NORMA 10/06/2004 - Portal Legislativ

NORMA 10/06/2004 - Portal Legislativ Portal Legislativ --> Meniu Meniu Acasă Despre Proiect Facilități Oferite Legături Utile GDPR Meniu Acasă Despre Proiect Facilități Oferite Legături Utile GDPR Prin portalul N-Lex se acorda acces gratuit la legislatiile nationale ale statelor membre, portalul fiind conceput pe baza unei tehnologii de comunicare interne, ce permite accesarea directa a bazelor de date legislative nationale, rezultatele cautarilor venind direct de la sursa. Cuprins Se încarcă, vă rugăm asteptati. + Fișă act Actiuni suferite Actiuni Induse Refera pe Referit de Cuprinsul Actului 11. Determinarea sodiului Reveniti in topul paginii Forma printabilă NORMĂ VETERINARA din 10 iunie 2004 privind metode naţionale de analiza pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conţinutul în aflatoxina*) EMITENT AGENŢIA VETERINARĂ ŞI PENTRU SIGURANŢA ALIMENTELOR Publicat în MONITORUL OFICIAL nr. 1.020 bis din 4 noiembrie 2004 Notă ... *) Aprobata prin Ordinul nr. 14 din 10 iunie 2004, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1020 din 4 noiembrie 2004. ANEXĂ NORMĂ VETERINARĂ privind metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în aflatoxină ANEXĂ la norma veterinară 3.2 Cloroform, stabilizat cu o.s până la 1.o% de 96% etanol (v/v). 3.3. 1\I-hexane. 3.4. Metanol 3.5. Eter etilic anhidru, liber de peroxid 3.6. Amestec de benzen şi acetonitril: 98/2 (v/v). 3.7. Amesteic de cloroform (3.2) şi metanol (3.4): 97/3 (v/

v)3.8 Silicagel, pentru coloana cromatografică, măsura particulei o-os până la 0-20 mm. 3.9. Vată de bumbac absorbantă, degresată anterior cu cloroform, sau vat i de sticlă, 3.1O. Sulfat de sodiu, anhidru, granular 3.11. Gaz inert, de ex. nitrogen 3.12 Acid clorhidric 1 N 3.13. acid sulfuric 50% ( v/
v)3.14. Diaton1it (hyflosupercel), spălat în acid. 3.15. Silicagel G-HH sau echivalent, pentru CSS 3.16. Soluţie standard cu aproximativ o.1 µg de aflatoxină 81 per ml în cloroforrn ( 3.2) sau amestHc de benzen/acetonitril (3.6)1preparat şi verificat aşa cum s-a indicat la Secţiunea 7. 3.17. Soluţie standard pentru scopuri de testare calitativă ce conţine aproximativ 0-1 µg de aflatoxină B·1 şi 82 per ml în cloroform (3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6). Aceste concentraţii sunt prezentate ca un ghid. Acestea trebuie să fie ajustate astfel încf:1t să se obţină aceeaşi intensitate de fluorescenţă pentru ambele aflatoxine. 3.18. Solvenţi de developare: 3.18.1. Cloroform (3.2)/acetonă (:3.1) : 9/1 (v/v), soluţie mamă nesaturată·I 3.18.2. Eter etilic (3.5)/metanol (:3.4)/apă : 96/3/1 (v/v/v, soluţie mamă nesaturată); 3.18.3. Eter etilic (3.5)/metanol (3.4)/apă : 94/4.5/1.5 (v/v/v), soluţie man1ă nesaturată; 3.18.4 Cloroform (3,.2)/metanol (3.4) : 94/6 (v/v), soluţie mamă saturată; 3.18.5. Cloroform (3.2)/metanol (3.4) : 97/3 (v/v), soluţie mamă saturată; 4. Aparatură. 4.1. Râşniţăt ...rnixer 4.2. Se scutură1 aparatul sau se agită ,nagnetic 4.3. Hârtie de filtru canelată, Schleicher şi SchOII nr 588 sau echivalent, diametru : 24 cm 4.4 Tub de sticlă pentru cromatografie (diametru intern : 22 mmj lungime : 300 mm), cu un robinet PTFE şi un rezervor de 250 ml. 4.5. Evapoirator rotativ în vacuurr1, cu un balon cu fund rotund de 500 rr1I 4.6. balon conic de 500 ml, cu buşon de sticlă rodat. 4.7. Aparatura pentru CSS 4.8. Plăci de sticlă pentru CSS, 200 x 200 mm, preparate după cun, urmează (cantităţile indicate sunt suficiente pentru a acoperi cinci pli ci). Se pun 30 g de silicagel G-HR (3.15) într-un balon conic. Se adaugă 60 n1I apă, sei astupă şi se agită timp de un minut. Se în1prăştie suspensia pe plăci astfel încât să se obţină un strat uniforrn de grosirne o.2s mm. Se lasă să se usuce la aer şi apoi se depozitează într-un exicator ce conţine silicagel. În rnornentul utilizăriij se activează plăcile prin ţinerea acestora în cuptor la 11O °C timp de o oră. Gata de utilizare, plăcile sunt corespunzătoare dacă acestea dau rezultate similare celor obţinute cu plăci preparate aşa cum s-a indicat mai sus. 4.9. l..arnpă UV de iungirne de undă (360 nm). Intensitatea iradierii trebuie :SEl facă posibil, pentru un spot de 1 ng de aflatoxină 81 să fie distins cu claritate pe o placă CSS la o distanţă de 1O cm de lampă. 4.1O. Tuburi gradate de 1O ml cu dopuri de polietilenă. 4.11. Spectrofotometru UV. 4.12. Fluorodensitometru (opţional) 5. Procedură. 5.1. Prepararea probei (vezi ăObservaţii", Partea C, punctul 1). Se râşneşte proba astfel încât întreaga cantitate să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm (în concordanţă cu recomandarea ISO R 565). 5.2. Extractie ' Se pun 50 g de probă râşnită, omogenizată într-un tub conic de 500 ml. Se adaugă 25 g de diatomit (3.14), 25 ml de apă şi 250 ml de cloroform (3.2). Se astupă balonul, se scutură sau se agită pentru 30 de minute cu aparatul (4.2) şi se filtrează printr o hârtie de filtru canelată (4.3). Se înlătură primii 1O ml din filtrat şi apoi se colectează 50 ml. 5.3. Curătarea coloanei ' Se insereaza în capătul inferior al unui tub de cromatografie (4.4) un dop de vată de bumbac sau de sticlă (3.9), se umple două treimi din tub cu cloroform (3.2) şi se adaugă 5 g de sulfat de sodiu (3.1O).Se verifică dacă suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu este netedă, apoi se adaugă 1O g de silicagel (3.8) în porţiuni mici. Se agită cu atenţie după fiecare adiţie, pentru a elimina bulele de aer. Se lasă în repaos timp de 15.minute şi apoi se adaugă cu atenţie 15 g de sulfat de sodiu (3.1O). Se lasă lichidul să cadă până când acesta este tocmai deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se amestecă 50 ml de extract colectat la 5.2 cu 100 ml de n-hexan (3.3) şi se transferă cantitatea din amestecul coloanei. Se lasă lichidul să cadă până când acesta este tocmai deasupra suprafeţei superioare a stratului de sulfat de sodiu. Se elimină această spălare. Apoi se adaugă 100 ml de eter etilic (3.5) şi se lasă din nou să cadă până la suprafaţa superioară a stratului de sulfat de sodiu. în timpul acestor operaţiunii se observă că debitul este 8 până la 12 ml per minut şi coloana nu devine uscată. Se elimină lichidul care iese. Se eluează apoi cu 150 ml de amestec de cloroform/metanol (3.7) şi se colectează întregul eluat. Se evaporă cel din urmă până aproape de uscare la o temperatură ce nu depăşeşte 50 °C şi sub un jet de gaz inert (3.11) cu evaporator rotativ (4.5). Se transferă în mod cantitativ reziduul, utilizând cloroform (3.2) sau amestec de benzen - acetonitril (3.6), într-un tub gradat de 1O ml {4._1O). Se concentrează soluţia sub un jet de gaz inert (3.11) şi apoi se ajustează volumul până la 2 ml cu cloroform (3 2) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6). 5.4. Cromatografie în strat subţire Se efectuează un spot pe o placă pentru cromatografie în strat subţire (4.8), 2 cm de la marginea inferioară şi la distanţe de 2 cm, cu volume indicate mai jos din soluţia standard şi din extract: - 1O, 15, 20, 30 şi 40 µI din soluţia standard de aflatoxină 81 (3.16); - 1O µI din extractul obţinut la 5.3 şi, suprapus pe acelaşi punct, - 20 µI de soluţie standard (3.16); - 1O şi 20 µI de extras obţinut la 5. . Se developează cromatograma la întuneric cu unul din solvenţii de developare (3.18). Alegerea solventului trebuie să fie efectuată în prealabil, prin depozitare de 25 µI de soluţie standard calitativă (3.17}' pe placă şi verificând ca atunci când se developează, aflatoxinele 81 şi 82 sunt complet separate. , Se lasă solvenţii să se evapore la întuneric şi apoi se iradiază cu lumină UV, plasând placa la 1O cm de lampă (4.9). Spoturile de aflatoxină 81 dau o fluorescenţă albastră. 5.5. Determinări cantitative Se determină fie vizual, fie prin fluorodensitometrie, aşa cum s-a indicat mai jos. 5.5.1. Măsurări vizuale Se determină cantitatea de aflatoxină 81 din extract, prin compararea intensităţii fluorescenţei din spoturile de extract cu cea a unuia din spoturile soluţiei standard. Se interpolează dacă este necesar. Fluorescenţa obţinută prin suprapunerea extractului din solutia standard trebuie să fie mai intensă decât cea a cantităţii de 1'O µI de extract şi nu trebuie să fie mai mare decât un spot vizibil. Dacă intensitatea fluorescenţei dată de cantitatea de 1O µI de extras este mai mare decât cea de 40 µI din solutia standard, se diluează extractul de 1O sau 100 de ori cu cloro' form (3.2) sau amestec de benzen/acetonitril (3.6) înainte să fie supus din nou cromatografiei în strat subţire. 5.5.2. Măsurări prin fluorodensitometrie Se măsoară intensitatea fluorescenţei spoturilor de aflatoxină 81 cu fluorodensitometru (4.12) la o excitaţie a lungimii de undă de 365 nm şi o emisie a lungimii de undă de 443 nm. Se determină cantitatea de aflatoxină 81 din spoturile de extract, prin compararea intensităţilor fluorescenţei acestora cu cea a spoturilor de aflatoxină 81 standard. 5.6. Confirmarea identitătii aflatoxinei 81 ' Confirmarea identitătii aflatoxinei 81 din extract se efectuează prin procesele 'indicate mai jos. 5.6.1. Tratare cu acid sulfuric Se pulverizează acid sulfuric (3.13) pe cromatograma obţinută la 5.4. Fluorescenţa spoturilor de aflatoxină 81 trebuie să devină, sub iradierea UV din albastră, galbenă. 5.6.2. Cromatografie bidimensională implicând formarea de aflatoxină 81-hemiacetat (aflatoxină 82a) N8: Operaţiunile descrise mai jos trebuie să fie efectuate urmând cu atenţie diagrama din figura 3. · 5.6.2.1. Aplicarea soluţiilor Se trasează pe o placă (4.8) două linii drepte paralele la două părţi marginale (6 cm de fiecare parte) până la limita migraţiei fronturilor de solvent. Se marchează soluţiile următoare pe placă utilizându-se pipete capilare sau microseringi : - în punctul A: un volum al probei de extract purificat, obţinută la 5.3, conţinând aproximativ 2. s ng de aflatoxină 81; - în punctele 8 şi C: soluţie standard de 25 µI 5.6.2.2. Developare Se developează cromatograma în direcţia I, la întuneric, utilizând solvent de developare (3.18.1)(un strat de 1 cm dintr-o soluţie mamă nesaturată) până când frontul de solvent atinge linia limită a solventului. Se îndepărtează soluţia mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la întuneric, la temperatura ambiantă, timp de cinci minute. Se pulverizează apoi cu acid clorhidric (3.12) de a lungul unei bande de 2. s cm înălţime ce acoperă punctele A şi 8 (indicată prin zona haşurată în figura 3.) până când se întunecă, protejând restul plăcii cu o foaie de sticlă. Se lasă să reacţioneze timp de 1O minute la întuneric şi se usucă cu un curent de aer la temperatură ambiantă. Se developează apoi cromatograma în direcţia li, la întuneric, utilizând solvent de developare (3.18.1) (un strat de 1 cm dintr-o soluţie mamă nesaturată) până când frontul de solvent ajunge la linia limită a solventului. Se îndepărtează soluţia mamă de pe placă şi se lasă să se usuce la temperatura ambiantă. 5.6.2.3. Interpretarea cromatogramei. Se examinează cromatograma sub lumină UV (4.9) şi se verifică următoarele caracteristici (
a)Apariţia unui spot albastru de aflatoxină 81 ce provine de la soluţia standard aplicată în punctul C (migrare în direcţia I). AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR O R D I N pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute*) În temeiul prevederilor art. 10 lit.
b)din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia, văzând Referatul de aprobare nr. 153.452 din 28 mai 2004 al Direcției generale veterinare, președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin: Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin. Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin. Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I. Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor, Liviu Harbuz București, 10 iunie 2004. Nr. 15. *) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 15/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis. **) Anexa este reprodusă în facsimil. ANEXĂ NORMĂ VETERINARĂ ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total și uleiurile și grăsimile brute ANEXĂ la norma veterinară 3.3. Fiole uscate din metal necorosiv sau din sticlă cu capace ce asigură o închidere etanşă; suprafaţă de lucru ce permite ca proba test să fie difuzată la vreo 0,3g/cm2. 3.4. Etuva termoreglabila (±1°C), cu ventilatie şi care asigură reglarea rapidă a temperaturii C). 3.5. Etuva cu vacuum încălzita electric dotata cu o pompă de ulei sau un mecanism pentru introducerea de aer uscat fierbinte sau a unui agent de uscare (de ex. oxid de calciu). 3.6. Desicator cu placă confecţionată dintr-un metal perforat gol sau din porţelan ce conţine un agent de uscare eficient. 4. ProcedurăN.B.: Operaţiunile descrise de această secţiune trebuie să fie efectuate imediat după deschiderea pachetelor de probe. Analiza trebuie să fie efectuată în cel puţin un duplicat. 4.1. Preparare 4.1.1. Furaje, altele decât cele ce sunt sub incidenţa punctelor 4.1.2. şi 4.1.3. Se iau cel puţin 50 de grame din probă. Dacă este necesar, se macină şi se împarte în aşa fel, încât să de evite orice variaţie în conţinutul de umiditate(vezi 6). 4.1.2. Cereale şi ovăz Se iau cel puţin 50 de grame din probă. Se macină în particule din care cel puţin 50°/c, trec printr-o sită cu plasă de O,75mm şi nu se permite să fie retinute mai mult de 10% particule pe un ochi de plasă de 1mm2. 4.1.3. Furaje sub formă lichidă sau de pastă, furaje compuse predominant din uleiuri şi grăsimi. Se iau circa 25 de g din probă, se cântăresc cu o aproximaţie de 1O mg, se adaugă o cantitate corespunzătoare de nisip anhidros, cântărit cu o aproximaţie de 1O mg şi se amestecă până este obţinut un produs omogen.

