Ordin nr. 387 din 21 mai 2007

ORDIN nr. 387 din 21 mai 2007 pentru modificarea şi completarea Ordinului ministrului agriculturii, pădurilor şi dezvoltării rurale nr. 912/2004 privind controlul putregaiului inelar al cartofului, produs de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus Publicat în MONITORUL OFICIAL nr. 417 din 22 iunie 2007 În temeiul prevederilor art. 5 din Ordonanţa Guvernului nr. 136/2000 privind măsurile de protecţie împotriva introducerii şi răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, cu modificările şi completările ulterioare, în temeiul Hotărârii Guvernului nr. 385/2007 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, văzând Referatul de aprobare nr. 292.399 din 18 mai 2007 al Agenţiei Naţionale Fitosanitare din cadrul Ministerului Agriculturii şi Dezvoltării Rurale, ministrul agriculturii şi dezvoltării rurale emite prezentul ordin.

Articolul I Ordinul ministrului agriculturii, pădurilor şi dezvoltării rurale nr. 912/2004 privind controlul putregaiului inelar al cartofului, produs de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr. 127 şi 127 bis din 9 februarie 2005, se modifică şi se completează după cum urmează:

Articolul II Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Articolul III Prezentul ordin transpune prevederile Directivei Consiliului 2006/56/CEE din 12 iunie 2006, care amendează anexele Directivei Consiliului 93/85/CEE privind controlul putregaiului inelar al cartofului.

Ministrul agriculturii şi dezvoltării rurale, Decebal Traian Remeş Bucureşti, 21 mai 2007.

Nr. 387.

Anexa I PROTOCOL de testare în vederea diagnosticării, detectării şi identificării agentului responsabil de putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann şi Kotthoff) Davis et al.

DOMENIU DE APLICARE AL PROTOCOLULUI DE TESTARE Protocolul prezentat în continuare descrie diferitele etape ce trebuie urmate pentru: (i) diagnosticarea putregaiului inelar al cartofului în tuberculi şi plante de cartof; (îi) detectarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de tuberculi şi plante de cartof; (iii) identificarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus PRINCIPII GENERALE Protocoalele optimizate pentru diversele metode, reactivii validaţi şi modalităţile de preparare a materialului necesar pentru teste şi pentru controale figurează în apendicii din prezenta anexă. În apendicele 1 din prezenta anexă se furnizează o listă a laboratoarelor incluse pentru optimizarea şi validarea protocoalelor.

Deoarece protocoalele implică detectarea unui organism dăunător de carantină şi includ utilizarea culturilor viabile de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus ca materiale de control, este necesar ca procedurile să se desfăşoare în condiţii adecvate de carantină, cu instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor şi cu respectarea cerinţelor referitoare la licenţele corespunzătoare emise de autorităţile oficiale responsabile pentru carantină.

Parametrii testelor trebuie să garanteze o detectare coerentă şi reproductibilă a nivelurilor de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus la pragurile stabilite pentru metodele selecţionate.

Este necesară pregătirea exactă a martorilor pozitivi.

Realizarea testelor în funcţie de pragurile cerute implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecţi, întreţinerea şi calibrarea echipamentelor, manevrarea şi conservarea atentă a reactivilor şi toate măsurile care vizează împiedicarea contaminării între probe, de exemplu, separarea martorilor pozitivi de probele de testat. Trebuie aplicate norme de control al calităţii pentru a evita apariţia oricărei greşeli, în special de ordin administrativ, în etichetare şi în documentaţie.

Apariţia suspectată a unui focar, conform art. 4 alin. (2), implică o reacţie pozitivă la testele de diagnostic sau de depistare efectuate pe o probă, după cum se indică în diagrame.

În cazul în care primul test de depistare [testul de imunofluorescenţă (IF) sau testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)/testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH)] este pozitiv, există o suspiciune de contaminare cu Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus şi trebuie efectuat un al doilea test de depistare. În cazul în care şi al doilea test de depistare este pozitiv, suspiciunea este confirmată (apariţie suspectată) şi testele trebuie continuate în conformitate cu protocolul. În cazul în care al doilea test de depistare este negativ, proba este considerată necontaminată cu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Reacţia pozitivă la testul IF, prevăzută la art. 4 alin. (2) din ordin, este aşadar definită ca o reacţie pozitivă la testul IF, confirmată de un al doilea test de depistare (PCR/FISH).

Prezenţa confirmată, prevăzută la art. 5 alin. (1) din ordin, implică izolarea şi identificarea unei culturi pure de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, cu confirmarea patogenităţii.

DIAGRAMA 1 -----

1.2.1. Protocol de detectare şi de identificare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de tuberculi de cartof fără simptome (vezi diagrama 2) Principiu Procedura de testare vizează detectarea infecţiilor latente ale tuberculilor de cartof. Orice rezultat pozitiv la cel puţin două teste de depistare, bazate pe principii biologice diferite, trebuie completat cu izolarea organismului patogen, urmată, în caz de izolare a coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Rezultatul pozitiv al unui singur test de depistare nu este suficient pentru ca proba să fie considerată suspectă.

Testele de depistare şi testele de izolare trebuie să permită praguri de detectare cuprinse între 10^3 şi 10^4 celule/mL în depozitul resuspendat, inclusiv în martorii pozitivi din fiecare serie de teste.

DIAGRAMA 2 -----

Se utilizează reactivi şi protocoale PCR validate în mod corespunzător (vezi pct. 6).

Se utilizează reactivi şi protocoale validate (vezi pct. 5).

1.3. Protocol de detectare şi de identificare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe probe de plante de cartof fără simptome (vezi diagrama 3) DIAGRAMA 3 ------

2.2. Tuberculi de cartof Primele simptome apar mai ales în apropierea hilului şi dau un aspect uşor sticlos sau translucid ţesutului, fără înmuiere în jurul sistemului vascular. Inelul vascular poate prezenta, la nivelul hilului, o culoare mai închisă decât de obicei. Primul simptom, uşor de identificat, este o îngălbenire a inelului vascular, ceea ce conduce la eliminarea din vase a unui exudat cu aspect cremos la presarea uşoară a tuberculului. Exudatul respectiv conţine milioane de bacterii. Poate apărea o brunificare a ţesutului vascular şi în acest stadiu simptomele tuberculului sunt asemănătoare cu cele ale veştejirii bacteriene produse de bacteria Ralstonia solanacearum. Într-o primă fază, simptomele pot să se limiteze la o porţiune a inelului care nu este neapărat situată în apropierea hilului, dar ulterior aceste simptome vor cuprinde treptat întreg inelul.

Pe măsură ce infecţia progresează, ţesuturile vasculare sunt distruse, iar cortexul exterior se poate separa de cortexul interior. În stadiile avansate ale infecţiei, la suprafaţa tuberculului apar fisuri cu marginile adesea colorate în roşu brun. În multe cazuri observate recent în Europa se constată o putrezire simultană a cortexului central şi a inelului vascular, care antrenează o infecţie secundară cu apariţia de cavitaţi interne şi necroză. O infecţie fungică sau bacteriană secundară poate masca simptomele şi poate fi dificil şi chiar imposibil să se distingă simptomele avansate ale putregaiului inelar al cartofului de simptomele altor putregaiuri ale tuberculilor. Nu trebuie excluse nici formele fără simptome.

Ilustraţii colorate ale unor simptome se pot găsi la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Tratarea probei - etapa facultativă:

Se spală tuberculii. Între probe se aplică substanţe dezinfectante (compuşi cloruraţi pentru eliminarea ADN-ului patogen, atunci când trebuie utilizat testul PCR) şi detergenţi corespunzători. Se usucă tuberculii cu aer. Procedura de spălare menţionată este utilă (dar nu este neapărat obligatorie) în special pentru probele care conţin sol în exces şi în cazul în care trebuie efectuat un test PCR sau o procedură de izolare directă.

