosorb 105) sa použijú nasledujúce referenčné zmesi. Tieto zmesi sa pripravia meraním mikrostriekačkou a pipetou, ale presné množstvo sa zistí okamžitým vážením pipety alebo banky po každom pridaní. Relatívny obsah (% hmotn.) Metanol (
23. ml)Etanol alebo propán-2-ol (
24. ml)Chloroform pridaný do objemu (
25. ml)Približne 2,5 50 2 100 Približne 5,0 100 2 100 Približne 7,5 150 2 100 Približne 10 200 2 100 Do chromatografu sa nastreknú 2 až 3 µl za podmienok v 6.2.2.Vypočíta sa pomer plôch píkov (metanol/etanol alebo metanol/propán-2-
26. ol)pre každú zmes. Zostrojí sa kalibračný graf, kde sa vynesie na os X percento metanolu v pomere k etanolu alebo propán-2-olu, os Y pomer plochy píkov (metanol/etanol alebo metanol/propán-2-ol). 7.3. Kalibračný graf musí byť priamka. 8. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu metanolu 5 % v pomere k etanolu alebo propán-2-olu nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť 0,25 %. 14. STANOVENIE DICHLÓRMETÁNU A 1,1,1-TRICHLÓRETÁNU (Podľa smernice Komisie 83/514/EHS z 27. septembra 1983) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda opisuje stanovenie dichlórmetánu (metylénchloridu) a 1,1,1-trichlóretánu (metylchloroformu) vo všetkých kozmetických výrobkoch, ktoré môžu obsahovať tieto rozpúšťadlá. 2. DEFINÍCIA Obsah dichlórmetánu a 1,1,1-trichlóretánu stanovený vo vzorke podľa tejto metódy sa vyjadrí v hmotnostných percentách. 3. PRINCÍP Táto metóda využíva plynovú chromatografiu s chloroformom ako vnútorným štandardom. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 4.1. Chloroform (CHCl3) 4.2. Chlorid uhličitý (CCl4) 4.3. Dichlórmetán (CH2Cl2) 4.4. 1,1,1-trichlóretán (CH3CCl3) 4.5. Acetón 4.6. Dusík 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. Bežné laboratórne vybavenie 5.2. Plynový chromatograf vybavený tepelnovodivostným detektorom 5.3. Fľaša na prenesenie vzorky 50 až 100 ml (podľa 5.3. „Laboratórna príprava skúšobných vzoriek“) 5.4. Tlaková injekčná striekačka 25 až 50 ml (podľa 5.4.2.2. „Laboratórna príprava skúšobných vzoriek“) 6. POSTUP 6.1. Vzorka, ktorá nie je pod tlakom Vzorka sa presne naváži do kónickej banky so zátkou, pridá sa presne navážené množstvo chloroformu (4.1.) ako vnútorný štandard, zodpovedajúce predpokladanému množstvu dichlórmetánu a 1,1,1-trichlóretánu obsiahnutému vo vzorke, a dôkladne sa premieša. 6.2. Vzorka pod tlakom Použije sa postup „Odber vzoriek“ s nasledujúcimi úpravami. 6.2.1. Po prenesení vzorky do fľaše (5.3.) sa pridá objem chloroformu (4.1.) ako vnútorný štandard, zodpovedajúci predpokladanému množstvu dichlórmetánu a/alebo 1,1,1-trichlóretánu, obsiahnutému vo vzorke. Dôkladne sa premieša. Mŕtvy objem ventilu sa prepláchne 0,5 ml chloridu uhličitého (4.2.). Po vysušení sa z rozdielu hmotnosti presne stanoví hmotnosť pridaného vnútorného štandardu. 6.2.2. Po naplnení striekačky vzorkou sa špička striekačky musí vypláchnuť prúdom dusíka (4.6.) tak, že v nej pred nástrekom vzorky do chromatografu nezostane žiadny zvyšok. 6.2.3. Po odobratí každej vzorky sa povrch ventilu a prenášacej časti niekoľkokrát prepláchne acetónom (4.5.) s použitím injekčnej striekačky, ak sa to vyžaduje, a potom sa dôkladne vysuší dusíkom (4.6.). 