Arrêté du 1 octobre 1968 relatif aux méthodes officielles de recherche

Article 1 Les laboratoires chargés de concourir à l'application de la réglementation relative à la répression des fraudes sont tenus d'employer les méthodes décrites en annexe pour la recherche des résidus de pesticides dans le vin, les jus de raisin, la farine, les fruits, les légumes, le beurre, le lait et les agrumes. Article 16 PRINCIPE Après extraction de l'isopropanol et le cyclohexane, le biphényle est dosé par spectrophotométrie ultra-violette sur le dixième de l'extrait tandis que l'o-phényl phénol est dosé par chromatographie gazeuse ou par colorimétrie sur le reste, après destruction des matières naturelles interférentes extraites. Réactifs

a)Mélanges acide sulfurique 36° B et eau : aux 2/3, 1/2, 1/5 et 1/10 en volumes.
b)Solution de bichromate de potassium à 3 p. 100 dans l'acide sulfurique au demi.
c)Soude 1 N et 0,1 N.
d)Solution de carbonate de sodium à 5 p. 100.
e)Cyclohexane. Purifiez au laboratoire le produit commercial de qualité "réactif pur" par agitation avec 10 p. 100 de son volume de bichromate sulfurique (réactif b), laissez en contact 1 heure au moins en agitant périodiquement avant de séparer la phase aqueuse. Ajoutez une quantité supplémentaire de bichromate sulfurique si ce réactif est devenu bleu (réduction complète). Lavez ensuite deux fois le solvant à l'eau distillée, une fois avec la solution de carbonate de sodium (réactif d), enfin deux fois à l'eau distillée.
f)Solution de biphényle à 2, 4 et 8 mg par litre dans le cyclohexane purifié préparées par dilutions successives pour effectuer l'étude du spectre d'absorption entre 200 et 300 nm.
h)Ether de pétrole 40-65° purifié et redistillé.
j)Solution d'o-phényl phénol à 1,0 g par litre dans l'éther de pétrole.
l)Solution aqueuse titrée à 0,2 mg d'o-p p par ml obtenue par dilution au 1/5 d'une solution d'o-phényl phénate de sodium au 1,129 g par litre.
m)Solution diluée d'acide phosphorique à 30 p. 100 en volume (1 ml de cette solution abaisse à un pH voisin de 10,5, 10 ml de soude N).
n)Solution tampon 0,2 M de Soerensen : pH 10,45. Na2CO3 0,14 M soit 14,85 g par litre. Na3HCO3 0,06 M soit 5,04 g par litre.
o)Solution à 1 p. 100 de 4 amino antipyrine (à conserver en flacon jaune).
p)Solution à 2 p. 100 de ferricyanure de potassium (extemporanée). MODE OPERATOIRE 1. Préparation de l'échantillon et extraction Pesez quatre fruits entiers, détachez entièrement l'écorce et calculez le pourcentage en poids de zestes (100 p). La fraction décimale correspondante étant désignée par la lettre p. Broyez les zestes et pesez exactement 12,00 g de broyat homogène, 12 quantité équivalente à l'écorce de -- grammes de fruit entier. p Introduisez cette prise d'essai dans un flacon de 1 litre à fermeture étanche. Ajoutez 50 ml d'isopropanol. Mixez quelques secondes pour homogénéiser. Ajoutez 30 ml de cyclohexane (qui servent préalablement au rinçage du mixeur). Ajoutez 2 ml d'acide sulfurique au 1/10. Agitez mécaniquement pendant 15 mn. Filtrez le liquide à travers un tampon de laine de verre dans un ballon jaugé de 100 ml. Exprimez les zestes. Reprenez les zestes broyés avec 25 ml de cyclohexane et agitez mécaniquement pendant 10 mn. Filtrez le liquide en recevant le filtrat dans le même ballon. Exprimez les zestes de manière à ajuster à 100 ml exactement. Homogénéisez le contenu du ballon. 2. Essais qualitatifs
a)Recherche du biphényle Dans un tube conique gradué de 15 ml muni d'un bouchon rodé introduisez : 1 ml d'extrait cyclohexane-isopropanol. 3 à 4 ml d'eau distillée. Agitez et après repos notez le volume de la phase cyclohexane séparée (0,5 ml normalement). Injectez 2 microlitres de cette phase (demeurée dans le tube conique) pour exécuter une chromatographie gazeuse dans les conditions indiquées ci-dessous avec le détecteur à ionisation de flamme : Chromatographe à détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène ; Colonne inox 1,50 m - 3,12 mm garnie de 5 p. 100 de SE 30 sur chromosorb W HMDS 60/80 mesh ; Température du four de la colonne : 135 à 160° C ; Température de l'injecteur : 140 à 165° ; Débit du gaz vecteur : azote 20 ml par minute. Sensible à moins de 10 ng de biphényle, cet essai en permet la perception de moins de 5 mg/kg dans le fruit analysé. Aucune interférence naturelle surchargeant le pic du biphényle au-dessus de 5mg/kg apparents n'ayant été observée, cet essai informe correctement sur l'opportunité de poursuivre l'analyse pour un contrôle du respect de la tolérance (70 mg/kg).
b)Recherche de l'o-phényl phénol L'examen de la fluorescence d'une phase aqueuse alcaline séparée de l'extrait cyclohexane-isopropanol renseigne sur la présence d'o-phényl phénol. Cette recherche qualitative sera effectuée dans les conditions du dosage afin d'éviter des manipulations inutiles si son résultat est positif. Elle constitue la phase préliminaire au dosage et sera décrite plus loin, au paragraphe 5, b. 3. Développements de l'analyse Le développement de l'analyse est conditionné par la nécessité ou non du dosage du biphényle, ainsi que par la possibilité d'utilisation d'un chromatographe, d'où deux éventualités. a') Le dosage du biphényle est inutile (la chromatographie gazeuse en a montré l'absence ou une teneur très inférieure à la tolérance). Utilisez la totalité de l'extrait pour l'étude du résidu d'o-phényl phénol. b') le dosage du biphényle est nécessaire (soit que la chromatographie gazeuse ait révélé sa présence en large quantité, soit que cette mesure n'ait pu être effectuée par défaut de chromatographie). Il sera prélevé exactement 10 ml d'extrait cyclohexane-isopropanol pour le dosage (ou la recherche et le dosage) du biphényle. La recherche et le dosage de l'o-phényl phénol seront exécutés sur le reste de l'extrait, soit les 9/10 de la prise d'essai. 4. Dosage du biphényle
a)Dosage par chromatographie gazeuse La recherche qualitative (paragraphe 2-a précédent) renseigne sur la teneur approximative en biphényle et demeure une mesure suffisante si la valeur trouvée est inférieure à 50 mg/kg. Pour un dosage correct aux teneurs voisines de la tolérance, le dosage par spectrophotométrie est nécessaire.
b)Dosage par spectrophotométrie ultra-violette Technique avec procédé de purification chimique Préparation de l'extrait à analyser : Si l'essai sur l'extrait cyclohexane-isopropanol a été positif, introduisez successivement dans une ampoule à décantation de 125 ml : 20 ml d'eau distillée ; 10 ml de soude N ; 15 ml de cyclohexane, et 10 ml exactement mesurés de l'extrait brut ajusté à 100 ml (soit 1,2 l'équivalent de 1,2 g de zestes ou encore --- g de fruit entier). p Agitez vigoureusement et laissez reposer jusqu'à bonne séparation des phases. Vidangez la phase hydro-alcoolique, lavez la phase organique deux fois avec 5 ml d'eau distillée. Recueillez la phase organique dans un ballon jaugé de 25 ml, complétez au trait avec 5 ml environ de cyclohexane utilisé au préalable pour rincer l'ampoule et le bécher intermédiaire. Purification de l'extrait et dosage spectrophotométrique Dans une ampoule à décantation de 125 ml introduisez 25 ml de bichromate sulfurique (réactif
b)et 10 ml de l'extrait ci-dessus ajusté à 25 ml. Mouillez le bouchon rodé avec une goutte d'acide sulfurique au demi et agitez 1 mn environ à trois reprises au moins. La durée totale du contact sera au moins égale à 1 h et pourra être prolongée quelques heures ou une nuit si les conditions de travail rendent cet intervalle pratique. Vidangez ensuite la phase aqueuse, lavez successivement la phase organique avec 10 et 5 ml d'eau distillée, ensuite avec 10 ml de solution de carbonate de sodium et enfin avec 10 et 5 ml d'eau distillée. Décantez le cyclohexane dans un bécher sec renfermant 1 g de sulfate de sodium anhydre et de celui-ci dans un ballon jaugé de 20 ml. Rincez l'ampoule avec 10 ml de cyclohexane et transvasez ce solvant successivement dans le bécher et le ballon jaugé. Complétez à 20 ml et agitez. Effectuez les mesures spectrophotométriques avec des cuves en quartz de 1 cm d'épaisseur. Tracez le spectre de 200 à 300 nm afin de contrôler l'identité du produit dosé. Le biphényle présente un maximum d'absorption à 248 nm. Calcul du résultat La relation entre la concentration et la densité optique est donnée par la droite d'étalonnage entre 1 et 8 mg par litre : c = k D248 où c = concentration en mg de biphényle par litre. D248 = densité optique mesurée à 248 nm par rapport au cyclohexane dans une cuve de 1 cm d'épaisseur. Soit D248 la densité optique obtenue, la teneur en biphényle du fruit analysé est égale à : 20 p 25 5 p Q mg/kg = (k D248 -----) (--- x --) 1.000 = ---- k D248 1.000 1,2 10 0,12 soit pour k = 9,4 par exemple : Q mg/kg = (5
p)78,3 D248. Le rendement de l'ensemble de la technique est égal à 90 plus ou moins 5 p. 100. La teneur réelle en biphényle des fruits analysés est donc obtenue en multipliant par 1,1 la valeur donnée par l'analyse. 5. Recherche et dosage de l'o-phényl phénol (o-p p). La présence de l'o-p p est vérifiée par l'examen de la fluorescence très intense, pour des teneurs voisines de la tolérance, de l'extrait alcalin sous lumière ultra-violette. Le dosage éventuel est exécuté ensuite (après destruction ménagée des substances naturelles) : Soit par chromatographie gazeuse ; Soit par colorimétrie au moyen de la réaction d'Emerson (action de la 4 amino antipyrine, en présence d'un oxydant et en milieu alcalin, sur les phénols).
a)Traitement de l'extrait brut Relargage du cyclohexane Introduisez la totalité de l'extrait cyclohexane-isopropanol, dans le cas où le dosage du biphényle n'est pas nécessaire ou les 9/10 de cet extrait dans le cas contraire dans une ampoule à décantation de 500 ml. Dans chaque cas, le prélèvement de 1 ml effectué pour la recherche qualitative du biphényle (phase aqueuse et cyclohexane) sera ajouté au contenu de l'ampoule de 500 ml. Ajoutez : 50 ml d'acide sulfurique au 1/10 et 200 ml d'eau distillée. Agitez vigoureusement. Après repos vidangez la phase aqueuse dans un vase, sans la jetez, et décantez la phase cyclohexane dans un bécher sec de 100 ml et de celui-ci dans une ampoule de 125 ml. Reversez la phase aqueuse dans l'ampoule de 500 à trois reprises pour l'épuiser successivement avec 15 - 10 et 10 ml d'éther de pétrole avant de la jeter. Mélangez les extraits éthérés au cyclohexane dans l'ampoule de 125 ml. Extraction du phényl phénate et vérification de sa présence Dans une ampoule de 125 ml, épuisez les extraits éther-cyclohexane successivement par 10 et 10 ml de soude N suivis d'une dernière extraction avec 5 ml de soude N dilués par 5 ml d'eau distillée. Conservez les phases aqueuses renfermant l'o-phényl phénate de sodium. L'examen sous irradiation ultra-violette (356
nm)de ces solutions aqueuses alcalines renseigne sur la possibilité de présence de l'o-p p. Les substances naturelles donnent au liquide irradié une légère fluorescence verte, surtout manifeste sur la couche supérieure du liquide irradié. La présence d'o-p p à une teneur égale à 1 mg/kg dans le fruit donne déjà à la masse du liquide une fluorescence bleue très nette. Pour des teneurs voisines de la tolérance (10 mg/
kg)la fluorescence observée est particulièrement intense. Destruction ménagée des substances naturelles gênantes Les phases alcalines, soit au total l'équivalent de 25 ml de soude N sont rassemblées dans une ampoule à décantation de 125 ml. Neutralisez et acidifiez le milieu par addition de 5 ml d'acide sulfurique au 1/5. Ajoutez 25 ml d'éther de pétrole purifié. Agitez. Ajoutez 10 ml d'acide sulfurique aux 2/3 en volume. Agitez à plusieurs reprises pendant 5 mn. Après un repos suffisant pour la séparation des phases, vidangez la phase aqueuse et ajoutez 10 ml d'acide sulfurique aux 2/3. Agitez à plusieurs reprises pendant 10 à 15 mn, laissez reposer. Vidangez la phase acide. Lavez l'éther avec 5 ml d'acide sulfurique au 1/10, puis avec 5 ml d'eau distillée. La phase éthérée demeurée dans l'ampoule sera traitée différemment selon que l'on désire doser l'o-p p : par chromatographie gazeuse avec vérification possible par colorimétrie. ou par colorimétrie seulement.
b)Dosage par chromatographie gazeuse Conditions opératoires Colonne 1,5 m 1/8" inox garnie de Carbowax 4000-acide téréphtalique (Wilkens Instrument, Aérograph fournisseur) à 20 p. 100 sur Chromosorb W HMDS 80/100. Température 160°. - Elution de l'o-p p en 9-10 mn. Dans ces conditions le temps de rétention relatif de l'o-p p par rapport au biphényle - qui chromatographie également sur cette colonne - est égal à 4,2. Dosage Décantez l'éther demeuré dans l'ampoule, dans un bécher de 50 ml et de celui-ci dans un tube conique gradué de 15 ml afin de le concentrer progressivement par évaporation à 2 ml ou à 1,8 ml lorsque 10 ml de l'extrait primitif auront été pris pour le dosage du biphényle. Rincez l'ampoule et le bécher avec un minimum (5 ml d'éther de pétrole). Une attention particulière sera portée à réaliser cette concentration sans pertes. Pour cela, il convient d'opérer au-dessus d'un bain-marie sans plonger le tube dans la vapeur, l'évaporation étant obtenue sous jet d'air froid. Le contenu du tube ne devra pas être évaporé à sec, ce qui entraînerait des pertes élevées. Injectez 2 microlitres d'extrait Calcul concentré à 2 ml ou à 1,8 ml. Soit n microgrammes par microlitre la teneur en o-p p de l'extrait concentré à 2 ml ou à 1,8 ml. La teneur correspondante en o-p p de fruit analysé est égale à : n Q mg/kg = 100 p. --- 0,6 Le rendement de l'ensemble de la technique est égal à 77 plus ou moins 4 p. 100. La teneur réelle en o-p p des fruits analysés est donc obtenue en multipliant par 1,25 la valeur donnée par l'analyse.