3.1.1. Cu ajutorul unui bisturiu sau al unui cuţit pentru legume, curat şi dezinfectat, se cojeşte fiecare tubercul la nivelul hilului până la apariţia ţesutului vascular. Se decupează cu atenţie un mic con de ţesut vascular la nivelul hilului, avându-se grijă să se preleve cât mai puţin ţesut nevascular posibil (vezi site-ul web accesibil la adresa: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main).

NOTĂ:

Dacă este cazul, tuberculii care prezintă simptome suspecte de putregai inelar se testează separat.

În cazul în care se observă simptome suspecte de putregai inelar în momentul prelevării conului de la nivelul hilului, trebuie să se efectueze o examinare vizuală a tuberculului, după ce a fost tăiat în apropierea hilului. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie suberificat timp de două zile la temperatura mediului ambiant, apoi păstrat în condiţii de carantină (la o temperatură cuprinsă între 4 şi 10°C) până la efectuarea tuturor testelor. Toţi tuberculii din probă (inclusiv cei care prezintă simptome suspecte) trebuie păstraţi în conformitate cu prevederile din anexa nr. II.

3.1.2. Se prelevă conurile în recipiente noi, de unică folosinţă, care să se poată închide şi/sau sigila (în cazul recipientelor refolosite, acestea se vor curăţa şi dezinfecta integral cu ajutorul compuşilor cloruraţi). Este preferabil ca tratarea conurilor să se efectueze imediat. În caz contrar, conurile se depozitează în recipient, fără a se adăuga tampon, şi fie se refrigerează pentru o perioadă mai mică de 72 de ore, fie se conservă la temperatura mediului ambiant pentru o perioadă mai scurtă de 24 de ore. Uscarea şi suberificarea, precum şi dezvoltarea saprofiţilor în momentul depozitării conurilor pot împiedica detectarea agentului responsabil de putregaiul inelar.

3.1.3. Conurile se tratează în conformitate cu una dintre următoarele proceduri:

NOTĂ:

Există un risc ridicat de contaminări încrucişate ale probelor atunci când acestea sunt omogenizate folosindu-se un mixer. Se vor lua măsuri de precauţie pentru a se evita orice vaporizare sau vărsare în timpul procesului de extracţie. Se va asigura folosirea unor lame de mixer şi a unor vase proaspăt sterilizate pentru fiecare probă. În cazul folosirii testului PCR, se va evita orice transport de ADN în recipientele sau în aparatele de zdrobire. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă zdrobirea în pungi de unică folosinţă şi utilizarea tuburilor de unică folosinţă.

3.1.4. Se decantează supernatantul. În cazul în care lichidul este prea tulbure, se limpezeşte prin centrifugare la viteză redusă (la maximum 180 g timp de 10 minute, la o temperatură de 4-10°C) sau prin filtrare în vid (40-100 æm), spălându-se suplimentar filtrul cu 10 mL tampon de extracţie (vezi apendicele 3).

3.1.5. Se concentrează fracţiunea bacteriană prin centrifugare la viteza de 7.000 g timp de 15 minute (sau de 10.000 g timp de 10 minute), la o temperatură cuprinsă între 4 şi 10°C, apoi se elimină supernatantul, fără a agita depozitul.

3.1.6. Se resuspendă depozitul în 1,5 mL tampon de sedimentare (vezi apendicele 3). Se utilizează 500 æL pentru testele de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, 500 æL pentru testele de Ralstonia solanacearum şi 500 æL ca alicot de referinţă. La cei 500 æL alicot de referinţă se adaugă glicerol steril 10-25% (în volum). Alicotul rămas se agită prin vortexare şi se depozitează la o temperatură cuprinsă între -16 şi -24°C (săptămâni) sau între -68 şi -86°C (luni). În timpul testelor, alicoţii se păstrează la o temperatură cuprinsă între 4-10°C.

Nu sunt recomandate congelările şi decongelările repetate.

În cazul în care extractul trebuie transportat, se va păstra într-o ladă frigorifică pentru o perioadă de 24-48 de ore.

3.1.7. Pentru a evita contaminarea, este necesar ca toţi martorii pozitivi şi toate probele de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus să fie tratate separat, atât pentru testele de IF, cât şi pentru toate celelalte teste.

3.2. Plante de cartof NOTĂ:

Pentru a detecta populaţiile latente de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus este recomandabil să se testeze probe mixte. Procedura poate fi aplicată cu uşurinţă pentru probele mixte care conţin până la 200 părţi de tulpini. (Atunci când se efectuează anchete, anchetele respective trebuie să se bazeze pe o probă reprezentativă din punct de vedere statistic a populaţiei vegetale examinate.) 3.2.1. Cu ajutorul unui cuţit sau al unei foarfeci de grădină, curate şi dezinfectate, se taie un segment de unu-doi centimetri de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra solului.

Fragmentele de tulpini se dezinfectează rapid cu etanol 70% şi se usucă imediat cu hârtie de filtru.

Se colectează fragmentele de tulpini într-un recipient steril închis, respectându-se procedura de prelevare expusă în continuare.

3.2.2. Fragmentele de tulpini se tratează urmându-se una dintre următoarele proceduri:

3.2.3. După o sedimentare de 15 minute, se decantează supernatantul.

3.2.4. De obicei, nu este necesar să se efectueze o nouă limpezire a extractului sau a concentraţiei fracţiunii bacteriene; cu toate acestea, limpezirea se poate efectua prin filtrare şi/sau centrifugare, în conformitate cu metoda descrisă la pct. 3.1.4-3.1.6.

3.2.5. Se separă extractul de probă pur/concentrat în două părţi egale. Una dintre părţi se păstrează pe toată durata testului la o temperatură de 4-10°C, iar cealaltă se depozitează la o temperatură cuprinsă între -16 şi -24°C (săptămâni) sau între -68 şi -86°C (luni), după ce s-a adăugat în prealabil o cantitate de glicerol steril 10-25% (în volum), pentru cazurile în care va fi necesară efectuarea unor testări suplimentare.

În cazul în care testul IF este utilizat ca principal test de depistare şi rezultatul său este unul pozitiv, trebuie să se efectueze un test PCR sau FISH ca test secundar. În cazul în care testul IF este folosit ca test secundar, iar rezultatul său este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, în conformitate cu indicaţiile din diagrama funcţională.

NOTĂ:

Atunci când testul IF se utilizează ca principal test de depistare, se folosesc întotdeauna anticorpi policlonali. Atunci când testul IF efectuat cu anticorpi policlonali dă un rezultat pozitiv, se efectuează un test suplimentar cu anticorpi monoclonali, test ce are o specificitate mai mare şi o sensibilitate mai mică.

Trebuie să se folosească anticorpii unei tulpini de referinţă a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Se recomandă să se determine titrul pentru fiecare nou lot de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai înaltă diluţie la care se obţine o reacţie optimă, atunci când se testează o suspensie care conţine între 10^5 şi 10^6 celule per mL a unei tulpini omoloage de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, folosindu-se un conjugat adecvat de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Soluţia brută de anticorpi policlonali sau monoclonali trebuie să aibă un titru IF de cel puţin 1:2.000. În momentul efectuării testului, diluţia/diluţiile de lucru a/ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală/egale cu titrul. Se folosesc anticorpi validaţi (vezi site-ul web la adresa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Testul trebuie efectuat pe extracte de probă proaspăt preparate. Dacă este cazul, acesta poate fi efectuat cu succes şi pe extracte conservate cu glicerol, la o temperatură cuprinsă între -68 şi -86°C. Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea unui mL de tampon de sedimentare (vezi apendicele 3), urmat de recentrifugare timp de 15 minute la 7.000 g şi resuspendare în acelaşi volum de tampon de sedimentare. Acest lucru este rareori necesar, în special atunci când proba este fixată pe lamă prin flambare (vezi pct. 2.2).

Se pregătesc lame-martor pozitive distincte, utilizându-se tulpini omoloage sau oricare altă tulpină de referinţă a bacteriei Clavibacter michiganensius ssp. sepedonicus, obtinute dintr-o suspensie de extract de cartof, aşa cum se specifică în apendicele 2 şi, opţional, într-un tampon.