(1)Pentru uscarea cerealelor, a făinii, a ovăzului şi a crupelor de ovăz, etuva trebuie să aibă o astfel de capacitate termică, încât atunci când este pre-fixat la 131°C acesta să revină la acea temperatură în mai puţin de 45 de minute după numărul maxim de probe test ce au fost plasate simultan în interior să se usuce. Ventilatia trebuie să fie astfel ca, atunci când sunt mai multe probe de grâu obişnuit decât le poate conţine şi sunt uscate timp de două ore, rezultatele diferă de cele obţinute după patru ore de uscare cu mai puţin de 0,715%. 4.2. Uscare 4.2.1. Furaje, altele decât cele ce sunt reglementate de 4.2.2. şi 4.2.3. Se cântăreşte o fiola (3.3) împreună cu capacul acestuia cu o aproximaţie de 0,5 mg. Se cântăresc în fiola cântărita cu o aproximaţie de 1 mg, aproximativ 5 g din probă şi chiar se difuzează. Se plasează containerul, fără capacul acestuia, în etuva preîncălzita la 103°C. Se introduce fiola cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura cuptorului să scadă nejustificat. Se lasă să se usuce timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura etuvei revine la 103°C. Se înlocuieşte capacul de pe fiola, se înlătură acesta din urmă de pe cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator(3.6) şi se cântăreşte cu o aproximaţie de 1 mg. Pentru furaje combinate compuse predominant din uleiuri şi grăsimi, se usucă în etuva timp de încă 30 de minute la 130°C. Diferenţa dintre două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,1% umiditate. 4.2.2. Cereale, făină, ovăz şi făină Se cântăreşte o fiola (3.3) împreună cu capacul acesteia, cu o aproximaţie de 0,75mg. Se cântăreşte în fiola cântărita cu o aproximaţie de 1mg, aproximativ 5g din proba măcinată şi chiar se difuzează. Se plasează fiola, fără capacul acesteia, în etuva preîncălzita la 130°C. Se introduce containerul cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura cuptorului să scadă nejustificat. Se lasă să se usuce timp de patru ore calculate din momentul în care temperatura cuptorului revine la 103°C. Se înlocuieşte capacul de pe container, se înlătură acesta din urmă de pe cuptor, se lasă se răcească timp de 30- 45 de minute în desicator(3.6) şi se cântăreşte cu o marjă de 1mg. 4.2.3. Furaje combinate ce conţin mai mult de 4% sucroză sau lactoză: furaje simple precum păstăi de fasole, produse cereale hidrolizate, seminţe de malţ, cartofi şi sfeclă uscată, peşte şi zahăr solubil; furaje combinate ce conţin mai mult de 25% săruri minerale, incluzând apă de cristalizare. Se cântăreşte o fiola (3.3) împreună cu capacul acestuia, cu o aproximaţie de 0,75mg. Se cântăresc în containerul cântărit cu o marjă de 1mg, aproximativ 5g din proba măcinată şi chiar se difuzează. Se plasează containerul, fără capacul acesteia, în etuva cu vacuum preîncălzit între 80-85°C. Se introduce fiola cât mai repede posibil, pentru a se preveni ca temperatura etuvei să scadă nejustificat. Se aduce presiunea până la 100 Torr şi se lasă să se usuce timp de patru ore la această temperatură, fie într-un curent de aer fierbinte, uscat fie utilizându-se un agent de uscare (aproximativ 300 g pentru 20 de probe). În ultimă instanţă, se deconectează pompa de vacuum, atunci când a fost atinsă presiunea prescrisă. Timpul de uscare se calculează din momentul când temperatura cuptorului revine la 80-85°C. Se aduce etuva cu grijă înapoi la presiunea atmosferică. Se deschide etuva, se plasează imediat capacul pe fiola, se îndepărtează fiola din etuva, se lasă să se răcească timp de 30-45 în desicator(3.6) şi se cântăreşte cu o aproximaţie de 1 mg. Se usucă timp de încă 30 de minute în etuva cu vacuum la 80-85°C şi se recântăreşte. Diferenţa dintre două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,71°/o umiditate. 4.3. Uscare preliminară 4.3.1. Furaje, altele decât cele ce sunt reglementate de 4.3.2. Furaje solide cu un conţinut ridicat de umiditate ce face ca măcinarea să fie supusă uscării preliminare după cum urmează: Se cântăresc 50g de probă nemăcinată cu o aproximaţie de 10mg (furajele comprimate şi aglomerate pot fi împărţite după duritate , dacă este necesar) într-un container potrivit (de ex. o placă de aluminiu de 20x12 cm cu o ramă de 0,75cm). Se lasă să se usuce într-o etuva de la 60-70°C până când conţinutul de umiditate s-a redus la 8-12%. Se îndepărtează din etuva, se lasă descoperit ca să se răcească în laborator pentru o oră şi se cântăreşte cu o aproximaţie de 1O mg. Se zdrobeşte imediat, aşa cum s-a indicat la punctul 4.1.1. şi se usucă aşa cum s-a indicat la punctul 4.2.1. sau 4.2.3., în conformitate cu natura furajului. , 4.3.2. Cereale Boabele cu un conţinut de umiditate·de peste 17%, trebuie să fie supuse unei uscări preliminarii după cum urmează: Se cântăresc 50g de boabe neîncolţite, cu o aproximaţie de 10mg într-un container corespunzător (de ex. o placă de aluminiu de 20x12 cm cu o ramă de 0,5cm). Se lasă să se usuce timp de 5-7 minute într-o etuva, la 130°C. Se scoate din etuva, se lasă să se răcească descoperit în laborator, timp de două ore şi se cântăresc cu o aproximaţie de 1O mg. Se macină aşa cum s-a indicat la 4.1.2. şi se usucă, aşa cum s-a indicat la punctul 4.2.2. 5. Calcularea rezultatelorConţinutul de umiditate, ca procent din probă, este calculat utilizând următoarea formulă: 5.1. Uscare fără uscare preliminară (E-m)x ioo E unde: E=masă iniţială a probei test, în grame, m=masa probei test uscate, în grame, 5.2. Uscare cu uscare preliminară [(M'-m)M+ E-M]xlOO= 100(1- Mm) M' E EM' unde: E=masă iniţială a probei test, în grame, M= masa a probei test după uscare preliminară, în grame, M'= masa probei test după zdrobire, în grame, m=masa probei test uscate, în grame. 5.3. Repetabilitate Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească 0,2°/c, de umiditate. 6. Observatie Dacă măcin' area se dovedeşte a fi necesară şi dacă l aceasta este estimată că alterează continutul în umiditate al produsului, rezultatele analizei componenţilor furajului trebuie să fie corectate pe baza conţinutului probei în starea iniţială a acesteia. li. DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE A. MICRODIFUZIE1. Scop şi domeniu de aplicareAceastă metodă face posibil să se determine conţinutul de baze azotate în furaje, exprimate ca amoniac. 2. PrincipiuProba este extrasă cu apă şi soluţie clarificată şi filtrată. Bazele azotate volatile sunt dislocate prin micro-difuzie, utilizându-se o soluţie de carbonat de potasiu, colectată într-o soluţie de acid boric şi titrată cu acid sulfuric. 3. Reactivi3.1. 20% (w/

v)soluţie de tricloracetic. 3.2. Indicator: se dizolvă 33 de mg de verde bromcrezol şi 65 de mg de roşu metil în 100ml de etanol 95-96%(v/v). ' 3.3. Solutie de acid boric: ' Într-un cilindru gradat de 1litru se dizolvă 1O g de acid boric A.R. în 200ml de etanol 95-96%(v/
v)şi 700ml de apă. Se adaugă 1O ml de indicator(3.2.). Se amestecă şi dacă e necesar, se ajustează culoarea soluţiei spre roşu deschis, adăugând o soluţie de hidroxid de sodiu. 1 ml din această soluţie va fixa un maxim de 300 Dg de NH3. 3.4. Soluţie saturată de carbonat de potasiu: Se dizolvă 1OOg de carbonat de potasiu A.R. în 100 ml de apă fiartă. Se lasă să se răcească, se filtrează. 3.5. Acid sulfuric 0,02 N. 4. Aparatură4.1. Mixer (tip pahar): aproximativ 35-40 r.p.m. 4.2. Celule Conway de plastic sau de sticlă (vezi diagrama). 4.3. Microbiurete gradate în 1/100ml. 5. ProcedurăSe cântăresc 1Og de probă, cu o aproximaţie de 1mg şi se plasează cu 100ml de apă într-un pahar gradat de 200 ml. Se amestecă în pahar timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluţie de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu vigoare şi se filtrează printr-un filtru plisat. Utilizând o pipetă, se introduce 1 ml de soluţie de acid boric(3.3) în partea centrală a celulei Conway şi 1 ml din filtratul probei în coroana celulei. Se acoperă parţial cu un capac lubrifiat. Se lasă să cadă rapid 1 ml de soluţie de carbonat de potasiu saturat (3.4) în coroană şi se închide capacul, astfel încât celula să nu primească aer. Se întoarce celula cu grijă, rotind-o în plan orizontal, astfel încât cei doi reactivi să fie amestecati. Se la' să incubat fie cel puţin patru ore la temperatura camerei fie pentru o oră la 40°C. Utilizând o microbiuretă(4.3), se titrează bazele volatile în soluţie de acid boric cu acid sulfuric 0,02N(3.5). Se efectuează un test steril, utilizând aceeaşi procedură, dar fără ca proba să fie analizată. 6. Calcularea rezultatelor1ml de H2SO4 0,02N corespunde la 0,34 mg de amoniac. Se exprimă rezultatul ca procentaj al probei. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească: - 10% în valoare relativă, pentru conţinut de amoniac mai puţin de 1,0%; - O,1% în valoare absolută, pentru conţinut de amoniac de 1,0% sau mai mult. 7. ObservatieSe diluează' filtratul initial, dacă continutul de amoniac al probei depăşeşte 0,76%. ' ' B. PRIN DISTILARE1. Scopul şi domeniul de aplicareAceastă metodă face posibilă determinarea conţinutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, în faina de peşte ce nu conţine practic uree. Aceasta este aplicabilă numai pentru un conţinut de mai puţin de 0,25%. 2. PrincipiuProba este extrasă cu apă şi soluţie de clarificare. Bazele azotate volatile sunt dislocate la punctul de fierbere, adăugându-se oxid de magneziu şi colectate într-o cantitate specifică de acid sulfuric, al cărui exces este titrat apoi cu o solutie de hidroxid de sodiu. ' 3. Reactivi 3.1. 20% (w/
v)soluţie de acid tricloracetic. 3.2. Oxid de magneziu 3.3. Emulsie anti-spumă (de ex. silicon). 3.4 Acid sulfuric O,1N. l 3.5. Solutie de hidroxid de sodiu O,1 N. 3.6. 0,3%, (m/
v)soluţie de metil roşu în etanol 95-96%(v/v). 4. Aparatură4.1. Mixer (tip pahar): aproximativ 35-40 r.p.m. 4.2. Aparat de distilare de tip Kjeldahl. 5. ProcedurăSe cântăresc 10g de probă cu o aproximaţie de 1mg şi se plasează cu 100ml de apă într-un balon cotat de 200ml. Se omogenizeaza timp de 30 de minute. Se adaugă 50ml de soluţie de acid tricloracetic(3.1), se completează volumul cu apă, se agită energic şi se filtrează printr-un filtru cutat. Se ia o cantitate de filtrat clar corespunzător pentru A I conţinutul estimat de baze azotate volatile(100ml sunt de obicei potrivite). Se diluează până la 200ml şi se adaugă 2g de oxid de magneziu (3.2.) şi câteva picături de emulsie anti spumă(3.3). Soluţia trebuie să fie alcalină faţă de hârtia de turnesol, altfel se adaugă puţin oxid de magneziu (3.2.). Se distila aproximativ 150 ml de soluţie în aparatul Kjeldahl şi se colectează distilatul într-un pahar Erlenmeyer ce conţine un volum măsurat cu acuratete (25-50ml) de acid sulfuric O,1 N(3.4). ln timp ce se distila, se evită supraîncălzirea pe părţile laterale. Se fierbe soluţia de acid sulfuric timp de 2 minute, se răceşte şi se titrează apoi excesul de acid sulfuric cu soluţie de hidroxid de sodiu O,1N(3,5) în prezenţa indicatorului de roşu metil (3.6). Se efectuează o proba martor utilizand aceeaşi procedură. 6. Calcularea rezultatelor-1ml de H2SO4 O,1N corespunde la 1,7 mg de amoniac. Se exprimă rezultatul ca procent din probă. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeaşi probă, nu trebuie să depăşească, în valoare relativă, 10°/o amoniac. III. DETERMINAREA FOSFORULUI TOTAL METODA FOTOMETRICĂ 1. Scop şi domeniu de aplicareAceastă metodă face posibilă determinarea conţinutului de fosfor total din furaje. Este corespunzătoare, în mod particular, pentru analiza produselor cu nivel scăzut de fosfor. În unele cazuri poate fi utilizată o metodă gravimetrică, (produs bogat în fosfor). 2. PrincipiuProba este mineralizată, fie prin combustie uscată(în cazul furajelor organice) sau prin digestie acidă (în cazul compuşilor minerali şi a furajelor lichide) şi plasată într-o soluţie de acid. Soluţia este tratată cu reagent molibdovanadiu. Densitatea optică a soluţiei galbene astfel formate este măsurată într-un spectrometru la o lungime de undă de 430nm. 3. Reactivi3.1. Carbonat de calciu p.a 3.2. Acid clorhidric p.a d:1,1 (aproximativ 6N). 3.3. Acid azotic p.a, d: 1,045. 3.4. Acid azotic p.a., d: 1,38-1,42. 3.5. Acid sulfuric p.a., d: 1,84. 3.6. Reactiv molibdovanadat: Se amestecă 200ml de soluţie de heptamolibdat de amoniu(3.6.1. ), 200ml de soluţie de monovanadat de amoniu(3.6.2) şi 134ml de acid azotic, într-un balon cotat de un litru. Se completează volumul cu apă distilata. 3.6.1. Soluţie de heptamolibdat de amoniu: Se dizolvă în apă distilata fierbinte 100g de heptamolibdat de amoniu p.a. (NH4)6Mo7O24_ 4H2O. Se adaugă 10ml de amoniac(d:0,91) şi se completează cu apă distilata până la un litru. 3.6.2. Solutie de monovanadat de amoniu: ' 2,735g de monovanadat de amoniu p.a. NH4VO3 se dizolvă în 400ml de apă distilata fierbinte·. Agitând constant, se adaugă lent 20ml de acid azotic p.a diluat (7ml de HNO3(3.4) + 13ml de H2O) şi se completează cu apă distilata până la un litru. 3.7. Soluţie standard de 1mg de fosfor per ml: se dizolvă 4,387g de fosfat dihidrogenat de potasiu p.a. KH2PO4 în apă. Se completează cu apă până la un litru. 4. Aparatură4.1. Creuzete pentru cenuşă din porţelan sau siliciu. 4.2. Cuptor electric cu termostat stabilit la 550°C. 4.3. Balon Kjeldahl de 250ml. 4.4. Baloane gradate şi pipete de precizie. 4.5. Spectrofotometru. 4.6. Eprubete gradate:25-30ml. 5. Procedură- 5.1. Prepararea solutiei ln conformitate cu na'tura probei se prepară o soluţie aşa cum a indicat punctul 5.1.1 sau 5.1.2. 5.1.1. Procedura uzuală Se cântăreşte 1g sau mai mult din probă cu o aproximaţie de 1mg. Se plasează proba test într-un balon Kjeldahl, se adaugă 20ml de acid sulfuric (3.5), se agită pentru a impregna substanţa complet cu acid şi pentru a se preveni ca aceasta să nu se lipească de pereţii balonului, se încălzeşte şi se păstrează la punctul de fierbere timp de 1O minute. Se lasă să se răcească puţin, se adaugă puţin acid azotic (3.4) şi se aduce apoi la punctul de fierbere. Se repetă această procedură până când este obţinută o soluţie incoloră. Se răceşte, se adaugă puţină apă, se decantează lichidul într-un balon cotat de 500 de ml, clătind cu apă fierbinte balonul Kjeldahl. Se lasă să se răcească, se completează volumul cu apă, se omogenizează şi se filtrează. 5.1.2. Probe ce conţin substanţe organice şi libere de calciu şi fosfaţi de magneziu Se cântăresc aproximativ 2,5 g din probă, cu o aproximaţie de 1mg într-un creuzet de calcinare. Se amestecă proba test până când se omogenizeaza complet cu 1g de carbonat de calciu(3.1). Se calcinează în cuptor la 550°C+5°C până când este obţinută o cenuşă albă sau gri (nu contează puţin mangal). Se transferă cenuşa într-o capsula de portelan de 250ml. Se adaugă 20ml de apă şi acid clorhidric(3.2) până încetează efervescenţa. Se adaugă încă 10ml de acid clorhidric (3.2). Se plasează capsula de portelan pe o baie de nisip şi se evaporă până se usucă pentru a face silicatul insolubil. Se redizolvă reziduul în 10ml de acid azotic(3.3) şi se fierbe pe baia de nisip timp de 5 minute, fără să se evaporeze, până se usucă. Se decantează lichidul într-un balon cotat de 500ml, clătind capsula de portelan de câteva ori cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează volumul cu apă, se omogenizează şi se filtrează. 5.2. Dezvoltarea coloraţiei şi măsurarea densităţii optice Se diluează o parte a picăturii filtrate obţinută la 5.1.1. sau 5.1.2., pentru a obţine o concentraţie în fosfor de cel mult 40µg/ml. Se plasează 10ml din această soluţie într-o eprubetă(4.6) şi se adaugă 10ml de reactiv molibdovanadat(3.6). Se omogenizează şi se lasă să stea cel puţin 1O minute, la 20°C. Se măsoară densitatea optică într-un spectrometru la lungimea de undă de 430nm fata de o soluţie obţinuta prin adăugare de 10ml de reactiv molibdovanadat (3.6) în 10ml de apă. 5.3. Curba de calibrare Din soluţia standard(3.7.) se prepară soluţii ce conţin respectiv 5,10,20,30 şi 40 µg de fosfor per ml. Se iau 10ml din fiecare din aceste soluţii şi se adaugă 10ml de reactiv molibdovanadat (3.6). Se omogenizează şi se lasă să stea cel puţin 1O minute la 20°c. Se măsoară densitatea optică , aşa cum a indicat punctul 5.2. Se trasează curba de calibrare prin împărţirea densităţilor optice faţă de cantităţile corespunzătoare de fosfor. Curba va fi liniară pentru concentraţii între O şi 40 µg/ml. 6. Calcularea rezultatelorSe determină cantitatea de fosfor din proba test pnn utilizarea curbei de calibrare. Se exprimă rezultatul ca procent din probă. Repetabilitate Diferenţa între rezultatele a două determinări paralele efectuate pe aceeaşi probă nu trebuie să depăşească: 3% în valoare relativă, pentru conţinut de fosfor de mai puţin de 5%; O,15% în valoare absolută, pentru conţinut de fosfor de 5% sau mai mult. IV. DETERMINARE DE ULEIURI ŞI GRĂSIMI BRUTE1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă este utilizată pentru determinarea uleiurilor şi grăsimilor brute din furaje. Aceasta nu se referă la analiza seminţelor uleioase şi a fructelor oleaginoase definite de legislaţia comunitară specifică. Utilizarea celor două proceduri descrise mai jos depinde de natura şi compoziţia furajului şi motivul pentru efectuarea analizei. 1.1. Procedura A - Uleiuri şi grăsimi brute direct extractibile Această metodă este aplicabilă materiilor furajere din plante, cu excepţia celor incluse în scopul Procedurii B. 1.2. Procedura B - Uleiuri şi grăsimi brute totale Această procedură este aplicabilă materiilor furajere de origine animală şi tuturor furajelor combinate. Aceasta trebuie să fie utilizată pentru toate materiile din care grăsimile şi uleiurile nu pot fi extrase complet fără o hidroliză anterioară (ex. gluten, drojdie, proteine din cartofi şi produse supuse proceselor precum extrudarea, floconarea şi încălzirea). 1.3. Interpretarea rezultatelor În toate cazurile în care este obtinut un rezultat mai ridicat prin utilizarea Procedurii B, decât pr'in Procedura A, rezultatul obţinut prin Procedura B va fi acceptat ca valoare adevărată. 2. Principiu2.1 Procedura A Proba este extrasă cu eter etilic. Solventul este distilat, iar reziduul este uscat şi cântărit. 2.2 Procedura B Proba este tratată la cald cu acid clorhidric. Amestecul este răcit şi filtrat. Reziduul este spălat, uscat şi supus determinării, în conformitate cu Procedura A. 3. Reactivi3.1. Eter etilic, punct de fierbere: 40-60°C. Valoarea de bromin trebuie să fie mai puţin de 1, iar reziduul din evaporare mai puţin de 2mg/100ml. 3.2. Sulfat de sodiu, anhidru 3.3. Acid clorhidric, c=3moli HCI/I 3.4. Cu ajutorul filtrării, Kieselguhr, supercelula Hyflo. 4. Aparatură4.1. Aparatură de extracţie. Dacă a fost dotată cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului trebuie să fie astfel încât să producă aproximativ 10cicluri/oră; dacă este utilizat tipul non sifon, rata refluxului trebuie să fie de aproximativ 10ml per minut. 4.2. Canule de extractie, libere de materie solubilă în eter etilic şi care să aibă o po' rozitate în conformitate cu cerinţele punctului 4.1. 4.3. Etuva de uscare, fie o etuva cu vacuum fixat la 75°C+3°C fie o etuva cu aer fixat la 1oo°C+3°C. 5. Procedură5.1. Procedura A(vezi punctul 8.1) Se cântăresc 5g din probă, cu o aproximaţie de 1mg, acestea se transferă într-un cartuş de extracţie(4.2) şi se acoperă cu un tampon de vată degresat. Se plasează un cartuş într-un extractor(4.1) şi se extrage timp de şase ore cu eter etilic(3.1). Se colectează extractul din eter etilic într-o retortă uscată, cântărită ce conţine fragmente de piatră ponce