c)Dosage colorimétrique Etalonnage Dans six ballons jaugés de 50 ml, introduisez successivement, en agitant après chaque addition : 0 0,5 1 2 3 et 4 ml de solution

(1)(soit 0,1 0,2 0,4 0,6 et 0,8 mg d'o-p

p): Un volume d'eau distillée suffisant pour obtenir approximativement 30 ml de liquide dans chaque ballon. 10 ml exactement de solution tampon (n). 1 ml de chacun des réactifs (
o)et (p). Complétez à 50 ml avec de l'eau distillée. Déterminez la densité optique à 510 nm en effectuant les mesures avec des cuves de 1 cm d'épaisseur. Il peut être constaté ici que la densité optique du témoin par rapport à de l'eau distillée est négligeable. L'étalonnage est traduit par la relation : q = k'x D510 avec q = mg d'o-p p dans la prise d'essai. (à titre indicatif K' a été trouvé égal à 1,6 dans les conditions ci-dessus). Technique 1° Cas d'un contrôle colorimétrique après chromatographie gazeuse Dans le tube conique gradué à bouchon rodé renfermant l'extrait éthéré (2 ou 1,8
ml)ajoutez 10 ml de soude N. Bouchez et agitez. Après repos, éliminez par aspiration l'éther épuisé. Si nécessaire, éliminez le reste du solvant surnageant par évaporation sous un jet d'air froid. Transvasez la solution alcaline dans un ballon jaugé de 50 ml, rincez le tube avec 10 ml exactement de solution tampon (
n)et 10 ml environ d'eau distillée. Ajoutez au milieu 1 ml de solution d'acide phosphorique (m). Introduisez 1 ml de chacun des réactifs (
o)et (p), complétez à 50 ml avec de l'eau distillée. Calcul - La teneur correspondante en o-p p dans le fruit analysé est égale à : p Q'mg/kg = -- 1000 (k' D510) 12 10 1 (ou bien les -- de cette valeur lorsque le -- de l'extrait brut a 9 10 été utilisé pour le dosage du biphényle). Pour tenir compte du rendement de l'ensemble de la technique, la teneur réelle en o-p p du fruit analysé est obtenue en multipliant par 1,25 la valeur donnée par l'analyse. 2° Cas d'un contrôle colorimétrique sans analyse préalable par chromatographie gazeuse Si la chromatographie gazeuse n'est pas envisagée, il est inutile de concentrer à 2 ml l'extrait éthéré purifié. En ce cas, la technique devient : Après le lavage à l'eau distillée et sans retirer de l'ampoule les 25 ml d'extrait traité à l'acide sulfurique (cf. paragraphe 5, a extrayez le phénate au moyen de 10 et 10 ml de soude N suivis d'un rinçage avec 10 ml d'eau distillée en recevant les phases aqueuses dans un ballon jaugé de 50 ml. Ajoutez 2,0 ml de solution d'acide phosphorique (m), 10 ml exactement de tampon (
n)et 1 ml de chacun des réactifs (
o)et (
p)en agitant toujours après chaque addition. Complétez à 50 ml avec de l'eau distillée et mesurez l'intensité de la teinte rouge obtenue à 510 nm et dans des cuves de 1 cm d'épaisseur. Le calcul est identique au précédent (paragraphe 5, c, 1°). METHODES DE DOSAGE DU BIPHENYLE ET DE L'O-PHENYL PHENOL APRES ENTRAINEMENT A LA VAPEUR D'EAU Se reporter aux techniques décrites dans le Journal officiel des communautés européennes (11 juillet 1967, numéros 148/4 à 148/9). Article ANNEXE I 1 PRINCIPE Le résidu laissé par l'extrait éthéré (éther de pétrole) du vin ou du jus de raison est minéralisé par combustion dans l'oxygène par la méthode de Schöniger. Les halogénures formés sont dosés par colorimétrie après formation de thiocyanate ferrique. La réaction colorée, sensible à 0,01, 0,02 et 0,04 mg de chlore, brome et iode, respectivement, permet, à partir d'une prise d'essai de 100 ml de vin ou de jus de raisin, de contrôler la présence des insecticides organochlorés usuels à des teneurs supérieures ou égales à 0,2 mg/l 1. (Les insecticides organochlorés renferment de 10 à 76 p. 100 de chlore dans leur molécule). Les essais effectués à ce jour situent entre 0,00 et 0,15 mg/l (exprimée en chlore) la teneur en halogène des vins, et entre 0,0 et 0,2 mg/l 1 (exprimée en chlore) la teneur en halogène des jus de raisin. MATERIEL Ampoule à décantation de 500 ml. Evaporateur rotatif sous vide. Appareil de mise à feu de sécurité, avec fioles de 1000 ml. Papier à combustion. Seringue ou pipette effilée. Bouteille d'oxygène. Agitateur magnétique. Photomètre pour mesures dans le visible. REACTIFS
a)Ether de pétrole 40-65° redistillé.
b)Acétone redistillée.
c)Sulfate de sodium cristallisé pur.
d)Solution absorbante : Carbonate de sodium pur ... 1 g Anhydride arsénieux ... 0,25 g Eau distillée ... 500 ml
e)Acide perchlorique à 65 p. 100 R.P..
f)Alcool à 95° redistillé sur potasse.
g)Solution ferrique. Dans un bécher de 250 ml, introduire 50 g d'alun de fer ammoniacal, 40 ml d'acide perchlorique à 65 p. 100, 100 ml environ d'eau distillée. Agiter. Aider la dissolution par séjour au bain-marie. Après refroidissement, transvaser dans un ballon jaugé de 200 ml et compléter au trait de jauge avec les eaux de rinçage du bécher.
h)Solution de thiocyanate mercurique : Saturer à chaud (en tiédissant au bain-marie bouillant) 200 ml d'alcool à 95° (réactif
f)avec 0,40 g de thiocyanate mercurique. Introduire dans le flacon du réactif l'alcool saturé, ainsi que l'excès de sel non dissout.
i)Solution de référence : Solution-mère à 1000 mg de chlore par litre : dans un ballon jaugé de 100 ml, introduire 0,165 g de NaCl exactement pesés, les dissoudre dans de l'eau distillée et compléter au trait de jauge. Solution à 20 microgrammes de chlore par ml : diluer de 5 à 250 ml la solution précédente. Lavez l'éther de pétrole de la deuxième ampoule avec 20 ml environ d'eau distillée. Décantez la phase éthérée de la deuxième ampoule par son orifice supérieur dans la première ampoule. Lavez les phases éthérées réunies avec 20 ml d'eau distillée après vidange de l'eau, décantez la phase éthérée dans un petit bécher sec et de celui-ci dans le ballon de 100 ml de l'évaporateur rotatif (en plusieurs fois). Evaporez sous vide, en aidant l'évaporation du solvant par un léger réchauffement du ballon. Dissolvez le résidu de l'évaporation par de l'acétone redistillée de manière à pouvoir le déposer en totalité au moyen de plusieurs lavages sur le papier spécial pour combustion maintenu au moyen de pinces, pour éviter toute souillure. Pliez le papier et insérez-le dans le panier en platine suspendu au bouchon de la fiole à combustion. Introduisez dans la fiole à combustion de 1000 ml : 15 ml exactement de solution absorbante d et un barreau magnétique. Déplacez l'air par un flux d'oxygène. Bouchez la fiole. Enflammez le papier dans le dispositif de sécurité. Retirez la fiole et déposez-la sur un agitateur magnétique. La fiole ne sera ouverte qu'après vingt minutes d'agitation. L'atmosphère à l'intérieur du ballon étant alors parfaitement éclaircie. Colorimétrie Prélevez exactement 10 ml de liqueur absorbante de la fiole à combustion et introduisez-les dans un ballon jaugé de 25 ml. Ajoutez ensuite, dans l'ordre, en agitant après chaque addition : 4 ml d'acide perchlorique à 65 p. 100 ; 5 ml de solution ferrique f ; 5 ml de solution de thiocyanate mercurique g. Complétez à 25 ml avec de l'eau distillée. Agitez. Après cinq minutes de repos, mesurez la teinte rouge obtenue à 460 microns dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport à un témoin préparé à partir de 10 ml de solution absorbante et des différents réactifs. Soit Dx la valeur de la densité optique observée. Calcul Le résultat sera calculé à partir d'une droite d'étalonnage obtenue à partir des mesures colorimétriques données par 0 - 10 - 20 ... 200 microgrammes de chlore dans la prise d'essai, c'est-à-dire en introduisant dans des ballons de 25 ml 0 - 0,5 - 1 ... 10 ml de solution à 20 microgrammes de Cl par ml. A titre d'indication, on notera que des mesures d'étalonnage exécutées avec un spectrophotomètre ont été traduites par les relations : Q/Cl mg = (0,24 plus ou moins 0,01) D/460 ; Q/Br mg = (0,52 plus ou moins 0,03) D/460 Q/Cl étant la quantité de chlore en microgrammes dans la prise d'essai. Pour tenir compte des traces d'halogènes apportées par les réactifs, il convient de retrancher à la densité optique Dx obtenue la valeur correspondant à l'ensemble des réactifs. Pour cela, il convient de réaliser un dosage complet à partir de 60 ml d'eau distillée et 125 ml d'éther de pétrole. La densité optique obtenue à la suite de cet essai à blanc est voisine de 0,03. L'analyse colorimétrique étant effectuée sur les 10/15 de la prise d'essai primitive, soit 100 ml d'échantillon, le résultat sera, par exemple, avec l'étalonnage précédent : (Dx - 0,03) 0,24 x 10 = 2,4 (Dx - 0,03) mg/l de Cl. RAISINS Prélèvement et extraction Opérez comme indiqué dans la méthode I-6. Utilisez 120 g de bouillie fluide pour l'extraction avec 100 et 75 ml d'éther de pétrole. Dosage Suivez la technique I-1. Calcul L'analyse colorimétrique étant effectuée sur 80 g d'échantillon, le résultat devient : 3 (Dx - 0,03) mg/kg de Cl. Article ANNEXE I 2 PRINCIPE Le résidu laissé par l'extrait benzénique du vin ou du jus de raisin est minéralisé par combustion dans l'oxygène, par la méthode de Schöniger. Après hydrolyse des pyrophosphates formés, les phosphates sont dosés par colorimétrie après réduction du phosphomolybdate d'ammonium. La réaction colorée sensible à 5 microgrammes de phosphore permet, à partir d'une prise d'essai de 200 ml de vin ou de jus de raisin, de contrôler la présence d'insecticides organo-phosphorés (qui renferment entre 8 et 14 p. 100 de phosphore), à des teneurs supérieures à 0,3 mg/l. Les essais effectués à ce jour situent à moins de 0,03 mg par litre la teneur en phosphore organique extrait des vins ou des jus de raisin. MATERIEL Identique à celui de la méthode n° 1. REACTIFS
a)Benzène pur redistillé.
b)Sulfate de sodium cristallisé pur.
c)Solution pour l'imprégnation du papier. NaOH ... 2,5 g. Eau distillée ... 10 ml. CH2 OH ... 90 ml.
d)Solution H2SO4 N.
e)Réactif molybdique : Peser 8,3 g de molybdate d'ammonium tétrahydraté (ou 7,5 g de molybdate de sodium di-hydraté) et les dissoudre dans 200 ml d'eau distillée en tiédissant. Laissez refroidir et ajouter 100 ml d'acide chlorhydrique pur. Diluer à 500 ml avec de l'eau distillée. Mélanger. Le réactif limpide peut être utilisé immédiatement.
f)Acétate d'éthyle.
g)Solution aqueuse d'hydroquinone à 2 p. 100. A conserver au réfrigérateur et à rejeter après brunissement.
h)Solution d'acide chlorhydrique dilué au 1/10 en volume.
i)Solution aqueuse de sulfite de sodium anhydre à 15,5 g pour 100 ml.
j)Solution titrée de phosphate : Solution-mère : dissoudre 4,394 g de phosphate monopotassique pur dans de l'eau distillée, amener à 1 litre dans un ballon jaugé après avoir introduit 5 ml de chloroforme. Solution de travail à 25 microgrammes de P (phosphore) par ml. Prendre 5 ml de solution-mère et les diluer à 200 ml dans un ballon jaugé. MODE OPERATOIRE Extraction Dans un flacon émeri de 500 ml, introduisez : 250 ml de vin ou de jus de raisin ; 20 à 25 g de sulfate de sodium cristallisé ; 200 ml de benzène redistillé. Après cinq minutes d'agitation mécanique, introduisez l'extrait dans une ampoule à décantation. Après un repos suffisant pour une complète séparation des phases, évacuez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation. Lavez la phase benzénique au moyen de 20 à 25 ml d'eau distillée qui sont ensuite récupérés dans la deuxième ampoule. Ajoutez 100 ml de benzène dans la deuxième ampoule et agitez modérément pendant deux à trois minutes. Après séparation, évacuez la phase aqueuse. Lavez la phase benzénique avec 20 ml d'eau distillée. Les phases benzéniques réunies sont lavées avec 20 à 25 ml d'eau distillée. Après vidange de l'eau, filtrez la phase benzénique sur papier dans le ballon de l'évaporateur rotatif. Evaporez sous vide en plongeant le ballon dans un bain-marie à 50-60° C et le récepteur dans de l'eau glacée. Combustion Plongez le papier spécial pour combustion, maintenu au moyen de pinces, dans la solution c. Faites sécher sous jet d'air froid. Dissolvez le résidu de l'évaporation par de l'éther sulfurique de manière à le déposer en totalité au moyen de plusieurs lavages sur le papier à combustion. (Lorsque l'évaporation aura été réalisée dans un ballon de grande capacité : 500 à 1000 ml, transvasez dans un premier temps le résidu d'évaporation dans un petit bécher de 50 ml au moyen de quatre ou cinq lavages par 5 ml d'éther sulfurique. Evaporez la presque totalité de l'éther, rincez les parois du bécher avec de l'éther et déposez l'extrait éthéré sur le papier au moyen d'une seringue). Pliez le papier et insérez-le dans le panier en platine suspendu au bouchon de la fiole à combustion. Veillez à ce que le panier soit à la distance la plus grande possible des parois du ballon, à 2 cm environ au-dessus du liquide absorbant, si nécessaire au moyen d'une rallonge en verre résistant à la chaleur placée entre le crochet du bouchon rodé et le panier. Introduisez dans la fiole à combustion de 1000 ml : 20 ml de solution N d'acide sulfurique ; Un barreau magnétique. Déplacez l'air par un flux d'oxygène. Bouchez la fiole. Enflammez le papier dans le dispositif de sécurité. Retirez la fiole et déposez-la sur un agitateur magnétique. La fiole ne sera ouverte qu'après vingt minutes d'agitation, l'atmosphère à l'intérieur du ballon étant parfaitement éclaircie. Prélevez 16 ml exactement de solution de la fiole à combustion, et introduisez-les dans un ballon à fond rond de 250 ml. Maintenez une douce ébullition sous reflux pendant trente minutes. Dosage colorimétrique Après refroidissement dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduisez : Le contenu du ballon et 4 ml d'eau distillée de rinçage ; 4 ml de réactif molybdique ; 20 ml d'acétate d'éthyle. Agitez modérément pendant une minute, laissez reposer cinq minutes. Agitez énergiquement pendant 1 minute. Une seule extraction suffit. Evacuez la phase aqueuse sans perte de la phase organique. Décantez la phase acétate d'éthyle par l'orifice supérieur de l'ampoule, dans une deuxième ampoule à décantation propre. Ne pas rincer. Introduire ensuite, en agitant après chaque addition de réactif : 1 ml de sulfite de sodium anhydre à 15,5 p. 100 ; 14 ml d'eau distillée ; 1 ml d'hydroquinone à 2 p. 100 ; 1 ml d'acide chlorhydrique au dixième. Agitez énergiquement ; laissez reposer jusqu'à séparation complète des deux phases (au moins 15 minutes) et vidangez ensuite la phase aqueuse colorée en bleu dans un ballon de 20 ml. Rincez l'ampoule avec 1 ou 2 ml d'eau distillée, laissez reposer et complétez à 20 ml avec cette eau de lavage. Mélangez le contenu du ballon. Mesurez l'absorption de la solution limpide par rapport à celle de l'essai témoin (préparé à partir de 10 ml d'eau distillée et des différents réactifs) dans des cuves de 1 cm d'épaisseur, au moyen d'un photocolorimètre muni d'un écran rouge (écran n° 70 de Jobin et Yvon), ou à l'aide d'un spectrophotomètre à 720 nm. Le résultat sera calculé à partir d'une droite d'étalonnage obtenue à partir des mesures colorimétriques données par l'équivalent de 25-50 et 75 microgrammes de phosphore (soit 1,2 et 3 ml de solution titrée de travail) en suivant la même technique. A titre d'indication, on notera que des mesures d'étalonnage ont été traduites par la relation : q mg = (0,190 plus ou moins 0,004) x D720 q mg étant la quantité de phosphore en milligrammes dans la prise d'essai. L'analyse colorimétrique étant effectuée sur les 8/10 de la prise d'essai primitive, soit 200 ml de vin, le résultat sera, par exemple avec l'étalonnage précédent. (0,190 x 5 x D) mg de P par litre ou (0,95 x D) mg de P par litre. Article ANNEXE I 3 A PRINCIPE La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est réalisée par la méthode colorimétrique d'Hestrin. L'acétylcholine réagit avec l'hydroxylamine pour former de l'acide hydroxamique qui, en présence d'ion ferrique, donne un complexe coloré en rouge. En présence de la pseudo cholinestérase du sérum qui hydrolyse l'acétylcholine, cette réaction ne se produit pas. En présence d'un composé organophosphoré inhibiteur de l'enzyme, l'hydrolyse de l'acétylcholine ne se produit pas et la réaction est par suite possible. L'inhibition du volume précis de sérum sanguin utilisé dans la technique étant obtenue par des quantités limitées de chacun des insecticides organophosphorés, la méthode réalisée à partir d'une prise d'essai primitive de 10 ml de vin ou de jus de raisin, subdivisée en deux essais différents correspondant à l'équivalent de 4 et 2 ml de boisson, permet d'apprécier soit : L'absence d'une dose supérieure à 0,05 mg/l d'insecticide organophosphoré si la réaction est négative ; La possibilité d'une dose supérieure à 0,25 mg/l d'insecticide organophosphoré si la réaction est positive ; Enfin, la teneur réelle lorsque l'insecticide est identifié par une technique exécutée séparément. MATERIEL Ampoule à décantation de 125 ml. Bain-marie bouillant. Tube à essai de 25 ml rodage émeri. Bain-marie à 37,5° C. Spectrophotomètre pour mesures dans le visible. REACTIFS NECESSAIRES
a)Benzène pur redistillé.