6.2.4. Pre každú analýzu sa uskutočnia merania s použitím dvoch rôznych fliaš na prenášanie vzoriek a pre každú fľašu sa vykoná 5 meraní. 7. PODMIENKY NA CHROMATOGRAFIU 7.1. Predkolóna Materiál kolóny nehrdzavejúca oceľ Dĺžka 300 mm Priemer 3 až 6 mm Náplň rovnaký materiál, akým je naplnená analytická kolóna 7.2. Kolóna Stacionárna fáza vyrobená z Hallcomidu M 18 na Chromosorb. Kolóna musí poskytovať rozlíšenie R rovnajúce sa alebo väčšie ako 1,5 podľa vzorca kde r1 ar2 sú retenčné časy v minútach, W1 a W2 je šírka píkov v polovičnej výške píku v milimetroch, d’ je rýchlosť zapisovača v milimetroch za minútu. 7.2. Ako príklady sú uvedené kolóny, ktoré poskytujú dané výsledky. Kolóna I II Materiál nehrdzavejúca oceľ nehrdzavejúca oceľ Dĺžka 350 cm 400 cm Priemer 3 mm 6 mm Nosič I II Chromosorb WAW WAW-DMCS-HP Zrnitosť 100 - 120 mesh 60 - 80 mesh Stacionárna fáza Hallcomid M 18, 10 % Hallcomid M 18, 20 % Teplotné podmienky sa môžu líšiť v závislosti od použitého prístroja. Na príkladoch sú nastavené takto: Kolóna I II Teploty Kolóna 65 °C 75 °C Dávkovací ventil 150 °C 125 °C Detektor 150 °C 200 °C Nosný plyn I II Prietoková rýchlosť hélia 45 ml/min. 60 ml/min. Vstupný tlak 2,5 bar 2 bar Nástrek 15 μl 15 μl 8. ZMES NA STANOVENIE ODOZVOVÉHO FAKTORA Do kónickej banky so zátkou sa presným navážením pripraví zmes obsahujúca – dichlórmetán (4.3.), 30 % (hmot.), – 1,1,1-trichlóretán (4.4.), 35 % (hmot.), – chloroform (4.1.), 35 % (hmot.). 9. VÝPOČTY 9.1. Výpočet odozvového faktora látky „p“ vo vzťahu k látke „a“ zvolenej ako vnútorný štandard Ak prvá látka je „p“, kde je kp jej odozvový faktor, mp jej hmotnosť v zmesi, Ap plocha jej píku. Ak druhá látka je „a“, kde je ka jej odozvový faktor zvolený ako rovnajúci sa jednej, Ma jej hmotnosť v zmesi, Aa plocha jej píku, potom Na príkladoch sú získané nasledujúce hodnoty odozvových faktorov (pre chloroform k = 1) dichlórmetán k1 = 0,78 ± 0,03, 1,1,1-trichlóretán k2 = 1,00 ± 0,03. 9.2. Výpočet hmotnostných percent dichlórmetánu a 1,1,1-trichlóretánu prítomných v analyzovanej vzorke, ak ma je hmotnosť pridaného chloroformu v gramoch, Ms je hmotnosť analyzovanej vzorky v gramoch, Aa je plocha píku chloroformu, A1 je plocha píku dichlórmetánu, A2 je plocha píku 1,1,1-trichlóretánu, potom 10. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu dichlórmetánu a/alebo 1,1,1-trichlóretánu 25 % (hmot.) nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť absolútnu hodnotu 2,5 % (hmot.). 15. DÔKAZ A STANOVENIE CHINOLÍN-8-OLU A BIS(8-HYDROCHINOLÍNIUM)-SULFÁTU (Podľa smernice Komisie 83/514/EHS z 27. septembra 1983) 1. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda opisuje dôkaz a kvantitatívne stanovenie chinolín-8-olu a jeho sulfátu. 2. DEFINÍCIA Obsah chinolín-8-olu a bis(8-hydroxychinolínium)-sulfátu stanovený vo vzorke podľa tejto metódy sa vyjadrí v hmotnostných percentách chinolín-8-olu. 3. PRINCÍP 3.1. Dôkaz Dokazujú sa tenkovrstvovou chromatografiou. 3.2. Stanovenie Stanovenie sa uskutoční spektrofotometriou komplexu získaného reakciou s Fehlingovým roztokom pri 410 nm. 4. ČINIDLÁ Všetky činidlá majú byť analyticky čisté. 4.1. Chinolín-8-ol 4.2. Benzén Vzhľadom na jeho jedovatosť je potrebné pracovať s ním veľmi opatrne. 