(1). Se distila solventul. Se usucă reziduul, menţinând retorta timp de o oră şi jumătate în etuva de uscare(4.3). Se lasă să se răcească într-un desicator şi se cântăreşte. Se usucă din nou timp de 30 de minute pentru a se asigura că greutatea uleiurilor şi grăsimilor rămâne constantă (pierderea în greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie de mai puţin de 1 mg). 5.2. Procedura B AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR O R D I N pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc*) În temeiul prevederilor art. 10 lit.

b)din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia, văzând Referatul de aprobare nr. 153.355 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare, președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin: Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin. Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin. Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I. Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor, Liviu Harbuz București, 10 iunie 2004. Nr. 16. *) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 16/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis. **) Anexa este reprodusă în facsimil. ANEXĂ NORMĂ VETERINARĂ ce stabilește metode naționale de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu referire la conținutul în zinc-bacitracină, flavofosfolipol, fier, cupru, mangan și zinc ANEXĂ la norma veterinară suspensia la diluţia 1/1O cu soluţie de clorură de sodiu (4.3). Transmisia luminoasă a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 75%, măsurată la o lungime de undă de 650 nm într-un cm de celulă faţă de soluţia de clorură de sodiu (4.3). Această suspensie poate fi menţinută pentru o săptămână la cca. 4 QC 4. Mediu de cultură şi reactanţi 4.1. mediu de cultură (
b)Carne peptonată 6,0 g Triptone 4,0 g Extract de drojdie Extract de carne Glucoză Agar Apă 3,0 g 1,5 g 1,0 g 10,0 la 20,0 g 1 OOO ml ph 6,5 la 6,6 (după sterilizare) 4.2. Mediu de probă (
b)Triptone 10,0 g Extract de drojdie 3,0 g Extract de carne Glucoză Agar Tween 80 Apă 1,5 g 1,0 g 10,0 la 20,0 g 1 ml 1 OOO ml pH 6,5 (după sterilizare) 4.3. Soluţie de clorură de sodiu 0,8% (w/v): se dizolvă 8 g clorură de sodiu în apă şi se diluează până la 1OOO ml; se steriIizează. 4.4. Amestec de metanol/apă şI acid clorhidric (4.6): 80/17,5/2,5 (v/v/
v)4.5. Tampon fosfatc, pH 6,5: Fosfat hidrogenat de potasiu K2HPO4 22,15 g Fosfat dihidrogenat de potasiu KH2PO4 27,85 g. Apă până la 1 OOO ml 4.6. Acid clorhidric (d: 1,18 la 1,19). 4.7 Acid clorhidric (O,1 M). 4.8. Hidroxid de sodiu solutie 1 M. ' 4.9. Sulfit de sodiu solutie cca. 0,5 M ' 4.1O. Soluţie roşu de bromcrezol 0,04 % (w/v): se dizolvă O,1 g de roşu de bromcrezol în 18,5 ml din soluţia de hidroxid de sodiu 0,01 M. Se aduce volumul la 250 ml cu apă şi se amestecă. 4.11. Substantă standard: zinc-bacitracină de activitate cunoscută (în u. i.). ' 5. Solutii standard ' Se cântăreşte o cantitate de zinc-bacitracină standard (4.11) ce corespunde la 1050 u.i (conform activităţii indicate). Se adaugă 5 ml de acid clorhidric 0,1 M (4.7) şi se lasă 15 minute. Se adaugă 30 ml de apă, se ajustează pH-ul la 4,5 cu tampon fosfat (4.5) (cca. 4 ml}, se aduce la un volum de 50 ml cu apă şi se amestecă bine (1 ml = 21 u.i.). Din această soluţie se prepară, prin diluţie succesivă cu tampon fosfat (4.5), următoarele soluţii: sa O, 42 u.i./ml S4 0,221 u.i./ml s2 O,105 u.i./ml s1 0,0525 u.i./ml 6. Prepararea soluţiilor de extract şi de probă 6.1 Extract,ie 6.1.1 Premixuri şi furaje minerale Se cântăreşte o cantitate de probă de 2,0 până la 5,0 g, se adaugă 29,0 ml de amestec (4.4) şi 1,0 ml de soluţie de sulfit de sodiu (4.9) şi se agită uşor. Se verifică dacă pH-ul este cca. 2. Se agită 1O minute şi se centrifughează. Se prelevează o picătură corespunzătoare din soluţia de supernatant şi se ajustează pH-ul la 6,5 prin intermediul unei soluţii de hidroxid 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluţie roşu de bromcrezol (4.1O) ca indicator. Se diluează cu tampon fosfat (4.5) se obţine un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u.i./ml (=u8) 6.1.2. Concentrate proteice Se cântăreşte o cantitate de probă de 10,0 g, se adaugă 49, O ml de amestec (4.4) şi 1,0 ml de soluţie de sulfit de sodiu (4.9) şi se agită uşor. Se verifică dacă pH-ul este aproximativ 2. Se agită 1O minute. Se adaugă 50 ml de tampon fosfat (4.5), se agită timp de 15 minute şi se centrifughează. Se prelevează un volum corespunzător de soluţie de supernatant şi se ajustează pH-ul la 6,5 prin intermediul soluţiei de hidroxid de sodiu - 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluţie roşu de bromcrezol (4.1O) ca indicator. Se evaporă până la aproximativ jumătate de volum într-un evaporator rotund la o temperatură ce nu depăşeşte 35QC. Se diluează cu tampon fosfat (4.5) până se obţine un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u.i./ml (= u8). 6.1.3. Alte furaje Se cântăreşte o cantitate de probă de 10,0 g (20,0 g pentru un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 5 mg/kg). Se adaugă un amestec de 24,0 ml de amestec (4.4) şi 1,0 ml de soluţie de sulfit de sodiu (4.9) şi se omogenizează timp de 1O minute. Se adaugă 25 ml tampon fosfat (4,5), se agită timp de 15 minute şi se centrifughează. Se iau 20 ml de soluţie de supernatant şi se ajustează pH-ul până la 6.5 prin intermediul soluţiei de hidroxid de sodiu - 1 M (4.8) cu un pH-metru sau cu soluţie roşu de bromcrezol (4.1O) ca indicator. Se evaporă până la 4 ml într-un evaporator rotund, la o temperatură ce nu depăşeşte 35 °C. Se diluează reziduul cu tampon fosfat (4.5) până se obţine un conţinut dorit de zinc-bacitracină de 0,42 u i../ml (= u8). 6.2. Soluţii probă Din soluţia u8 se prepară soluţii u4 (conţinut aşteptat: 0,21u i./ml), u2 (conţinut aşteptat: O,105 u.i./
ml)şi u1 (conţinut aşteptat: 0,0525 u.i./
ml)prin intermediul diluţiei succesive (1-1) cu tampon fosfat (4.5). 7. Procedura de testare7.1. Însământarea mediului de testare ' Se însămânţează mediul de testare (4.2) cu o suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ 50 °e. Prin experimentări preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2) se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a determina cele mai mari şi mai curate zone de inhibiţie cu diferite concentratii de zinc-bacitracină. ' 7.2. Prepararea plăcilor de însămânţare Difuziunea pe agar este efectuată în plăci utilizându-se patru concentraţii din soluţia standard (s8,s4,s2,Şi s1) şi patru concentraţii din soluţia de testare (u8, u4 ,u2 şi u1). Aceste patru concentraţii de extract şi standard trebuie, în mod necesar, să fie plasate în fiecare placă. Pentru acest scop, se aleg plăci destul de mari pentru a se permite să fie făcute cel puţin opt godeuri cu un diametru de 1O la 13 mm şi la nu mai puţin de 30 mm de centru în mediul agar. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau într-o placă de sticlă cu o faţă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în diametru şi 20 mm înăltime. ' Se toarnă în plăci o cantitate din mediul însămânţat (4.2) ca la punctul 7.1. , pentru a se obţine un strat gros de aproximativ 2 mm (60 ml pentru o placă de 200 mm diametru), se lasă să se solidifice, se formează godeuri şi se pun în acestea volume de probă măsurate cu exactitate şi soluţii standard (între O,1O şi O,15 ml per goden, conform diametrului). Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone de inhibitie. ' ' 7.3. lncubatie Se incubează plăcile timp de 16 până la 18 ore la 30 ± 2 °e 8. Evaluare Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie de O,1 mm. Se înregistrează valorile medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semilogaritmică ce indică logaritmul concentraţiilor în relaţie cu diametrele zonelor de inhibitie. ' Se trasează liniile cele mai potrivite, atât pentru soluţia standard cât şi pentru extract ca în exemplu de mai jos: Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) utilizând formula: (
a)SL = 7s1 + 4s2 +S4 - 2sa 10 Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru nivelul standard cel mai ridicat (SH) utilizând formula: (
a)SH = 7sa + 4S4 +s2 - 2s1 10 Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite " pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH), prin substituirea u1, u2, U4 şi ua cu s1, s2, s4şi s8 din formula menţionată mai sus. Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluţia standard. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract. În absenta oricărei interferente liniile trebuie să fie paralele. Pentr'u scopuri practice, 'liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora. Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 şi s1 fie u8 şi s8 pot fi înlăturate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite": 5S1 + 2S2 - S4 5s2 + 2s4- s8 (a') SL = sau -----sau---- 6 6 (
b)SH= 5S4 +2S2-S1 sau5S8 +2S4 -sS2 6 6 şi în mod similar pentru UL şi UH. Trebuie să fie întrunite aceleaşi criterii de paralelism. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele trebuie să fie notat în raportul final (buletinul de analiză). Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul (log
a)activităţii relative (A) prin intermediul uneia din următoarele formule, ce depinzând de faptul dacă au fost utilizate trei sau patru nivele pentru evaluarea paralelismului. Pentru patru nivele (
c)log A= (ul +u2 +u4 +ug -s1 -s2 -S4 -s8 )x0,602 u4+u8 +s4+s8 -u1-u2-s1-s2 Pentru trei nivele (
d)log A= (u1 +u2+u4-s1-s2-sJx0,401 U4 +s4 -u1 -s1 sau (d'} log A= (u2+u4+u8 -s1-s4-s8)x0,401 u8+s8-u2-s2 Activitatea extractului de probă = activitatea standardului relevant x A (u8 = sa x A) Dacă activitatea relativă este în afara zonei de variatie de la 0,5 la 2,0, atunci se repetă proba făcând aju' stări corespunzătoare ale concentraţiilor extractului sau, dacă aceasta nu este posibil, ale soluţiilor standard. Atunci când activitatea relativă nu poate fi adusă în gama de valori solicitată, orice rezultat obţinut trebuie să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie notat în raportul final (buletinul de analiză). Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă realizat, înseamnă că nu a fost obtinută o determinare satisfăcătoare. ' Se exprimă rezultatul în miligrame de zinc-bacitracină per kilogram de furaj. Pentru patru nivele Diferenta între rezultatele celor două determinări efectuate pe aceeaşi' probă prin aceeaşi analiză nu trebuie să depăşească: 2 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de zinc-bacitracină până la 1O mg/kg, 20% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru niveluri de la 10 la 25 mg/kg, 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru niveluri de la 25 la 50 mg/kg, 10% din valoarea cea mai mare pentru niveluri mai mari de 50 mg/kg