b)Solution tampon : 12,52 g de Na2, HPO6, 7 OH8 ou 16,7 g de Na2 HPO4 à 12 OH2. 2,72 g de KH2, PO4. Eau distillée Q. S. 1 litre. Le pH doit être égal à 7,2.
c)Solution de brome : 0,4 ml de solution d'eau de brome saturée. Eau distillée Q. S. P. 100 ml.
d)Solution de pseudo-cholinestérase : 2 ml de sérum sanguin. Tampon Q. S. P. 25 ml.
e)Solution acétylcholine : 0,138 g chlorhydrate d'acétylcholine. Tampon Q. S. P. 100 ml.
f)Solution alcaline d'hydroxylamine : 1. Solution de chlorhydrate d'hydroxylamine : 13,9 NH2, OH HC1. Eau distillée Q. S. P. 100 ml. 2. Solution de soude : 14 g Na OH. Eau distillée Q. S. P. 100 ml. Mélanger les solutions 1 et 2 à parties égales.
g)Solution d'acide trichloracétique : 10 g d'acide trichloracétique. 30 ml d'acide chlorhydrique pur. 70 ml d'eau distillée.
h)Solution de perchlorure de fer : 10 g de Fe Cl3, 6 OH2 (ou 22,4 ml de solution Codex). Acide chlorhydrique 0,1 N Q. S. P. 100 ml. MODE OPERATOIRE Extraction Dans une ampoule à décantation de 125 ml, introduire : 10 ml de vin ou de jus de raisin ; 20 ml de benzène. Agitez modérément pendant cinq minutes. Laissez reposer. Agitez à nouveau et laissez reposer jusqu'à complète séparation des deux phases. Centrifugez les extraits si une légère émulsion persiste. Vidangez le vin ou le jus de raisin. Décantez la phase benzénique par l'orifice supérieur de l'ampoule dans un petit bécher sec. Prélevez respectivement 8 et 4 ml de l'extrait benzénique et introduisez-les dans deux tubes à essai à rodage émeri. Evaporez juste à sec au bain-marie sous un courant d'air froid projeté au niveau du solvant au moyen d'une canne de verre. Dosage colorimétrique Dans une série de tubes à essai à rodage émeri numérotés, introduisez : :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 7 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 0 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 4 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 0 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Eau distillée .. : 1,8 ml : : Eau de brome .. : 0,2 ml : : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : Solution : : : cholinestérase .. : 2 ml : : : : :================================: Portez au bain-marie à 37,5° pendant trente minutes. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 0 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Solution : : : acétycholine .. : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution : : : acétylcholine .. : 3 ml : : : : :================================: Portez au bain-marie à 37,5° pendant trente minutes. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution alcaline : : : d'hydroxylamine .. : 6 ml : : : : :================================: Attendre une minute. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Solution acide : : : trichloracétique ..: 3 ml : : Solution : : : Fe Cl2 ... : 3 ml : : : : :================================: Filtrez et mesurez la densité optique à 540 mn dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport au témoin tube n° 0. :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : 0,00 : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : Dm : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : DM : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : Dx4 : : : : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :-----------: : Densité optique : : : lue .. : Dx2 : : : : :================================: :================================: : : 0 : : : Tube : : : témoin : : :-----------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Minimum : : :-----------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : 0 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Maximum : : :-----------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. :100 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Résidu de : : : 4 ml de : : : boisson : : :----------------: : Pourcentage : (Dx4 - Dm) 100 : : d'inhibition : -------------- : : : (DM - Dm) : :================================: :================================: : : 4 : : : Résidu de : : : 2 ml de : : : boisson : : :----------------: : Pourcentage : (Dx2 - Dm) 100 : : d'inhibition : -------------- : : : (DM - Dm) : :================================: RESULTATS 1. Les densités optiques Dx 4 et Dx 2 indiquent une inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100. On peut considérer globalement que ces résultats indiquent que les prises d'essai renferment moins de 0,2 micron de gramme d'insecticide organophosphoré. Nous avons noté les valeurs suivantes : 0,05 micron de gramme de phosphamidon. 0,14 micron de gramme de parathion. 0,15 micron de gramme de malathion. En tenant compte de l'essai sur 4 ml de boisson, ce résultat exprime l'absence d'insecticide organophosphoré à des doses supérieures à 0,05 mg/l. 2. Les densités optiques indiquent une inhibition supérieure à 90 p. 100. S'il est possible de donner une dose moyenne minimale d'insecticide organophosphoré pour la limite inférieure de sensibilité de la méthode, la diversité des produits ne permet pas de donner une dose moyenne pour une inhibition supérieure ou égale à 90 p. 100. Cette dose sera, par exemple, de : 0,5 micron de gramme pour le parathion. 5 microns de grammes pour le phosphamidon. 12 microns de grammes pour le malathion. La définition de la dose réelle demande une identification parallèle du produit actif. Dans le cas des quatre produits cités, si Dx 2 montre une inhibition supérieure à 90 p. 100, la teneur sera respectivement supérieure à 0,25-2,6 et 6 mg/kg. Dans l'ignorance de la qualité de l'insecticide organophosphoré présent, ce résultat pourra être interprété comme l'indication d'une teneur en insecticide organophosphoré supérieure à 0,25 mg/kg. 3. L'une ou les deux mesures Dx 4 et Dx 2 indiquent les inhibitions comprises entre 5 et 90 p. 100. L'interprétation du résultat dépend également ici de la connaissance du produit actif décelé. Les deux volumes 2 et 4 ml ont été choisis de manière à augmenter les chances de se trouver, dans l'un des cas, au voisinage de 50 p. 100 d'inhibition. L'inhibition 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 0,3 micron de gramme de parathion. 0,65 micron de gramme de phosphamidon. 1,8 microns de grammes de malathion. Après identification du produit existant, sa teneur sera déduite de la droite : pourcentage d'inhibition (en unités probits) par rapport aux logarithmes des doses précisées expérimentalement pour cet insecticide. Article ANNEXE I 3 B PRINCIPE La détermination de l'activité anticholinestérasique des extraits benzéniques du vin ou du jus de raisin est exécutée après oxydation préalable à l'eau de brome par la méthode électrométrique de Michel. La technique consiste à mesurer l'abaissement de pH produit par la libération d'acide acétique. MATERIEL Tubes à essai, diamètre extérieur 2 cm, hauteur 11 cm. pH mètre (de préférence à bande étalée). Commutateur multiple à main pour mesures alternées de pH. Quatre électrodes de verre combinées. Bain-marie avec thermostat à 25° C. REACTIFS NECESSAIRES
a)Eau de brome : diluez extemporanément 0,2 ml d'eau de brome saturée dans 50 ml d'eau distillée.
b)Tampon de Michel : Barbital sodique ... 1,237 g. Phosphate monopotassique ... 0,136 g. Chlorure de sodium ... 17,535 g. Eau distillée ... 900 ml. Ajustez à pH 8 avec 11,6 ml d'HCl 0,1 N et complétez à 1000 ml avec de l'eau distillée.
c)Sérum de poulain filtré sans antibiotique. Ampoule de 10 ml. Institut Pasteur. Sérum de poulain ... 1 ml. Tampon de Michel ... 9 ml. Eau distillée ... 11 ml.
e)Solution de chlorhydrate d'acétylcholine : solution extemporanée à 1 p 100 (0,25 g dans 25 ml d'eau distillée).
f)Solution aqueuse de glycérine à 10 p. 100. MODE OPERATOIRE Extraction Suivre la technique indiquée dans la méthode colorimétrique (3 A). DOSAGE POTENTIOMETRIQUE Prenez quatre tubes de 25 ml environ pouvant recevoir chacun une électrode combinée (calomel - verre), introduisez dans les numéros 2, 3 et 4 les volumes désirés d'extrait à analyser représentant 1 et (
ou)2 g d'échantillons, ajoutez 0,1 ml de solution f, évaporez presque à sec ces extraits à basse température et introduisez successivement dans tous les tubes les divers réactifs indiqués sur le tableau suivant : :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Eau de brome : : : diluée .. : 0,2 ml : : : : :================================: Repos trois minutes. :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Solution : : : tampon .. : 2 ml : : : : :================================: Agitez. :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Sérum : : : tamponné .. : 2 ml : : : : :================================: Agitez et disposez au bain-marie à 25° les quatre tubes dans lesquels sont plongés les électrodes combinées. Après trois minutes, vérifiez que le pH est voisin de 8. Laissez incuber trente minutes à 25° (sans retirer les électrodes). :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHOto : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH01 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH02 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pH03 : : Ajoutez 1 ml : : : de solution : : : d'acétylcholine : 1 ml : : : : :================================: Laissez hydrolyser trente minutes à 25° C (sans retirer les électrodes). :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHfto : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf1 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf2 : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-------------: : Prenez le pH : : : après ces trente : : : minutes .. : pHf3 : :================================: :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :------------------: : Abaissement : DTo = : : du pH .. : (pH0to - pHfto) : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D1 = : : du pH .. : (pH01 - pHf1) : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D2 = : : du pH .. : (pH02 - pHf2) : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :------------------: : Abaissement : D3 = : : du pH .. : (pH03 - pHf3) : : : : :================================: :================================: : : To : : : Témoin zéro : : :-------------: : Pourcentage : : : d'inhibition .. : 0 p. 100 : : : : :================================: :================================: : : 1 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D1 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: :================================: : : 2 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D2 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: :================================: : : 3 : : : Extrait : : :-----------------: : Pourcentage : DT0 - D3 : : d'inhibition : -------- : : : 0,01xDT0 : : : : :================================: NOTA - En raison de l'activité variable et inconnue des échantillons de sérum utilisés, il est conseillé de vérifier cette activité avant l'analyse des extraits. A cet effet, une mesure témoin sera effectuée au préalable, le sérum ne devant être considéré comme valable que si la valeur de l'abaissement du pH est supérieure à 0,8 unité de pH. RESULTATS La sensibilité de cette technique est supérieure à celle de la méthode colorimétrique. En raison des variations d'activité des produits techniques étalons, les doses inhibitrices suivantes pour le malathion et le parathion sont données à titre indicatif seulement. 1° Inhibition nulle ou inférieure à 5 p. 100. Les résultats obtenus indiquent que les prises d'essai renferment généralement moins de 0,05 micron de gramme d'insecticide organo-phosphoré. Nous avons noté par exemple qu'une inhibition de 5 p. 100 était obtenue avec : 0,03 micron de gramme de malathion. 0,01 micron de gramme de parathion produisent une inhibition de 10 p. 100. 2° Inhibition de 50 p. 100. L'inhibition de 50 p. 100 est obtenue respectivement avec : 0,16 micron de gramme de malathion et 0,08 micron de gramme de parathion. 3° Inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100. Cette inhibition est constatée respectivement pour : 0,59 micron de gramme de malathion et 0,60 micron de gramme de parathion. La définition de la dose réelle demande toujours une identification parallèle du produit actif. NOTA - Technique sans oxydation préalable à l'eau de brome. La suppression de l'étape d'oxydation à l'eau de brome rend la technique beaucoup moins sensible. A titre d'exemple, pour le parathion et le malathion, les sensibilités sont réduites aux valeurs suivantes : 1° L'inhibition voisine de 5 p. 100 est donnée par : 80 microns de grammes de malathion ou 0,85 micron de gramme de parathion. 2° L'inhibition de 50 p. 100 est donnée par : 400 microns de grammes de malathion ou 8 microns de grammes de parathion. 3° L'inhibition égale ou supérieure à 90 p. 100 est donnée par : 1,400 microns de grammes de malathion ou 45 microns de grammes de parathion. Article ANNEXE I 4 PRINCIPE L'extraction des pesticides est réalisée par l'éther de pétrole. Après évaporation de l'extrait, le résidu est chromatographié sur plaque imprégnée de gel de silice G. Merck lavée à l'eau distillée avant activation. L'élution est effectuée au moyen du mélange éther de pétrole et méthanol. Les spots sont révélés par irradiation de lumière ultra-violette à 254 microns de grammes des plaques traitées au réactif de Mitchell. Des quantités de l'ordre de 2 microgrammes de pesticides organo-halogénés peuvent être détectées très nettement, permettant à la présente méthode de révéler des doses d'insecticides organohalogénés à des doses supérieures de 0,1 mg/l avec des prises d'essai de 25 ml de vin ou de jus de raisin. MATERIEL Ampoules à décantation de 250 ml. Evaporateur rotatif ou bain-marie avec soufflerie d'air froid. Dispositif pour chromatographie en couche mince (le matériel Desaga a été utilisé). Cuve 36 X 28 X 26 cm (de chromatographie sur papier). Etuve. Lampe U-V émettrice de radiations à 254 et 360 microgrammes. REACTIFS
a)Ether de pétrole 40-65° redistillé.