Acolo unde este posibil, ar trebui să se utilizeze pe aceeaşi lamă un martor provenit din ţesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la temperaturi cuprinse între -16°C şi -24°C).

Ca martori negativi se folosesc alicoţi din extract de probă care au fost găsiţi negativi la testare.

Se utilizează lame de microscop cu multe godeuri, de preferinţă 10 godeuri, fiecare godeu având un diametru minim de 6 mm.

Controalele se testează la fel ca probele.

4.1. Lamele se prepară folosindu-se una dintre următoarele metode: (i) pentru sedimentele cu conţinut relativ redus de amidon: se pipetează în primul godeu un volum standard (15 æL în godeurile de 6 mm; pentru godeurile cu un diametru mai mare se pipetează o cantitate mai mare) dintr-o diluţie de 1/100 de sediment de cartof resuspendat. Apoi se pipetează un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase de pe acel rând. Rândul următor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru a doua probă, aşa cum este indicat în figura 1; (îi) alte sedimente: se prepară diluţii zecimale (1/10 şi 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon de sedimentare. Se pipetează pe primul rând de godeuri un volum standard (15 æL în godeurile de 6 mm; pentru godeurile cu un diametru mai mare se pipetează un volum mai mare) de sediment resuspendat şi fiecare diluţie. Şirul următor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru o a doua probă, aşa cum este indicat în figura 2.

4.2. Se usucă picăturile la temperatura mediului ambiant sau prin încălzire la temperaturi cuprinse între 40°C şi 45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire (15 minute la 60°C), prin flambare, cu ajutorul etanolului 95%, sau urmând instrucţiunile specifice ale furnizorilor de anticorpi.

Dacă este necesar, lamele fixate pot fi păstrate la frigider într-o cutie desicator pentru cel mult 3 luni înainte de efectuarea unui alt test.

4.3. Procedura testului de imunofluorescenţă (IF): (i) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor-test, indicată la pct. 4.1 (i): se prepară o serie de diluţii de anticorpi la jumătate, într-un tampon IF. Primul godeu trebuie să conţină 1/2 din titru (T/2), celelalte, 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titrul (T) şi de două ori titrul (2T); (îi) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor-test, indicată la pct. 4.1 (îi): se prepară diluţia de lucru de anticorpi într-un tampon IF. Diluţia de lucru are efect asupra specificităţii.

Figura 1. Prepararea lamei-test în conformitate cu pct. 4.1 (i) şi 4.3 (i) Figura 2. Prepararea lamei de testare în conformitate cu pct. 4.1 (ii) şi 4.3 (ii) 4.3.1. Se plasează lamele pe hârtie umedă. Se acoperă complet fiecare godeu cu una sau mai multe diluţii de anticorpi. Cantitatea de anticorpi aplicată pe fiecare godeu trebuie să fie cel puţin egală cu volumul de extract aplicat.

În absenţa instrucţiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi, se aplică următoarea procedură:

4.3.2. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18-25°C).

4.3.3. Se elimină picăturile de pe fiecare lamă şi se clăteşte cu grijă cu tampon IF. Se spală 1prin imersie timp de 5 minute într-o soluţie tampon IF-Tween (vezi apendicele 3), apoi încă 5 minute într-o soluţie tampon IF. Se evită orice vaporizare sau vărsare care ar putea determina o contaminare încrucişată. Se elimină cu atenţie excesul de umiditate cu ajutorul hârtiei sugative.

4.3.4. Se plasează lamele pe hârtie umedă. Se acoperă godeurile cu conjugat FITC la diluţia utilizată la titrare. Cantitatea de conjugat aplicată pe godeuri trebuie să fie identică cu cantitatea de anticorpi utilizată.

4.3.5. Se incubează lamele pe hârtie umedă, acoperite timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18-25°C).

4.3.6. Se elimină de pe lamă picăturile de conjugat. Se clăteşte şi se spală în conformitate cu indicaţiile anterioare (vezi pct. 4.3.3).

Se elimină cu grijă excesul de umiditate.

4.3.7. În fiecare godeu se pipetează 5-10 æL tampon glicerol-fosfat 0,1 M (vezi apendicele 3) sau un suport antidecolorare din comerţ, apoi se acoperă cu o lamelă.

4.4. Citirea testului IF:

4.4.1. Se examinează lamele-test cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă prevăzut cu filtre adaptate la excitaţia FITC-ului, în imersie cu ulei sau apă şi cu o mărire de la 500 la 1.000. Se examinează godeurile pe două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu prezintă celule sau care prezintă doar un număr redus de celule se observă cel puţin 40 de câmpuri microscopice.

Se începe prin a se controla lama martorului pozitiv. Celulele trebuie să prezinte o fluorescenţă vie şi să fie complet colorate la titrul de anticorp sau de diluţie de lucru determinat. În cazul unei colorări anormale, testul IF (vezi pct. 4) trebuie repetat.

4.4.2. Se caută în godeurile lamelor-test prezenţa celulelor cu o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (vezi site-ul web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii martor pozitiv pentru o diluţie identică de anticorpi. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.

La cea mai mică suspiciune de contaminare testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt izolate şi găsite în exteriorul godeurilor.

4.4.3. Există un anumit număr de probleme inerente specificităţii testului de imunofluorescenţă. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi în segmentele de tulpină de cartof pot apărea populaţii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum şi bacterii saprofite care pot da reacţii încrucişate având mărime şi morfologie asemănătoare cu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

4.4.4. Numai celulele fluorescente care au o dimensiune şi o morfologie caracteristice titrului sau diluţiei de lucru a anticorpilor menţionaţi la pct. 4.3 trebuie să fie luate în considerare.

4.4.5. Interpretarea testului IF: (i) Dacă proba conţine celule care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică, se evaluează numărul mediu de celule caracteristice per câmp microscopic şi se calculează numărul celulelor menţionate per mL de sediment resuspendat (vezi apendicele 4).

Testul IF este considerat pozitiv atunci când proba conţine cel puţin 5 x 10^3 celule caracteristice per mL de sediment resuspendat. În acest caz, proba este considerată ca fiind potenţial contaminată şi trebuie să se continue testele. (îi) Testul IF este considerat negativ atunci când proba conţine mai puţin de 5 x 10^3 celule per mL de sediment resuspendat, iar proba este considerată necontaminată.

Nu este necesară continuarea testelor.

NOTĂ:

Se utilizează oligosonde validate specifice pentru bacteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (vezi apendice 7). Testele preliminare efectuate prin această metodă trebuie să permită detectarea a cel puţin 10^3-10^4 celule/mL ale bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative.

Este preferabil să se aplice procedura descrisă în continuare pentru extractele de probă proaspăt preparate, dar procedura poate funcţiona, de asemenea, utilizând extracte de probă conservate cu glicerol la temperaturi cuprinse între -16°C şi -24°C sau între -68°C şi -86°C.

Ca martori negativi se folosesc extracte de probe care au dus în prealabil la un rezultat negativ, în urma testelor de depistare a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Ca martori pozitivi se prepară suspensii care conţin între 10^5 şi 10^6 celule/mL de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (de exemplu, tulpini NCPPB 4053 sau PD 406) în tampon fosfat 0,01 M, pornindu-se de la o cultură de trei până la cinci zile (vezi apendicele 2 pentru preparare). Se prepară lame-martor pozitive distincte dintr-o tulpină omoloagă sau orice altă tulpină de referinţă a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus într-o suspensie de extract de cartof, aşa cum se indică în apendicele 2.

Controlul procesului de hibridizare se realizează prin utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC), ce colorează toate eubacteriile prezente în probă.

Materialul de control se testează la fel ca şi probele.

5.1. Fixarea extractului de cartof Protocolul prezentat în cele ce urmează se bazează pe Wullings et al. (1998).

5.1.1. Se prepară soluţia de fixare (vezi apendicele 7).

5.1.2. Se pipetează 100 æL din fiecare extract într-un tub Eppendorf şi se centrifughează 8 minute la 7.000 g.

5.1.3. Se elimină supernatantul şi se dizolvă sedimentul concentrat în 500 æL soluţie de fixare preparată cu mai puţin de 24 de ore înainte. Se agită şi se lasă la incubat toată noaptea la 4°C.