(1)1 mg grade de zinc-bacitracină în furaj este echivalent cu 42 unităţi internaţionale (u.i.). (

a)Pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să se fi stabilit că acestea utilizează suspensii bacteriene similare. (
b)Poate fi utilizat orice mediu de cultură comercială de compoziţie similară şi care dă aceleaşi rezultate. 2. Determinarea de flavofosfolipol prin difuziune in mediu de agar 1. Domeniu şi scop Metoda este utilizată pentru determinarea flavofosfolipolului din furaje, concentrate şi premixuri. Limita inferioară de determinare este 1 mg/kg (1 ppm). 2. Principiu Proba este extrasă cu metanol diluat prin încălzire sub reflux. După centrifugare, extractul este purificat (unde este necesar) prin tratarea cu răşini schimbătoare şi prin schimb de ioni şi diluat. Activitatea antibiotică a acestuia este determinată prin măsurarea difuziei de flavofosfolipol într-un mediu de agar însămânţat cu Staphyilococcus aureus. Difuzia este indicată prin formarea de zone de inhibiţie a creşterii microorganismului. Diametrul acestor zone este considerat a fi direct proporţional cu logaritmul concentraţiei de antibiotic peste gama de concentratii de antibiotic utilizate. ' 3. Micro-organism: Staphylococcus aureus ATCC 6538 p 3.1. Mentinerea culturii stoc' Se însămânţează mediul de cultură (4.1) în tuburi înclinate cu Staphylococcus aureus , se incubează timp de 24 de ore la 37 °e, se depozitează într-un frigider la aproximativ 4 °e şi se reînsământează în fiecare lună în tuburi înclinate. ' 3.2 Prepararea suspensiei bacteriene (pot fi utilizate alte metode, cu condiţia să se fi stabilit că acestea dau suspensii bacteriene similare) Se pun deoparte două tuburi ce conţin cultura stoc (3.1) şi se însămânţează săptămânal. Se incubează timp de 24 de ore la 37 °e şi se depozitează întru-un frigider la aproximativ 4 QC. Cu 24 de ore înainte de testare, se însămânţează cu această cultură două până la patru tuburi înclinate ce conţin mediul de cultură (4.1). Se incubează timp de 16 până la 18 ore la 37 °C. Se efectuează o suspensie de cultură în soluţie de clorură de sodiu (4.3). Transmisia luminoasă a suspensiei trebuie să fie de aproximativ 40%, măsurată la la lungimea de undă de 578 nm, într-o celulă de 1 cm în comparaţie cu soluţia de clorură de sodiu. (4.3) 4. Mediu de cultură şi reactivi 4.1 Mediu de cultură (poate fi utilizat orice mediu de cultură comercial, de compoziţie similară şi care dă aceleaşi rezultate, de ex. mediu antibiotic oxoid 1 (cm 327) cu un adaos de agar oxoid n 3 (L 13)).Carne peptonată 6,0 g Triptone 4,0 g Extract de drojdie 3,0 g Extract de carne 1,5 g Glucoză 1,0 g Agar 15.0 g Apă 1 OOO ml ph 6,5 (după sterilizare) 4.2 Mediu de probă 4.2.1. Strat de bază (poate fi utilizat orice mediu de cultură comercial, de compoziţie similară şi care dă aceleaşi rezultate, de ex. mediu antibiotic oxoid 2 (cm 335) cu un adaos de agar oxoid n 3 (L 13)). Carne peptonată 6,0 g Extract de drojdie 3,0 g Extract de carne 1,5 g Agar 10.0 g Apă 1 OOO ml ph 6,5 (după sterilizare) I 4.2.2. Strat de însământare Ca pentru punctul 4.1, cu adăugarea a 2.0 g de emulsie siliconată anti-spumantă (de ex. SE 2 din Wacker Chemie Gmnh, Munchen). 4.3. Soluţie de clorură de sodiu 0.4% (w/v): se dizolvă 4 g de clorură de sodiu a. p. în apă şi se diluează până la 1OOO ml apă sterilă. 4.4 Metanol pur 4.5 Metanol 50 % (v/v): se diluează 500 ml de metanol (4.4) cu 500 ml de apă. 4.6. Metanol 80% (v/v): se diluează 800 ml de metanol (4.4) cu 200 ml de apă. 4.7. Tris (hidroximetil) aminometan a.p. 4.8. Soluţie metanolică de clorură de potasiu 1.5 % (w / v): se dizolvă 1.5 g de clorură de potasiu a.p. în 20 ml de apă, se aduce volumul la 100 ml cu metanol (4.4) 4.9. Schimbător de cationi: sub formă de Dowex 50W x 8, 20 la 50 mesh, sodiu (cat. Serva Nr 41 600) sau echivalent. 4.1O Schimbător de anioni: sub formă de Dowex 1 la 2, 50 la 100 mesh, ci (cat. Serva n 4101O) sau echivalent. Înainte de utilizare, se ţine timp de 12 la 14 ore în metanol 80% (4.6.) 4.11 Vată de sticlă 4.12 Hârtie indicatoare de Ph (ph 6.6 până la 8.1). 4.13. Acid ascorbic 4.14. Substanţă standard: flavofosfolipol de activitate cunoscută 5. Aparatură 5.1 Tub de sticlă pentru cromatografie, diametru intern: 9 mm, lungime: 150 la 200 mm, dotat cu un dop la partea îngustă a capătului inferior şi o legătură de sticlă-cauciuc (porţelan) pentru a se conecta cu pâlnia de scurgere (5.2). la capătul superior 5.2 Pâlnie de scurgere de 250ml, dotată cu un dop şi cu o legătură sticlă - cauciuc (sau porţelan) 5.3. balon conic de 250 ml cu legătură sticlă - cauciuc (sau porţelan) 5.4. Condensator de reflux cu legătură sticlă - cauciuc (sau porţelan) 6. Solutii standard ' Se dizolvă o cantitate cântărită corect din substanta standard (4.14) în metanol 50°/c, (4.5) şi se diluează pentru a s'e obţine o soluţie stoc ce conţine 100 ug flavofosfolipol per mililitru. Se depozitează în baloane cu buşon la 4 QC unde această soluţie este stabilă pentru mai mult de două luni. Din această soluţie stoc se prepară, prin diluţie succesivă cu metanol 50% (4.5), următoarele soluţii: Sa 0.2 ug/ml S4 0.1 ug/ml S2 0.05 ug/ml S1 0.025 ug/ml 7. Prepararea extractului 7.1. Extractie ' 7.1.1. Concentrate, premixuri şi furaje minerale Se cântăreşte o cantitate de probă de 2.O la 5.O g şi se adaugă aproximativ 150 mg de acid ascorbic (4.13). Se omogenizează cu 150 ml de metanol 50% (4.5) într-un balon conic (5.3) şi se ajustează ph-ul la 8.1 până la 8.2, cu aproximativ 400 mg de tris (hidroximetil) aminometan (4.7). Se verifică ph-ul cu hârtie indicatoare (4.12). Se lasă să stea 15 minute, apoi se reajustează ph-ul de la 8.1 la 8.2 cu tris (hidroximetil) aminometan (4.7) şi se fierbe timp de 1O minute sub reflux (5.4) cu amestecare constantă. Se lasă să se răcească, se centrifughează amestecul şi se decantează extractul. 7.1.2. Alte furaje 7.2. Purificarea (acest pas poate fi omis pentru concentrate, premixuri şi furaje minerale) Se amestecă 11O ml de extract cu 11 g de schimbător de cation (4.9), se fierbe timp de un minut sub reflux (5.4) cu amestecare constantă. Se separă schimbătorul de cation prin centrifugare sau filtrare. Se amestecă 100 ml de extract cu 150 ml de metanol (4.4) şi se depozitează soluţia timp de 12 până la 15 ore la 4 °C. Se filtrează şi se îndepărtează masa de flacoane în timpul răcirii. Se inserează un dop de vată de sticlă (4.11) la capătul unui tub de sticlă (5.1), se toarnă în tub 5ml de schimbător de anioni (4.1O) şi se spală coloana cu 100 ml de metanol 80 % (4.6). Utilizând pâlnia (5.2), se transferă în coloană un volum filtrat de cel puţin 100 ml ce este de aşteptat să conţină 16 ug de flavofosfolipol (200 ml pentru o probă de 30 g de furaj la 1 ppm). Atunci când se consideră necesar, înainte de utilizarea coloanei, se diluează filtratul cu metanol 80 % (4.6) pentru a se obţine un conţinut dorit de flavofosfolipol de 16 ug/100ml. Se ajustează rata de curgere la aproximativ 2 ml / minut. Se înlătură filtratul. Apoi se spală coloana cu 50 ml de metanol 80 % (4.6) şi se înlătură filtratul. Se elutează flavofospfolipolul cu soluţie metanolică de clorură de potasiu (4.8) menţinând rata de curgere la aproximativ 2 ml / minut. Se colectează 50 ml de eluat într-un balon gradat, se adaugă 30 ml de apă şi se amestecă. Această solutie ar trebui să aibă un continut de flavofosfolipol de O; 2ug /'ml (= u8). ' 7.3. Solutii de testare ' Atunci când ce consideră necesar (de ex. când etapa de purificare a fost omisă), se diluează extractul obţinut ca la punctul 7.1. cu metanol 50 % (4.5) pentru a se obţine un conţinut dorit de flavofosfolipol de 0.2 ug/ml (=Ua). Din soluţia U8 se prepară soluţii U4 (conţinut aşteptat: 0.1 ug I ml), U2 (conţinut aşteptat: 0.05 ug /
ml)şi U1 (conţinut aşteptat: 0.025 ug /
ml)prin intermediul diluţiei succesive (1/1) cu metanol 50% (4.5). 8. Procedura de efectuare a testării 8.1. Însăn,ânţarea mediului de probă Se însămânţE ază rnediul de testare (4.2.2) cu suspensie bacteriană (3.2) la aproximativ fiO °C. Prin testări preliminare pe plăci cu mediu de testare (4.2.2.) se determină cantitatea de suspensie bacteriană necesară pentru a indica cele mai mari şi mai curate zone de inhibitie obtinute cu diferite concentratii de flavofosfolipol (aproximativ' 30 m'l/ litru). ' 8.2 Pregătirea placilor Difuzia pe agar este efectuată în plăci utilizându-se patru concentraţii din s.oluţia standard (S8, 84, S2, S1) şi patru concentraţii din soluţia de testare (U8, IU4, U2, U1). Aceste patru concentraţii de extract şl cele standard trebuie, în mod obligatoriu, să fie plasate în fiecare placă. Pentru acest scop, se aleg pliîci destul de mari pentru a permite să se efectueze cel puţin opt godeuri în rnediu de agar cu un diametru de 1O până la 13 mrn şi nu n1ai puţin de 30 mn, de centru. Testul poate fi efectuat pe plăci ce constau într-o placă de sticlă cu o faţadă din aluminiu sau un inel din plastic plasat în vârf, 200 mm în dian1etru şi 20 mm înălţ:ime. Se toarnă în plăci o cantitate din rnediu (4.2.1) pentru a se obţine un strat gros ele aproximativ 1,5 mm (45 ml pentru o placă de 200 rnrn diametru). Se lasă să se solidifice şi apoi peste st.rat cu o cantitatei din mediu (4. -2) ,se însămânţează ca la punctul 8.1, pentru a se obţine un strat gros de 1 mm (30 ml pentru o placă d•3!2'.00 mrn diannetru). Se lasă să se solidifice din nou1 se efectuează godeuri şi se pun în acestea volume de probă, măsurate cu exactitate şi soluţii standard (între O,1 O şi O,15 ml per gaură) conform diametrului). Se utilizează fiecare concentraţie de cel puţin patru ori, astfel încât fiecare determinare să fie supusă unei evaluări a 32 zone ele inhibitir1. ' 8.3. Incubare Se incubează plăcile timp de 16 p ină la 18 ore, la 28 până la 30 QCă 9. Evaluare Se măsoară diametrul zonelor de inhibiţie cu o aproximaţie de 0-1 mm. Se înregistrează valorile •medii pentru fiecare concentraţie pe hârtie grafică semi-logaritmică ce indică logaritmul concentraţiilor în relaţie cu diametrele zonelor de inhibitie. ' Se trasează liniile cele mai potrivite, atât pentru soluţia standard cât şi pentru extract , ca în exemplu de mai jos: Se determină punctul ăcel mai potrivit" pentru cel mai scăzut nivel standard (SL) utilizând formula: (
a)SL= 1s1+4s2+s4-2s3 10 (
b)SH= 7S8 +4S4 +S2 -2S1 10 Se calculează în mod similar punctele ăcele mai potrivite " pentru nivelul cel mai scăzut de extract (UL) şi nivelul cel mai înalt de extract (UH), prin substituirea u1, u2, U4 şi ua cu s1, s2, S4 şi s8 din formula menţionată mai sus. Se înregistrează valorile calculate ale SL şi SH pe aceeaşi hârtie grafică şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru soluţia standard. Se înregistrează în mod similar UL şi UH şi se unesc pentru a da linia ăcea mai potrivită" pentru extract. În absenta oricărei interferente, liniile trebuie să fie paralele. Pentr'u scopuri practice, 'liniile pot fi considerate paralele dacă valorile (SH-SL) şi (UH-UL) nu diferă mai mult de 10% ca valoare medie a acestora. Dacă liniile nu sunt paralele fie u1 şi s1 fie u8 şi s8 pot fi înlăturate şi SL, SH, UL şi UH calculate, utilizând formula alternativă, pentru a da liniile alternative ăcele mai potrivite": (a') SL= -5-S--1-+-"2-S--2---'S--4------'5-SS2a+U2-S-"4'---S--8'- 6 6 (b') SH= 5S4 + 2S2 -sl sau 5S8 + 2S4 -S2 6 .,... 6 şi în mod similar pentru UL şi UH. Liniile alternative cele mai potrivite trebuie să fie verificate pentru paralelism ca mai înainte. Faptul că rezultatul a fost calculat pe baza celor trei nivele, trebuie să fie notat în raportul final·(buletinul de analiză). Atunci când liniile sunt considerate ca fiind paralele, se calculează logaritmul activităţii relative (log A) prin intermediul uneia din următoarele formule (
c)log A= (u, +u2+u4 +U8 -s, -s2 -S4 -S8)xo,602 U4 +U8 +S4 +S8 -u1 -u2 -s,-s2 Pentru trei nivele (
d)log A= (u, +U2 +U4 -S\ -S2 -SJx0,401 U4 +S4 -U1 -S1 sau (d') log A= (U2+U4 +Ug-s, -s4-Ss)x0,401 U8+S8-U2-S2 Activitate reală = activitate presupusă X activitate relativă Atunci când liniile sunt considerate ca nefiind paralele, se repetă determinarea. Dacă paralelismul nu este încă realizat, se calculează logaritmul activităţii relative (log. A) prin intermediul formulei (c). Rezultatul obţinut trebuie totuşi să fie considerat ca aproximativ şi acesta trebuie să fie notat în raportul final (buletinul de analiză). 1o. Repetabilitate Diferenta între rezultatele celor două determinări efectuate pe aceeaşi ' probă prin aceeaşi analiză nu trebuie să depăşească: - 0,5 mg/kg, în valoare absolută, pentru conţinutul de flavofosfolipol de la 1 până la 2 mg /kg - 25% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut mai mare de 2 şi până la 1O mg/kg - 20% să fie corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut mai mare de 1O şi până la 25 mg/kg, - 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut mai mare de 25 mg/kg şi până la 50 mg/kg, 10% fiind corelată cu valoarea cea mai mare pentru un conţinut de aproximativ 50 mg/kg 3. Determinarea oligoelementelor: fier, cupru, mangan şi zinc1. Domeniu şi scop Metoda face posibil să se determine oligoelementele fier, cupru, mangan şi zinc din furaje. Limitele inferioare de determinare sunt: Fier (fe): 20 mg/kg Cupru (cu): 1O mg/KG Mangan (mn): 20mg/kg Zinc (zn): 20 mg/kg 2. Principiu Proba este introdusă în soluţie de acid clorhidric după distrugerea materiilor organice, dacă este cazul. Elementele fier, cupru, mangan şi zinc sunt determinate după o diluare corespunzătoare, prin spectrometrie de absorbţie atomică. 3. Reactivi Comentarii introductive Pentru prepararea reactivilor şi soluţiilor analitice se utilizează apă liberă de cationii ce trebuie, în consecinţă, determinaţi, obţinută fie prin distilare dublă a apei într-o sticlă de borosilicat sau cuarţ sau prin tratament dublu pe răşină schimbătoare de ioni. Reactivii trebuie să fie de acelaşi grad analitic(p.a). Eliberarea elementului ce trebuie determinat trebuie să fie determinată printr-un experiment ăorb". Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie purificaţi ulterior. în locul soluţiilor standard, descrise mai jos, pot fi utilizate solutii comerciale standard, cu conditia ca acestea să fie gara'ntate şi verificate înainte de utilizare.' 3.1 Acid clorhidric p.a.(d: 1.19} 3.2. Acid clorhidirc p.a. (6N). 3.3. Acid clorhidric p.a. (0.5 N) 3.4. Acid fluorhidric 38 la 40 %, (v/