b)Alcool méthylique redistillé sur potasse.
c)Acétone redistillée.
d)Sulfate de sodium cristallisé pur.
e)Gel de silice G. de Merck.
f)Mélange colorant d'essai de Desaga.
g)Réactif de révélation de Mitchell. Dissoudre 1,7 g de nitrate d'argent dans 5 ml d'eau distillée ; ajouter 10 ml de 2-phénoxyéthanol et compléter à 200 ml avec de l'acétone. Ajouter deux gouttes d'eau oxygénée à 30 p. 100. Conserver le réactif à l'abri de la lumière et dans un flacon en verre coloré. Conservation quinze jours au maximum.
h)Mélange éluant : h1) Ether de pétrole 40-65° redistillé, additionné de 1 p. 100 de méthanol redistillé sur potasse. h2) Ether de pétrole à 7 p. 100 de méthanol.
k)Solution "k" : huile de paraffine à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole. PREPARATION DES PLAQUES L'étalement des couches est obtenu avec le matériel Desaga Standard, en utilisant un mélange de : 25 g de gel de silice G ; 50 ml d'eau distillée, immédiatement étalé sur plaques de verre 20 X 20 cm. Les plaques obtenues sont séchées douze heures environ à l'air du laboratoire, dans une atmosphère à l'abri des vapeurs d'acide chlorhydrique. Les plaques sèches sont ensuite lavées soigneusement à l'eau distillée. A cette fin, elles sont disposées dans une cuve à chromatographie renfermant une couche de 1 cm d'eau distillée. Une épaisse couche de papier filtre sec est placé au-dessus des plaques, au contact de celles-ci, de manière à absorber l'eau lorsqu'elle a parcouru toute la longueur de la plaque. La cuve est fermée et l'ensemble est abandonné quatre heures au moins, ou mieux une nuit. Après ce lavage continu à l'eau distillée, les plaques sont abandonnées à l'air pour un séchage progressif (une à deux heures), et ensuite portées exactement une heure à l'étuve à 110° C. Après refroidissement dans l'exsiccateur Novus, les plaques sont prêtes à l'emploi. La migration de l'eau ayant été réalisée dans le sens de l'étalement de la couche, une bande de 1 cm environ, baignant dans l'eau, s'est désagrégée pendant le lavage. Afin d'éviter l'utilisation d'une trop grande quantité de solvant éluant, les spots seront disposés à 5 cm du bord opposé, la migration des spots devant s'effectuer dans le sens inverse de celui de la migration de l'eau distillée. TECHNIQUE Extraction Introduisez successivement, dans une ampoule à décantation : 50 ml de vin ou de jus de raisin. 10 g environ de sulfate de sodium cristallisé. 50 ml d'éther de pétrole. Agitez pendant cinq à dix minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation. Lavez l'éther de pétrole par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée. Ajoutez 50 ml d'éther de pétrole dans la deuxième ampoule, agitez modérément et laissez reposer. Rejetez la phase inférieure de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois l'éther de la première ampoule avec 10 ml environ d'eau distillée qui est encore utilisée pour laver l'éther de la deuxième ampoule. Réunissez les deux phases éthérées dans une éprouvette. Divisez l'extrait en deux parties égales dans deux béchers secs et après avoir ajouté 0,5 ml de solution k pou réduire les pertes de HCH et de gamma HCH, évaporez presque à sec au bain-marie, en projetant un jet d'air froid sur la surface du liquide. Cette évaporation pourra être réalisée dans un appareil rotatif à vide ; en ce cas, une attention particulière sera apportée à la récupération de la totalité de l'extrait réparti sur les parois du ballon. Chromatographie La chromatographie sera exécutée sur deux plaques distinctes pour utiliser les deux modes d'élution. Dépôt des spots : Par des lavages répétés à l'éther de pétrole, transférez, au moyen d'une seringue, le résidu d'évaporation, correspondant ici à 25 ml d'échantillon, sur la position de départ de la chromatographie. Si l'évaporation a été faite dans un ballon (évaporateur rotatif) de capacité importante, rincez en un premier temps le ballon avec quelques ml d'acétone redistillée, à plusieurs reprises, en collectant les liqueurs de lavage dans un petit bécher de 50 ml ; évaporez juste à sec l'acétone, lavez les parois du bécher avec un minimum d'éther de pétrole et déposez cette dernière solution sur la plaque. Les positions de départ sont disposées de 2 en 2 cm sur une ligne distante de 5 cm du bord de la plaque (côté opposé à celui qui a trempé dans l'eau). Les deux spots extrêmes étant à 3 cm des bords, huit positions sont disponibles. Des solutions titrées de références seront toujours disposées sur chaque plaque pour contrôler la sensibilité et identifier éventuellement les produits décelés. 5 microlitres de solution de références contenant respectivement 1 g par litre de chacun des insecticides à rechercher, pourront être déposés soit séparément, soit simultanément si leurs Rf le permettent. La dernière position sera occupée par quatre microlitres du mélange de colorants ; ces derniers ne sont pas séparés par le mélange à 1 p. 100 de méthanol mais ils migrent avec des Rf voisins de 0,53 - 0,56 et 0,88 avec le mélange à 7 p. 100. Elution La (ou les) plaques sont introduites dans la petite cuve pour chromatographie en couche mince, dont l'atmosphère est saturée par l'introduction préalable du mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol dans l'éther de pétrole redistillé ou du mélange à 7 p. 100 de méthanol. La hauteur de solvant dans lequel trempe la plaque ne doit pas dépasser 0,5 cm. La chromatographie dure ainsi 45 minutes environ pour un déplacement du front au-dessus de la ligne zéro des spots de 10 cm environ. Notez la position du front dès la sortie des plaques de la cuve. Révélation des insecticides organochlorés : Après évaporation du solvant, pulvérisez sur toute la plaque le réactif révélateur de Mitchell. Irradiez la plaque sous un flux de lumière ultraviolette (254 microgrammes) pendant vingt minutes. Les taches des insecticides organochlorés sont visibles sur le fond fluorescent pendant l'irradiation et laissent des taches brunes sur fond blanc perceptibles pour des doses inférieures au microgramme, mais vraiment incontestables seulement au-dessus de 2 microgrammes. Les plaques ont tendance à brunir par la suite, mais la lecture est encore très nette vingt-quatre heures après la révélation. Les vins et les jus de raisin exempts d'insecticides organochlorés ne donnent aucune tache, à l'exception de la tache foncée du point de départ. L'identité des insecticides organochlorés éventuellement observés sera déduite par comparaison de leur Rf par rapport à ceux des témoins obtenus dans le même essai. Le dosage approximatif pourra être obtenu après un premier essai indicatif de la dose probable, par un deuxième essai encadré de doses croissantes entre 1 et 10 microgrammes de l'insecticide présumé. A titre indicatif, les Rf suivants ont été observés : Tableau 1 - Rf des insecticides organochlorés sur silicagel G. MERCK (élution avec de l'éther de pétrole à 1 p. 100 de méthanol) : HEOD ... 0,05 Endrine ... 0,07 HCH technique ... 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5 Gamma HCH ... 0,3 DDE technique ... 0,63 - 0,67 Zeidane ... 0,59 - 0,62 Heptachlore et heptachlore ep ... 0,65 - 0,68 Chlordane ... 0,6 - 0,65 - 0,7 Toxaphène ... Bande continue à 0,4 à 0,65 HHDN ... 0,75 - 0,95 Le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol sépare les insecticides organochlorés les plus polaires comme l'endrine, l'HEOD, le chlorobenzilate, le méthoxychlore et le phaltane ainsi que quelques composés simultanément organophosphorés et organohalogénés tels que le naled et le bromophos. Tableau 2 - Rf des insecticides organohalogénés sur Silicagel G. MERCK (élution avec l'éther de pétrole à 7 p. 100 de méthanol) : Naled ... 0,15 Dicofol ... 0,3 - 0,9 Phaltane ... 0,34 Chlorobenzilate... 0,38 Méthoxychlore ... 0,73 Bromophos ... 0,75 HEOD ... 0,76 Endrine ... 0,80 L'utilisation séparée des deux mélanges éluants donne plus de valeur au résultat qualitatif. Les pesticides correctement élués avec le mélange à 1 p. 100 de méthanol migrent avec le front du mélange à 7 p. 100, inversement les pesticides correctement élués avec le mélange à 7 p. 100 ne migrent pratiquement pas avec le mélange à 1 p. 100. Lorsque l'analyse par chromatographie en couche mince sera appliquée à l'étude des éluats E1 - E2 - E3 donnés par le fractionnement sur florisil, le mélange éluant à 1 p. 100 de méthanol sera utilisé dans le cas de l'éluat E13, tandis que le mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol sera réservé à la chromatographie des éluats E2 et E9. Article ANNEXE I 5 PRINCIPE L'extraction des pesticides est réalisée par le benzène. Après évaporation de l'extrait, le résidu est chromatographié sur plaque imprégnée de gel de silice G. Merck, lavée à l'eau distillée avant activation. L'élution est effectuée au moyen d'éther de pétrole à 7 p. 100 de méthanol. Les spots sont révélés au moyen de réactifs spécifiques des thiophosphates organiques. Des quantités de l'ordre de 0,5 microgramme d'insecticide organothiophosphoré sont détectées en présence de l'extrait de 50 ml de vin, permettant à la méthode de révéler des teneurs en insecticides thiophosphorés supérieures à 0,01 mg/l. MATERIEL Identique à celui de la méthode 4. REACTIFS Réactifs : a - b - d - e - f - h2 de la méthode 4.
i)Ether sulfurique fraîchement redistillé.
j)Réactifs pour la révélation des chromatogrammes : Solution A : Ester éthylique de la tétrabromophénolphtaléine (E. Kodak n° 6810) ... 0,10 g Acétone ... 50 ml Solution B : Nitrate d'argent ... 0,05 g Eau distillée ... 25 ml Dissoudre le sel et diluer à 100 ml avec de l'acétone distillée. Solution C : Acide citrique ... 5 g Eau distillée ... 50 ml Dissoudre l'acide dans l'eau et diluer à 100 ml avec de l'acétone distillée. PREPARATION DES PLAQUES Suivez la technique indiquée dans la méthode 4. TECHNIQUE Extraction Introduisez successivement dans une ampoule de décantation : 50 ml de vin ou de jus de raisin. 10 g environ de sulfate de sodium cristallisé. 50 ml de benzène. Agitez modérément pendant 5 à 10 minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, ou éventuellement une centrifugation, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule de décantation. Lavez le benzène par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée. Ajoutez 50 ml de benzène dans la deuxième ampoule, agitez et laissez reposer. Rejetez la phase inférieure de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois le benzène de la première ampoule avec 10 ml d'eau distillée qui est ensuite utilisée pour laver le benzène de la deuxième ampoule. Transvasez les phases benzéniques dans un bécher sec et de celui-ci dans un ballon de 100 ml de l'évaporateur rotatif (en deux temps). Evaporez juste à sec avec l'aide du vide et d'un léger réchauffement du ballon (50° C environ). Chromatographie Dépôt des spots Rincez les parois intérieures du ballon de l'évaporateur avec plusieurs petits volumes d'éther sulfurique, de manière à transposer la totalité du résidu dans un petit bécher (50 ml au maximum) ; évaporez l'éther sous jet d'air froid, lavez les parois du bécher avec un minimum d'éther de pétrole et déposez entièrement cette dernière solution sur la plaque. Plusieurs reprises à l'éther de pétrole sont nécessaires pour que le dépôt soit quantitatif. Des solutions titrées de référence seront toujours disposées sur chaque plaque pour contrôler la sensibilité et identifier éventuellement les produits décelés. 5 microlitres de solution de référence contenant respectivement 0,5 g par litre (dans l'éther de pétrole) de chacun des insecticides dont on désire contrôler la présence, pourront être disposés, soit séparément, soit simultanément en utilisant par exemple le mélange suivant : Azinphos - malathion - parathion-méthyl - fénitrothion - parathion. La dernière position sera occupée par 4 microlitres du mélange de colorants Desaga. Ce mélange devra être séparé : Le rouge Soudan G migre avec un Rf voisin de 0,53 ; L'indophénol migre avec un Rf voisin de 0,56 ; Le jaune beurre avec un Rf voisin de 0,88. Elution La plaque est introduite dans la petite cuve pour chromatographie en couche mince dont l'atmosphère est saturée par l'introduction préalable de mélange éluant à 7 p. 100 de méthanol dans l'éther de pétrole redistillée. La hauteur de solvant dans lequel trempe la plaque ne doit pas dépasser 0,5 cm. La chromatographie dure ainsi environ quarante-cinq minutes pour un déplacement du front au-dessus de la ligne de départ des spots de 10-11 cm environ. Notez la position du front dès la sortie des plaques de la cuve. NOTA - La migration des colorants renseigne sur la qualité de la séparation qui dépend en particulier de l'état de saturation de l'enceinte de la cuve et par suite de la température ambiante. Il est possible que l'opérateur soit amené à faire varier entre 6 et 8 p. 100 la concentration en méthanol pour tenir compte des conditions locales de température. Une enceinte thermostatique serait souhaitable. Révélation des insecticides organothiophosphorés. Le réactif j est spécifique des esters thiophosphoriques, l'intensité de la coloration variant avec la position du soufre dans la molécule. Il ne réagit pas avec les esters phosphoriques comme le mévinphos ne renfermant pas de soufre, et malgré la présence de nitrate d'argent, ne donne rien avec les insecticides organochlorés dans les conditions de son emploi. Après évaporation du solvant, pulvérisez successivement sur toute la surface de la plaque, au moyen de trois pulvérisateurs garnis au préalable des réactifs A, B et C ; 1° Le réactif A : indicateur coloré ; 2° Le réactif B : nitrate d'argent ; 3° Le réactif C : acide citrique ; Les extraits de 50 ml de vin, qui laissaient apparaître une légère traînée jusqu'au Rf 0,2 environ, avant la pulvérisation des réactifs, ne donnent plus aucune tache après pulvérisation des réactifs. Les colorants du mélange d'essai virent, à l'exception du rouge (qui le demeure) : au rouge pour le jaune beurre, au jaune pour le bleu qui disparaît ainsi dans le fond jaune. Les composés organo-thiophosphorés apparaissent en bleu vif sur fond jaune uni. La teinte bleu vif reste intacte pendant vingt à trente minutes, disparaît par la suite, mais laisse une trace encore perceptible après 24 heures. Les tâches sont très apparentes au-dessus de 1 microgramme. 