Se mai poate utiliza pentru fixare etanol 96%. În acest caz, sedimentul menţionat la punctul 5.1.2 se dizolvă într-un amestec format din 50 æL tampon fosfat 0,01 M şi din 50 æL etanol 96%. Se vortexează şi se incubează timp de 30-60 minute la 4°C.

5.1.4. Se centrifughează timp de 8 minute la 7.000 g, apoi se elimină supernatantul şi se resuspendă sedimentul în 75 æL tampon fosfat 0,01 M (vezi apendicele 3).

5.1.5. Se pipetează 16 æL din fiecare suspensie pe o lamă multitest, aşa cum este indicat în figura 3. Pe fiecare lamă se aplică două probe nediluate diferite şi din acestea se prelevează 10 æL pentru a face o diluţie de 1:100 (în tampon fosfat 0,01 M). Restul probei (49 æl) poate fi conservat la -20°C, după ce s-a adăugat o cantitate de etanol 96%. În cazul în care este necesară repetarea testului FISH, se elimină etanolul prin centrifugare şi se înlocuieşte cu o cantitate echivalentă de tampon fosfat 0,01 M (se omogenizează prin agitare).

Figura 3. Dispunerea unei lame pentru testul FISH 5.1.6. Lamele se usucă la aer (sau într-un uscător la 37°C) şi se fixează prin flambare.

În acest stadiu procedura poate fi întreruptă, iar hibridizarea poate continua în ziua următoare. Lamele trebuie depozitate la adăpost de praf, într-un loc uscat şi la temperatura mediului ambiant.

5.2. Prehibridizare şi hibridizare 5.2.1. Se prepară o soluţie de lizozim din 10 mg lizozim (Sigma L-6876) în 10 mL de tampon (100 mM Tri-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Soluţia menţionată poate fi conservată, dar nu trebuie congelată şi dezgheţată decât o singură dată. Fiecare probă se acoperă integral cu aproximativ 50 æL de soluţie de lizozim şi se incubează timp de 10 minute la temperatura camerei, apoi lamele se scufundă o singură dată în apă demineralizată şi se usucă cu hârtie de filtru.

O altă posibilitate: în fiecare godeu, în locul lizozimului, se adaugă 50 æL de 40-400 æg/mL proteinază K (preparată în 2mM Tri-HCl, 2mM CaCl(2), pH 7,4) şi se incubează la 37°C timp de 30 de minute.

5.2.2. Se deshidratează celulele prin băi succesive cu etanol 50%, 80% şi 96% câte un minut fiecare. Se plasează lamele pe un suport şi se lasă să se usuce în aer liber.

5.2.3. Se prepară o cameră de incubaţie umedă, tapiţând fundul unei cutii ermetice cu hârtie de filtru umedă sau cu hârtie de filtru impregnată cu hibmix 1x (vezi apendicele 7). Se pune la preincubat cutia timp de cel puţin 10 minute în cuptorul de hibridizare, la o temperatură de 55°C.

5.2.4. Se prepară soluţia de hibridizare (vezi apendicele 7), putându-se folosi până la 45 æL pe lamă, apoi se preincubează timp de 5 minute la o temperatură de 55°C.

5.2.5. Se plasează lamele pe o placă încălzită la 45°C şi se pipetează 10 æL soluţie de hibridizare în fiecare dintre cele patru godeuri ale fiecărei lame.

5.2.6. Se acoperă fiecare lamă cu două lamele (24 x 24 mm), avându-se grijă să nu prindă aer. Apoi se plasează lamele în camera de hibridizare umedă preîncălzită şi se lasă acolo o noapte, la întuneric, la o temperatură de 55°C, pentru a permite desfăşurarea hibridizării.

5.2.7. Se prepară trei recipiente de laborator care conţin 1 L apă ultrapură, 1 L hibmix 1x (334 mL hibmix 3x în 666 mL apă ultrapură) şi 1 L hibmix 1/2x (167 mL hibmix 3x în 833 mL apă ultrapură). Fiecare dintre recipiente se preincubează în baie de apă, la o temperatură de 55°C.

5.2.8. Se îndepărtează lamelele de pe lame şi se plasează lamele pe un suport.

5.2.9. Se elimină excesul de sondă prin incubare la 55°C timp de 15 minute în recipientul de laborator care conţine hibmixul 1x.

5.2.10. Se transferă suportul cu lame într-o soluţie de spălat ce conţine hibmix 1/2 şi se incubează timp de încă 15 minute.

5.2.11. Se scufundă rapid lamele într-o baie de apă ultrapură şi se usucă cu hârtie de filtru. Se elimină excesul de umiditate, aşezând uşor hârtia de filtru peste suprafaţa care trebuie uscată. Se pipetează în fiecare godeu între 5 şi 10 æL de soluţie suport antidecolorare (de exemplu, Vectashield de la Vecta Laboratories, CA, USA sau o soluţie echivalentă) şi se acoperă întreaga suprafaţă a lamei cu o lamelă mare (24 x 60 mm).

5.3. Citirea testului FISH 5.3.1. Lamele se observă imediat cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă la o mărire de 630 sau 1.000 x, cu ulei de imersie. Cu un filtru adaptat pentru izotiocianatul de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene (inclusiv majoritatea celulelor gram-negative) prezente în probă se colorează în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat pentru tetrametilrodamină-5-izotiocianat, celulele de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, marcate cu Cy3, apar colorate în roşu fluorescent. Se compară morfologia celulelor cu cea a martorilor pozitivi. Celulele trebuie să fie complet colorate şi să prezinte o fluorescenţă vie. În caz de colorare anormală, testul FISH (vezi pct. 9.4) trebuie repetat. Se examinează godeurile pe două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu prezintă celule sau care prezintă doar un număr redus de celule se observă cel puţin 40 de câmpuri microscopice.

5.3.2. Se caută în godeurile lamelor-test prezenţa celulelor care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (vezi site-ul web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinilor-martor pozitiv sau superioară acesteia. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.

5.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întâmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sunt găsite în afara godeurilor.

5.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente specificităţii testului FISH. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi în segmentele de tulpini de cartof pot apărea populaţii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum şi bacterii saprofite care pot da reacţii încrucişate, având mărimea şi morfologia asemănătoare cu Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Fenomenul menţionat este cu toate acestea mult mai puţin frecvent decât în cazul testului IF.

5.3.5. Doar celulele fluorescente care prezintă mărime şi morfologie caracteristice trebuie luate în considerare (vezi pct. 5.3.2).

5.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH: (i) rezultatele testului FISH sunt valabile atunci când prin intermediul filtrului pentru FITC se observă celule care prezintă o fluorescenţă vie de culoare verde şi o mărime şi o morfologie caracteristice bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Cu ajutorul filtrului pentru rodamină se observă celule care prezintă o fluorescenţă vie de culoare roşie la toţi martorii pozitivi şi la niciun martor negativ. Dacă proba conţine celule care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule caracteristice pe câmp microscopic şi se calculează numărul celulelor respective per mL de sediment resuspendat (vezi apendicele 4). Probele care conţin cel puţin 5 x 10^3 celule caracteristice per mL de sediment resuspendat sunt considerate ca fiind potenţial contaminate. În această situaţie se vor continua testele. Probele care conţin mai puţin de 5 x 10^3 celule caracteristice per mL de sediment resuspendat sunt considerate ca fiind negative; (îi) testul FISH este negativ în cazul în care nu se observă, cu ajutorul filtrului pentru rodamină, celule de mărimea şi cu morfologia caracteristice bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, care prezintă o fluorescenţă vie de culoare roşie. Astfel de celule caracteristice cu o fluorescenţă vie şi de culoare roşie trebuie să fie observate cu filtrul pentru rodamină numai în preparatele de martori pozitivi.

Exploatarea completă a metodei menţionate ca test de depistare principal nu se recomandă decât în cazul în care există o expertiză specializată în domeniu.