4.3. Chloroform 4.4. Vodný roztok hydroxidu sodného, 50 % (hmot.) roztok 4.5. Pentahydrát síranu meďnatého 4.6. Vínan draselno-sodný 4.7. 1 M kyselina chlorovodíková 4.8. Kyselina sírová, 0,5 M 4.9. Hydroxid sodný, 1 M roztok 4.10. Etanol 4.11. Bután-1-ol 4.12. Ľadová kyselina octová 4.13. Kyselina chlorovodíková, 0,1 M 4.14. „Celit 545“ alebo jeho ekvivalent 4.15. Štandardné roztoky 4.15.1. Do 100 ml odmernej banky sa naváži 100 mg chinolín-8-olu (4.1.). Rozpustí sa v malom množstve kyseliny sírovej (4.8.). Doplní sa kyselinou sírovou (4.8.) po značku. 4.15.2. Do 100 ml odmernej banky sa naváži 100 mg chinolín-8-olu. Rozpustí sa v etanole (4.10.). Doplní sa etanolom (4.10.) po značku a premieša sa. 4.16. Fehlingov roztok Roztok A Do 100 ml odmernej banky sa naváži 7 g pentahydrátu síranu meďnatého (4.5.), rozpustí sa v malom množstve vody, doplní vodou po značku a premieša sa. Roztok B Do 100 ml odmernej banky sa naváži 35 g vínanu draselno-sodného (4.6.). Rozpustí sa v 50 ml vody, pridá sa 20 ml roztoku hydroxidu sodného (4.4.), doplní vodou po značku a premieša sa. Tesne pred použitím sa do 100 ml odmernej banky pipetou prenesie 10 ml roztoku A a 10 ml roztoku B a doplní sa vodou po značku a premieša sa. 4.17. Elučné zmesi pre tenkovrstvovú chromatografiu I. zmes Bután-1-ol (4.11.)/kyselina octová (4.12.)/voda, obj. diely 80 : 20 : 20 II. zmes Chloroform (4.13.)/kyselina octová (4.12.), obj. diely 95 : 5 4.18. 2,6-dichlór-4-(chlórimino)cyklohexa-2,5-dienón, 1 % (m/V) roztok v etanole (4.10.) 4.19. Uhličitan sodný, 1 % (hmot.) roztok vo vode 4.20. Etanol (4.10.), 30 % (obj.) roztok vo vode 4.21. Dinátrium-dihydrogen-etyléndiamíntetraacetát, 5 % (hmot.) roztok vo vode 4.22. Tlmivý roztok, pH 7 Do 1 000 ml odmernej banky sa naváži 27 g bezvodého dihydrogenfosforečnanu draselného a 70 g trihydrátu hydrogenfosforečnanu didraselného. Doplní sa po značku vodou. 4.23. Príprava tenkovrstvových platničiek Hotové tenkovrstvové chromatografické platne s hrúbkou 0,25 mm (napr. Merck Kieselgel 60 alebo ich ekvivalent). Pred použitím sa doska postrieka 10 ml činidla (4.21.) a vysuší sa pri 80 oC. 5. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.1. 100 ml banka s okrúhlym dnom a zábrusovým skleným hrdlom 5.2. Odmerné banky 5.3. Delené pipety, 10 a 5 ml 5.4. Nedelené pipety, 20, 15, 10 a 5 ml 5.5. Oddeľovacie lieviky, 100, 50 a 25 ml 5.6. Skladaný filtračný papier, priemer 90 mm 5.7. Rotačná vákuová odparka 5.8. Spätný chladič so zábrusovým skleneným hrdlom 5.9. Spektrofotometer 5.10. Kyvety s optickou dráhou dlhou 10 mm 5.11. Miešadlo s výhrevnou platňou 5.12. Sklenená chromatografická kolóna, dĺžka 160 mm, priemer 8 mm na spodnom zúženom konci, so zátkou zo sklenej vaty a s nadstavcom na možnú aplikáciu tlaku na hornom konci 6. POSTUP 6.1. Dôkaz 6.1.1. Kvapalné vzorky 6.1.1.1. Hodnota pH časti testovanej vzorky sa upraví na 7. Na štartovaciu čiaru na vopred pripravenej silikagélovej tenkovrstvovej platničke (4.23.) sa nanesie 5 a 10 µl vzorky. 6.1.1.2. Na dva ďalšie body na štartovacej čiare sa nanesie 10 a 30 µl štandardného roztoku (4.15.2.), potom sa platnička nechá vyvíjať v jednej z dvoch elučných zmesí (4.17.). 6.1.1.3. Keď čelo rozpúšťadla dosiahne 150 mm, platnička sa vysuší pri 110 oC (počas 15 minút). Škvrny chinolín-8-olu fluoreskujú pod ultrafialovou lampou (366