0,5 microgramme constitue une limite moyenne raisonnable pour la perception, mais il est indiqué de chromatographier en même temps que les extraits du vin, l'insecticide ou les insecticides dont on désire vérifier l'absence. Cette assurance étant prise, l'absence de tache bleue dans la chromatographie d'un extrait de 50 ml de boisson indique que le produit examiné renferme moins de 0,01 mg/l desdits insecticides organothiophosphorés. L'identité des insecticides organo-thiophosphorés éventuellement observés sera déduite par comparaison de leurs Rf par rapport à ceux des témoins obtenus dans le même essai. Les valeurs suivantes des Rf, qui ne sont modifiés en présence de l'extrait du vin, ont été notées : Tableau 1 - Rf des insecticides organo-phosphorés sur Silicagel G. Merck (élution méthanol 7 p. 100) : Azinphos méthyl ... 0,21 Malathion ... 0,45 Phosalone ... 0,50 Parathion-méthyl ... 0,56 Fénitrothion ... 0,62 Diazinon ... 0,63 Phenthoate ... 0,68 Parathion ... 0,70 Bromophos ... 0,75 Fenthion ... 0,78 Carbophénothion ... 0,76 Notes : 1° Recherche de parathion : La révélation des pesticides organophosphorés possédant un groupement nitré, comme le parathion, peut être assurée très simplement par la pulvérisation d'une solution de potasse alcoolique 2 N. Les spots jaunes sont accentués après un séjour de cinq minutes à l'étuve à 110° et permettent de détecter 0,1 microgramme de parathion. Si"cette recherche est effectuée sur le cinquième de l'extrait benzénique, soit l'équivalent de 10 ml de boisson, elle assure le contrôle de l'absence de résidus de parathion à une teneur supérieure à 0,01 mg/l. 2° Recherches après élution sur Florisil : Lorsque l'analyse par chromatographie en couche mince sera appliquée à l'étude des éluats donnés par le fractionnement sur Florisil, il sera inutile de procéder à l'étude de l'Eluat E, qui ne renferme pas d'insecticides organophosphorés. Seuls les éluats E2 et E3 devront, dans ce cas, être étudiés. Article ANNEXE I 6 PRINCIPE L'extraction des pesticides est réalisée par l'éther de pétrole. Après purification par chromatographie sur colonne de florisil, la chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électrons permet de certifier l'absence d'un certain nombre d'insecticides au-dessus d'une concentration déterminée et très faible. La présomption de l'identité des produits éventuellement détectés avec celle d'un insecticide déterminé sera établie par la concordance de diverses informations données par l'analyse complète. MATERIEL Ampoules à décantation de 125 ml et 500 ml, à robinets téflon et bouchons de verre rodé, non graissés, équipés de manchon téflon. Evaporateur rotatif sous vide. Bain-marie. Colonne à chromatographie 20 X 600 mm à robinet téflon. Chromatographie à détecteur à capture d'électrons. Colonnes par chromatographie gazeuse : toute colonne généralement utilisée pour l'analyse des résidus de pesticides peut être prise, en particulier les colonnes en verre résistant à la chaleur 5° 1/8" garnies des phases DC 200 à 10 p. 100 ou QF 1 à 6 p. 100 sur un rapport habituel de 80/100 mesh, tel que le chromosorb G, etc.. Chromatographe à détecteur thermoionique et microcoulométrique. REACTIFS
a)Ether de pétrole purifié : L'éther de pétrole brut 40-65° ordinaire est agité mécaniquement trente minutes environ avec 5 p. 100 de son volume d'acide sulfurique concentré. Après repos, séparation de l'acide et lavage à l'eau distillée, l'éther est agité mécaniquement dans la même ampoule avec 5 p. 100 de son volume de lessive de soude 36° dilué au demi. Après repos et séparation de la phase alcaline, lavage à l'eau distillée, le milieu est à nouveau agité trente minutes avec environ 5 p. 100 de son volume d'acide sulfurique au cinquième en volume et 3 p. 100 de son volume de solution aqueuse de permanganate de potassium à 1 p. 100. L'éther purifié est ensuite rectifié dans une colonne rectificatrice sous un taux de reflux très faible qui permet une distillation rapide. L'appareil à distiller entièrement en verre ne sera muni que d'un seul robinet en téflon pour le réglage du taux de reflux. Essai de l'éther de pétrole purifié : Concentrez à 0,5 ml dans les conditions utilisées pour les recherches de résidus (évaporateur sous vide, ou bien jet d'air froid et filtré), 50 ml d'éther de pétrole préalablement desséché par 1 g de sulfate de sodium anhydre, en présence de 0,5 ml de solution d'huile de paraffine à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole anhydre. Au moyen d'une seringue propre de 10 microlitres, injectez 5 microlitres de cet extrait dans les conditions de la recherche de résidus. Il ne doit pas être observé de pic (en dehors du solvant), ou tout au moins il ne devra pas être observé de pic dépassant 10 p. 100 de l'échelle de l'enregistreur dans les conditions habituelles de sensibilité. Un pic de cet ordre pouvant être donné par environ 0,05 ng d'insecticide organochloré, la pureté de l'éther de pétrole utilisé équivaut alors à une teneur apparente en insecticide de l'ordre de 0,0001 mg/l, soit 0,1 microgramme.
b)Eau distillée lavée : Lavez l'eau distillée obtenue dans un appareil entièrement en verre par deux fois le quart environ de son volume d'éther de pétrole purifié. NOTA - L'eau minérale Charrier peut être utilisée au lieu et place d'eau distillée lavée.
c)Acétonitrile fraîchement distillé sur quelques gouttes d'acide phosphorique.
d)Sulfate de sodium cristallisé R.P..
e)Sulfate de sodium anhydre pur et florisil : Ces réactifs sont maintenus avant l'emploi quarante-huit heures au moins dans un four à 180° C.
f)Florisil : Le florisil est ensuite conservé dans une étuve à 130° C. Prélevez, douze à vingt-quatre heures avant l'emploi, 100 g de florisil dans un petit flacon poudrier et après refroidissement, ajoutez 5 ml d'eau distillée lavée. Bouchez et agitez pour homogénéiser. Chaque lot ainsi préparé sera utilisé dans les trois jours suivants, période pendant laquelle il sera conservé à la température ordinaire.
g)Solutions de références : A partir de produits étalons, préparez par dilutions successives des solutions de référence des insecticides à rechercher. La première solution relativement concentrée pourra être dans l'acétone, les dilutions suivantes dans l'éther de pétrole. Pour la recherche avec un détecteur à capture d'électrons de sensibilité moyenne, les dilutions finales seront préparées en fonction des réponses particulières de chaque insecticide, soit par exemple : 0,1 mg/l pour : gamma HCH, HCH, HHDN, HCB. 0,5 mg/l pour : HEOD, endrine. 1,0 mg/l pour zeidane, DDE, heptachlore, heptachlore-époxyde, dicofol, DDD, soufre, dichlofluanide, bromophos, phenthoate. 2,0 mg/l pour : chlordane, toxaphène. 5,0 mg/l pour : méthoxychlore, tétradifon, parathion, carbophénothion, diazinon. 20 mg/l pour : chlorobenzilate, dinocap.
h)Ether sulfurique : fraîchement redistillé, anhydre.
i)Mélange éluant : Ether sulfurique anhydre ... 20 volumes. Ether de pétrole purifié ... 80 volumes.
k)Solution à 1 p. 100 d'huile de paraffine dans l'éther de pétrole. TECHNIQUE Extraction du vin ou du jus de raisin Introduisez dans une ampoule à décantation : 100 ml de jus de raisin ou de vin. 10 g de sulfate de sodium cristallisé R.P. (à dissoudre progressivement). 75 ml d'éther de pétrole. Agitez modérément pendant cinq minutes et laissez reposer jusqu'à séparation des deux phases. Soutirez la phase aqueuse dans un bécher et décantez la phase éthérée dans un bécher renfermant 1 à 2 g de sulfate de sodium anhydre et de celui-ci dans un deuxième bécher sec avant transvasement dans le ballon de l'évaporateur rotatif. Epuisez à nouveau la phase aqueuse dans l'ampoule de 75 ml d'éther de pétrole. Après repos et séparation, transvasez la phase éthérée dans le ballon de l'évaporateur après décantations successives dans les deux béchers précédents. Ajoutez 1 ml de solution k et concentrez sous vide à basse température jusqu'à 10-15 ml environ. Extraction des raisins A partir de 2 kg de raisins, préparez un échantillon moyen de 600 g environ. Séparez les grains. Réduisez-les en bouillie au mixeur. Pesez 100 g de bouillie fluide et introduisez-les dans un flacon de 1 litre à large col. Ajoutez 100 ml d'éther de pétrole, traitez quelques secondes au mixeur, agitez mécaniquement 20 minutes. Versez le mélange hétérogène sur un filtre aluminium. Filtrez le liquide ainsi séparé sur un tampon de laine de verre en recevant les liqueurs dans une ampoule à décantation. Reversez la phase aqueuse et la pulpe retenue sur le filtre dans le flacon ; ajoutez 75 ml d'éther de pétrole, traitez quelques secondes au mixeur et agitez mécaniquement pendant 10 minutes. Filtrez la phase éthérée dans l'ampoule à décantation après en avoir retiré le premier extrait éthéré. Séparez la couche aqueuse. Lavez les phases éthérées rassemblées deux fois avec 10 ml d'eau distillée lavée. Séchez l'éther sur sulfate de sodium anhydre. Concentrez sous vide à basse température jusqu'à 10-15 ml environ. Purification de l'extrait
a)Préparation de la colonne : Tassez dans la colonne : 2,5 cm de sulfate de sodium anhydre. 5 cm environ de florisil (10 g). 2,5 cm de sulfate de sodium anhydre. Lavez le contenu de la colonne par 50 ml de mélange éluant suivi de 50 ml d'éther de pétrole purifié.
b)Opération : Après ce lavage, introduisez l'extrait éthéré concentré dans la colonne : rincez le ballon de l'évaporateur rotatif et les parois de la colonne avec de petites fractions d'éther de pétrole purifié prélevé sur une réserve de 100 ml. Recueillez l'éluat obtenu E1 dans un bécher de 150 ml. Introduisez ensuite successivement dans la colonne : 50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E2 ET 50 ml de mélange i pour obtenir l'éluat E3. Une liste (non limitative) des pesticides qui peuvent être séparés dans les différents éluats est donnée au tableau 1. TABLEAU N° 1 Séparation des pesticides donnée par la chromatographie sur la colonne de florisil indiquée. :================================: : Eluat E1 100 ml E.P. : :--------------------------------: : Soufre. : : HCB. : : HCH. : : Gamma HCH. : : Quintozène. : : Triallate (+). : : HHDN. : : : : Heptachlore. : : Heptachlore-époxyde. : : DDE. : : DDD. : : Chlordane. : : : : Zeidane. : : Toxaphène. : : : :================================: :================================: : Eluat E2 50 ml 4 : :--------------------------------: : Diallate. : : Triallate (+++). : : Diazinon (+++). : : Fénitrothion (++). : : Ronnel. : : Fenthion. : : Parathion. : : Dicofol. : : Bromophos. : : Phenthoate. : : 2,4-D-butyl glycol ester. : : Endosulfan. : : Chlorofénizon. : : : : HEOD. : : Endrine. : : Chlorobenzilate. : : 2,4-D-alkyl cyclohexanol : : ester (85 p. 100). : : 2,4,5-T-butyl glycol ester : : (85 p. 100). : : Diéthion. : : Carbophénothion. : : Méthoxychlore. : : Dinocap. : : Tétradifon. : : : :================================: :================================: : Eluat E3 50 ml 4 : :--------------------------------: : Parathion-méthyl. : : Dichlofuanide. : : Malathion. : : Diazinon (+). : : Fénitrothion (++). : : Phaltane. : : 2,4-D-alkyl cyclohexanol : : ester (15 p. 100). : : : : : : Endosulfan (2e pic) : : +++... E4. : : : : 2,4,5-T-butyl glycol ester : : (15 P. 100). : : : :================================: Analyse par chromatographie gazeuse L'éluat E12 après addition de 0,5 ml de solution k est préalablement concentré à 50 ml par évaporation au bain-marie et sous jet d'air froid. Les éluats E2 et E3 seront de même concentrés à 10 ml. Les conditions habituelles de l'analyse chromatographique ayant été préalablement mises au point avec l'appareil disponible, injectez 4 microlitres de chacun des éluats concentrés, sur colonne garnie de silicone DC 200 ou QF 1. En négligeant les pics donnés dans les conditions de travail favorables et par un détecteur de sensibilité moyenne par les quantités de pesticides indiquées dans la deuxième colonne du tableau suivant, l'injection effectuée permet d'assurer l'absence de teneurs supérieures à celles indiquées dans la troisième colonne du même tableau. Si jugé utile, la limite de sensibilité pourra être abaissée en concentrant à 10 ou 5 ml les éluats (4e colonne du tableau n° 2). TABLEAU N° 2 Limites de sensibilité de la méthode :================================: : : : : : A : : PESTICIDES : : : :------------: : : ng : : :------------: : Groupe 1 (E1) : : : HCB .. : 0,01 : : HCH .. : 0,05 : : Gamma HCH .. : 0,05 : : HHDN .. : 0,05 : : Quintozène .. : 0,075 : : DDE .. : 0,1 : : DDD .. : 0,1 : : Zeidane .. : 0,2 : : Heptachlore .. : 0,2 : : Heptachlore- : : : epoxyde .. : 0,2 : : Chlordane .. : 0,4 : : Toxaphène .. : 0,4 : : Soufre .. : 0,4 : : : : :================================: :================================: : : : : : B : : PESTICIDES : : : :---------------: : : à 50 ml : : :---------------: : Groupe 1 : : : (E1) : : : HCB .. : 0,002 : : HCH .. : 0,01 : : Gamma HCH .. : 0,01 : : HHDN .. : 0,01 : : Quintozène .. : 0,02 : : DDE .. : 0,02 : : DDD .. : 0,02 : : Zeidane .. : 0,05 : : Heptachlore .. : 0,05 : : Heptachlore- : : : epoxyde .. : 0,05 : : Chlordane .. : 0,1 : : Toxaphène .. : 0,1 : : Soufre .. : 0,1 : : : : :================================: :================================: : : : : : B : : PESTICIDES : : : :---------------: : : à 10 ml : : :---------------: : Groupe 1 : : : (E1) : : : HCB .. : 0,0004 : : HCH .. : 0,002 : : Gamma HCH .. : 0,002 : : HHDN .. : 0,002 : : Quintozène .. : 0,004 : : DDE .. : 0,004 : : DDD .. : 0,004 : : Zeidane .. : 0,01 : : Heptachlore .. : 0,01 : : Heptachlore- : : : epoxyde .. : 0,01 : : Chlordane .. : 0,02 : : Toxaphène .. : 0,02 : : Soufre .. : 0,02 : : : : :================================: :================================: : : : : : A : : PESTICIDES : : : :------------: : : ng : : :------------: : GROUPE 2 (E2) : : : Ronnel .. : 0,05 : : HEOD .. : 0,1 : : Endrine .. : 0,1 : : Triallate .. : 0,1 : : Fénitrothion .. : 0,1 : : Dicofol .. : 0,2 : : Bomophos éthyl .. : 0,2 : : Phenthoate .. : 0,2 : : Endosulfan .. : 0,4 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 0,4 : : Diéthion .. : 0,5 : : Méthoxychlore .. : 1 : : Tétradifon .. : 1 : : Parathion .. : 1 : : Carbophénothion . : 1 : : Chlorofénizon .. : 1 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 1 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 1 : : Diallate .. : 1 : : Diazinon .. : 2 : : Chlorobenzilate . : 4 : : Dinocap .. : 4 : : Fenthion .. : 40 : : : : :================================: :================================: : : : : : B : : PESTICIDES : : : :--------------: : : à 10 ml : : :--------------: : Groupe 2 (E2) : : : Ronnel .. : 0,002 : : HEOD .. : 0,004 : : Endrine .. : 0,004 : : Triallate .. : 0,004 : : Fénitrothion .. : 0,004 : : Dicofol .. : 0,01 : : Bomophos éthyl : 0,01 : : Phenthoate .. : 0,01 : : Endosulfan .. : 0,02 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 0,02 : : Diéthion .. : 0,025 : : Méthoxychlore . : 0,05 : : Tétradifon .. : 0,05 : : Parathion .. : 0,05 : : Carbophénothion : 0,05 : : Chlorofénizon . : 0,05 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 0,05 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 0,05 : : Diallate .. : 0,05 : : Diazinon .. : 0,1 : : Chlorobenzilate : 0,2 : : Dinocap .. : 0,2 : : Fenthion .. : 2 : : : : :================================: :================================: : : : : PESTICIDES : B : : : : : :--------------: : : à 5 ml : : :--------------: : Groupe 2 (E2) : : : Ronnel .. : 0,001 : : HEOD .. : 0,002 : : Endrine .. : 0,002 : : Triallate .. : 0,002 : : Fénitrothion .. : 0,002 : : Dicofol .. : 0,005 : : Bomophos éthyl : 0,005 : : Phenthoate .. : 0,005 : : Endosulfan .. : 0,01 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 0,01 : : Diéthion .. : 0,0125 : : Méthoxychlore . : 0,025 : : Tétradifon .. : 0,025 : : Parathion .. : 0,025 : : Carbophénothion : 0,025 : : Chlorofénizon . : 0,025 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 0,025 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 0,025 : : Diallate .. : 0,025 : : Diazinon .. : 0,05 : : Chlorobenzilate : 0,1 : : Dinocap .. : 0,1 : : Fenthion .. : 1 : : : : :================================: :================================: : : : : PESTICIDES : A : : : : : :------------: : Groupe 3 (E3) : : : Parathion-méthyl : 0,1 : : Dichlofluanide .. : 0,2 : : Phaltan .. : 0,8 : : Malathion .. : 1 : : : : :================================: :================================: : : : : PESTICIDES : B : : : : : :---------------: : : à 10 ml : : :---------------: : Groupe 3 (E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 0,005 : : Dichlofluanide : 0,01 : : Phaltan .. : 0,02 : : Malathion .. : 0,02 : : : : :================================: :================================: : : : : PESTICIDES : B : : : : : :---------------: : : à 5 ml : : :---------------: : Groupe 3 (E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 0,0025 : : Dichlofluanide : 0,005 : : Phaltan .. : 0,01 : : Malathion .. : 0,01 : : : : :================================: NOTA : A - QUANTITE MINIMALE considérée comme valable pour l'analyse. B - LIMITE THEORIQUE (en mg/
l)qui en résulte après injection de 4 microlitres d'éluat provenant de 100 ml de vin concentré. CALCUL Lorsqu'une réponse positive est enregistrée après chromatographie sur l'une des deux colonnes DC 200 ou QF 1, l'analyse sera répétée avec le même extrait sur la deuxième colonne. La présomption de la présence d'un insecticide déterminé sera donnée en première analyse par les critères suivants : Possibilité de la présence de ce produit dans l'éluat E1, E2, ou E3 ; Conformité des temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN dans les deux conditions opératoires différentes ; Conformité des résultats quantitatifs donnés par les deux chromatographies effectuées. Les teneurs apparentes seront calculées par comparaison entre les surfaces des pics observés et celles voisines des pics donnés par les solutions étalons dans les mêmes conditions opératoires, immédiatement avant ou après l'analyse de l'inconnu. La surface d'un pic sera déterminée soit en utilisant les données de l'intégrateur disponible, soit par le produit de la hauteur réelle du pic par sa largeur mesurée à 54,6 p. 100 de la hauteur totale comptée à partir du sommet. Après avoir assuré par l'une au moins des techniques indiquées plus loin (a - b - c -
d)ou par l'une des méthodes précédemment exposées (méthodes 1 à 5) l'identification définitive du résidu, la teneur trouvée sera corrigée après détermination du rendement de la technique par une analyse de l'échantillon additionné avant l'extraction d'une dose connue - égale ou voisine de celle trouvée - du pesticide incriminé. Cette détermination ne sera utile que si la teneur trouvée initialement est à la fois inférieure et du même ordre de grandeur qu'une tolérance en vigueur puisque le rendement est normalement supérieur à 80 p. 100 pour les produits stables (organo-halogénés en général) et supérieur à 60 p. 100 pour les substances à dégradation plus rapide (organo-phosphorés en particulier). Elle ne sera pas indispensable lorsque la teneur trouvée sera supérieure à une tolérance en vigueur, notamment pour les tolérances nulles. Identification par chromatographie gazeuse
a)Temps de rétention relatifs. Le temps de rétention relatif trr du composé à identifier sera déterminé par chromatographie sur colonnes DC 200 et QF 1 en présence d'HHDN, élément de référence. Les valeurs de trr seront précisées au moment de l'analyse ; les trr donnés dans le tableau 2 peuvent être consultés à titre indicatif. TABLEAU N° 3 Temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN :================================: : : : : INSECTICIDES : trr sur DC 200 : : : : : :-----------------: : Groupe 1 : : : (Eluat E1) : : : Soufre .. : 0,20 - 0,48 : : : - 1,07 : : HCB .. : 0,40 : : HCH (isomère : : : alpha) .. : 0,36 : : Gamma HCH .. : 0,45 : : Quintozène : 0,48 : : Triallate .. : 0,58 : : Chlordane .. : 0,7 - 0,8 - 1,5 : : : 1,65 - 2,6 : : Heptachlore : 0,79 : : HHDN .. : 1,00 : : Heptachlore- : : : époxyde .. : 1,49 : : op' DDE .. : 1,50 : : pp' DDE .. : 1,87 : : DDD .. : 2,5 : : op' DDT .. : 2,78 : : pp' DDT .. : 3,55 : : Toxaphène .. : Série de pics : : : indéterminés de : : : 2 à 6 : : : : :================================: :================================: : : : : INSECTICIDES : trr sur QF 1 : : : : : :-----------------: : Groupe 1 : : : (Eluat E1) : : : Soufre .. : 0,20 - 0,40 : : : - 0,82 : : HCB .. : 0,41 : : HCH (isomère : : : alpha) .. : 0,66 : : Gamma HCH .. : 0,82 : : Quintozène : 0,87 : : Triallate .. : 0,7 : : Chlordane .. : 0,84 - 1,4 : : : 2,0 - 2,2 : : Heptachlore : 0,88 : : HHDN .. : 1,00 : : Heptachlore- : : : époxyde .. : 2,10 : : op' DDE .. : 1,67 : : pp' DDE .. : 2,26 : : DDD .. : 4,6 : : op' DDT .. : 2,40 : : pp' DDT .. : 4,60 : : Toxaphène .. : Série de pics : : : indéterminés de : : : 1 à 6 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : DC 200 : : :--------------: : Groupe 2 : : : (Eluat E2) : : : Diallate .. : 0,37 : : Triallate .. : 0,58 : : Diazinon .. : 0,50 - 1,7 : : Fénitrothion : 0,79 : : Ronnel .. : 0,795 : : Fenthion .. : 0,84 : : Parathion .. : 0,96 : : Dicofol .. : 1,02 : : Bromophos- : : : éthyl .. : 1,16 : : Phenthoate : 1,25 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 1,58 : : Endosulfan : : : (léger) .. : 1,62 : : Chlorofénizon : 1,64 : : HEOD .. : 1,95 : : Endrine .. : 2,15 : : Chlorobenzilate : 1,94 - 2,60 : : : - 4,7 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclo-hexanol : 1,9 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 2,52 : : Diothion .. : 2,57 : : Carbophénothion : 3,1 : : Méthoxychlore : 5,4 : : Dinocap .. : 5,55 - 6 : : : 7,15 : : Tétradifon .. : 6,0 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : QF 1 : : :--------------: : Groupe 2 : : : (Eluat E2) : : : Diallate .. : 0,47 : : Triallate .. : 0,7 : : Diazinon .. : 0,77 - 1,5 : : Fénitrothion : 3,6 : : Ronnel .. : 1,44 : : Fenthion .. : 4,9 : : Parathion .. : 4,0 : : Dicofol .. : 2,1 - 2,4 : : Bromophos- : : : éthyl .. : 2,0 : : Phenthoate .. : 3,66 : : 2,4-D-butyl : : : glycol .. : 2,82 : : Endosulfan : : : (léger) .. : 2,54 : : Chlorofénizon : 6,0 : : HEOD .. : 3,32 : : Endrine .. : 4,00 : : Chlorobenzilate : 3,0 - 4,6 : : : - 8,6 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclo-hexanol : 3,08 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 4,17 : : Diothion .. : 6,1 : : Carbophénothion : 5,8 : : Méthoxychlore : 6,0 : : Dinocap .. : : : Tétradifon .. : 21,0 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : DC 200 : : :--------------: : Groupe 3 : : : (Eluat E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 0,69 : : Dichlofuanide : 0,86 : : Malathion .. : 0,88 : : Diazinon .. : 0,50 - 1,7 : : Fénitrothion .. : 0,79 : : Phaltane .. : 1,36 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 1,9 : : Endosulfan : : : (lourd) .. : 2,22 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 2,52 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : QF 1 : : :--------------: : Groupe 3 : : : (Eluat E3) : : : Parathion- : : : méthyl .. : 3,2 : : Dichlofuanide : 3,2 : : Malathion .. : 0,12 - 3,16 : : Diazinon .. : 0,77 - 1,5 : : Fénitrothion .. : 3,6 : : Phaltane .. : 3,92 : : 2,4-D-alkyl : : : cyclohexanol .. : 3,08 : : Endosulfan : : : (lourd) .. : 4,88 : : 2,4,5-T-butyl : : : glycol .. : 4,17 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : DC 200 : : :--------------: : Groupe 4 : : : (non élués : : : en 1-2-3) : : : Dichlorvos .. : 0,07 : : Mévinphos .. : 0,14 : : Déméton-S : : : -méthyl .. : 0,3 : : Naled .. : 0,3 : : Diméthoate .. : 0,04 - 0,4 : : : 0,73 : : Phosphamidon .. : 0,50 - 0,66 : : Endothion .. : 0,88 : : Captane .. : 1,19 : : Difolatan .. : 3,25 : : Azinphos-méthyl : 4,2 : : Phosalone .. : 7 : : : : :================================: :================================: : : trr sur : : INSECTICIDES : QF 1 : : :--------------: : Groupe 4 : : : (non élués en : : : en 1-2-3) : : : Dichlorvos .. : 0,67 : : Mévinphos .. : 0,42 - 0,50 : : : - 0,80 - 1,0 : : Déméton-S : : : -méthyl .. : 0,85 - 2,0 : : Naled .. : : : Diméthoate .. : : : Phosphamidon .. : 0,67 : : Endothion .. : : : Captane .. : 4,5 : : Difolatan .. : : : Azinphos-méthyl : 2,14 : : Phosalone .. : : : : : :================================:
b)Coefficient d'extraction (éther de pétrole, acétonitrile). La détermination d'un coefficient d'extraction : fraction d'insecticide subsistant dans l'éther de pétrole après agitation avec un volume d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole, pourra contribuer à l'identification d'un produit inconnu. Ce coefficient sera déterminé comme suit : Dans une ampoule à robinet téflon de 125 ml, introduisez : 5 ml d'éluat E1 ou E2 concentré à 10 ml, par exemple, soit E cette solution. 5 ml d'acétonitrile saturé d'éther de pétrole. Agitez. Après repos et complète séparation des phases, évacuez la phase acétonitrile. Lavez la phase éthérée avec 5 ml d'eau distillée. Filtrez la phase éthérée sur sulfate de sodium : soit E' la solution obtenue. Injectez 2 nl de cette solution dans le chromatographe. Comparez les diagrammes correspondants aux injections de 2 microlitres de solution E et de 2 microlitres de solution E'. Le rapport des surfaces des pics SE et SE' ayant le même temps de rétention dans les deux cas, donne la valeur p du coefficient de partage recherché. S Quantité d'insecticide restant dans l'éther E' de pétrole après partage --- = ------------------------------------------- = p. S quantité d'insecticide totale E Les valeurs de p obtenues dans les conditions opératoires indiquées sont les suivantes : Gamma HCH ... p = 0,24 plus ou moins 0,02 HHDN ... p = 0,92 plus ou moins 0,02 HEOD ... p = 0,46 plus ou moins 0,02 endrine ... p = 0,47 plus ou moins 0,03 pp' DDE ... p = 0,58 plus ou moins 0,02 op' DDT ... p = 0,53 plus ou moins 0,03 pp' DDT ... p = 0,37 plus ou moins 0,02
c)Analyse par microcoulométrie Les éluats E1 et E2 dans lesquels auront été décelés des résidus d'insecticides organochlorés pourront être analysés par chromatographie gazeuse avec détecteur microcoulométrique après concentration suffisante, de manière à injecter 20 à 50 microlitres d'une solution titrant au moins 1 mg/kg de l'insecticide présumé.
d)Analyse par le détecteur thermo-ionique Les éluats E2 et E3 dans lesquels auront été mis en évidence, au moyen du détecteur à capture d'électron, des résidus apparents d'insecticides organophosphorés pourront être soumis à l'analyse chromatographique avec détecteur thermo-ionique pour confirmer l'identité de ces composés. Les éluats E2 et E3 seront analysés directement ou après concentration, de manière à soumettre à la chromatographie une solution titrant environ 5 mg/kg en insecticide présumé. Injectez 2 à 4 microlitres. RECHERCHE DES INSECTICIDES PAR CHROMATOGRAPHIE EN COUCHE MINCE Les techniques décrites pour la recherche directe par chromatographie en couche mince des insecticides organochlorés et organothiophosphorés dans le vin peuvent être suivies sans modification (en ce qui concerne la préparation des plaques et la chromatographie) pour confirmer la présence d'éventuels insecticides dans les éluats E1, E2 et E3. Se reporter aux textes des méthodes I - 4 et I - 5. Article ANNEXE I 7 PRINCIPE Le parathon extrait du vin ou du jus de raisin par du benzène en milieu chlorhydrique est dosé par colorimétrie au moyen du chlorhydrate de N - (1 naphtyl) éthylène diamine. Sensible à 20 microgrammes à partir de 100 ml de boisson, la technique permet le dosage de teneurs comprises entre 0,20 et 4 mg/l de parathion. MATERIEL Ampoule à décantation de 500 ml. Erienmeyer de 125 ml à rodage émeri surmonté de réfrigérant à air amovible de 12 cm environ. Evaporateur rotatif. Spectrophotomètre. REACTIFS
a)Benzène redistillé.