NOTĂ:

Testele preliminarii efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detectarea a 10^3-10^4 celule/mL de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, care se adăugă extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Se pot dovedi necesare experienţe de optimizare pentru a obţine niveluri maxime de sensibilitate şi de specificitate în toate laboratoarele.

Se folosesc reactivi şi protocoale PCR validate. Se alege, de preferinţă, o metodă cu control intern.

Se iau precauţiile necesare pentru a se evita contaminarea probei cu ADN-ul ţintă. Pentru a reduce pe cât posibil riscul contaminării cu ADN-ul ţintă, ar trebui ca testul PCR să fie efectuat de către tehnicieni experimentaţi, în laboratoare de biologie moleculară specializate.

Martorii negativi (în ceea ce priveşte procedurile PCR şi de extracţie a ADN-ului) trebuie trataţi întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a evidenţia apariţia unui eventual transfer de ADN.

În testul PCR trebuie incluşi următorii martori negativi:

De asemenea, trebuie incluşi aici şi următorii martori pozitivi:

Pentru a evita riscurile de contaminare, martorii pozitivi se prepară într-un mediu diferit de cel în care se găsesc probele care trebuie testate.

În măsura posibilului, extractele de probe trebuie curăţate de pământ. În anumite cazuri este recomandabil să se prepare extracte din cartofi spălaţi, dacă se prevede folosirea protocoalelor PCR.

6.1. Metode de purificare a ADN-ului Se folosesc probe-martori pozitivi şi negativi, conform metodei descrise anterior.

Materialul de control se prepară la fel ca şi probele.

Există o serie întreagă de metode pentru purificarea ADN-ului-ţintă, în cazul substratelor de probe complexe, pentru a elimina inhibitorii PCR şi alte reacţii enzimatice şi pentru a concentra ADN-ul-ţintă în extractul de probă.

Următoarea metodă a fost optimizată pentru a fi utilizată cu metoda PCR validată, descrisă în apendicele 6.

6.1. a) Metoda Pastrik (2000) 1. Se pipetează 220 æL tampon de liză (100 mM NaCl, 10mM Tri-HCl îpH 8,0ş, 1 mM EDTA îpH 8,0ş) într-un tub Eppendorf de 1,5 mL.

6.1. b) Alte metode Se pot aplica şi alte metode de extracţie a ADN-ului (de exemplu, Qiagen DNeasy Plant Kit), cu condiţia ca metodele respective să aibă o eficacitate recunoscută ca fiind echivalentă, pentru purificarea ADN-ului provenit din probele-martori care conţin între 10^3 şi 10^4 celule de agent patogen per mL.

6.2. PCR 6.2.1. Se prepară probele-test şi controalele pentru PCR, urmând protocoale validate (vezi apendicele 6). Se prepară o diluţie zecimală din extractul de ADN provenit din probă (1:10 în apă ultrapură).

6.2.2. Se prepară mix-ul pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (vezi apendicele 6). Protocolul PCR validat este o reacţie multiplex care include şi un control PCR intern.

6.2.3. Se adaugă 5 æL de extract de ADN la 25 æL reactiv PCR în tuburi PCR sterile.

6.2.4. Se constituie o probă-martor negativ, care nu conţine decât mix-ul pentru PCR, şi se adaugă în locul probei apă ultrapură provenind din aceeaşi sursă ca şi cea utilizată în amestecul PCR.

6.2.5. Se aşază tuburile în acelaşi termociclor folosit la testul preliminar şi se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (vezi apendicele 6).

6.3. Analiza produsului reacţiei PCR 6.3.1. Se vizualizează ampliconii prin electroforeză în gel de agaroză. O cantitate de cel puţin 12 æL de ADN amplificat, provenit de la fiecare probă, la care se adaugă 3 æL de tampon de încărcare (vezi apendicele 6), se supune unei tensiuni de 5-8 V/cm în geluri de agaroză 2,0% într-un tampon tris-acetat EDTA (TAE) (vezi apendicele 6). Se utilizează un marker de ADN corespunzător, de exemplu "100 bp ladder".

6.3.2. Pentru a pune în evidenţă benzile de ADN se foloseşte colorarea cu bromură de etidiu (0,5 mg/L) timp de 30-45 de minute, luând precauţiile care se impun pentru manipularea agentului mutagen în cauză.

6.3.3. În cazul produselor PCR care au mărimea corespunzătoare (vezi apendicele 6), se vizualizează gelul colorat la transiluminator sub unde UV scurte (de exemplu, lambda = 302 nm) şi se notează rezultatele.

6.3.4. Pentru toate cazurile/rezultatele noi se verifică autenticitatea ampliconului, efectuându-se o analiză de restricţie enzimatică pe o probă din ADN-ul amplificat rămas. În acest scop, se lasă la incubat la o temperatură optimă şi pe o durată optimă, folosindu-se o enzimă şi un tampon corespunzătoare (vezi apendicele 6). Se vizualizează fragmentele restrictate prin electroforeză în gel de agaroză, în conformitate cu metoda indicată anterior, şi se vizualizează la transiluminator sub UV dispunerea caracteristică a fragmentelor după restricţia enzimatică şi colorarea cu bromură de etidiu. Se compară apoi cu martorii pozitivi dinainte şi de după restricţie.

Interpretarea rezultatului testului PCR:

NOTĂ:

Se poate suspecta o inhibiţie a PCR-ului, în cazul în care ampliconul corespunzător se obţine în martorul pozitiv care conţine bacteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus în soluţie apoasă, iar martorii pozitivi care conţin Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus în extractul de cartof dau un rezultat negativ. În protocoalele de multiplex PCR cu controale PCR interne inhibiţia reacţiei este probabilă atunci când nu se obţine niciunul dintre cei 2 ampliconi.

Se poate suspecta o contaminare dacă ampliconul corespunzător este evidenţiat în cel puţin unul dintre martorii negativi.

Testele preliminarii realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detectarea de 10^3-10^4 celule formatoare de colonii de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus /mL, adăugate extractelor de probe care anterior au dat rezultate negative (pentru preparare vezi apendicele 2).

Pentru a obţine o sensibilitate maximă a detecţiei este preferabil să se utilizeze un extract de probă proaspăt preparat în condiţii optime de creştere. Cu toate acestea, metoda poate fi aplicată cu succes pentru extracte conservate cu glicerol la temperaturi cuprinse între -68°C şi -86°C.

Anumite soiuri de vinete constituie un mediu selectiv excelent de îmbogăţire pentru creşterea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus chiar şi în absenţa simptomelor şi permit, de asemenea, realizarea unui excelent test de confirmare.

Pentru a reduce riscul de a obţine rezultate fals negative, condiţiile de creştere trebuie să fie optime.

Pentru detaliile privind cultura vezi apendicele 8.

7.1. Se repartizează pe vinete, în conformitate cu una dintre metodele indicate în continuare (vezi pct. 7.3 sau 7.4), tot alicotul rămas din sedimentul resuspendat, obţinut conform prevederilor pct. 3.1.6 sau 3.2.5. Se folosesc doar plante ajunse în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze, până la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Pentru a folosi integral sedimentul resuspendat şi pentru a asigura eficacitatea inoculării, pentru procedurile descrise în continuare sunt necesare între 15 şi 25 vinete per probă.

7.2. Înainte de inoculare, vinetele nu trebuie udate timp de una sau două zile, pentru a reduce turgescenţa.

7.3. Inoculare prin incizie 7.3.1. Se ţine planta între două degete şi se pipetează pe tulpină, între cotiledoane şi prima frunză, o picătură (în jur de 5-10 æL) de sediment resuspendat.

7.3.2. Cu ajutorul unui bisturiu steril se realizează, plecând de la picătura de sediment, o incizie diagonală cu o lungime de 1,0 cm şi o adâncime aproximativ egală cu două treimi din grosimea tulpinii.

7.3.3. Se închide incizia cu vaselină sterilă, folosindu-se o seringă.

7.4. Inoculare prin injecţie Se injectează sediment resuspendat în tulpini de vinete chiar deasupra cotiledoanelor, cu ajutorul unei seringi dotate cu un ac hipodermic (nu mai puţin de 23 G), repartizându-se în toate plantele de vinete utilizate pentru testare.