v)având un conţinut de fier mai mic de 1 mg Fe/litru şi un reziduu după evaporare mai mic de 1O mg (ca sulfat)/litru. 3.5. Acid sulfuric p.a. (d: 1.84.) 3.6. Peroxid de hidrogen p.a. 30% 3.7. Soluţie de fier standard (1OOOug Fe/
ml)preparată după cum urmează: se dizolvă 1g de sârmă de fier p.a. în 200 ml de acid clorhidric 6 n (3.2), se adaugă 16 ml de peroxid de hidrogen (3.6) şi se aduce la un litru cu apă 3.7.1. Soluţia de fier standard de lucru (1OO□g Fe /
ml)preparată prin diluarea soluţiei standard (3.7) 1/9 cu apă. 3.8. Soluţia de cupru standard (1OOO □g Cu /
ml)preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de cupru sub formă de pulbere (p.
a)în 25 ml de acid clorhidric 6 n (3.2), se adaugă 5 ml de peroxid de hidrogen (3.6) şi se aduce la un litru cu apă. 3.8.1. Soluţia standard de cupru de lucru (1O □g Cu /
ml)preparată prin diluarea soluţiei standard (3.8) 1/9 cu apă şi apoi prin diluarea soluţiei ce rezultă 1/9 cu apă. 3.9. Soluţie standard de mangan (1 OOO ug mn/
ml)preparată după cum urmează: se dizolvă 1 g de mangan sub formă de pulbere (p.
a)în 25 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) şi se aduce la un litru cu apă. 3.9.1. Soluţia standard de mangan de lucru (1O □g Mn /
ml)preparată prin diluarea soluţiei standard (3.9) 1 / 9 cu apă şi apoi se diluează soluţia ce rezultă 1 / 9 cu apă. 3.1O Soluţia standard de zinc (1OOO □g Zn /
ml)preparată după cum urmează: se dizolvă 1g de zinc sub formă de folie (p.
a)în 25 ml de acid clorhidric 6n (3.2) şi se aduce la un litru cu apă. 3.10.1 Soluţia standard de zinc de lucru (1O □g Zn /
ml)preparată prin diluarea soluţiei standard (3.1O) 1/9 cu apă şi apoi diluarea soluţiei ce rezultă 1/ 9 cu apă. 3.11 Soluţie de clorură de lantan preparată după cum urmează: se dizolvă 12 g de oxid de lantan în 150 ml de apă, se adaugă 100 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) şi se aduce la un litru cu apă. 4. Aparatură 4.1. Cuptor cu muflă cu temperatură reglabilă şI înregistrare 4.2. Sticlăria trebuie să fie rezistentă, de tip borosilicat şi se recomandă să se utilizeze aparate ce sunt rezervate în mod exclusiv pentru determinări de oligoelemente. 4.3. Creuzete de platină şi creuzete de cuarţ 4.4. Spectrometru de absorbţie atomică ce întruneşte cerinţele metodei cu privire la sensibilitatea şi precizia gamei de valori solicitate. 5. Procedură 5.1. Probe ce conţin materie organică 5.1.1. Incinerarea şi prepararea soluţiei pentru analiză (*) (
i)se pun 5 până la 1O g de probă, cântărită cu o aproximaţie de O ,2 mg, într-un creuzet de cuarţ sau platină (4.3) (vezi nota(b)), se sicatează într-un cuptor la 105 °C şi se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă rece (4.1). Se închide cuptorul (vezi nota (c)) şi se ridică în mod gradat temperatura de la 450 la 475 QC timp de aproximativ 90 minute. Se menţine această temperatură timp de 4 până la 16 ore (de ex. peste noapte) pentru a se îndepărta materialul carbonatat şi apoi se deschide cuptorul şi se lasă să se răcească (vezi nota (d.)) Se spală creuzetul cu un total de aproximativ 5 ml de acid clorhidric (3.1) şi acesta din urmă se adaugă încet şi cu atenţie în capsula (poate surveni o reacţie viguroasă datorită formării de CO2). Se adaugă acidul clorhidric (3.1) sub formă de picătură, cu agitare până când se stopează toată efervescenţa. Se evaporă la sec, amestecând din când în când cu o bagheta de sticlă. (*) Este posibil ca furajul verde (proaspăt sau uscat) să conţină o cantitate mare de siliciu vegetal, ce poate reţine oligoelemente şi trebuie să fie, de aceea, îndepărtat. Pentru probe din aceste furaje, deci, trebuie să fie urmată următoarea procedură modificată Se efectuează operaţiunea 5.1.1 (I) până la filtrare. Se spală hârtia de filtru ce conţine reziduul ·insolubil, de două ori, cu apă fiartă şi se pune într-un creuzet din platină (4.3.). Se dă foc furnalului cu muflă (4.1) la o temperatură mai mică de 550 °C până când tot materialul carbonatat a dispărut complet. Se lasă să se răcească, se adaugă câteva picături de apă, apoi se adaugă între 1O - 15 ml de acid fluorhidric (3.4) şi se evaporă până la uscare, la aproximativ 150 °C. Dacă mai rămâne siliciu în reziduu, se dizolvă în câţiva mililitri de acid fluorhidric (3.4) şi se evaporă până la uscare. Se adaugă cinci picături de acid sulfuric (3.5) şi se încălzeşte până când nu mai este degajat nici un vapor alb. După adăugarea a 5 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) şi aproximativ 30 ml de apă, se încălzeşte, se filtrează soluţia într-un balon gradat de 250 ml şi se umple până la semn cu apă (concentraţie de acid clorhidric aproximativ 0,5n). Se procedează apoi cu determinarea de la punctul 5.1.3. Apoi se adaugă 15 ml de acid clorhidric 6 n (3.2) la reziduul rezultat urmat de aproximativ 120 ml de apă. Se amestecă cu bagheta de sticlă ce trebuie să fie lăsată în capsula şi se acoperă capsula cu o sticlă de ceas. Se aduce uşor la fierbere şi se menţine la punctul de fierbere până când se observă că nu se mai dizolvă. Se filtrează cenuşa cu hârtie de filtrare şi se colectează filtratul într-un balon gradat, se spală capsula şi se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6n fierbinte (3.2) şi de două ori cu apă fiartă. Se completează balonul gradat până la semn cu apă (concentraţie de HCI aproximativ 0.5 N). (
ii)dacă reziduul din filtru apare negru (particule de carbon), se pune înapoi în cuptor şi se incinerează din nou la 450 până la 475 °C . Această incinerare, ce solicită doar câteva ore (aproximativ trei până la cinci ore), se realizează până când cenuşa pare albă sau aproape albă. Se dizolvă reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric (3.1), se evaporă până la sec şi se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6N (3.2). se încălzeşte, se filtrează soluţia în balonul gradat şi se completează până la semn cu apă. Zinc µg Zn/ml o 0.05 0.1 0.2. 0.4 0.6 0.8 ml solutie standard d' e lucru (3.8.1) (1 ml = 1O µg Zn) +ml 6N HCI o 7 0.5 7 1 7 2 7 4 7 6 7 8 7 +1O ml de soluţie de clor lantan (3.11) şi se completează până la 100 ml cu apă. 5.1.2.2. Prepararea soluţiei pentru analiză Pentru determinarea de cupru, soluţia preparată ca la punctul 5.1.1. poate fi utilizată, în mod normal, direct. Dacă este necesar să se aducă concentraţia în cadrul gamei soluţiilor de calibrare, o porţiune alicotă poate fi pipetată într-un balon gradat şi se completează până la semn cu acid clorhidric 0.5 n. (3.3). Pentru determinarea de fier, mangan şi zinc, se pipetează o porţiune alicotă din soluţia preparată la punctul 5.1.1. într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 1O ml de soluţie de clor lantan (3.11) şi se completează până la semn cu acid clorhidric 11 0.5 n (3.3) (vezi, de asemenea, punctul 8 observaţie") 5.1.2.3. Experiment ăorb" Experimentul 11orb" trebuie să includă toate etapele prescrise de procedură, cu excepţia faptului că materialul de probă este omis. Solutia de calibrare 11 ' 011 nu trebuie să fie utilizată ca ăorb". 5.1.2.4. Măsurarea absorbtiei atomice ' Se măsoară absorbţia atomică a soluţiilor de calibrare şi a solutiei ce trebuie analizată, utilizându-se o flacara oxidantă de aer-a' cetilenă la următoarele lungimi de undă: AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR O R D I N pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări*) În temeiul prevederilor art. 10 lit.
b)din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia, văzând Referatul de aprobare nr. 153.185 din 26 mai 2004 al Direcției generale veterinare, președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin: Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin. Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prezentului ordin. Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I. Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor, Liviu Harbuz București, 10 iunie 2004. Nr. 17. *) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 17/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis. **) Anexa este reprodusă în facsimil. ANEXĂ NORMĂ VETERINARĂ ce stabilește metoda de calcul pentru valoarea energetică a furajelor combinate pentru păsări METODA DE CALCUL a valorii energetice a furajelor pentru păsări ANEXĂ la norma veterinară AGENfiIA VETERINARĂ ȘI PENTRU SIGURANfiA ALIMENTELOR O R D I N pentru aprobarea Normei veterinare ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia*) În temeiul prevederilor art. 10 lit.
b)din Ordonanța Guvernului nr. 42/2004 privind organizarea activității veterinare, în baza Hotărârii Guvernului nr. 308/2004 privind organizarea și funcționarea Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor și a unităților din subordinea acesteia, văzând Referatul de aprobare nr. 153.878 din 27 mai 2004 al Direcției generale veterinare, președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor emite următorul ordin: Art. 1. — Se aprobă Norma veterinară ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia, prevăzută în anexa**) care face parte integrantă din prezentul ordin. Art. 2. — Institutele centrale de profil, direcțiile veterinare și pentru siguranța alimentelor județene și a municipiului București vor duce la îndeplinire prevederile prezentului ordin. Art. 3. — Agenția Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor va controla modul de îndeplinire a prevederilor prezentului ordin. Art. 4. — Prezentul ordin se va publica în Monitorul Oficial al României, Partea I. Președintele Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor, Liviu Harbuz București, 10 iunie 2004. Nr. 18. *) Ordinul președintelui Agenției Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 18/2004 a fost publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 1.020 din 4 noiembrie 2004 și este reprodus și în acest număr bis. **) Anexa este reprodusă în facsimil. ANEXĂ NORMĂ VETERINARĂ ce stabilește metode de analiză pentru controlul oficial al furajelor cu privire la conținutul în acid cianhidric, calciu, carbonați, cenușă brută, cenușă brută insolubilă în acid clorhidric, clor din cloruri, ulei de muștar, lactoză, potasiu, sodiu, zahăr, uree și estimarea activității ureazice a produselor derivate din soia ANEXĂ la norma veterinară controlul oficial al furajelor privind umiditatea, bazele azotate volatile, fosforul total şi uleiurile şi grăsimile brute" 3. Procedură Se amestecă bine proba finală, fie mecanic sau manual. Se împarte proba în două părţi egale (poate să fie utilizată metoda de împărţire în patru când este cazul). Se menţine una din porţiuni într-un container corespunzător, curat şi uscat, echipat cu un dop etanş şi se pregătesc din cealaltă porţiune sau dintr-o porţiune reprezentativă a acesteia, cel puţin 100g, aşa cum s-a indicat mai jos. 3.1. Furaje ce pot fi măcinate ca atare Cu excepţia cazului când nu s-a specificat de metodele de analiză, după măcinare, dacă e necesar, se cerne întreaga probă printr-o sită cu ochiuri de 1mm (în conformitate cu Recomandarea ISO R 565). Se evită orice supra-măcinare. Se amestecă proba măcinată şi se colectează într-un container corespunzător, curat şi uscat, echipat cu un dop etanş. Se amestecă din nou, imediat înainte de cântărirea cantităţii pentru analiză. 3.2. Furaje ce pot fi măcinate după uscare Cu excepţia cazului când nu s-a specificat de metodele de analiză, se usucă proba pentru a se aduce conţinutul în umiditate al acesteia la un nivel scăzut de 8-12%, în conformitate cu procedura preliminară de uscare descrisă în baza punctului 4.3. al metodei de determinare a umidităţii menţionată la secţiunea 2 de mai sus. Se procedează apoi aşa cum s-a indicat la sectiunea 3.1. 3.3. Furaje lichide sau' semi-lichide Se colectează proba într-un container corespunzător, curat şi uscat, echipat cu un dop etanş. Se amestecă bine imediat înainte de cântărirea cantităţii pentru analiză. 3.4. Alte furaje Probele ce nu pot fi preparate în conformitate cu una din procedurile anterioare trebuie să fie tratate prin orice altă procedură ce asigură că, în fapt, cantităţile cântărite pentru analiză sunt omogene şi reprezentative pentru probele finale. 4. Depozitarea probelor Probele trebuie să fie depozitate la o temperatură ce nu va altera compoziţia acestora. Probele destinate pentru analiza vitaminelor sau a substantelor ce sunt sensibile în mod deosebit la lumină, trebuie să fie 'depozitate în containere cu geamuri fumurii. B. Prevederi în legătură cu reactivii şi aparatura utilizată la metodele de analiză. 1. Numai dacă nu s-a specificat la metodele de analiză, toţi reactivi analitici trebuie să fie puri din punct de vedere analitic.(a.p.). Când se determină micro-elemente, puritatea reactivilor trebuie să fie controlată printr-un test martor. În funcţie de rezultatele obţinute, poate să fie necesară o purificare suplimentară a reactivilor. 