b)Sulfate de boisson cristallisé pur.
c)Alcool à 95° redistillé sur potasse.
d)Ether éthylique fraîchement distillé.
e)Acide chlorhydrique 6 N (HCl pur dilué au demi).
f)Paraffine.
g)Zinc en poudre.
h)Solution A : Alcool à 95° ... 100 ml. Eau distillée ... 200 ml. Acide chlorhydrique 6 N ... 20 ml. Solutions à préparer extemporanément :
i)Solution du nitrite de sodium à 0,25 g p. 100 ml.
j)Solution de sulfamate d'ammonium à 2,5 g p. 100 ml.
k)Réactif au chlorhydrate de N - (1 naphtyl) éthylène diamine (Eastman Kodak n° 4835) à 1,00 g p. 100 ml.
l)Solution de référence de parathion : Préparez une dilution de parathion dans l'alcool à 95° titrée à 40 microgrammes par ml. MODE OPERATOIRE Extraction Dans une ampoule à décantation de 250 ml, introduisez : 100 ml de vin ou de jus de raisin. 0,5 ml d'acide chlorhydrique dilué au demi. 15 g environ de sulfate de sodium cristallisé. 50 ml de benzène. Agitez modérément pendant dix minutes ; après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, évacuez la phase aqueuse dans une deuxième ampoule à décantation et agitez à nouveau cinq minutes avec un nouveau volume de 50 ml de benzène. Laissez reposer. Lavez le benzène de la première ampoule avec 10 à 15 ml d'eau distillée. Evacuez le vin épuisé de la deuxième ampoule et y introduire l'eau de lavage soutirée de la première ampoule. Après agitation et repos, évacuez l'eau de lavage. Refaire un deuxième lavage de la première et de la deuxième ampoule avec 10 ml d'eau distillée ; rassemblez les phases benzéniques dans le ballon de l'évaporateur rotatif. Concentrez sous vide jusqu'à ce qu'il ne subsiste que 5 à 10 ml de liquide. Colorimétrie Transvasez le résidu dans un erlenmeyer. Récupérez soigneusement le résidu au moyen de plusieurs lavages de l'intérieur du ballon par des fractions de 5 ml environ d'éther éthylique. Evaporez au bain-marie, avec l'aide d'un jet d'air froid plongeant à l'intérieur de l'erlenmeyer, l'éther ainsi utilisé. Introduisez ensuite dans l'erlenmeyer : 32 ml de solution A. 2 g de paraffine. 0,5 g de zinc pulvérulent. Fixez le crachoir sur l'erlenmeyer. Abandonnez exactement dix minutes au-dessus du bain-marie bouillant. Retirez et plongez dans un bac d'eau glacée. Disposez au-dessus d'un ballon de 100 ml un petit entonnoir muni d'un léger tampon de coton hydrophile. Lorsque la paraffine est solidifiée, décantez le liquide sur le filtre. Ajoutez 5 ml d'eau distillée à l'erlenmeyer et reposer sur le bain-marie jusqu'à fusion de la paraffine. Agitez. Laissez refroidir dans la glace. Filtrez à nouveau à la suite. Recommencez deux fois cette opération (15 ml d'eau au total). Ajoutez ensuite dans le ballon jaugé : 1 ml de nitrite de sodium à 0,25 p. 100. Agitez quinze secondes et laissez reposer dix minutes. 1 ml de sulfamate d'ammonium à 2,5 p. 100. Agitez quinze secondes et laissez reposer dix minutes. 2 ml de réactif E. K. 4835 à 1 p. 100. Agitez quinze secondes et laissez reposer dix minutes. 2 ml d'HCl 6 N. 50 ml d'alcool à 95, ou la quantité suffisante pour compléter à 100 ml. Mélangez. Mesurez la teinte obtenue à 555 microns dans une cuve de 1 cm d'épaisseur et par rapport à un témoin obtenu dans les mêmes conditions, en opérant à partir de 32 ml de solution A, etc.. Etalonnage L'étalonnage sera effectué par les mesures réalisées à partir de 0 - 20 - 50 - 100 - 150 et 200 microgrammes de parathion. A titre indicatif, un étalonnage a permis d'établir la relation : q mg = 08 x D. q = mg de parathion dans la prise d'essai. Les vins et les jus de raisin exempts de parathion et de ses dérivés ne donnent aucune coloration : la densité optique étant de l'ordre de 0,003 par rapport au témoin. Cette technique colorimétrique donne un résultat positif avec le parathion, le parathion-méthyl, le para oxon, le fénitrothion, le chlorthion, l'E. P. N. et le p nitro phénol. Article ANNEXE I 8 PRINCIPE Après hydrolyse acide, le sulfure de carbone libéré du dithiocarbamate est absorbé par une solution alcoolique d'acétate de cuivre et de diéthanolamine. La coloration obtenue est mesurée à 435 nm. La réaction colorée est sensible à 0,01 mg de sulfure de carbone, soit respectivement 0,018 - O,017 - 0,016 mg de zinèbe, manèbe et nabame. Exécutée à partir de 100 ml de boisson, la méthode permet les dosages de teneurs en dithiocarbamates supérieures à 0,21 mg/l. MATERIEL Appareil à distiller et barboteurs. L'appareil comprend un ballon en verre résistant à la chaleur à fond rond de 1 litre porteur d'une tubulure latérale permettant une arrivée d'air au fond du liquide. Le col principal du ballon s'adapte par un rodage sphérique de 35/20 à un réfrigérant ascendant à deux boules de 15 cm de hauteur. La sortie supérieure du réfrigérant, équipée d'un rodage sphérique de 18/7 reçoit deux barboteurs 1 et 2 placés en série. Ces barboteurs sont des tubes droits d'une capacité de 30 ml dans lesquels plonge jusqu'au fond un tube effilé. Une légère aspiration au moyen d'une trompe à eau permet la circulation d'un courant gazeux refroidi dans le sens : extérieur - ballon - réfrigérant - barboteur 1 - barboteur 2. Spectrophotomètre pour mesure dans le visible. REACTIFS
a)Acide sulfurique 2 N
b)Alcool absolu redistillé sur potasse.
c)Solution de référence de sulfure de carbonne à 0,10 mg par ml : c1) Sulfure de carbone ... 1 g Alcool absolu Q. S. P.... 100 ml c2) Diluez c1 au 1/100 avec de l'alcool absolu.
d)Solution d'acétate de zinc à 20 p. 100 Acétate de zinc ... 20 g Eau distillée Q. S. P.... 100 ml
e)Réactif pour la détermination de quantités de S2 C comprises entre 10 et 200 microgrammes : Acétate de cuivre monohydraté ... 0,004 g Diéthanolamine ... 25 g Alcool absolu Q. S. P... 250 ml MODE OPERATOIRE
a)Hydrolyse Dans le ballon de 1 litre, introduisez : 100 ml de vin et 15 ml de H2 SO4 4 N. Garnissez le premier barboteur avec 15 ml d'acétate de zinc à 20 p. 100 (pour éliminer les sulfures éventuels qui pourraient interférer sur la coloration). Garnissez le deuxième barboteur avec 12,5 ml de réactif e. Portez le contenu du ballon à douce ébullition et ménagez une légère aspiration dans l'ensemble au moyen de la trompe à eau. Maintenez l'ébullition et le courant d'air quarante-cinq minutes.
b)Coloration Transvasez le contenu du deuxième barboteur dans un ballon jaugé de 25 ml. Rincez le barboteur avec de l'alcool absolu et complétez à 25 ml. Mélangez. Mesurez l'intensité de la teinte jaune après quinze minutes de repos, à 435 nm dans des cuves de 1 cm d'épaisseur et par rapport à un témoin préparé avec le réactif e dilué au demi avec de l'alcool absolu.
c)Etalonnage Précisez la courbe d'étalonnage par la mesure des densités optiques des teintes obtenues après quinze minutes de repos, par : 10 - 25 - 50 - 75 - 100 - 150 - 200 microgrammes de sulfure de carbone dans la prise d'essai, soit respectivement : 0,1 - 0,25 - 0,5 - 0,75 - 1 - 1,5 - 2 ml de solution de référence c2 + 12,5 de réactif e. De l'alcool absolu en quantité suffisante pour compléter à 25 ml. A titre indicatif, des mesures ont permis de représenter la courbe d'étalonnage par l'équation. Q mg = (0,34 plus ou moins 0,03) (D.O.). Q = mg de sulfure de carbone dans la prise d'essai.
d)Calcul La technique ci-dessus permet de rechercher les dithiocarbamates grâce au sulfure de carbone qu'ils sont, tous, susceptibles de libérer ; la méthode n'est pas spécifique pour un dithiocarbamate particulier. Le résultat sera donc exprimé en sulfure de carbone équivalent aux dithiocarbamates indiquant pratiquement la moitié de la concentration en dithiocarbamates métalliques présents. Article ANNEXE I 9 PRINCIPE L'extraction du dinocap (dinitro capryl phényl crotonate) est réalisée par l'éther de pétrole. Le dosage colorimétrique est effectué directement sur l'extrait concentré au moyen de pyridine. La recherche et le dosage peuvent être effectués sur un extrait purifié par chromatographie sur florisil au moyen de la chromatographie gazeuse avec détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène. Le dosage colorimétrique, possible entre 10 et 100 microgrammes de dinocap, permet de déceler et de doser ce fongicide à des teneurs comprises entre 0,1 et 1 mg/l à partir de 100 ml de boisson. Le dosage par chromatographie gazeuse, possible à partir de 0,2 microgrammes permet l'identification et le dosage de doses supérieures à 0,05 mg/l dans de bonnes conditions opératoires. MATERIEL Ampoules à décantation de 250 ml. Evaporateur rotatif sous vide. Spectrophotomètre pour mesures dans le visible. Colonne à chromatographie (diamètre : 2 cm ; hauteur : 60 cm). Chromatographe à détecteur à ionisation de flamme. REACTIFS
a)Ether de pétrole 40-65° redistillé.
b)Sulfate de sodium anhydre.
c)Ether sulfurique fraîchement redistillé.
d)Florisil 60/100, activé par séjour à l'étuve à 130° pendant vingt-quatre heures, puis additionné de 5 p. 100 d'eau distillée, conservé en flacon bouché et utilisé à partir de vingt-quatre heures de repos.
e)Pyridine anhydre redistillée additionnée de 1 p. 100 d'eau distillée.
f)Solutions de référence : A - Mère : à 200 mg par litre. Dissoudre 50 mg de dinocap dans 250 ml d'éther de pétrole. B - Solution à 20 mg par litre. Diluer au dixième la solution mère avec de l'éther de pétrole. MODE OPERATOIRE Extraction Dans une ampoule à décantation de 250 ml, introduisez : 100 ml de vin ou de jus de raisin ; 75 ml d'éther de pétrole. Agitez pendant cinq à dix minutes. Après un repos suffisant pour une bonne séparation des phases, vidangez la phase inférieure dans une deuxième ampoule à décantation. Lavez l'éther de pétrole par agitation légère avec 20 ml d'eau distillée. Ajoutez 50 ml d'éther de pétrole dans la deuxième ampoule, agitez et laissez reposer. Rejetez la phase aqueuse de la deuxième ampoule, vidangez dans cette ampoule l'eau de lavage de la première ampoule, agitez et rejetez cette eau. Lavez une deuxième fois l'éther de pétrole de la première ampoule avec 5 à 10 ml d'eau distillée qui est encore utilisée pour laver l'éther de la deuxième ampoule. Réunissez les deux phases éthérées dans un bécher sec, desséchez avec 5 g environ de sulfate de sodium anhydre et transvasez la solution dans un évaporateur rotatif, rincez les ampoules et le bécher avec un petit volume d'éther de pétrole qui est également introduit dans le ballon de l'évaporateur. Si l'on dispose de ballons de 100 ml et d'un évaporateur permettant une évaporation avec alimentation progressive de ces ballons, évaporez sans atteindre la siccité : 2 à 3 ml devant subsister pour éviter les pertes. Si l'évaporation est réalisée dans un ballon de plus grande capacité, évaporez également jusqu'à ce qu'il ne subsiste plus que quelques ml, mais pas à sec. Egouttez dans un petit bécher de 50 ml, rincez les parois du ballon avec quelques ml d'éther de pétrole anhydre, à plusieurs reprises ; évaporez l'éther sous jet d'air froid en laissant subsister de 1 à 3 ml de liquide dans le petit bécher. Recherche et dosage 1° Colorimétrie Dans le bécher de 50 ml renfermant l'extrait concentré, ou bien dans le petit ballon de 100 ml à large col de l'évaporateur renfermant l'extrait concentré, ajoutez 3 ml de pyridine à 1 % d'eau. Abandonnez sous une hotte le récipient non bouché pendant une heure. Mesurez ensuite l'intensité de la coloration jaune développée par rapport à la pyridine à 1 p. 100 d'eau, à 442 nm et dans des cuves de 1cm d'épaisseur. Etalonnage La courbe d'étalonnage sera précisée par la mesure des densités optiques des teintes obtenues après 1 h de repos, par mélange de : 0,5, 1,0, 2,0 et 4,0 ml de solution de référence b, soit : 10, 20, 40 et 80 microgrammes de dinocap avec 3 ml de réactif pyridine à 1 p. 100 d'eau. Remarque - L'introduction du réactif pyridine-eau dans l'extrait éthéré concentré et non sur le résidu sec d'évaporation de cet extrait évite les risques réels de pertes de l'évaporation totale de l'extrait. L'hydrolyse s'effectue normalement dans ce milieu, tandis que l'excès d'éther s'évapore spontanément à l'air libre dans le petit récipient débouché. La hotte est indiquée pour éviter de répandre dans le laboratoire l'odeur désagréable de la pyridine. Le volume final de 3 ml pourra être vérifié par simple pesée du bécher préalablement taré, la densité étant pratiquement égale à 1. Lorsque la coloration est développée, un excès d'éther de pétrole peut être éliminé sans risques de pertes par évaporation forcée sous jet d'air froid, ce qui autorise toute opération jugée utile ; pour transvaser le contenu du récipient : bécher ou ballon, dans un tube gradué, rincer avec de l'éther de pétrole et amener à 3 ml par évaporation. Ces opérations ne sont cependant pas nécessaires. Rendement L'étude des vins surchargés de dinocap immédiatement avant leur analyse par la méthode ci-dessus a montré que le fongicide introduit est retrouvé avec un rendement de 90 à 95 p. 100. 2° Chromatographie gazeuse L'extrait concentré précédemment obtenu peut être utilisé pour rechercher et doser le dinocap par chromatographie gazeuse. Lorsque cette détermination, qui nécessite l'emploi de moins de 10 p. 100 de l'extrait, sera envisagée, elle pourra être effectuée avant de procéder au dosage colorimétrique sur le reste de l'extrait. L'extrait concentré sera au préalable et en totalité purifié comme suit. Purification
a)Préparation de la colonne : Dans la colonne à chromatographie 20 X 600 mm, tassez successivement : 2,5 cm de sulfate de sodium anhydre. 5 cm de florisil (10 g). 1,5 cm de sulfate de sodium anhydre.