27. nm)nažlto. 6.1.1.4. Platnička sa postrieka roztokom uhličitanu sodného (4.19.), vysuší sa a postrieka roztokom 2,6-dichlór-4-(chlórimino)cyklohexa-2,5-dienónu (4.18.). Chinolín-8-ol sa zviditeľní ako modrá škvrna. 6.1.2. Tuhé vzorky alebo krémy 6.1.2.1. V 5 ml tlmivého roztoku (4.22.) disperguje sa 1 g vzorky. Potom sa do oddeľovacieho lievika prenesie s 10 ml chloroformu (4.3.) a pretrepe sa. Po oddelení chloroformovej vrstvy sa vodná vrstva ešte dvakrát extrahuje 10 ml chloroformu (4.3.). Spojené a prefiltrované chloroformové extrakty sa v 100 ml banke s okrúhlym dnom (5.1.) odparia na rotačnej vákuovej odparke (5.7.) takmer dosucha. Odparok sa rozpustí v 2 ml chloroformu (4.3.), 10 a 30 µl získaného roztoku sa nanesie na silikagélovú dosku na chromatografiu na tenkej vrstve (4.23.), podľa 6.1.1.1. a ďalej. 6.1.2.2. Na platničku sa nanesie 10 a 30 µl štandardného roztoku (4.15.2.) a pokračuje sa postupom podľa 6.1.1.2. až 6.1.1.4. 6.2. Stanovenie 6.2.1. Kvapalné vzorky 6.2.1.1. Do 100 ml banky s okrúhlym dnom sa naváži 5 g vzorky. Pridá sa 1 ml roztoku kyseliny sírovej (4.8.) a zmes sa odparí za zníženého tlaku pri 50 oC takmer dosucha. 6.2.1.2. Tento zvyšok sa rozpustí v 20 ml teplej vody. Prenesie sa do 100 ml odmernej banky. Opláchne sa trikrát 20 ml vody. Doplní sa vodou do 100 ml a premieša sa. 6.2.1.3. Do 50 ml oddeľovacieho lievika (5.5.) sa pipetou prenesie 5 ml tohto roztoku. Pridá sa 10 ml Fehlingovho roztoku (4.16.). Získaný meďnatý komplex chinolín-8-olu (oxín-kuprium (ISO)) sa extrahuje trikrát 8 ml chloroformu (4.3.). 6.2.1.4. Chloroformové vrstvy sa prefiltrujú a zachytávajú do 25 ml odmernej banky (5.2.). Doplnia sa chloroformom (4.3.) po značku a premiešajú sa. Meria sa absorbancia žltého roztoku oproti chloroformu pri 410 nm. 6.2.2. Tuhé vzorky alebo krémy 6.2.2.1. Do 100 ml banky s okrúhlym dnom (4.1.) sa naváži 0,5 g vzorky. Pridá sa 30 ml benzénu (4.2.) a 20 ml kyseliny chlorovodíkovej (4.7.). Obsah sa za miešania zahrieva na reflux počas 30 minút. 6.2.2.2. Obsah banky sa prenesie do 100 ml oddeľovacieho lievika (5.5.). Opláchne sa 5 ml 1 M HCl (4.7.). Vodná fáza sa prenesie do banky s okrúhlym dnom (5.1.) a benzénová fáza sa premyje 5 ml kyseliny chlorovodíkovej (4.7.). 6.2.2.3. V prípade vytvorenia emulzií, čo bráni ďalšiemu postupu, zmieša sa 0,5 g vzorky s 2 g Celitu 545 (4.14.), čím sa vytvorí voľne sypký prášok. Zmes sa po malých častiach prenesie do sklenenej chromatografickej kolóny (5.12.). Po každom pridaní sa pritlačí náplň kolóny. Len čo sa do kolóny prenesie celá zmes, eluuje sa kyselinou chlorovodíkovou (4.13.) takým spôsobom, aby sa 10 ml eluátu získalo približne za 10 minút (ak je to potrebné, elúcia sa môže uskutočniť pod miernym tlakom dusíka). Počas elúcie sa musí zabezpečiť, aby nad vrstvou náplne kolóny vždy bolo nejaké množstvo kyseliny chlorovodíkovej. Prvých 10 ml eluátu sa ďalej spracuje, ako je opísané v 6.2.2.4. 6.2.2.4. Zachytené vodné fázy (6.2.2.2.) alebo eluát (6.2.2.3.) sa takmer dosucha odparia na vákuovej rotačnej odparke za zníženého tlaku. 6.2.2.5. Zvyšok sa rozpustí v 6 ml roztoku hydroxidu sodného (4.9.). Pridá sa 20 ml Fehlingovho roztoku (4.16.) a obsah banky sa prenesie do 50 ml oddeľovacieho lievika (5.5.). Banka sa premyje 8 ml chloroformu (4.3.). Pretrepe sa a chloroformová fáza sa prefiltruje do 50 ml odmernej banky (5.2.). 