2. Orice operaţiune ce implică pregătirea soluţiilor, diluarea, clătirea sau spălarea, menţionate de metodele de analiză, fără indicaţie în ceea ce priveşte natura solventului sau a diluantului întrebuinţat, implică faptul, că trebuie să fie utilizată apă. Ca regulă generală, apa trebuie să fie demineralizată sau distilată. În cazuri particulare ce sunt indicate de metodele de analiză, aceasta trebuie să fie supusă unor proceduri speciale de purificare. 3. În legătură cu echipamentul aflat în mod normal în laboratoarele de control metodele de analiză fac referire numai la acele instrumente sau aparate ce sunt speciale sau necesită utilizare specifică. Acestea trebuie să fie curate, în special atunci când trebuie să fie determinate cantităti foarte mici de substante. ' ' C. Aplicarea metodelor de analiză şi exprimarea rezultatelor 1. Este stabilită, în general, o singură metodă de analiză pentru determinarea fiecărei substanţe din furaje. Atunci când sunt prezentate câteva metode, trebuie să fie indicată, în raportul de analiză, metoda specifică utilizată de laboratorul de control. 2. Rezultatul prezentat de raportul de analiză trebuie să fie valoarea medie obţinută de la cel puţin două determinări, efectuate pe porţiuni separate de probă şi de o repetabilitate satisfăcătoare. Acest rezultat trebuie să fie exprimat în maniera stabilită de metoda de analiză, cu un număr corespunzător de cifre semnificative şi trebuie să fie corectat, dacă este necesar, în funcţie de conţinutul de umiditate al probei finale anterior preparării. Pregătirea probei pentru analizăEste esenţial ca analizele chimice să fie efectuate pe o probă omogenă. Este totuşi posibil să se efectueze unele determinări macroscopice sau microscopice şi de asemenea, determinarea umidităţii, din probă în starea în care aceasta ajunge la laborator. Pentru a satisface aceste două cerinţe, proba va fi divizată în două părţi. O parte va fi păstrată aşa cum este, iar cealaltă poate va fi preparată pentru analiză chimică, după cum urmează. Se divide proba cu aparatură mecanică sau manual, după amestecarea cu grijă a întregii probe pe o suprafaţă curată şi uscată. În caz extrem este preferabil să se utilizeze metoda de divizare în sferturi ce constă în prelevarea de probe pe rând din două secţiuni opuse. În cele din urmă se delimitează pentru analiză o porţiune ce cântăreşte aproximativ 100g şi dacă e necesar, aceasta se mărunţeşte, astfel încât întreaga probă trece printr-o sită cu ochiuri de 1mm. Se transferă imediat această probă într-un container uscat, etanş şi se sigilează. Dacă proba este foarte umedă, aceasta trebuie să fie pre uscată, pentru a se aduce conţinutul umidităţii la un nivel scăzut, între 8 şi 12%. Pentru a se realiza aceasta, se usucă proba la o temperatură potrivită pentru o perioadă de timp adecvată. Reactivi şi aparaturăLa descrierea metodelor de analiză sunt mentionate numai instrumente sau aparate speciale sau cele ' ce necesită standarde speciale. Nu se consideră necesar să se menţioneze toate aparatele sau instrumentele ce fac parte din echipamentul de zi cu zi al laboratoarelor de testare. De asemenea, acolo unde este menţionată apa, în legătură cu realizarea diluării sau spălării, aceasta înseamnă apă distilată. În mod similar, acolo unde este menţionată soluţia unui reactiv, fără orice altă indicatie, aceasta înseamnă o soluţie în apă distilată. ' E primarea rezultatelorRezultatul specificat de certificatul de analiză trebuie să fie valoarea medie obţinută pe baza a cel puţin două testări. Supus unor prevederi speciale, acesta trebuie să fie exprimat ca un procentaj din proba originală, aşa cum a fost când acesta a ajuns la laborator. Nu trebuie să fie prezentat rezultatul cu cifre mai semnificative decât permite acurateţea metodei de analiză. 2. Determinarea acidului cianhidric1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibilă determinarea nivelului acidului cianhidric, liber şi combinat sub forma glicozidelor, în furaje şi în particular în produse derivate din seminţe de in, din făină de manioc şi din unele specii de fasole. 2. Principiu Proba este suspendată în apă. Acidul cianhidric este eliberat prin acţiunea enzimelor, antrenat prin distilare cu aburi şi colectat într-un volum specific de soluţie acidifiată de nitrat de argint. Cianura de argint este separată prin filtrare, iar excesul de nitrat de argint este titrat cu o soluţie de tiocianat de amoniu. 3. Reactivi 3.1. O suspensie de migdale dulci: se zdrobesc 20 de migdale dulci confiate în 100 ml de apă la 37-40°C. Se controlează să nu existe acid cianhidric în cei 1O ml ai suspensiei, utilizând hârtie de picrat de sodiu sau efectuând un test martor, aşa cum este descris la ultimul paragraf al punctului 5. 3.2. 10°/o soluţie (w/
v)de acetat de sodiu, neutră la fenolftaleină. 3.3. Emulsie anti-spumă (e.g. Silicon) 3.4. Acid azotic, d20=1,4Og/ml 3.5. Soluţie de azotat de argint: O,O2N 3.6. Solutie de tiocianat de amoniu: O,O2N. 3.7. Solut'ie saturată de sulfat feric de amoniu. 3.8. Amon' iac, d20 = O,958g/ml. 4. Aparatură 4.1. Cuptor cu termostat fixat la 38°C. 4.2. Aparat pentru distilare prin antrenare cu aburi, echipat cu un refrigerent cu o piesă extinsă curbată. 4.3. Baloane de 1000ml cu fundul plat cu dop de sticlă 4.4. Baie de ulei 4.5. Biurete gradate de 1120ml. 5. Procedură Se cântăresc 2Og din probă, cu o aproximaţie de 5mg, se introduc într-un balon cu fund plat de 1000ml şi se adaugă 50ml de apă şi 10ml de suspensie de migdale dulci (3.1). Se pune dopul la balon şi se transferă în cuptor, timp de 16ore la 38°C. Se răceşte apoi la temperatura camerei şi se adaugă 80ml de apă, 10ml de soluţie de acetat de sodiu(3.2) şi o picătură din emulsia anti-spumă (3.3). Se conectează balonul la aparatul de distilare şi se introduce într-o baie de ulei ce a fost mai întâi adusă la o temperatură cu puţin peste 1oo0c. Se distila 200ml până la 300ml de lichid, trecând un puternic curent de aburi prin balon şi încălzind uşor baia de ulei. Se colectează distilatul într-un pahar Erlenmeyer protejat de lumină şi care conţine exact 50ml de soluţie de azotat de argint O,O2N (3.5) şi 1ml de acid azotic (3.4). Trebuie să se asigure că tubul prelungitor al refrigerentului este imersat într-o soluţie de nitrat de argint. Se transferă conţinutul din paharul Erlenmeyer într-un balon cotat de 500ml, se completează cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se iau 250ml din filtrat, se adaugă aproximativ 1ml de soluţie de sulfat feric de amoniu (3.7) şi se titrează înapoi excesul de nitrat de argint cu soluţie de tiocianat de amoniu 0,02N (3.6)provenita dintr-o biuretă gradată de 1120ml. Un test martor poate să fie efectuat, dacă este necesar, aplicând aceeaşi procedură la 10ml de suspensie de migdale dulci (3.1), omiţând că proba trebuie analizată. 6. Calcularea rezultatelor Dacă testul martor indică faptul că soluţia de azotat de argint 0,02 n a fost consumată, se scade valoarea acesteia din volumul consumat de distilatul probei. 1ml de AgNO3 0,02 n corespunde la 0,54 mg de HCN. Se exprimă rezultatul procentual. 7. Observatii Dacă 'proba conţine o cantitate mare de sulfiţi (ex. boabe de fasole}, se formează un precipitat negru de sulfit de argint ce este filtrat împreună cu un depozit de cianură de argint. Formarea acestui precipitat cauzează o pierdere de soluţie de nitrat de argint 0,02n, volum ce trebuie să fie scăzut din volumul utilizat pentru a calcula conţinutul de HCN. Pentru a face aceasta, se procedează după cum urmează: Se tratează depozitul rămas pe un filtru cu 50ml de amoniac (3.8), pentru a se dizolva cianura de argint. Se spală reziduul în amoniac diluat şi apoi se determină conţinutul în argint al acestuia. Se converteşte valoarea obţinută în ml de soluţie de azotat de argint 0,02 N. Conţinutul în HCN al probei poate fi, de asemenea, determinat prin titrarea filtratului amoniacal acidifiat, cu acid azotic. 3. Determinarea calciului1. Scop şi domeniu de aplicare Metoda face posibilă determinarea calciului total din furaje. 2. Principiu Proba de analizat este calcinata, cenuşa tratată cu acid clorhidric, iar calciul precipitat sub forma de oxalat de calciu. Se dizolvă precipitatul în acid sulfuric şi se titrează acidul oxalic ce se formează cu o solutie de permanganat de potasiu. ' ' 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric p.a., d20=1,14g/ml 3.2. Acid azotic p.a.,d 20= 1,40 g/ml 3.3. Acid sulfuric p.a., d20= 1,13 g/ml 3.4. Amoniac p.a., d20=O,89 g/ml l 3.5. Solutie saturată la rece de oxalat de amoniu p.a.. 3.6. Soluţie 3O°/c, (w/
v)de acid citric p.a.. 3.7. Soluţie 5°/o (w/
v)de clorură de amoniu p.a. 3.8. Soluţie 0,04% (w/
v)de verde brom crezol 3.9. Soluţie de permanganat de potasiu O,1n 4. Aparatură 4.1. Cuptor electric cu circulaţie a aerului şi termostat. 4.2. Creuzete din platină, siliciu sau porţelan pentru calcinare. 4.3. Creuzete filtrante cu frita din sticlă de porozitate G4. 4.4. Baie de apa. 5. Procedura Se cântăresc aproximativ 5g din probă (sau mai mult dacă este necesar) cu o precizie de 1 mg, se calcinează la 55O°c şi se transferă cenuşa într-un pahar de laborator de 250ml. Se adaugă 40ml de acid clorhidric (3.1), 60ml de apă şi câteva picături de acid azotic (3.2). Se aduce la fierbere şi se menţine la punctul de fierbere timp de 30 de minute. Se răceşte şi se transferă soluţia într-un balon cotat de 250ml. Se clăteşte, se completeaza la semn cu apa, se omogenizează şi se filtrează. Utilizând o pipetă, se transferă într-un pahar de laborator de 250ml, o cantitate ce conţine 1O până la 40mg de calciu, în conformitate cu conţinutul în calciu asumat. Se adaugă 1ml de soluţie de acid citric (3.6) şi 5ml de soluţie de clorură de amoniu (3.7). 5. Se dilueaza cu apă volumul până la aproximativ 100ml. Se aduce până la punctul de fierbere, se adaugă 8 până la 1O picături de soluţie de verde brom crezol (3.8) şi 30ml de soluţie fierbinte de oxalat de amoniu (3.5). Dacă se formează un precipitat, acesta se dizolvă adăugând câteva picături de acid clorhidric (3.1). Se neutralizează lent cu amoniac (3.4), sub agitare constanta până la obtinerea unui pH de 4.4 pana la 4.6 (ex.: Atunci când indicatorul îşi schimbă culoarea). Se plasează paharul de laborator într-o baie de apă la fierbere şi se mentine timp de 30 de minute, pentru a permite precipitatului ce s-a format să se depună. Se scoate paharul de laborator din baia de apă. Se lasă ca acesta să stea timp de o oră şi se filtrează printr-un creuzet filtrant tip G4. Se spală paharul de laborator şi creuzetul cu apa pana la eliminarea completa a excesului de oxalat de amoniu, constatat prin absenta ionului clor in apa de spalare Se dizolvă precipitatul de pe filtru în 50ml de acid sulfuric fierbinte (3.3). Se clăteşte creuzetul cu apă fierbinte şi se completează filtratul până la aproximativ 100ml. Se aduce temperatura până la 70-ao0c şi se titrează picătură cu picătură cu o soluţie de permanganat de potasiu (3.9) până când este obţinută o culoare roz ce durează timp de 1 minut. 6. Calcularea rezultatelor 1ml de permanganat de potasiu O,1 n corespunde la 2,004 mg de calciu. Se exprimă rezultatul obţinut procentual. 7. Observatii 7.1. P' entru un continut foarte scăzut de calciu se procedează după cum urm' ează: se filtrează precipitatul de oxalat de calciu printr-o hârtie de filtru liberă de cenuşă. După spălare se usucă filtrul şi cenuşa la sso0c într-un creuzet de platină. Se redizolvă reziduul în câteva picături de acid sulfuric (3.3), se evaporă până la sec, se calcinează din nou la 550°C şi se cântăreşte. Dacă w este greutatea sulfatului de calciu obţinut, conţinutul în calciu a cantităţii luată ca o probă = W x 0,2944. 7.2 Dacă proba constă numai din substante minerale, I A aceasta se dizolvă în acid clorhidric fără a o calcina mai întâi. ln cazul produselor precum fosfatul de aluminocalcic ce este dificil de dizolvat în acid, se dizolvă după cum urmează printr-un proces alcalin înainte de dizolvare: se amestecă bine proba ce trebuie analizată într-un creuzet de platină cu un amestec de cinci ori greutatea acesteia, constând în cantităţi egale de carbonat de potasiu şi carbonat de sodiu. Se încălzeşte cu grijă până când amestecul este dizolvat complet. Se răceşte şi se dizolvă în acid clorhidric. 7.3. Se precipită oxalatul de calciu a doua oară, dacă conţinutul în magneziu al probei este ridicat. 4. Determinarea carbonatilor' 1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine cantitatea de carbonaţi, exprimată convenţional ca şi carbonat de calciu în majoritatea furajelor. Totuşi, în unele cazuri, trebuie să fie utilizată o metodă specială (de ex.: cu carbonat de fier). 2. Principiu Carbonaţii sunt descompuşi în acid clorhidric. Dioxidul de carbon eliberat este colectat într-un tub gradat, iar volumul acestuia comparat cu cel eliberat în aceleaşi condiţii, printr-o cantitate cunoscută de carbonat de calciu p.a. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric, d=1,1Og/ml. 3.2. Carbonat de calciu, p.a 3.3. Acid sulfuric, aproximativ O,1n, colorat cu roşu metil. 4. Aparatură Aparatură Scheibler - Dietrich (vezi diagrama) sau aparatura echivalentă. 5. Procedura în conformitate cu conţinutul în carbonaţi al probei, se cântăreşte o porţiune a probei, aşa cum se arata în continuare: 0,5g pentru produse ce conţin de la 50 la 100% carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu 1g pentru produse ce conţin de la 40 la 50% carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu. 2-3g pentru alte produse. Se plasează porţiunea probei într-un recipient special