b)Mélange éluant : Ether sulfurique fraîchement redistillé ... 20 ml. Ether de pétrole 40-65° redistillé ... 80 ml.
c)Opération : Lavez au préalable le contenu de la colonne par 40 ml de mélange éluant. Introduisez ensuite le concentré de l'extrait éthéré dans la colonne, rincez le récipient et les parois de la colonne avec de petits volumes de mélange éluant, de manière à parfaitement reprendre la totalité de l'extrait. Utilisez 75 ml de mélange éluant. L'éluat sera ensuite évaporé, sous vide, ou bien au bain-marie sous jet d'air froid, dans un petit ballon ou un bécher de 50 ml, en prenant soin de ne pas arriver à siccité. Il sera enfin concentré exactement à 0,5 ml dans un tube gradué conique : 0,45 ml pourront être utilisés pour le dosage colorimétrique. 0,05 ml serviront au dosage chromatographique.
d)Conditions de travail pour la chromatographie gazeuse : Colonne : tube en verre résistant à la chaleur 5' 1/8'' garnie de DC 200 à 10 p. 100 sur Chromosorb W HMDS 80/100. Température de la colonne : la température constante peut être prise entre 205 et 210°. Température de l'injecteur : 190 à 210°. Débit d'azote : 40 ml par mn. Pression à l'entrée de l'appareil : 2,0 kg par cm2. Détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène. Sensibilité : à l'atténuation 1/40, le détecteur à ionisation de flamme d'hydrogène permet le tracé de chromatogrammes avec des quantités de dinocap comprises entre 0,2 et 0,8 microgramme. Solution de référence : la solution-mère renfermant 0,2 microgrammes de dinocap par microlitre convient aux essais témoins. Dans les conditions indiquées ici, le dinocap donne un pic composite formé de trois pics non séparés, dont les temps de rétention relatifs par rapport à l'HHDN sont voisins de 5,55, 6,0 et 7,15. Dans les conditions indiquées, le dinocap est entièrement élué en moins de 20 mn. Ces temps de rétention relatifs seront toujours vérifiés dans les conditions particulières de chacun.
e)Recherche et dosage dans l'échantillon : Les essais seront effectués par injections de 1 à 4 microlitres de l'extrait concentré à 0,5 ml. L'absence de pics aux temps de rétention où est élué le dinocap peut être considérée comme l'indication de l'absence de ce produit à une dose supérieure à 0,2 microgramme dans l'essai, soit une teneur supérieure à 0,25 mg/l pour une injection de 4 microlitres de l'extrait de 100 ml de boisson concentré à 0,5 ml. La sensibilité peut être amenée à 0,05 mg/l après concentration de l'extrait à 0,10 ml dans le tube conique gradué. Si cette dernière détermination est jugée utile par suite de la teneur faible ou nulle de dinocap dans la boisson analysée, l'opération peut disposer de la totalité de l'extrait pour les essais chromatographiques, puisque le dosage colorimétrique a perdu son intérêt par sa sensibilité trop faible. Le calcul du résultat sera fait comme dans tout dosage chromatographique, par comparaison entre les surfaces observées : échantillon et étalonnages. Article ANNEXE I 10 PRINCIPE La méthode est basée sur la réaction colorée du captane (ou du phaltane) avec la résorcine à 140° C. REACTIFS
a)Benzène distillé.
b)Résorcine pure (sèche).
c)Acide acétique glacial.
d)Octane pur : Pt Eb. : 124-126° (Eastman Kodak).
e)Décane pur : Pt Eb. : 174° (Eastman Kodak).
f)Sulfate de sodium anhydre, R.P..
g)Charbon activé "Nuchar Attaclay" Wilkens Instr. Cy.. Solution de références : A (stock) - 50 mg dans 50 ml de benzène = 1 mg par millilitre. B (travail) - Diluez la solution A au 1/25 = 0,04 mg par millilitre. C (travail) - Diluez la solution B au 1/4 = 0,01 mg par millilitre. MATERIEL Ampoules à décantation de 250 ou 500 ml et de 50 ou 100 ml. Kuderna-Danish ou réfrigérant adaptable par rodage à un tube à essai en verre résistant à la chaleur de 50 ml. Evaporateur rotatif avec pompe à vide. Spectrophotomètre (visible). ETALONNAGE Dans un tube en verre résistant à la chaleur de 15-50 ml à rodage émeri, adaptable à un appareil Kuderna-Danish ou à un réfrigérant de 30 cm, placez : 1 ml de solution C (soit 0,010 mg de captane) ; 1 g de résorcine ; 3,5 ml d'octane et 1,5 ml de décane (soit 5 ml du mélange des deux hydrocarbures bouillant vers 141° plus ou moins 2° C). Faites bouillir sous reflux 10 à 15 mn modérément. Avant refroidissement, par le haut du réfrigérant ou après avoir libéré le tube en verre résistant à la chaleur, ajoutez 3 ml d'acide acétique glacial. Mélangez et laissez refroidir. Transvasez le mélange dans une ampoule à décantation de 50 ml environ. Transvasez le mélange dans une ampoule à décantation de 50 ml environ. Rincez le tube avec 1 ml d'acide acétique. Transvasez cet acide de lavage dans l'ampoule, sans agiter cette ampoule de manière à ne pas mélanger cet acide au précédent saturé de résorcine. Cette précaution permet d'isoler trois phases : La phase inférieure concentrée en résorcine est colorée en jaune ; La phase intermédiaire est incolore ; La phase supérieure renferme les hydrocarbures (qui pourront être récupérés pour un nouveau dosage). Soutirez les deux phases inférieures acides dans un ballon jaugé de 10 ml, l'acide acétique de sa deuxième phase rinçant les parois de l'ampoule et la lumière du robinet. Complétez au trait de jauge avec de l'acide acétique. Mesurez la densité optique à 428 microns dans une cuve de 1 cm d'épaisseur par rapport à la solution témoin obtenue dans les mêmes conditions à partir de 1 ml de benzène au lieu et place de la solution C. Normalement, la teinte de ce témoin est très faible et sa densité optique par rapport à l'acide acétique pur est de l'ordre de 0,01 indiquant que la résorcine utilisée est suffisamment pure. Dans ce cas, l'acide acétique pourra être utilisé comme solution de référence pour les autres mesures. Pour construire la droite d'étalonnage, opérez de même successivement avec : 0,5, 2 et 3 ml de solution C, soit respectivement 5, 20 et 30 microgrammes de captane et avec 1, 1,5 et 2 ml de solution B, soit respectivement 40, 60 et 80 microgrammes de captane. Réduisez à 1, 1,5 ml environ par évaporation au bain-marie sous un jet d'air froid dirigé au fond du tube, lorsque le volume dépasse 1,5 ml. Tracez la droite d'étalonnage. NOTA - Les résultats de mesures ont permis d'écrire la relation : microgrammes de captane dans la prise d'essai = 100 (D. 0.). Les variations ont été trouvées inférieures à 3 p. 100 au-dessus de 10 microgrammes. Bien que moins précises, les mesures sont relativement bonnes au-dessous de 10 microgrammes, quantité pour laquelle la densité optique est égale à 0,10. EXTRACTION DU VIN Note importante - En raison de la toxicité à long terme du benzène, opérez toujours sous une hotte ou en atmosphère très ventilée, de manière à éviter l'inhalation de ce solvant. Dans une ampoule à décantation de 500 ml agitez, pendant 5 mn, 100 ml de vin avec 75 ml de benzène. Laissez reposer 20 mn et décantez le vin dans un bécher. Décantez, par l'orifice supérieur de l'ampoule, la phase benzénique dans un bécher de 200 ml. Séchez avec 1 g environ de Na, SO, anhydre. Remettez le vin dans l'ampoule et agitez-le avec 25 nouveaux ml de benzène. Après repos, soutirez la phase vineuse et décantez la phase benzénique dans un bécher sec. Décantez ou filtrez la première phase benzénique dans le ballon de l'évaporateur rotatif, lavez le sulfate de sodium et le filtre avec la deuxième phase benzénique et évaporez les extraits combinés sous vide presque à sec, mais pas à siccité. Reprenez le résidu par 10 ml de benzène, et agitez avec un gramme de charbon "Nuchar attaclay", pour éliminer les pigments du vin qui interféreraient sur la couleur. Filtrez dans le tube en verre résistant à la chaleur à rodage 45-50 ml, lavez le charbon actif par 10 ml de benzène, et réduisez le volume à 1 ou 2 ml environ, au bain-marie, sous hotte, et avec l'aide d'un jet d'air froid projeté dans l'axe du tube. Introduisez ensuite, successivement : 1 g de résorcine ; 1,5 ml de décane et 3,5 ml d'octane. Adaptez le dispositif réfrigérant et continuez comme il est indiqué pour la gamme d'étalonnage. RESULTATS A partir de 100 ml de vin, la teneur en mg/l (mg de captane par litre) se trouve être numériquement égale à la densité optique lue à 438 nm. RENDEMENT Le rendement de l'ensemble des opérations : extraction, purification et colorimétrie est voisin de 85 p. 100 pour des teneurs de 0,1 mg/l de captane introduites dans le vin. La purification de l'extrait est nécessaire pour éviter une réaction parasite. Un vin rouge non traité, soumis à l'analyse sans purification de l'extrait, a donné une coloration correspondant à une teneur apparente de 0,03 mg/l de ce fongicide. Article ANNEXE II PRINCIPE Les insecticides sont extraits de la farine par agitation avec de l'acétonitrile. Après transfert dans l'éther de pétrole, la recherche et le dosage du gamma HCH et du malathion sont effectués sur deux éluats différents obtenus au cours d'une chromatographie sur florisil. MATERIEL Voir analyse des vins - 1 : méthode 6. REACTIFS Réactifs a - b - c - d - e - f - h - i et k. Voir analyse des vins. - I : méthode 6. g1) Solution de référence pour la recherche du gamma HCH : A. Gamma HCH à 100 mg/l (10 mg de gamma HCH pour 100 ml d'éther de pétrole). B. Gamma HCH à 1 mg/l. Diluez la solution A à 1 p. 100 dans l'éther de pétrole ; A. HHDN à 100 mg/l (dissolvez 10 mg d'aldrine dans 10 ml d'acétone et complétez à 100 ml avec de l'éther de pétrole) ; B'. HHDN à 1 mg/l. Diluez la solution A' à 1 p. 100 avec de l'éther de pétrole ; C. Gamma HCH et HHDN à 0,25 mg/l. Dans un ballon de 100 ml, introduisez 25 ml de solution B et 25 ml de solution B' et complétez à 100 ml avec de l'éther de pétrole. g2) Solution de référence pour la recherche du malathion : A. Malathion à 1.000 mg/l (100 mg de malathion pour 100 ml d'acétone) ; B. Malathion à 10 mg/l (1 ml de solution A dilué à 100 ml avec de l'éther de pétrole). EXTRACTION Dans un tube à centrifuger à fermeture étanche de 100 ml introduisez : 10 g de farine et 25 ml d'acétonitrile. Après 20 mn d'agitation mécanique, centrifugez pendant 5 mn à 3.000 t/mn. Décantez le liquide surnageant dans une ampoule à décantation de 500 ml renfermant 300 ml d'eau distillée lavée et 40 ml d'éther de pétrole. Agitez. Ajoutez 20 ml d'acétonitrile au culot. Après 15 mn d'agitation et une nouvelle centrifugation, mélangez le deuxième extrait au premier dans l'ampoule. Agitez modérément. Laissez reposer. Agitez à nouveau et laissez reposer jusqu'à séparation complète des phases. Soutirez la phase aqueuse. Lavez la phase éthérée avec 10 ml d'eau distillée lavée, soutirez cette eau de lavage, décantez l'éther dans un bécher de 100 ml renfermant 0,5 g environ de sulfate de sodium anhydre. La phase aqueuse est épuisée avec 10 ml d'éther de pétrole qui, après séparation, lavage à l'eau et déshydratation, seront introduits à la suite de l'extrait éthéré précédent dans la colonne de florisil. PURIFICATION DE L'EXTRAIT Préparation de la colonne Tassez successivement dans la colonne : 2,5 cm de sulfate de sodium anhydre ; 5 cm environ (10
g)de florisil ; et 2,5 cm de sulfate de sodium anhydre. Lavez la colonne absorbante successivement avec : 50 ml de mélange éluant ; et 50 ml d'éther en pétrole, en rejetant les effluents. Elution du gamma HCH Introduisez dans la colonne l'extrait précédemment obtenu (35 ml environ) après avoir disposé au-dessous d'elle un ballon jaugé de 100 ml pour recevoir l'éluat. Lorsque l'extrait a disparu dans l'absorbant introduisez dans la colonne des 10 ml d'éther de pétrole utilisés pour compléter l'extraction. Après disparition de ceux-ci, ajoutez 60 ml d'éther de pétrole dans la colonne. Retirez le ballon jauge lorsqu'il est rempli jusqu'au trait. Mélangez. Cet éluat E1 renferme la totalité du gamma HCH extrait. 1 ml d'éluat E1 correspond à 0,1 g de farine. NOTE - Dans une analyse plus générale, pour assurer une recherche de résidus éventuels d'HHDN, zeidane, heptachlore, heptachlore-époxyde, chlordane et toxaphène, l'élution sera poursuivie avec 25 ml d'éther de pétrole supplémentaire. Après avoir recherché directement le gamma HCH (ou HCH) dans les 100 premiers ml non concentrés, la recherche des autres pesticides énumérés pourra être effectuée après concentration de la totalité des 125 ml élués. Elution du malathion Remplacez le ballon jaugé de 100 ml par un bécher et continuez l'élution au moyen de 125 ml de mélange à 20 p. 100 d'éther éthylique. Les premiers 50 ml (éluat E1) pourront être rejetés ou, dans le cas d'une analyse plus générale, conservés pour la recherche d'éventuels résidus de HEOD, endrine, méthoxychlore, dicofol, tétradifon, chlorobenzylate ou parathion. Recevez séparément les 75 ml suivants (éluat E4) qui renferment le malathion extrait éventuellement de la farine analysée. ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE I. - Recherche et dosage du gamme HCH La recherche et le dosage du gamma HCH dans l'éluat E1 est effectuée par chromatographie gazeuse avec détecteur à capture d'électrons. Les chromatographies gazeuses seront effectuées vers 160° et sous une pression variable avec la colonne et son état (1,5 à 2,5 kg par centimètre carré) capable d'assurer à la fois une valeur convenable du courant de base et une élution suffisamment lente du gamma HCH (2 à 3 mn). La chambre

🔗 Vers la source officielle

Explication IA à partir du texte officiel de la loi. Indicatif, ne remplace pas un conseil juridique.

Arrêté du 1 octobre 1968 relatif aux méthodes officielles de recherches des résidus de pesticides dans le vin, les jus de raisins, la farine, les frui