6.2.2.6. Extrakcia sa zopakuje trikrát s 8 ml chloroformu (4.3.). Chloroformové fázy sa prefiltrujú a zachytia do 50 ml odmernej banky. Doplní sa chloroformom (4.3.) po značku a premieša sa. Meria sa absorbancia žltého roztoku oproti chloroformu (4.3.) pri 410 nm. 7. KALIBRAČNÁ KRIVKA Do štyroch 100 ml baniek s okrúhlym dnom (5.1.), z ktorých každá obsahuje 3 ml 30 % vodného etanolu (4.20.), napipetuje sa 5, 10, 15 a 20 ml štandardného roztoku (4.15.1.), zodpovedajúce 5, 10, 15 a 20 mg chinolín-8-olu. Postupuje sa, ako je opísané v 6.2.1. 8. VÝPOČET 8.1. Kvapalné vzorky Obsah chinolín-8-olu v hmotnostných percentách v kvapalných vzorkách sa vypočíta podľa vzorca kde a je množstvo chinolín-8-olu odčítané z kalibračnej krivky

(7)v miligramoch, m je hmotnosť testovanej časti vzorky (6.2.1.1.) v miligramoch. 8.2. Tuhé vzorky alebo krémy Obsah chinolín-8-olu v hmotnostných percentách v tuhých vzorkách alebo krémoch sa vypočíta podľa vzorca kde a je množstvo chinolín-8-olu odčítané z kalibračnej krivky

(7)v miligramoch, m je hmotnosť testovanej časti vzorky (6.2.1.1.) v miligramoch.

1. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu chinolín-8-olu okolo 0,3 % nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť absolútnu hodnotu 0,02 %.
2. STANOVENIE AMONIAKU (Podľa smernice Komisie 83/514/EHS z
3. septembra 1983)
4. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda opisuje stanovenie voľného amoniaku v kozmetických výrobkoch.
5. DEFINÍCIA Obsah amoniaku stanovený vo vzorke podľa tejto metódy sa vyjadrí v hmotnostných percentách amoniaku.
6. PRINCÍP Roztok chloridu bárnatého sa pridá do testovanej časti kozmetických výrobkov zriedenej vo vodnom roztoku metanolu. Akákoľvek zrazenina, ktorá vznikne, odfiltruje sa alebo odstredí na centrifúge. Tento postup zabraňuje stratám amoniaku počas destilácie s vodnou parou z niektorých solí amoniaku, ako napríklad uhličitan alebo hydrogenuhličitan amónny a soli mastných kyselín, s výnimkou octanu amónneho. Z filtrátu alebo supernatantu sa amoniak oddelí destiláciou s vodnou parou a stanoví sa potenciometrickou alebo inou titráciou.
7. ČINIDLÁ Všetky činidlá majú byť analyticky čisté. 4.
8. Metanol 4.
9. Dihydrát chloridu bárnatého, 25 % (m/V) roztok 4.
10. Kyselina trihydrogenboritá, 4 % (m/V) roztok 4.
11. Kyselina sírová, 0,25 M štandardný roztok 4.
12. Kvapalina obmedzujúca penenie 4.
13. Hydroxid sodný, 0,5 M štandardný roztok 4.
14. Indikátor, ak je potrebný: 5 ml 0,1 % (m/V) roztoku metylčervene v etanole sa zmieša s 2 ml 0,1 % (m/V) roztoku metylénovej modrej vo vode.
15. PRÍSTROJE A POMÔCKY 5.
16. Bežné laboratórne vybavenie 5.
17. Centrifúga so 100 ml uzavierateľnými odstredivkovými skúmavkami 5.
18. Aparatúra na destiláciu s vodnou parou 5.
19. Potenciometer 5.
20. Indikátorová sklenená elektróda a kalomelová (s chloridom ortutným) referenčná elektróda
21. POSTUP 6.
22. Do 100 ml odmernej banky sa naváži vzorka s hmotnosťou (m), zodpovedajúca maximálne 150 mg amoniaku. 6.
23. K vzorke sa pridá 10 ml vody, 10 ml metanolu (4.1.), 10 ml roztoku chloridu bárnatého (4.2.) a doplní sa do 100 ml metanolom (4.1.). 6.