(4)a aparaturii, echipată cu un tub mic din material indestructibil ce conţine 1O ml de acid clorhidric (3.1) şi se conectează recipientul la aparatură. Se deschide robinetul cu trei căi

(5), astfel încât tubul

(1)se conectează cu exteriorul. Se aduce nivelul lichidului la nivelul de sus, până la semnul zero, utilizând tubul mobil

(2)ce este plin cu acid sulfuric colorat (3.3) şi conectat la tubul gradat

(1). Se deschide robinetul pentru a se conecta tuburile

(1)şi

(3)şi se verifică dacă nivelul este la zero. Se dă drumul încet la acid clorhidric (3.1) peste porţiunea de probă, aplecând recipientul

(4). Se egalizează presiunea coborând tubul

(2); Se agită recipientul

(4)până când se opreşte complet eliberarea de dioxid de carbon. Se restaurează presiunea aducând lichidul din tuburile

(1)şi

(2)înapoi la acelaşi nivel. Se citeşte după câteva minute, atunci când volumul de gaz a devenit constant. Se efectuează un test de control în aceleaşi condiţii pe 0,5g de carbonat de calciu (3.2).

Calcularea rezultatelor Conţinutul de carbonaţi în grame, exprimat ca şi carbonat de calciu, ca procent din probă, este calculat utilizând formula: Vx100 Tx2W unde: V=ml de CO2 T= greutatea în grame a porţiunii de probă W= greutatea în grame a porţiunii de probă
Observatii 7.
At' unci când porţiunea din probă cântăreşte mai mult de 2g, se plasează mai întâi 15ml de apă distilată în recipient

(4)şi se amestecă înainte de a începe testarea. Se utilizează acelaşi volum de apă pentru testul de control. 7.2. Dacă aparatura utilizată are un volum diferit de cel al aparatului Scheibler - Dietrich, porţiunile prelevate din probă şi din substanţa de control şi calcularea rezultatelor trebuie să fie adaptate în consecinţă. 5. Determinarea cenuşii brute1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibilă determinarea conţinutului de cenuşă brută al furajelor. 2. Principiu Proba este calcinată la 550°C; este cantarit rezidiul. 3. Reactivi Soluţie 20°/o (w/

v)de azotat de amoniu. 4. Aparatură 4.1. Plita încinsă; 4.2. Cuptor electric cu termostat. 4.3. Creuzete pentru calcinare confecţionate din platină sau dintr-un aliaj din platină şi aur (10%Pt, 90% Au), fie rectangular (60x40x25mm) fie circular (diametru: 60-75mm, înălţime: 20-25mm). 5. Procedură Se cântăreşte proba cu o marjă de aproximativ 5g (2,5 în cazul produselor ce au tendinţa de a creşte în volum) şi se plasează într-un creuzet pentru calcinare ce iniţial a fost calcinat şi tarat. Se plasează creuzetul pe plita de incalzire şi se încălzeşte treptat până când substanţa se carbonizează. Se pune creuzetul într-un cuptor fixat la 550+5°C. Se menţine la această temperatură până când este obţinută o cenuşă albă, gri deschis sau roşiatică ce pare a fi liberă de particule de cărbune. Se plasează creuzetul într-un exsicator, se lasă să se răcească şi se cântăreşte imediat. 6. Calcularea rezultatelor Se calculează cantitatea de reziduu scazand tara. Se exprimă rezultatul procentual. 7. Observatii 7.1. Ce' nuşa substanţelor ce sunt dificil de calcinat trebuie să fie supusă unei calcinări iniţiale de cel puţin trei ore, răcită şi apoi se adaugă la aceasta (cu grijă, pentru a se evita dispersia cenuşii sau formarea de bulgări) câteva picături de soluţie 20% de azotat de amoniu. Se continuă calcinarea după uscare în cuptor. Se repetă operaţiunea cât este necesar, până când este încheiată calcinarea. 7.2. în cazul substantelor rezistente la tratamentul descris în baza punctului 7.1., se p'rocedează după cum urmează: după o calcinare de trei ore, se plasează cenuşa în apă fierbinte şi se filtrează printr-un filtru mi,c, liber de cenuşă. Se calcinează filtrul şi conţinutul acestuia în creuzetul iniţial. Se plasează filtratul în creuzetul răcit, se evaporă până la sec, se calcinează şi se cântăreşte. 7.3. În cazul uleiurilor şi al grăsimilor, se cântăreşte cu acurateţe o probă de aproximativ 25 de g într-un creuzet de mărime potrivită. Se carbonizeaza fixând resturile substanţei cu o bucată de hârtie de filtru liberă de cenuşă. După ardere, se umezeşte cu cât de puţină apă este posibil. Se usucă şi se calcinează, aşa cum s-a descris în baza punctului 5. 6. Determinarea cenuşii, insolubilă in acid clorhidric1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine nivelul de substante minerale ce sunt insolubile în acid clorhidric din furaje. P'ot fi utilizate două metode, depinzând de natura probei. 1.1. Metoda A : aplicabilă furajelor organice simple şi majorităţii furajelor combinate 1.2. Metoda B aplicabilă compuşilor minerali şi amestecurilor şi furajelor combinate al căror conţinut în substanţe insolubile în acid clorhidric, aşa cum s-a determinat prin metoda a, este mai mare de 1%. 2. Principiu 2.1. Metoda a: proba este calcinată, cenuşa este tratata la cald acid clorhidric si adusa apoi la fierbere, iar reziduul insolubil este filtrat şi cântărit. 2.2. Metoda b: proba este tratată cu acid clorhidric. Soluţia este filtrată, reziduul calcinat, iar cenuşa astfel obţinută tratată în conformitate cu metoda A. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric 3n. 3.2. 20% (w/
v)soluţie de acid tricloracetic. 3.3. 1% (w/
v)soluţie de acid tricloracetic. 4. Aparatură 4.1. Plita încinsă 4.2. Cuptor electric cu termostat. 4.3. Creuzete pentru calcinare din platină sau un aliaj din platină şi aur (10% Pt, 90% Au), fie rectangular (60x40x25mm) fie circular (diametru: 60-75mm, înălţime: 20-25mm). 5. Procedură 5.1. Metoda A: Se calcinează proba utilizându-se metoda descrisă pentru determinarea cenuşii brute. Poate fi, de asemenea, utilizată cenuşa obţinută din acea analiză. Se plasează cenuşa într-un pahar de laborator, utilizându se 75ml de acid clorhidric (3.1). Se aduce încet si se mentine in fierbere inceata timp de 15 minute. Se filtrează soluţia fierbinte printr-o hârtie de filtru liberă de cenuşă şi se spală reziduul cu apă fierbinte până când nu mai este vizibilă reacţia acidă. Se usucă filtrul ce cantine reziduul si cenusa într-un creuzet tarat in prealabil la o temp'eratură de nu mai puţin de 550°C şi nu mai mult de 700°C. Se răceşte într-un exsicator şi se cântăreşte. 5.2. Metoda B Se cântăresc 5g din probă cu o aproximaţie de 1mg şi se plasează într-un pahar de laborator de 250-400ml. Se adaugă succesiv 25ml de apă şi 25ml de acid clorhidric 3n (3.1), se amestecă şi se aşteaptă să înceteze efervescenţa. Se adaugă încă 50ml de acid clorhidric 3N (3.1). Se aşteaptă să înceteze orice eliberare de gaz, apoi se plasează paharul de laborator într-o baie cu apă ce fierbe şi acesta se menţine acolo timp de 30 de minute sau mai mult, dacă este necesar, pentru a se hidroliza bine amidonul ce poate fi prezent. Se filtrează, în timp ce se încălzeşte, printr-un filtru liber de cenuşă şi se spală filtrul cu 50ml de apă fierbinte (vezi observaţia 7). Se plasează filtrul ce conţine reziduul într-un creuzet pentru calcinare, se usucă şi se calcinează la o temperatură nu mai scăzută de 550°C şi nu mai mult de 700°C. Se plasează cenuşa într-un pahar de 250-400ml, utilizându-se 75ml de acid clorhidric 3n (3.1). Se continuă aşa cum s-a descris la al doilea subparagraf al punctului 5.1. 6. Calcularea rezultatelor Se calculează cantitatea de cenusa insolubila deducand tara. Se exprimă rezultatul procentual. 7. Observatii Dacă ' filtrarea se dovedeşte dificilă, se reîncepe analiza, înlocuind cei 50ml de acid clorhidric 3N (3.1) cu 50ml de acid tricloracetic (3.2.) şi spălând filtrul într-o soluţie fierbinte de acid tricloracetic (3.3). 7. Determinarea clorului din cloruri1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine cantitatea de clor din cloruri ce sunt solubile în apă, exprimate convenţional ca şi clorură de sodiu. Aceasta este aplicabilă tuturor furajelor. 2. Principiu Clorurile prezente in proba de analizat sunt dizolvate în apă. Dacă produsul conţine materie organică, acesta este clarificat. Soluţia este uşor acidifiată cu acid azotic iar clorurile precipită sub formă de clorură de argint, prin intermediul unei soluţii de azotat de argint. Azotatul de argint în exces este titrat cu o soluţie de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard. 3. Reactivi 3.1. Soluţie de tiocianat de amoniu O,1n. 3.2. Soluţie de azotat de argint O,1 n. l 3.3. Solutie saturată de sulfat feric de amoniu. 3.4. Acid azotic, d20= 1,38g/ml. 3.5. Eter dietilic p.a. 3.6 Acetonă p.a. 3.7. Soluţie Carrez I: se dizolvă în apă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)2 . 2H2O şi 3g de acid acetic glacial. Se completează până la 100ml cu apă. 3.8. Soluţie Carrez li: se dizolvă în apă 10,6g de ferocianat de potasiu K4[Fe(CN)6] x3H2O. Se completează până la 100ml cu apă. 3.9. Carbune activ p.a., liber de cloruri şi neabsorbant al acestora. 4. Aparatură Mixer (amestecator) avand o frecventa de rotatie de cca. 35-40rpm. 5. Procedură 5.1. Prepararea soluţiei în conformitate cu natura probei, se prepară o soluţie, aşa cum se specifica la pct. 5.1.1., 5.1.2. sau 5.1.3. În acelaşi timp se efectuează un test martor ce omite proba ce trebuie analizată. 5.1.1. Probe libere de materie organică. Se cântăreşte, cu o aproximaţie de 1mg, o proba de lucu de maxim 10g si care se presupune a nu cantine mai mult de 3 g cloruri si se introduce intr-un balon cotat de 500ml cu 400ml apa la temperatura de aproximativ 20°C.Se amestecă timp de 30 de minute în amestecator(4.1), se completeaza la semn cu apa , se omogenizează şi se filtrează. 5.1.2. Probe ce conţin substante organice, excluzând produsele listate în baza punctului 5.1.3. Se cântăresc cu o precizie de 1mg, o proba de lucru de cca. 5g şi se introduc cu 1 g de carbune activ într-un balon cotat de 500ml. Se adaugă 400ml de apă la aproximativ 20°c şi 5ml de soluţie Carrez I (3.7), se agită şi apoi se adaugă 5ml de soluţie Carrez li (3.8). Se amestecă timp de 30 de minute în amestecatorul (4.1), se completeaza la semn cu apa, se omogenizează şi se filtrează. 5.1.3. Furaje preparate, sroturi şi făină de in, produse bogate în făină de in şi alte produse bogate în mucilagii sau în substanţe coloidale (de exemplu amidon dextrinizatt). Se prepară soluţia aşa cum s-a descris la punctul 5.1.2., dar nu se filtrează. Se decantează (dacă este necesar se centrifughează), se reţin 100ml din lichidul supernatant şi se transferă într-un balon cotat de 200ml. Se amestecă cu acetonă (3.6) şi se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizează şi se filtrează. 5.2. Titrare Utilizând o pipetă, se transferă într-un balon Erlenmayer 25-100ml din filtrat (în conformitate cu conţinutul de clor presupus) obţinut, aşa cum s-a descris în baza punctelor 5.1.1., 5.1.2 sau 5.1.3. Portiunea alicota nu trebuie să cantină mai mult de 150mg de C'I. Se diluează, dacă este necesa'r, la cel puţin 50ml cu apă, se adaugă 5ml de acid azotic (3.4), 20ml de soluţie saturată de sulfat feric de amoniu (3.3) şi două picături de soluţie de tiocianat de amoniu (3.1) transferat prin intermediul unui biurete umplută până la semnul zero. Utilizând o biuretă, se transferă oluţia de azotat de argint (3.2) în aşa mod încât este obţinut un exces de 5ml. Se adaugă 5ml de dietil eter (3.5) şi se agita puternic pentru formarea precipitatului. Se titrează excesul de azotat de argint cu soluţie de tiocianat de amoniu (3.1) până la obtinerea unei coloratii roşie brună persistenta timp de 1 minut. 6. Calcularea rezultatelor Cantitatea de clor (w), exprimată ca şi clorură de sodiu, prezentă în volumul de filtrat luat pentru titrare, este calculată utilizându-se următoarea formulă: W=5,845(V1 -V2)mg unde: V1= ml de soluţie de azotat de argint O,1 N adăugată V2= ml de soluţie de tiocianat de amoniu O,1 N utilizată pentru titrare. Dacă testul martor indică faptul că soluţia de azotat de argint O,1 N a fost consumată, se scade această valoare din volumul (V1- V2). 7. Observatii 7.1. T' itrarea poate fi, de asemenea, efectuată prin potenţiometru; 7.2. În cazul produselor ce sunt foarte bogate în uleiuri şi grăsimi, se realizează o primă degresare cu dietil eter sau eter de petrol 7.3. În cazul făinii de peşte, titrarea poate fi efectuată prin metoda Mohr. 8. Determinarea uleiului de muştar1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine cantitatea de ulei de muştar conţinut în brichete, elaborate de speciile Brassica şi Sinapis şi din furajele combinate ce conţin brichete obţinute de la aceste specii şi exprimate ca alil izotiacianat ce poate fi antrenat cu aburi. 2. Principiu Proba este suspendată în apă. Uleiul de muştar este eliberat prin acţiunea enzimelor, antrenat prin distilare cu etanol şi colectat cu amoniac diluat. Soluţia este tratată, în timp ce se încălzeşte, cu un volum precis de soluţie de azotat de argint, apoi se răceşte şi se filtrează. Excesul de azotat de argint este titrat cu o solutie de tiocianat de amoniu. 3. Reactivi ' 3.1. Muştar alb (Sinapis alba). 3.2. Etanol 95-96% (v/v). 3.3. Emulsie anti-spumă (de ex. silicon). 3.4. Amoniac, d 20 =958g/ml 3.5. Soluţie de azotat de argint O,1N. 3.6. Solutie de tiocianat de amoniu O,1N. 3.7. Acid 'azotic, d20= 1,4Og/ml 3.8. Solutie saturată de sulfat feric de amoniu. 4. Aparatură ' 4.1. Balon cotat cu fund plat de 500ml, cu dop rodat de sticlă. 4.2. Aparat de distilat, echipat cu un refrigerent şI cu echipament pentru prevenirea antrenării picăturilor mici. 5. Procedură Se cântăresc 1Og de probă cu o aproximaţie de 1mg, se plasează într-un balon cotat cu fundul plat de 500ml şi se adaugă 2g de muştar alb mărunţit fin (3.1) (o sursă de enzimă) şi 200ml de apă la 2O°C.Balonul se menţine la 2O°C timp de aproximativ 2 ore şi se agită frecvent. Se adaugă 40ml de etanol (3.2) şi o picătură de emulsie anti-spumă (3.3). Se distila aproximativ 150ml şi se colectează distilatul într-un pahar ce conţine 20ml de amoniac (3.4), fiind sigur că tubul prelulungitor al refrigerentului este imersat în lichid. Se adaugă la soluţia amoniacală 50ml de soluţie de azotat de argint O,1 N (3.5) (sau mai mult dacă e necesar}, se plasează o mică pâlnie peste pahar şi se încălzeşte amestecul pe o baie de apă fiartă, timp de o oră. Se lasă să se răcească, se completează la semn cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se reţin 100ml de filtrat clar, se adaugă 5ml de acid azotic (3.7) şi aproximativ 5ml de solutie de sulfat feric de amoniu. Se titrează, în schimb, exce'sul de azotat de argint cu o soluţie O,1N de tiocianat de amoniu (3.6). Se efectuează un test martor, aplicând aceeaşi procedură la 2g de muştar alb fin, omiţând proba pentru analiză. 6. Calcularea rezultatelor Se scade volumul de soluţie O,1N de azotat de argint consumat în testul martor din cel consumat de probă în soluţie. Valoarea obtinută redă numărul de ml de solutie O,1N de azotat de argint co' nsumat de uleiul de muştar din' probă. 1ml de AgNO3 O,1N corespunde la 4,956 mg de izotiocianat alil. Se exprimă rezultatul procentual. 9. DETERMINAREA LACTOZEI1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine nivelul de lactoză din furaje ce conţin mai mult de 0,5% lactoză. 2. Principiu Zaharurile sunt dizolvate în apă. Soluţia este supusă fermentaţiei cu drojdie de Saccharomyces cerevisiae ce lasă lactoza intactă. După clarificare şi filtrare conţinutul de lactoză al filtratului este determinat prin metoda Luff-Schoorl. 3. Reactivi 3.1. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se suspendă 25g de drojdie proaspătă în 100ml de apă. Suspensia se va ţine pentru o perioadă maximă de o săptămână, într-un frigider. 3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă în apă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2 x2H2O şi 3g de acid acetic. Se completează până la 100ml cu apă. 3.3. Soluţie Carrez li: se dizolvă în apă 10,6g de ferocianură de potasiu K4[Fe(CN6) ]x3H2O. Se completează până la 100ml cu apă. 3.4. Reactiv Luff-Schoorl ln soluţia de carbonat de sodiu(3.4.3) se adaugă soluţie de acid citric (3.4.2) si se agită cu grijă Se adaugă apoi soluţia de sulfat de cupru (3.4.1) şi se completează până la un litru cu apa.. Se lasă in repaus peste noapte şi se filtrează. Se verifica normalitatea reactivului astfel obţinut (Cu O,1N; Na2C03 2N). PH-ul soluţiei trebuie să fie de aproximativ 9,4. 