Arrêté du 1 octobre 1968 relatif aux méthodes officielles de recherches des résidus de pesticides dans le vin, les jus de raisins, la farine, les frui

PRINCIPE La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est exécutée après oxydation préalable à l'eau de brome par la méthode électrométrique de Michel. La technique consiste à mesurer l'abaissement de pH produit par la libération d'acide acétique. MATERIEL Tubes à essai, diamètre extérieur 2 cm, hauteur 11 cm. pH mètre (de préférence à bande étalée). Commutateur multiple à main pour mesures alternées de pH. Quatre électrodes de verre combinées. Bain-marie avec thermostat à 25° C. REACTIFS NECESSAIRES

1. a)Eau de brome : diluez extemporanément 0,2 ml d'eau de brome saturée dans 50 ml d'eau distillée.
2. b)Tampon de Michel : Barbital sodique ... 1,237 g. Phosphate monopotassique ... 0,136 g. Chlorure de sodium ... 17,535 g. Eau distillée ... 900 ml. Ajustez à pH 8 avec 11,6 ml d'HCl 0,1 N et complétez à 1000 ml avec de l'eau distillée.
3. c)Sérum de poulain filtré sans antibiotique. Ampoule de 10 ml. Institut Pasteur. Sérum de poulain ... 1 ml. Tampon de Michel ... 9 ml. Eau distillée ... 11 ml.
4. e)Solution de chlorhydrate d'acétylcholine : solution extemporanée à 1 p 100 (0,25 g dans 25 ml d'eau distillée).
5. f)Solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100. MODE OPERATOIRE Extraction Suivre la technique indiquée dans la méthode colorimétrique (3 A). DOSAGE POTENTIOMETRIQUE Prenez quatre tubes de 25 ml environ pouvant recevoir chacun une électrode combinée (calomel - verre), introduisez dans les numéros 2, 3 et 4 les volumes désirés d'extrait à analyser représentant 1 et (
6. ou)2 g d'échantillons, ajoutez 0,1 ml de solution f, évaporez presque à sec ces extraits à basse température et introduisez successivement dans tous les tubes les divers réactifs indiqués sur le tableau suivant : :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: Repos trois minutes. :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: Agitez. :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: Agitez et disposez au bain-marie à 25° les quatre tubes dans lesquels sont plongés les électrodes combinées. Après trois minutes, vérifiez que le pH est voisin de 8. Laissez incuber trente minutes à 25° (sans retirer les électrodes). :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHOto : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH01 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH02 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH03 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: Laissez hydrolyser trente minutes à 25° C (sans retirer les électrodes). :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHfto : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf1 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf2 : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf3 : :================================: :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :------------------: : Abaissement : DTo = : : du pH .. : (pH0to - pHfto) : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D1 = : : du pH .. : (pH01 - pHf1) : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D2 = : : du pH .. : (pH02 - pHf2) : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D3 = : : du pH .. : (pH03 - pHf3) : : : : :================================: :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : 0 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D1 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D2 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D3 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: NOTA - En raison de l'activité variable et inconnue des échantillons de sérum utilisés, il est conseillé de vérifier cette activité avant l'analyse des extraits. A cet effet, une mesure témoin sera effectuée au préalable, le sérum ne devant être considéré comme valable que si la valeur de l'abaissement du pH est supérieure à 0,8 unité de pH. RESULTATS La sensibilité de cette technique est supérieure à celle de la méthode colorimétrique. En raison des variations d'activité des produits techniques étalons, les doses inhibitrices suivantes pour le malathion et le parathion sont données à titre indicatif seulement. 1° Inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100. Les résultats obtenus indiquent que les prises d'essai renferment généralement moins de 0,05 micron de gramme d'insecticide organo-phosphoré. Nous avons noté par exemple qu'une inhibition de 5 p. 100 était obtenue avec : 0,03 micron de gramme de malathion. 0,01 micron de gramme de parathion produisent une inhibition de 10 p. 100. 2° Inhibition de 50 p. 100. L'inhibition de 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 0,16 micron de gramme de malathion et 0,08 micron de gramme de parathion. 3° Inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100. Cette inhibition est constatée respectivement pour : 0,59 micron de gramme de malathion et 0,60 micron de gramme de parathion. La définition de la dose réelle demande toujours une identification parallèle du produit actif. NOTA - Technique sans oxydation préalable à l'eau de brome. La suppression de l'étape d'oxydation à l'eau de brome rend la technique beaucoup moins sensible. A titre d'exemple, pour le parathion et le malathion, les sensibilités sont réduites aux valeurs suivantes : 1° L'inhibition voisine de 5 p. 100 est donnée par : 80 microns de grammes de malathion ou 0,85 micron de gramme de parathion. 2° L'inhibition de 50 p. 100 est donnée par : 400 microns de grammes de malathion ou 8 microns de grammes de parathion. 3° L'inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100 est donnée par : 1,400 microns de grammes de malathion ou 45 microns de grammes de parathion.