24. Roztok sa premieša a nechá sa stáť cez noc v chladničke (5 oC). 6.
25. Potom sa ešte chladný roztok prefiltruje alebo odstredí na centrifúge v uzavretých kyvetách počas 10 minút tak, aby sa získal číry filtrát alebo vrstva supernatantu. 6.
26. 40 ml tohto číreho roztoku sa pipetou prenesie do aparatúry na destiláciu s vodnou parou (5.3.) s prídavkom 0,5 ml kvapaliny obmedzujúcej penenie (4.5.), ak je to potrebné. 6.
27. Predestiluje sa a 200 ml destilátu sa zachytí do 250 ml kadičky obsahujúcej 10 ml štandardného roztoku kyseliny sírovej (4.4.) a 0,1 ml indikátora (4.7.). 6.
28. Nadbytok kyseliny sa spätne titruje so štandardným roztokom hydroxidu sodného (4.6.). 6.
29. Poznámka Na potenciometrické stanovenie sa 200 ml destilátu zachytí do 250 ml kadičky obsahujúcej 25 ml roztoku kyseliny trihydrogenboritej (4.3.) a titruje sa štandardným roztokom kyseliny sírovej (4.4.). Zostrojí sa titračná krivka.
30. VÝPOČTY 7.
31. Výpočet v prípade spätnej titrácie Obsah amoniaku v hmotnostných percentách v prípade spätnej titrácie sa vypočíta podľa vzorca kde V1 je objem spotrebovaného roztoku hydroxidu sodného (4.6.) v mililitroch, M1 je jeho skutočná molarita (4.6.), M2 je skutočná molarita roztoku kyseliny sírovej (4.4.), m je hmotnosť naváženej vzorky (6.1.) v miligramoch. 7.
32. Výpočet v prípade priamej potenciometrickej titrácie Obsah amoniaku v hmotnostných percentách v prípade priamej potenciometrickej titrácie sa vypočíta podľa vzorca kde V2 je objem spotrebovaného roztoku kyseliny sírovej (4.4.) v mililitroch, M2 je jeho skutočná molarita (4.4.), m je hmotnosť naváženej vzorky (6.1.) v miligramoch.
33. OPAKOVATEĽNOSŤ2) Pri obsahu amoniaku okolo 6 % nesmie rozdiel medzi výsledkami dvoch paralelne uskutočnených stanovení na tej istej vzorke presiahnuť absolútnu hodnotu 0,6 %.
34. DÔKAZ A STANOVENIE NITROMETÁNU (Podľa smernice Komisie 83/514/EHS z
35. septembra 1983)
36. ROZSAH A OBLASŤ POUŽITIA Táto metóda je vhodná na dôkaz a stanovenie nitrometánu približne až do 0,3 % v kozmetických výrobkoch balených v aerosólových rozprašovačoch.
37. DEFINÍCIA Obsah nitrometánu stanovený vo vzorke podľa tejto metódy sa vyjadrí v hmotnostných percentách nitrometánu v celkovom obsahu aerosólového rozprašovača.
38. PRINCÍP Nitrometán sa dokazuje farebnou reakciou. Nitrometán sa stanoví plynovou chromatografiou po pridaní vnútorného štandardu.
39. DÔKAZ 4.
40. Činidlá Všetky činidlá majú byť analyticky čisté. 4.1.
41. Hydroxid sodný, 0,5 M roztok 4.1.
42. Folinovo činidlo, 0,1 g nátrium-3,4-dihydro-3,4-dioxonaftalén-1-sulfonátu sa rozpustí vo vode a zriedi sa do 100 ml. 4.
43. Postup K 1 ml vzorky sa pridá 10 ml 4.1.
44. a 1 ml 4.1.
45. Fialové sfarbenie indikuje prítomnosť nitrometánu.
46. STANOVENIE 5.
47. Činidlá Všetky činidlá musia byť analyticky čisté. 5.1.
48. Chloroform (vnútorný štandard 1) 5.1.
49. 2,4-dimetylheptán (vnútorný štandard 2) 5.1.
50. Etanol, 95 % 5.1.
51. Nitrometán 5.1.
52. Referenčný roztok chloroform Do odváženej