7.5. Ca martori pozitivi se inoculează 5 plante prin aceeaşi metodă (vezi pct. 7.3 sau 7.4), cu o suspensie apoasă care conţine între 10^5 şi 10^6 celule/mL dintr-o cultură cunoscută de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, şi, în cazul în care este posibil, cu extract din tubercul infectat în mod natural (vezi pct. 4).

7.6. Ca martori negativi se inoculează 5 plante prin aceeaşi metodă (vezi pct. 7.3 sau 7.4), cu o soluţie tampon fosfat sterilă.

7.7. Se lasă plantele la incubat până la 4 săptămâni la temperaturi cuprinse între 18°C şi 24°C, în condiţii de carantină. În timpul incubaţiei se menţine o lumină suficientă şi un grad ridicat de umiditate (de la 70% la 80%), asigurându-se o udare adecvată pentru a evita orice obturare hidrică sau veştejire din cauza lipsei apei. Celulele de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus nu rezistă la temperaturi mai mari de 30°C; temperatura optimă de dezvoltare este de 21°C. Pentru a evita riscurile de contaminare, martorii pozitivi şi negativi se pun la incubat în seră sau fitotron pe etajere complet separate sau, în cazul în care spaţiul este limitat, se prevede o compartimentare riguroasă. În cazul în care plantele infectate provenite din probe diferite trebuie să stea la incubat aproape unele de altele, plantele respective se vor separa cu ajutorul unor ecrane corespunzătoare. Se va acorda o mare atenţie evitării contaminării încrucişate în timpul fertilizării, al udării, al inspecţiilor şi în orice alt caz de manipulare. Este necesar să se evite prezenţa insectelor în sere sau fitotroane, deoarece sunt susceptibile de a răspândi bacteria de la o proba la alta.

7.8. După o săptămână se examinează cu regularitate plantele pentru a identifica apariţia simptomelor. Se numără plantele care prezintă simptome. Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus provoacă la vinete o veştejire a frunzelor, care se poate manifesta în primul rând printr-o inmuiere a marginilor frunzelor sau între nervuri. La început, ţesutul veştejit poate lua o culoare verde închis sau un aspect pestriţ, dar păleşte înainte de a se necroza. Veştejirile dintre nervuri prezintă adesea aspectul unsuros al ţesuturilor saturate cu apă. ţesutul necrozat prezintă adesea o margine de culoare galben viu. Plantele nu mor neapărat. Cu cât simptomele întârzie să apară, cu atât şansele de supravieţuire sunt mai mari. Plantele pot învinge infecţia. Plantele tinere sunt mult mai sensibile la populaţiile slabe de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus decât plantele mai în vârstă, de unde necesitatea de a utiliza plante în stadiul celei de-a treia frunze adevărate sau chiar înaintea acestui stadiu.

Veştejirile mai pot fi provocate şi de populaţii de alte bacterii sau de ciuperci prezente în extract. Este vorba, printre altele, de Ralstonia solanacearum, de Erwinia carotovora ssp. carotovora şi de Erwinia carotovora ssp. atroseptica, de Erwinia chrysanthemi, de Phoma exigua var. foveata, precum şi de vaste populaţii de bacterii saprofite. Erwinia chrysanthemi, în special, poate induce simptome la nivelul frunzelor şi o veştejire foarte asemănătoare cu simptomele produse de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, cu singura diferenţă că infecţiile cu Erwinia chrysanthemi provoacă o înnegrire a tulpinilor. Alte tipuri de veştejiri se disting de cele provocate de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus prin faptul că frunzele sau plantele întregi se ofilesc rapid. De asemenea, se poate recurge la o colorare Gram pentru a distinge bacteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus de bacteria Erwinia spp.

7.9. Odată cu apariţia simptomelor pe vinete trebuie să se efectueze noi operaţiuni de izolare, utilizându-se segmente de ţesut care provin din frunzele veştejite sau din tulpinile plantelor (pentru macerarea ţesuturilor vezi pct. 3.1.3). Se dezinfectează suprafaţa frunzelor şi a tulpinilor de vinete cu etanol 70%. Se efectuează un test IF sau PCR pe extractul de vinete şi se trece la izolarea pe mediu adecvat (selectiv) (vezi pct. 8). De asemenea, este posibil să se efectueze o colorare Gram (vezi apendicele 9). Se identifică culturile pure ale izolatelor presupuse a fi de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus şi li se confirmă patogenitatea (vezi pct. 9 şi 10).

7.10. În anumite circumstanţe şi, în special, în cazul în care condiţiile de cultură nu sunt optime, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus poate fi prezent în vinete într-un stadiu de infecţie latentă, chiar şi după perioade de incubaţie care ajung până la 4 săptămâni. În cazul în care după 4 săptămâni nu se observă niciun simptom, se efectuează un test IF sau PCR pe o probă mixtă de segmente de tulpini de 1 cm provenind de la fiecare plantă-test, prelevate de deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se efectuează o nouă izolare pe un mediu adecvat (selectiv), conform procedurii de la pct. 8. Se identifică culturile pure ale izolatelor presupuse a fi de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus şi li se confirmă patogenitatea (vezi pct. 9 şi 10).

Interpretarea rezultatelor testului biologic Rezultatele testului biologic sunt valabile atunci când plantele care constituie martorul pozitiv prezintă simptome caracteristice, bacteria poate fi reizolată din aceste plante şi când nu se observă niciun simptom pe martorii negativi.

Testul biologic este negativ în cazul în care plantele-test nu sunt infectate cu bacteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, aceasta fiind evidenţiată numai pe martorii pozitivi.

Testul biologic este pozitiv în cazul în care plantele-test sunt infectate cu bacteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Diagnosticul nu poate fi confirmat decât după izolarea şi identificarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (vezi pct. 9), urmate de o confirmare prin testul de patogenitate (vezi pct. 10). Deşi este vorba de un organism dificil de izolat, el poate fi totuşi izolat din ţesut simptomatic.

Cu toate acestea, organismul poate fi inhibat de bacterii saprofite cu creştere rapidă, ceea ce îl face dificil de izolat în mod direct din sedimentul de ţesut de tubercul sau de tulpină (vezi pct. 3.1.6 sau 3.2.5). Izolarea directă a bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus se poate realiza pe mediu selectiv, pornindu-se de la diluţii corespunzătoare ale sedimentului resuspendat provenit din conuri sau tulpini de cartof.

Izolările trebuie să se realizeze pornindu-se de la toţi tuberculii sau fragmentele de tulpini de cartof cu simptome şi de la toate vinetele care nu prezintă simptome, dar la care testul IF sau PCR efectuat pe o probă mixtă (vezi pct. 7.10) a fost pozitiv. Dacă este cazul, tulpinile de vinete trebuie să fie macerate conform metodei descrise la pct. 3.1.3.

Ca martori pozitivi se prepară diluţii zecimale dintr-o suspensie de 10^6 ufc/mL de Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus (de exemplu, NCPPB 4053 sau PD 406). Pentru a se evita orice posibilitate de contaminare, martorii pozitivi se vor prepara separat de probe.

În cazul fiecărui lot de mediu selectiv nou-preparat, trebuie să se verifice în ce măsură acesta este potrivit pentru cultura agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea de rutină a probelor.

Materialul de control se testează la fel ca şi probele.

8.1. Izolarea pe medii selective 8.1.1. Pornindu-se de la 100 æL alicot obţinut dintr-un sediment de cartof resuspendat sau din extract de vinete, se efectuează diluţii la a zecea parte într-un tampon de sedimentare 10mM (vezi apendicele 3).

8.1.2. Tentativele de izolare pornindu-se de la sediment nediluat de cartof se soldează, în general, cu eşecuri datorită dificultăţilor care apar la izolarea bacteriei Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus şi a concurenţei saprofiţilor. Deoarece bacteria este în general prezentă în număr mare de populaţii în ţesuturile infectate, adesea saprofiţii pot fi înlăturaţi prin diluţie, dar păstrându-se totodată agentul patogen. Prin urmare, se recomandă să se utilizeze tehnica de însămânţare pe plăci cu ajutorul unei anse, însămânţându-se câte 100 æl din fiecare probă şi din fiecare diluţie de 1/100 până la 1/10.000 pe mediu MTNA sau NCP-88 (vezi apendicele 5).