3.4.1. Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru p.a. CuSO4 x5H2O, ( fara fier), în 100ml de apă. 3.4.2. Soluţie de acid citric: se dizolvă 50g de acid citric p.a C6HaO7 xH2O în 50ml de apă. 3.4.3. Soluţia de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,Bg de carbonat de sodiu anhidru p.a. în aproximativ 300ml de apă calda. Se lasă să se răcească. 3.5. Piatră ponce granulată, fiartă în acid clorhidric, spălată cu apă şi uscată. 3.6. Soluţie 30% de iodură de sodiu (w/v). 3.7. Acid sulfuric 6N. 3.8. Solutie de tiosulfat de sodiu O,1N. 3.9. Solu'ţie de amidon: 5g de amidon solubil dizolvat în 30ml de apă se fierbe într-un litru de apă, timp de trei minute. Se lasă să se răcească şi dacă este necesar, se adaugă 10mg de iodură de mercur ca prezervativ. 4. Aparatură Baie de apă cu termostat stabilit la 38-40°C. 5. Procedură Se cântăreşte 1g de probă cu o aproximaţie de 1mg şi se intoduce într-un balon cotat de 100ml. Se adaugă 25-30ml de apă. Se plasează balonul într-o baie de apă la fierbere, timp de 30 de minute dupa care se răceşte la aproximativ 35°C. Se adaugă 5ml de suspensie de drojdie (3.1) şi se omogenizează. Se lasă balonul să stea timp de două ore într-o baie de apă, la o temperatură de 38-40°C. Se lasă să se răcească la aproximativ 20°c. Se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrez I (3.2) şi se agită timp de 30 de secunde, apoi se adaugă 2,5ml de soluţie Carrez li (3.3) şi se agită din nou, timp de 30 de secunde. Se completează până la 100ml cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Utilizând o pipetă, se reţine o cantitate de filtrat ce nu depăşeşte 25ml şi care conţine de preferinţă 40-80mg de lactoză şi aceasta se transferă într-un pahar Erlenmeyer de 300ml. Dacă este necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă. Se efectuează în acelaşi mod un test martor cu 5ml de suspensie de drojdie. (3.1). Se determină continutul în lactoză în conformitate cu metoda Luff-Schoorl, du' pă cum urmează: se adaugă exact 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) şi două granule de piatră ponce (3.5). Se agită mecanic, în timp ce se încălzeşte deasupra unei flăcări libere, la înălţime medie şi se aduce lichidul la fierbere în aproximativ două minute. Se plasează paharul Erlenmayer pe o sita de azbest cu o gaură de aproximativ 6cm în diametru sub care a fost aprinsă flacăra. Flacăra trebuie să fie reglată în aşa fel incat numai baza Erlenmeyer-ului să fie încălzită. Se ataseaza un refrigerent de reflux la paharul Erlenmeyer. Se fierbe timp de 1O minute. Se răceşte imediat în apă rece şi după aproximativ 5 minute se titrează după cum urmează: Se adaugă 10ml de soluţie de iodură de potasiu (3.6) şi imediat după aceea (cu grijă, datorită riscului de spumare abundentă) se adaugă 25 ml de acid sulfuric 6N (3.7). Se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu O ,1N (3.8) până când apare o culoare galbuie, se adaugă solutie de amidon ca indicator (3.9) şi se continua titrarea pana la atingerea virajului. Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec măsurat cu acurateţe de 25ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) şi 25ml de apă, după care se adaugă 10ml de iodură de potasiu (3.6) şi 25 ml de acid sulfuric 6N (3.7) fără fierbere. 6. Calcularea rezultatelor Utilizându-se tabelul ataşat, se stabileşte cantitatea de lactoză, în mg ce corespunde diferenţei dintre rezultatele celor două titrări, exprimată în ml de tiosulfat O,1N. Se exprimă rezultatul (ca parti de lactoza anhidra) procentual.. 7. Observatie Pentru' produse ce conţin mai mult de 40°/o zahăr fermentabil, se utilizează mai mult de 5ml de suspensie de drojdie (3.1). 1O. Determinarea potasiului1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine nivelul de potasiu din furaje. 2. Principiu Proba este calcinată iar cenuşa dizolvată în acid clorhidric. Conţinutul în sodiu al soluţiei este determinat prin fotometrie cu flacără, în prezenţa clorurii de cesiu şi a azotatului de aluminiu. Adăugarea acestor substanţe elimină în mare măsură interferenţa elementelor perturbatoare. 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric p.a., d= 1,12g/ml. 3.2. Clorură de cesiu p.a 3.3. Azotat de aluminiu Al (NO3)3 x9 H2O, reactiv cu scop general. 3.4. Clorură de potasiu p.a. , anhidra. 3.5. Agent de încărcare: se dizolvă 50 g de clorură de cesiu (3.2) şi 250g de azotat de aluminiu în apă (3.3), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 3.6. Soluţie standard de potasiu: se dizolvă 1,907g de clorură de potasiu în apă (3.4), se adaugă 5ml de acid clorhidric (3.1), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 1ml al acestei soluţii conţine 1,00mg de potasiu. 4. Aparatură 4.1. Creuzete din platină, siliciu sau porţelan, prevăzute, dacă e necesar, cu capace. 4.2. Cuptor electric cu termostat. 4.3. Flamfotometru 5. Procedură 5.1. Analiza probei Ca regulă generală, se cântăresc 1O g din probă, cu o aproximaţie de 10mg, se plasează într-un creuzet şi se calcinează la 450°C, timp de trei ore. După răcire se transferă cantitatea de cenuşă într-un balon gradat de 500ml, utilizându se 250-300ml de apă şi se adaugă apoi 50ml de acid clorhidric (3.1). Când a încetat eliberarea de dioxid de carbon, se încălzeşte soluţia şi se menţine temperatura la aproximativ go0c, timp de două ore, agitându-se ocazional. După răcire la temperatura camerei, se completează până la semnul cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se transferă într-un balon gradat de 100ml o portiune alicota din filtratul ce conţine maxim 1,0 mg de potasiu, se adaugă 10,0 ml de agent de încărcare (3.5), se completează până la semnul cu apă şi se omogenizează. În cazul unor cantităţi de potasiu mai mari, se diluează soluţia ce trebuie analizată în proporţii potrivite, înainte de a se adăuga agentul de încărcare. Tabelul de mai jos e dat ca un ghid pentru o probă de aproximativ 1Og. Continut presupus de potasiu din proba(% K) Factor de dilutie Parte alicota in ml pana la 0,1 - 50 0.1 pana la 0.5 - 10 0.5 pana la 1.0 - 5 1.0 pana la 5.0 1:1O 10 5.0 pana la 1O.O 1:10 5 1O.O pana la 20.0 1:20 5 Se măsoară prin fotometrie cu flacără la o lungime de undă de 768nm. Se calculează rezultatul prin intermediul curbei de calibrare. 5.2. Curbă de calibrare Se plasează exact 10ml de soluţie standard (3.6) într-un balon gradat de 250ml, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se plasează în baloane gradate de 100ml exact 5,1O,15, 20 şi 25ml din această soluţie, corespunzând respectiv la cantităţile de potasiu de 0,2, 0,4, 0,6, O, 8 şi 1,0mg/ml. Se completează seriile cu baloane martor ce nu conţine soluţie standard. Se adaugă 1O ml de agent de încărcare (3.5) fiecărui balon, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se efectuează măsurătorile, aşa cum s-a indicat la 5.1. Curba de calibrare este în general aliniată la concentraţia de potasiu de 1mg la 100ml de soluţie. 6. Calcularea rezultatelor Se exprimă rezultatul ca procent din probă. 7. Observatii Nu es'te întotdeauna necesar să se adauge agentul de încărcare (3.5) pentru a se elimina interferenţa elementelor perturbatoare. 11. Determinarea sodiului1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil2i determinarea nivelului de sodiu din furaje. 2. Principiu Proba este calcinată iar cenuşa dizolvată în acid clorhidric. Conţinutul în sodiu al soluţiei este determinat prin fotometrie cu flacără, în prezenţa clorurii de cesiu şi a azotatului de aluminiu. Aditia acestor substante elimină în mare măsură interferenţa elemen'telor perturbatoare.' 3. Reactivi 3.1. Acid clorhidric p.a., d= 1,12g/ml. 3.2. Clorură de cesiu p.a 3.3. Azotat de aluminiu Al (N03)3 x9 H20, reactiv cu scop general. 3.4. Clorură de potasiu p.a. , anhidra. 3.5. Agent de încărcare: se dizolvă 50 g de clorură de cesiu (3.2) şi 250g de azotat de aluminiu în apă (3.3), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 3.6. Soluţie standard de sodiu: se dizolvă în apă 2,542g de clorură de sodiu (3.4), se adaugă 5ml de acid clorhidric (3.1), se completează până la un litru cu apă şi se omogenizează. Se depozitează în sticle de plastic. 1ml din aceste soluţii conţine 1,00mg de sodiu. 4. Aparatură 4.1. Creuzete din platină, siliciu sau porţelan, prevăzute, dacă e necesar, cu capace. 4.2. Cuptor electric cu termostat. 4.3. Flamfotometru 5. Procedură 5.1. Analiza probei Ca regulă generală se cântăresc 1O g din probă, cu o aproximaţie de 10mg, se plasează într-un creuzet (4.2) şi se calcinează la 450°C timp de trei ore. Se evită supraîncălzirea(aprinderea). După răcire se transferă cantitatea de cenuşă într-un balon gradat de 500ml, utilizându-se 250- 300ml de apă şi se adaugă apoi 50ml de acid clorhidric (3.1). Când a încetat toată eliberarea de dioxid de carbon, se încălzeşte soluţia şi se menţine temperatura la aproximativ 90°C timp de două ore, agitându-se ocazional. După răcire la temperatura camerei, se completează până la semn cu apă, se omogenizeaza şi se filtrează. Se transferă într-un balon gradat de 100ml o portiune alicota din filtrat ce conţine un maxim de 1,0 mg de potasiu, se adaugă 10,0 ml de agent de încărcare (3.5), se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. În cazul unor niveluri de sodiu mai mari se diluează soluţia ce trebuie analizată în proporţii potrivite, înainte de a se adăuga agentul de încărcare. Tabelul de mai jos e redat ca ghid pentru o probă de aproximativ 1Og. Continut presupus de sodiu din probă (% Na) Factor de dilut,ie Parte alicota,tn ml pana la 0.1 - 50 0.1 până la 0.5 - 10 0.5 până la 1.0 - 5 1.0 până la 5.0 1:10 10 5.0 până la 1O.O 1:10 5 1O.O până la 20.0 1:20 5 Se măsoară intensitatea radiatiei emise la o lungime de undă de 589nm. Se calculează rezultatul prin intermediul curbei de calibrare. 5.2. Curbă de calibrare Se plasează exact 10ml de soluţie standard (3.6) într-un balon gradat de 250ml, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se plasează în baloane gradate de 100ml exact 5,1O,15,20 şi 25ml din această soluţie, corespunzând respectiv la cantităţi de sodiu de 0,2, 0,4, 0,6, O, 8 şi 1,0mg/ml. Se completează seriile cu balene martor ce nu conţin soluţie standard. Se adaugă 1O ml de agent de încărcare (3.5) fiecărui balon, se completează până la semn cu apă şi se omogenizează. Se efectuează măsurători, aşa cum s-a indicat la 5.1. Curba de calibrare este în general aliniată la concentraţia de sodiu de 1mg la 100ml de soluţie. 6. Calcularea rezultatelor Se exprimă rezultatul ca procent din probă. 7. Observatii 7.1. Pe' ntru produse ce conţin mai mult de 4% sodiu este preferabil să se calcineze substanţa timp de două ore într-un creuzet cu capac. După răcire se adaugă apă, se aduce apa în suspensie prin intermediul unui fir de platină, se usucă şi se calcinează din nou, timp de două ore, într-un creuzet cu capac. 7.2. Dacă proba constă numai din substanţe minerale, se dizolvă fără o calcinare prealabilă. 12. Determinarea zahărului1. Scop şi domeniu de aplicare Această metodă face posibil să se determine cantitatea de zaharuri reduse şi toate zaharurile după inversie, exprimată ca glucoză sau când este cazul ca sucroză, convertită de factorul 0,95. Această metodă este aplicabilă furajelor combinate. Sunt prevăzute metode speciale pentru alte furaje. Când este necesar, trebuie să fie măsurată separat lactoza şi trebuie să se tină cont de aceasta atunci când se calculează rezultatele. 2. P' rincipiul Extractia zaharurilor dintr-o probă cu un amestec.Clarificarea solutiei obtinute cu solutiile Carrez I si li.Separarea etanolului si determinarea zaharurilor cu reactiv Luff-Schoorl înainte si dupa invertire . 3. Reactivi 3.1. Etanol 40% (v/
v)d20 =0,948g/ml neutralizat m prezenta de fenolftaleină: 3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2.2H2O şi 3g de acid acetic glacial în apă. Se completează până la 100ml cu apă. 3.3. Soluţie Carrez li: se dizolvă 10,6g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN6), 3H2O în apă. Se completează până la 100ml cu apă. 3.4. Soluţie O,1% (w/
v)de metil oranj. 3.5. Acid clorhidric 4n. 3.6. Acid clorhidric O,1n. 3.7. Solutie de hidroxid de sodiu O,1n. 3.8. Reac'tiv Luff-Schoorl 3.8.1 Soluţie de cupru: se dizolvă 25g de sulfat de cupru p.a CuSO4x 5H2O (fara) fier, în 100ml de apă. 3.8.2 Soluţie de acid citric: se dizolvă 50g de acid citric A.R., C6HaO7xH2O în 50ml de apă. 3.8.3 Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8g de carbonat de sodiu anhidru p.a. în aproximativ 300ml de apă calda. Se lasă sa se raceasca. Amestecand cu atentie, se pune soluţia de acid citric (3.8.2) peste soluţia de carbonat de sodiu (3.8.3). Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (3.8.1) şi se completează până la un litru cu apă. Se lasă in repaus peste noapte şi apoi se filtrează. Se verifica normalitatea reactivului astfel obţinut (Cu O,1 N;Na2CO3 2N). PH-ul soluţiei trebuie să fie de aproximativ 9,4.Se lasa sa se raceasca. 3.9. Soluţie de tiosulfat de sodiu O,1n. 3.1O. Soluţie de amidon: Sg de amidon solubil dizolvat în 30ml de apă se fierb intr-un litru de apa, trei minute, se lasă să se răcească şi dacă e necesar, se adaugă 10mg de iodură de mercur ca prezervativ. 3.11. Acid sulfuric 6N. 3.12. Soluţie 30% (w/
v)de iodură de potasiu. 3.13. Piatră ponce granulată, fiartă în acid clorhidric, spălată în apă şi uscată. 3.14. 3-metilbutan-1-ol. 4. Aparatură Mixer(agitator) cu f ecvenţă rotatorie de 35-40 rpm. 5. Procedură 5.1. Extracţia probei Se cântăresc 2,5g din probă cu o aproximaţie de 1mg şi se introduc într-un balon cotat de 250ml. Se adaugă 200ml de etanol (3.1) şi se agita mecanic timp de o oră. Se adaugă 5ml de soluţie Carrez I (3.2) şi se agită timp de un minut apoi se mai adaugă 5ml de soluţie Carrez li (3.3) agitand din nou, timp de 1 minut. Se completează la volum cu etanol (3.1), se omogenizează şi se filtrează. Se reţin 200ml din filtrat şi se evaporă la aproximativ jumătate din volum, pentru a se elimina majoritatea etanolului. Se transferă întreaga cantitate din reziduul de evaporare într-un balon cotat de 200ml, utilizându se apă fierbinte, se răceşte, se aduce la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează, dacă este necesar. Această soluţie va fi utilizată pentru a se determina cantitatea de zaharuri reduse şi după invertire, a zaharului total. 5.2. Determinarea zaharurilor reducatoare Utilizându-se o pipetă, se ia o cota parte din filtrat(5.1) sa nu depaseasca 25ml de soluţie si care sa nu conţin mai puţin de 60mg de zaharuri reduse, exprimate ca glucoză. Dacă e necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă distilată şi se determină conţinutul de zaharuri reduse prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent al glucozei din probă. 5.3. Determinarea zaharurilor totale după invertire Utilizându-se o pipetă, se iau 50ml de soluţie şi se transferă într-un balon cotat de 100ml. Se adaugă câteva picături de soluţie de metil oranj (3.4) apoi, cu grijă şi agitând continuu, se adaugă acid clorhidric 4N (3.5), până când lichidul virează spre un roşu accentuat. Se adaugă 15ml de acid clorhidric O,1 N (3.6), se imersează rapid balonul într-o baie de apă la fierbere şi se ţine acolo timp de 30 de minute. Se răceşte rapid la aproximativ 20°c şi se adaugă 15ml de soluţie de hidroxid de sodiu O,1n. Se completează apoi până la 100ml cu apă şi se omogenizează. Se reţin cel mult 25ml ce conţin mai puţin de 60mg de zaharuri reduse exprimate ca glucoză. Dacă e necesar se iau mai putin de 25ml si se completează până la 25ml cu apă distilată şi se determină conţinutul de zaharuri reduse prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul este exprimat ca procent de glucoză sau, unde e cazul, sucroză, multiplicându se cu factorul 0,95. 5.4. Ti

Explicație AI pe baza textului oficial al legii. Orientativă, nu înlocuiește consilierea juridică.