NOTĂ:

O altă modalitate poate consta în însămânţarea, cu ajutorul unei anse, a 100 æL din alicotul sedimentului de cartof iniţial, la început pe o placă cu agar, apoi de pe aceasta pe o a doua placă cu agar, însămânţându-se astfel în striuri pe cea de-a doua placă ceea ce a rămas pe ansă; în final, procedura se repetă pe o a treia placă, ansa permiţând astfel ca pe plăci să se obţină un efect de diluţie.

8.1.3. Se incubează plăcile la întuneric, la temperaturi cuprinse între 21°C şi 23°C.

8.1.4. Prima examinare a plăcilor, prin comparaţie cu plăcile-martor, cu numărarea eventualelor colonii asemănătoare cu cele produse de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, trebuie să se realizeze după 3 zile. Numărarea ulterioară se va realiza după 5, 7 şi, în final, 10 zile.

8.2. Purificarea coloniilor suspecte NOTĂ:

Trebuie să se efectueze o repicare pe mediu YGM a coloniilor asemănătoare cu cele produse de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, în scopul inoculării ulterioare a vinetelor şi/sau al identificării. Aceasta trebuie efectuată înainte ca plăcile să atingă o creştere excesivă, de preferinţă, după 3-5 zile.

8.2.1. Se efectuează o însămânţare în striuri a coloniilor asemănătoare cu cele produse de Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus pe unul dintre următoarele medii (reţetele figurează în apendicele 5):

Se incubează 10 zile la o temperatură cuprinsă între 21°C şi 24°C.

Clavibacter michiganensis. ssp. sepedonicus creşte lent, producând, în general, în 10 zile colonii de dimensiunea şi de forma unui vârf de ac, sub formă de cupolă şi de culoare crem. Fotografii ale coloniilor caracteristice bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus sunt prezentate la adresa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

8.2.2. Se însămânţează din nou în striuri pentru a obţine culturi pure.

Ratele de creştere sunt îmbunătăţite prin subculturi. Coloniile caracteristice sunt de culoare crem-albicioasă sau de culoarea fildeşului, uneori galbene, rotunjite, netede, înălţate sub formă de cupolă convexă, cu o consistenţă mucoid-fluidă, cu margini întregi, cu diametrul în general de 1-3 mm.

O simplă colorare Gram (vezi apendicele 9) poate ajuta la selectarea coloniilor în vederea efectuării testelor suplimentare.

8.2.3. Se identifică culturile presupuse (vezi pct. 9) şi se realizează un test de patogenitate (vezi pct. 10).

Dacă este cazul, pentru fiecare test efectuat se includ tulpini de referinţă cunoscute.

9.1. Teste de identificare de nutriţie şi enzimatice Se determină caracteristicile fenotipice menţionate în continuare, care sunt în mod sistematic prezente sau absente la Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, în conformitate cu metodele lui Lelliott şi Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) şi anonim (1987).

Toate mediile se incubează la temperatura de 21°C şi se examinează după 6 zile. În cazul în care nu se constată nicio creştere, se incubează până la 20 de zile.

Fiecare test trebuie să includă o tulpină cunoscută de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus ca martor. Testele de nutriţie şi cele fiziologice trebuie să fie efectuate utilizându-se un inocul provenit din repicări pe agar nutritiv. Comparaţiile morfologice trebuie să se efectueze pe culturi obţinute pe nutrient dextroza agar.

9.2. Testul de imunofluorescenţă (IF)

9.3. Testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)

9.4. Testul de hibridizare fluorescentă în situ (FISH)

9.5. Testul de profil al acizilor graşi (FAP)

9.6. Testul BOX-PCR

10.1. Se prepară un inoculum de aproximativ 10^6 celule/mL dintr-o cultură de 3 zile a izolatului de testat şi dintr-o tulpină-martor pozitivă, corespunzătoare bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

10.2. Se inoculează 5-10 tulpini de plante tinere de vinete în stadiul celei de-a treia frunze adevărate (vezi pct. 7.3 sau 7.4).

10.3. Se incubează la temperaturi cuprinse între 18°C şi 24°C, la o umiditate relativ ridicată, asigurând o stropire corespunzătoare pentru a preveni obturarea hidrică sau stresul cauzat de secetă (vezi pct. 7.7). În cazul culturilor pure ar trebui să apară o veştejire tipică în două săptămâni; cu toate acestea, plantele care nu prezintă simptome (vezi pct. 7.8) la sfârşitul acestei perioade trebuie lăsate în continuare la incubat până la 3 săptămâni, la temperaturi favorabile creşterii vinetelor, nedepăşind temperatura de 25°C (vezi apendicele 8). Dacă la sfârşitul celor 3 săptămâni nu apar simptome, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

10.4. Se izolează din plante cu simptome, prelevându-se o secţiune de tulpină la o înălţime de 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunţesc şi se suspendă într-o cantitate mică de apă distilată sterilă sau de tampon fosfat 50 mM (vezi apendicele 3). Se izolează din suspensie, diluând prin însămânţare simplă sau în striuri pe MTNA şi YPGA (vezi apendicele 5), se incubează timp de 3-5 zile la o temperatură cuprinsă între 21°C şi 23°C, apoi se observă formarea coloniilor caracteristice de C. m. ssp. sepedonicus.

Apendice 1 Laboratoare care practică optimizarea şi validarea protocoalelor ----- *1) Pentru experţii de contact vezi site-ul web la adresa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Apendice 2 Prepararea martorilor pozitivi şi negativi pentru testele de depistare PCR/IF şi FISH aplicate tuberculilor de cartof Se însămânţează pe un mediu MTNA, timp de 72 de ore, o tulpina virulentă de C. m. ssp. sepedonicus îNCPPB 4053 sau PD 406ş, apoi se suspendă în tampon fosfatat 10 mM, astfel încât să se obţină o densitate celulară de aproximativ 1-2 x 10^8 UFC per mL. Aceasta corespunde, în general, unei suspensii uşor tulburi, care prezintă o densitate optică de 0,20-600 nm.

Se prelevează conurile de la 200 de tuberculi dintr-o recoltă de cartof alb, cunoscută ca fiind lipsită de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.

Se tratează conurile urmând metoda obişnuită şi se resuspendă sedimentul în 10 mL.

Se pipetează 900 æL de sediment resuspendat în 10 microtuburi sterile de 1,5 mL.

Se însămânţează primul microtub cu 100 æL din suspensia de Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Se omogenizează prin vortexare.

Se stabilesc niveluri de contaminare la a zecea parte, urmând diluţii în următoarele 5 microtuburi.

Cele 6 microtuburi contaminate vor fi utilizate ca martori pozitivi. Cele 4 microtuburi necontaminate vor fi utilizate ca martori negativi. Microtuburile se etichetează corespunzător.

Se prepară alicoţi de 100 æL în microtuburi sterile de 1,5 mL, astfel încât să se obţină 9 repetiţii ale fiecărei probe-martor. Se depozitează la temperaturi cuprinse între -16 şi -24°C până în momentul utilizării.

Prezenţa şi determinarea bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus în probele-martor trebuie confirmate în primul rând printr-un test IF.

Pentru testul PCR se extrage ADN pe baza probelor-martor pozitive şi negative din fiecare serie de probe.

Pentru testele IF şi FISH, se efectuează analize pe probele-martor pozitive şi negative ale fiecărei serii de probe.

În cazul testelor IF, FISH şi PCR, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus trebuie detectat în martorii pozitivi cel puţin 10^6 şi 10^4 celule/mL şi trebuie să lipsească complet în martorii negativi.

Apendice 3 Tampoane pentru procedurile de testare Generalitate: tampoanele sterilizate care nu sunt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

Următoarele componente pot fi utile: ----- Notă ... *) A se utiliza cu metoda de extracţie prin omogenizare.

1.2. Tampon de sedimentare (tampon fosfat 10 mM, pH 7,2) Tamponul menţionat este utilizat pentru resuspendarea şi diluţia sedimentelor de conuri de cartof concentrate prin centrifugare.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare timp de 15 minute la 121°C.

2.2. Tampon IF-Tween Tamponul menţionat este utilizat pentru spălarea lamelor.

Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF.

2.3. Tampon Glicerol fosfat, pH 7,6 Tamponul menţionat este utilizat ca lichid de montare pentru lamele IF, pentru a întări fluorescenţa.

Soluţii suport antidecolorare sunt disponibile în comerţ: exemplu, Vectashield(^R) (Vector Laboratories) sau Citifluor (^R) (Leica).

Apendice 4 Determinarea gradului de contaminare în momentul testelor IF şi FISH 1. Se numără numărul mediu de celule fluorescente caracteristice per câmp (c).

C = c x S/s, unde:

S = suprafaţa (S) godeului unei lame cu multe godeuri; şi s = suprafaţa câmpului obiectivului 3. Se calculează celulele fluorescente caracteristice per mL de sediment resuspendat (N) N = C x 1.000/y x F, unde: y = volumul de sediment resuspendat din fiecare godeu F = factorul de diluţie al sedimentului resuspendat; şi C = celule fluorescente caracteristice per godeu Apendice 5 Medii de izolare şi de cultură ale bacteriei C. m. ssp. sepedonicus (a) Medii de cultură generale (b) Medii de creştere selective validate Se dizolvă ingredientele şi se ajustează pH-ul la 7,2. După autoclavare (15 minute la 121°C) şi o răcire la 50°C se adaugă antibioticele: trimetoprim 0,06 g, acid nalidixic 0,002 g, amfotericină B 0,01 g.

Soluţiile stoc de antibiotice sunt: trimetoprimul (Sigma) şi acidul nalidixic (Sigma) (ambele 5 mg/mL) în metanol 96%; amfotericina B (Sigma) (1 mg/mL) în dimetilsulfoxid. Soluţiile stoc sunt sterilizate prin filtrare.

NOTĂ:

Mediul fără antibiotic se conservă timp de 3 luni. După adăugarea antibioticelor mediul se conservă o lună la frigider.

Se dizolvă ingredientele şi se ajustează pH-ul la 7,2. Se sterilizează prin autoclavare şi se răceşte la 50°C, se adaugă apoi următoarele antibiotice: sulfat de polimixină B (Sigma) 0,003 g, acid nalidixic (Sigma) 0,008 g, cicloheximidă (Sigma) 0,2 g.

Antibioticele se dizolvă în soluţiile stoc, după cum urmează: acidul nalidixic în NaOH 0,01 M; cicloheximida în etanol 50%, sulfatul de polimixină B în apă distilată. Soluţiile stoc sunt sterilizate prin filtrare.

NOTĂ:

Mediul fără antibiotic se conservă timp de trei luni. După adăugarea antibioticelor mediul se conservă timp de o lună la frigider.

Apendice 6 Protocol şi reactivi PCR validaţi NOTĂ:

Testele preliminare trebuie să permită detectarea a cel puţin 10^3-10^4 celule de C. m. ssp. sepedonicus per mL de extract de probă.

De asemenea, testele preliminare nu trebuie să indice niciun rezultat fals pozitiv pentru o gamă de tulpini bacteriene selecţionate.

Dimensiunea prevăzută a ampliconului controlului PCR intern 18S rRNA = 377 bp (în prezenţa primerului NS).

1.2. Mixul pentru PCR -----

1.3. Condiţii ale reacţiei PCR Se execută următorul program:

NOTĂ:

Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară modificarea etapelor ciclurilor (îi), (iii), (iv), (v), (vi) şi (vii), în cazul utilizării altor modele de termociclor.

1.4. Analiza restricţiei enzimatice a ampliconului Produsele PCR amplificate ale ADN-ului bacteriei Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus produc un polimorfism distinct al lungimii fragmentelor de restricţie cu enzima Bgl II, după incubare la 37°C timp de 30 de minute. Fragmentele de restricţie obţinute pe baza fragmentului specific de C. m. ssp. sepedonicus au o lungime de 282 bp şi 220 bp.

ATENŢIE! NU SE UTILIZEAZĂ PH-METRU ÎN SOLUŢII CARE CONŢIN PARAFORMALDEHIDĂ. (iii) Soluţia se filtrează printr-un filtru cu membrană de 0,22 æm, se protejează de praf şi se păstrează la 4°C până la utilizare. (iv) NOTĂ:

Soluţie de fixare alternativă: etanol 96%.

Tabel: Cantităţi sugerate pentru prepararea amestecului de hibridizare NOTĂ:

Toate soluţiile care conţin oligosonde sensibile la lumină se depozitează la întuneric şi la o temperatură de -20°C. În timpul utilizării se protejează de lumina directă a soarelui sau de lumina electrică directă.

Apendice 8 Culturi de vinete Se seamănă seminţe de vinete (Solanum melongena) într-un pământ sterilizat prin pasteurizare. Atunci când cotiledoanele sunt complet dezvoltate (10-14 zile), plantulele se repică într-un pământ sterilizat prin pasteurizare.

Vinetele trebuie cultivate în seră în următoarele condiţii:

Furnizor: vezi site-ul web la adresa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Apendice 9 Procedura pentru reacţia Gram (modificarea lui Hucker) (Doetsch, 1981) Soluţie Cristal violet Se dizolvă 2 g cristal violet în 20 mL etanol 95%.

Se dizolvă 0,8 g oxalat de amoniu în 80 mL apă distilată.

Se amestecă cele două soluţii.

Soluţia iod Lugol Substanţele solide se zdrobesc împreună cu ajutorul unui pistil şi al unui mojar. Se adaugă apă şi se amestecă într-un recipient închis pentru a se dizolva.

Soluţie colorantă de safranină Soluţie stoc:

Se amestecă şi se depozitează.

Se diluează în raport 1:10 pentru a obţine o soluţie de lucru.

Procedura de colorare 1. Se prepară frotiurile, se usucă la aer şi se fixează la căldură.

Bacteriile Gram pozitive au o culoare violet-albastră; bacteriile Gram negative au o culoare roz-roşie.

Anexa II 1. Pentru fiecare apariţie suspectată pentru care s-a identificat un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform metodelor descrise în anexa nr. I şi confirmată sau infirmată prin aplicarea completă a metodelor menţionate trebuie să se păstreze şi să se conserve adecvat:

Păstrarea tuberculilor permite testarea soiului, efectuată atunci când este cazul.

Anexa III 1. Elementele avute în vedere pentru determinarea gradului contaminării probabile conform art. 5 alin. (1) lit. b) includ:

Anexa IV 1. Măsurile luate sub control oficial, conform art. 8 alin. (1), sunt:

Toate deşeurile asociate şi care rezultă din operaţiile menţionate anterior sunt eliminate prin metode aprobate oficial, în conformitate cu anexa nr. V la prezentul ordin.

4.1. în locurile de producţie declarate ca fiind contaminate conform art. 5 alin. (1) lit. a):

4.2. în interiorul zonei delimitate şi fără a prejudicia măsurile enumerate la pct. 4.1 se aplică următoarele măsuri:

Anexa V Pentru a preveni orice risc identificabil de răspândire a organismului, metodele de eliminare a deşeurilor, aprobate în mod oficial şi prevăzute în anexa nr. IV pct 1, respectă următoarele dispoziţii: (i) deşeurile de cartof (inclusiv cartofii eliminaţi şi cojile) şi orice alt deşeu solid asociat cartofilor (inclusiv pământ, pietre şi alte resturi) vor fi eliminate:

Apoi, deşeurile lichide vor fi:

Detaliile vor fi notificate Comisiei şi celorlalte state membre.

Diferitele proceduri descrise în prezenta anexă se aplică în egală măsură şi deşeurilor asociate cu manipularea, eliminarea şi tratarea loturilor contaminate. -------